CN101978057A - 修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用供体DNA修饰宿主DNA中的对象区域的方法：其中所述供体DNA依序包括分别与宿主DNA中的对象区域外侧的5′-侧区、宿主DNA中的对象区域外侧的3′-侧区和宿主DNA中的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，并且在与3′-侧区同源的区域和与第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；该方法包括以下步骤：第一步骤，在5′-侧区和第一同源重组区的区域处进行供体DNA和宿主DNA之间的同源重组，从而基于第一选择性标记基因的表达选择与供体DNA整合的宿主；以及第二步骤，在通过第一步骤与供体DNA整合的宿主DNA内，在源自宿主DNA的3′-侧区和源自供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在表达诱导启动子的表达诱导条件下基于第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被修饰的宿主。本发明还涉及本方法中使用的选择性标记盒。

Description

修饰宿主DNA中的对象区域的方法和选择性标记盒
技术领域
本发明涉及修饰宿主DNA中的对象区域的方法，并且涉及选择性标记盒。
背景技术
在遗传工程领域，药物抗性基因已经用作人工选择转化体的工具。具体地，所需转化体可基于药物抗性基因来选择，该药物抗性基因的表达赋予耐药性。不仅药物抗性基因，而且，例如营养缺陷型基因，都用作选择转化体的工具。可用于选择转化体的这些基因通常称为选择性标记(选择性标记基因)。
选择性标记基因用于选择转化体。然而，此选择性标记基因取决于其种类，对环境表现出不利的不良作用，诸如如果选择性标记基因保留在宿主细胞中，选择性标记基因对野生型微生物的生物性污染。另外，如果在同一宿主上进行多基因操作，可以使用的选择性标记基因的种类可能受到限制。因此原因，需要开发用于从转化体中去除选择性标记基因的工具。
当通过从宿主基因组中删除特定区或通过将外源DNA插入至宿主细胞中而构建突变体时，也使用选择性标记基因。
例如，JP-A-2007-111015公开了一种通过使用阻遏物和由该阻遏物调控的启动子来删除宿主基因组中的特定区的方法。具体地，该方法公开了DNA片断(供体DNA)通过同源重组整合进宿主基因组中，然后通过供体DNA的区域与宿主基因组的区域之间的同源重组使供体DNA和宿主基因组中的特定区均从宿主基因组删除。在此方法中，供体DNA含有选择性标记和编码阻遏物的基因，并且宿主基因组含有处于阻遏物的控制下的启动子和处于启动子的控制下的药物抗性基因。通过源自供体DNA的选择性标记可以选择其中供体DNA掺入进宿主基因组中的转化体。另外，当供体DNA整合进宿主基因组中时，宿主细胞通过阻遏药物抗性基因的表达而形成药物敏感性。供体DNA从宿主基因组中去除后，药物抗性基因的表达恢复，从而得到耐药的宿主细胞。结果，有可能使宿主基因组的特定区缺失而不将源自供体DNA的选择性标记留在宿主基因组中。
如上所解释，JP-A-2007-111015的方法的有利之处在于选择性标记基因可以有效地使用。然而，该方法需要预先将表达盒引入至宿主基因组的附加步骤，所述表达盒包含处于阻遏物的控制下的启动子和在启动子的控制下表达的药物抗性基因。
在克隆基因或DNA片断时，难以将编码膜蛋白的基因、编码当蛋白大量存在时在宿主中起到致死因子作用的蛋白(大量蛋白的存在在宿主细胞中起到致死因子的作用)的基因、尺寸非常大的DNA片断等插入至质粒中。当多种基因参与特定的生物合成或多种基因构成亚单位时，也难以插入这些基因并且同时地在细胞中表达它们。为了克服克隆此类基因或DNA片断的问题，已经提出了使用低复制质粒的方法、使用通常用于制备基因组文库的噬菌体或粘粒作为载体的方法、及类似方法。另外，也已经提出了使用可以严格地调控基因表达的启动子的方法和改善宿主大肠埃希氏菌的伴侣功能的方法。
然而，改善宿主的方法经常取决于所需产物的特异性，并且需要选择和调节适于该特异性的克隆方法。在使用噬菌体或粘粒的方法中，也难以将多种基因插入至细胞的多个基因位点中。
因此，存在着开发与使用噬菌体的常规方法相比以简单的步骤将多个和相对大尺寸的DNA片断插入至单细胞中的方法的需求。近年来，获自环境材料的DNA通过宏基因组分析的方式进行了积极的研究。存在着对难以通过常规方法克隆的基因和DNA片断进行克隆的新工具和新方法的需求。
发明内容
如上所述，用于修饰宿主DNA和获得转化体的常规遗传操作方法存在选择性标记留在转化体中的问题。
JP-A-2007-111015的方法包含预先将表达盒引入至宿主基因组中的必需步骤。因此，该方法对于改善操作效率并不完全令人满意。另外，即使在特定区从宿主基因组中删除后，先前引入的表达盒仍然留在宿主基因组中。
在使用质粒的常规遗传操作方法中，难以将大尺寸DNA片断或致死基因引入至宿主DNA的所需区中。此外，在使用噬菌体或粘粒的常规方法中，不可能将多个基因插入至单细胞的多个位点中。
本发明要提供一种修饰宿主DNA中的对象区域的方法；其中该方法能够以简单的步骤修饰宿主DNA中的对象区域而不限制可以使用的选择性标记(选择性标记基因)的种类，并且修饰宿主DNA中的对象区域而不会在被修饰的宿主DNA中留下修饰步骤中使用的选择性标记等；并且本发明要提供一种用于该方法中的选择性标记盒。
具体地，本发明要提供一种通过使宿主DNA中的所需区缺失，并且在缺失后，还不会在宿主DNA中留下选择性标记基因等来修饰宿主DNA的方法。本发明还要提供一种通过用所需的DNA序列(特别是，例如，大尺寸DNA片段、难以引入至宿主中的DNA片段、或多种基因(多基因))替换宿主DNA中的任何区，并且在替换后，仅留下插入至宿主DNA的所需DNA序列，而不留下选择性标记基因等来修饰宿主DNA的方法。
根据本发明，提供以下方式：
根据本发明的修饰宿主DNA中的对象区域的方法(此后，称为本发明的修饰方法)是一种使用供体DNA修饰宿主DNA中的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的所述对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA中的所述对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的所述对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
该方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区与源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被修饰的宿主。
根据本发明的删除宿主DNA中的用于删除的对象区域的方法(此后，称为本发明的删除方法)是一种使用供体DNA删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于删除的对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA中的用于删除的对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的用于删除的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
该方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区与源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域删除的宿主。
根据本发明的替换宿主DNA中的用于替换的对象区域的方法(此后，称为本发明的替换方法)是一种使用供体DNA替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的用于替换的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，包括与所述5′-侧区同源的区域和与所述3′-侧区同源的区域之间的所需DNA序列，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
该方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区与源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被所需DNA序列替换的宿主。
在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中，可通过例如，正向选择(positive selection)来进行基于第二选择性标记基因的表达的第二步骤中的宿主选择。
此后，其对象区域被修饰的宿主、其对象区域删除的宿主或其对象区域被所需的DNA序列替换的宿主将简单地称为“转化体”或“突变体”。
在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中，第二选择性标记基因不特别地限制，但可以是，例如，编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因。编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因不特别地限制，但可以是，例如，chpA基因。
在这种情况下，通过第二步骤从宿主DNA中删除源自供体DNA的选择性标记基因的宿主可以增殖。另一方面，含有保留了源自供体DNA的选择性标记基因的基因组的宿主在表达诱导条件下不能增殖。正向选择允许选择不含有源自供体DNA的选择性标记基因的宿主。
在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中，表达诱导启动子不特别地限制，但可以是在表达诱导物的存在下诱导下游基因的表达的启动子。
此外，在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中，第一选择性标记基因不特别地限制，但可以是，例如，药物抗性基因。具体地，有可能防止选择性标记基因留在宿主DNA中，因为根据本发明的修饰方法、删除方法和替换方法，选择性标记基因从宿主DNA中除去。
此外，在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中，可以使用的宿主的种类不特别地限制，但例如，可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
用于本发明中的选择性标记盒具有第一选择性标记基因、诱导表达启动子和在表达诱导启动子下表达的第二选择性标记基因。在供体DNA中，选择性标记盒位于与对象区域外侧的3′-侧区同源的区域和与对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域之间。
第二选择性标记基因优选地编码诱导宿主细胞死亡的蛋白。具体地，chpA基因优选地用作第二选择性标记基因。表达诱导启动子优选是在表达诱导物的存在下诱导下游基因表达的启动子。作为第一选择性标记基因，可以优选地使用药物抗性基因。根据本发明的选择性标记盒可以处于掺入在枯草芽孢杆菌基因组中的状态。
此外，本发明要提供一种产生通过上述本发明的修饰方法、删除方法和替换方法修饰对象区域的宿主的方法。
根据本发明的方法，有可能以简单的步骤修饰宿主DNA中的所需区域。
根据本发明，在修饰过程(包括删除过程和替换过程)中使用的第一选择性标记基因或第二选择性标记基因在修饰后均不保留于宿主DNA中。因此，有可能制备所需的转化体而不限制可以使用的选择性标记基因的范围。特别是当修饰宿主DNA中的多个区域时，与选择性标记基因保留在宿主中的常规基因修饰方法相比，根据本发明的修饰过程可以大大简化，因为可以使用任意的选择性标记基因而没有限制。除了选择性标记基因以外，根据本发明，修饰过程中使用的其他区域(诸如第一同源重组区、启动子序列等)在修饰后不保留在宿主DNA中。因此，当在同一宿主中反复地进行多次修饰时，根据本发明的修饰过程也可以简化。
根据本发明，还有可能防止由选择性标记基因残留在宿主中所导致的对环境的不良作用。例如，如果药物抗性基因携带在致病株(即，耐药微生物)中，则存在关于环境污染的问题。引入药物抗性基因的菌株通常作为重组生物体处理，并且其需要防止菌株传播至环境中。因此，使用此类菌株的操作步骤更为复杂，诸如限制了菌株的生产、使用和储藏中的处理，并且需要防止菌株的扩散。本发明有效地用于由残留选择性标记基因所导致的此类环境污染。
此外，根据本发明，用于修饰的对象区域不限于宿主DNA中的特定位置，并且宿主DNA中的任何区域可作为用于修饰的对象区域进行修饰。
此外，根据本发明，宿主DNA中的较宽区域可用作用于修饰的对象区域。更具体地，宿主DNA中的较宽区域可被删除或替换。
附图说明
[图1]图1是显示根据本发明的删除宿主DNA中的对象区域的方法的一个实施方式的流程图。
[图2]图2是显示根据本发明的替换宿主DNA中的对象区域的方法的一个实施方式的流程图。
[图3]图3是显示使用SOE-PCR片段通过双交换法(doublecrossover method)引入药物抗性基因的过程的流程图。
[图4]图4是显示作为根据本发明的修饰宿主DNA中的对象区域的方法的一个实施方式，将所需DNA序列插入至引入了药物抗性基因的宿主DNA中的过程的流程图。
[图5]图5是显示制备实施例1和2中使用的Bacillus subtilis 168(aprE::spec，lacI，Pspac-chpA)和Bacillus subtilis 168(aprE::Km，lacI，Pspac-chpA)的过程的流程图。
[图6]图6是显示实施例1中从宿主DNA中删除对象区域的过程的流程图。
[图7]图7是显示实施例2中将DNA序列插入至宿主DNA中的过程的流程图。
从下面的描述，适当地参考附图，将更充分地显示本发明的其他和进一步的特征和优点。
具体实施方式
此后，本发明将参考附图详细地说明。
在本发明中，术语“修饰宿主DNA中的对象区域”是指宿主DNA中的对象区域的DNA序列被改变或修饰。具体地，其是指对象区域的DNA序列从宿主DNA中删除，或宿主DNA中的对象区域的DNA序列被所需的DNA序列替换以便将所需的DNA序列插入至宿主DNA中。因此，本发明的修饰方法包括本发明的删除方法和本发明的替换方法作为优选的实施方式。此后，在本说明书中，包括本发明的删除方法和替换方法的本发明的修饰方法简单地称为“本发明”或“本发明的方法”。
本发明的删除宿主DNA中的用于删除的对象区域的方法的实施方式显示在图1中。
本发明的替换宿主DNA中的用于替换的对象区域的方法的实施方式显示在图2中。根据图2所示的实施方式，宿主DNA中的对象区域的DNA序列可以用所需的DNA序列替换，并且所需的DNA序列可以插入至宿主DNA中。
首先，将解释根据本发明的对象区域。
在本发明中，术语“宿主DNA中的对象区域”是指存在于宿主DNA中的其中DNA序列待修饰的任何区域。具体地，在本发明的删除方法的情况下，对象区域是用于删除的对象区域，即，有意从宿主DNA中删除的区域。在本发明的替换方法的情况下，对象区域是用于替换的对象区域，即，有意用所需的DNA序列替换的宿主DNA中的区域。此后，本说明书中的术语“对象区域”包括用于删除的对象区域和用于替换的对象区域。
对象区域的实例包括宿主DNA的不需要的区域，诸如宿主中不需要用于产生物质的区域(例如，孢子形成相关基因)、抑制宿主生长或产生物质的区域(例如，噬菌体区)、在宿主中复制的基因或基因群(例如，双组分调节基因)等。
在本发明中，如果对象区域在应用本发明的方法前存在于宿主DNA中，其可以是任何区域。对象区域包括固有区或在应用本发明的方法前人工引入的区域。人工引入的区域的实例包括包含选择性标记基因的区域、包含报告基因的区域等。
在本发明的方法中，对象区域的大小不特别地限制，但优选1bp或以上，更优选0.2kb或以上，并且最优选0.5kb或以上。对象区域的大小优选为200kb或以下，更优选160kb或以下，还更优选120kb或以下，特别优选80kb或以下，且最优选40kb或以下。如果对象区域的大小为200kb或以下，则非常有可能在对象区域中不存在对生长必不可少的基因。如本文所使用，“对生长必不可少的基因”是指如果其从宿主基因组中删除会导致宿主细胞死亡的基因，以及编码具有不能被代偿的功能的蛋白的基因，例如通过向培养基中外源性地添加物质。换句话说，如果通过向培养基中添加任何补充物质(例如，代谢相关物质)宿主可以增殖，若其从宿主基因组中删除会导致宿主细胞死亡的基因可以包含在对象区域中。在Bacillus subtilis中不包含对生长必不可少的基因的最大区域为约200kb的从dltA基因至yycH基因的区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，4679(2003))。
首先，在本发明的方法中，识别宿主DNA中的对象区域外侧5′-侧区和对象区域外侧3′-侧区。在本发明中，对象区域外侧5′-侧区和对象区域外侧3′-侧区的每一个都是指邻接对象区域但不包含对象区域的区域。即，对象区域位于对象区域外侧5′-侧区和对象区域外侧3′-侧区之间。此后，对象区域外侧5′-侧区将称为“5′-外侧区”，对象区域外侧3′-侧区将称为“3′-外侧区”。通过使用含有有机体基因组的核苷酸序列信息的数据库可以识别5′-外侧区和3′-外侧区的核苷酸序列，并且也可以通过分析对象区域的核苷酸序列和其邻近的核苷酸序列来识别5′-外侧区和3′-外侧区的核苷酸序列。在本说明书中，术语5′和3′要被理解为他们与双链核酸中的一条链相关。在图1和图2中，5′-外侧区由A表示，而3′-外侧区由B表示。
下一步，识别第一同源重组区。第一同源重组区位于宿主DNA中的对象区域内部。在本发明中，第一同源重组区是指可以与上述的5′-外侧区一起在供体DNA和宿主DNA之间进行第一同源重组的区域。在图1和图2中，第一同源重组区由C表示。第一同源重组区C可以位于靠近5′-外侧区的位置处，但优选是在朝向3′-区的方向与5′-外侧区分隔0kb至200kb、特别优选0kb至140kb的区域。
类似于上述的对象区域，如果在应用本发明的方法前第一同源重组区存在于宿主DNA中，其可以是任何区，因为第一同源重组区位于对象区域内部。第一同源重组区可以是固有区或在应用本发明的方法前人工引入的区域。人工引入的区域的实例包括包含选择性标记基因的区域、包含报告基因的区域等。
如果在宿主DNA的5′-外侧区和3′-外侧区之间没有具有足够长度的第一同源重组区；或者，如果在5′-外侧区和3′-外侧区之间完全没有DNA序列，有可能通过使用常用的遗传操作方法将已知的DNA序列(例如，药物抗性基因的DNA序列等)插入至宿主DNA中而形成第一同源重组区。例如，如图3中所示，源自宿主DNA的A区，源自宿主DNA的B区和药物抗性基因序列通过SOE(通过重叠延伸拼接)-PCR法构建(参见，例如，Horton，RM.等人：Gene，77，pp.61-68(1989))并且药物抗性基因可以通过宿主DNA的A区和B区之间的双交换同源重组而引入至宿主DNA中。
通过如上所述使用事先用诸如药物抗性基因的DNA序列作为第一同源重组区而引入的宿主DNA，有可能通过本发明的替换方法仅将所需的DNA序列插入至宿主DNA中，同时保留宿主DNA的天然序列(参见图4)。在这种情况下，事先作为第一同源重组区插入的DNA序列通过后面所述的第二同源重组步骤从宿主DNA中去除，并且其在修饰后不留在宿主DNA中(参见图4(iv))。本发明的方法包括将所需DNA序列插入至对象区域中同时保留宿主DNA序列的方法。
在确定5′-外侧区后，使用本发明识别宿主DNA中的3′-外侧区和第一同源重组区、供体DNA。
在本发明中，供体DNA可用于修饰、删除和替换位于宿主DNA的5′-外侧区和3′-外侧区之间的对象区域(用于删除的对象区域和用于替换的对象区域)。可用于本发明的供体DNA具有以下列顺序的与宿主DNA的5′-外侧区A同源的区域、与宿主DNA的3′-外侧区B同源的区域和与宿主DNA的第一同源重组区C同源的区域。(此后，这些区域的每一个均称为“同源区”。)除了三个同源区以外，供体DNA在3′-外侧区B和第一同源重组区C的同源区之间具有选择性标记盒(参见图1(i)和图2(i)中的供体DNA)。此后，供体DNA的这些同源区也将简单地称为供体DNA的5′-外侧区、供体DNA的3′-外侧区和供体DNA的第一同源重组区。在图1和2中，供体DNA的5′-外侧区表示为A；3′-外侧区表示为B；供体DNA的第一同源重组区表示为C。
选择性标记盒是具有第一选择性标记基因M1、表达诱导启动子和在表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因M2的核苷酸片段。
在本发明中，供体DNA的5′-外侧区、供体DNA的3′-外侧区和供体DNA的第一同源重组区参与在宿主DNA和供体DNA之间的同源重组过程中的或在供体DNA掺入至宿主DNA后宿主DNA中同源重组过程中的两条DNA链之间的遗传交换。因此，供体DNA的5′-外侧区、供体DNA的3′-外侧区和供体DNA的第一同源重组区的每一个具有足够高的序列同源性(同一性)，从而进行这些区和宿主DNA的相应区之间的同源重组。
各个区之间的核苷酸序列同源性通过例如Lipman-Pearson法来计算(Science，227，1435，(1985))。具体地，其可以通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software Development)的同源性分析(同源性搜索)程序来进行分析而计算，而比较的单位大小(ktup)设置为2。计算结果显示各个区的核苷酸序列优选具有60％或以上、更优选80％或以上、还更优选90％或以上、特别优选95％或以上、且最优选99％或以上的同源性。
供体DNA或宿主DNA中5′-外侧区、3′-外侧区和第一同源重组区的大小不特别地限制，条件是该大小适于形成链间交换结构，并且例如，优选为0.1kb至3kb，更优选0.5kb至3kb，并且特别优选0.5kb至2kb。
下一步，将说明根据本发明的选择性标记盒。根据本发明的选择性标记盒具有第一选择性标记基因M1、表达诱导启动子、和在表达诱导启动子的调控下表达的第二选择性标记基因M2。选择性标记盒位于供体DNA的3′-外侧区和供体DNA的第一同源重组区之间。
选择性标记盒的大小不特别地限制，但优选3kb至10kb，更优选3kb至5kb。
可用于本发明的第一选择性标记基因M1不特别地限制，并且其实例包括药物抗性基因(氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因和杀稻瘟菌素S抗性基因等)。或者，可以使用营养需要相关基因作为第一选择性标记基因M1。
在本发明中，第一选择性标记基因M1优选是药物抗性基因，最优选是壮观霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。
根据本发明的第二选择性标记基因M2不特别地限制，只要其是不同于上述的第一选择性标记基因M1的基因并且是如果其从宿主DNA中被去除显示可选择的表型的基因。
作为第二选择性标记基因M2，可以使用例如lacZ基因(β-内酰胺酶编码基因)。当lacZ基因表达细胞在含有x-gal的培养基中培养时，x-gal被分解，并且因此可以观察到蓝色集落。因此，如果使用lacZ基因作为第二选择性标记基因M2，缺少第二选择性标记基因M2的细胞形成正常颜色的集落，由此通过观察集落的颜色而选择所需的转化细胞。如果lacZ基因表达细胞在含有乳糖的MacConkey培养基中培养，可以观察到乳糖的分解。因此，如果使用lacZ基因作为第二选择性标记基因M2，缺少第二选择性标记基因M2的细胞不导致乳糖分解，由此通过观察培养基中乳糖的浓度来选择缺少标记基因的细胞。
作为第二选择性标记基因M2，可使用amyE基因(淀粉酶编码基因)。在含淀粉的培养基中培养amyE基因表达细胞能够观察通过淀粉组分的分解而形成的晕圈(halo formation)。因此，如果amyE基因用作第二选择性标记基因M2，缺少第二选择性标记基因M2的细胞不导致淀粉组分的分解，由此通过观察存在晕圈形成与否而选择所需的细胞。
作为第二选择性标记基因M2，可以使用编码通过激发光而发光的蛋白的基因，诸如gfp基因(yfp基因、cfp基因、bfp基因或rfp基因)。例如，如果使用gfp基因作为第二选择性标记基因M2，具有第二选择性标记基因M2的细胞能够观察到荧光，而缺少第二选择性标记基因M2的细胞不能观察到荧光。由此有可能通过观察细胞的荧光来选择缺少第二选择性标记基因M2的细胞。
第二选择性标记基因M2优选是导致细胞死亡的基因(此后，称为致死基因)。致死基因的实例包括编码细胞增殖抑制蛋白的基因，诸如chpA基因(核糖核酸酶编码基因)或ccdB基因(DNA促旋酶抑制剂编码基因)、Kid基因、RelE基因、SymE基因(核糖核酸内切酶编码基因)、Hok基因、TxpA基因(溶胞肽编码基因)、Doc基因(蛋白合成抑制相关基因)和PerE基因(DNA促旋酶抑制相关基因)。其中，可以在本发明中使用的致死基因更优选地是编码细胞增殖抑制蛋白的基因，诸如chpA基因(核糖核酸酶编码基因)或ccdB基因(DNA促旋酶抑制剂编码基因)。表达诸如chpA基因的致死基因的细胞不增殖并且死亡。如果诸如chpA基因的致死基因用作第二选择性标记基因M2，缺少第二选择性标记基因M2的细胞可以增殖并生长，并且由此有可能通过观察集落形成来选择所需的转化体。
chpA基因已知作为编码mazF毒素(一种大肠埃希氏菌的毒素)的基因。chpA基因的核苷酸序列显示为SEQ ID No.1，并且由chpA基因编码的毒素的氨基酸序列显示为SEQ ID No.2。
供体DNA中的第二选择性标记基因M2或选择性标记盒放置在其表达处于表达诱导启动子的控制下的位置处。在本发明中，术语“表达诱导启动子”是指仅在特定的条件下具有诱导基因表达的功能的启动子。特定条件的实例包括诱导物质(诱导物)的存在、培养基组分诸如碳源的存在、温度等。
可以在本发明中使用的表达诱导启动子优选是在诱导物质(诱导物)的存在下具有诱导下游基因表达的功能的启动子。
表达诱导启动子的实例包括，但不限于在异丙基-β-D-硫代-吡喃半乳糖苷(IPTG)的存在下诱导表达的lac启动子和spac启动子、木糖诱导性启动子、阿拉伯糖诱导性启动子、ECF sigma因子特异性启动子(参见，例如，Bacillus subtilis and its closest relatives(枯草芽孢杆菌及其最近的亲属)289-312页，RNA polimerase and Sigma factors(RNA聚合酶和Sigma因子)，J.Helmann和C.Moran Jr.，Editors：A.Sonenshein，J Hoch，R Losick：ASM Press)、由Mg/Cu双组分调节系统调控的启动子等。其中，在本发明中优选使用spac启动子。
如果使用lac启动子或spac启动子，则供体DNA或选择性标记盒包含编码在缺少IPTG时抑制这些启动子的阻遏物的lacI基因。阻遏物编码基因，lacI基因，也位于供体DNA的3′-外侧区B和第一同源重组区C之间。
可以通过使用常规的遗传操作技术来制备供体DNA，其包括5′-外侧区A、3′-外侧区B、第一选择性标记基因M1、表达诱导启动子、第二选择性标记基因M2和第一同源重组区C。为了制备供体DNA，可以使用，例如，DNA片段诸如PCR产物、整个基因组或其部分、质粒、往复载体、辅助质粒、噬菌体DNA、病毒载体、BAC DNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8242(1990))和YAC DNA(Science 236，806(1987))等。此外，可以使用DNA片段、在质粒中克隆的部分基因组DNA等、往复载体、辅助质粒、噬菌体DNA、病毒载体、BAC和YACDNA等。
质粒的实例包括Escherichia coli来源的质粒(例如，pET质粒诸如pET30b，pBR质粒诸如pBR322和pBR325，pUC质粒诸如pUC118、pUC119、pUC18和pUC19，pBluescript质粒等)、Bacillus subtilis来源的质粒(例如，pUB110、pTP5等)、酵母来源的质粒(例如，YEp质粒诸如YEp13，YCp质粒诸如YCp50等)等。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(例如，Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)和PBS1噬菌体(参见，例如，J.Bacteriol.90，1575(1965))。此外，可以使用动物病毒载体诸如逆转录酶病毒或牛痘病毒，植物病毒载体诸如花椰菜花叶病毒，和昆虫病毒载体诸如杆状病毒。或者，如果使用LP(原生质体的溶解)转化法(参见，例如，T.Akamatsu和J.Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T.Akamatsu和H.Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829)，例如，可以使用本身具有供体DNA的微生物诸如Bacillus subtilis。
下面将更详细地描述本发明的替换方法中使用的供体DNA。
本发明的替换方法中使用的供体DNA除了上述供体DNA的构造以外，还在供体DNA的5′-外侧区和供体DNA的3′-外侧区之间具有所需的DNA序列(参见图2(i)：供体DNA)。
在本发明中，“所需的DNA序列(此后，也称为“目的DNA序列”)”可以是任何的DNA序列，条件是其可以插入至宿主DNA的对象区域中。其实例包括编码蛋白的基因、编码调节物诸如启动子的基因、和类似基因。所需的DNA序列可以包含多个这些基因。例如，所需的DNA序列可以具有启动子序列和编码蛋白的基因序列，或多个调节物序列和多个基因序列。
在本发明的替换方法中，插入的所需的DNA序列的大小不特别地限制，条件是供体DNA可以引入至宿主细胞中，但优选为1bp或以上和10kb或以下，更优选1bp或以上和5kb或以下。
可在本发明中使用的所需的DNA序列的制备方法不特别地限制，并且所需的DNA序列可以通过已知方法诸如PCR法和使用DNA连接酶的方法来设计和制备。例如，DNA序列与任何启动子序列和任何基因序列组合可以制备成所需的DNA序列，然后插入至宿主DNA的所需区域中。
所需的DNA序列或供体DNA不总是PCR产物。例如，用限制性酶消化的所需的DNA序列可以通过使用DNA连接酶连接进供体DNA的5′-外侧区和3′-外侧区之间的区域，且获得的DNA片段(5′-外侧区-所需的DNA序列-3′-外侧区)可以通过PCR法扩增，然后扩增产物和选择性标记盒可以通过使用DNA连接酶彼此连接以制备供体DNA。
根据本发明的替换方法，有可能通过用所需的DNA序列替换宿主DNA中的对象区域来将所需的DNA序列插入至宿主中。通过使用本发明的替换方法，有可能以简单容易的步骤将通过使用质粒的常规方法难以克隆的DNA片段(例如，大尺寸的DNA序列、编码膜蛋白的基因、当引入至宿主细胞中时显示毒性并且耐受插入至多复制质粒中的基因、或包含多个基因群、多个调节物等的DNA序列)插入至宿主DNA中。也有可能通过本发明的替换方法将多个大尺寸的DNA片段插入至宿主DNA中的多个位点(基因座位)中。
因此通过本发明的替换方法有可能将基因群，诸如编码形成生物合成系统的蛋白的基因群和编码当表达时起到蛋白复合物作用的蛋白的基因群，插入至同一细胞中。结果，有可能通过同时在细胞中表达基因群的插入基因而在细胞中进行基因群的功能分析。近年来在宏基因组分析中，从环境样品回收的DNA被克隆进用于测序的质粒中。环境中存在的DNA包含许多不可能被克隆进质粒中的DNA片段。本发明的替换方法还可以用于此类DNA片段的克隆和该DNA片段中的基因的功能分析。
在本发明中，供体DNA通过上述的步骤构建，并且被引入至宿主DNA中用于宿主DNA中的对象区域的修饰、删除或替换。
根据本发明的宿主DNA包括有机体中的基因组DNA、线粒体DNA等。
根据本发明的宿主(受体)的实例包括芽孢杆菌属诸如Bacillus subtilis，埃希氏杆菌属诸如Escherichia coli，和假单胞菌属诸如Pseudomonas putida(恶臭极毛杆菌)；酵母诸如Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)和Schizosaccharomyces pombe(粟酒裂殖酵母)；动物细胞诸如猿猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和小鼠L细胞；昆虫细胞诸如Sf9；植物诸如禾本科(Poaceae)(米(Oryza sativa)、谷物(Zea mays))、十字花科(Brassicaseae)(阿拉伯芥(ThaleCress)(Arabidopsis thaliana))、茄科(Solanaceae)(烟草(Nicotiana tabacum)和豆科(Fabaceae)(大豆(Glycine max))；等。具体地，Bacillus subtilis优选地用作根据本发明的宿主。
在本发明中，将供体DNA引入至宿主中的方法不特别地限制，条件是其是将DNA引入至细胞中的方法。例如，可以使用采用钙离子的方法、电穿孔法和类似方法。
当使用Bacillus subtilis作为宿主时，可以使用感受态细胞转化法(参见，例如，J.Bacterial.93，1925(1967))或LP转化法(参见，例如，T.Akamatsu和J.Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T.Akamatsu和H.Taguchi，Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，2001，65，4，p.823-829)。
当酵母用作宿主时，引入DNA的方法不特别地限制，条件是其可以将DNA引入至酵母中。例如，可以使用电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法和类似方法。
当使用动物细胞作为宿主时，将DNA引入至动物细胞中的方法的实例包括电穿孔法、磷酸钙法、脂转染(lipofection)法和类似方法。当昆虫细胞用作宿主时，将DNA引入至昆虫细胞中的方法的实例包括磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法和类似方法。当植物用作宿主时，将DNA引入至植物细胞中的方法的实例包括电穿孔法、农杆菌法、粒子炮(particle gun)法、PEG法和类似方法。
在本发明中，在通过上述方法将供体DNA引入至宿主中后，供体DNA和宿主DNA在同源重组的条件下彼此接近，从而导致在5′-外侧区A和第一同源重组区C的区域处供体DNA和宿主DNA之间的双交换同源重组(在图1和2中，“第一同源重组”)。作为双交换同源重组的结果(第一同源重组)，在本发明的删除方法中，供体DNA的3′-外侧区B、第一选择性标记基因M1和第二选择性标记基因M2可以引入至宿主DNA的5′-外侧区A和宿主DNA的第一同源重组区C之间的位置(参见图1(ii))。在本发明的替换方法中，供体DNA的所需DNA序列、供体DNA的3′-外侧区B、第一选择性标记基因M1和第二选择性标记基因M2可以引入至宿主DNA的5′-外侧区A和宿主DNA的第一同源重组区C之间的位置中(参见图2(ii))。
术语“同源重组的条件”是指其中宿主的固有功能诸如重组反应相关酶的功能没有丧失的条件。
进行供体DNA和宿主DNA之间的重组的方法的实例包括一般的感受态细胞转化法(参见，例如，J.Bacterial.93，1925(1967))、原生质体转化法(参见，例如，Mol.Gen.Genet.168，111(1979))、电穿孔法(参见，例如，FEMS Microbiol.Lett.55，135(1990))和LP转化法(参见，例如，T.Akamatsu和J.Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T.Akamatsu and H.Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829)。
如果宿主是Bacillus subtilis，例如，转化可以以如下方式根据感受态细胞转化法来进行(参见，例如，J.Bacterial.93，1925(1967))。
宿主细胞在SPI培养基(0.20％(W/V)硫酸铵、1.40％(W/V)磷酸氢二钾、0.60％(W/V)磷酸二氢钾、0.10％(W/V)柠檬酸三钠二水合物、0.50％(W/V)葡萄糖、0.02％(W/V)水解酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.25μM氯化锰和50μg/ml色氨酸)中于37℃下振摇培养，例如，至约1的生长率(O.D.600)。在振摇培养后，部分培养溶液接种在9倍体积的SPII培养基(0.20％硫酸铵、1.40％(W/V)磷酸氢二钾、0.60％(W/V)磷酸二氢钾、0.10％(W/V)柠檬酸三钠二水合物、0.50％(W/V)葡萄糖、0.01％(W/V)水解酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.40μM氯化锰、5μg/ml色氨酸)中，并且将混合物振摇培养，例如，至约0.4的生长率(O.D.600)，从而制备宿主细胞的感受态细胞。
然后供体DNA加入至宿主株的感受态细胞。加入的供体DNA的量不特别地限制，但优选100pg至100μg，且更优选1ng至10μg。感受态细胞优选地以105至109CFU，且更优选地以106至108CFU使用。供体DNA加入至宿主株的感受态细胞中，并且细胞培养1小时至2小时。
在上述的步骤中，供体DNA引入至宿主细胞中，从而导致供体DNA和宿主DNA之间的第一同源重组(参见图1(i)至(ii)和图2(i)至(ii)，“第一同源重组”)。
在第一同源重组后，可以基于来自供体DNA的第一选择性标记基因的表达来选择重组宿主。因为在第一同源重组后第一选择性标记基因在重组宿主中表达，因此有可能在第一同源重组后通过观察标记基因的表型从其他的宿主中选择重组宿主。例如，当上述的药物抗性基因用作第一选择性标记基因时，可以选择具有药物抗性的宿主细胞。
在单个集落分离后，通过第一同源重组获得的重组宿主(例如，Bacillus subtilis的转化体)培养0至48小时(优选1至24小时，特别优选2至3小时)，从而进行宿主DNA中的两个3′-外侧区之间的同源重组(第二同源重组；参见图1(iii)和图2(iii))。第二同源重组导致宿主DNA中的对象区域的修饰以及第一选择性标记基因和第二选择性标记基因从宿主DNA的删除(参见图1(iv)和图2(iv))。因为第一选择性标记基因的删除，在第二同源重组后获得的转化体的表型已经改变。当药物抗性基因用作第一选择性标记基因时，通过第一同源重组获得的药物抗性丧失，并且由此，转化体显示药物敏感表型。
第二同源重组后，在表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因也从宿主DNA中删除。因此，在通过第二同源重组修饰的宿主中没有表达第二选择性标记基因，即使宿主细胞在表达诱导条件下培养。
如果第二同源重组不成功，则表达诱导启动子和第二选择性标记基因留在宿主DNA中。在此情况下，第二选择性标记基因在表达诱导条件下在宿主中表达。
以此方式，有可能基于第二选择性标记基因的表达从其他宿主中选择具有第二同源重组的宿主。
当lacZ基因用作第二选择性标记基因时，有可能基于含有x-gal的培养基上x-gal的分解所显现的蓝色来选择具有第二同源重组的宿主。具体地，具有第二同源重组的宿主产生正常颜色的集落，因为lacZ基因没有表达。由此有可能通过选择非蓝色的正常颜色集落来仅选择具有第二同源重组的宿主。
当amyE基因用作第二选择性标记基因时，有可能基于含淀粉培养基上的晕圈形成来从其他宿主中选择具有第二同源重组的宿主。因此，具有第二同源重组的宿主不形成晕圈，因为amyE基因不表达。由此有可能通过选择得到没有晕圈形成的正常集落的宿主来仅选择具有第二同源重组的宿主。
当gfp基因用作第二选择性标记基因时，有可能基于荧光从其他宿主中选择具有第二同源重组的宿主。具体地，具有第二同源重组的宿主不显示荧光，因为gfp基因不表达。由此有可能通过选择得到观察不到荧光的集落的宿主来从其他宿主中仅选择具有第二同源重组的宿主。
在本发明中，第二选择性标记基因优选是允许通过正向选择来选择第二同源重组后的转化体的选择性标记基因。有可能通过使用此类选择性标记基因来以高准确度仅选择通过第二同源重组修饰的转化体，而不会选择假阳性克隆。
在本发明中，术语“正向选择”是指基于在特殊培养基中仅所需转化体的增殖能力来选择所需的转化体的方法。
在本发明中，术语“负向选择”是指基于在特殊培养基中仅所需转化体的增殖能力的缺陷来选择所需的转化体的方法，或基于特殊蛋白的生产能力的缺陷来选择所需转化体的方法。如本文所使用，“特殊培养基中增殖能力的缺陷”是指，例如，所需转化体丧失其产生特定蛋白的能力并且在特殊培养基中不增殖或保持存活。
在本发明中，允许通过正向选择选择所需转化体的第二选择性标记基因优选是上述的致死基因，诸如chpA基因、ccdB基因、Kid基因、RelE基因、SymE基因、Hok基因、TxpA基因、Doc基因、PerE基因等。
如果致死基因用作第二选择性标记基因，则仅通过第二同源重组而缺少第二选择性标记基因的宿主可以在正常培养基中增殖和生长。而没有发生第二同源重组的宿主由于表达致死基因而不能够增殖并且死亡。使用上述的致死基因作为第二选择性标记基因，有可能高准确度地通过正向选择来选择具有第二同源重组的所需转化体。
另一方面，如果具有第二同源重组的转化体要通过负向选择来选择，则假阳性个体可能被错误地选择为所需转化体。例如，如果第一同源重组中使用的第一选择性标记基因也用作第二同源重组中的选择性标记，具有第一同源重组的个体通过正向选择而被选择，而具有第二同源重组的个体将通过负向选择而被选择。
在本发明中，使用两种选择性标记基因(即，第一和第二选择性标记基因)，并且第二选择性标记基因表达受表达诱导启动子的控制。通过适当地选择这些选择性标记基因的种类，有可能通过正向选择选择第一同源重组后的转化体，并且通过正向选择选择第二同源重组后的转化体。第一次和第二次正向选择导致以极高的准确度选择所需转化体，而不会错误地选择假阳性克隆。
例如，当在IPTG的存在下诱导基因表达的启动子诸如spac启动子用作表达诱导启动子时，通过向培养基中加入IPTG可以从其他宿主中选择具有第二同源重组的所需转化体。在此情况下，仅具有第二同源重组的所需转化体可以在含有IPTG的培养基中生长，而其他宿主被由IPTG诱导的致死基因表达杀死。
在使用IPTG的上述选择中，优选在液体培养基(诸如LB培养基)中细胞浓度反复倍增约6-10次，将培养物接种在含有100μM或以上的IPTG的琼脂平板培养基上，由此获得形成集落的克隆，因为料想第二同源重组与染色体复制同时发生。此外，为了防止由于选择压力由spac启动子突变导致的假阳性克隆，优选同时检验由第一选择性标记基因删除所产生的表型的变化。具体地，当壮观霉素抗性基因用作第一选择性标记基因时，优选选择在含有100μg/ml壮观霉素的琼脂板上不生长的克隆以确认其壮观霉素敏感性。通过使用由第一选择性标记基因的删除所导致的表型变化作为附加指标，有可能以非常高的准确度(几乎100％)获得所需转化体。
实施例
此后，本发明将参照实施例更详细地进行说明，但应该理解，本发明的技术范围不受下列的实施例的限制。
实施例1
在本实施例中，pro5区(20,485bp)是Bacillus subtilis 168的基因组上从1,879,258bp至1,899,742bp的区域，其作为用于删除的对象区域被删除。在本实施例中使用的引物的序列显示在表1中。本实施例的流程图显示在图5和图6中。
表1  引物序列
Figure BPA00001229883600211
<供体DNA的制备>
首先，从Bacillus subtilis 168株以下列的方式构建突变株、Bacillus subtilis 168(aprE::spec，lacI，Pspac-chpA)和Bacillus subtilis 168(aprE::Km，lacI，Pspac-chpA)：将含有壮观霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因、lacI基因和Pspac-chpA基因的DNA片段插入至Bacillus subtilis168的基因座位中。
如图5中所示，使用Bacillus subtilis表达载体pO2HC作为模板并且使用pO2HC-lacF(SEQ ID NO：3)和pO2HC-lacR(SEQ ID NO：4)的引物组通过PCR扩增该载体中从lacI基因至spac启动子下游的SD序列的区域。还使用大肠杆菌W3110的基因组作为模板以及chpA-F(SEQ ID NO：5)和chpA-R(SEQ ID NO：6)的引物组通过PCR扩增大肠杆菌W3110的基因组中从chpA基因的起始密码子至终止密码子的另一区域。两个扩增的DNA片段通过SOE-PCR法连接(Gene，77，61(1989))，得到连接的DNA片段。
然后，连接的DNA片段用限制性酶ApaI和BamHI消化，获得限制性酶消化的片段。类似地，用限制性酶ApaI和BamHI消化pAPNC213(包括壮观霉素抗性基因：specR)或pAPNCK(包括卡那霉素抗性基因：KmR)，获得限制性酶消化的片段。这些限制性酶消化的片段通过使用DNA连接酶连接，获得环状DNA。
Bacillus subtilis 168用该环状DNA转化，然后覆盖(plated)在含有100μg/ml壮观霉素或5μg/m卡那霉素的LB培养基平板上，以选择所需转化体。所需转化体命名为168(aprE::spec，lacI，Pspac-chpA)和168(aprE::Km，lacI，Pspac-chpA)。
通过使用菌株168(aprE::spec，lacI，Pspac-chpA)或168(aprE::Km，lacI，Pspac-chpA)的染色体DNA作为模板，使用APNC-F引物(SEQID NO：7)和chpA-R引物(SEQ ID NO：6)通过PCR扩增DNA片段(参见图5)。扩增的DNA片段称为选择性标记基因盒。
另外，从Bacillus subtilis 168的染色体DNA分别使用pro5-DF1(SEQ ID NO：8)和pro5-DR1(SEQ ID NO：9)、pro5-DF2(SEQ ID NO：10)和pro5-DR2(SEQ ID NO：11)、以及pro5-IF(SEQ ID NO：12)和pro5-IR(SEQ ID NO：13)的引物组通过PCR扩增用于删除的对象区域的5′-外侧区(片段A)、用于删除的对象区域的3′-外侧区(片段B)和第一同源重组区(片段C)(参见图6(i))。
使用由此获得的PCR片段，即，选择性标记基因盒、5′-外侧区(片段A)、3′-外侧区(片段B)和第一同源重组区(片段C)，用pro5-DF1(SEQ ID NO：8)和pro5-IR(SEQ ID NO：13)的引物组进行SOE-PCR(Gene，77，61(1989))。结果，如图6(i)中所示获得了具有以下列顺序排列的5′-外侧区(片段A)、3′-外侧区(片段B)、选择的标记基因盒和第一同源重组区(片段C)的DNA片段。此DNA片段在下面的转化中用作供体DNA。
<转化>
1.第一同源重组
使用20μg或以上的量的PCR产物(上面获得的供体DNA)，根据感受态细胞转化法转化Bacillus subtilis 168(J.Bacterial.93，1925(1967))。1μg PCR产物(供体DNA)加入至400μl Bacillus subtilis 168的感受态细胞中，混合物培养1.5小时(第一同源重组(参见图6(i)至(ii))。
转化(第一同源重组)后，基于壮观霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的表达选择转化体。具体地，转化后的细胞覆盖在含有100μg/ml壮观霉素或5μg/m卡那霉素的LB培养基平板中，于37℃下过夜，然后将在LB培养基平板上生长的集落收集为转化体。仅有通过第一同源重组将供体DNA整合进入Bacillus subtilis 168株中而产生的具有壮观霉素抗性或卡那霉素抗性的Bacillus subtilis突变株，可以在含有壮观霉素或卡那霉素的LB培养基平板上生长并形成集落。
2.第二同源重组
具有壮观霉素抗性或卡那霉素抗性的转化体在LB液体培养基中培养过夜。稀释培养物后，将培养溶液涂在添加有1mM IPTG的LB培养基平板上。结果，获得了48个集落。这些在含有IPTG的LB培养基平板上生长的集落是Bacillus subtilis转化体，其中通过第二同源重组使用于删除的对象区域和供体DNA均从宿主DNA中删除(参见图6(iii)至(iv))。
此外，为了确认pro5区(用于删除的对象区域)的删除，使用pro5-checkF引物(SEQ ID NO：14)和pro5-checkR引物(SEQ ID NO：15)通过PCR对获得的48个Bacillus subtilis转化体的单个集落进行检验。结果，所有48个转化体均没有pro5区。
从上述结果很显然，通过本发明的方法使用供体DNA和其中包含的选择性标记盒，有可能高准确度地删除Bacillus subtilis基因组中的所需区域。
此外，转化步骤中用作选择性标记基因的壮观霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因均没有保留在得到的转化体中。因此，通过本发明的方法获得的转化体可以反复地用于使用壮观霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作为选择性标记基因的进一步转化。
实施例2
在本实施例中，与Bacillus subtilis 168的基因组中1,690,526bp至1,695,233bp对应的flgB-fliH区(4,708bp)用作所需的DNA序列，将该DNA序列插入至宿主DNA中用于替换的对象区域中。在本实施例中使用的引物的序列显示在表2中。本实施例的流程图显示在图7中。
表2  引物序列
Figure BPA00001229883600241
<供体DNA的制备>
通过使用在实施例2中获得的168株(aprE::spec，lacI，Pspac-chpA)的染色体DNA作为模板，使用APNC-F引物(SEQ ID NO：7)和chpA-R引物(SEQ ID NO：6)通过PCR扩增DNA片段(参见图5)。扩增的DNA片段称为选择性标记基因盒。
另外，flgB-fliH区(所需DNA序列)、用于删除的对象区域的5′-外侧区(片段A)、用于删除的对象区域的3′-外侧区(片段B)和第一同源重组区(片段C)分别使用flgB-F(SEQ ID NO：16)和fliH-R(SEQID NO：17)、aprEclone-fF(SEQ ID NO：18)和aprEclone-fR(SEQ ID NO：19)、aprEclone-bF(SEQ ID NO：20)和aprEclone-bR(SEQ ID NO：21)、以及aprEclone-mF(SEQ ID NO：22)和aprEclone-mR(SEQ ID NO：23)的引物组从Bacillus subtilis 168的染色体DNA通过PCR扩增(参见图7(i))。
使用由此获得的PCR片段，即，选择性标记基因盒、5′-外侧区(片段A)、flgB-fliH区(所需DNA序列)、3′-外侧区(片段B)和第一同源重组区(片段C)，使用aprEclone-fF(SEQ ID NO：18)和aprEclone-mR(SEQ ID NO：23)的引物组进行SOE-PCR(Gene，77，61(1989))。结果，如图7(i)中所示获得了具有以下列顺序排列的5′-外侧区(片段A)、flgB-fliH区(所需DNA序列)、3′-外侧区(片段B)、选择的标记基因盒和第一同源重组区(片段C)的DNA片段。此DNA片段在下面的转化中用作供体DNA。
<转化>
1.第一同源重组
转化(第一同源重组)和第一同源重组后转化体的选择以与上述实施例1相似的方式进行。
2.第二同源重组
具有壮观霉素抗性的转化体在LB液体培养基中培养过夜。稀释培养物后，将培养溶液涂在添加有1mM IPTG的LB培养基平板上。结果，获得了100个或以上的集落。这些在含有IPTG的LB培养基平板上生长的集落是Bacillus subtilis转化体。在该转化体中，flgB-fliH区(所需DNA序列)插入至宿主DNA的用于替换的对象区域中，并且通过第二同源重组使选择性标记基因盒从宿主DNA中删除(参见图7(iii)至(iv))。
此外，为了确认flgB-fliH区(所需DNA序列)的插入和选择性标记基因盒的删除，使用aprEclone-checkF引物(SEQ ID NO：24)和aprEclone-checkR引物(SEQ ID NO：25)通过PCR对获得的24个Bacillus subtilis转化体的单个集落进行检验。结果，所有24个转化体均没有选择性标记基因盒并且具有flgB-fliH区。
从上述结果很显然，通过本发明的方法使用供体DNA和其中包含的选择性标记盒，有可能高准确度地将所需DNA序列引入至Bacillus subtilis基因组中用于替换的对象区域中。
此外，转化步骤中用作选择性标记基因的壮观霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因均没有保留在得到的转化体中。因此，通过本发明的方法获得的转化体可以反复地用于使用壮观霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作为选择性标记基因的进一步转化。
已经关于本实施方式说明了本发明，我们的意图是，除非另外指明，本发明不限于该说明书的任何细节，而是要在如附带的权利要求所给出的其精神和范围内广义地解释本发明。
本非临时申请根据35U.S.C.§119(a)要求于2008年3月24日在日本申请的专利申请第2008-076008号、和于2009年2月26日在日本申请的专利申请第2009-044193号的优先权，两件申请的每一件均通过引用整体地并入本文。
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Claims (24)

1.一种使用供体DNA修饰宿主DNA中的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA中的对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
所述方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区和源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被修饰的宿主。
2.一种使用供体DNA删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于删除的对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA的中用于删除的对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的用于删除的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
所述方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区和源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被删除的宿主。
3.根据权利要求2所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中在所述第二步骤中，其对象区域被删除的所述宿主基于所述第二选择性标记基因的表达通过正向选择而被选择。
4.根据权利要求2或3所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中所述第二选择性标记基因是编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中所述第二选择性标记基因是chpA基因。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中所述表达诱导启动子是在表达诱导物的存在下诱导下游基因表达的启动子。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中所述第一选择性标记基因是药物抗性基因。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法，其中所述宿主是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
9.一种使用供体DNA替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法：
其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的5′-侧区、所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的3′-侧区和所述宿主DNA中的用于替换的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域，在与所述5′-侧区同源的区域和与所述3′-侧区同源的区域之间包括所需DNA序列，并且在与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因；
所述方法包括以下步骤：
第一步骤，在所述5′-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组，从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主；以及
第二步骤，在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内，在源自所述宿主DNA的3′-侧区和源自所述供体DNA的3′-侧区这两个区域之间进行同源重组，从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被所述所需DNA序列替换的宿主。
10.根据权利要求9所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中在所述第二步骤中，其对象区域被替换的所述宿主基于所述第二选择性标记基因的表达通过正向选择而被选择。
11.根据权利要求9或10所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中所述第二选择性标记基因是编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中所述第二选择性标记基因是chpA基因。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中所述表达诱导启动子是在表达诱导物的存在下诱导下游基因表达的启动子。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中所述第一选择性标记基因是药物抗性基因。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法，其中所述宿主是枯草芽孢杆菌。
16.一种用于根据权利要求1、2和9中任一项所述的方法的选择性标记盒，包括所述第一选择性标记基因、所述表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子下表达的所述第二选择性标记基因，其中，在所述供体DNA中，所述选择性标记盒位于与所述3′-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间。
17.根据权利要求16所述的选择性标记盒，其中所述第二选择性标记基因是编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因。
18.根据权利要求16或17所述的选择性标记盒，其中所述第二选择性标记基因是chpA基因。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的选择性标记盒，其中所述表达诱导启动子是在表达诱导物的存在下诱导下游基因表达的启动子。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的选择性标记盒，其中所述第一选择性标记基因是药物抗性基因。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的选择性标记盒，其中所述选择性标记盒掺入至枯草芽孢杆菌基因组中。
22.一种生产宿主的方法，所述方法包括通过使用根据权利要求1所述的方法修饰宿主DNA中的对象区域。
23.一种生产宿主的方法，所述方法包括通过使用根据权利要求2-8中任一项所述的方法删除宿主DNA中用于删除的对象区域。
24.一种生产宿主的方法，所述方法包括通过使用根据权利要求9-15中任一项所述的方法替换宿主DNA中用于替换的对象区域。
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