CN117286168A - 一种用于编辑可生成细菌纤维素细菌基因组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种用于可生成细菌纤维素细菌基因组的基因编辑方法，所述方法包括以下步骤：S1)确定可生成纤维素膜细菌中的目标修改的基因或位点，并根据目标修改的基因或位点确定第一同源臂序列；S2)制备供体质粒，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因以及用于和基因组等位交换的第二同源臂序列；S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，并通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因编辑的可生成纤维素膜细菌的重组菌；所述重组菌基因组中的目标修改的基因或位点插入了线性化的供体质粒序列。本发明利用单重组的方法，对可生成纤维素膜的细菌基因组快速、简便的基因修改。操作简单，用时短。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于可生成细菌纤维素细菌基因组的快速修改的方法。
背景技术
基因修改是研究细菌基因功能、调控基因回路、筛选特定表型等方面一种常见而成熟的技术。然而，对于可生成天然细菌纤维素细菌，例如木醋杆菌等微生物来说，其生长速度较慢、培养方式和分子生物学操作与常用的大肠杆菌等细菌相差较大、可用于编辑其基因组的技术目前只有Red重组技术被报道。
目前虽然有研究者利用Red重组技术实现了对木醋杆菌基因组的敲除，但这一敲除首先需要将辅助质粒(helper plasimde)电转入野生型木醋杆菌中，同时还需要通过重叠聚合酶链式反应(overlap PCR)将靶标基因上下游同源臂和抗性基因共三个片段构建成一个重组片段；其次需要再一次电转将得到的重组片段电转入含有辅助质粒的木醋杆菌中；最后若需要获得纯净敲除，需要经历一次额外电转、一次抗生素培养基筛选。这种策略虽然很经典但操作步骤多，流程复杂，尤其是对于生长周期较慢的木醋杆菌等微生物，每多经历一次电转无疑是要多花4-5天的时间。
因此，在大肠杆菌等细菌中已经较为成熟的Red重组技术虽然可以在可生成细菌纤维素细菌，例如木醋杆菌中操作，但是却存在操作方法复杂，耗时太长的问题。这些因素均很大程度的限制了研究者对它们基因组基因和表型的研究以及工程化这类细菌。
发明内容
因此，为了缩短对可生成纤维素膜且生长速度较慢的木醋杆菌等细菌基因重组(敲除，插入，修改，蛋白融合等操作)时间，本发明提供了一种单次重组的方法，实现仅利用一次等位基因交换就可以将携带同源片段的质粒线性化插入特定的基因组位点。这种方法不需要辅助质粒，比上述Red重组方法少一次电转，并且用于重组的质粒只需要目标位置一段同源臂即可。换言之本发明的方法操作简单且耗时较短，尤其对于批量的基因型与表型研究工作来说。
本发明一个方面提供了一种可生成纤维素膜细菌基因编辑方法，所述方法包括以下步骤：
S1)确定可生成纤维素膜细菌中的目标修改的基因或位点，并根据目标修改的基因或位点确定用于和供体质粒进行等位交换的第一同源臂序列；
S2)制备供体质粒，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因以及用于和可生成纤维素膜细菌基因组中第一同源臂序列进行等位交换的第二同源臂序列；
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，并通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因编辑的可生成纤维素膜细菌的重组菌；所述重组菌基因组的目标修改的基因或位点插入了线性化的供体质粒序列；
在供体质粒中的复制起始位点为在所述可生成纤维素膜细菌中无法自主复制的复制起始位点；
所述第一同源臂片段和第二同源臂序列分别为可生成纤维素膜细菌基因组以及供体质粒中能够进行等位交换的片段，除同于目标基因突变外，第二同源臂序列应与第一同源臂DNA序列完全一致。
进一步地，所述基因编辑方法为目标基因失活、目标基因特定位点突变、目标基因末尾基因融合表达、基因组特定位置外源基因的插入、单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS。
进一步地，所述基因编辑方法为目标基因失活，在步骤S1)中，第一同源臂序列为待失活目标基因的一部分，优选第一同源臂序列为位于待失活目标基因中间。
进一步地，所述基因编辑方法为目标基因特定位点突变，在步骤S1)中，第一同源臂序列为目标基因部分序列或者目标基因部分序列和其连续的下游序列；其中所述目标基因部分序列为包含待突变位置碱基序列和终止密码子的连续DNA序列，优选地，待突变位置位于第一同源臂中间或者末端，同时除待突变位置碱基外，第二同源臂序列中其它碱基序列与第一同源臂100％同源。
进一步地，所述基因编辑方法为目标基因末尾基因融合表达；在步骤S1)中，第一同源臂序列为目标基因且不包含目标基因终止密码子，但包含编码终止密码子前一个氨基酸序列的连续片段。优选的第一同源臂序列从不包含目标基因完整起始密码子序列的任意位置起始到编码其终止密码子前一个氨基酸的碱基终止；在步骤S2)中，供体质粒还包含待插入的外源基因；待插入基因的外源基因起始密码子上游不包含启动子和RBS，转录方向与目标基因转录方向一致，任选地，包含连接用的氨基酸链的编码序列。
进一步地，所述基因编辑方法为基因组特定位置外源基因的插入，在步骤S1)中，第一同源臂序列为待插入位点及其连续的上游序列；在步骤S2)中，供体质粒还包含待插入的外源基因，所述外源基因起始密码子前包含启动子和RBS序列。更进一步地，第一同源臂序列为待失活的目标基因中的部分序列。
进一步地，所述基因编辑方法为单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS，在步骤S1)中，第一同源臂为目标基因自起始密码子开始的部分序列；在步骤S2)中，供体质粒还包含替换的启动子和或RBS序列，替换的启动子和或RBS必须在同源臂的5’端，且转录方向与目标基因转录方向一致。
进一步地，所述第二同源臂片段包含了目标修改的基因中的至少一部分，或者与目标修改的基因中的至少一部分同源，或者所述第二同源臂片段中至少一部分选自与目标修改的基因及其下游部分序列同源，与特定编辑位点及其上游部分序列同源。
进一步地，所述第二同源臂片段中至少一部分选自与目标修改的基因及其下游部分序列同源，与特定编辑位点及其上游部分序列同源，所述基本同源为至少90％以上的序列同源，或至少95％以上的序列同源，或至少96％以上的序列同源，或至少97％以上的序列同源，或至少98％以上的序列同源，或至少99％以上的序列同源；或者所述基本同源为除1个碱基以外其他碱基同源，除2个碱基以外其他碱基同源，除3个碱基以外其他碱基同源除4个碱基以外同源，其他碱基同源除5个碱基以外其他碱基同源。
进一步地，第一和或第二同源臂片段的长度为至少10个碱基，优选为50-1000个碱基，例如50、60、70、80、90、100、200、300、500、600、700、800、900、1000个碱基。
进一步地，在步骤S3)后还包含通过聚合酶链式反应(PCR)以及二代测序进行检测的步骤，已确定得到的可生成纤维素膜细菌的基因编辑结果是否准确。更进一步地，所述聚合酶链式反应(PCR)以及测序的方法为通过基因编辑位点上下游引物扩增基因编辑位点序列，并通过测序方法，例如二代测序方法获得基因编辑位点序列。
进一步地，所述重组菌基因组中插入了线性化的供体质粒序列。
进一步地，步骤S2)中制备供体质粒的方法为：
S2-1)获得编辑包含目标的基因或位点的DNA序列的同源片段；
S2-2)将用于编辑目标的基因或位点的DNA序列的同源片段与表达载体质粒连接获得供体质粒，所述供体质粒包含在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点和筛选基因；
进一步地，所述供体质粒还含有待插入细菌基因组的新基因及其启动子和核糖体结合位点(RBS)；
进一步地，所述筛选基因为抗生素抗性基因、荧光蛋白基因、标记蛋白基因，营养缺陷型筛选标记。
进一步地，所述的抗生素抗性基因选自blatem、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aac6’－IIa、aacA4、aad(6’)、vanA、vanB、vanC、msrA、satA、aac(6’)－aph(2”)、vat、vga、ermA、ermB、ermC、mecA、int和sul。
进一步地，所述在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点选自在除可生成纤维素膜细菌外任意一种细菌中可以复制的复制起点。例如，除可生成纤维素膜细菌外任意一种细菌可以为大肠杆菌。
进一步地，所述在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点pMB1、R6K、RK2、Pro1600、ColE1、pBR322。
进一步地，基因编辑的序列为待失活的编码区或者非编码区的部分序列。
进一步地，步骤S3)中转入可生成纤维素膜细菌的方法为电转导或化学转导。
进一步地，所述可生成细菌纤维素细菌选自木醋杆菌、巴氏醋杆菌、木葡糖酸醋杆菌、汉氏葡糖醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、气杆菌、根瘤杆菌、无色杆菌、土壤杆菌、假单胞杆菌、产碱杆菌、八叠球菌、动胶菌中的至少一种。
本发明发现，利用等位交换的原理，当供体质粒和细菌基因组有一定长度同源臂就可以将供体质粒整合到其基因组中，进而对细菌基因组进行编辑。因此供体质粒的同源序列中必须包含目标基因或基因组特定位点同源的DNA序列。当用于特定基因修改时，同源臂必须且可以包含目标基因的部分DNA序列；当同于编辑基因组特定位点时，此同源序列由特定位点DNA序列和其连续的上游任意长度DNA序列组成。此外，若对基因组某一特定基因进行突变时，供体质粒与其对应的基因组中同源臂DNA序列不完全一致，供体质粒中的同源臂序列中对应位置单个或多个碱基要由原始碱基突变成设计的碱基。
有益效果
本发明利用单重组的方法，实现对可生成纤维素膜的细菌基因组快速，简便的基因修改。操作简单，用时短。
附图说明
图1：实施例1中单重组方法用于木醋杆菌基因组特定基因修改和特定位点基因插入的原理图。
其中，A为可生成纤维素膜细菌基因组中特定基因失活的原理图，B为向可生成纤维素膜细菌基因组中特定位点或失活特定基因的同时插入新基因的原理图，C为可生成纤维素膜细菌基因组中特定基因3’端融合外源蛋白的原理图，D为可生成纤维素膜细菌中目标基因点或小段突变的原理图，E为通过单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS进而调整其表达量的原理图。
图2：实施例1供体质粒图谱。其中A为pln2-acsC1’的供体质粒图谱，B为pln2-ccpAX’的供体质粒图谱,C为pln2-dgc2’的供体质粒图谱。
图3：实施例1PCR鉴定胶图以及DNA测序结果。其中A为acsC1组的结果，B为ccpAX’的结果，C为dgc2’的结果。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
结合图1的A说明可生成纤维素膜细菌基因组中特定基因失活的原理。图1A为本发明用于失活基因组中特定基因原理的示意图。
S1)根据实验目标，确定可生成纤维素膜细菌基因组中的目标失活基因(X)。随后根据目标基因序列确定同源臂序列(A’)，A’为目标失活基因X的部分序列，优选为位于目标失活基因X中间，A’的长度为至少10个碱基。为了方便理解，将基因组X基因中用作同源臂的序列也标为A’，因此目标修改基因X可表示为AA’A；
S2)制备供体质粒Pln2-A’，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因以及同源臂序列(A’)；其中同源臂序列只能由目标基因A的部分序列组成。在质粒骨架上的复制起始位点无法在具有在可生成纤维素膜细菌中自主复制。筛选基因是为了对重组菌进行筛选。
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，由于供体质粒中的复制起始位点无法在可生成纤维素膜细菌中自主复制，只能通过同源序列A’与基因组进行等位交换将质粒中的基因全部整合到可生成纤维素膜细菌的基因组中才能被复制。同时由于质粒中包含了筛选基因，通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，就可得到特定基因失活的可生成纤维素膜细菌的重组菌。例如当选择的筛选基因为抗生素抗性基因时，采用含有抗生素的培养基培养时未整合成功的细菌则无法存活，整合成功得到重组菌基因组中具有抗性基因表达，因此可以存活。同时重组菌由于等位交换后进行了整合，因此将原编码目标蛋白X的序列AA’A分成了两段，无法再表达原蛋白，实现了目标基因的失活。
结合图1的B说明向可生成纤维素膜细菌基因组中特定位点或失活特定基因的同时插入新基因的原理。图1B为本发明向可生成纤维素膜细菌基因组中特定位点或失活特定基因的同时插入新基因的原理示意图。
S1)根据实验目标，确定可生成纤维素膜细菌基因组中的目标插入位点或者基因。随后根据目标插入位点或者基因序列，确定同源臂序列(A’)。
S2)制备供体质粒pln2-B-A’，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因、待插入的新基因(B)和同源序列(A’)。其中待插入基因组的新基因B起始密码子前需要包含启动子和RBS序列，启动子和RBS根据实验中计划外源基因表达方式和强度决定，待插入的新基因在载体质粒上位置和转录方向不做要求；若将新基因插入基因组特定位点，同源臂A’必须由特定位点及其上游DNA序列组成；若插入新基因同时失活特定基因，其中同源臂序列只能由目标基因的部分序列组成。在质粒骨架上的复制起始位点无法在具有在可生成纤维素膜细菌中自主复制。筛选基因是为了对重组菌进行筛选。
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，由于供体质粒中的起始位点无法在可生成纤维素膜细菌中进行自主复制，只能通过同源的序列A’进行等位交换将质粒中的基因全部整合到可生成纤维素膜细菌的基因组中才能复制，由于质粒中包含了筛选基因，通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，就可得到在特定基因组位点或者基因中插入新基因的可生成纤维素膜细菌的重组菌。例如当选择的筛选基因为抗生素抗性基因时，采用含有抗生素的培养基培养时未整合成功的细菌则无法存活，整合成功得到重组菌基因组中具有抗性基因表达，因此可以存活。该重组菌通过等位交换后，即可将新的外源基因插入宿主菌基因组中特定位点或者在失活特定基因的同时插入新的基因到宿主基因组中。
结合图1的C说明可生成纤维素膜细菌基因组中特定基因3’端融合外源蛋白的原理。图1C为本发明可生成纤维素膜细菌基因组中特定基因3’端融合外源蛋白的原理示意图。
S1)根据实验目标，确定可生成纤维素膜细菌基因组中的目标融合基因X。随后根据目标融合基因序列，确定同源臂序列(A’)。为了方便理解，我们将基因组中用在同源臂的序列标为A’，因此目标融合基因X可表示为AA’.
S2)制备供体质粒pln2-A’-B，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因、待插入基因(B)和同源序列(A’)。其中待插入基因的外源基因起始密码子前不需要包含任何启动子和RBS，可包含小段连接用的氨基酸链(linker)的编码序列，待插入基因的转录方向必须与目标融合基因相同。供体质粒中同源臂序列只能由目标融合基因终止密码子上游10个以上碱基长度的部分DNA序列组成，且不包含其终止密码子。在质粒骨架上的复制起始位点无法在具有在可生成纤维素膜细菌中自主复制。筛选基因是为了对重组菌进行筛选。
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，由于供体质粒中的起始位点无法在可生成纤维素膜细菌中进行自主复制，只能通过同源的序列A’进行等位交换将质粒中的基因全部整合到可生成纤维素膜细菌的基因组中才能复制，由于质粒中包含了筛选基因，通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因组中特定基因融合表达的重组菌。例如当选择的筛选基因为抗生素抗性基因时，采用含有抗生素的培养基培养时未整合成功的细菌则无法存活，整合成功得到重组菌基因组中具有抗性基因表达，因此可以存活。该重组菌通过等为交换后，即可将新的外源基因与宿主菌基因组中特定基因进行融合。
结合图1D说明可生成纤维素膜细菌中目标基因点或小段突变的原理。图1D为本发明目标基因点或小段突变原理示意图。
S1)根据实验目标，确定可生成纤维素膜细菌基因组中的目标突变基因。随后根据目标突变基因序列以及计划突变位置，确定同源臂序列(mA)。为了方便理解，目标突变基因为X，同源臂的序列标为mA，因此目标突变基因X表示为AmA；
S2)制备供体质粒pln-mA，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因，以及同源臂(mA)。其中同源臂mA为目标基因部分DNA序列或者目标修改基因部分DNA序列和其连续的下游DNA序列。其中目标基因的部分DNA序列必须是包含突变位置碱基序列和终止密码子的连续DNA序列，优选地突变位置位于同源臂中间或者末端，同时除突变位置碱基外，其它碱基序列与目标基因及其下游序列100％同源。在质粒骨架上的复制起始位点无法在具有在可生成纤维素膜细菌中自主复制。筛选基因是为了对重组菌进行筛选。
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，由于供体质粒中的起始位点无法在可生成纤维素膜细菌中进行起始复制表达，只能通过同源的序列进行等位交换将质粒中的基因全部整合到可生成纤维素膜细菌的基因组中，由于质粒中包含了筛选基因，通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因编辑的可生成纤维素膜细菌重组菌。例如当选择的筛选基因为抗生素抗性基因时，采用含有抗生素的培养基培养时未整合成功的细菌则无法存活，整合成功得到重组菌基因组中具有抗性基因表达，因此可以存活。该细菌由于等位交换后进行了整合，即可将基因组中的目标基因的进行突变。
结合图1E说明通过单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS进而调整其表达量的原理。图1E为本发明通过单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS进而调整其表达量的原理示意图。
S1)根据实验目标，确定可生成纤维素膜细菌基因组中的目标突变基因X。随后根据目标基因，确定同源臂序列(tA)。为了方便区分和理解将基因组中X基因中用作同源臂的序列标为tA，即图中目标突变基因X以tAA行式展现；
S2)制备供体质粒pln2-P/R-A，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因、替换的启动子(P)或RBS(R)和同源臂序列(tA)。其中同源臂序列必须且只能由X基因从起始密码子开始的部分DNA序列组成。替换的启动子或RBS必须在同源臂的5’端，且方向与X基因转录方向一致；在质粒骨架上具有在可生成纤维素膜细菌中无法起始复制的复制起始位点，还包含筛选基因，筛选基因可以用于基因编辑后工程菌的筛选。
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，由于供体质粒中的起始位点无法在可生成纤维素膜细菌中进行自主复制，只能通过同源臂进行等位交换将质粒中的基因全部整合到可生成纤维素膜细菌的基因组中才能复制，由于质粒中包含了筛选基因，通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因编辑的可生成纤维素膜细菌重组菌。例如当选择的筛选基因为抗生素抗性基因时，采用含有抗生素的培养基培养时未整合成功的细菌则无法存活，整合成功得到重组菌基因组中具有抗性基因表达，因此可以存活。该重组菌通过等为交换后，目标基因的启动子或RBS就可被更改，随即其表达量进行改变。
实施例1单重组方法使木醋杆菌基因失活实验
选用木醋杆菌ATCC53582菌株为目标菌株，以分别失活其基因组中ccpAX、dgc2、acsC1基因为例。
在进行基因重组实验时，使用的载体质粒pln2只包含筛选标记的抗性基因aacC1和复制起始位点pMB1。pMB1复制起始位点在大肠杆菌中可复制，但在木醋杆菌中不可复制。因此，木醋杆菌只能通过与供体质粒中的同源臂发生等位交换，进而将整个载体质粒骨架整合到其基因组中才能在含有对应抗性的HS抗性板中生存下来(图1)。
如图2所示，实验中使用的含有ccpAX、dgc2、acsC1基因自身一部分片段(ccpAX’、dgc2’、acsC1’)的供体质粒，通过将供体质粒分别电转到木醋杆菌ATCC53582中，随后细菌借助单次等位基因交换将目的基因破坏为两段，从而实现基因失活。通过PCR鉴定以及对对应位置基因序列测序分析也证实本发明方法通过单重组的方法成功灭活ccpAX、dgc2、acsC1基因(图3)，同时也证实了单次重组技术用于可生成纤维素膜的细菌基因组修改的可行性。
菌种和生长条件：大肠杆菌TOP10菌株用于质粒构建、增殖以及目标质粒的初步筛选。木醋杆菌ATCC58532为宿主菌株。在所有实验中，大肠杆菌均使用LB肉汤用作生长培养基，木醋杆菌ATCC58532均使用Hestrin-Schramm(HS)培养基用作生长培养基。如需要添加抗生素，对大肠杆菌和木醋杆菌，庆大霉素使用浓度分别为15μg/mL和300μg/mL。所有的实验中，如非特别说明大肠杆菌和木醋杆菌培养温度分别为37℃和30℃。
重组质粒构建：1)首先利用PCR方法克隆目标片段(ccpAX’、dgc2’、acsC1’)基因，同时PCR克隆制备线性化的表达载体pln2；2)通过吉布森(Gibson assembly)无缝连接技术，分别将目标片段(ccpAX’、dgc2’、acsC1’)基因连接到载体上，构建出供体质粒。
单重组基因组重组操作步骤：1)测序验证后的质粒电转入木醋杆菌ATCC53582中，在含有300μg/mL庆大霉素的HS固体培养基培养；2)挑选单克隆点，用对应的引物鉴定基因组插入情况；3)将鉴定插入成功的片段切胶送测序。
Claims (10)
1.一种可生成纤维素膜细菌的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法包括以下步骤：
S1)确定可生成纤维素膜细菌中的目标修改的基因或位点，并根据目标修改的基因或位点确定用于和供体质粒进行等位交换的第一同源臂序列；
S2)制备供体质粒，所述供体质粒包含复制起始位点、筛选基因以及用于和可生成纤维素膜细菌基因组中第一同源臂序列进行等位交换的第二同源臂序列；
S3)将制备获得的供体质粒转入可生成纤维素膜细菌中，进行培养，并通过与所述筛选基因对应的筛选方法进行筛选，进而得到基因编辑的可生成纤维素膜细菌的重组菌；所述重组菌基因组的目标修改的基因或位点插入了线性化的供体质粒序列；
在供体质粒中的复制起始位点为在所述可生成纤维素膜细菌中无法自主复制的复制起始位点；
所述第一同源臂片段和第二同源臂序列分别为可生成纤维素膜细菌基因组以及供体质粒中能够进行等位交换的片段，除同于目标基因突变外，第二同源臂序列应与第一同源臂DNA序列完全一致；
优选地，基因编辑的序列为待失活的编码区或者非编码区的部分序列；
优选地，所述可生成细菌纤维素细菌选自木醋杆菌、巴氏醋杆菌、木葡糖酸醋杆菌、汉氏葡糖醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、气杆菌、根瘤杆菌、无色杆菌、土壤杆菌、假单胞杆菌、产碱杆菌、八叠球菌、动胶菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法为目标基因失活、目标基因特定位点突变、目标基因末尾基因融合表达、基因组特定位置外源基因的插入、单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS。
3.根据权利要求2所述的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法为目标基因失活，在步骤S1)中，第一同源臂序列为待失活目标基因的一部分，优选第一同源臂序列为位于待失活目标基因中间；或者
所述基因编辑方法为目标基因特定位点突变，在步骤S1)中，第一同源臂序列为目标基因部分序列或者目标基因部分序列和其连续的下游序列；其中所述目标基因部分序列为包含待突变位置碱基序列和终止密码子的连续DNA序列，优选地，待突变位置位于第一同源臂中间或者末端，同时除待突变位置碱基外，第二同源臂序列中其它碱基序列与第一同源臂100％同源；或者
所述基因编辑方法为目标基因末尾基因融合表达；在步骤S1)中，第一同源臂序列为目标基因且不包含目标基因终止密码子，但包含编码终止密码子前一个氨基酸序列的连续片段。优选的第一同源臂序列从不包含目标基因完整起始密码子序列的任意位置起始到编码其终止密码子前一个氨基酸的碱基终止；在步骤S2)中，供体质粒还包含待插入的外源基因；待插入基因的外源基因起始密码子上游不包含启动子和RBS，转录方向与目标基因转录方向一致，任选地，包含连接用的氨基酸链的编码序列；或者
所述基因编辑方法为基因组特定位置外源基因的插入，在步骤S1)中，在步骤S1)中，第一同源臂序列为待插入位点及其连续的上游序列；在步骤S2)中，供体质粒还包含待插入的外源基因，所述外源基因起始密码子前包含启动子和RBS序列。更进一步地，第一同源臂序列为待失活的目标基因中的部分序列；或者
所述基因编辑方法为单独或同时修改可生成纤维素膜细菌基因组中目标基因启动子和RBS，在步骤S1)中，第一同源臂为目标基因自起始密码子开始的部分序列；在步骤S2)中，供体质粒还包含替换的启动子和或RBS序列，替换的启动子和或RBS必须在同源臂的5’端，且转录方向与目标基因转录方向一致。
4.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述第二同源臂片段包含了目标修改的基因中的至少一部分，或者与目标修改的基因中的至少一部分同源，或者所述第二同源臂片段中至少一部分选自与目标修改的基因及其下游部分序列同源，与特定编辑位点及其上游部分序列同源。
5.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述第二同源臂片段中至少一部分选自与目标修改的基因及其下游部分序列同源或基本同源，与特定编辑位点及其上游部分序列同源或基本同源，所述基本同源为至少90％以上的序列同源，或至少95％以上的序列同源，或至少96％以上的序列同源，或至少97％以上的序列同源，或至少98％以上的序列同源，或至少99％以上的序列同源；或者所述基本同源为除1个碱基以外其他碱基同源，除2个碱基以外其他碱基同源，除3个碱基以外其他碱基同源除4个碱基以外同源，其他碱基同源除5个碱基以外其他碱基同源。
6.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，第一和或第二同源臂片段的长度为至少10个碱基，优选为15-1000个碱基。
7.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，步骤S2)中制备供体质粒的方法为：
S2-1)获得编辑包含目标的基因或位点的DNA序列的同源片段；
S2-2)将用于编辑目标的基因或位点的DNA序列的同源片段与表达载体质粒连接获得供体质粒，所述供体质粒包含在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点和筛选基因；
优选地，所述供体质粒还含有待插入细菌基因组的新基因及其启动子和核糖体结合位点(RBS)。
8.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，进一步地，所述筛选基因为抗生素抗性基因、荧光蛋白基因、标记蛋白基因，营养缺陷型筛选标记；
优选地，所述的抗生素抗性基因选自blatem、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aac6’－IIa、aacA4、aad(6’)、vanA、vanB、vanC、msrA、satA、aac(6’)－aph(2”)、vat、vga、ermA、ermB、ermC、mecA、int和sul。
9.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点选自在除可生成纤维素膜细菌外任意一种细菌中可以复制的复制起点；
优选地，所述在可生成纤维素膜细菌中不可复制的复制起始位点pMB1、R6K、RK2、Pro1600、ColE1、pBR322。
10.根据权利要求1所述的可生成纤维素膜细菌基因编辑方法，其特征在于，在步骤S3)后还包含通过聚合酶链式反应以及二代测序进行检测的步骤，以确定得到的可生成纤维素膜细菌的基因编辑结果是否准确；
优选地，所述聚合酶链式反应以及测序的方法为通过基因编辑位点上下游引物扩增基因编辑位点序列，并通过测序方法获得基因编辑位点序列；
优选地，步骤S3)中转入可生成纤维素膜细菌的方法为电转导或化学转导。
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