CN112941088A - 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用。本发明首先利用蛋白结构域及3D结构预测鉴定到一种与布氏杆菌毒力相关的基因——abcS基因。利用RecA同源重组的方法，以卡那霉素抗性基因作为筛选标记替换abcS基因，构建了布氏杆菌abcS基因缺失株M28ΔabcS。荧光定量PCR试验表明，M28ΔabcS突变株中毒力因子四型分泌系统的表达严重下降。利用Balb/c小鼠持留感染模型评价了布氏杆菌abcS基因对布氏杆菌M28毒力的影响。结果显示：abcS基因缺失显著降低感染时脾脏的肿胀，同时严重影响细菌在小鼠脾脏内复制存活的能力，证实该基因是布氏杆菌M28的毒力相关基因。本发明的提出为布氏杆菌疫苗和药品的研发，提供了新的技术手段。

Description

与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备 弱毒布氏杆菌中的应用
技术领域
本发明涉及布氏杆菌的一种新型毒力基因，还涉及该毒力基因在布氏杆菌毒力评价以及制备弱毒布氏杆菌中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
布氏杆菌病是目前我国流行最严重的人兽共患细菌病之一。动物布氏杆菌病通常会导致牲畜附睾炎和流产相关的生殖障碍。在人类中，布氏杆菌病的症状是体虚、波状热和各种器官的慢性炎症，包括脾脏、肝脏、骨骼和其他器官。布氏杆菌病的病原为布氏杆菌，是一种革兰氏阴性胞内寄生菌。在已确认的10种布氏杆菌中，羊种布氏杆菌对人类的致病性最强。布氏杆菌进入人体通常是通过吸入或食用受污染的肉类或奶制品。一旦进入，它们可以穿透粘膜表面，并通过巨噬细胞进一步传递到淋巴结。布氏杆菌具有在巨噬细胞内存活和复制的能力，除了巨噬细胞外，布氏杆菌还可以感染多种宿主细胞，例如上皮细胞和生殖组织细胞。布氏杆菌已知的毒力因子包括脂多糖(LPS)和四型分泌系统(T4SS，VirB1-VirB12)，它们帮助细菌逃避或抑制宿主免疫系统，来保证布氏杆菌在宿主体内的存活。然而，目前对布氏杆菌新的毒力因子的了解是非常有限的，大大限制了国内现有布病疫苗的创制、优化能力。已有的动物用减毒活疫苗可能存在残余毒力并对动物及人致病。因此，布氏杆菌新毒力因子的鉴定，有着非常重要的理论和实践意义。
Extracytoplasmic function sigma factor(ECF)系统广泛存在于细菌中，通常包括2个结构蛋白组分，即sigma(bcrS)和anti-sigma(abcS)。Sigma因子通常被抑制因子abcS所束缚，当感应到外界环境响应信号时，通过各种蛋白酶的作用将抑制因子abcS分解并且释放出sigma因子，表达相关的基因。在这个过程中，abcS主要作为感应信号和控制sigma释放的开关，在我们的研究中发现这个ECF系统中bcrS对于布氏杆菌毒力未产生明显影响，而抑制因子abcS却明显影响强毒株M28致病力。
本发明首次证明布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS参与布氏杆菌毒力，对于布氏杆菌相关疫苗的研发具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新型的与布氏杆菌毒力相关的基因及其用途。
本发明的目的之二在于提供一种布氏杆菌毒力基因检测试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种致弱的布氏杆菌及其构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明首先利用蛋白结构域及3D结构预测鉴定到布氏杆菌M28菌株Anti-sigma因子B0023，命名为AbcS。利用基于RecA同源重组的方法，以卡那霉素抗性基因作为筛选标记替换布氏杆菌M28菌株的abcS基因，构建了布氏杆菌abcS基因缺失株M28ΔabcS。荧光定量PCR试验表明，M28ΔabcS突变株中毒力因子四型分泌系统的表达严重下降。利用Balb/c小鼠持留感染模型评价了布氏杆菌abcS基因对布氏杆菌M28毒力的影响。结果显示：abcS基因缺失显著降低感染时脾脏的肿胀，同时严重影响细菌在小鼠脾脏内复制存活的能力，证实该基因是布氏杆菌M28的毒力相关基因。
在上述研究的基础上本发明提出了一种与布氏杆菌毒力相关的基因，其特征在于，所述的基因为编码布氏杆菌sigma因子抑制因子anti-sigma(abcS)的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了所述的与布氏杆菌毒力相关的基因在布氏杆菌毒力评价中的应用。以及
所述的与布氏杆菌毒力相关的基因在制备弱毒布氏杆菌中的应用。
再进一步的，本发明提出了一种布氏杆菌毒力基因检测试剂盒，其中含有用于扩增编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS基因的引物以及PCR试剂，所述的编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
再进一步的，本发明提出了一种致弱的布氏杆菌，所述的布氏杆菌的基因组中不含编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS的基因。
其中，优选的，所述的致弱的布氏杆菌通过以下方法制备得到：
(1)合成用于构建布氏杆菌abcS基因缺失株的引物：
abcS_up-F:5’CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTTCATGGCGTCGCCT3’
abcS_up-R:5’GTTCTTCTGACTTCAGCTCGCCCGTCAGG3’
abcS_kan-F:5’CGAGCTGAAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’
abcS_kan-R:5’CTTCTTCCCCGCGATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’
abcS_down-F:5’TTTGAATCGCGGGGAAGAAGCGCG3’
abcS_down-R:5’TCTGATATCATCGATGAATTCAAGACCAGTAAATAGAGAAATATGACCAG3’
CK-abcS-F1:5’CCCATGATCGTGCTTCTC3’
CK-abcS-R1:5’GTGCGATCTTCAGCGGTTC3’
Km-1:5’CAGTCATAGCCGAATAGCCT3’
Km-2:5’CGGTGCCCTGAATGAACTGC3’
CK-abcS-F2:5’ATGCAGAGGCTGCTATTG3’
CK-abcS-R2:5’ACGCCTGTTCCCACAATG3’
SP6-F:5’ATTTAGGTGACACTATAGAA3’
T7-R:5’TAATACGACTCACTATAGGG3’
(2)基因缺失质粒的构建
以布氏杆菌基因组DNA为模板，使用引物abcS_up-F、abcS_up-R和abcS_down-F、abcS_down-R分别PCR扩增abcS基因上游与下游同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物abcS_kan-F和abcS_kan-R扩增卡那霉素抗性基因(Kanr)表达盒，切胶回收以上三段目的片段；用BamHI和EcoRI双酶切pSP72载体，将酶切后的载体片段与上述三段目的片段进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-abcS-km；
(3)基因缺失质粒的电击转化及abcS基因缺失株的鉴定筛选
将pSP72-abcS-km电转化至布氏杆菌感受态细胞中，筛选获得具有卡那霉素抗性而无氨苄青霉素抗性的阳性克隆，对筛选到的候选缺失株通过平板划线传代检测其稳定性，利用CK-abcS-F1+km-1、km-2+CK-abcS-R和CK-abcS-F2+CK-abcS-R2三对引物进行PCR鉴定，最后辅以测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存，得到致弱的布氏杆菌。
其中，优选的，所述的布氏杆菌为布氏杆菌M28，构建得到的致弱的布氏杆菌命名为M28ΔabcS。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种新型的与布氏杆菌毒力相关的基因，通过基因缺失构建了布氏杆菌abcS突变株M28ΔabcS。实验证明abcS基因缺失后对布氏杆菌在基本培养基对数期的生长有轻微影响。缺失株M28ΔabcS与野生株相比，在小鼠感染模型中，abcS的缺失在感染后3周引起脾脏载菌量明显下降(≈100倍)。此外，野生型感染的小鼠脾脏明显肿大，而感染M28ΔabcS突变体的小鼠脾脏更小、更轻，表现出不明显的脾肿大(P<0.001)。感染后第3周，感染M28ΔabcS的小鼠脾脏重量与未感染的小鼠相似，小鼠感染实验证明布氏杆菌abcS基因与布氏杆菌的毒力相关。通过对该基因的检测，能够对布氏杆菌的毒力进行评价，并且通过缺失该基因能够制备得到毒力显著下降的布氏杆菌，本发明的提出为布氏杆菌新疫苗的研发提供了新的技术手段。
附图说明
图1为abcS蛋白的结构域预测与3D结构预测(Transmembrane，TMH)；
图2A为基因缺失质粒pSP72-abcS-km的构建与鉴定；
其中，M：DNAMarker DL5000，1:重组质粒pSP72-abcS-km的PCR扩增鉴定；
图2B为M28ΔabcS缺失株的PCR鉴定；
其中，M：DNAMarkerDL2000，1：M28ΔabcS(CK-abS-F1，Km1)，2：M28ΔabcS(Km2，CK-abcS-R1)，3：M28ΔabcS(CK-abcS-F2，CK-abcS-R2)，4：M28(CK-abcS-F2，CK-abcS-R2)；
图3为荧光定量RT-PCR鉴定abcS调控Ⅳ型分泌系统基因的表达；
图4为abcS缺失影响布氏杆菌对小鼠的毒力(**：P<0.01；***：P<0.001)；
其中，(A)abcS缺失对小鼠脾重的影响；(B)abcS缺失对小鼠脾脏载菌量的影响；
图5为使用abcS-C-F和abcS-C-R引物进行PCR扩增的结果。
其中，泳道1：以ddH2O为模板的阴性对照；2：marker；3：以M28基因组DNA为模板。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 M28ΔabcS基因缺失株的构建及毒力评价
1材料与方法
1.1菌株、质粒与载体
布氏杆菌M28由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物安全三级实验室保存，质粒pSP72和pBlue-Kan由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存提供。DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞公司。6周龄SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有涉及布氏杆菌菌株及其致病性的实验均在生物安全三级实验室进行。
1.2试剂
TSB和TSA培养基购自BD公司。Brucella Selective Supplement购自OXOID。
Figure BDA0002934718610000051
Super-Fidelity DNA Polymerase、
Figure BDA0002934718610000052
MultiS One Step CloningKit和
Figure BDA0002934718610000053
II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞公司。质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自OMEGA公司。BamHI和EcoRI内切酶购自NEB公司。质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自大连宝生物公司。
1.3方法
1.3.1引物设计及合成
根据GenBank中M28基因注释信息设计合成用于构建abcS基因缺失株的引物，引物均由长春库美生物有限公司合成(表1)。
表1构建abcS缺失株和荧光定量RT-PCR的引物
Figure BDA0002934718610000061
Figure BDA0002934718610000071
1.3.2 abcS蛋白的结构域预测与3D结构预测
按如下步骤预测蛋白abcS的结构域和3D结构：根据Genbank发布的abcS蛋白氨基酸序列，利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和i-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)在线软件预测蛋白abcS的结构域和3D结构(图1)。
1.3.3 M28ΔabcS基因缺失株的构建
1.3.3.1基因缺失质粒的构建
按如下实验步骤构建基因缺失质粒：以布氏杆菌M28基因组DNA为模板，使用引物abcS-up-F+abcS-up-R和abcS-down-F+abcS-down-R分别PCR扩增abcS基因上游和下游同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物abcS-Kan-F和abcS-Kan-R扩增卡那霉素抗性基因表达盒(Kanr)，切胶回收以上三段目的片段；用BamHI和EcoRI双酶切pSP72载体，将酶切后的载体片段与上述三段目的片段进行连接，具体操作参照OMEGA Gel Extraction Kit。使用
Figure BDA0002934718610000081
MultiS One Step Cloning Kit在冰上配置如下反应体系：
Figure BDA0002934718610000082
使用移液器吹打混匀，37℃反应30min，冰浴5min，保存于-20℃待用。取10μL反应液加入到100μL感受态细胞中，化学转化，涂布Kanr抗性平板，PCR鉴定挑取的单克隆，筛选阳性克隆送样库美生物公司测序，将测序正确的质粒命名为pSP72-abcS-km。
1.3.3.2布氏杆菌M28电击感受态制备
取-80℃保存的菌种，接种到5mLTSB培养基中，37℃震荡培养至对数晚期，活化后转接至200mL的TSB培养基中，震荡培养至OD600＝1.0。冰浴30min后4℃，6000rpm离心5min，收集菌体沉淀，使用10％的甘油水溶液反复洗涤3次，最后收集菌体沉淀，加入适当体积的10％甘油水溶液，按照每支100μL分装，保存于-80℃待用。
1.3.3.3基因缺失质粒的电击转化及abcS基因缺失株的鉴定筛选
将基因缺失质粒pSP72-abcS-km与100ul感受态细胞充分混匀，预冷25min，使用0.1cm的转化杯，电击转化仪电击后迅速将其转移至900μL的SOC培养基中，37℃振荡过夜，培养活化后，将菌液全部涂布到卡那抗性(50μg/ml)的TSA培养基上，3～5天后观察菌落情况。
将具有卡那霉素抗性的菌落分别划线接种至含有卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的TSA平板，进一步筛选确定阳性克隆。筛选到的阳性克隆应只有卡那霉素抗性，对筛选到的候选缺失株划线传代20代，检测其稳定性。取新鲜培养的候选缺失株，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)完成基因组DNA提取。利用引物CK-abcS-F1+km-1、km-2+CK-abcS-R1和CK-abcS-F2+CK-abcS-R2三对引物进行PCR鉴定，并进一步测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存，得到布氏杆菌弱毒株，命名为M28ΔabcS。
1.3.4荧光定量RT-PCR验证基因abcS调控Ⅳ型分泌系统基因的表达
细菌培养在TSB培养基中直到OD600≈0.5，加入HOCl终浓度到2mM，37℃，180r/min继续培养10min，提取RNA，以16S RNA为内参基因，利用荧光定量RT-PCR鉴定基因abcS缺失对布氏杆菌重要毒力因子四型分泌系统的表达的影响，所用的引物为表1中的SEQ IDNO.18-41。
1.3.5abcS缺失对布氏杆菌M28在小鼠体内存活复制能力的影响
将38只6周龄雌性的SPF级BALB/c小鼠，分为实验组两组(8只/组)，空白对照组一组(3只/组)，设两个感染时间点，分别为7d和21d。分别腹腔注射100μL布氏杆菌M28、M28ΔabcS和PBS，接种剂量为1×106CFU/只。在感染后7d、21d时无菌取脾称重，加入1mL含0.1％TritonX-100的PBS，使用组织研磨机研磨，1：10倍比稀释后，取100μL涂布于TSA平板，37℃培养计数。
2结果
2.1蛋白abcS的结构域和3D结构预测
结果如图1所示。
2.2 pSP72-abcS-km基因缺失质粒及abcS缺失菌株的鉴定
采用PCR扩增和质粒测序的方式完成基因缺失质粒鉴定。基因缺失质粒含有abcS基因上下游片段和卡那霉素抗性基因表达盒，使用一步法克隆后其总长度约为3200bp。如图2A所示，使用引物SP6-F和T7-R进PCR验证后扩增结果与预期一致，基因缺失质粒命名为pSP72-abcS-km。
经卡那霉素和氨苄青霉素筛选后，获得仅有卡那霉素抗性的缺失菌株。设计位于缺失基因abcS左右同源臂外侧基因组上一对引物CK-abcS-F1和CK-abcS-R1,位于kanr表达盒上的一对引物Km1和Km2以及abcS基因内源引物CK-abcS-F2，CK-abcS-R2作为鉴定引物，以M28ΔabcS基因组为模板，扩增鉴定筛选到的缺失株。扩增结果显示，缺失株外侧引物交叉鉴定(CK-abcS-F1，Km1和Km2，CK-abcS-R1)均能扩增出约1200bp大小的片段，而野生株外侧引物交叉鉴定不能扩增出条带。野生株内源引物鉴定能扩增出约500bp的条带，而缺失株内源引物鉴定不能扩增出条带，说明abcS基因已被卡那霉素基因代替，成功被缺失(图2B)。
2.3荧光定量RT-PCR验证基因abcS调控Ⅳ型分泌系统基因的表达
如图所示，在M28ΔabcS缺失株中，virB1到virB10基因都有不同程度的、显著的下调；其中，virB2、virB8、virB9、virB10下降达到25倍，即约为野生株的1/32(图3)。表明，abcS基因调控布氏杆菌重要的毒力因子Ⅳ型分泌系统。
2.4 abcS缺失对布氏杆菌M28在小鼠体内存活复制能力的影响
将M28、M28ΔabcS按照1×106CFU/只的剂量，腹腔注射感染6-7周龄的雌性SPF级BALB/c小鼠，在感染后7d和21d后处死，无菌取脾，称重并研磨计数，测定其脾重和脾载菌量以衡量不同菌株在小鼠体内存活能力。结果显示，abcS缺失株M28ΔabcS在感染3周后引起脾脏细菌负荷急剧下降(≈100倍)。此外，野生型感染的小鼠脾脏明显肿大，而感染M28ΔabcS突变体的小鼠脾脏更小、更轻，表现出不明显的脾肿大(P<0.001)。第3周，感染M28ΔabcS的小鼠脾脏重量与未感染的小鼠相似，小鼠感染实验证明布氏杆菌abcS基因显著影响了布氏杆菌M28在小鼠体内存活复制的能力(图4A、B)。
实施例2布氏杆菌毒力基因检测试剂盒及其检测方法
1、试剂盒组成：
所述的试剂盒含有用于扩增编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS基因的引物以及Vazyme Taq mix，所述的引物由上游引物abcS-C-F和下游引物abcS-C-R组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2、方法：
以布氏杆菌M28基因组DNA为模板(以ddH2O为阴性对照)，使用abcS-C-F和abcS-C-R引物进行PCR扩增，反应程序为：95℃，5mins；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，5mins。反应体系：
Figure BDA0002934718610000101
Figure BDA0002934718610000111
3、结果：
如图5所示，以H2O为模板的阴性对照，没有PCR产物；而以M28基因组DNA为模板，可以得到约636bp的特异的PCR产物。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 636
<212> DNA
<213> Brucella
<400> 1
ataaccgatg acctgatcaa ccgcctgacg ggcgagctga agccggtgtc gcgccatgcc 60
atgcagaggc tgctattggg acatgcgctt ttgggcatgg ttgcgggcgt ggtcatcatg 120
ctggcttttc tgggcgcccg ccacgatctt gccgccgcaa tggcgacccc cgccttctgg 180
agcaagcttt gctatgccgc gctgttgctt gccgtcctgc ttcctgcctt gttcgcgctg 240
tcgcggcctt tgcggcaaaa cctgccctgg cctgcgctgc tgctcatttt ttcctgcctt 300
ggtgcggcgg ctatctatca atgggaggaa gcctcgcctg aggtgaggcc ggtgctggta 360
tggggatata cggcgctcgt ctgcccctgg ctgatcgggc ttatctcgct gccgacactt 420
gcttcgcttc tgctggcgat ccgcaagctt gcgcccgcgc gcccaacgct tgccggtttc 480
gcggcagggc tggtgtcggg cggcatcggc gttctggtct atgccttcca ttgcccggaa 540
tccggcctgc cattcattgc gctgtggtac acgctgggca ttgtgggaac aggcgtgctg 600
ggtgcgcttg gcgggcgctt ctgcctgcgc tggtaa 636
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cagtcatagc cgaatagcct 20
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cggtgccctg aatgaactgc 20
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atgcagaggc tgctattg 18
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acgcctgttc ccacaatg 18
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ataaccgatg acctgatcaa ccg 23
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gcatgaaagt ctatctttca gccg 24
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cacggttgaa gaagccaaga 20
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accttcctct cggcttatca 20
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gtcgtgagat gttgggttaa gt 22
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cggcgtagta acaggagaat g 21
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ccctgcaaga acctgaagat 20
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ggtggcctcg ataaggtaaa t 21
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ttgtaaccgg accagatgat g 21
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cggcagcatc gttctcttat 20
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cggaacatct gatcgtcagt c 21
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caatgctccg atgggtatgt 20
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cgttcctgat ggcaaggtat 20
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tgtgaggcta aagtggtgaa g 21
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tcgatctctt gtaggcgttt g 21
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atccacaacc agttgaacaa ttac 24
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aatatgccca tggcggtata g 21
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cttgccggtt gcactaca 18
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ggtttagccg gaacgctt 18
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tggctaccaa tacgtcaatc c 21
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cattgcacca ctcccatttc 20
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agtgggacac aaacctgatg 20
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gtagcggaac tgaacacgat ag 22
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tctttgtcgt gggcttcatc 20
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gtctgcacca tcgtcttgt 19

Claims (8)

1.一种与布氏杆菌毒力相关的基因，其特征在于，所述的基因为编码布氏杆菌sigma因子抑制因子anti-sigma(abcS)的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的与布氏杆菌毒力相关的基因在布氏杆菌毒力评价中的应用。
3.权利要求1所述的与布氏杆菌毒力相关的基因在制备弱毒布氏杆菌中的应用。
4.一种布氏杆菌毒力基因检测试剂盒，其特征在于，含有用于扩增编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS基因的引物以及PCR试剂，所述的编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
6.一种致弱的布氏杆菌，其特征在于，所述的布氏杆菌的基因组中不含编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS的基因。
7.如权利要求6所述的致弱的布氏杆菌，其特征在于，通过以下方法制备得到：
(1)合成用于构建布氏杆菌abcS基因缺失株的引物：
abcS_up-F:5’CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTTCATGGCGTCGCCT3’
abcS_up-R:5’GTTCTTCTGACTTCAGCTCGCCCGTCAGG3’
abcS_kan-F:5’CGAGCTGAAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’
abcS_kan-R:5’CTTCTTCCCCGCGATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’
abcS_down-F:5’TTTGAATCGCGGGGAAGAAGCGCG3’
abcS_down-R:5’TCTGATATCATCGATGAATTCAAGACCAGTAAATAGAGAAATATGACCAG3’
CK-abcS-F1:5’CCCATGATCGTGCTTCTC3’
CK-abcS-R1:5’GTGCGATCTTCAGCGGTTC3’
Km-1:5’CAGTCATAGCCGAATAGCCT3’
Km-2:5’CGGTGCCCTGAATGAACTGC3’
CK-abcS-F2:5’ATGCAGAGGCTGCTATTG3’
CK-abcS-R2:5’ACGCCTGTTCCCACAATG3’
SP6-F:5’ATTTAGGTGACACTATAGAA3’
T7-R:5’TAATACGACTCACTATAGGG3’
(2)基因缺失质粒的构建
以布氏杆菌基因组DNA为模板，使用引物abcS_up-F、abcS_up-R和abcS_down-F、abcS_down-R分别PCR扩增abcS基因上游与下游同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物abcS_kan-F和abcS_kan-R扩增卡那霉素抗性基因(Kanr)表达盒，切胶回收以上三段目的片段；用BamHI和EcoRI双酶切pSP72载体，将酶切后的载体片段与上述三段目的片段进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-abcS-km；
(3)基因缺失质粒的电击转化及abcS基因缺失株的鉴定筛选
将pSP72-abcS-km电转化至布氏杆菌感受态细胞中，筛选获得具有卡那霉素抗性而无氨苄青霉素抗性的阳性克隆，对筛选到的候选缺失株通过平板划线传代检测其稳定性，利用CK-abcS-F1+km-1、km-2+CK-abcS-R和CK-abcS-F2+CK-abcS-R2三对引物进行PCR鉴定，最后辅以测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存，得到致弱的布氏杆菌。
8.如权利要求7所述的致弱的布氏杆菌，其特征在于，所述的布氏杆菌为布氏杆菌M28，构建得到的致弱的布氏杆菌命名为M28ΔabcS。
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Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006501846A (ja) * 2002-10-04 2006-01-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ローソニア・イントラセルラリス由来の核酸およびポリペプチド配列ならびに使用方法
CN101031655A (zh) * 2004-07-26 2007-09-05 陶氏环球技术公司 通过株工程改进蛋白表达的方法
EP1874806A2 (en) * 2005-04-15 2008-01-09 The Secretary of State for Defence Vaccine against burkholderia infections
CN101163499A (zh) * 2005-02-11 2008-04-16 Ace生物科学公司 表面定位的肺炎链球菌多肽
CN101652468A (zh) * 2007-04-10 2010-02-17 花王株式会社 重组微生物
CN101781632A (zh) * 2009-01-20 2010-07-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 马耳它布氏杆菌bp26基因缺失M5-90疫苗株
CN101978057A (zh) * 2008-03-24 2011-02-16 花王株式会社 修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒
CN102803290A (zh) * 2009-06-11 2012-11-28 丹尼斯科美国公司 用于增加蛋白质产生的芽孢杆菌属菌株
AU2013202795A1 (en) * 2008-09-26 2013-05-02 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
CN103131717A (zh) * 2011-03-08 2013-06-05 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 马耳他布氏杆菌毒力相关基因
CN103344770A (zh) * 2013-07-15 2013-10-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒
CN103864928A (zh) * 2012-12-13 2014-06-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 布鲁氏菌脂多糖共同抗原单克隆抗体的制备及c-ELISA方法的建立
AU2014210639A1 (en) * 2010-02-24 2014-09-11 The Broad Institute, Inc Methods of diagnosing infectious disease pathogens and their drug sensitivity
CN106434453A (zh) * 2016-10-08 2017-02-22 吉林工商学院 一种能快速降解鸡粪中雌激素及其相似物的微生物菌群
CN109593761A (zh) * 2018-12-21 2019-04-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN109652429A (zh) * 2018-12-10 2019-04-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 与布鲁氏菌毒力相关的基因及其在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN111094546A (zh) * 2017-06-12 2020-05-01 兽医制药股份公司 粗糙型肠炎沙门氏菌的获取及其用于禽流感疫苗的基因改造
US20210069264A1 (en) * 2017-12-11 2021-03-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof
CN112695004A (zh) * 2020-12-28 2021-04-23 南通大学 APEC双基因rpoS和arcA缺失菌株及弱毒疫苗
CN112888305A (zh) * 2018-08-17 2021-06-01 国家科学研究中心 保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的治疗方法
WO2021256582A1 (ko) * 2020-06-17 2021-12-23 포항공과대학교 산학협력단 전사 활성 인자 및 토홀드 스위치를 포함하는 트립토판 검출용 바이오센서

Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006501846A (ja) * 2002-10-04 2006-01-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ローソニア・イントラセルラリス由来の核酸およびポリペプチド配列ならびに使用方法
CN101031655A (zh) * 2004-07-26 2007-09-05 陶氏环球技术公司 通过株工程改进蛋白表达的方法
CN101163499A (zh) * 2005-02-11 2008-04-16 Ace生物科学公司 表面定位的肺炎链球菌多肽
EP1874806A2 (en) * 2005-04-15 2008-01-09 The Secretary of State for Defence Vaccine against burkholderia infections
CN101652468A (zh) * 2007-04-10 2010-02-17 花王株式会社 重组微生物
CN101978057A (zh) * 2008-03-24 2011-02-16 花王株式会社 修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒
AU2013202795A1 (en) * 2008-09-26 2013-05-02 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
CN101781632A (zh) * 2009-01-20 2010-07-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 马耳它布氏杆菌bp26基因缺失M5-90疫苗株
CN102803290A (zh) * 2009-06-11 2012-11-28 丹尼斯科美国公司 用于增加蛋白质产生的芽孢杆菌属菌株
AU2014210639A1 (en) * 2010-02-24 2014-09-11 The Broad Institute, Inc Methods of diagnosing infectious disease pathogens and their drug sensitivity
CN103131717A (zh) * 2011-03-08 2013-06-05 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 马耳他布氏杆菌毒力相关基因
CN103864928A (zh) * 2012-12-13 2014-06-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 布鲁氏菌脂多糖共同抗原单克隆抗体的制备及c-ELISA方法的建立
CN103344770A (zh) * 2013-07-15 2013-10-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒
CN106434453A (zh) * 2016-10-08 2017-02-22 吉林工商学院 一种能快速降解鸡粪中雌激素及其相似物的微生物菌群
CN111094546A (zh) * 2017-06-12 2020-05-01 兽医制药股份公司 粗糙型肠炎沙门氏菌的获取及其用于禽流感疫苗的基因改造
US20210069264A1 (en) * 2017-12-11 2021-03-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof
CN112888305A (zh) * 2018-08-17 2021-06-01 国家科学研究中心 保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的治疗方法
CN109652429A (zh) * 2018-12-10 2019-04-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 与布鲁氏菌毒力相关的基因及其在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN109593761A (zh) * 2018-12-21 2019-04-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用
WO2021256582A1 (ko) * 2020-06-17 2021-12-23 포항공과대학교 산학협력단 전사 활성 인자 및 토홀드 스위치를 포함하는 트립토판 검출용 바이오센서
CN112695004A (zh) * 2020-12-28 2021-04-23 南通大学 APEC双基因rpoS和arcA缺失菌株及弱毒疫苗

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUOMING LI 等: "An Extracytoplasmic Function Sigma/Anti-Sigma Factor System Regulates Hypochlorous Acid Resistance and Impacts Expression of the Type IV Secretion System in Brucella melitensis", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
LI HUOMING 等: "病原菌的"攻防一体化"：布鲁氏菌胞质外Sigma因子协同调控抗次氯酸与四型分泌系统基因表达", 《中国预防兽医学报》 *
NCBI: "extracytoplasmic function alternative sigma factor [Brucella melitensis bv. 1 str. 16M]", 《GENBANK DATABASE》 *
VITO G. DELVECCHIO 等: "The genome sequence of the facultative intracellular pathogen Brucella melitensis", 《PNAS》 *
刘爽 等: "布鲁氏菌S2株菌壳的制备研究", 《中国人兽共患病学报》 *
叶俊贤 等: "布鲁氏菌S19疫苗应用及研究进展", 《中国兽药杂志》 *
崔丽瑾 等: "布鲁氏菌致病因子及感染机制研究进展", 《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集》 *
曹小安等: "布鲁氏菌毒力基因的研究状况", 《中国人兽共患病学报》 *
李火明: "布鲁氏菌胞质外sigma因子bcrS系统调控抗氧化和毒力基因的机制及在致病过程中的作用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》 *
柳建新等: "布鲁氏菌致病及免疫机制研究进展", 《动物医学进展》 *
董浩等: "牛种布鲁氏菌RpoE2蛋白部分生物学特性研究", 《中国农业大学学报》 *

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