CN103131717A - 马耳他布氏杆菌毒力相关基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来源于羊种布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90的延伸因子tuf基因，及其在区分马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90和它的亲本株M28中的应用。本发明还提供一种将马耳他布氏杆菌强毒株M28毒力致弱的方法，该方法包括将马耳他布氏杆菌强毒株M28的延伸因子tuf基因突变失活的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及马耳他布氏杆菌研究领域。更具体地，本发明公开了一种来源于羊种布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90的延伸因子tuf基因，及其在区分马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90和它的亲本株M28中的应用。本发明还提供一种将马耳他布氏杆菌强毒株M28毒力致弱的方法，该方法包括将马耳他布氏杆菌强毒株M28的延伸因子tuf基因突变失活的步骤。
背景技术
布氏杆菌(Brucella)为革兰氏阴性细菌，细胞内寄生，可感染人类及多种动物引起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致世界范围巨大经济损失和严重公共卫生问题。其毒力取决于在宿主细胞的侵袭和繁殖能力。研究表明，布氏杆菌通过阻止晚期内体和溶酶体融合在细胞内增殖(J.P.Gorvel，E.Moreno.2002.Brucellaintracellular life：from invasion to intracellular replication.Vet.Microbiol.90：281-297)。迄今为止，还没有安全的人用疫苗。布氏杆菌病缺乏有效治疗手段，现有抗菌素治疗收效有限(Alton GG，Jones LM，Angus RD.Techniques for the brucellosis laboratory.INRA(Institut National de la Recherche Agronomique)，Paris，France，1988)。
目前已有六个种十余株布氏杆菌全基因组序列发表(Seleem，M.N.，Boyle，S.M.，Sriranganathan，N.2010.Brucellosis：a re-emerging zoonosis.Vet.Microbiol.140：392-398)。布氏杆菌的基因组大小、基因和蛋白的数量极其相似。通过分析全基因组发现布氏杆菌缺乏典型的毒力基因，如荚膜、菌毛、外毒素、溶细菌素、质粒和抗原变异等(Seleem，M.N.，Boyle，S.M.，Sriranganathan，N.2008.Brucella：a pathogen withoutclassic virulence genes.Vet Microbiol.129：1-14.)。布氏杆菌致病力的研究主要集中在影响其胞内运输和增殖的因子方面(Spera，J.M.，J.E.Ugalde，J.Mucci，D.J.Comerci，andR.A.Ugalde.2006.A B lymphocyte mitogen is a Brucella abortus virulence factor requiredfor persistent infection.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：16514-16519.)。
马耳他布氏杆菌(Brucella Melitensis)疫苗株M5-90为我国自行分离并致弱，并在临床应用中取得了很好的效果，成功地防治了羊布氏杆菌病(尚德秋.中国布鲁氏菌病防治科研50年.中华流行病学杂志(Chinese Journal of Epidemiology)，2000，21(1)：55-57。
M5-90菌株培育的经过：为提高M5(弱毒疫苗株，是由中国采用生物I型羊种布鲁氏菌强毒株M28，通过鸡体连续传代致弱，于1962年研制成功，1964年开始中试)稳定性，继续用M5高代次257代，继续通过鸡体187代，经黄色素处理后的培养物在9～10日龄鸡胚制备的单层原代鸡胚成纤维细胞上连续传代90代，获得毒力稳定，免疫原性良好的菌株，把这个菌株称为M5-90。而其致弱的分子和生理机制不甚清楚。
发明内容
马耳他布氏杆菌是一种重要的人畜共患致病菌，主要感染绵羊、山羊和人等人畜。马耳他布氏杆菌M5-90系我国自行分离培养的弱毒疫苗株，具有较好的安全性及免疫保护力，为我国布病防控发挥了重要作用，但其致弱的分子机制，尤其是和其亲本株M28致病性差异还不甚清楚。为了研究M5-90的致弱的分子和生理机制，本研究通过M5-90及其亲本强毒株M28全基因组序列分析和比较，以期发现M5-90致弱相关的基因。
应用第二代高通量测序平台454 GS FLX对羊种布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90及其亲本强毒株M28的全基因组进行测序。使用454 GS FLX自带软件GSAssemblersoftware v2.0.01.14进行序列拼接，获得完整全基因组序列。利用软件ZCURVE和Glimmer 3.0预测蛋白(CDS)。通过BLASTP软件搜索NCBI和KEGG蛋白数据库对编码蛋白进行注释。经系统比较M5-90与M28的基因组发现，25个毒力相关候选基因，其中延伸因子tuf基因在染色体I上有两个拷贝(BM28_A1246，BM28_A1261)，只有BM28_A1261发生显著突变。本研究以延伸因子tuf基因(BM28_A1261)作为重组靶位点，以M28为亲本，利用tuf基因ORF外侧序列作为同源臂，将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中，双交叉重组阳性菌株，经PCR克隆测序鉴定突变株。通过小鼠感染模型验证了该tuf基因在M5-90致弱中的作用。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.延伸因子tuf基因，优选其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.延伸因子tuf基因在区分马耳他布氏杆菌(Brucella Melitensis)疫苗株M5-90和它的亲本株M28中的应用。
3.根据以上2所述的应用，其中所述延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
4.一种区分马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90和它的亲本株M28的方法，所述方法包括PCR扩增延伸因子tuf基因并对该基因进行测序的步骤。
5.根据以上4的方法，其中如果所扩增的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示，则指示该疫苗株是马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90；如果所扩增的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，则指示该疫苗株是马耳他布氏杆菌疫苗株M28。
6.一种将马耳他布氏杆菌强毒株毒力致弱的方法，该方法包括将马耳他布氏杆菌强毒株的延伸因子tuf基因突变失活的步骤。
7.根据以上6所述的方法，其中所述马耳他布氏杆菌强毒株是羊马耳他布氏杆菌强毒株，优选羊马耳他布氏杆菌强毒株M28。
8.根据以上6或7所述的方法，其中延伸因子tuf基因的突变失活是通过同源重组实现的。
9.根据以上8的方法，其中将抗生素基因通过同源重组替换延伸因子tuf基因，优选所述抗生素基因是卡那霉素抗性基因(Kanr)。
10.根据以上6-9中任一项的方法，其中所述马耳他布氏杆菌强毒株的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
附图说明
图1.M28(A)与M28-tuf(B)tuf基因表达元件及转移载体pSP-tuf-k(C)示意图。A.M28中tuf大小为1176bp。左右同源臂分别为1019bp和1013bp。B.795bp的Kanr基因替换M28-tuf中tuf；
图2.系统进化树；
图3.tuf同源臂PCR扩增及转移载体pSP-tuf-k酶切鉴定。M1：DL2000标记；M2：DL15000标记；A：1和2，tuf1右和左同源臂，3和4，tuf2右和左同源臂；B：1，pstI/XhoI双酶切质粒pSP-tuf1-k，2，EcoRI/BamHI双酶切质粒pSP-tuf1-k；C：1，XbaI/XhoI双酶切质粒pSP-tuf2-k，2，XhoI/NcoI双酶切质粒pSP-tuf2-k；D：1，tuf的PCR产物，2，BamHI/XhoI双酶切质粒pET-tuf；
图4.重组蛋白EF-Tu纯化和Western-blot分析(A：1结合上清液(诱导超声细菌上清液)；2，3，4洗脱上清液；5洗脱蛋白；M分子量标记。B：M28阳性血清。C：M5-90阳性血清)；
图5.EF-Tu免疫小鼠M28/M5-90攻毒后两周脾重和脾脏细菌分离(**：t-检验分析显著区别于对照组)；
图6.tuf突变株的PCR鉴定(M DL2000标记；1-5 Kanr合成量；1为pSP-tuf2-k质粒空白对照；2为M28-tuf2；3为M90-tuf2；4为pSP-tuf1-k质粒空白对照；5为M28-tuf1)；
图7.突变株及其亲本株的生长曲线；
图8.突变株和其亲本株M28、M5-90小鼠体内毒力实验中脾脏荷菌量(A)和脾脏重量变化(B)；
图9.pBlue-kana的质粒图谱；
图10.马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90的延伸因子tuf基因(BM28_A1261)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；
图11.由于M5-90中BM28_A1261处的序列由于有显著突变，所以在序列SEQ IDNO：1中没有完整的tuf基因的orf，而是预测出三个截短或移码的小orf构成一个假基因；和
图12.与马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90的延伸因子tuf基因(BM28_A1261)相对应的亲本株M28的序列(SEQ ID NO：2)。
具体实施方式
为了提供对上面公开的实施方案，包括其代表性的优势的更好理解，提供下列的实施例。
1材料和方法
1.1材料
马耳他布氏杆菌(Brucella Melitensis)：强毒株M28(为M5-90驯化前的亲本)和弱毒株M5-90商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(相关参考文献：宏武，赫崇礼，陈乃昌等.布氏杆菌羊种m5-90菌苗对山西土种黄牛二年免疫期试验.中国畜禽传染病，1988年第2期.432-433.卢景良，李节堂，王振生等。羊型布氏杆菌单克隆抗体的研究I.M281D2C-1杂交瘤株的建立。家畜传染病1984年第4期。134-37))。
质粒：pBluescript-II(Strategene公司)，pSP72(Promega公司)，pET30a(Invertrogen公司)，pBlue-kana(即在pBluescript-II质粒的Pst I和Kpn I位点之间插入kana抗性基因(GenBank Accession No.ACU30026.1)，质粒图谱如图9所示)。
液体TSB-YE培养基为TSB(Bioscience-Clonetech公司)添加0.1％酵母浸出物(Bioscience-Clonetech公司)，pH为7.2。平板培养基为液体TSB-YE中添加1％琼脂粉。卡那霉素(Sigma)和氨苄青霉素(Sigma)的浓度为50μg/ml和100μg/ml。
仪器：小鼠饲养隔离器(IVC)、电转化杯(Bio-rad)、电转化仪(Bio-rad)、离心机(Beckman)、电子天平(Sartorius group)、显微镜(Olympus)、CO2培养箱(Thermo)恒温振荡器(哈尔滨东联电子技术有限公司)、低温冰箱(NEW BrunswickScientific)、生物安全柜(Esco)和纯水仪(Millipore)。
1.2布鲁氏菌M28和M5-90基因组的提取
将冻干保存的菌株用PBS溶解，接种于TSB-YE液体培养基中，置摇床中37℃培养48h，然后用接种环将培养的液体于TSA-YE平板上划线培养，于温箱37℃，5％CO2条件下培养72h，再挑取单菌落接种TSB-YE液体培养基，37℃振荡培养48h，离心收集菌体，重悬于67％甲醇PBS溶液中，70℃孵育2h，提取细菌的基因组DNA(具体方法参照天跟生物公司的细菌基因组提取试剂盒说明书)。
1.3基因测序和拼接
应用高通量测序平台454 GS FLX(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)对羊种布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90及其亲本强毒株M28的全基因组进行测序。测序覆盖率分别达到21和29倍。经GS de novo Assembler software(http://www.454.com/)拼接获得79和29个contigs。多重PCR确定contigs间的顺序关系。与参考序列B.melitensis16M比对确定基因组Gaps，并通用ABI 3730xl capillary sequencers测通Gaps。然后用Phred，Phrap and Consed software packages(http://www.genome.washington.edu)拼接完成全基因组序列。两株菌的全基因组已上传上传GenBank基因组数据库，登录号分别为B.melitensis M28(CP002459-CP002460)和M5-90(CP001851-CP001852)。
1.4基因预测和注释
编码序列CDSs利用软件ZCURVE和Glimmer 3.0(Delcher，A.L.，D.Harmon，S.Kasif，O.White，and S.L.Salzberg.1999.Improved microbial gene identification withGLIMMER.Nucleic Acids Res 27：4636-4641.)进行预测。插入序列通过搜索IS Finderdatabase(http://www-is.biotoul.fr/is.html)确定。用tRNAScan-SE软件预测tRNA。通过BLASTP软件搜索NCBI和KEGG蛋白数据库对编码蛋白进行注释。蛋白代谢通路通过KEGG数据库构建。用PSORTb软件对蛋白进行亚细胞定位。
1.5基因组比较和系统进化分析
本研究比较级系统进化分析涉及的基因组如下：B.melitensis 16M(NC_003317，NC_003318)，B.melitensis ATCC 23457(NC_012441，NC_012442)，B.suis 1330(NC_004310，NC_004311)，B.abortus 9-941(NC_006932，NC_006933)，B.melitensisbiovar Abortus 2308(NC_007618，NC_007624)，B.ovis ATCC 25840(NC_009505，NC_009504)，B.suis ATCC 23445(NC_010169，NC_010167)，B.canis ATCC 23365(NC_010103，NC_010104)and B.abortus S19(NC_010742，NC_010740)，B.microt CCM4915(NC_013119，NC_013118)，Ochrobactrum anthropi ATCC 49188(NC_009667，NC_009668)，and two uncomplated sequences B.melitensis bv.1 str.Rev.1[NZ_ACEG00000000]and B.melitensis bv.3 str.Ether[NZ_ACEI00000000](Pruitt，K.D.，T.Tatusova，D.R.Maglott.2005.NCBI Reference Sequence(RefSeq)：a curatednon-redundant sequence database of genomes，transcripts and proteins.Nucleic Acids Res33：501-504.).
M5-90基因组与M28及马耳他布氏杆菌国际标准株16M和ATCC 23457单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)分析应用软件Mauve 2.3.0 Darling，A.C.E.，B.Mau，F.R.Blatter，和N.T.Perna.2004.Mauve：multiple alignment ofconserved genomic sequence with rearrangements.Genome Research.14：1394-1403.
系统进化分析：首先用软件MUSCLE对串联的蛋白进行比对，然后用软件Gblocks提取出比对保守区块。用软件PHYML最大似然法构建进化树。参数如下：100bootstrap分析重复抽样次数；“JTT”取代样本；“estimated”不变位点比例；“estimated”伽马分布参数；“4”取代分类数；“yes”树形优化布局；“BIONJ”进化树“根”。用软件MEGA对进化树进行编辑和图形化(Edgar，R.C.2004.MUSCLE：amultiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.BMCbioinformatics 5，113.Castresana，J.2000.Selection of conserved blocks from multiplealignments for their use in phylogenetic analysis.Molecular biology and evolution 17：540-552.Guindon，S.& Gascuel，O.2003.A simple，fast，and accurate algorithm to estimatelarge phylogenies by maximum likelihood.Systematic biology 52：696-704.Tamura，K.，J.Dudley，M.Nei，and S.Kumar.2007.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular biology and evolution 24：1596-1599.)。
1.6应用本地比对软件BLAST version 2.2.21对弱毒株M5-90基因与强毒株两两比对，分析插入与缺失突变(Indels)。将定位于CDSs内的Indels和非同义替换SNPs突变基因作为毒力相关候选基因。
1.7延伸因子tuf基因突变株的构建
1.7.1自杀质粒同源臂tuf基因外侧序列基因扩增及序列测定
布氏杆菌基因组含有两个拷贝的延伸因子tuf编码基因，分别是BM28_A1246(tuf-1)和BM28_A1261(tuf-2)。取M28细菌基因组，利用高保真PrimeSTAR(Takara公司)，BM28_A1246和BM28_A1261左右臂引物对(表1，BM28_A1246左臂(tuf1-l)：引物tuf1-l-f和tuf1-l-r；BM28_A1246右臂(tuf1-r)：引物tuf1-r-f和tuf1-r-r；BM28_A1261左臂(tuf2-l)：引物tuf2-l-f和tuf2-l-r；BM28_A1261右臂(tuf2-r)：引物tuf2-r-f和tuf2-r-r)分别PCR扩增这两个tuf基因拷贝的左臂和右臂同源基因。PCR程序，98℃预热10sec，30个循环为98℃10s，58℃15s，72℃1.5min，72℃终止反应10min。将各个PCR产物分别克隆于pBluescript-II的EcoRV位点，获得的质粒分别命名为pBlue-tuf1-l、pBlue-tuf1-r、pBlue-tuf2-l和pBlue-tuf2-r，对这些基因进行序列测定。
表1构建自杀质粒pSP-tuf-k和鉴定tuf突变株及tuf克隆所用引物
1.7.2含有外源基因自杀质粒pSP-tuf-k(即pSP-tuf1-k和pSP-tuf2-k)的构建
用ClaI和Kpn I从pBlue-tuf1-l上切下tuf1-l片段，EcoR I和Kpn I从pBlue-tuf2-l上切下tuf2-l片段；Pst I和Xhol I切下pBlue-tuf1-r及质粒pBlue-tuf2-r上的tuf1-r和tuf2-r片段，pBlue-Kanr(含有Kanr)用Kpn I和Pst I同样处理，回收Kanr基因片段。以pSP72质粒为载体，自杀质粒pSP-tuf2-k克隆按先插入L臂(即tuf2-l片段)，再插入Kanr，后R臂(即tuf2-r片段)的顺序构建；pSP-tuf1-k按先插入R臂(即tuf1-r)，再Kanr，后L臂(即tuf1-l)的顺序构建。tuf同源臂之间表达元件的示意图见图1，其中tuf可以是tuf1或tuf2，相应地tuf-l可以是tuf1-l或tuf2-l，tuf-r可以是tuf1-r或tuf2-r，pSP-tuf-k可以是pSP-tuf1-k或pSP-tuf2-k，区别仅在于所用的左右同源臂基因片段分别是tuf1和tuf2的左右臂基因。其中Kanr基因定向插入，其使用的转录翻译的调控元件和阅读框架均来自tuf基因，而且tuf基因完全被替换掉。中量制备质粒pSP-tuf1-k和pSP-tuf2-k，将浓度调整为1μg/μL(Qiangen试剂盒)。
1.7.3 M28和M5-90tuf突变株构建、筛选及卡那霉素基因表达稳定性的检测
M28强毒株和M5-90受态细胞制备方法，100ml培养基37℃培养6h，OD600约为0.4～0.6时，收获细菌5000g离心10min，10％甘油水溶液洗3次，重悬于2.5ml冰冷10％甘油水溶液，200μl分装，置于-80℃保存备用。电转化(Bio-rad)质粒pSP-tuf1-k或pSP-tuf2-k到M28或M5-90细菌(E.Susan Drazek，Huo-shu H.Houng，Robert M.Crawford.Deletion of purE Attenuates Brucella melitensis 16M for Growth in HumanMonocyte-Derived Macrophages.Infection and Immunity，1995，63：3297-3301.)。
具体地，取10μg pSP-tuf1-k或pSP-tuf2-k质粒加入置于冰上的M28或M5-90感受态细胞，电转化条件为0.2cm的转化杯(Bio-rad)，25μF，2.5KV，400Ω，6ms，然后迅速将其转移至1mL的SOC培养基(Invotrogen)中，37℃预热后转移250rpm摇床培养活化3h，全部涂布于含有卡那霉素TSB的平板上，72h后观察菌落。将含有卡那霉素抗性的菌落一分为二分别划线到卡那霉素和氨苄青霉素的TSB平板上，进一步确认阳性克隆的抗性。双交叉只有卡那霉素抗性。将获得的阳性克隆(双交叉筛选)在卡那霉素和氨苄青霉素的平板上传代20代，检验外源Kanr基因能否在突变株中稳定表达。
取1mL新鲜培养的tuf突变株菌液12000g离心后弃掉上清。重悬于67％甲醇PBS(pH 7.2)溶液中，70℃孵育2h，试剂盒提取细菌基因组。利用引物jd-tuf-l-f和jd-tuf-r-rPCR鉴定Kanr基因是否存在于tuf突变株，并进一步克隆测序鉴定。
通过PCR方法验证，获得M28的tuf-1基因的突变株、M28的tuf-2基因的突变株以及M5-90的tuf-2基因的突变株，分别命名为M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2。无法获得M5-90的tuf-1基因的突变株(M90-tuf1)。
1.7.4突变菌株生化特性及生长曲线测定
按照文献(胡森(2009)马耳他布鲁氏菌M5-90 bp26基因缺失疫苗株的构建及安全性和免疫原性评估.[D]东北农业大学)所述方法，对突变株一般生物学特性(形态学、生化特性等)进行检测；生长曲线测定：将各突变株以及其亲本株M28和M5-90涂布TSA平板，3天后取单个菌落接种于新鲜TSB液体培养基中。隔一定时间取1mL菌液，4℃暂存。待72h后作10倍系列稀释，分别涂于TSA平板(突变株培养基加卡那霉素抗性)，每个涂3个板。5天后菌落计数和统计，计算并绘制生长曲线。复制生长特性统计分析按文献(Gibby IW，Gibby AM(1964)Population Dynamics ofBrucella on Solid Media.Appl Microbiol 12：442-446)方法计算。
1.8 EF-Tu克隆表达
设计tuf基因上下游引物tuf-f和tuf-r(表1)，取M28细菌基因组，克隆延伸因子全ORF，BamHI和XhoI酶切处理，定向插入同样用BamHI和XhoI酶切处理的pET30a表达载体。将酶切并测序鉴定正确阳性质粒转入Rosetta/BL21(DE3)(Invitrogen)，IPTG诱导表达、菌体重组蛋白纯化及Western Blot分析按文献(王方昆(2007)H9N2亚型猪流感病毒M、NS、NP基因的原核表达和ELISA检测技术的研究.[D]山东农业大学)所述方法进行。纯化重组蛋白按文献介绍方法(Wenxing Liu，Sen Hu，Zujian Qiao，Weiye Chen，Lintao Liu，et al.Expression，purification，and improved antigenic specificityof a truncated recombinant bp26 protein of Brucella melitensis M5-90：a potential antigenfor differential serodiagnosis of brucellosis in sheep and goats.Biotechnology and AppliedBiochemistry 58：32-38)建立tuf-iELISA，检测背景清晰阴、阳性血清，探讨在布病血清学诊断应用前景。
1.9 EF-Tu免疫小鼠免疫保护实验
5周龄雌性BALB/c(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)20只，以纯化蛋白100mg/只剂量免疫小鼠3次，其中10只为PBS空白对照，每次间隔2周。第三次免疫后2周，免疫组及空白组小鼠，分别用M28和M5-90以1×105CFU(菌落形成单位)量腹腔接种攻毒，攻毒14天后将所有小鼠断颈处死，脾脏称重并分离细菌计数，分析免疫保护效果。
1.10小鼠体内感染实验
4-5周龄雌性BALB/c小鼠，分6组，每组30只。分别腹腔免疫M28、M5-90、M28-tuf1，M28-tuf2和M90-tuf2免疫剂量为1×105CFU(菌落形成单位)。分别在免疫后第1，2，3，4，7周时颈部拉断处死小鼠5只。无菌取脾脏称重，然后加入1mL的PBS匀浆。10倍系列稀释匀浆液，取100μl涂TSA培养基(BD公司)平板，菌落可以在37℃培养4天后出现。
2结果
2.1.1 Brucella melitensis M5-90和M28基因组
用GS-FLX焦磷酸测序技术鸟枪法对基因组进行测序并结合Sanger法测通Gaps。布氏杆菌基因组由两条染色体组成，分别长约2.13Mbp和1.19Mbp。M28和M5-90分别编码3363和3361个蛋白基因(表2)。
表2 M5-90和M28基因组与同种标准株特征比较。
2.1.2 Brucella melitensis M5-90和M28遗传和进化分析
Brucella melitensis M5-90和M28在基因组大小和编码基因极其相似。与其他六个经典布氏杆菌种十株布氏杆菌比较，M28和M5-90划分于羊种布氏杆菌，与生物2型ATCC23457亲缘关系最近(图2)。SNPs分析显示，M5-90和M28只有126个SNPs，而M5-90与ATCC 23457、16M分别有372和2,959个(表3)。
表3 SNPs分析
2.1.2毒力相关基因
分析发现全基因组只有31个编码序列(CDS)含有Indels，其中四个为转座酶(BM28_A0145，BM28_A0932，BM28_A0989和BM28_B0522)，BM28_B0076和BM28_B0963在ORF 3’端缺失或插入的是终止信号，对编码蛋白无影响(表4)。其它25个突变蛋白可能与M5-90致弱相关，其中M28编码基因延伸因子tuf(BM28_A1261)与同种强毒株16M、ATCC 23457及其他种强毒株比较完全相同，而在M5-90基因组中存在9个Indels，同时有50个SNPs，变异最大，导致其移码突变，基因断裂。
表4 M5-90与M28插入或缺失影响基因列表。
| gene | Indelsa | production |
| BM28_A0145 | +4 | Transposase |
| BM28_A0177 | +0 | Sodium：dicarboxylate symporter，DUF540 |
| BM28_A0277 | -1 | conserved hypothetical protein |
| BM28_A0422 | -1 | Methyltransferase |
| BM28_A0655 | +1 | lytic transglycosylase catalytic |
| BM28_A0683 | -2 | conserved hypothetical protein |
| BM28_A0904 | -1 | tRNA(uracil-5-)-methyltransferase Gid |
| BM28_A0932 | -1 | Transposase |
| BM28_A0936 | +1 | conserved hypothetical protein |
| BM28_A0938 | +1 | conserved hypothetical protein |
| BM28_A0989 | -1 | IS6501 transposase |
| BM28_A1137 | -1 | Dehydrogenase，E1 component |
| BM28_A1164 | -1 | phosphatidate cytidylyltransferase |
| BM28_A1215 | +1 | recombination factor protein RarA |
| BM28_A1261 | +7 | elongation factor Tu |
| BM28_A1528 | -1 | conserved hypothetical protein |
| BM28_A1618 | +1 | transcriptional regulator，Cro/CI family |
| BM28_A2028 | -1 | alcohol dehydrogenase(acceptor) |
| BM28_B0001 | +1 | replication initiation protein RepC |
| BM28_B0076 | +8 | nodulation protein nfed，c-terminal only |
| BM28_B0107 | -1 | O-antigen polymerase |
| BM28_B0388 | +1 | lipopolysaccharide biosynthesis protein |
| BM28_B0404 | 0 | conserved hypothetical protein |
| BM28_B0522 | -2 | conserved hypothetical protein |
| BM28_B0564 | +1 | conserved hypothetical protein |
| BM28_B0697 | +1 | pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase |
| BM28_B0699 | +1 | putative Cytosolic Protein |
| BM28_B0885 | +1 | hypothetical protein |
| BM28_B0947 | -1 | alanine dehydrogenase/PNT domain-containing protein |
| BM28_B0963 | -16 | WD-repeat family protein |
| BM28_B0980 | -1 | hypothetical protein |
注：a M5-90相对M28“+”、“-”分别代表插入和缺失，“0”代表插入个数＝缺失个数。
2.1 pSP-tuf1-k和pSP-tuf2-k转移载体构建及鉴定
tuf基因同源臂的扩增产物(图3A所示)，左右同源臂大小与理论值1019bp和1013bp相符。序列测定结果表明tuf基因同源臂基因来自M28。pSP-tuf1-k上tuf基因左右同源臂用EcoR I和BamH I双酶切鉴定，分别切出1700bp和500bp条带；Kanr基因用pstI和Xho I鉴定，分别切出1707bp和943bp条带。pSP-tuf2-k上tuf基因左右同源臂用XbaI和Xho I酶切鉴定，切出2415bp条带，Kanr基因用Xho I和Nco I酶切鉴定，分别切出1330bp和700bp条带。与理论值相符(图3B和3C)，将阳性质粒测序验证，证明pSP-tuf1-k和pSP-tuf2-k转移载体构建成功。经序列比对分析，M28的tuf-1和tuf-2两侧臂序列与M5-90的完全相同，该转移载体可同时用于M5-90同源重组分析。
2.2重组蛋白EF-Tu克隆纯化
将tuf全长定向克隆到pET30a表达载体中，经BamHI和Xho I双酶切鉴定pET-tuf(图3D)。将阳性克隆转入Rosetta/BL21(DE3)表达。阳性菌转接100mL LB诱导表达，将菌体重组蛋白按文献(王方昆(2007)H9N2亚型猪流感病毒M、NS、NP基因的原核表达和ELISA检测技术的研究.[D]山东农业大学)所述方法进行纯化(图4)。将纯化蛋白用BI-RAD蛋白定量试剂盒定量，确定蛋白浓度为2mg/mL。纯化蛋白半干法转印NC膜，可被布氏杆菌小鼠阳性血清(M28、M5-90)特异性识别(图4)，且该蛋白与强毒M28阳性血清反应性更强。
2.3 EF-Tu蛋白免疫原性分析
本研究通过短期免疫保护试验检测EF-Tu免疫保护力。EF-Tu三次免疫14天后，强毒株M28和疫苗株M5-90攻毒，15天后脾脏分离细菌。结果如图5B所示，EF-Tu免疫小鼠脾脏分离的强弱毒菌数均明显低于PBS对照组约1个Log，t检验p＜0.05，差异显著。另外，通过对攻毒后小鼠脾脏重量进行比较分析，如如图5A所示。EF-Tu免疫组和空白组，M28攻毒后脾脏与非攻毒组比较，高度肿大，但M28攻毒组间t检验的p值＞0.05，差异不显著。M5-90攻毒后，EF-Tu免疫组的脾重约0.197±0.012g/脾，脾脏比非免疫M5-90攻毒组显著肿大，炎症反应更重。这充分说明，EF-Tu具有良好的免疫原性，能够显著降低脾脏的菌分离数，提供一定的免疫保护。
2.4重组蛋白tuf-iELISA检测
按文献(王方昆，袁秀芳，刘思当，张存，徐丽华，et al.(2008)重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立.浙江农业学报20：408-413)介绍方法，通过方阵法确定ELISA蛋白包被浓度为2μg/孔，血清稀释度1∶40。RBPT和cELISA(WenxingLiu，Sen Hu，Zujian Qiao，Weiye Chen，Lintao Liu，et al.Expression，purification，andimproved antigenic specificity of a truncated recombinant bp26 protein of Brucellamelitensis M5-90：a potential antigen for differential serodiagnosis of brucellosis in sheepand goats.Biotechnology and Applied Biochemistry 58：32-38)验证为阴性羊血清67份，而bp26-iELISA和tuf-iELISA方法检测，结果阳性率分别为1％和5％，阴性总符合率为92.5％，同时数据经统计学分析，平均值X＝0.188，标准差SD＝0.093，取置信区间上限(99.9％)：X+3SD＝0.468作为血清检测阳性判定下线。
应用初步建立的tuf-iELISA检测M5-90免疫山羊和绵羊血清、突变株M5-90-26免疫山羊血清和现地羊阳性血清(齐齐哈尔)共计125份血清，并与本实验室建立的cELISA(王加兰，胡森，高红霞，郑孝辉，步志高(2009)光滑型布鲁杆菌抗体竞争ELISA检测方法的建立.中国兽医科学39：803-809)和bp26-iELISA(Wenxing Liu，SenHu，Zujian Qiao，Weiye Chen，Lintao Liu，et al.Expression，purification，and improvedantigenic specificity of a truncated recombinant bp26 protein of Brucella melitensis M5-90：a potential antigen for differential serodiagnosis of brucellosis in sheep and goats.Biotechnology and Applied Biochemistry 58：32-38)方法进行平行比较分析(表5)。
表5羊血清多种检测方法分析
注：abp26-iELISA和tuf-iELISA检测阴性结果符合率。
2.5突变菌株抗性筛选及PCR鉴定
将获得的阳性克隆在卡那霉素抗性平板上传代20代各突变株命名为M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2。取新鲜培养的M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2菌液，试剂盒提取细菌基因组。设计位于左臂外的上游引物和Kanr编码区内下游引物(表1)，PCR扩增M28-tuf1约1200bp条带，M28-tuf2和M90-tuf2约1100bp条带(图6)；同时自杀质粒扩增无条带证实菌体卡那霉素抗性非由残留质粒提供，排除假阳性干扰。最终经测序证明重组M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2构建成功。
2.6突变株生物学特性
经革兰氏染色，镜下观察突变株与亲本株形态学一致；吖啶橙试验、A/M单因子血清凝集试验等证明其种及凝集特性与亲本株保持一致。抗R血清的凝集试验证明了缺失株为光滑型菌株。为检测突变株其生长特性是否发生改变，本实验将突变株和亲本株培养于TSB液体培养基中，每隔一段时间取出1mL菌液，72h后将所有收集到的细菌涂板，计数菌落并绘制生长曲线。通过统计分析比对，结果如图7所示，时间与活菌数二者关系显示，开始16h之内细菌增殖较缓慢，随后进入对数生长期，约40h时细菌复制到达平台期，活菌数最大约为1011～1012。强毒株M28及其突变株M28-tuf1和M28-tuf2生长曲线趋于一致，M5-90与M90-tuf2生长曲线趋于一致，两组菌株间进入平台期后，细菌数相差大约0.5个LOG，但通过t-test分析，每组内菌株间p值均大于0.05，差异不显著。
2.7突变菌株小鼠体内毒力的测定
为了评估突变菌株毒力变化，体内存活及增殖情况。将M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2与亲本强毒株M28及疫苗株M5-90按每只小鼠1×105CFU感染量免疫，比较脾脏分离细菌情况(图8)。研究表明，亲本强毒株很快定植到脾脏，高出M28突变株(M28-tuf1和M28-tuf2)约1个Log，t-test差异极其显著(p＜0.001)；高于疫苗株M5-90及其突变株M90-tuf2 2个Log，t-test差异极显著(p＜0.001)；M28脾脏分离菌数一直缓慢增长，于第三周达到高峰，而其两株突变株于第二周达到峰值，而后缓慢减少；强毒突变株(M28-tuf1和M28-tuf2)间脾脏细菌分离曲线类似，但M28-tuf1从第二周起一直高于M28-tuf2，二者t-test差异不显著(p＝0.826＞0.05)，M5-90及其突变株M90-tuf2分离曲线趋于一致，在第二周达到峰值后迅速进入细菌清除过程，在第四周便降到约3个Log。到第七周，M28及其突变株均下降约1个Log，而疫苗株M5-90及其突变株维持在约3个Log处。
除了菌体于体内停留增殖水平外，脾脏的肿胀程度(即脾重)也是衡量布氏杆菌毒力的一个重要指标，在做脾脏细菌分离曲线同时，对无菌采取的脾脏、称重、统计和分析，结果汇总如图8B所示：M28及其突变株攻毒脾脏第一周明显肿胀，在四周的监测期内一直呈上升趋势；M28与M5-90及其突变株M90-tuf2间t-检验p值均小于0.01，差异极显著；M28与其突变株M28-tuf1和M28-tuf2间t-检验p值均大于0.05，差异不显著；M5-90与M90-tuf2攻毒组脾脏的肿胀程度及变化规律大体一致，肿胀峰值出现于第3周，随后保持平稳的下降趋势，M5-90与M90-tuf2接种小鼠脾脏重量曲线波动较小而且平稳，差异不显著。强毒株M28接种小鼠后脾脏重量迅速升高，出现巨脾症，第四周时，M28接种小鼠的脾重约为疫苗接种脾脏4.5倍；M28突变株脾脏重量也呈现上升趋势，脾重低于M28，但仍高于疫苗接种脾重约3.5倍。随后，强毒株及其突变株脾重均呈下降趋势，到第九周降到约0.2g，但强毒株仍略重于突变株。
3.讨论
在M5-90及其亲本株M28的全基因组测序基础上，经系统比较两株基因组，发现25个毒力相关候选基因，其中延伸因子tuf基因在染色体I上有两个拷贝(BM28_A1246(在本文中也称为tuf-1基因)，BM28_A1261(在本文中也称为tuf-2基因))，而在M5-90基因组上只有tuf-2(BM28_A1261)发生显著突变，可能形成假基因。本研究以延伸因子tuf基因(BM28_A1246，BM28_A1261)作为重组靶位点，以M28和M5-90为亲本，利用tuf-1和tuf-2基因ORF外侧序列作为同源臂，将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中构建突变株；通过小鼠感染模型验证其在M5-90致弱中的作用。
通过实验，成功构建了突变株M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2，而无法获得M90-tuf1突变株。M90-tuf2和亲本株M5-90不论在生长特性还是对小鼠毒力上都无显著差异，说明对M5-90的tuf2位点的突变缺失对M5-90毒力无影响；tuf为布氏杆菌等细菌重要保守看家基因，编码一个主要翻译因子，为细菌必须基因。由于tuf基因是细菌重要看家基因，是翻译蛋白必须的延伸因子，所以无法突变M5-90的tuf1，这也许可以佐证M5-90 tuf2为假基因。对强毒株M28的两个tuf分别突变缺失，发现其对小鼠致病力明显减弱，但比疫苗株致病力强，差异显著；证实tuf2是M5-90致弱的重要基因，但也不是唯一因素。突变株M28-tuf1和M28-tuf2二者之间，M28-tuf1致病力略高于后者，但差异不显著；这说明tuf2可能为布氏杆菌的两个tuf基因的主要毒力相关基因(资料未显示)，在M28人工致弱的持续选择压力下，基因组30％突变集中发生在了该位点。
本实验还对tuf编码蛋白EF-Tu进行原核表达，通过Western-blot验证其具有良好的反应原性，其蛋白免疫小鼠在强毒或弱毒攻击时均能够降低脾脏细菌分离数，提供一定的免疫保护力；EF-Tu并作为包被抗原初步建立tuf-iELISA方法。对于现地RBPT和cELISA检测阳性血清，bp26-iELISA和tuf-iELISA阳性率分别为56％和58％；同时有5份检出bp26抗体阳性、而EF-Tu抗体却是阴性，相反有7份检出bp26抗体阴性、而EF-Tu抗体却是阳性，表明两种蛋白诱导抗体的时相侯，强度有差异，两者结合使用有助于提高阳性检出率，或单独同时使用进行相互佐证。tuf-iELISA方法进行EF-Tu抗体检测，阳性结果分别为强毒自然感染(58％)、M5-90疫苗免疫(山羊30％、绵羊18％)、突变株M5-90-26疫苗免疫(6％)和阴性场(5％)，说明强毒株(自然感染)与疫苗株(M5-90、M5-90-26)(疫苗免疫)在诱导EF-Tu抗体水平上存在较大差异；有文献报道[8，9]，EF-Tu不仅仅是主要胞内功能蛋白，还可以与其它某些蛋白形成蛋白复合体运输到细胞膜或细胞外，而运输到细胞膜或细胞外的EF-Tu更利于宿主对其的抗原捕获和提呈。血清学检测结果说明M5-90疫苗株及M5-90-26突变株tuf-2基因的缺失可能影响到疫苗株EF-Tu蛋白表达和功能。这种影响是否影响到EF-Tu蛋白复合体运输到细胞膜或细胞外，以及EF-Tu蛋白复合体胞外运输是否是布氏杆菌胞内寄生所必需，还需要实验进一步验证。EF-Tu是细胞内第二多的蛋白，其基因必定有一个最强的启动子(周冰曹，刘传暄(2007)翻译延伸因子1A的研究进展.生物技术通讯18：281-284)，EF-Tu的mRNA有特殊的5′TOP序列，负责mRNA的有效翻译，这可以用于某些蛋白细胞内高量表达。针对M5-90 tuf2基因操作，可以探索插入免疫辅助因子或提高细菌自身某抗原因子的表达以提高疫苗株的免疫效力和安全性。
布病为世界范围严重的人兽共患病，目前动物用活苗均对人有一定的致病力，至今没有安全有效的人用疫苗(Fugier E，Pappas G，Gorvel JP(2007)Virulence factors inbrucellosis：implications for aetiopathogenesis and treatment.Expert Rev Mol Med 9：1-10)。由于该病对经济动物的影响和对人类的危害，大多数国家都制定布病防控计划，牛羊疫苗接种结合传统血清学诊断阳性动物扑杀。EF-Tu自身也具有较强的免疫原性，在所有布氏杆菌中高度保守。EF-Tu在研究新一代安全疫苗方面具有独特的优势。
Claims (10)
1.马耳他布氏杆菌延伸因子tuf基因，优选其为马耳他布氏杆菌的染色体I上的BM28_A1261(tuf-2)，更优选其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的延伸因子tuf基因在区分马耳他布氏杆菌(BrucellaMelitensis)疫苗株M5-90和它的亲本株M28中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示。
4.一种区分马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90和它的亲本株M28的方法，所述方法包括PCR扩增延伸因子tuf基因并对该基因进行测序的步骤，优选所述tuf基因为BM28_A1261(tuf-2)。
5.根据权利要求4的方法，其中如果所扩增的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，则指示该疫苗株是马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90；如果所扩增的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，则指示该疫苗株是马耳他布氏杆菌疫苗株M28。
6.一种将马耳他布氏杆菌强毒株毒力致弱的方法，该方法包括将马耳他布氏杆菌强毒株的延伸因子tuf基因突变失活的步骤，优选将马耳他布氏杆菌强毒株基因组中两个拷贝的延伸因子tuf基因(即tuf-1和tuf-2)之一突变失活，更优选所述tuf基因是位于染色体I上的BM28_A1261处的tuf基因拷贝(tuf-2)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述马耳他布氏杆菌强毒株是羊马耳他布氏杆菌强毒株，优选羊马耳他布氏杆菌强毒株M28。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中延伸因子tuf基因的突变失活是通过同源重组实现的。
9.根据权利要求8的方法，其中将抗生素基因通过同源重组替换延伸因子tuf基因，优选所述抗生素基因是卡那霉素抗性基因(Kanr)。
10.根据权利要求6-9中任一项的方法，其中所述马耳他布氏杆菌强毒株的延伸因子tuf基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
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