CN101163499A

CN101163499A - 表面定位的肺炎链球菌多肽

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Publication number: CN101163499A
Application number: CNA2006800098342A
Authority: CN
Inventors: T·科弗德; N·P·耐伯格; P·斯彻罗特兹-金; J·皮特森; A·博埃森; T·A·布罗科霍瓦; J·西格; C·默斯科兹克
Original assignee: ACE Biosciences AS
Current assignee: Zymenex Holding AS
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-09
Publication date: 2008-04-16

Abstract

本发明涉及肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的细胞表面定位多肽，以及其在针对链球菌感染的免疫接种、链球菌诊断和具有抗链球菌活性的化合物鉴定中的用途。在进一步的方面，本发明涉及能够识别肺炎链球菌的细胞表面定位多肽的抗体及其用途。

Description

表面定位的肺炎链球菌多肽

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献特此以其整体引入作为参考。本专利申请要求于2005年2月18日提交的美国临时申请系列号60/653,932的优选权利益，所述临时申请整体引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的细胞表面定位多肽，以及其在针对链球菌感染的免疫接种、链球菌诊断和具有抗链球菌活性的化合物鉴定中的用途。

发明背景

链球菌感染的发生

Sternberg和Pasteur首次鉴定出肺炎链球菌，最初描述为肺炎球菌(Austrian R.The pneumococcus at the millennium：not down，not out.J Infect Dis 1999；179(Suppl 2)：S338-41)。肺炎链球菌是革兰氏阳性有荚膜的球菌。基于多糖荚膜组成方面的差异，鉴定出约90种血清型。这种荚膜是基本的毒力因子。婴儿中的大多数肺炎球菌疾病与这些血清型中的少数相关，所述血清型可以依地区而变。目前的数据暗示，11种最常见的血清型引起所有地区中至少75％的侵袭性疾病。

肺炎链球菌是人病原体。肺炎球菌的储库据推测是无症状的人类携带者的鼻咽。没有动物或昆虫媒介。肺炎链球菌是幼儿中的菌血症、肺炎、脑膜炎和中耳炎的最常见原因。肺炎球菌疾病在幼儿中是非常严重的疾病。在美国，据估计，肺炎链球菌每年在5岁以下的儿童中引起200例死亡，700例脑膜炎，17,000例菌血症，4,900,000例中耳炎(耳感染)。在欧洲和美国，肺炎球菌性肺炎是最常见的社区获得性细菌性肺炎，估计每年影响大约100/100,000位成人。关于发热性菌血症和脑膜炎的相应数字分别是15-19/100,000，和1-2/100,000。一种或多种这些表现的危险在婴儿和老年人中高得多。

脑膜炎是最严重类型的肺炎球菌疾病。在具有肺炎球菌性脑膜炎的5岁以下儿童中，约5％将死于其感染并且其他人可能具有长期问题，例如听力丧失。具有肺炎球菌性肺炎或血流感染的许多儿童将会病得必需住院；具有血流感染或具有伴随血流感染的肺炎的儿童的大约1％将死于其疾病。几乎所有儿童具有耳感染恢复，尽管具有复发性感染的儿童可以遭受听力丧失。

最危险的还是采取免疫抑制化学疗法的患者，具有先天性和获得性免疫缺陷(包括HIV感染)的那些患者，以及具有慢性肾病的那些患者。

表1：在美国每年发生的大多数疾病适应症和住院患者数目，以及在儿童和老年人中的病死率：

疾病适应症	肺炎球菌性肺炎	肺炎球菌性菌血症	肺炎球菌性脑膜炎
疾病适应症	肺炎球菌性肺炎	肺炎球菌性菌血症	肺炎球菌性脑膜炎	美国每年的住院患者	175,000	50,000	3,000-6,000
病死率儿童/老年人	5-7％/更高	20％/60％	30％/80％	美国每年的住院患者	175,000	50,000	3,000-6,000

表2.1998年由Active Bacterial Core surveillance(ABCs)鉴定的侵袭性疾病的发病率、病死率、预计的美国病例和死亡、以及对青霉素不易感的比例

	A群链球菌	B群链球菌	流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)	脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)	肺炎链球菌
	A群链球菌	B群链球菌	流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)	脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)	肺炎链球菌	总发病率^a	3.8	6.5	1.4	1.0	24.1
不同地区间的范围^a	2.6-4.1	4.8-8.5	1.1-2.3	0.6-2.0	20.0-28.9	总发病率^a	3.8	6.5	1.4	1.0	24.1
不同地区间的范围^a	2.6-4.1	4.8-8.5	1.1-2.3	0.6-2.0	20.0-28.9	ABCs区域中的病死率	12.2％	9.5％	13.9％	13.7％	9.3％
预计的美国病例	10,200	17,400	3,900	2,500	63,000	ABCs区域中的病死率	12.2％	9.5％	13.9％	13.7％	9.3％

预计的美国死亡	1,300	1,700	500	400	6,100
预计的美国死亡	1,300	1,700	500	400	6,100	青霉素不易感性^b	0	0	--	1.1％	25.0％

^a发病率＝病例/100,000

^b不易感性包括被分类为中间体或对青霉素有抵抗力的分离物。结果反映了来自1997年的A群链球菌分离物(n＝183)以及组合的来自1997和1998年的B群链球菌分离物(n＝188)的测试。

Schuchat，A等人，“Active Bacterial Core Surveillance of theEmerging Infections. Program Network”，Emerging InfectiousDiseases，第7卷，No.1，Jan-Feb2001。

肺炎链球菌感染的症状

肺炎球菌性肺炎是成人中肺炎球菌疾病的最常见的临床代表。肺炎球菌性肺炎的潜伏期很短，约1-3天。症状一般包括突然发作的发热和寒战或发冷。通常存在单一的发冷，而反复的恶寒战栗并不常见。其他常见症状包括胸膜炎性胸痛、产生粘液脓性锈色痰的咳嗽、呼吸困难(呼吸短促)、呼吸急促(急促呼吸)、缺氧(弱的氧合)、心动过速(快速的心率)、不适和虚弱。

肺炎链球菌感染的治疗和预防

正在显现出来的对于青霉素和其他常用抗生素的抗性强调了开发新型策略来对抗肺炎球菌疾病的重要性。在美国的某些地区，高达40％的侵袭性肺炎球菌分离物对青霉素有抗性。治疗将通常包括广谱头孢菌素和通常的万古霉素，直至获得抗生素敏感性测试的结果。

存在两种市售的针对肺炎链球菌的疫苗：

1.Prevnar(Wyeth)，7价肺炎球菌缀合物疫苗，包含血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的多糖，

2.Pneumovax(Merck Research Laboratories)，23价多糖疫苗，包含23种纯化的荚膜多糖抗原(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。

然而，仍存在对于开发改进的链球菌疫苗的巨大医学需要，因为：

○这些疫苗只涵盖了某些血清型，例如Prevnar可能覆盖了对于美国来说超过85％的肺炎球菌分离物，对于欧洲来说为60-70％，和对于亚洲来说为约55％。

○经历最高比率的肺炎球菌携带和疾病的2岁以下儿童以及免疫妥协的患者在这种疫苗接种后显示出严重受损的抗体应答。

○所述多糖疫苗对于由肺炎链球菌引起的急性中耳炎无效。

○所述多糖疫苗不诱导T细胞依赖性免疫应答。这暗示了记忆B细胞的缺乏，并限制了保护期。

○几种荚膜多糖是弱免疫原性的。这些包括与青霉素抗性有关的几种血清型。

目前，几种肺炎球菌表面蛋白质因为其血清型独立性而被视为备选的疫苗候选物。然而，到目前为止，没有一种蛋白质被认为诱发在种类方面广泛的肺炎球菌保护。这可以通过在大多数个体蛋白质内发生的等位基因变异来解释。针对单一蛋白质产生的抗体可能不识别等位基因变体。在发展中国家中，针对肺炎的功效是决定新疫苗使用的重要因素。

除治疗和预防的更佳方式之外，还需要用于诊断肺炎链球菌感染的新型、快速且可靠的方法。

上述目标可以通过鉴定和使用合适的肺炎链球菌多肽来实现，所述多肽可以充当靶，即免疫系统和/或抗体的靶，细胞毒性抑制剂的靶，或诊断中的指示剂部分的靶。

发明概述

本申请涉及肺炎链球菌的表面定位多肽。在本申请的上下文中，“表面定位(surface-located)”多肽被定义为至少部分(即多肽链的一部分和/或多肽分子群体的一部分)位于肺炎链球菌细胞膜外的多肽。因此，表面定位多肽是完全或部分暴露于膜外空间的多肽。表面定位多肽还包括可以在通过如本文所述的高pH表面蛋白质提取或变溶菌素消化而获得的级分中鉴定出的所有多肽或多肽片段，

表面定位多肽对于抗菌疗法和/或细菌感染的诊断来说是有吸引力的靶，因为此类多肽暴露于细胞外空间意味着与这些多肽相互作用的化合物(例如用于预防、治疗或诊断细菌感染的化合物)通常不需要进入或穿过膜就可生效。

肺炎链球菌多肽的细胞表面定位的测定目前只能通过实验来完成，并且不能通过生物信息学来完成，因为对于这种定位没有已知的常见分选信号或基序。可能可以有一定把握度地预测多肽是否进入周质，但还没有鉴定出关于多肽表面定位的一般基序。关于鉴定用于针对肺炎链球菌的蛋白质疫苗接种的候选物的现有技术策略主要基于基因组测序和计算机分析(WO 02/077021；Wizemann等人(2001)Infect.Immun.69：1593-1598)。这些策略不是很成功，因为只有小亚群的鉴定出并进行测试的候选物在小鼠模型中给予了保护(Wizemann等人(2001)Infect.Immun.69：1593-1598)。

本发明人已鉴定出在肺炎链球菌的细胞表面级分中的282种不同的多肽。所采用的方法鉴定出以相对较高水平表达的多肽。表面暴露和以相对较大的量存在这一组合使得这些多肽高度适合作为抗体的靶，并因此适合于在被动或主动免疫接种/疫苗接种中使用。

因此，在第一个方面，本发明涉及组合物，其包括

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282的表面定位的链球菌多肽的序列，或包含所述序列的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，或

-抗体，其能够结合所述多肽，

所述组合物用作药物。

在一个优选实施方案中，所述组合物包括

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：28的序列，或包含所述序列的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体。

在一个更加优选的实施方案中，所述组合物包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：16，或者包含SEQ ID NO：16的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

SEQ ID NO：16表示硫辛酸-蛋白质连接酶A的同系物，该酶以前已在大肠杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)中进行了鉴定和表征(Morris等人(1994)J.Biol.Chem.269：16091；O′Riordan等人(2003)Science 302：462)。这个家族的蛋白质以前未在细胞表面上被鉴定或被发现是疫苗候选物或关于抗体疗法的合适靶。

在另一优选实施方案中，所述组合物包括能够结合选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽的抗体。在一个更加优选的实施方案中，所述多肽是SEQ ID NO：16。

在一个进一步的主要方面，本发明涉及组合物在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗细菌，优选链球菌，更优选肺炎链球菌感染的药物中的用途，所述组合物包括

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体。优选的序列是SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：28。最优选SEQ ID NO：16。

在一个进一步的主要方面，本发明涉及能够结合选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抗体。

此外，本发明在一个主要方面涉及能够结合选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抗体在制备用于治疗或预防动物或人类中链球菌，优选肺炎链球菌感染的药物中的用途。能够结合选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：33的多肽的抗体的用途是优选的。

最优选的是，能够结合SEQ ID NO：16的多肽的抗体在制备用于治疗或预防动物或人类中链球菌，优选肺炎链球菌感染的药物中的用途。

表面暴露和以相对较大的量存在这一组合还使得由本发明人所鉴定的多肽高度适合于作为用于诊断肺炎链球菌感染的靶，允许以高灵敏度检测完整细胞。因此，在一个进一步的主要方面，本发明涉及使用能够识别本文所描述的细胞表面定位多肽的指示剂部分来检测肺炎链球菌或其部分的方法。

此外，所述多肽的表面定位使得它们适合于作为抑制剂的靶。此类抑制剂可以是杀菌的或抑菌的或者阻止肺炎链球菌与宿主生物的相互作用(毒力)。因此，在一个进一步的主要方面，本发明涉及用于鉴定本文所描述的细胞表面定位多肽的抑制剂的方法。

定义

-疫苗。其用于指能够在人类或动物中诱导针对微生物的保护性免疫应答的组合物。

-保护性免疫应答。其用于指在生物中引起记忆的免疫应答(体液/抗体和/或细胞免疫应答)，导致传染剂(本文中为肺炎链球菌)遇到次级而不是初级应答，从而减少其对宿主生物的影响。

-多肽。除非另有说明，术语“多肽”在本文中使用时还可指多肽的变体或片段。优选的多肽是抗原性多肽。

-片段。其用于指多肽的非全长部分。因此，片段自身也是多肽。

-变体。给定的参照多肽的“变体”是指展示出与所述参照多肽的一定程度的序列同一性的多肽，但不等同于所述参照多肽。

-抗原/抗原的/抗原性/免疫原/免疫原的/免疫原性。这些术语都指诱导免疫应答的能力。

-免疫原性载体(immunogenic carrier)。其指直接或间接帮助或增强免疫应答的化合物。

-表达载体。其指用于从多核苷酸序列产生多肽的(优选重组的)质粒或噬菌体或病毒。表达载体包括表达构建体，其包括(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如启动子或增强子，(2)被转录为mRNA并被翻译为蛋白质，并且与(1)的元件可操作地连接的结构或编码序列；和(3)合适的转录起始和终止序列的集合。

-多肽的结合配偶体(binding partner)。其指可以结合所述多肽的分子。此类结合可以是间接的，通过另一分子，但优选是直接的。结合配偶体可以是任何类型的分子，例如小的疏水性分子，或者例如细胞或细胞外的大分子，例如蛋白质，碳水化合物或核酸。结合配偶体的优选类型包括抗体、配体或抑制剂。

-多个。术语“多个”指超过1个，优选超过10个。

-指示剂部分。术语“指示剂部分”包括能够特异性地结合给定多肽和/或细胞且能够产生可检测信号的分子或分子复合物。优选地，指示剂部分是抗体或者包括抗体分子。因此，优选的指示剂部分是与可检测物质相偶联或复合的抗体。

-源自宿主的分子或宿主分子。其指通常在可以被肺炎链球菌感染的宿主生物中发现的分子。源自宿主的分子优选是宿主多肽，优选人多肽。

-抗体。术语“抗体”在本文中使用时意欲包括抗体以及其功能等价物。因此，这包括多克隆抗体，单克隆抗体(mAbs)，人源化、人或嵌合抗体，单链抗体，还有抗体的结合片段，例如但不限于，Fab片段，F(ab′)₂片段，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型抗体，包含抗体片段的杂合物，以及这些中的任何一个的表位结合片段。该术语还包括多价抗体，多特异性抗体，例如双特异性抗体，以及单克隆抗体的混合物。

-解离常数，Kd。其是描述大分子例如抗体及其抗原之间的结合强度(或亲和性或亲和力)的量度。Kd越小，结合越强。

-分离的。当与本文公开的多肽、多核苷酸和抗体相结合使用时，“分离的”指已从其天然(一般是细胞的)环境的组分中鉴定和分离和/或回收的这些。天然环境的污染性组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质性质的或非蛋白质性质的溶质。本发明的多肽、多核苷酸和抗体优选是分离的，并且本发明的疫苗及其他组合物优选包括分离的多肽或分离的多核苷酸或分离的抗体。

发明详述

附图

图1：本发明的优选组合物的表。列和行中的数字表示SEQ ID NOs。每个交叉号表示包括该交叉号所属列的多肽(或其抗原性片段或变体)以及该交叉号所属行的多肽(或其抗原性片段或变体)的组合物。

图2：表面定位的肺炎链球菌多肽的氨基酸序列列表。

图3：在感染一天时，使用来源于感染了肺炎链球菌D39的小鼠脾脏的cDNA所进行的RT-PCR。使用对于抗原029(SEQ ID NO：16)、060(SEQ ID NO：26)、607(SEQ ID NO：20)和653(SEQ ID NO：33)的转录物特异的引物。此外，使用对肺炎球菌RNA聚合酶σ70亚基(持家基因)的转录物特异的引物。-RT：不含逆转录酶的对照；+RT：RT-PCR；N：无模板的对照。

图4：使用患者血清(单个患者)来检测rec.vac.(抗原)029、060、144、487、607、646和653的免疫印迹。

图5：在疫苗接种第0、21和35天，抗原(ags)029、060、607、653以及对照(包括未处理的动物(未免疫接种的)、单独的明矾佐剂和无关抗原)的免疫原性。

图6：用肺炎链球菌D39攻击后6小时，在用抗原(ags)029、060、607、653以及对照(包括未处理的动物(未免疫接种的)、单独的明矾佐剂和无关抗原)疫苗接种的小鼠血液中的CFU。

图7：与对照组(包括未处理的动物(未免疫接种的)、单独的明矾佐剂和无关抗原(σ))相比较，在用肺炎链球菌D39攻击经抗原(ags)029和607疫苗接种的小鼠后的存活者。

用作药物的组合物

在第一个主要方面，本发明涉及组合物，其包括

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282的表面定位的肺炎链球菌多肽的序列，或包含所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，

-抗体，其能够结合所述多肽，

所述组合物用作药物。

在一个重要实施方案中，所述组合物包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

所述组合物可以用作疫苗以用于有此需要的个体的主动免疫接种。这在“本发明的疫苗组合物和疫苗接种方法”部分中描述。

在一个优选实施方案中，所述组合物包括多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1-282的序列或包含所述序列的抗原性片段或变体。

在另一重要实施方案中，所述组合物包括能够结合多肽的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO：1-282的表面定位的肺炎链球菌多肽。所述组合物可以例如用于有此需要的个体的被动免疫接种。这在“本发明的抗体和用于产生抗体的方法”部分中描述。

本发明的疫苗组合物和疫苗接种的方法

疫苗接种或主动免疫接种的目标是通过使用抗原性或免疫原性组合物诱导针对传染性微生物的记忆应答来提供保护性免疫。因此，疫苗是能够在人类或动物中诱导针对微生物的保护性免疫应答的组合物。此类免疫应答可以是细胞应答和/或体液应答，例如特异性T细胞应答或抗体应答。

因此，在一个重要的实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。即，本发明涉及组合物作为疫苗的用途，所述组合物包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

本文的变体优选与所述序列具有至少95％的序列同一性，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

在上述组合物的一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：1或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：3或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：4或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：5或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：6或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：7或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：8或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：9或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：10或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：11或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：12或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：13或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：14或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：15或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：16或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：17或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：18或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：19或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：20或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：21或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：22或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：23或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：24或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：25或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：26或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：27或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：28或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：29或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：30或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：31或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：32或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：33或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：34或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：35或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：36或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：37或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：38或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：39或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：40或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：41或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：42或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：43或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：44或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：45或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：46或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：47或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：48或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：49或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：50或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：51或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：52或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：53或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：54或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：55或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：56或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：57或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：58或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：59或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：60或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：61或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：62或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：63或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：64或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：65或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：66或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：67或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：68或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：69或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：70或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：71或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：72或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：73或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：74或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：75或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：76或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：77或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：78或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：79或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：80或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：81或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：82或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：83或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：84或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：85或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：86或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：87或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：88或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：89或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：90或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：91或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：92或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：93或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：94或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：95或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：96或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：97或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：98或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：99或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：100或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：101或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：102或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：103或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：104或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：105或其抗原性片段或变体。

在上述组合物的另一个优选实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：168或其抗原性片段或变体。

用作药物的包括SEQ ID NO：16的多肽或其抗原性片段或变体的组合物目前是最优选的实施方案。

在所述组合物的某些实施方案中，所述多肽由选自SEQ ID NO：1-282的序列组成。在其他实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，或所述序列的抗原性片段或变体，以及标签，例如his-标签，即聚组氨酸标签。

在另一个优选实施方案中，本发明组合物中的多肽可以与毒素，例如肠产毒性大肠杆菌稳定或不稳定毒素相组合或融合。合适的热稳定毒素II(STII)已在Lee等人(1983)Infect.Immun.42：264-268中描述。合适的融合蛋白的例子在SEQ ID NO：295和SEQ ID NO：296中给出。在一个实施方案中，所述组合包括本发明的多肽和非共价连接的毒素，其中毒素可以是单一毒素多肽，或包含多个拷贝的毒素的多聚(例如二聚)形式。在另一个实施方案中，本发明的多肽与毒素是共价连接的，例如通过翻译后键合或从单一融合开放阅读框进行转录和翻译。在任何一种情况下，所述两个组成成分可以直接或经由间隔物或连接体结构域进行连接，所述间隔物或连接体结构域可以是例如肽连接体，优选蛋白酶抗性和/或非免疫原性的肽连接体。此类肽连接体可以具有任何长度，例如它的长度可以为2-200个，例如5-50个氨基酸。多个拷贝的毒素可以融合至本发明的多肽。

包括本发明的多肽例如SEQ ID NO：16的多肽以及肠产毒性大肠杆菌的组合物，可以用于制造用于预防肺炎链球菌和/或肠产毒性埃希氏菌(Escherichia)感染的疫苗。

在进一步的实施方案中，本发明的组合物可以包括SEQ ID NO：1-282中任何多肽的二聚体，例如SEQ ID NO：16的二聚体。二聚体可以例如通过翻译后键合形成或者从单一融合开放阅读框产生。在任何一种情况下，二聚体的两个单体单位可以直接或者经由间隔物或连接体结构域进行连接，所述间隔物或连接体结构域可以是例如肽连接体，优选蛋白酶抗性和/或非免疫原性的肽连接体。此类肽连接体可以具有任何长度，例如它的长度可以为2-200个，例如5-50个氨基酸。

组合物可以只包括选自SEQ ID NO：1-282的一种多肽或其抗原性片段或变体。然而，在其他实施方案中，组合物包括超过一种的选自SEQID NO：1-282的多肽和/或选自SEQ ID NO：1-282的多肽的超过一种的抗原性片段。因此，根据本发明的组合物可以包括超过一种，例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，例如数目为5-10种的多肽和/或片段，或者超过10种，例如10-20种选自SEQ ID NO：1-282的不同多肽或其抗原性片段或变体。

类似地，组合物可以只包括本发明的一种多核苷酸，一种表达载体或者一种重组病毒或重组细胞。然而，在其他实施方案中，组合物包括本发明的超过一种多核苷酸、超过一种表达载体、或者超过一种重组病毒或重组细胞。因此，根据本发明的组合物可以包括如本文所述的本发明的超过一种，例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，或超过10种，例如10-20种不同的多核苷酸、表达载体或者重组病毒或重组细胞。

此外，在某些实施方案中，本发明的重组细胞可以表达超过一种的选自SEQ ID NO：1-282的多肽和/或选自SEQ ID NO：1-282的多肽的超过一种的抗原性片段或变体。因此，根据本发明的组合物可以包括重组细胞，所述重组细胞包含超过一种，例如2种，例如3种，例如4种，例如5种，例如6种，例如7种，例如8种，例如9种，例如10种，例如数目为5-10种的多肽和/或抗原性片段或变体，或者超过10种，例如10-20种选自SEQ ID NO：1-282的不同多肽或其抗原性片段或变体。在另一个实施方案中，在本发明中使用的组合物包括多种本文描述的重组病毒或重组细胞。

优选地，本发明的组合物包括表1中给出的多肽(或其抗原性片段或变体)组合中的一种。

在表1中，位于由SEQ ID号指定的列与由另一SEQ ID号指定的行的交叉点处的每个交叉号(“x”)指明了包括那两个SEQ ID号的两种多肽(或其抗原性片段或变体)的组合物。

即，作为例子，完全用于举例说明的目的而不希望以限制性方式，SEQ ID NO：2的列(“2”)与SEQ ID NO：1的行(“1”)的交叉点处的交叉号(“x”)指明了这样的组合物，其包括

-SEQ ID NO：1的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：2的多肽或其抗原性片段或变体。

高度优选的组合物包括如下的那些组合物：

组合物，其包括：

-SEQ ID NO：16的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：1-41中的任何多肽或其抗原性片段或变体，更优选选自SEQID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20和SEQ DI NO：28的多肽，最优选SEQ ID NO：20的多肽或其抗原性片段或变体。

组合物，其包括：

-SEQ ID NO：10的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：1-41中的任何多肽或其抗原性片段或变体，更优选选自SEQID NO：13、SEQ ID NO：20和SEQ DI NO：28的多肽，最优选SEQ ID NO：20的多肽或其抗原性片段或变体。

组合物，其包括：

-SEQ ID NO：13的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：1-41中的任何多肽或其抗原性片段或变体，更优选选自SEQID NO：20和SEQ DI NO：28的多肽，最优选SEQ ID NO：20的多肽或其抗原性片段或变体。

组合物，其包括：

-SEQ ID NO：28的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：1-41中的任何多肽或其抗原性片段或变体，SEQ ID NO：20的多肽或其抗原性片段或变体。

包括至少3种多肽的优选组合物包括下列组合物：

组合物，其包括选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO.28的3种或更多种多肽。

组合物，其包括：

-SEQ ID NO：16的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：20的多肽或其抗原性片段或变体，和

-SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：1-41中的任何多肽或其抗原性片段或变体，更优选选自SEQID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ DI NO：28的多肽。

根据本发明的进一步优选的组合物包括选自SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO.28的4种或更多种多肽。

在一个更进一步优选的实施方案中，本发明的组合物包括SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO.28的5种多肽。

在包括2种或更多种多肽的上述组合物的某些实施方案中，多肽不是共价连接的。然而，在其他实施方案中，多肽可以形成融合多肽，其通过翻译后键合形成或从单一融合开放阅读框产生。在任何一种情况下，所述2种或更多种多肽可以直接或经由间隔物或连接体结构域进行连接，所述间隔物或连接体结构域例如可以是肽连接体，优选蛋白酶抗性和/或非免疫原性的肽连接体。此类肽连接体可以具有任何长度，例如它的长度可以为2-200个，例如5-50个氨基酸。

包括多肽的疫苗

如上所述，在一个优选实施方案中，本发明涉及用作疫苗的包括多肽的组合物，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，或所述序列的抗原性片段或变体。优选的片段和变体是在本文涉及片段和变体部分中所描述的那些。

因此，在这个实施方案中，通过直接施用通常位于肺炎链球菌细胞表面上的多肽来提供抗原性或免疫原性。在一个具体实施方案中，如此选择所述多肽，即使得疫苗组合物包括能够与不同MHC分子例如不同的I类MHC分子相缔合的多种多肽。优选地，用作疫苗的组合物包括能够与最常出现的I类MHC分子相缔合的多肽和/或片段。在本发明的一个具体实施方案中，组合物包括一种或多种能够与I类MHC分子相缔合的多肽和/或片段以及一种或多种能够与II类MHC分子相缔合的多肽和/或片段。因此，疫苗组合物在某些实施方案中能够产生特异性的细胞毒性T细胞应答和/或特异性的辅助性T细胞应答。与MHC分子的缔合可以例如根据Andersen等人(1999)Tissue Antigens 54：185；或Tan等人(1997)J.Immunol.Methods 209：25所述进行测定。

佐剂和免疫原性载体

优选地，本发明的用作疫苗的组合物，即疫苗组合物，包括如本文在“用于本发明的组合物”部分中描述的药学上可接受的载体。

组合物可以进一步包括佐剂。佐剂是混合到疫苗组合物中以增加或者修饰针对多肽或其他抗原的免疫应答的物质。佐剂可以例如是下列任何一种：AlK(SO₄)₂，AlNa(SO₄)₂，AlNH₄(SO₄)，二氧化硅，明矾，Al(OH)₃，Ca₃(PO₄)₂，高岭土，炭，氢氧化铝，磷酸铝，胞壁酰二肽，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰基-nornuramyl-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，也称为MTP-PE)，在2％角鲨烯/Tween-80.RTM.乳状液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)，脂多糖和衍生物，包括脂质A，弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂，Merck Adjuvant 65，多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)，来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的D蜡(waxD)，在小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中发现的物质，脂质体或其他脂质乳状液，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN(参见US 58767和5,554,372)，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成的肽基质或GMDP，白介素1，白介素2，MontanideISA-51和QS-21。在本发明中使用的优选佐剂包括明矾、MontanideISA-51和QS-21。Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是类似于弗氏不完全佐剂的基于矿物油的佐剂，其通常作为乳状液施用。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是高度纯化的水溶性皂苷，其作为水溶液运用。在本发明组合物中使用的另一优选佐剂是来自Netherlands Vaccine Institute的IMSAVAC-L。在另一个优选实施方案中，将所述多肽包括在病毒体中。

能够依据本发明进行使用的佐剂的所需功能性列于下表中。

表1佐剂作用方式

作用	佐剂类型	益处
作用	佐剂类型	益处	1.免疫调节2.呈递3.CTL诱导4.靶向5.贮藏库的产生	一般是修饰细胞因子网络的小分子或蛋白质一般是与以其天然构象存在的免疫原相互作用的两亲性分子或复合物●可以结合或包封免疫原并且可以与细胞膜融合或使之破裂的颗粒●用于将肽直接附着至细胞表面MHC-1的w/o乳状液●结合免疫原的颗粒佐剂。饱和Kupffer细胞的佐剂●靶向巨噬细胞和DCs上的凝集素受体的碳水化合物佐剂●关于短期的w/o乳状液●关于长期的微球或纳米球	上调免疫应答。选择Th1或Th2增加的中和性抗体应答。更长的应答持续时间产生正确的1类限制酶切肽的蛋白质的胞质加工如果已知是混杂的肽，则为简单加工佐剂和免疫原的有效使用如上。如果选择性靶向，则还可确定应答类型功效单剂量疫苗的效力

来源：John C.Cox和Alan R.Coulter，Vaccine 1997 Feb；15(3)：248-56

根据本发明的疫苗组合物可以包括超过一种的不同佐剂。还考虑了，本发明的肺炎链球菌多肽，或一种或多种其抗原性片段，和佐剂可以以任何合适的顺序分开施用。

选择的佐剂可以是例如弗氏完全或不完全佐剂，或被杀死的百日咳博德特氏菌生物体，其例如与明矾沉淀的抗原组合使用。关于佐剂的一般讨论在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles&Practice(第二版，1986)，第61-63页中提供。然而，Goding注意到，当目的抗原具有低分子量，或具有弱的免疫原性时，建议偶联至免疫原性载体(参见下文)。还提议将各种皂苷提取物和细胞因子用作免疫原性组合物中的佐剂。近来，已提出使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)这种众所周知的细胞因子作为佐剂(WO 97/28816)。

此外，本发明的疫苗组合物可以包括肺炎链球菌多肽或其片段能够与其缔合的免疫原性载体，例如支架结构，例如蛋白质或多糖。因此，在疫苗组合物中存在的肺炎链球菌多肽或其抗原性片段或变体可以与免疫原性载体例如蛋白质缔合。多肽与载体蛋白的结合或缔合可以是共价的或非共价的。免疫原性载体蛋白可以不依赖佐剂而存在。载体蛋白的功能可以是例如增加特定片段的分子量以便增加其活性或免疫原性，赋予稳定性，增加生物学活性，或增加血清半衰期。此外，免疫原性载体蛋白可以帮助将肺炎链球菌多肽或其片段呈递至T细胞。载体蛋白可以是但不限于，匙孔血蓝蛋白，血清蛋白质例如转铁蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，甲状腺球蛋白或卵清蛋白，免疫球蛋白，或激素例如胰岛素。破伤风类毒素和/或白喉类毒素在一个本发明实施方案中也是合适的载体。备选地或另外地，可以加入葡聚糖例如sepharose。在另外一个实施方案中，可以加入抗原呈递细胞例如能够将所述多肽或其片段呈递至T细胞的树突状细胞，以获得与载体蛋白一样的效果。用于制备疫苗组合物的方法已在例如US 5,470,958和其中的参考文献中描述。

在一个进一步的实施方案中，本发明的疫苗组合物可以包括除本发明多肽以外的肺炎链球菌碳水化合物。在一个实施方案中，加入的碳水化合物是来源于一种或多种肺炎链球菌血清型或作为其特征的碳水化合物。在一个优选实施方案中，本发明的多肽与来源于表4中给出的任何一种或多种血清型或作为其特征的多糖相组合。在一个优选实施方案中，所述多肽与一种或多种，优选2、3、4、5、6或7种多糖相组合，所述多糖来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F或作为其特征。在另一个实施方案中，所述多肽与血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的多糖抗原中的8种或更多种，优选10种或更多种，15种或更多种，或20种或更多种相组合。这些碳水化合物可以以游离的形式加入本发明的疫苗组合物中，或备选地，它们可以与本发明的多肽相融合以在疫苗组合物中使用。

本发明的多肽的有效量可以是在免疫调节剂不存在下能够引发可检测的体液免疫应答的量。使用的免疫原的合适量取决于它希望引发的免疫应答。此外，必需的确切有效量可以在从受试者到受试者之间不同，取决于受试者的种类、年龄和一般状况，待治疗的病状的严重度，施用方式等。本发明的多肽疫苗可以以各种剂量施用，包括比通常用于其他疫苗的剂量低的剂量。这可能是因为本发明的多肽在肺炎链球菌细胞表面上是丰富的，因而甚至相当低水平的应答也可以提供免疫性。因此，当用于免疫接种时，本发明多肽的剂量可以是例如0.1-500微克/千克体重，例如0.1-100微克，例如0.1-50微克，例如0.1-25微克，例如8-25微克/千克体重，或少于那种，例如0.1-5微克或0.1-2微克/千克体重。

包括重组病毒或重组细胞的DNA疫苗组合物和疫苗组合物

DNA或RNA疫苗属于通过在患者细胞中过表达多核苷酸构建体而将例如抗原性多肽决定簇导入患者中，所述多核苷酸构建体包括可操作地连接至编码目的多肽的序列的表达控制序列，所述目的多肽在本文中是SEQ ID NO：1-282中的任何多肽或其抗原性片段或变体，优选SEQ ID NO：16的多肽或其抗原性片段或变体。由于这样的片段可以不包含甲硫氨酸起始密码子，因此这一密码子任选被包括为表达控制序列的一部分。多核苷酸构建体可以是非复制性的且线性的多核苷酸，环状表达载体，或自主复制质粒或病毒表达载体。构建体可以整合到宿主基因组中。可以转染哺乳动物细胞的任何表达载体可以在根据本发明的用于免疫接种个体的方法中使用。用于构建表达载体的方法是本领域众所周知的(参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。优选的是包括表达多种多肽的多个基因的组合物，所述多肽选自SEQ ID NO：1-282和/或多种本发明的抗原性片段，从而允许使用各种预先选择的靶同时进行疫苗接种。

疫苗还可通过将编码特异性的目的抗原性多肽的多核苷酸掺入活的但无害的载体中来制备，所述载体例如为病毒或细胞，例如毒力减弱或减少的大肠杆菌或沙门氏菌(Salmonella)细胞。将无害的重组病毒或重组细胞注射到希望的受者中。此类重组细胞可以是死的或活的。如果是活的，那么该重组生物可以在宿主中复制，同时产生抗原性多肽并将其呈递至宿主免疫系统。预期这种类型的疫苗可以比非复制型疫苗更有效。为了此类疫苗能够成功，载体生物可以是有生活力的，并且是天然无毒力的或具有毒力减弱或减少的表型。

关于使用减毒的细菌进行疫苗接种的策略和其中所使用的合适细菌菌株已在例如Makino等人(2001)Microb.Pathog.31：1-8；Gentschev等人(2002)Int.J.Med.Microbiol.291：577-582；Turner等人(2001)Infect.Immun.69：4969-4979；WO99/49026；和WO03/022307中描述。

可以应用的载体的进一步例子是这样的载体，例如包括逆转录病毒，其在WO90/07936、WO91/02805、WO93/25234、WO93/25698和WO94/03622中公开；腺病毒，其在Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988；Li等人，Hum.Gene Ther.4：403-409，1993；Vincent等人，Nat.Genet.5：130-134，1993；和Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219，1994)中公开；痘病毒，其在U.S.4,769,330；美国专利号5,017,487；和WO 89/01973中公开；裸DNA，其在WO 90/11092中公开；与聚阳离子分子复合的多核苷酸分子，其在WO93/03709中公开；以及与脂质体缔合的多核苷酸，其在Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7851，1987中公开。在某些实施方案中，如Curiel等人，Hum.GeneTher.3：147-154，1992；Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6094，1992所公开的，DNA可以连接至杀死的或灭活的腺病毒。其他合适的组合物包括如Wu等人(J.Biol.Chem.264：16985-16987，1989)公开的DNA-配体，和如Felgner等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，1989)公开的脂质-DNA组合。此外，裸DNA摄入到细胞中的效率可以通过将DNA包被在生物可降解的胶乳珠上来增加。

疫苗载体优选包括合适的启动子，其可操作地连接至编码免疫原性多肽的多核苷酸序列。可以在本发明中使用能够在靶细胞中指导高水平的转录起始的任何启动子。因此也可以使用非组织特异型启动子，例如巨细胞病毒启动子(DeBernardi等人，Proc Natl Acad Sci USA 88：9257-9261[1991]，以及其中的参考文献)，小鼠金属硫蛋白I启动子(Hammer等人，J Mol Appl Gen 1：273-288[1982])，HSV胸苷激酶启动子(McKnight，Cell31：355-365[1982])，和SV40早期启动子(Benoist等人，Nature 290：304-310[1981])。

疫苗接种的方法和用于疫苗接种/免疫接种的用途

在一个进一步的主要方面，本发明涉及组合物在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗细菌感染的药物中的用途，所述组合物包括下列中的任何一种或多种：

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体。所述免疫接种优选诱导保护性免疫应答。在上述用途的一个实施方案中，药物只给予一次。

在一个优选实施方案中，所述药物用于针对链球菌感染的免疫接种。最优选地，所述药物用于针对肺炎链球菌的免疫接种。然而，使用肺炎链球菌多肽的免疫接种还可以给予针对其他细菌种类的交叉保护。这通常需要与其他物种的多肽的至少一部分具有显著的同源性。例如在SEQID NO：16与来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)(SEQ ID NO：283)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)(SEQ ID NO：284)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(SEQ ID NO：285)的其变体之间发现了这样的同源性。类似地，在SEQ ID NO：20与来自酿脓链球菌(A群链球菌)(SEQ ID NO：286)、无乳链球菌(B群链球菌)(SEQ ID NO：287)和单核细胞增生利斯特氏菌(SEQ ID NO：288)的其变体之间发现了同源性。

因此，所述药物在某些实施方案中用于针对一种或多种下列微生物的免疫接种：酿脓链球菌(A群链球菌)、无乳链球菌(B群链球菌)和单核细胞增生利斯特氏菌。在此类药物制备中所使用的高度优选的多肽是SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20。

关于针对一种或多种细菌进行免疫接种的备选策略是用包含变体多肽的药物进行免疫。因此，在一个进一步的实施方案中，用于制备药物的多肽是SEQ ID NO：1-282中任一个的变体，优选SEQ ID NO：16的变体和/或SEQ ID NO：20的变体。最优选地，所述多肽选自SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：288，或者其片段或其变体，例如与SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：287或SEQ ID NO：288具有超过95％，例如超过98％的序列同一性的变体。

因此，在某些实施方案中：

-将包含SEQ ID NO：283和/或SEQ ID NO：286，或这两种中任一种的片段或变体的药物用于针对酿脓链球菌和/或肺炎链球菌和/或其他细菌的免疫接种；

-将包含SEQ ID NO：284和/或SEQ ID NO：287，或这两种中任一种的片段或变体的药物用于针对无乳链球菌和/或肺炎链球菌和/或其他细菌的免疫接种；

-将包含SEQ ID NO：285和/或SEQ ID NO：288，或这两种中任一种的片段或变体的药物用于针对单核细胞增生利斯特氏菌和/或肺炎链球菌和/或其他细菌的免疫接种。

在最优选的实施方案中，本文的组合物包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：16，或者包含SEQ ID NO：16的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在另一个优选实施方案中，本文的组合物包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：10，或者包含SEQ ID NO：10的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在另一个优选实施方案中，本文的组合物包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：13，或者包含SEQ ID NO：13的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在另一个优选实施方案中，本文的组合物包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：28，或者包含SEQ ID NO：28的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在另一个优选实施方案中，所述组合物进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：20，或者包含SEQ ID NO：20的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

类似地，本发明涉及用于免疫接种动物或人类以抵抗肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括这样的步骤，即施用下列中的任何一种或多种：

-多肽，其包含SEQ ID NO：1-282中的任何序列，或者包含所述序列的片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，从而免疫接种所述动物或人类以抵抗肺炎链球菌感染。

在用于免疫接种的上述方法的一个实施方案中，只给予一次所述

-多肽，其包含SEQ ID NO：1-282中的任何序列，优选SEQ ID NO：16，或者包含所述序列中任一种的片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，从而通过单次施用来免疫接种所述动物或人类以抵抗肺炎链球菌感染。

动物可以是任何鸟类或哺乳动物，例如鸡、鸭、火鸡、牛或猪。人类中特别的靶群体可以是来自处于危险之中的群体的个体，所述处于危险之中的群体例如为直至4岁大的儿童群体、老年人群体或到发展中国家的免疫上幼稚的或半免疫的旅行者群体。

因为本发明的多肽是免疫原性的并且因为它们在肺炎链球菌细胞上是丰富的，所以甚至在对抗原刺激应答能力降低的患者，例如青少年、老年患者或免疫妥协患者中也可以诱导保护性免疫应答。

此外，由于相同原因，本发明的疫苗还可用于预防中耳炎，预防肺炎链球菌的鼻咽携带，预防由肺炎链球菌引起的败血病，或预防由肺炎链球菌引起的脑膜炎。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗肺炎链球菌感染的药物中的用途，

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，优选SEQ ID NO：16，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，其中所述人类是小于4岁，例如小于2岁，例如小于1岁的儿童，和/或具有母源性免疫的儿童(即，在循环系统中含有母体抗体)。

在一个进一步的实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗肺炎链球菌感染的药物中的用途，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，其中所述人类是免疫妥协的患者。免疫妥协的患者可以是例如采取免疫抑制化学疗法的患者或者具有先天性或获得性免疫缺陷的患者。为了使得免疫接种在这些患者有效，要求患者在某种程度上仍能够产生免疫应答。

在另一个实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于预防中耳炎，特别是由于肺炎链球菌而引起的中耳炎的药物中的用途，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在另外一个实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于治疗和/或预防肺炎链球菌的鼻咽携带的药物中的用途，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

在更进一步的实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于预防链球菌性脑膜炎的药物中的用途，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

疫苗可以通过任何合适的施用方式以本文描述的剂量施用，所述施用方式包括导致所有所施用的抗原的低于完全(例如低于50％或低于90％)摄取的施用方式。这可能是因为本发明的多肽具有足够的免疫原性，并且因为由于它们在肺炎链球菌细胞表面上的丰富性，从而甚至稍微亚最佳的应答也可以提供免疫性。因此，根据本发明的组合物的施用方式包括，但不限于，全身施用，例如静脉内或皮下施用，经皮施用，皮内施用，肌内施用，鼻内施用，口服施用，以及一般地任何形式的粘膜施用。

与有效的链球菌疫苗生产有关的重要问题是细菌的免疫学上不同的类型(也称为血清型)的出现。这些类型在其多糖谱中明显不同，并且还在某些高度可变的蛋白质中也不同，尽管较少。由于这样的可变性，本领域中已知的疫苗通常只针对某些而不是所有血清型起作用。

本发明的疫苗基于不是高度可变的丰富的表面定位多肽。这些疫苗将有效地针对多种血清型。因此，在一个实施方案中，本发明涉及下列中的任何一种或多种在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗超过一种肺炎链球菌血清型(例如5种或更多种不同血清型，例如8种或更多种不同血清型，例如15种或更多种不同血清型，例如24种或更多种不同血清型)的药物中的用途，

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，优选选自SEQ IDNO：1-41的序列，最优选SEQ ID NO：16，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

优选地，所述超过一种的血清型包括选自6A、7C、9A、10B、13、15C、16F、18B、21、23A、24F、28F、31、34、35F、35B、38的血清型。

在一个优选实施方案中，所述药物用于免疫接种，所述免疫接种针对至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F，以及优选地还有至少一种其他血清型，所述其他血清型优选选自6A、7C、9A、10B、13、15C、16F、18B、21、23A、24F、28F、31、34、35F、35B、38。

在另一个优选实施方案中，所述药物用于免疫接种，所述免疫接种针对至少血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，以及优选地还有至少一种其他血清型，所述其他血清型优选选自6A、7C、9A、10B、13、15C、16F、18B、21、23A、24F、28F、31、34、35F、35B、38。

在一个进一步的优选实施方案中，所述药物用于免疫接种，所述免疫接种针对表4中给出的任何血清型，优选选自表4中给出的血清型的至少5种或更多种不同血清型，例如选自表4中给出的血清型的8种或更多种不同血清型，例如15种或更多种不同血清型，例如24种或更多种不同血清型。

根据本发明的免疫原性效应可以例如通过测定血清样品中的抗体(例如通过RIA)来进行测量。此外，该效应可以在体内测定，通过测量例如对于T细胞依赖性抗原性多肽的增加的T细胞应答性，其中所述增加的应答性是针对此类抗原性多肽的正常免疫应答增强的特征。免疫刺激效应还可被测量为特别是IL-2、IL-3、IFN-γ和/或GM-CSF的增强的T细胞产生。因此，如引入本文作为参考的例如US 07/779,499中描述的，通过就增强的T细胞的IL-2、IL-3、IFN-γ或GM-CSF产生进行筛选可以容易地鉴定具有引发增强的免疫应答的潜力的多肽或其片段。

涉及针对肺炎链球菌而进行疫苗接种的许多方面已在Bogaert等人(2004)Vaccine 22：2209-2220中讨论。这个综述包括对于描述了用于测试和评估此类疫苗的方法的其他文件的参考。

本文描述的多核苷酸和表达载体可以通过任何标准方法在体内或体外导入靶细胞中：例如，作为裸DNA(Donnelly等人，Annu Rev Immunol15：617-648[1997])，其被掺入ISCOMS、脂质体或红细胞血影中，或通过生物射弹转移，钙沉淀，或电穿孔。备选地，可以采用基于病毒的载体作为用于将编码目的多肽的多核苷酸导入到动物或人类细胞中的手段。优选的病毒载体包括来源于复制缺陷型肝炎病毒(例如HBV和HCV)、逆转录病毒(参见例如WO 89/07136；和Rosenberg等人，N Eng J Med 323(9)：570-578[1990])、腺病毒(参见，例如Morsey等人，J Cell Biochem，Supp.17E[1993])、腺伴随病毒(Kotin等人，Proc Natl Acad Sci USA87：2211-2215[1990])、复制缺陷型单纯疱疹病毒(HSV；Lu等人，Abstract，第66页，Abstracts of the Meeting on Gene Therapy，Sep.22-26，1992，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)、金丝雀痘病毒的那些，以及这些载体的任何修饰形式。需要时，在导入患者之前，可以培养并克隆体外转染的细胞。

除了直接的体内操作程序外，也可以使用离体操作程序，在其中将细胞从动物中取出，修饰，并放回同一或另一动物中。很明显，可以采用上文注明的任何组合物来用于将根据本发明的抗原性多肽或编码此类抗原性多肽的多核苷酸导入离体环境中的组织细胞之中。关于摄取的病毒、物理和化学方法的规程是本领域众所周知的。因此，作为将本发明多肽或能够表达此类多肽的载体直接施用给患者的备选方案，可以从患者中取出辅助性T细胞；使用相同抗原性多肽或载体离体刺激那些T细胞；并将经刺激的辅助性T细胞导入同一患者中。

抗体和用于产生本发明抗体的方法

在一个进一步的主要实施方案中，所述用作药物的组合物包括能够结合多肽的抗体，所述多肽选自SEQ ID NO：1-282的表面定位的肺炎链球菌多肽，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选SEQ ID NO：16的多肽。此类药物可以用于抗体疗法，例如有此需要的个体的被动免疫接种。

因此，在一个进一步的主要方面，本发明涉及能够结合，优选特异性地结合选自SEQ ID NO：1-282的多肽和/或其片段和/或变体的抗体。“特异性地结合”在这个情况下不希望指绝对特异性。抗体在某些实施方案中还可以特异性地结合例如来自其他链球菌种类并且与来自肺炎链球菌的多肽具有高度序列同一性的多肽，例如与来自肺炎链球菌的多肽具有超过90％，例如超过95％或超过98％的序列同一性的多肽。

在一个优选实施方案中，所述抗体能够结合，优选特异性地结合选自SEQ ID NO：1-282的多肽，例如SEQ ID NO：1的多肽，例如SEQ IDNO：2的多肽，例如SEQ ID NO：3的多肽，例如SEQ ID NO：4的多肽，例如SEQ ID NO：5的多肽，例如SEQ ID NO：6的多肽，例如SEQ ID NO：7的多肽，例如SEQ ID NO：8的多肽，例如SEQ ID NO：9的多肽，例如SEQ ID NO：10的多肽，例如SEQ ID NO：11的多肽，例如SEQ ID NO：12的多肽，例如SEQ ID NO：13的多肽，例如SEQ ID NO：14的多肽，例如SEQ ID NO：15的多肽，例如SEQ ID NO：16的多肽，例如SEQ IDNO：17的多肽，例如SEQ ID NO：18的多肽，例如SEQ ID NO：19的多肽，例如SEQ ID NO：20的多肽，例如SEQ ID NO：21的多肽，例如SEQID NO：22的多肽，例如SEQ ID NO：23的多肽，例如SEQ ID NO：24的多肽，例如SEQ ID NO：25的多肽，例如SEQ ID NO：26的多肽，例如SEQ ID NO：27的多肽，例如SEQ ID NO：28的多肽，例如SEQ ID NO：29的多肽，例如SEQ ID NO：30的多肽，例如SEQ ID NO：31的多肽，例如SEQ ID NO：32的多肽，例如SEQ ID NO：33的多肽，例如SEQ IDNO：34的多肽，例如SEQ ID NO：35的多肽，例如SEQ ID NO：36的多肽，例如SEQ ID NO：37的多肽，例如SEQ ID NO：38的多肽，例如SEQID NO：39的多肽，例如SEQ ID NO：40的多肽，例如SEQ ID NO：41的多肽，例如SEQ ID NO：42的多肽，例如SEQ ID NO：43的多肽，例如SEQ ID NO：44的多肽，例如SEQ ID NO：45的多肽，例如SEQ ID NO：46的多肽，例如SEQ ID NO：47的多肽，例如SEQ ID NO：48的多肽，例如SEQ ID NO：49的多肽，例如SEQ ID NO：50的多肽，例如SEQ IDNO：51的多肽，例如SEQ ID NO：52的多肽，例如SEQ ID NO：53的多肽，例如SEQ ID NO：54的多肽，例如SEQ ID NO：55的多肽，例如SEQID NO：56的多肽，例如SEQ ID NO：57的多肽，例如SEQ ID NO：58的多肽，例如SEQ ID NO：59的多肽，例如SEQ ID NO：60的多肽，例如SEQ ID NO：61的多肽，例如SEQ ID NO：62的多肽，例如SEQ ID NO：63的多肽，例如SEQ ID NO：64的多肽，例如SEQ ID NO：65的多肽，例如SEQ ID NO：66的多肽，例如SEQ ID NO：67的多肽，例如SEQ IDNO：68的多肽，例如SEQ ID NO：69的多肽，例如SEQ ID NO：70的多肽，例如SEQ ID NO：71的多肽，例如SEQ ID NO：72的多肽，例如SEQID NO：73的多肽，例如SEQ ID NO：74的多肽，例如SEQ ID NO：75的多肽，例如SEQ ID NO：76的多肽，例如SEQ ID NO：77的多肽，例如SEQ ID NO：78的多肽，例如SEQ ID NO：79的多肽，例如SEQ ID NO：80的多肽，例如SEQ ID NO：81的多肽，例如SEQ ID NO：82的多肽，例如SEQ ID NO：83的多肽，例如SEQ ID NO：84的多肽，例如SEQ IDNO：85的多肽，例如SEQ ID NO：86的多肽，例如SEQ ID NO：87的多肽，例如SEQ ID NO：88的多肽，例如SEQ ID NO：89的多肽，例如SEQID NO：90的多肽，例如SEQ ID NO：91的多肽，例如SEQ ID NO：92的多肽，例如SPQ ID NO：93的多肽，例如SEQ ID NO：94的多肽，例如SEQ ID NO：95的多肽，例如SEQ ID NO：96的多肽，例如SEQ ID NO：97的多肽，例如SEQ ID NO：98的多肽，例如SEQ ID NO：99的多肽，例如SEQ ID NO：100的多肽，例如SEQ ID NO：101的多肽，例如SEQ IDNO：102的多肽，例如SEQ ID NO：103的多肽，例如SEQ ID NO：104的多肽，例如SEQ ID NO：105的多肽，例如SEQ ID NO：168的多肽。

在优选实施方案中，本发明的抗体还能够结合完整的肺炎链球菌细胞，即能够结合保持了其结构完整性的活的或死的链球菌细胞，优选保持了膜完整性的细胞(即其中膜未被渗透化)。抗体与完整细胞的结合可以例如通过如在Rioux等人(2001)Infect.Immun.69：5162-5165中描述的或如在Singh等人(2003)Infect.Immun.71：3937-3946中描述的流式细胞术来测定。

优选的抗体是以小于5×10^-6M的解离常数或Kd进行结合的那些，例如小于10^-6M，例如小于5×10^-7M，例如小于10^-7M，例如小于5×10^-8M，例如小于10^-8M，例如小于5×10^-9M，例如小于10^-9M，例如小于5×10^-10M，例如小于10^-10M，例如小于5×10^-11M，例如小于10^-11M，例如小于5×10^-12M，例如小于10^-12M，例如小于5×10^-13M，例如小于10^-13M，例如小于5×10^-14M，例如小于10^-14M，例如小于5×10^-15M，或小于10^-15M。结合常数可以使用本领域众所周知的方法进行测定，例如ELISA(例如，如在Orosz和Ovadi(2002)J.Immunol.Methods 270：155-162中描述的)或表面等离子体共振分析。

抗体可以用于哺乳动物，优选人类，更优选免疫妥协的患者的被动免疫接种。可以进行使用抗体的治疗以治愈或预防肺炎链球菌感染，包括肺炎球菌疾病，例如肺炎或脑膜炎或肺炎球菌性败血病。优选的患者群体包括4岁以下的儿童、老年患者或免疫妥协的患者。

本发明的抗体包括下列优选的机制群：

1.作为抗菌剂(影响细菌的生存力)起作用的抑制功能的抗体。此类抗体应当是有效的，而不管患者的免疫状态。优选地，此类抗体能够减少体外肺炎链球菌生长至没有添加抗体的对照的低于50％，例如低于25％，例如低于10％，例如低于5％。

2.设计为增强吞噬性杀死的起调理作用的抗体。此类抗体的功效可能取决于患者的免疫状态，但非常可能地，甚至在妥协的患者中它们也将增强吞噬性杀死。

3.与治疗部分例如毒素或杀菌剂例如蓖麻毒素或放射性同位素缀合的抗体。用于将治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见，例如Thorpe等人(1982)Immunol.Rev.62，119-158。这些抗体应当也是有效的，而不管患者的免疫状态。

含或不含与其缀合的治疗部分的抗体可以用作单独地或与化学治疗剂或其他治疗试剂联合施用的治疗剂。

在一个实施方案中，本发明的抗体是起调理作用的以及是抑制功能的。在另一实施方案中，本发明的抗体是起调理作用的，但不是抑制功能的。后面一组抗体可以是例如针对对于肺炎链球菌的生存力不是必需的靶多肽的抗体。

在一个进一步的主要方面，本发明涉及用于在非人动物中产生针对选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抗体的方法，其包括下列步骤：

a.提供

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的序列，最优选SEQ ID NO：16的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，

b.将包括所述多肽、多核苷酸、载体、重组病毒或重组细胞的组合物导入所述动物中，

c.在所述动物中产生抗体，

d.分离并任选地纯化所述抗体。

在一个优选实施方案中，能够结合完整的肺炎链球菌细胞的抗体通过包括执行上述步骤和选择能够结合完整的肺炎链球菌细胞的抗体的进一步步骤来鉴定。

上述方法优选在能够产生人抗体的转基因动物中进行。在一个进一步的优选实施方案中，上述方法是非治疗性的。

单克隆/多克隆抗体

本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体或者单克隆抗体的混合物。在一个优选实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段。单克隆抗体(Mab′s)是其中每个抗体分子是类似的并因此识别相同表位的抗体。所述抗体可以是任何种类的抗体，然而，它优选是IgG或IgA抗体。

优选的抗体，更优选单克隆抗体，是能够特异性地结合本发明多肽的表面暴露区域的抗体。因此，在能够结合SEQ ID NO：16的抗体的一个优选实施方案中，所述抗体结合在SEQ ID NO：16上的表位，其包括SEQ ID NO：289-SEQ ID NO：294中任何序列的一个或多个氨基酸。更加优选地，所述抗体结合表位，所述表位包括选自SEQ ID NO：289、SEQID NO：290、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：293和SEQID NO：294的序列的2个或更多个，例如3个或更多个，例如4个或更多个，例如5个或更多个氨基酸。

单克隆抗体一般通过杂交瘤细胞系产生。制备单克隆抗体和合成抗体的杂交瘤细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。产生抗体的杂交瘤可以例如通过将抗体生成性B淋巴细胞与永生化细胞系融合来进行制备。单克隆抗体可以通过下列步骤产生。

动物用抗原例如全长多肽或其片段进行免疫接种。所述免疫接种通常通过以免疫有效量，即足以产生免疫应答的量，将所述抗原施用给免疫活性的哺乳动物来完成。优选地，所述哺乳动物是啮齿类动物例如兔、大鼠或小鼠。然后，将哺乳动物按强化时间表维持足以使哺乳动物产生高亲和力抗体分子的时间段。从分泌所需抗体的每个经免疫接种的哺乳动物中取出抗体生成细胞的悬浮液。在足以产生高亲和力抗体的时间后，处死动物(例如小鼠)，并从淋巴结、脾脏和外周血中的一种或多种之中获得抗体生成性淋巴细胞。脾细胞是优选的，并且可以使用本领域技术人员众所周知的方法在生理性介质中机械分离成单个细胞。抗体生成细胞通过与小鼠骨髓瘤系的细胞融合而变得永生。小鼠淋巴细胞产生高百分比的与小鼠同源骨髓瘤的稳定融合物，不过，也可以使用大鼠、兔和青蛙体细胞。所需的产生抗体的动物的脾细胞一般在融合剂例如聚乙二醇存在下通过与骨髓瘤细胞融合而变得永生。适合作为融合配偶体的许多骨髓瘤细胞系中的任何一种可以是例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系，它们可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Md获得。

单克隆抗体还可通过重组DNA技术领域中的技术人员众所周知的其他方法产生。已开发了称为“组合抗体展示”法的备选方法以鉴定和分离具有特定特异性的抗体片段，并且可以用于生产单克隆抗体。

多克隆抗体是识别特殊给定抗原的抗体分子的混合物，因此多克隆抗体可以识别例如多肽内的不同表位。一般而言，多克隆抗体从哺乳动物的血清中纯化，所述哺乳动物先前已用所述抗原进行了免疫接种。多克隆抗体可以例如通过Antibodies：A Laboratory Manual，By Ed Harlowand David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中描述的任何方法进行制备。多克隆抗体可以来源于任何合适的哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠、兔、驴、山羊和绵羊。

特异性

本发明的抗体对于SEQ ID NO：1-282中任何多肽可以是单特异性的。在另一个实施方案中，抗体是双特异性或多特异性的，其中具有对SEQ ID NO：1-282中任何多肽特异的至少一个部分。

单特异性抗体可以是单价的，即只具有一个结合结构域。对于单价抗体，免疫球蛋白恒定结构域氨基酸序列优选包括本领域中称为CH1、CH2、CH3和CH4的抗体分子的结构部分。优选的是本领域中称为C_L的那些。此外，在恒定结构域可以是重链或轻链恒定结构域(分别为C_H或C_L)的情况下，本发明考虑了各种单价抗体组合物。例如，轻链恒定结构域能够经二硫桥连接至另一个轻链恒定结构域或重链恒定结构域。相反地，重链恒定结构域可以形成两个独立的二硫桥，从而允许与另一个重链以及轻链桥接的可能性，或者形成重链的聚合物。因此，在另一个实施方案中，本发明考虑了包括单价多肽的组合物，其中恒定链结构域C具有能够形成至少一个二硫桥的半胱氨酸残基，并且其中所述组合物包括通过所述二硫桥共价连接的至少两个单价多肽。

在本发明的另一个实施方案中，抗体是具有至少两个结合结构域的多价抗体。结合结构域可以具有对于相同配体或不同配体的特异性。

多特异性，包括双特异性

在一个优选实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其对至少2种不同实体具有亲和力或能够特异性地结合至少2种不同实体。

在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其携带至少2个不同的结合结构域，其中至少一个具有抗体起源。本发明的双特异性分子还可以是单链双特异性分子。多特异性分子也可以是单链分子或可以包括至少2个单链分子。多特异性抗体，包括双特异性抗体，可以通过本领域技术人员已知的任何合适方式来产生。已开发了许多方法，例如在WO 94/09131；WO 94/13804；WO 94/13806或者美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858中描述的方法。使用根据本发明的双特异性或多特异性抗体，本发明提供了与单特异性/单价抗体相比的几个优点。双特异性/多特异性抗体具有第一个结合结构域，其能够特异性地识别并结合SEQ ID NO：1-282中的任何肺炎链球菌多肽，而其他结合结构域可以用于其他目的。在一个实施方案中，至少一个其他结合结构域用于结合肺炎链球菌多肽，例如结合在与第一个结合结构域相同的肺炎链球菌多肽上的另一个表位。从而可以增加对于肺炎链球菌的特异性，以及增加抗体的亲和力。在另一个实施方案中，所述至少一个其他结合结构域可以用于特异性地结合哺乳动物细胞，例如人细胞。优选地，所述至少其他结合结构域能够结合免疫活性细胞，例如白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞，以便增加治疗方法中抗体的效果。这可以通过确定所述至少一种其他结合结构域能够特异性地结合哺乳动物蛋白质来实现，所述哺乳动物蛋白质例如为人蛋白质，例如选自分化群蛋白(cluster differentiation proteins，CD)中任何一种的蛋白质，特别是CD64和/或CD89。

人源化抗体

并非总是希望使用非人抗体用于人治疗，因为非人的“外源”表位可能在接受治疗的个体中引发免疫应答。为了消除或最小化与非人抗体相关的问题，希望改造出嵌合抗体衍生物，即“人源化”抗体分子，其将非人Fab可变区结合决定簇与人恒定区(Fc)相组合。此类抗体的特征为上文描述的单克隆和多克隆抗体的等价抗原特异性和亲和力，并且当施用给人时具有更少的免疫原性，由此更可能被接受治疗的个体耐受。

因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。人源化抗体一般是嵌合抗体，其包括来源于人抗体的区域和来源于非人抗体例如啮齿类动物抗体的区域。人源化(也称为重构或CDR-移植)是良好建立的技术，其用于减少来自异种来源(通常是啮齿类动物)的单克隆抗体(mAbs)的免疫原性，增加与人免疫球蛋白的同源性，并用于改善其对人免疫系统的激活。因此，人源化抗体通常是人抗体，其中某些CDR残基以及可能还有某些框架残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基所置换。

重要的是人源化抗体保留了对抗原的高亲和力以及其他有利的生物学特性。为了达到这个目标，根据一种优选方法，使用亲本和人源化序列的三维模型通过分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且对于本领域技术人员来说是熟悉的。计算机程序是可获得的，其图解说明并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检查使得能够分析某些残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基并与受者和输入序列相组合，从而使得最大化所需的抗体特征例如增加的对于靶抗原的亲和力，尽管是CDR残基直接和最基本地影响抗原结合。

用于人源化MAbs的一种方法涉及产生嵌合抗体，其中将包含一种抗体的完整可变结构域的抗原结合部位与来源于第二种抗体优选人抗体的恒定结构域融合。用于执行此类嵌合化操作的方法例如在EP-A-0120694(Celltech Limited)、EP-A-0125023(Genentech Inc.)、EP-A-0171496(Res.Dev.Corp.Japan)、EP-A-0173494(Stanford University)和EP-A-0194276(Celltech Limited)中描述。

本发明的人源化抗体可以通过能够用来源于非人抗体的CDR替代人抗体CDR的至少一部分的任何方法来进行制备。Winter描述了可以用于制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB 2188638A)，其内容引入作为参考。

例如，本发明的人源化抗体可以通过下列过程来产生：

(a)通过常规技术构建表达载体，其包含具有编码抗体重链的DNA序列的操纵子，其中CDRs和对于保留抗体结合特异性必需的可变结构域框架区的此类最小部分来源于非人免疫球蛋白，并且抗体链的剩余部分来源于人免疫球蛋白；

(b)通过常规技术构建表达载体，其包含具有编码互补抗体轻链的DNA序列的操纵子，其中CDRs和对于保留供体抗体结合特异性必需的可变结构域框架区的此类最小部分来源于非人免疫球蛋白，并且抗体链的剩余部分来源于人免疫球蛋白；

(c)通过常规技术将表达载体转染到宿主细胞中；和

(d)通过常规技术培养转染的细胞以产生人源化抗体。

宿主细胞可以用两种本发明的载体共转染，第一种载体包含编码轻链来源的多肽的操纵子，和第二种载体包含编码重链来源的多肽的操纵子。这两种载体包含不同的选择标记，但在其他方面，除抗体重链和轻链编码序列之外，它们优选是等同的以尽可能确保重链和轻链多肽的相等表达。备选地，可以使用单个载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。轻链和重链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA或两者。

用于表达本发明的经改变的抗体的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌或真核细胞。特别地，可以使用为了这个目的而良好限定类型的哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞或中国仓鼠卵巢细胞。

通过其可以构建本发明载体的一般方法，产生本发明的宿主细胞所需的转染方法，以及从此类宿主细胞产生本发明的抗体所需的培养方法都是常规技术。同样地，一旦产生了，本发明的人源化抗体就可以根据标准操作程序进行纯化。

人抗体

在一个更优选的实施方案中，本发明涉及抗体，其中结合结构域由人抗体携带，即其中抗体具有比人源化抗体更大程度的人肽序列。

针对人蛋白质的人mAb抗体可以使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生。将来自用目的抗原免疫接种的这些转基因小鼠的脾细胞用于产生杂交瘤，其分泌对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和力的人mAbs(参见，例如Wood等人，国际申请WO 91/00906；Kucherlapati等人，PCT出版物WO 91/10741；Lonberg等人，国际申请WO 92/03918；Kay等人，国际申请92/03917；Lonberg，N.等人，1994Nature 368：856-859；Green，L.L.等人，1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等人，1993 Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等人，1993 PNAS90：3720-3724；Bruggeman等人，1991 Eur J Immunol 21：1323-1326)。此类转基因小鼠可从Abgenix，Inc.，Fremont，Calif.和Medarex，Inc.，Annandale，N.J.获得。已描述了，在嵌合的和种系突变的小鼠中抗体重链连接区(IH)基因的纯合性缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移入人种系免疫球蛋白基因排列将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；和Duchosal等人，Nature 355：258(1992)。人抗体还可来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227：381(1992)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech14：309(1996))。

用于分离高亲和力抗体的优选方法是消减式操作，其中可以以其天然构型从噬菌体抗体文库中快速获得针对靶特别是针对抗原029(SEQ IDNO：16)和607(SEQ ID NO：20)的人抗体或抗体片段(参见，例如DeKruif等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3938-3942(1995)；美国专利6265150；以及美国专利申请2002132228和2005043521)。噬菌体抗体文库可以例如使用来自具有目的疾病的患者(此处是感染肺炎链球菌的患者)的抗体生成细胞进行构建。编码由这些细胞产生的抗体的基因可以通过使用重排所克隆的基因的CDR3区的简并寡核苷酸而克隆到半合成的噬菌体抗体文库中。然后，将文库与靶抗原或表达靶的细胞(此处是肺炎链球菌)一起孵育，并且通过使用标准方法分离与靶结合的噬菌体抗体。本发明还旨在通过上述操作鉴定的抗体，特别是能够结合选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽的抗体，优选解离常数或Kd小于10-7M的抗体，例如小于10^-8M，例如小于10^-9M，例如小于10^-10M，例如小于10^-11M，和/或结合这些靶中任何一种的表面暴露表位的抗体。

用于产生人单克隆抗体的合适方法还在WO 03/017935、WO02/100348、US 2003091561和US 2003194403中描述。

抗体的结合片段

在本发明的一个实施方案中，抗体是抗体片段，优选抗原结合片段或可变区。对本发明有用的抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为Fab片段的抗原结合片段，各自具有单个抗原结合部位；以及残留的“Fc”片段，因为其容易结晶的能力而这样称呼。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段，其具有两个能够交联抗原的抗原结合片段；以及残留的其他片段(其称为pFc′)。另外的片段可以包括双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体片段Fab、Fv和scFv与完整抗体的不同之处在于抗体片段只携带单个抗原结合部位。具有两个结合部位的重组片段已以几种方式制备，例如，通过在Fv的VH的C-末端(Cumber等人，1992)或在scFv的VL的C-末端(Pack和Pluckthun，1992)处引入的半胱氨酸残基的化学交联，或者通过Fab′s的铰链半胱氨酸残基(Carter等人，1992)。

优选的抗体片段保留某些或基本上所有的抗体与其抗原选择性地结合的能力。某些优选片段定义如下：

(1)Fab是包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以通过如此产生，即用木瓜蛋白酶消化整个抗体，从而得到完整的轻链和一条重链的一部分。

(2)Fab′是抗体分子的片段，并且可以通过如此获得，即用胃蛋白酶处理整个抗体，随后还原，从而得到完整的轻链和重链的一部分。每个抗体分子获得两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端处添加的少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

(3)(Fab′)₂是可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而没有后续还原而获得的抗体片段。F(ab′)₂是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab′片段的二聚体。

(4)Fv是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合部位。这个区域由以紧密且非共价缔合形式的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成(V_H-V_L二聚体)。在这个构型中，每个可变结构域的3个CDRs相互作用以限定在V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合部位。共同地，6个CDRs赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包括对抗原特异的3个CDRs的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比整个结合部位低。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是单链抗体，其被定义为包含轻链可变区、重链可变区的经基因改造的分子，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽连接体连接为基因融合的单链分子。此类单链抗体还称为“单链Fv”或“sFy”抗体片段。一般地，Fv多肽进一步包含在V_H和V_L结构域之间的多肽连接体，其使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。

根据本发明的抗体片段可以以本领域技术人员已知的任何合适方式来产生。已开发了几种微生物表达系统用于生产活性抗体片段，例如已描述了在多种宿主例如大肠杆菌或酵母中生产Fab。片段可以以Fab′s或Fv′s的形式产生，但另外已显示，V_H和V_L可以通过柔性多肽连接体以任何次序进行基因连接，该组合称为scFv。

用于本发明的组合物

在用作药物的组合物的一个优选实施方案中，所述组合物除活性组分以外还包括药学上可接受的载体。

如本文所使用的，与组合物或载体结合使用的术语“药学上可接受的”表示，所述材料能够施用至或施用给人或动物而不产生不希望的生理效应，例如恶心、头晕、胃不适等。

包含溶解或分散在其中的活性成分的组合物的制备是本领域中非常了解的。此类组合物通常制备为无菌注射剂，作为液体溶液或悬浮液，其是水性的或非水性的，然而，也可制备适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性成分可以与载体混合，所述载体是药学上可接受的并且与活性成分相容，并且以适合于在本文描述的方法中使用的量。合适的载体是，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，需要时，组合物可以包含少量辅助物质，例如增强活性成分的功效的湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。

本发明的组合物在其中可以包括活性组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)。由游离羧基形成的盐还可来源于无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

药学上可接受的载体是本领域众所周知的。液体载体的例子是无菌水溶液，其除活性成分和水以外不包含其他材料，或者包含缓冲液例如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。再进一步地，水性载体可以包含超过一种缓冲盐，以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇和其他溶质。液体组合物还可除了水以外还包含其他液相，或包含不包括水的液相。示例性的此类另外的液相是甘油、植物油例如棉籽油、有机酯例如油酸乙酯和水-油乳状液。

组合物还可以是部件套盒(kit-in-part)，其进一步包括抗生物剂，例如选自万古霉素、β-内酰胺类、头孢菌素类、青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类抗生素(红霉素、克拉霉素或阿奇霉素)和氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星或莫西沙星)的抗生素，和/或包括免疫刺激剂，例如细胞因子、干扰素、生长因子例如GCSF或GM-CSF。部件套盒还可用于同时、顺次或分开的施用。

本发明还涉及用于实践本文描述的方法的药物组合物。因此，本发明涉及包括药学上可接受的载体和下列物质的药物组合物：

-分离的多肽，其包含SEQ ID NO：1-282中的任何序列，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：2O和SEQ ID NO：28的序列，最优选SEQ ID NO：16，或者包含所述序列中的任何序列的片段或变体，

-分离的多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

此外，本发明涉及包括如本文定义的本发明抗体和药学上可接受的载体的药物组合物，所述抗体优选能够结合选自SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽。

本发明的多肽

本发明的片段

在一个进一步的方面，本发明涉及多肽的片段，优选抗原性片段，所述多肽在SEQ ID NO：1-282的任何一个中列出，优选SEQ ID NO：16。抗原性可以通过本领域已知的各种方法进行预测。此类片段的长度可以从多肽的2个连续氨基酸残基变化到全长多肽减去一个氨基酸残基。优选地，片段长度少于100个连续氨基酸，例如少于70个或50个连续氨基酸，例如少于40个连续氨基酸，例如少于30个连续氨基酸，例如少于25个连续氨基酸，例如少于20个连续氨基酸。因此，例如片段长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。在一个进一步的优选实施方案中，片段包含相应的全长序列的6个或更多个，例如7个或更多个，例如8个或更多个，例如9个或更多个，例如10个或更多个连续氨基酸。优选的范围包括长度为5-50个连续氨基酸的片段，例如长度为5-25个连续氨基酸的片段，例如长度为5-20个连续氨基酸的片段。以另一种方式表述，片段由与全长多肽相比其长度少于100％的部分氨基酸序列组成。优选地，片段长度少于99％，例如少于75％，例如少于50％，例如少于25％，例如少于20％，例如少于15％，例如少于10％的全长多肽长度。在一个进一步的优选实施方案中，片段由部分氨基酸序列组成，所述部分氨基酸序列与全长多肽相比长度少于100％但超过1％，例如少于100％但超过5％，例如少于100％但超过10％，例如少于100％但超过20％，例如少于100％但超过25％，例如少于100％但超过50％的全长多肽长度。

优选地，当在肺炎链球菌细胞或其他细胞中重组表达时，本发明的片段在完整的肺炎链球菌细胞或其他细胞中是表面暴露的。表面暴露可以例如使用对所述片段特异的单克隆抗体来测定，例如如Singh等人(2003)Infect.Immun.71：3973-3946中描述的。还优选的是能够诱导抗体的片段，所述抗体可以特异性地结合完整的肺炎链球菌细胞。这可以通过使用所述片段产生单克隆抗体和随后表征单个种抗体与完整细胞的结合来测定，例如如Singh等人(2003)Infect.Immun.71：3973-3946中描述的。SEQ ID NO：16的优选的片段包括包含SEQ ID NO：289-SEQ ID NO：294中的一种或多种序列或由其组成的片段，更优选的片段包括包含SEQ ID NO：289和/或SEQ ID NO：290或由其组成的片段、包含SEQ ID NO：291和/或SEQ ID NO：292或由其组成的片段、和包含SEQ ID NO：293和/或SEQ ID NO：294或由其组成的片段。

本发明的SEQ ID NO：1-282的全长多肽以及片段可以通过本领域已知的常规技术重组产生。合适的宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO、COS或HEK293细胞。备选地，可以使用昆虫细胞、细菌细胞或真菌细胞。用于在上文列出的细胞类型中异源表达多核苷酸序列和随后纯化产生的多肽的方法，例如使用可以在纯化后去除的标签序列例如组氨酸标签，是本领域技术人员众所周知的。备选地，本发明的片段可以合成产生。

本发明的变体

在一个进一步的主要方面，本发明涉及SEQ ID NO：1-282中列出的任何多肽优选SEQ ID NO：16的多肽的变体，或者SEQ ID NO：1-282中列出的任何多肽优选SEQ ID NO：16的多肽的片段的变体，在用作药物的组合物中的用途。在本文中使用时，短语例如“与SEQ ID NO：X具有至少95％序列同一性的多肽”与短语例如“SEQ ID NO：X的多肽及其变体，其中所述变体与所述序列具有至少95％的序列同一性”可互换使用，并期望指向相同主题。

变体优选与给定的多肽或片段具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性。使用Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT或FASTA这些算法中的任何一种，使用缺省缺口权重，来测定序列同一性。

给定的多肽或片段的优选变体是其中在变体和给定的参照多肽或片段之间的所有氨基酸置换是保守置换的变体。保守氨基酸置换指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。

多肽或其片段的变体还包括其中已删除或插入一个或多个氨基酸的多肽或片段形式。优选地，已插入或删除少于5个，例如少于4个，例如少于3个，例如少于2个，例如只1个氨基酸。多肽或其片段的“变体”还包括这些多肽或片段通过氨基酸序列的翻译后修饰过程而被修饰的形式。

本发明的重组细胞

在一个进一步的主要方面，本发明涉及用包含编码多肽的序列的多核苷酸转化或转染的重组细胞的用途，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1-282的序列，优选SEQ ID NO：16，或者包含所述序列的抗原性片段或变体。优选地，所述重组细胞是大肠杆菌或沙门氏菌细胞，更优选是毒力减弱或减少的埃希氏菌或沙门氏菌细胞。

在本文中使用的合适的细菌菌株已在下列文献中进行了描述：例如Makino等人(2001)Microb.Pathog.31：1-8；Gentschev等人(2002)Int.J.Med.Microbiol.291：577-582；Turner等人(2001)Infect.Immun.69：4969-4979；WO 99/49026；和WO 03/022307以及其中的参考文献。合适的沙门氏菌菌株的例子是CvD908-T7pol(Santiago-Machuca等人(2002)Plasmid 47：108-119)、ATCC 39183、ATCC 53647和ATCC53648。合适的大肠杆菌菌株的例子是YT106和E1392/75-2A。

本发明的方法和用途

上文定义的组合物以及其他产物可以用于在有此需要的动物或人类中治疗或预防肺炎链球菌感染和/或由此类感染引起的疾病。

本文的治疗和预防包括对抗肺炎链球菌的所有类型的治疗性处理和预防性处理以及其他处理，包括但不限于疫苗接种、预防、主动免疫接种、被动免疫接种、抗体施用、治愈性处理、改善性处理。特别地，使用本发明抗体的被动免疫接种是用于免疫妥协个体的合适处理。

本发明的诊断方法

在细胞中表面暴露和以相对较高的拷贝数存在这一组合还使得由本发明人鉴定的多肽高度适合作为用于检测肺炎链球菌的靶，从而允许以高的灵敏度来检测这种生物。

因此，在一个进一步的主要方面，本发明涉及用于检测样品中的肺炎链球菌或其部分的方法，所述方法包括下列步骤：

a.使所述样品与指示剂部分接触，所述指示剂部分能够特异性地结合选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，和

b.测定是否已由所述指示剂部分产生了信号，从而检测所述样品是否包含肺炎链球菌或其部分。

优选地，所述指示剂部分能够结合，优选特异性地结合完整的肺炎链球菌细胞。

在上述诊断方法的优选实施方案中，在接触步骤和检测步骤之间进行洗涤步骤，以便改进检测的特异性。

样品可以例如是粪便，尿，组织，组织提取物，液体样品或体液样品例如血液、血浆、血清、痰，或取自鼻或肺的样品。样品的另一例子是食物样品，例如肉样品。

在另一方面，本发明涉及用于检测样品中的肺炎链球菌或其部分的方法，包括通过质谱法分析样品以评估SEQ ID NO：1-282中的一种或多种多肽，特别是SEQ ID NO：16和/或SEQ ID NO：20的多肽的存在和/或量的步骤。在一个实施方案中，对样品例如血液样品进行预处理以富集待检测的多肽。此类预处理可以包括样品中存在的蛋白质的大小分级。

上述方法可以例如用于诊断个体中的肺炎链球菌感染。在上述方法的优选实施方案中，所述指示剂部分不穿过肺炎链球菌细胞的膜。所述指示剂部分的优选类型由抗体组成或包括抗体，例如如本文定义的本发明的抗体。

本领域技术人员将理解，存在众多众所周知的临床诊断化学操作程序，其中指示剂部分可以用于形成结合性反应产物，其量涉及样品中的配体(本文中为肺炎链球菌或其部分)的量。因此，尽管本文中描述了示例性测定方法，但本发明并不局限于此。

本发明还涉及用于测定生物样品中肺炎链球菌的存在和优选地还有量的诊断系统，其优选为试剂盒形式。用于制备诊断试剂盒的方法已在例如US 5,470,958以及其中的参考文献中描述。

诊断系统以足以执行至少一次测定的量包括根据本发明的指示剂部分，其优选作为分开包装的试剂，和更优选地还包括使用说明书。包装指使用能够将本发明的指示剂部分控制在固定界限内的固体基质或材料例如玻璃、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯)、纸、箔等。因此，例如，包装可以是玻璃小瓶，其用于包含毫克量的所考虑的经标记的指示剂部分的制剂，或者它可以是微量滴定板的孔，其中微克量的所考虑的指示剂部分已可操作地附着，即连接，以便能够结合配体。

“使用说明书”通常包括有形表述，其描述了试剂浓度或至少一种测定方法参数例如待混合的试剂和样品的相对量，关于试剂/样品混合物的维持时间段，温度，缓冲条件等。

在大多数实施方案中，本发明的诊断方法和系统包括能够用信号表示结合性反应复合物形成的标记或指示手段作为所述指示剂部分的一部分，所述结合性反应复合物包括与预先选择的配体(即包含SEQ ID NO：1-282中任何序列的多肽和/或其片段)复合的指示剂部分。此类标记自身是临床诊断化学中众所周知的。

标记手段可以是荧光标记试剂，其化学结合抗体或抗原而在不使它们变性的情况下形成荧光色素(染料)，这是有用的免疫荧光示踪物。合适的荧光标记试剂是荧光色素，例如异氰酸荧光素(FIC)、异硫氰酸荧光素(FITC)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯(DANSC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、丽丝胺、罗丹明8200磺酰氯(RB200SC)。合适的荧光材料的其他例子包括伞形酮、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等。免疫荧光分析技术的描述在DeLuca，“ImmunofluorescenceAnalysis”，Antibody As a Tool，Marchalonis等人，eds.，John Wiley&Sons，Ltd.，第189-231页(1982)中可以找到。

放射性元素可以用作标记试剂。示例性的放射性标记试剂是产生γ射线发射的放射性元素。自身发出γ射线的元素，例如¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁸I、¹³²I和⁵¹Cr代表了一类产生γ射线发射的放射性元素指示基团。特别优选的是¹²⁵I。另一组有用的标记手段是其自身发射阳电子的那些元素例如¹¹C、¹⁸F、^15O和¹³N，或β发射体例如¹¹¹铟或³H。其他合适的放射性材料包括¹³¹I和³⁵S。

在其他实施方案中，使用抗体的检测可以通过将抗体与另一个可检测的物质相偶联来促进，所述可检测物质例如为酶、辅基、发光材料或生物发光材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、荧光素和水母发光蛋白。

在优选实施方案中，所述指示基团是酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)或葡萄糖氧化酶。在主要指示基团是酶例如HRP或葡萄糖氧化酶的此类情况下，需要另外的试剂以显现指示剂部分/配体复合物(免疫反应物)已形成这一事实。对于HRP的此类另外的试剂包括过氧化氢和氧化染料前体例如二氨基联苯胺。可与葡萄糖氧化酶一起使用的另外的试剂是2，2′-氨基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-G-磺酸)。

标记物的连接，即对多肽例如抗体进行标记，是本领域众所周知的。例如，蛋白质可以通过代谢掺入包含放射性同位素的氨基酸来进行标记，所述氨基酸作为培养基中的组分提供。参见，例如Galfre等人，Meth.Enzymol.，73：3-46(1981)。通过活化的官能团的蛋白质缀合或偶联技术是特别适用的。参见，例如Aurameas，等人，Scand.J.Immunol.，第8卷，Suppl.7：7-23(1978)；Rodwell等人(1984)Biotech.3：889-894；和美国专利号4,493,795。

可以建立采用上述指示剂部分的各种诊断测定法以测试样品的肺炎链球菌。示例性的测定法在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中详细描述。此类测定法的代表性例子包括：对流免疫电泳(CIEP)、放射性免疫测定法、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定法(EILSA)、蛋白质印迹测定法、斑点印迹测定法、抑制或竞争测定法、和夹心测定法、免疫试纸条(immunostick)(浸渍片)测定法、同时免疫测定法、免疫色谱测定法、免疫过滤测定法、胶乳珠凝集测定法、免疫荧光测定法、生物传感器测定法、和低光检测测定法(low-light detection assay)(还参见例如U.S.4,376,110和4,486,530)。合适的测定法的例子是这样的测定法，其中样品例如血清样品通过电泳而分离，随后目的多肽例如SEQ ID NO：16通过蛋白质印迹法进行检测。

在一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可以以“ELISA”形式使用，以检测流体样品中预先选择的配体的量。“ELISA”指酶联免疫吸附测定法，其采用与固相结合的抗体或抗原以及酶-抗原或酶-抗体缀合物以检测和定量样品中存在的抗原量，并且可容易地应用于本方法。因此，在某些实施方案中，本发明的指示剂部分可以附着至固体基质以形成固体支持物，其包括在受试者诊断系统中的包装物。通常通过从水性介质中吸附来将试剂附着至固体基质，尽管可以使用本领域技术人员众所周知的可应用于多肽例如抗体的其他附着方式。有用的固体基质也是本领域众所周知的。此类材料是水不溶性的，并且包括以商标SEPHADEX可从Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway，N.J.)获得的交联葡聚糖；琼脂糖；可从Abbott Laboratories of North Chicago，III.获得的直径为约1微米-约5毫米的聚苯乙烯珠；聚氯乙烯，聚苯乙烯，交联的聚丙烯酰胺，基于硝化纤维或尼龙的网，例如片、条或搅棒；或管、板或微量滴定板的孔，例如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制备的那些。

一种进一步的诊断方法可以采用本发明一个实施方案的抗体组合物对于交联配体的多价性，从而形成多个配体和多肽的聚集，产生可沉淀的聚集物。这个实施方案与众所周知的免疫沉淀方法相当。这个实施方案包括将样品与包括本发明抗体的组合物混合以在结合条件下形成结合混合物的步骤，随后为分离所形成的结合复合物的分离步骤。通常，分离通过如此进行，即离心或过滤以从混合物中移出聚集物。结合复合物的存在表明待检测的预先选择的配体的存在。

本发明多肽的结合配偶体和抑制剂

本发明所涉及的多肽的表面定位使得它们高度适合作为结合配偶体例如抑制剂的靶。致病微生物的表面定位多肽通常与宿主生物相互作用。因此，表面定位多肽的任何类型的结合配偶体可以干扰与宿主-病原体相互作用。因此，结合配偶体常常拮抗微生物的致病性(毒力)。结合配偶体还可以是其所结合的多肽的抑制剂。

因此，在一个进一步的主要方面，本发明涉及用于鉴定SEQ ID NO：1-282中列出的表面定位多肽的结合配偶体的方法。此类方法可以是生物化学的或基于细胞的。

生物化学方法

在一个主要方面，本发明涉及用于鉴定选自SEQ ID NO：1-282的多肽或其片段的结合配偶体的方法，其包括下列步骤：

a.提供多肽，其选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选SEQ ID NO：16

或

其片段，

b.使所述多肽或片段与假定的结合配偶体接触，和

c.测定所述假定的结合配偶体是否能够结合所述多肽或片段。在一个优选实施方案中，所述假定的结合配偶体是源自宿主的分子。

在所述方法的进一步的优选实施方案中，提供固定在固体支持物例如柱或微量滴定板上的多肽或其片段，并且在接触步骤后，测定假定的结合配偶体是否已结合至固体支持物。多肽或其片段的固定化可以通过直接结合至固体支持物，或通过间接结合例如使用特异性抗体。在优选实施方案中，在接触步骤和测定步骤之间进行洗涤步骤，以便提高检测的特异性。在进一步的优选实施方案中，假定的结合配偶体与可检测的标记相复合。假定的配偶体可以在接触发生前进行标记。备选地，标记过程还可以在接触步骤后进行。此外，在这种方法的某些实施方案中，固定化可以在多肽或其片段已结合至结合配偶体后进行。在优选实施方案中，该方法是筛选方法，其中对于多个假定的结合配偶体重复该方法。用于测定结合的合适方法是本领域众所周知的，并且其中几个已在本文其他地方提及。

在另一方面，选自SEQ ID NO：1-282，优选SEQ ID NO：16的多肽的源自宿主的结合配偶体可以如下鉴定：将纯化的宿主膜进行电泳分离，印迹到膜上，并与目的多肽或其片段一起孵育。然后，可以使用对目的多肽或其片段特异的抗体检测结合。多肽或其片段已与之结合的宿主结合配偶体随后可以通过如此来鉴定，即从印迹中洗脱，随后通过质谱法或通过本领域已知的任何其他技术进行分析。

如果致病生物的表面定位多肽的结合配偶体是源自宿主的分子，那么表面定位多肽和宿主之间的此类相互作用对于细菌的毒力可能是重要的。干扰表面定位多肽与源自宿主的结合配偶体的相互作用的化合物因此可能适合于预防或治疗肺炎链球菌感染。因此，本发明的另一种方法涉及鉴定SEQ ID NO：1-282中的任何表面定位的肺炎链球菌多肽与源自宿主的结合配偶体相互作用的抑制剂的方法，其包括下列步骤：

a.提供SEQ ID NO：1-282中的任何多肽，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，

或

其片段，

b.提供所述多肽的源自宿主的结合配偶体(如上所述或通过任何其他方法鉴定的)，

c.在所述相互作用的假定抑制剂不存在下使所述多肽与所述源自宿主的结合配偶体接触，

d.在所述假定抑制剂存在下使所述多肽与所述源自宿主的结合配偶体接触，和

e.测定由步骤d.产生的所述多肽与所述源自宿主的结合配偶体的结合强度与由步骤c.产生的那种相比是否减少。

在某些实施方案中，步骤c.和d.可以在两个不同的样品室中进行。在其他实施方案中，步骤d.可以通过向步骤c.的混合物中加入假定的抑制剂来进行。在优选实施方案中，对于多个假定的抑制剂重复该方法。

特别感兴趣的是抑制表面定位多肽的活性的结合配偶体。此类活性可以是酶促活性、转运活性、或任何类型的其他生物化学或细胞活性，优选酶促活性。

优选的源自宿主的结合配偶体是宿主多肽和宿主脂质。结合可以例如如Szymanski和Armstrong(1996)Infect.Immun.64：3467-3474所述进行测定。

在上述生物化学方法的优选实施方案中，结合配偶体和表面定位多肽或其片段之间的结合所具有的解离常数或Kd小于5×10^-6M，例如小于10^-6M，例如小于5×10^-7M，例如小于10^-7M，例如小于5×10^-8M，例如小于10^-8M，例如小于5×10^-9M，例如小于10^-9M，例如小于5×10^-10M，例如小于10^-10M，例如小于5×10^-11M，例如小于10^-11M，例如小于5×10^-12M，例如小于10^-12M。解离常数可以通过例如表面等离子体共振分析来测定。

基于细胞的方法

通过删除或破坏关于其的结构基因或下调基因表达(参见下文)来减少表面定位多肽的水平，可以影响细菌细胞。细胞可以变得对细胞毒性化合物更敏感。特别是对于表面定位多肽，其水平的减少可以影响细胞外部部分例如膜或细胞壁阻止化合物进入细胞的功能。因此，表面定位多肽水平的减少可以使得细胞对于各种化合物更“可渗透”。

因此，本发明的一个方面涉及用于鉴定具有针对肺炎链球菌的抗菌活性的化合物的方法，其包括下列步骤：

a.提供致敏细胞，其具有水平减少的SEQ ID NO：1-282中的任何多肽，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，和

b.例如通过生长测定法来测定所述细胞对假定的抗菌化合物的敏感性。

优选地，该方法是筛选方法，其中对于多个假定的抗菌化合物重复该操作。优选的假定的抗菌化合物是不穿过野生型肺炎链球菌细胞膜的那些化合物。

这种方法的原理是，具有较低水平的表面定位多肽的细胞将显示出增加的对于细胞毒性化合物的敏感性，从而允许鉴定具有低效力的抗菌化合物，这些化合物在当使用野生型细胞用于测定法时是被错过的。通过这种方法鉴定的化合物通常需要进行修饰的以便提高效力。这可以通过化学修饰来完成。

表面定位多肽的活性的抑制可以影响细菌的生存力(即，存活、生长和/或增殖)。特别感兴趣的是抑制对于肺炎链球菌的生存力是必需的表面定位多肽。用于测试肺炎链球菌基因的重要性的方法已在现有技术中得到描述，例如在Chan等人(2002)J.Bacteriol 185：2051-2058，和Thanassi等人(2002)Nucleic Acid Res.30：3152-31-62中。

必需的表面定位多肽的抑制剂可以不必进入细菌细胞就能影响其生存力。因此，为了作为抗菌剂是有效的，一般对必需的表面定位靶多肽的抑制剂的结构提出比细胞内靶的抑制剂更少的要求。

因此，本发明涉及用于鉴定选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抑制剂的方法，其包括下列步骤：

a.提供在多肽水平方面不同的两种细胞，所述多肽是SEQ ID NO：1-282中的任何多肽，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，

b.例如通过生长测定法来测定所述细胞对假定的抑制剂的敏感性，和

c.测定所述两种细胞是否受到所述假定的抑制剂存在的不同影响。优选地，对于多个假定的抑制剂重复该方法。优选的抑制剂是不穿过肺炎链球菌细胞膜的那些。

这种方法的原理是，必需多肽的活性较低的细胞的生存力比水平较高的细胞的生存力更多地受到所述多肽的抑制剂的影响。如果所述两种细胞受到不同影响，那么这是抑制剂对所述靶或至少在相同生物化学途径中发挥作用的指示。

在该方法的某些实施方案中，目的多肽活性不同的所述两种细胞是野生型细胞(或具有目的基因的野生型活性的其他细胞)和目的多肽活性减少的致敏细胞。在某些实施方案中，致敏细胞中的不同或减少的水平可以是目的基因的不同或减少的表达水平(导致所述多肽的拷贝数不同或减少)。这可以通过将所述基因置于可调节启动子的控制下或通过反义RNA的可调节表达来完成，所述反义RNA抑制编码所述必需多肽的mRNA的翻译。在其他实施方案中，不同或减少的活性可以是目的多肽的不同或减少的活性，例如由于突变，例如温度敏感型突变。

产生致敏细菌细胞以及在抑制剂筛选中使用这些细胞的合适方式已在WO 02/077183中描述。致敏细胞可以通过如此来获得，即在一定浓度的诱导物或阻抑物或者其他条件存在下培养条件性表达肺炎链球菌突变株，所述浓度或其他条件提供了对于细菌生存力所需的基因产物水平，从而使得其功能的存在或不存在成为对于生存力的决速步骤。靶基因的亚致死表达可以是这样的，即使得生长抑制是至少约10％，例如至少约25％，例如至少约50％，例如至少约75％，例如至少90％，例如至少95％。

在本发明的基于细胞的测定法的另一实施方案中，致敏细胞是如此获得的，即通过在多肽中使用突变例如温度敏感型突变来减少对于细菌生存力所需的多肽的活性水平。在许可性和限制性温度之间的中间温度下培养此类细胞产生了基因产物活性减少的细胞。应当理解，上述方法可以采用任何突变来进行，所述突变减少但不消除对于细菌生存力所需的基因产物的活性或水平。这种方法还可以与条件性表达方法相组合。在这种组合方法中，制备细胞，在所述细胞中在目的基因中存在温度敏感型突变，并且在所述细胞中这种基因还是条件性表达的。

当筛选必需多肽的抑制剂时，生长抑制可以通过如此来测量，即直接比较在实验样品中经由相对于未接种的生长培养基的培养物光密度而测量出的生长量与对照样品的生长量。用于测定细胞增殖的备选方法包括测量绿色荧光蛋白(GFP)报告构建体的发射，各种酶促活性测定法，和本领域众所周知的其他方法。用于测量生存力的其他参数包括例如菌落形成单位。上述方法可以在固相、液相、两种前述介质的组合中或在体内进行。可以将多种化合物转移至琼脂平板，并使用自动化和半自动化装置同时进行测试。

本发明的基于细胞的测定法能够检测显示出针对目的靶分子的低或中等效力的化合物，因为此类化合物对致敏细胞比对非致敏细胞有效得多。效应可以是这样的，即与非致敏细胞相比，在对致敏细胞进行测试时，测试化合物的效力可以是2倍至几倍，例如至少10倍，例如至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍，例如至少1000倍，或甚至超过1000倍。

过表达表面定位多肽的肺炎链球菌突变株还可用于鉴定抑制此类多肽的化合物。如果化合物是细胞毒性的，那么靶多肽的过表达可以使得细胞更具有抵抗力。因此，本发明还涉及用于发现SEQ ID NO：1-282中的任何表面定位的肺炎链球菌多肽的抑制剂的方法，其包括下列步骤：

a.提供在多肽活性方面不同的两种细胞，所述多肽是SEQ ID NO：1-282中的任何表面定位的肺炎链球菌多肽，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，其中一种细胞包含基本上野生型拷贝数的所述多肽，和另一种细胞包含高于野生型拷贝数的所述多肽，

c.测定所述两种细胞是否受到所述假定的抑制剂存在的不同影响。过表达可以通过使用强启动子或通过导入多个拷贝的关于表面定位多肽的结构基因来实现。因为不是抑制剂的细胞靶的多肽的过表达也可以使得细胞对抑制剂具有抵抗力，所以假定的抑制剂对目的靶多肽的抑制将需要通过其他手段来验证，例如生物化学测定法。

除了表面定位多肽的生物化学或其他细胞活性的抑制剂之外，上述细胞方法可以用于鉴定例如通过干扰基因调节而减少靶的表达水平并从而减少其拷贝数的化合物。

在任何用于发现结合配偶体或抑制剂的基于细胞的或生物化学的方法的优选实施方案中，对于多个候选化合物重复该方法。

在一个进一步的方面，本发明涉及在本文描述的基于细胞的方法中使用的肺炎链球菌突变株，例如其中编码表面定位多肽的基因被置于异源可调节启动子的控制下的菌株，携带表面定位多肽的温度敏感等位基因的菌株，和过表达表面定位多肽的菌株。

通过靶向表面定位多肽例如SEQ ID NO：1-282中的任何多肽来干扰细菌生长的其他方法，包括使用特异性反义分子例如反义RNA或DNA，以及使用对于编码必需的表面定位多肽的mRNA特异的核酶分子，来抑制基因表达。

实施例1

策略：

计划中的实验步骤如下：表面蛋白质通过高pH洗脱或通过变溶菌素消化进行分离。分离的表面蛋白质通过三种互补的基于质谱法的策略进行鉴定：1)2-D SDS PAGE，2)1D SDS PAGE，和3)溶液中消化(in-solutiondigest)。所有三种策略包括通过质谱法分析的蛋白质鉴定。将鉴定的表面蛋白质克隆到大肠杆菌表达载体中。纯化表达出的重组蛋白质并用于免疫接种小鼠以证实抗原的免疫原性。所述经免疫接种的小鼠在攻击研究中使用，其中小鼠用肺炎链球菌攻击，并监测针对疾病和/或死亡的保护。

小鼠：

6周龄的BALB/c小鼠在无特定病原体的条件下饲养，并无限制地给予无菌的食物和水。

细菌：

大肠杆菌Top10(Invitrogen)用作常规质粒克隆的宿主。在大肠杆菌BL21/(DE3)(Invitrogen)中表达重组蛋白质。大肠杆菌在补充有抗生素的Luria液体培养基中培养。有毒力的肺炎链球菌菌株D39(血清型2，由Dr.M.Trombe，CICT，Toulouse，France购买)用于蛋白组学、攻击实验，并作为用于PCR扩增实验的基因组DNA的来源。选择并从在丹麦哥本哈根的WHO Collaborating Centre for Reference andResearch on Pneumococci购买肺炎链球菌临床分离物，包括造成大多数肺炎球菌感染的40种血清型。常规地，肺炎链球菌在血琼脂平板(Difco)上培养。

肺炎链球菌细胞包膜部分的分离：

肺炎球菌细胞壁的变溶菌素消化。细菌在血琼脂平板上生长过夜，收获到包含20％蔗糖的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并通过在6000g下离心10分钟而形成粒状沉淀。将粒状沉淀重悬浮于0.5ml渗透消化缓冲液(在20mM Tris-HCl，pH7.0，10mM MgCl₂，蛋白酶抑制剂混合物，和100U/ml变溶菌素(Sigma)中的20％蔗糖，每平板)中。让酶促消化于37℃进行1-2小时。通过在7,000×g下离心15分钟来去除完整的原生质体。收集上清液，用丙酮沉淀，并使用基于质谱法的技术进行分析。

表面蛋白质的高pH洗脱。细菌在血琼脂平板上生长过夜，收获到包含20％蔗糖的PBS中，并通过在6000g下离心10分钟而形成粒状沉淀。将粒状沉淀重悬浮于包含20％蔗糖的PBS中，并如上再次离心。然后，对于每个平板，将细菌重悬浮于2ml包含20％蔗糖的50mM甘氨酸-NaOH(pH12)中。允许细胞表面蛋白质的碱提取在室温下伴随轻微摇动进行30分钟。悬浮液在15,000g下离心20分钟，收集上清液，用1 M HCl调整至pH7，用丙酮沉淀，并通过1-D和2-D凝胶电泳进行分析。

表面蛋白质鉴定：

在表面提取后获得的复杂的蛋白质混合物通过全都基于质谱法的三种互补策略进行分析：基于2D凝胶的策略、基于1D凝胶的策略和溶液中消化的策略。

基于2D凝胶的策略(2D-凝胶MALDI-TOF/TOF)：根据与凝胶系统一起提供的手册在Ettan Dalt 2系统(Amersham Biosciences)或NovexNuPage系统(Invitrogen)上进行二维凝胶电泳。简言之：根据制造商的说明书，使用Ettan IPGphor等电聚焦系统(Amersham Biosciences)，在7cm或24cm预制的IPG条(pH范围3-10或4-7)上进行第一维电泳。在下列条件下进行等电聚焦：7cm条：8000Vh，24cm条：52000Vh。对于24cm条，第二维使用预制的12.5％凝胶(AmershamBiosciences)在5W/凝胶下进行15分钟，然后总共170W进行4-6小时。7cm条在Novex NuPage系统(Invitrogen)上使用预制的4-12％凝胶(Invitrogen)在200伏特下电泳40分钟。凝胶根据最初由Mortz等人(2001)Proteomics 1(11)，1359-1363描述的修改方法进行银染色，并且使用来自Amersham的Ettan Spot Picker并根据制造商的说明书挑取用于质谱分析的斑点。

特异性蛋白质斑点经过斑点挑取，并置于Milli-Q水中。将这些凝胶塞(gel plugs)在50mM NH₄HCO₃/50％乙醇中洗涤，并通过在96％乙醇中孵育进行脱水。通过于56℃在还原溶液(10mM DTT，50mM NH₄HCO₃)中孵育，随后在烷化溶液(55mM碘乙酰胺，50mM NH₄HCO₃)中于黑暗中室温孵育进行还原和烷化。然后，在加入5ul胰蛋白酶溶液(在50mMNH₄HCO₃，10％乙腈中的12.5ng/ul Promega胰蛋白酶)之前进行2个循环的洗涤和脱水。然后，加入另外量的碳酸氢钠溶液，并使消化物于37℃孵育过夜。向过夜消化物中加入三氟乙酸，随后在摇动下进行孵育。

部分提取物用于MALDI-TOF肽质量指纹图谱和MALDI-TOF/TOF分析(Ultraflex，Bruker Daltonics，Germany)，并且将峰值列表用于针对特定肺炎链球菌数据库的数据库搜索。在数据库搜索中使用Mascot搜索程序和评分算法(Matrix Science，UK)。肽质量容许量(tolerance)分别设定为60ppm和0.7Da。搜索参数调整至包括Met的氧化，向Cys添加脲甲基基团，并允许胰蛋白酶每个肽遗漏一个切割位点。

基于1D凝胶的策略(GeLC-MS/MS)：根据与凝胶系统一起提供的手册在Novex NuPage系统(Invitrogen)上进行一维凝胶电泳。简言之，我们使用尺寸8cm×8cm、厚1mm的预制12％双-tris凝胶(Invitrogen)在200伏特下在NuPage-MOPS-SDS走样缓冲液中电泳60分钟。凝胶根据最初由Mortz等人(2001)Proteomics 1(11)，1359-1363描述的修改方法进行银染色。用刀片以0.5cm凝胶切片切下整个泳道。如在基于2D凝胶的策略下描述的对凝胶切片进行消化，但胰蛋白酶的量是20ul胰蛋白酶溶液(在50mM NH₄HCO₃，10％乙腈中的12.5ng/ul Promega胰蛋白酶)。

提取物在LC-MS/MS(Waters Cap-LC和Micromass Ultima TOF MS)上分析。每种提取物接受115分钟LC-MS/MS分析。将由片段化的肽产生的峰值列表用于针对特定肺炎链球菌数据库的数据库搜索。在数据库搜索中使用Mascot搜索程序和评分算法(Matrix Science，UK)。对于片段离子，将肽质量容许量设定为200ppm和0.4Da。搜索参数调整至包括Met的氧化，向Cys添加脲甲基基团，并允许胰蛋白酶每个肽遗漏一个切割位点。

基于溶液中(In-solution)的策略(ISD-MS/MS)：将蛋白质混合物重悬浮于50mM NH₄HCO₃，10％乙腈中。加入胰蛋白酶溶液(50μl)(在50mM NH₄HCO₃，10％乙腈中的12.5ng/ul Promega胰蛋白酶)，并让混合物于37℃孵育过夜。如在基于1D的策略下描述的，通过用TFA(最终浓度1％)酸化来中止消化，并通过LC-MS/MS进行分析。还如在基于1D的策略下描述的，进行数据库搜索。

在不同肺炎链球菌株中检测关于蛋白质疫苗候选物的基因：

使用PCR扩增来证实编码在肺炎链球菌临床分离物中列出的抗原的基因的存在。为了这个目的，细胞在血琼脂中生长，并在PBS中稀释。通过加热(95℃5分钟)从4 0种肺炎球菌菌株中制备基因组DNA，并将等分试样用作用于使用Taq聚合酶(Qiagen)和基因特异性引物的PCR扩增的模板。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶进行电泳，并通过用溴化乙锭(0.5μg/ml)进行染色而显现。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：

如在肺炎球菌攻击下描述的，用肺炎链球菌D39感染BALB/C小鼠。在感染1天后，处死该小鼠，然后取出脾脏并分成2片。为了从组织中分离出完整的总细菌RNA，在RNA分离前将一半器官在液氮中快速冷冻并贮存于-80℃。在RNA分离前使用血琼脂平板测试每个器官的另一半的细菌(数据未显示)。使用Rneasy试剂盒(Qiagen，Hilden)从包含肺炎链球菌的动物组织中分离总RNA。用总RNA和iScript试剂盒(Biorad)进行第一链cDNA合成。将1μl cDNA用于使用基因特异性引物的后续PCR步骤。

重组疫苗(rec.vac.)的产生：

重组疫苗的产生通过PCR扩增肺炎球菌基因，随后在大肠杆菌中克隆和表达所述基因来完成。在PCR扩增实验中使用的寡核苷酸引物都购自MWG，Germany。通过使用高保真的热稳定DNA聚合酶，Platinum Pfx(Life Technologies)，从肺炎链球菌菌株D39的基因组DNA中扩增出用于蛋白质表达的肺炎球菌基因。使用包含开放阅读框的起始密码子但不包括终止密码子的引物扩增出编码序列。使用定向的Topo克隆试剂盒，用大肠杆菌Top 10作为细菌宿主，将用于蛋白质表达的编码序列克隆到质粒pET101(invi trogen)中。质粒所编码的C-末端聚组氨酸标签位于每个重组蛋白质的侧翼。为了重组蛋白质表达，将每个重组pET101质粒亚克隆到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。通过用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导来起始重组蛋白质表达，并且通过使用金属亲和层析树脂和缓冲液(invitrogen)并根据制造商的说明书，从重组大肠杆菌裂解物的可溶性部分中纯化出蛋白质。蛋白质浓度通过使用BCA测试(Hercules，Calif.)来评估。重组蛋白质相对于PBS(Millipore)进行透析，并贮存于-80℃。重组蛋白质在纯化后使用MALDI MS技术进行鉴定。

蛋白质印迹分析：

在一维(大约20μg蛋白质)SDS-PAGE上分离纯化的蛋白质，并转移至PVDF膜。根据制造商的说明书(invitrogen)进行固定化的蛋白质的免疫检测。患者血清由Dr.M.Trombe(CICT，Toulouse，France)友情提供。我们使用1∶100稀释的单一和混合的患者血清用于免疫检测。二抗的稀释度为1∶5000。

经主动免疫接种的小鼠的肺炎球菌攻击：

在攻击实验中使用BALB/C小鼠(每组10只小鼠)。对于抗原特异性疫苗接种，在第0天时用包含明矾佐剂(100μg)的25μg每种抗原对小鼠进行初刺激(prime)。动物在第14天和第28天时用相同抗原浓度进行加强。我们使用未处理的BALB/c小鼠和用无关的纤维素结合性结构域CBD(sigma)处理的小鼠作为阴性对照。所有疫苗皮下施用(s.c)。所有小鼠在第0、21和36天时抽血，并在第35天时用肺炎链球菌D39攻击。在攻击前测试来自每只经免疫接种的小鼠的个体血清中特异性抗体的存在。准备在血琼脂平板上生长的有毒力的肺炎链球菌(D39)以用于在经主动免疫接种的小鼠或对照组中经腹膜内(i.p.)途径攻击。对于攻击感染，小鼠经腹膜内注射大约每只小鼠10⁷CFU的在PBS中悬浮的有毒力的肺炎链球菌菌株D39。施用的实际CFU数目通过在血琼脂上铺板接种物的系列稀释物而回顾性地测定。小鼠的存活监控7天，在所述时间点终止实验。

用于检测小鼠中的免疫球蛋白G(IgG)的ELISA：

开发了Elisa测定法用于检测在疫苗接种后第0天、第21天和第35天时小鼠血清中的抗原特异性IgG。用重组疫苗(2μg)和肺炎链球菌D39的全细胞裂解物(2μg)包被不同的ELISA板。从小鼠血清制备2倍系列稀释物作为一抗。二抗(山羊抗小鼠IgG，缀合有辣根过氧化物酶)的稀释度为1∶5000。OPD底物用于显色。板在492nm处进行阅读。将在疫苗接种后第21天和第35天时的IgG状态的结果与在疫苗接种第0天时的IgG状态进行比较。

结果：

我们在经变溶菌素制备的肺炎链球菌细胞表面级分中鉴定了282种不同的多肽。所鉴定的多肽的序列在图2中给出。采用的方法鉴定出以相对较高水平表达的多肽。我们使用三种不同策略来检测分离出的肺炎链球菌表面蛋白质：a)基于2-D凝胶的策略，b)使用1-D凝胶和LC-MS/MS的策略，以及c)基于溶液中的MS策略。我们选择鉴定的表面蛋白质的ORFs用于表征。使用PCR扩增出基因的ORFs，并定向克隆到pET101中。如材料和方法中所述，在大肠杆菌中表达重组蛋白质。选择4种重组蛋白质用于进一步研究(表3)：

组#	AnrP编号(抗原#，短#)	描述
组#	AnrP编号(抗原#，短#)	描述	1234	230653(1，653)516029(2，029)800607(3，607)944060(4，060)	水解酶，假定的[肺炎链球菌TI]；大约32kDa(rec.vac.)硫辛酸-蛋白质连接酶，假定的[肺炎链球菌TIGR4]；大约40kDa(rec.vac.)ATP-依赖性Clp蛋白酶，蛋白水解亚基；大约24kDa(rec.vac.)自诱导物-2产生蛋白；21kDa(rec.vac.)

PCR研究证实，这4种所选择的蛋白质各自的基因在40种不同的肺炎链球菌血清型中呈现(表4)。

表4：使用不同肺炎链球菌血清型和对于下列基因的特异引物施行的PCR(+＝检测出，-＝未检测出)。

血清型	AnrP230653	AnrP516029	AnrP800607	AnrP944060
血清型	AnrP230653	AnrP516029	AnrP800607	AnrP944060	123456a6b7f7c89n9v9a	+++++++++++++	+++++++++++++	+++++++++++++	+++++++++++++

10a10b11a12f131415b15c16f17f18b18c19a19f2022f23a23f28f3131f3233f3435b35f38

+++++++++++++++++++++++++++

为了鉴定这4种基因的转录物，我们进行了RT-PCR分析。用肺炎链球菌感染BALB/C小鼠，并在感染第1天后从脾脏中分离出总RNA。使用来自脾脏的RNAs的RT-PCRs证实，所选择的基因在动物感染后在肺炎链球菌中表达(图3)。另外，制备使用患者血清的蛋白质印迹(WB)以用于测试表3中列出的蛋白质的免疫原性。此外，还使用蛋白质印迹测试了3种另外蛋白质(144，AnrP454144(14kDa rec.vac.)；487，AnrP98487(32kDa)；646，AnrP373646(25kDa))的免疫原性。我们在使用从单个患者分离的血清(图4)或从不同患者汇集的血清(数据未显示)的免疫印迹(WBs)中检测了重组疫苗029、060、607、646和653。在WBs中，对于纯化的蛋白质144和487检测到非特异信号或没有信号，然而，缺乏信号并不排除这2种蛋白质可能适合于作为疫苗。

我们用表3中的蛋白质作为蛋白质疫苗对小鼠进行疫苗接种，并测试针对肺炎链球菌的保护功效。使用明矾制备抗原，并在3个时间点上(第0、14、28天)皮下注射到BALB/C小鼠中。关于阴性对照，小鼠保持未处理(组5)或者用100μg明矾(组6)或无关蛋白质(组7)处理。我们在疫苗接种的第0天、第21天和第35天使用ELISA测定法测试了每种蛋白质的免疫原性。小鼠产生针对抗原029、060、607和653的免疫球蛋白(IgG)(图5)。如所预期的，在组5、6和7的动物中没有检测到针对肺炎球菌抗原的免疫应答。关于细菌攻击，每只小鼠在疫苗接种的第35天用肺炎链球菌D39进行感染(10⁷CFU/小鼠)。来源于用蛋白质029和607疫苗接种的2个组的小鼠证实了，在用这种肺炎链球菌菌株感染后具有较低的死亡率和较低的CFU-滴度(图6，图7)。蛋白质060和653还显示出朝向较低CFU-滴度的趋势(图6)。

为了研究不同肺炎链球菌菌株之间的序列变异，从血清型15b、15c和35f中，和从肺炎链球菌菌株D39中部分测定了抗原029和607的序列。将这些序列与来自类型4(TIGR)和R6(Sanger Center)的029和607的数据库序列进行比较。从第1位氨基酸至第315位氨基酸的029的区域在6个菌株之间于氨基酸水平上显示出超过98％的序列同一性。对于607，在从第20位至第190位的区域中发现在6个菌株之间于氨基酸水平上具有超过98％的序列同一性。这些数据表明，029和607在不同菌株之间是非常保守的。

已测定了抗原029(SEQ ID NO：16)(假定的硫辛酸蛋白质连接酶)的结构，并可在EBI(European Bioinformatics Institute)的PDB(Protein Data Bank)和HSSP数据库中在登录号1VQZ下获得。通过鉴定具有高水可接近性(ACC)的氨基酸来预测表面暴露区域，所述氨基酸同时应当在序列中具有低可变性(VAR)(参见下表)。通过几个氨基酸而分开的不同区域的氨基酸序列段在3D结构中是邻近的，并因此配对在一起。

暴露在表面上的氨基酸：

155-160+185-191[DLSVLA(SEQ ID NO：289)/IINELPK(SEQ ID NO：290)]

127-128+166-180[IDG/SKDKFESKGVKSVRA(SEQ ID NO：291)]

195-204+207-211[VEKFRDLLLE(SEQ ID NO：292)/KKEYP(SEQ ID NO：293)]

氨基酸编号	氨基酸	ACC	VAR
氨基酸编号	氨基酸	ACC	VAR	127	I	7	21
128	D	139	26	127	I	7	21
128	D	139	26	129	G	36	18
				129	G	36	18
				155	D	78	20
156	L	90	24	155	D	78	20
156	L	90	24	157	S	72	35
158	V	9	49	157	S	72	35
158	V	9	49	159	L	53	14
160	A	83	42	159	L	53	14
160	A	83	42
166	S	15	37
166	S	15	37	167	K	102	35
168	D	59	37	167	K	102	35

169	K	74	7
169	K	74	7	170	F	34	22
171	E	92	41	170	F	34	22
171	E	92	41	172	S	86	26
173	K	39	13	172	S	86	26
173	K	39	13	174	G	64	10
175	V	78	11	174	G	64	10
175	V	78	11	176	K	96	28
177	S	77	0	176	K	96	28
177	S	77	0	178	V	100	11
179	R	102	20	178	V	100	11
179	R	102	20	180	A	86	32
				180	A	86	32
				185	I	0	14
186	I	44	48	185	I	0	14
186	I	44	48	187	N	110	32
188	E	51	46	187	N	110	32
188	E	51	46	189	L	18	18
190	P	102	42	189	L	18	18
190	P	102	42	191	K	70	36
				191	K	70	36
				195	V	1	43
196	E	84	26	195	V	1	43
196	E	84	26	197	K	112	39
198	F	0	22	197	K	112	39
198	F	0	22	199	R	37	43
200	D	72	40	199	R	37	43
200	D	72	40	201	L	33	42
202	L	0	25	201	L	33	42

203	L	24	38
203	L	24	38	204	E	116	46
				204	E	116	46
				207	K	65	51
208	K	102	41	207	K	65	51
208	K	102	41	209	E	81	50
210	Y	42	50	209	E	81	50
210	Y	42	50	211	P	107	46

Claims

1.组合物，其包括

-抗体，其能够结合SEQ ID NO：20的多肽，或者能够结合选自SEQ ID NO：1-19或选自SEQ ID NO：21-282的多肽，或

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-19或选自SEQ ID NO：21-282的多肽序列，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-重组病毒或重组细胞，其包含所述多核苷酸或所述表达载体，所述组合物用作药物。

2.权利要求1的组合物，其包括或进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-抗体，其能够结合所述多肽。

3.前述权利要求中任一项的组合物，其包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：10，或者包含SEQ ID NO：10的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-抗体，其能够结合所述多肽。

4.前述权利要求中任一项的组合物，其包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：13，或者包含SEQ ID NO：13的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-抗体，其能够结合所述多肽。

5.前述权利要求中任一项的组合物，其包括或进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：28，或者包含SEQID NO：28的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-抗体，其能够结合所述多肽。

6.权利要求2-5中任一项的组合物，其进一步包括

-多肽，其包含SEQ ID NO：20，或者包含SEQ ID NO：20的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

-抗体，其能够结合所述多肽。

7.前述权利要求中任一项的组合物，其包括或进一步包括能够结合SEQ ID NO：26的多肽的抗体。

8.前述权利要求中任一项的组合物，其包括或进一步包括能够结合SEQ ID NO：33的多肽的抗体。

9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述变体与所述序列具有至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。

10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗原性片段包含少于99％，例如少于75％，例如少于50％，例如少于25％，例如少于20％，例如少于15％，或例如少于10％的全长所述序列。

11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗原性片段包含所述序列的少于70个连续氨基酸残基，例如少于50个，例如少于40个，例如少于30个，例如少于邻接的20个残基。

12.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗原性片段包含6个或更多个，例如7个或更多个，例如8个或更多个，例如9个或更多个，例如10个或更多个所述序列的连续氨基酸。

13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包括SEQ IDNO：1-282中的两种或更多种多肽，优选SEQ ID NO：1-41中的两种或更多种多肽，例如图1的组合物中的任何一种。

14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽包含标签，例如组氨酸标签。

15.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述重组细胞是毒力减弱或减少的大肠杆菌细胞或者毒力减弱或减少的沙门氏菌细胞。

16.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述重组细胞是活的。

17.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述重组细胞是死的。

18.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述药物是疫苗。

19.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包括免疫原性载体，例如载体蛋白，其中所述免疫原性载体优选地被结合至所述多肽。

20.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包括佐剂。

21.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体还能够结合完整的肺炎链球菌细胞。

22.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体是多克隆的。

23.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体是单克隆的。

24.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

25.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体是抗体的结合片段。

26.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗体所具有的解离常数或Kd小于5×10^-6M，例如小于10^-6M，例如小于5×10^-7M，例如小于10^-7M，例如小于5×10^-8M，例如小于10^-8M，例如小于5×10^-9M，例如小于10^-9M，例如小于5×10^-10M，例如小于10^-10M，例如小于5×10^-11M，例如小于10^-11M，例如小于5×10^-12M，例如小于10^-12M，例如小于5×10^-13M，例如小于10^-13M，例如小于5×10^-14M，例如小于10^-14M，例如小于5×10^-15M，或小于10^-15M。

27.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包括药学上可接受的载体。

28.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物适合于全身施用。

29.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物适合于静脉内、肌内或皮下施用。

30.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物适合于口服施用。

31.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物适合于鼻内施用。

32.抗体，其能够结合选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽。

33.权利要求32的抗体，其中所述抗体还能够结合完整的肺炎链球菌细胞。

34.权利要求32-33中任一项的抗体，其包括权利要求22-26中任一项的特征。

35.用包含编码多肽的序列的多核苷酸转化或转染的重组细胞，所述多肽包含

-选自SEQ ID NO：1-19或选自21-282，优选选自SEQ ID NO：1-19或选自21-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQID NO：13、SEQ ID NO：28的序列，最优选SEQ ID NO：16的序列，或

-所述序列的抗原性片段或变体。

36.权利要求35的重组细胞，其中所述重组宿主细胞是大肠杆菌或沙门氏菌细胞。

37.权利要求35或36的重组细胞，其中所述重组细胞是毒力减弱或减少的细胞。

38.组合物在制备用于免疫接种动物或人类以抵抗细菌，优选链球菌，更优选肺炎链球菌感染的药物中的用途，所述组合物包括

-多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-19或选自SEQ ID NO：21-282的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或变体，或

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

39.权利要求38的用途，其中所述免疫接种诱导保护性免疫应答。

40.权利要求38或39的用途，其中所述药物是适合于肠胃外、静脉内、肌内、皮下、口服或鼻内施用的药物。

41.权利要求38-40中任一项的用途，其中所述组合物包括或进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

42.权利要求38-41中任一项的用途，其中所述组合物包括或进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

43.权利要求38-42中任一项的用途，其中所述组合物包括或进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

44.权利要求38-43中任一项的用途，其中所述组合物包括或进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

45.权利要求38-44中任一项的用途，其中所述组合物进一步包括

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，或

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

46.能够结合选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抗体在制备用于治疗或预防动物或人类中链球菌，优选肺炎链球菌感染的药物中的用途，所述抗体优选为权利要求32-34中任一项所定义的抗体。

47.权利要求46的用途，其中所述多肽选自SEQ ID NO：1-41，优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选地其中所述多肽是SEQ ID NO：16。

48.用于在非人动物中产生针对选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抗体的方法，其包括下列步骤：

a.提供

-多肽，其包含

选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的序列，最优选SEQ ID NO：16的序列

或

所述序列的抗原性片段或变体，

-多核苷酸，其包含编码所述多肽的序列，

-表达载体，其包含编码所述多肽的序列，或

c.在所述动物中产生抗体，和

d.分离并任选地纯化所述抗体。

49.用于产生能够结合完整的肺炎链球菌细胞的抗体的方法，其包括执行权利要求48中指明的步骤，和选择能够结合完整的肺炎链球菌细胞的抗体的进一步步骤。

50.权利要求48或49的方法，其中所述动物是能够产生人抗体的转基因动物。

51.用于检测样品中的肺炎链球菌或其部分的方法，其包括下列步骤：

a.使所述样品与指示剂部分接触，所述指示剂部分能够特异性地结合选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33的多肽，最优选SEQ ID NO：16的多肽，和

52.权利要求51的方法，其中所述指示剂部分还能够结合完整的肺炎链球菌细胞。

53.权利要求51-52中任一项的方法，其中所述指示剂部分不穿过肺炎链球菌细胞的膜。

54.权利要求51-53中任一项的方法，其中所述指示剂部分由抗体组成或包括抗体，例如权利要求32-34中任一项所定义的抗体。

55.用于检测样品中的肺炎链球菌或其部分的方法，其包括下列步骤：通过质谱法分析所述样品，以评估SEQ ID NO：1-282的多肽中的一种或多种的存在和/或数量。

56.用于鉴定选自SEQ ID NO：1-282的多肽或其片段的结合配偶体的方法，其包括下列步骤：

a.提供多肽，其选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选SEQ ID NO：16

或

其片段，

b.使所述多肽或片段与假定的结合配偶体接触，和

c.测定所述假定的结合配偶体是否能够结合所述多肽或片段。

57.用于鉴定具有针对肺炎链球菌的抗菌活性的化合物的方法，其包括下列步骤：

a.提供多肽水平减少的致敏细胞，所述多肽选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选SEQ ID NO：16的多肽，和

58.用于鉴定选自SEQ ID NO：1-282的多肽的抑制剂的方法，其包括下列步骤：

a.提供在多肽水平方面不同的两种细胞，所述多肽选自SEQ ID NO：1-282，优选选自SEQ ID NO：1-41，更优选选自SEQ ID NO：16、SEQID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33，最优选SEQ ID NO：16的多肽，

c.测定所述两种细胞是否受到所述假定的抑制剂存在的不同影响。

59.权利要求58的方法，其中所述假定的抑制剂不穿过肺炎链球菌细胞的膜。