CN101119744B - 来自金黄色葡萄球菌的多肽和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可从葡萄球菌属物种分离出来的分离的多肽。本发明还提供包括一种或多种该多肽的组合物，以及所述多肽的制备方法和使用方法。

Description

来自金黄色葡萄球菌的多肽和使用方法
继续申请数据
本申请要求享受于2005年2月14日提交的美国临时申请序列号60/652,843的权益，其内容全部引入本文作为参考。
背景
革兰氏阳性细菌是显著多样化的一类生物，可导致人类和动物多种疾病。一些病原体被公认对人类和/或动物健康是重要的，包括属于棒状杆菌科、肠球菌科、微球菌科、分支杆菌科、诺卡菌科和消化球菌科家族的细菌，包括这样的细菌种类：放线菌属物种、双岐杆菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、真细菌属物种、皮球菌属属物种、乳酸杆菌属物种、微球菌属物种、动弯杆菌属物种、分枝细菌属物种、消化链球菌属物种、丙酸杆菌属物种和葡萄球菌属物种。这些病原体在许多不同的动某种类中导致多种临床症状。这样感染的治疗在历史上是攻击革兰氏阳性生物体共同结构和功能的抗生素。但是，许多更加普遍存在的革兰氏阳性生物体发展了对几类抗生素的抗性，使感染的治疗困难。对人类和食物生产动物广泛使用抗生素治疗细菌疾病，可能是许多对抗生素有抗性的革兰氏阳性生物体菌株种类增生的主要原因。因此，对发现不同的预防或消除动物和人类革兰氏阳性生物体感染的治疗方法有巨大的需求。
在农业动物中的葡萄球菌感染
在农业产业中许多重要的疾病是革兰氏阳性生物体导致的。革兰氏阳性细菌感染导致的临床病症实例包括乳房炎、败血病、肺炎、骨髓炎、脑膜脑炎、淋巴管炎、皮炎、生殖道感染、子宫炎、围产期疾病、垂体脓肿、关节炎、粘液囊炎、睾丸炎、膀胱炎和肾盂肾炎、干酪性坏死淋巴腺炎、肺结核，溃疡性淋巴管炎、丹毒、蹄叶炎、tyzzer疾病、破伤风、波特淋菌中毒、肠炎、恶性肿胀、羊炭疽、杆菌性血红蛋白尿、肠原性毒血症。葡萄球菌属物种特别能够感染许多不同种类的农业动物，并能导致大量经济损失。例如，美国牛奶产业估计每头奶牛每年由于乳房炎损失约185美元，乳房炎经常是金黄色葡萄球菌导致的疾病。因为在美国有9百50万头产奶奶牛，乳房炎每年的代价大约为约18亿美元。这大约是农场牛奶销售额总价值的10％，这个损失的三分之二是由于减少了亚临床感染奶牛的牛奶产量而引起的。其它损失是由于弃去异常牛奶和用抗生素治疗的奶牛产奶受到抑制所致，感染奶牛被提早更换的费用，精选奶牛减少销售价值，药物和兽医服务费用，和增加的劳动力费用。除了在牛奶产业盛行以外，革兰氏阳性球菌导致的乳房炎在山羊和绵羊中也常见。金黄色葡萄球菌导致的另外的动物疾病包括马的葡萄状菌病，家禽的化脓性滑膜炎和骨髓炎，兔子的鼻塞，猪的流产，和羊羔的扁虱脓毒症。葡萄球菌的其它种类是犬(S.intermedius)和猪(S.hycius)的主要皮肤病原体。在家禽种类中，葡萄球菌病原体导致心内膜炎和败血病。
人类葡萄球菌感染
葡萄球菌属也是人类的病原体，导致各种各样的感染。种类金黄色葡萄球菌是人类粘膜和皮肤的常见建群者，是能够导致多种人类感染的条件性病原体。例如，金黄色葡萄球菌是几种皮肤感染的病因性媒介，包括脓疱病、疖病、蜂窝织炎(cellulitis)、和烫伤皮肤综合征以及潜在致命的手术后伤口感染。此外，免疫减弱的个体在医院环境下暴露于金黄色葡萄球菌可导致器官感染例如肺炎、尿路感染、骨髓炎、关节炎、菌血症和心内膜炎。金黄色葡萄球菌还是中毒症、最著名的中毒休克综合征和食物中毒的病因性媒介。葡萄球菌肠毒素B导致的食物中毒是食物致疾病的最常见原因，甚至超过沙门氏菌病、弯曲菌病和利斯特菌病。其它种类的葡萄球菌也导致人类疾病；表皮葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和人肉孢子虫通常感染建群医疗器械，腐生葡萄球菌与妇女尿路感染有关。
葡萄球菌的毒性机制
葡萄球菌感染多种宿主组织，通过以下方式躲避免疫系统：产生几种类型分泌蛋白、表面表达毒性因子，和代谢系统被设计为在有限资源中生存，和宿主环境相关的活性防御。建群是建立感染的必需的第一个步骤；许多因子包括被膜、脂磷壁质酸和磷壁酸是帮助建群的常见结构的成分。此外，表面蛋白例如葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白和骨唾液酸糖蛋白结合蛋白特异性与宿主组织成分结合。葡萄球菌病原体通常产生毒素，并是高度破坏性的；几种人类疾病包括食物中毒、中毒休克综合征和表皮脱落皮肤病症是细胞外分泌毒素蛋白的直接结果。单个分离菌可以编码20-30个不同的分泌毒素的基因。一些分泌的蛋白产物是超级抗原，能非特异性地与抗原-产生细胞的MHC类II分子结合，同时与T细胞的T-细胞受体结合。结合诱导T细胞信号，导致高水平前炎症因子的释放，最终诱导宿主由于不可抵抗的免疫响应的损伤。另一类在表面表达的毒性因子伪装来自宿主免疫系统的细菌。例如，金黄色葡萄球菌表面-表达的蛋白A通过与宿主抗体Fc成分结合抑制调理素作用和噬菌作用。许多蛋白酶、溶血素(α、β、γ和δ)、核酸酶、脂肪酶、透明质酸酶和胶原质还帮助细菌从环境细胞提取营养素，保护它们对抗宿主的防御。
在葡萄球菌中抗生素抗性
CDC估计在美国每年有接近二百万人受到医院源性感染，每年导致90,000例死亡。在这些致命感染中70％是由抗生素-抗性细菌导致的。在微生某种类中抗生素-抗性的增加在皮肤和粘膜建群者例如金黄色葡萄球菌中特别明显。例如，绝大部分从医院环境分离的金黄色葡萄球菌是对青霉素抗性的，50％还对半合成青霉素类例如二甲氧基苯青霉素、萘夫西林和苯唑西林有抗性。这些分离菌，被称作MRSA(二甲氧基苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌)在1970年代第一次被发现，现在在医院环境中已经明确地确立。最近出现几例在社区的MRSA感染，其中被感染的个体以前没有暴露于医院或健康护理工作者。这个令人担忧的趋势通过MRSA分离菌的分离被强化，该分离菌对用于治疗MRSA的糖肽万古霉素敏感性差。按照CDC对万古霉素抗性的定义非常少的菌株曾表现出对万古霉素真正的抗性，但是几种MRSA菌株曾被鉴定为包含对万古霉素敏感性降低的亚群落，或VISA(万古霉素中间体金黄色葡萄球菌)。因为将万古霉素抗性菌株和万古霉素中间体菌株分离是相对新的进展，只有很少关于它们在医院和/或社区流行性的数据。偶尔地，对万古霉素具有完全抗性的和带有可能从肠球菌某种获得的抗性质粒的VRSA(万古霉素抗性金黄色葡萄球菌)也曾从人体中找到。
预防和治疗葡萄球菌属感染的策略
许多对多种抗生素抗性的革兰氏阳性病原体的出现激发了旨在发展预防性疫苗以对抗疾病研究的努力。设计施用给患者的疫苗是为了引起免疫系统长期记忆效应，以致在未来时间遭遇到该病原体时，免疫系统能更快速和更有效地清除该病原体。目前，对抗革兰氏阳性病原体的具有广泛保护作用的疫苗还没有得到，所述革兰氏阳性病原体是与许多严重的人类疾病相关的，特别是与葡萄球菌感染的那些疾病相关的。发展预防葡萄球菌感染疫苗的方法包括报导使用微生物表面成分识别粘连基质分子的那些：[MSCRAMMS(Nilsson等1998.JClin Invest101：2640-9；Menzies等2002.J Infect Dis185：937-43；Fattom等2004.Vaccine22：880-7]，表面多糖类(McKenney等2000；McKenney等1999.Science284：1523-7；Maira-Litran等2002.InfectImmun70：4433-40；Maira-Litran等2004.Vaccine22：872-9；Maira-Litran等2005.Infect Immun73：6752-62)和突变的外蛋白(Lowerell等1996.Infect Immun64：4686-93；Stiles等2001.InfectImmun69：2031-6；Gampfer等2002.Vaccine20：3675-84)，在亚单位疫苗组合物中作为抗原，以及活的无毒菌株(Reinoso等2002.Can J VetRes66：285-8)，和几种DNA疫苗方法(Ohwada等1999.J AntimicrobChemother44：767-74)；Brouillette等2002.Vaccine20：2348-57；Senna等2003.Vaccine21：2661-6)。尽管这些组合物中许多表现出一些程度保护作用，它们对抗不同葡萄球菌菌株的交叉-保护作用很小，在免疫减弱患者中不会引起另外的实质性免疫响应，这对于处于医院源性感染危险的人群是重要的。
最严重的葡萄球菌疾病是通过前述超级抗原致热外毒素(SPE)介导的那些，其不依赖抗原表达非特异性地刺激T-细胞。这样的疾病包括中毒休克综合征、表皮脱落性皮肤疾病和可能的Kawasaki综合征。对于这些SPE-介导的疾病，在活性感染期间促进免疫系统的免疫治疗剂通常比疫苗更有效，而疫苗典型地在感染之前施用。对SPE免疫响应的不可抵抗性质使得将快速减小毒素活性作为第一治疗目标成为必要。目前，在金黄色葡萄球菌-介导的疾病中毒素中和是通过静脉内施用人类免疫球蛋白(IVIG)来最有效完成的，其是来源于几千人类提供者的纯化浓缩的人类抗体制剂(Takei等1993.J ClinInvest91：602-7；Stohl和Elliot.1996.Clin Immunol Immunopathol79：122-33)。金黄色葡萄球菌分布广泛，健康人类成人约30％有建群，与大多数人群高暴露率是一致的，所以在IVIG中抗-葡萄球菌抗-毒素抗体水平常常足以中和毒素足够的长时间以稳定免疫响应，直至细菌负载用抗生素减小(Schlievert，2001.J Allergy Clin Immunol108(4Supρl)：S107-110)。来自多个生产者的IVIG制剂已经表明用人类外周血单核细胞在增生分析中中和毒素，体外抑制毒素-诱导的人类T细胞-驱动的B细胞分化(Stohl和Elliot.1996.Clin ImmunolImmunopathol79：122-33；Stohl和Elliott.1995.J Immunol155：1838-50；Stohl等1994.J Immunol153：117-27)，和在用葡萄球菌肠毒素B刺激的PBMC中减小IL-4和IL-2分泌(Takei等1993.J Clin Invest91；602-7；Darenberg等2004.Clin Infect Dis38：836-42)。证明中和SPE能力的IVIG治疗现在是Kawasaki综合征的推荐疗法，作为葡萄球菌中毒休克综合征治疗方法越来越受到欢迎(Schlievert2001.JAllergy Clin Immunol108(4Suppl)：S107-110)。使用IVIG作为外科手术期间免疫保护的伤口灌洗已经在小鼠中进行了研究(Poelstra等2000.Tissue Eng6(4)：401-411)。尽管标准IVIG已经用于限制一些葡萄球菌SPE-介导疾病的发展，从成千上万未经选择的人类给体中得到的IVIG制剂的安全性、效力和一致性还存在争议(Baker等1992.N EnglJ Med327:213-9；Miller等2001.J Allergy Clin Immunol108：S91-4；Sacher，2001.J Allergy Clin Immunol108：S139-46；Darenberg等2004.Clin Infect Dis38：836-42)。而且，IVIG在预防一些葡萄球菌感染中的益处是可疑的(Baker等1992.N EnglJ Med327：213-9；Hill，H.R.2000.J Pediatr137：595-7；Darenberg等2004.Clin Infect Dis38：836-42)。为了提高IVIG在某些危险人群中治疗葡萄球菌感染的效果，制备了来源于血浆的给体选择的多克隆抗-葡萄球菌人类IgG，具有指向葡萄球菌MSCRAMMS聚集因子A(ClfA)和纤维蛋白原-结合蛋白G(SdrG)的高抗体滴定度，在非常低出生体重的婴儿中成功实验预防葡萄球菌脓毒症(Vernachio等2003.Antimicrob Agents Chemother47：3400-6；Bloom等2005.Pediatr Infect Dis J24：858-866；Capparelli等2005.Antimicrob Agents Chemother49：4121-7)。也开发了指向金黄色葡萄球菌MSCRAMM聚集因子A的特异性人化单克隆抗体。该抗体选自成千上万鼠科动物具有与ClfA结合能力的抗-ClfA抗体，其结合方式废除了金黄色葡萄球菌与人纤连蛋白的结合，随后通过突变特定的靶标残基人化以模拟同源人类幼体亚组抗体(Hall等2003.Infect Immun71：6864-70；Domanski等2005.Infect Immun73:5229-32)。特定抗体被设计用于与抗生素结合以治疗严重的致命性金黄色葡萄球菌感染，尽管动物研究还证明有预防性保护作用。
概述
本发明提供包括两个或多个分离多肽的组合物。两个分离的多肽可以具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的分子量。例如，组合物可以包括88kDa和55kDa的分离蛋白。在一些方面组合物可以包括具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的分离多肽。分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳确定。多肽是可从当在包含铁螯合剂介质中培养时的金黄色葡萄球菌中分离出来的，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌中分离出来。组合物保护动物，例如小鼠或奶牛或人类，对抗用金黄色葡萄球菌菌株例如ATCC菌株19636的激发。组合物可以进一步包括可药用载体，和可以进一步包括具有150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa或其组合的分子量的分离多肽，并且可从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌中分离出来的。在一些方面，组合物的多肽可以从金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离。
本发明还提供使用组合物的方法。在一方面该方法用于治疗患者的感染，包括施用有效量的本发明组合物给患有或处于患有葡萄球菌属物种导致的感染危险的患者。在另一方面，该方法用于治疗患者的症状，包括施用有效量的本发明组合物给患有葡萄球菌属导致的感染的患者。患者可以为哺乳动物，例如人类、马或奶牛。葡萄球菌属物种可以为金黄色葡萄球菌。
本发明进一步提供使用抗体例如多克隆抗体的方法，其特异性地与本发明多肽结合。在一方面，该方法用于治疗患者的感染，包括给患有或有危险患有葡萄球菌属物种导致感染的患者施用有效量的组合物，其中组合物包括特异性地与本发明两个分离的多肽结合的抗体。在另一方面，该方法用于治疗患者的症状，包括给患有由葡萄球菌属导致的感染的患者施用有效量的组合物，其中组合物包括特异性地与本发明两个分离的多肽结合的抗体。患者可以为哺乳动物，例如人类、马或奶牛。葡萄球菌属物种可以为金黄色葡萄球菌。
本发明还提供在患者中减少建群的方法。在一方面，该方法包括施用有效量的本发明组合物给被葡萄球菌属物种建群的患者。在另一方面，该方法包括施用有效量的组合物给被葡萄球菌属物种建群的患者。其中组合物包括与本发明两个分离的多肽特异性结合的抗体。
本发明提供检测与多肽特异性结合的抗体的试剂盒。该试剂盒包括在分离的容器中本发明的分离多肽，和检测与多肽特异性结合抗体的试剂。
本发明进一步提供组合物，包括具有分子量选自88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的两个分离的多肽，其中分子量通过在十二烷硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳确定。组合物的每个多肽具有的质量指纹图谱至少80％类似于金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的相同分子量多肽的多肽质量指纹图谱，其中多肽是从当在包含铁螯合剂介质中培养时的金黄色葡萄球菌中可分离出来的，并且当在不含铁螯合剂的介质生长时不可分离出来的。例如，分子量88kDa分离多肽的质量指纹图谱有至少80％与金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的88kDa多肽质量指纹图谱类似，分子量55kDa分离多肽的质量指纹图谱有至少80％与金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的55kDa多肽质量指纹图谱类似。
附图简述
图1.从在有铁和没有铁下生长的不同种类得到的不同菌株金黄色葡萄球菌的蛋白的毛细管电泳谱(泳道分别表示Fe++和DP)。
图2.在用金黄色葡萄球菌同源和异源激发后免疫接种小鼠和未免疫接种小鼠之间死亡率的差异。
图3.在接种疫苗和用金黄色葡萄球菌ATCC19636同源激发后表现百分生存率的Kaplan-Meier生存曲线。
图4.在接种疫苗和用金黄色葡萄球菌ATCC19636异源激发后表现百分生存率的Kaplan-Meier生存曲线。
图5.在被动免疫和用金黄色葡萄球菌ATCC19636同源激发后表现百分生存率的Kaplan-Meier生存曲线。
图6.在被动免疫和用金黄色葡萄球菌菌株1477异源激发后表现百分生存率的Kaplan-Meier生存曲线。
本发明优选实施方案的详细描述
本发明提供多肽和包含多肽的组合物。本文中所用的“多肽”意指通过肽键连接的氨基酸聚合物。因此例如术语肽、寡肽、蛋白和酶包括多肽定义之内。该术语还包括多肽表达后的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。术语多肽不意味着特定长度的氨基酸聚合物。多肽可以直接从天然来源分离出来，或可以用重组、酶或化学技术制备。在天然出现的多肽的情况下，这样的多肽典型地是分离的。“分离的”多肽是指将其从天然环境中移出。例如，分离的多肽是指从细胞质或从细胞膜中移出的多肽，许多在其天然环境中的多肽、核酸和其它细胞材料不再存在。“可分离出来的”多肽是指能从特定来源中分离的多肽。“纯化的”多肽是指从其天然相关的其它成分中至少60％游离，优选至少75％游离，最优选至少90％游离的多肽。在其天然发生的生物体外边产生的多肽，例如，通过化学的或重组方法，考虑被分离和按照定义被纯化，因为它们从来不存在于天然环境中。本文中所用的“多肽片段”意指部分多肽，用蛋白酶消化多肽而得到。除非另外指明，“一种”、和“至少一种”可以交换使用，含义为一种或超过一种。当这些术语出现在说明书和权利要求中时，术语“包含”和其变种没有限制的含义。
本发明的多肽可以通过分子量、质量指纹图谱或其组合表征。多肽的分子量典型地以千道尔顿(kDa)表示，可以使用常规方法确定，包括例如凝胶过滤、包括十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯基酰胺凝胶电泳(PAGE)的凝胶电泳、毛细管电泳、质谱和液相色谱法，包括HPLC。优选通过使用具有约4％积层凝胶和约10％分离凝胶的SDS聚丙烯基酰胺凝胶在还原和变性的条件下分离多肽来测定分子量。除非另外指明，分子量意指通过SDS-PAGE确定的分子量。本文中所用的“质量指纹图谱”意指在用蛋白酶消化后，从多肽获得的多肽片段的种群。典型地，使用质谱方法分析从消化得到的多肽片段。每个多肽片段通过质量表征，或通过质量(m)与电荷(z)的比率表征，其被称为“m/z比”或“m/z值”。产生多肽质量指纹图谱的方法是常规的。这样方法的实例在实施例13公开。
本发明多肽可以为金属调节的多肽。本文中所用的“金属调节多肽”是指微生物当在低金属的条件下生长时与在高金属的条件下相同微生物的生长比较，通过微生物表达更高水平的多肽。低金属和高金属的条件在本文描述。例如，葡萄球菌属物种产生的一类金属调节多肽在高金属的条件下微生物生长期间不以可检测水平表达，但是在低金属的条件下生长期间以可检测水平表达。在低铁条件下生长后，可从金黄色葡萄球菌分离出来这样的金属调节多肽的实例具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa。在低锌或低铜条件下生长后，可从金黄色葡萄球菌分离出来这样的金属调节多肽的实例具有分子量115kDa、88kDa、80kDa、71kDa、69kDa、35kDa、30kDa、29kDa和27kD。
本发明还包括不是金属调节的多肽。这样的多肽在金属离子例如氯化铁存在下表达，也在低铁的条件下生长时表达。可从金黄色葡萄球菌分离出来的这样多肽的实例具有分子量150kDa、132WDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
多肽是金属调节的多肽或不是能通过用于比较多肽存在的方法确定，包括例如凝胶过滤、包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的凝胶电泳、毛细管电泳、质谱和液相色谱法，包括HPLC。分离在高金属的条件下和在低金属的条件下生长的微生物培养物，按照本文描述的分离本发明的多肽，将存在于每种培养物中的多肽分离并比较。典型地，来自每种培养物中的多肽等量使用。优选，使用具有约4％积层凝胶和约10％分离凝胶的SDS聚丙烯基酰胺凝胶在还原和变性的条件下分离多肽。例如，可以使用来自每种培养物的30微克(μg)总多肽，并负载到凝胶孔中。在运行完凝胶后，用Coomasie亮蓝染色，可比较二条泳道。当确定了多肽是否在可检测水平表达时，将来自培养物的30μg总多肽在SDS-PAGE凝胶上分离，使用本领域已知方法用Coomasie亮蓝染色。可以通过眼睛可视化的多肽被认为是在可检测水平表达的，同时不能被眼睛可视化的多肽则被认为不是以可检测水平表达的。
本发明多肽可以具有免疫原活性。“免疫原活性”意指多肽引起动物免疫响应的能力。对多肽的免疫响应是在动物中发展的对多肽的细胞和/或抗体-介导的免疫响应。通常，免疫响应包括但是不限于一种或多种下列作用：指向多肽一种或多种抗原决定部位的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒T细胞的产生。“抗原决定部位”意指在B细胞和/或T细胞特异性地响应以致产生抗体的抗原上的位点。免疫原活性可以为保护作用。“保护性免疫原活性”意指多肽在动物中引起免疫响应以预防或抑制葡萄球菌属物种例如金黄色葡萄球菌感染的能力。多肽是否具有保护性免疫原活性可以通过本领域已知方法确定，例如在实施例5，9或12中描述的方法。例如，本发明多肽或本发明多肽的组合保护啮齿动物例如小鼠对抗用葡萄球菌属物种的激发。本发明多肽可以具有血清激活活性。“血清激活活性”意指侯选多肽与来自感染葡萄球菌属物种例如金黄色葡萄球菌的动物的康复期血清中存在的抗体反应的能力。在一些方面，康复期血清可以来自ATCC分离菌19636、菌株SAAV1、菌株2176或菌株1477感染的动物。本发明多肽可以具有免疫调节活性。“免疫调节活性”意指多肽以非特异性方式作用以增强对特定抗原免疫响应的能力。确定多肽是否具有免疫调节活性的方法是本领域已知的。
本发明多肽可以具有参考微生物表达多肽的特征。特征可包括分子量和质量指纹图谱两者。参考微生物可以是革兰氏阳性的，优选是微球菌科家族的成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌。优选的菌株实例在表1中详细描述。
表1.细菌菌株
 
细菌细胞 实验室名称
金黄色葡萄球菌 ATCC分离菌19636
金黄色葡萄球菌 菌株SAAV1
金黄色葡萄球菌 菌株1477
金黄色葡萄球菌 菌株2176
当参考微生物是金黄色葡萄球菌ATCC分离菌19636时，如果侯选多肽具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa35kDa或33kDa和与参考微生物表达的以及分别具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa35kDa或33kDa的金属调节多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。优选，这样的多肽为金属调节的。例如，如果侯选多肽具有88kDa的分子量，并且具有参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离菌19636产生的88kDa金属调节多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。
当参考微生物是金黄色葡萄球菌分离菌SAAV1，如果侯选多肽具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa分子量(通过SDS-PAGE确定的)，且具有参考微生物表达的以及分别具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的分子量(通过SDS-PAGE确定的)的多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。优选，这样的多肽为金属调节的。例如，如果侯选多肽具有88kDa的分子量，和与参考菌株金黄色葡萄球菌分离菌SAAV1产生的88kDa金属调节多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽为本发明的多肽。
当参考微生物是金黄色葡萄球菌菌株2176时，如果侯选多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa分子量(通过SDS-PAGE确定的)，且具有与参考微生物表达的以及具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量(通过SDS-PAGE确定的)的多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。优选这样的多肽为金属调节的。例如，如果侯选多肽具有88kDa的分子量，和与参考菌株金黄色葡萄球菌分离菌2176产生的88kDa金属调节多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。
当参考微生物是金黄色葡萄球菌菌株1477时，如果侯选多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量(通过SDS-PAGE确定的)，且具有与参考微生物表达的以及分别具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量(通过SDS-PAGE确定的)的多肽质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。优选这样的多肽为金属调节的。例如，如果侯选多肽具有88kDa的分子量，和与参考菌株金黄色葡萄球菌分离菌1477产生的88kDa金属调节多肽的质量指纹图谱类似的质量指纹图谱，则侯选多肽被考虑为本发明的多肽。
被参考微生物所表达的和以上分子量指代的多肽，可以通过参考微生物在低金属的条件下生长，并随后通过本文公开的方法分离多肽得到。侯选多肽是从微生物中可分离出来的，优选革兰氏阳性微生物，更优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌。
来自多肽可以被分离的其它革兰氏阳性微生物，包括棒状杆菌属物种、肠球菌某种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属物种，和微球菌属物种、分支杆菌属物种和丹毒丝菌属物种。侯选多肽还可以使用重组、酶或化学的技术生产。
侯选多肽可以通过质谱评价分析以确定侯选多肽是否具有与参考微生物表达的并参考上述分子量的多肽之一类似的质量指纹图谱。典型地将侯选多肽分离，例如通过凝胶电泳分离侯选多肽，并切除含有侯选多肽的凝胶部分。可以使用基于不同特征分离多肽分任何凝胶电泳方法，包括1维或2维凝胶电泳，以及基于例如疏水性、pI或大小的液相色谱法分离法。例如通过用蛋白酶消化，侯选多肽被分段。优选蛋白酶在氨基酸赖氨酸的羧基端和氨基酸精氨酸之间裂解肽键，在赖氨酸或精氨酸之后的氨基酸是脯氨酸的除外。这样蛋白酶的实例是胰岛素。用胰岛素消化多肽的方法是常规的，并本领域是已知的。这样方法的实例在实施例13中公开。
多肽的质谱分析方法是常规的，本领域是已知的，包括但不限于基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。典型地，将含有从侯选多肽获得的多肽片段混合物与发挥将激光能量转移给样品功能的基质混合，产生离子化，优选单同位素的多肽片段。可以使用的基质的实例包括例如芥子酸或氰基-4-羟基肉桂酸。通过MALDI-TOF MS分析多肽方法的实例在实施例13中描述。离子化的多肽片段根据它们的m/z比分离，检测生成m/z比对于强度的光谱。光谱包括表示从侯选多肽得到多肽片段的m/z值。对于任何给定的多肽，从胰岛素消化得到的每个多肽片段的量应当是等摩尔的。但是，已知胰岛素消化不总是100％有效，例如，一些位点被更有效地裂解。因此，当MALDI-TOF MS用于确定m/z值时，每个m/z值的强度典型地是不相同的。一般说来，光谱具有在绝大部分x-轴(即轴具有m/z比率的值)存在噪音的背景水平。这种噪音的背景水平依据运行条件和使用的仪器而变化，容易通过光谱视觉分析鉴定。当强度比噪音背景水平高至少2倍，至少3倍，至少4倍时，一个m/z值一般说来被认为代表一个多肽片段。光谱通常包括其它m/z值，其是假象，例如由以下原因导致：不完全的消化、过分消化、在混合物中存在的其它多肽，或用于消化多肽的蛋白酶，包括从蛋白酶自水解得到的m/z值。这种用蛋白酶消化多肽的方法在本领域被认为是可得到高度专一性的质量指纹图谱，能被用于准确鉴定多肽和将其与其它多肽区分的方法。
在本发明的这方面，当侯选多肽通过质谱法分析时，优选将侯选多肽和来自参考微生物的多肽两者共同制备和分析，因此可减少在样品处理和操作条件上差异导致的任何潜在的假象，优选，用于制备和分析两种多肽的所有试剂都是相同的。例如，将来自参考微生物的多肽和侯选多肽在基本上相同的条件下分离，在基本上相同的条件下破碎，在相同的仪器和基本上相同的条件下通过MALDI-TOF MS分析。当侯选多肽的质量指纹图谱有至少80％，至少90％，至少95％或基本上所有的m/z值出现在参考微生物多肽的光谱中时，侯选多肽的质量指纹图谱被认为与来自参考微生物的多肽质量指纹图谱是类似的，上述噪音的背景水平也出现在侯选多肽的光谱中。
在另一方面，如果多肽具有在表2，3，4或5中描述的参考多肽的分子量，且质量指纹图谱包括如表2，3，4或5所列参考多肽的多肽片段的种群，则考虑该多肽是本发明的多肽。例如本发明多肽包括88kDa的多肽，包括具有质量HVDVR，YSYER，IIGDYRR，IFTDYRK，ELKELGQK，YAQVKPIR，QMQFFGAR，SMQPFGGIR，VSGYAVNFIK，NHATAWQGFK，LWEQVMQLSK，SLGKEPEDQNR，DGISNTFSIVPK，AGVITGLPDAYGR，TSTFLDIYAER，SMQPFGGIRMAK，THNQGVFDAYSR，KAGVITGLPDAYGR，       TLLYAINGGKDEK，      IEMALHDTEIVR，AGEPFAPGANPMHGR，    VALYGVDFLMEEK，       KTHNQGVFDAYSR，YGFDLSRPAENFK，    TSSIQYENDDIMR，      KAGEPFAPGANPMHGR，RVALYGVDFLMEEK， LWEQVMQLSKEER，        MLETNKNHATAWQGFK，MHDFNIMSTEMSEDVIR，YGNNDDRVDDIAVDLVER，ETLIDAMEHPEEYPQLTIR，YAQVKPIRNEEGLVVDFEIEGDFPK的多肽片段的质量指纹图谱。可以通过质谱方法确定侯选多肽的质量指纹图谱，例如通过MALDI-TOFMS。侯选多肽的质量指纹图谱一般具有另外的多肽片段，因此有不同于表2，3，4或5所列那些多肽的另外的m/z值。优选，当将侯选多肽与在表2，3，4或5的多肽比较时，侯选多肽是从微生物中可分离出来的，优选革兰氏阳性微生物，更优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌。其它革兰氏阳性生物体包括棒状杆菌属物种、肠球菌某种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种、分支杆菌属物种和丹毒丝菌属物种。侯选多肽可以通过在低金属的条件下生长微生物，随后通过本文描述的方法分离多肽获得。
在本领域众所周知在样品处理期间，例如氧化和形成甲酰胺甲基衍生物，氨基酸的修饰可以意外引入。进一步地，这些类型的修饰改变多肽片段的m/z值。例如，如果多肽片段含有氧化的甲硫氨酸，其m/z值相对于不含氧化甲硫氨酸的相同片段将增加16。因此，在表2，3，4或5中有符号“氧化(M)”的那些多肽片段的m/z值相对于不含氧化的甲硫氨酸的相同片段增加16。应当理解表2，3，4或5中多肽片段可以在样品处理期间被修饰。
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在另一个方面，本发明进一步包括具有氨基酸序列类似性的多肽。类似性是指结构的类似性，其测定一般通过将二种氨基酸序列残基排列(即侯选氨基酸序列和参考氨基酸序列)，沿着它们序列的长度优化相同氨基酸的编号；为优化相同氨基酸的编号在完成排列时允许在其中之一或两者中出现间隔，尽管在每个序列中的氨基酸要保留它们适当的顺序。参考氨基酸序列在表6，7，8和9中公开。使用商购获得的算法可以比较二种氨基酸序列。优选使用Tatusova等(FEMSMicrobiol Lett1999，174：247-250)描述的BLAST2搜索算法的BLASTP程序比较二种氨基酸序列，该程序可通过世界互联网获得，例如在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的生物信息学国家中心(National Center for Biotechnology Information)的互联网网页中。优选使用所有BLAST2搜索参数的缺省值，包括矩阵＝BLOSUM62；开放间隔罚分＝11，延长间隔罚分＝1，间隔x_坡度＝50，预期＝10，词大小＝3和任选的过滤器开。在使用BLAST搜索算法比较二种氨基酸序列中，结构的类似性被称作“相同性”。优选侯选氨基酸序列具有与参考氨基酸序列至少80％相同性，至少90％相同性，至少95％相同性，至少96％相同性，至少97％相同性，至少98％相同性或至少99％相同性。优选侯选氨基酸序列和参考氨基酸序列分子量基本上相同。优选侯选氨基酸序列和参考氨基酸序列的分子量通过SDS聚丙烯基酰胺凝胶电泳测定。侯选多肽可以通过微生物在低金属的条件下生长获得，随后通过本文公开的方法分离多肽。
典型地，与参考氨基酸序列具有结构类似性的侯选氨基酸序列具有免疫原活性、保护性免疫原活性、血清激活活性、免疫调节活性或其组合。
表6.金黄色葡萄球菌ATCC分离菌19636.
 
参考多肽的分子量(kDa)1           通过计算机算法鉴定与参考多肽质量指纹图谱匹配最好的多肽NCBI序列识别号            
88 49243545
55 81762012
38 82750440
37 49243435
36 57286380
35 49245508
33 49243946
1.通过SDS-PAGE测定分子量。
表7.金黄色葡萄球菌SAAV1
 
参考多肽的分子量(kDa)1           通过计算机算法鉴定与参考多肽质量指纹图谱匹配最好的多肽NCBI序列识别号            
55 57286470
55 48874
37 49243435
33 49243946
1.通过SDS-PAGE测定分子量。
表8.金黄色葡萄球菌2176.
 
参考多肽的分子量(kDa)1           通过计算机算法鉴定与参考多肽质量指纹图谱匹配最好的多肽NCBI序列识别号            
88 57285406
80 57285406
65 57285406
55 57286528
37 49482358
36 57286380
35 15927153
33 57285658
32 57285658
1.通过SDS-PAGE测定分子量。
表9.金黄色葡萄球菌1477.
 
参考多肽的分子量(kDa)1           通过计算机算法鉴定与参考多肽质量指纹图谱匹配最好的多肽NCBI序列识别号            
88 49482458
80 57285406
65 57285406
55 57286528
36 15927153
35 49484031
1.通过SDS-PAGE测定分子量。
通过参考微生物表达的和通过上述分子量指代的多肽可以通过将参考微生物在低金属的条件下生长，随后通过本文公开的方法分离多肽获得。侯选多肽是从微生物中可分离出来的，优选革兰氏阳性微生物，更优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌。其它革兰氏阳性微生物包括棒状杆菌属物种、丹毒丝菌属物种、分支杆菌属物种和丹毒丝菌属物种。侯选多肽还可使用重组、酶或化学的技术生产。
本发明还提供微生物全细胞制剂，其中微生物表达一种或多种本发明的多肽。存在于全细胞制剂中的细胞优选是无活性的，以致细胞不能复制，但是通过该微生物表达本发明多肽的免疫原活性得以保持。典型地通过将细胞暴露于试剂例如戊二醛、福尔马林或甲醛而杀死细胞。
组合物
本发明组合物可以包括至少一种本文描述的多肽或许多多肽，整数超过1(例如，至少2，至少3，至少4)。例如，组合物可以包括2，3，4，5或更多的具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或任何亚组或其组合的分离的金属调节多肽。组合物可以包括从一种微生物可分离出来的多肽，或者从二种或多种微生物组合可分离出来的多肽。例如，组合物可以包括从二种或更多的葡萄球菌属物种，或从葡萄球菌属物种和不是葡萄球菌种属成员的不同微生物中可分离出来的多肽。本发明还提供包括全细胞制剂的组合物，其中全细胞表达一种或多种本发明的多肽。例如，全细胞可以为葡萄球菌属物种。在一些方面，组合物可以包括来自2，3，4，5或6菌株的全制剂。
任选地，本发明的多肽可以与载体多肽共价结合或轭合以改善多肽的免疫性质。有用的载体多肽为本领域已知的。使用已知的和常规的方法可以完成本发明的多肽化学偶合。例如，可以使用各种同体双官能团和/或异体双官能团交叉-连接试剂例如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、双(重氮联苯胺)、己二亚胺酸二甲酯、庚二亚胺酸二甲酯、二甲基superimidate、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、戊二醛、间马来酸亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基-间马来酸亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酸亚胺基甲基)环heane-1-甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酸亚胺基-苯基)丁酸酯和(1-乙基-3-(二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(参见例如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，概述和第5章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，NY(1988))。
本发明组合物任选进一步包括可药用载体。“可药用”意指稀释剂、载体、赋形剂、盐等与组合物的其它成分相容，且对其接受者是无害的。典型地，当组合物按照本文描述的使用时，组合物包括可药用载体。本发明组合物可以配制为适合选择的施用途径的多种药物制剂形式，包括适合刺激对抗原免疫响应的途径。因此，本发明组合物可以通过以下已知的途径被施用，包括例如，口服；胃肠外(parenteral)包括真皮内、经皮和皮下；肌肉内、静脉内、腹膜内等和局部例如鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、真皮内，经皮和直肠等。可以预见组合物可以被施用到粘膜表面，例如通过对鼻腔或呼吸粘膜(例如喷雾剂或气雾剂)的施用，从而刺激整个动物身体的粘膜免疫，例如产生IgA抗体分泌。
本发明组合物还可以通过持续或延迟释放植入施用。根据本发明适合使用的植入是已知的，包括例如那些在Emery和Straub公开的(WO01/37810(2001))和Emery等(WO96/01620(1996))。可以生产足够小尺度的植入物以通过气雾剂或喷雾剂施用。植入物还包括纳米球和微球。
本发明组合物可以足以治疗本文描述的某些病症的量被施用。本发明组合物中多肽或全细胞的量可以变化。例如，多肽剂量可以为0.01微克(μg)和300mg之间，典型地在0.1mg和10mg之间。当组合物是全细胞制剂时，细胞可以存在的浓度例如为102细菌/m1，103细菌/ml，104细菌/ml，105细菌/ml，106细菌/ml，107细菌/ml，108细菌/ml或109细菌/ml。对于可注射的组合物(例如皮下、肌肉内等)，多肽可以以一定的量在组合物中存在，以使被施用组合物的总体积为0.5ml至5.0ml，典型地为1.0-2.0ml。当组合物是全细胞制剂时，细胞优选以一定的量在组合物中存在，以使被施用组合物的总体积为0.5ml至5.0ml，典型地为1.0-2.0ml。被施用的量依据各种的因素而变化，包括但不限于具体选择的多肽、动物的体重、身体状况和年龄，以及施用途径。因此，包括在给定单位剂型中多肽的绝对重量可以有很大的变化，依据下列因素例如动物的种类、年龄、体重和身体状况，以及施用方法。这样的因素可以由本领域技术人员确定。适合本发明剂量的其它实例在Emery等(美国专利6,027,736)中公开。
剂型可以方便地以单位剂型给出，可以通过制药业领域众所周知的方法制备。用可药用载体制备组合物的方法包括将活性化合物(例如，本发明的多肽或全细胞)与组成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂的制备是通过将活性化合物与液体载体、精细分散的固体载体或两者均匀地和密切地结合，然后，如果需要，将产品定型为所需的剂型。
包括可药用载体的组合物还可以包括助剂。“助剂”意指能以非特异性方式增强对特定抗原免疫响应的物质，因此潜在地减少在任何给定的免疫组合物中抗原的数量，和/或减少为对目标抗原产生足够免疫响应需要注射的频率。助剂可以包括例如IL-1、IL-2、乳化剂、胞壁酰二肽、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDA)、阿夫立定、氢氧化铝、油、皂角苷、α-生育酚、多糖、乳化石蜡(包括例如那些从MVPLaboratories，Ralston，Nebraska的EMULSIGEN商品名下可获得的)、ISA-70、RIBI和其它本领域已知的物质。预期本发明的多肽具有免疫调节活性，这样的多肽可以用作助剂，直接作用为T和/或B细胞活化剂，或作用在特定细胞类型上，增强各种细胞因子的合成或活化细胞内信号通路。这样的多肽预期增加免疫响应，以致增加现存组合物的保护指数。
在另一个实施方案中，本发明组合物包括可药用载体，可以包括生物响应修饰剂，例如，IL-2、IL-4和/或IL-6，TNF，IFN-α、IFN-γ和其它调节免疫细胞的细胞因子。免疫组合物还可以包括本领域已知的其它成分，例如抗生素、防腐剂、抗-氧化剂或螯合剂。制备方法
本发明还提供获得本文描述多肽的方法。本发明的多肽和全细胞从微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属，更优选金黄色葡萄球菌中可分离出来。其它可以分离多肽的革兰氏阳性微生物包括棒状杆菌属物种、丹毒丝菌属物种、分支杆菌属物种和丹毒丝菌属物种。用于获得本发明的多肽和制备全细胞制剂的微生物可从生物库例如AmericanType Culture Collection(ATCC)中商购获得。此外，这样的微生物通过常规和已知的技术可容易地获得。所述微生物可以从感染的动物得到作为野外分离菌，并用于获得本发明的多肽和/或全细胞制剂，或储存起来为未来使用，例如在含有20％甘油和其它类似介质的细菌介质中在-20℃至-95℃或-40℃至-50℃的冷冻储藏室中储存。
当本发明的多肽从微生物中获得时，微生物可以在低金属的条件下培养。本文中所用的措词“低金属的条件下”意指典型的细菌学介质环境，其含有可导致微生物在可检测水平下表达金属调节多肽的游离金属。本文中所用的措词“高金属的条件下”意指含有一定量游离金属的环境，导致微生物或者不以可检测水平表达一种或多种本文描述的金属调节多肽，或导致这样多肽表达的减少。金属是指元素周期表中在1至17族下的元素(IUPAC命名；在CAS命名中也分别被称为族I-A，II-A，III-B，IV-B，V-B，VI-B，VII-B，VIII，I-B，II-B，III-A，IV-A，V-A，VI-A，和VII-A)。优选的金属为在2至12族中的那些，更优选3-12族。甚至更优选金属铁，锌，铜，镁，镍，钴，锰，钼或硒，最优选铁。
一般说来，低金属的条件是向细菌学介质中加入金属螯合化合物的结果，使用低金属含量的细菌学介质，或其组合。一般当介质中不存在螯合剂时，向介质中加入金属或其组合使用时，出现高金属条件。金属螯合剂的实例包括天然和合成化合物。天然化合物的实例包括植物酚类化合物，例如类黄酮(flavonoids)。类黄酮的实例包括铜螯合剂儿茶酚和4，5，7-三羟黄烷酮，和铁螯合剂杨梅黄素和槲皮素。合成铜螯合剂的实例包括，例如四硫钼酸盐，和合成锌螯合剂的实例包括，例如N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)-亚乙基二胺。合成铁螯合剂的实例包括2，2′-联吡啶(在本领域还被称作α，α′-联吡啶)、8-羟基喹啉、亚乙基二胺-二-邻羟基苯基乙酸(EDDHA)、去铁敏甲烷磺酸盐(desferol)、转铁蛋白、乳铁传递蛋白、卵铁传递蛋白、生物含铁细胞，例如，含铁细胞catecholates和氧肟酸盐和柠檬酸盐。一般二价阳离子螯合剂的实例是Chelex
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树脂。优选使用2，2′-联吡啶来螯合铁。典型地，加入到介质中的2，2′-联吡啶浓度至少300微克/毫升(μg/ml)，至少600μg/ml或至少900μg/ml。高水平的2，2′-联吡啶可以为1200μg/ml、1500μg/ml或1800μg/ml。
金黄色葡萄球菌基因组编码三个Fur同族体：Fur，PerR和Zur。尽管Zur和PerR蛋白看上去主要分别涉及调节锌的体内平衡和过氧化应激基因，已经证明Fur蛋白在响应铁限制中调节几种含铁细胞铁吸收系统。Fur蛋白在氧化应激抵抗和毒性中也发挥作用。预期带有突变的fur基因的革兰氏阳性生物体，优选金黄色葡萄球菌，将导致组成性表达许多，如果不是所有的，本发明的金属调节多肽。在革兰氏阳性菌优选金黄色葡萄球菌中fur突变株的产生，可以使用常规方法，包括例如转位子、化学的或位点-导向的用于在革兰氏阳性菌中产生基因敲除突变株的突变。
用于培养微生物的介质，和用于培养微生物的介质体积可以变化。当评价微生物产生一种或多种本文描述多肽的能力时，微生物可以在合适体积例如10毫升至1升的介质中生长。当生长微生物是为获得用于例如施用给动物用途的多肽时，微生物可以在发酵罐中生长以保证分离大量多肽。在发酵罐中生长微生物的方法是本领域技术中常规和已知的。用于生长微生物的条件优选包括金属螯合剂，更优选铁螯合剂，例如2，2′-联吡啶，6.5和7.5之间，优选6.9和7.1之间的pH值，和37℃的温度。
在本发明的一些方面，可以在生长后收获微生物。收获包括浓缩微生物至较小体积，悬浮在不同于生长介质的介质中。浓缩微生物的方法是本领域技术中常规和已知的，包括例如过滤或离心。典型地，将浓缩的微生物悬浮在适当的缓冲液中。可以使用的缓冲液实例含有pH8.5的Tris-碱(7.3克/升)。任选最终缓冲液也最小化蛋白降解。通过使最终缓冲液在超过8.0的pH，优选至少8.5，和/或包括一种或多种蛋白酶抑制剂(例如苯基甲烷磺酰氟)实现这一点。任选和优选地，将浓缩微生物在-20℃或更低冷冻直至破碎。
当微生物被用作全细胞制剂中时，可以使用常规和已知的方法处理使细胞失活。或者，当微生物被用于制备本发明的多肽时，可以使用本领域技术常规和已知的化学、物理或机械方法破碎细胞，包括例如，煮沸、弗氏细胞压碎器、超声、肽聚糖消化(例如，通过用溶菌酶消化)或均质化。合适的用于均质化的设备实例是型号C500-BAvestin均质器(Avestin Inc，Ottawa Canada)。本文中所用的“破碎”意指细胞的破碎。通过本技术领域常规和已知的方法可以测定微生物的破碎，包括例如，光密度的改变。典型地，当1：100稀释测定时，微生物经受破碎直至百分比透光率增加到20％。当使用物理的或机械的方法时，破碎期间的温度典型地保持低温，优选在4℃，进一步使蛋白水解降解最小化。当使用化学方法时，温度可以增加以使细胞破碎最优化。将化学、物理和机械的方法组合还可以用于使微生物细胞壁溶解。本文中所用的术语“溶解”意指将细胞物质(例如多肽、核酸、碳水化合物)溶解到微生物破碎所用缓冲液的水相中，形成不可溶细胞物质的聚集体。没有预计受到理论的限制，溶解的条件下被认为导致本发明的多肽凝集为不溶的凝聚体，其足够大保证通过例如离心容易分离。
包含一种或多种本发明的多肽的不溶聚集体可以通过本技术领域常规和已知的方法分离。优选不溶聚集体通过离心分离。典型地多肽离心，例如膜多肽，可以通过离心力100,000xg完成。这样的离心力使用要求使用超级离心机，通常规模达到处理大量样品是困难的，用这些类型的离心机是不经济的。本文描述的方法提供不溶聚集体的制备方法，可大到允许使用连续流离心，例如T-I Sharpies(Alfa LavalSeparations，Warminster，PA)，其可以在17psi以250ml/分钟流动速率在离心力46,000xg至60,000xg使用。其它大规模离心机可以使用例如管状碗、腔室和盘状离心机。这样的离心机在本领域是常规使用和已知的，可从这样的制造商如Pennwalt，Westfalia和alpha-Laval商购获得。
使用本领域已知的方法将最终收获的蛋白用适当的缓冲液洗涤和/或透析，例如透滤法、沉淀、疏水色谱法、离子交换色谱法或亲和色谱法或超滤和洗涤多肽，例如在醇中，通过透滤法。在分离后，将多肽悬浮在缓冲液中，储存在低温下，例如在-20℃或更低。
在本发明制备全细胞制剂的那些方面，在微生物生长后可以用以在培养物中足够使细胞失活的浓度加入试剂例如戊二醛、福尔马林或甲醛来杀死微生物。例如，福尔马林可以以0.3％浓度(vol/vol)加入。在一段足以使细胞失活的时间后，可以将细胞通过例如透滤法和/或离心以及洗涤来收获。
使用方法
本发明一方面进一步涉及使用本发明组合物的方法。该方法包括给动物施用有效量的本发明组合物。动物可以为例如，鸟类(包括例如鸡或火鸡)、牛类(包括例如牛)、羊(包括例如山羊)、绵羊类(包括例如绵羊)、猪类(包括例如猪)、野牛(包括例如水牛)、马类(包括例如马)、伴侣动物(包括例如狗或猫)、鹿家族成员(包括例如鹿、麋鹿、驼鹿、北美驯鹿和驯鹿)或人类。
在一些方面，该方法可以进一步包括组合物另外的施用(例如一次或多次加强剂量施用)给动物以增强或刺激第二次免疫响应。加强剂量可以在第一次施用后一段时间施用，例如在第一次组合物施用后的1至8周，优选2至4周。随后加强剂量可以每年施用一次、二次、三次、四次或更多次。没有预计受到理论限制，预期本发明在一些方面每年加强剂量将不是必需的，通过暴露于微生物，动物将被在野外激发，所述微生物表达存在于组合物中的多肽，具有与施用给动物的组合物的多肽上存在的抗原决定部位相同或结构相关的抗原决定部位。
在一方面，本发明涉及制备抗体的方法，例如通过在动物中诱导产生抗体或通过重组技术。产生的抗体包括与组合物中存在的至少一种多肽特异性结合的抗体。在本发明的这个方面，“有效量”是导致动物抗体产生抗体的有效量。确定动物是否产生与本发明组合物存在多肽特异性结合抗体的方法，可以按照本文描述的方法测定。本发明进一步包括与本发明的多肽特异性结合的抗体，和包括这样抗体的组合物。该方法可以用于生产与多肽特异性结合的抗体，所述多肽是由不同于分离组合物多肽的微生物表达的。本文中所用的抗体可以“特异性结合”多肽是指抗体与抗原的抗原决定部位相互作用，所述抗原诱导了所述抗体的合成，或者抗体与结构相关的抗原决定部位相互作用。至少一些存在于本发明组合物中的多肽典型地包括抗原决定部位，其是在不同种和不同属的微生物多肽中保守的。因此，使用从一种微生物得到的组合物产生的抗体，预期与其它微生物表达的多肽结合，提供对抗革兰氏阳性生物体的广谱保护作用。抗体可以特异性结合的革兰氏阳性微生物实例为微球菌科，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌；链球菌族家族成员，优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、马链球菌、或停乳链球菌；和芽孢杆菌属物种、梭菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种和分支杆菌属物种、皮球菌属物种和丹毒丝菌属物种。
本发明还涉及这样抗体的用途，靶向表达本发明多肽的微生物，或靶向表达具有抗原决定部位结构上与本发明多肽存在的抗原决定部位相关的多肽的微生物。化合物可以与抗体共价结合，其中化合物可以为例如毒素。同样地，这样的化合物可以与细菌铁载体共价结合以靶向微生物。本发明抗体或其部分(例如Fab片段)的化学的偶合或轭合，可以使用已知的和常规方法完成。在本发明一方面还涉及治疗动物包括人类的感染，该感染是通过革兰氏阳性生物体导致的，优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌；链球菌族家族成员，优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、马链球菌、或停乳链球菌；芽孢杆菌属物种、梭菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种、分支杆菌属物种、和丹毒丝菌属物种。本文中所用的术语“感染”意指革兰氏阳性微生物在动物身体中的存在，其可以是或不是临床上明显的。葡萄球菌属成员感染的动物不在临床上表现出来，时常称之为无症状携带者。本方法包括施用有效量本发明组合物给革兰氏阳性微生物导致感染的动物，确定是否导致感染的微生物数目减少。确定感染是否通过革兰氏阳性微生物导致的方法在本领域是常规和已知的，确定感染是否减少的方法也是一样。
在另一方面，本发明涉及治疗动物某些病症的一种或多种症状的方法，该病症可能由革兰氏阳性微生物感染导致，优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌；链球菌族家族成员，优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、马链球菌、或停乳链球菌；芽孢杆菌属物种、梭菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种、分支杆菌属物种、和丹毒丝菌属物种。本方法包括给患有或有危险患有病症或病症的症状的动物施用有效量的本发明组合物，并确定是否至少一种病症症状改变，优选减轻。通过微生物感染导致的病症的实例包括例如，乳房炎、败血病、肺炎、脑膜脑炎、淋巴管炎、皮炎、生殖道感染、腺疫、子宫炎、围产期疾病、垂体脓肿、关节炎、粘液囊炎、睾丸炎、膀胱炎和肾盂肾炎、干酪性坏死淋巴腺炎、肺结核、溃疡性淋巴管炎、利斯特氏菌病、丹毒、蹄叶炎、炭疽热、tyzzer病、破伤风、波特淋菌中毒、肠炎、恶性肿胀、羊块疫、杆菌性血红蛋白尿、肠原性毒血症、坏死皮肤损伤和医院源性感染。通过金黄色葡萄球菌导致的病症的实例还包括，例如马的葡萄状菌病、化脓性滑膜炎和家禽骨髓炎，猪的流产和羊羔的扁虱脓毒症。通过链球菌属物种导致的病症实例还包括例如，咽喉痛、猩红热、脓疱病、溃疡性心内膜炎、风湿性热病和人类链球菌感染后肾团粒肾炎、马和猪的子宫颈炎和猪的脑膜炎和颌脓肿。
与这些病症相关症状的治疗可以为预防性的，或者，可以在本文描述的病症发展后启动。本文中所用的术语“症状”意指在被微生物感染导致病症的患者中的客观性证据。与参考本文病症相关的症状，对这样症状的评价在本领域是常规和已知的。预防性的治疗，例如，在患者被微生物导致的病症症状发现之前引发，本文中是指对“有危险”发展病症的患者治疗。典型地“有危险”发展病症的动物是指出现在某一地区，该地区的动物患上被诊断为和/或可能暴露于导致病症的微生物。因此，组合物的施用可以在本文描述的病症发生之前、期间或之后。在病症发展后治疗引发可以导致病症之一症状严重性的下降，或完全去除症状。在本发明的这个方面，“有效量”是指预防疾病症状表现，减小疾病症状严重程度，和/或完全去除症状的有效量。成功治疗动物革兰氏阳性微生物感染在实施例5中公开，其表明在小鼠模型中通过施用本发明组合物，对抗被金黄色葡萄球菌导致疾病的保护作用。这些小鼠模型是研究人类被这些微生物导致疾病的普遍接受的模型。成功治疗动物革兰氏阳性微生物感染还在实施例10-12中公开，其证明对奶牛施用本发明组合物对抗金黄色葡萄球菌导致疾病的保护作用。
本发明还提供减少革兰氏阳性微生物建群的方法，例如阻断革兰氏阳性微生物附着位点，包括骨骼系统组织(例如骨骼、软骨、肌腱和韧带)、肌肉系统(例如骨骼肌肉和平滑肌肉)、循环系统(例如心脏、血管、毛细血管和血)、神经系统(例如大脑、脊髓和外周神经)、呼吸系统(例如鼻子、气管、肺、支气管、细支气管、肺胞)、消化系统(例如口腔、唾液腺、食管、肝、胃、大肠和小肠)、排泄系统(例如肾、输尿管、膀胱和尿道)、内分泌系统(例如下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺和肾上腺)、生殖系统(例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸和精囊泡)、淋巴/免疫系统(例如淋巴、淋巴结和管，单核细胞或白血细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞t-和b-细胞)，和特定细胞系(例如前驱细胞、上皮细胞、干细胞)等的组织。优选的革兰氏阳性微生物是微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌；链球菌族家族成员，优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、马链球菌、或停乳链球菌；芽孢杆菌属物种、梭菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种、分支杆菌属物种、和丹毒丝菌属物种。该方法包括施用有效量的本发明组合物给被革兰氏阳性微生物建群或处于被革兰氏阳性生物体建群危险中动物。在本发明的这方面，“有效量”是足以减少微生物在动物中的建群的量。评价动物被微生物建群的方法，在本领域是常规和已知的。例如，动物肠道内被微生物建群可通过测定在动物粪便中存在的微生物确定。预期动物被微生物建群的减少可以减小微生物对人类的传播。
本发明组合物可以用于提供对抗细菌感染主动或被动的免疫。一般说来，组合物可以施用给动物提供主动免疫。但是，组合物还可以用于诱导免疫产物例如抗体的产生，其可以从产生免疫产物的动物中收集，施用给另一个动物提供被动免疫。免疫成分例如抗体可以从血清、血浆、血、初乳等中收集，制备组合物(优选含有抗体的)，用于被动免疫治疗。抗体组合物包括单克隆抗体和/或抗-个体基因型还可以使用已知的方法制备。嵌合抗体来自人类的重链和轻链两者的不变区和来自鼠科动物的抗原特异性的可变区(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，81(21)：6851-5；LoBuglio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(11)：4220-4；Boulianne等，Nature，1984，312(5995)：643-6)。通过人类对等体，人化抗体替代鼠科动物不变区和框架(FR)(可变区)(Jones等，Nature，1986，321(6069)：522-5；Riechmann等，Nature，1988，332(6162)：323-7；Verhoeyen等，Science，1988，239(4847)：1534-6；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(24)：10029-33；Daugherty等，Nucleic Acids Res.，1991，19(9)：2471-6.)。或者，可以使用某些小鼠种类，其已经被基因工程处理以生产几乎完全来自人的抗体；在免疫后将这些小鼠的B细胞收获，和处死用于生产人类单克隆抗体(Bruggeman和Taussig，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8(4)：455-8；Lonberg and Huszar，Int.Rev.Immunol.，1995；13(1)：65-93；Lonberg等，Nature，1994，368：856-9；Taylor等，Nucleic Acids Res.，1992，20：6287-95.)。被动抗体组合物和其片段，例如scFv，Fab，F(ab′)2或Fv或其它修饰形式，可以以血清、血浆、血、初乳等形式施用给接受者。但是，使用已知的方法还可以从血清、血浆、血、初乳等中分离抗体，以后用在浓缩或重构形式例如灌洗溶液、输注辅料和/或局部用药剂等。被动免疫制剂对于治疗急性全身疾病，或对没有成功通过母亲初乳接受充足水平的被动免疫的幼年动物的被动免疫可能特别有利。用于被动免疫的抗体还可以用于与各种的药物或抗生素轭合，如此可以直接靶向细菌，所述细菌是在全身和局部感染期间表达本发明多肽，或表达具有与本发明多肽存在的抗原决定部位结构相关的抗原决定部位的多肽。
用于试验评价本发明组合物的动物模型，特别是小鼠模型是可获得的。这些小鼠模型是葡萄球菌属成员，特别是金黄色葡萄球菌导致的人类疾病研究共同可接受的模型。在那些葡萄球菌属成员导致动物例如奶牛疾病情况下，天然宿主可以被用于试验评价本发明组合物。
本发明另一方面提供检测与本发明多肽特异性结合的抗体的方法。这些方法用在例如检测动物是否具有与本发明多肽特异性结合的抗体，诊断动物是否可能患上表达本文描述多肽的微生物导致的病症，或是否可能患上表达与本文描述的多肽分享共同抗原决定部位的多肽的微生物导致的病症。这样的诊断系统可以为试剂盒的形式。该方法包括将抗体与包括本发明多肽的制剂接触得到一个混合物。抗体可以存在于生物样品，例如血、奶或初乳中。该方法进一步包括在一定条件下培养所述混合物，以使抗体与多肽特异性结合形成多肽：抗体复合物。本文中所用的术语多肽：抗体复合物意指当抗体与多肽特异性结合时导致的复合物。包括本发明多肽的制剂还可包括试剂，例如缓冲液，其提供形成多肽：抗体复合物的适当的条件。然后检测多肽：抗体复合物。抗体检测在本领域是已知的，可以包括例如免疫荧光法或过氧化物酶法。检测与本发明多肽特异性结合抗体存在的方法可以以用于检测抗体的各种形式应用，包括放射免疫分析法和酶联免疫吸附分析法。
本发明还提供用于检测与本发明多肽特异性结合抗体的试剂盒。检测的抗体可以从怀疑患上革兰氏阳性微生物导致感染的动物获得，更优选微球菌科家族成员，优选葡萄球菌属物种，更优选金黄色葡萄球菌；链球菌属物种、芽孢杆菌属物种、梭菌属物种、棒状杆菌属物种、肠球菌属物种、丹毒丝菌属物种、皮球菌属属物种、李斯特菌属物种、微球菌属物种、分支杆菌属物种和丹毒丝菌属物种。
试剂盒包括至少一种本发明的多肽，或许多多肽，整数超过1(例如至少2，至少3等)，试剂盒以至少够一次分析的足够的量在合适的包装材料中。任选还包括实施本发明需要的其它试剂例如缓冲液和溶液。例如，试剂盒还可以包括能够检测与本发明多肽特异性结合的抗体的试剂，例如可检测的标记的第二抗体，其被设计用于与来自动物的抗体特异性结合。还可典型地包括包装多肽使用说明书。本文中所用的措词“包装材料”意指一种或多种用于容纳试剂盒内容的物理结构。通过众所周知的方法构造包装材料，一般提供灭菌的无污染的环境。包装材料可以带有标签，说明多肽可以用于检测与本发明多肽特异性结合的抗体。此外，包装材料含有说明书，指示在试剂盒之内的材料如何用于检测抗体。本文中所用的术语“包装”意指容器，例如玻璃、纸、箔等，能在固定的限制内盛放多肽和其它试剂，例如第二抗体。因此，例如，包装可以为微滴定板孔，其中可以吸附微克量的多肽。包装还可以含有第二抗体。“使用说明书”典型地包括切实的说明，描述试剂浓度或至少一种分析方法参数，例如试剂和被混合样品的相对量，试剂/样品混合物的保留时间，温度，缓冲条件等等。
通过下列实施例举例说明本发明。应当理解特定实施例、材料、量和步骤应按照本文提出的发明范围和精神被宽泛地解释。
实施例
实施例1
铁调节蛋白的制备
实验室规模
对于从不同菌株金黄色葡萄球菌得到的组合物，包括在限制铁和/或其它金属离子螯合程度下表达的新蛋白，评价其在小鼠中对抗病毒激发的效力。通过收集下列参数的数据评价组合物的效力，(1)每种组合物在小鼠中提供同源和异源保护作用以对抗肝病毒激发的效力，(2)每种组合物减小坏死皮肤损伤的效力，和(3)从葡萄球菌属得到的组合物在充足和耗尽铁的条件下生长提供保护作用的效力。
在本研究中评价了从3种动某种类来源的金黄色葡萄球菌菌株；鸟类、人类和牛。鸟类分离菌SAAV1是野外分离菌，最初从一群患有重度骨髓炎和滑膜炎的火鸡中得到。牛分离菌(菌株1477和菌株2176)从两个患有临床乳房炎高发病率的不同的商业牛奶场牛群中分离出来。人类分离菌从ATCC(菌株19636)中获得，来源于患有临床骨髓炎的患者。
通过将适当的分离菌接种到200ml含有300μM2，2-联吡啶(Sigma-Aldrich St.Louis，MO)的胰蛋白酶大豆培养基(TSB，DifcoLaboratories，Detroit，MI)中制备每个分离菌的主要原菌种。将培养物在37℃200rpm搅拌下生长6小时，通过在10,000xg离心收集。将细菌团粒重新悬浮在100ml含有20％甘油的TSB培养物中，灭菌后分装进2ml低温小瓶(每小瓶1ml)，并在-90℃储存直至使用。
将每个主要原菌种扩大到操作菌种。将每瓶主要菌种分离菌接种到200ml含有1000μM2，2-联吡啶(Sigma-Aldrich St.Louis，MO)的胰蛋白酶大豆培养基(TSB，Difco Laboratories，Detroit，MI)中。将培养物在37℃200rpm搅拌下生长6小时，通过在10,000xg离心收集。将细菌团粒重新悬浮在100ml含有20％甘油的TSB培养物中，灭菌后分装进2ml低温小瓶(每小瓶1ml)，并在-90℃储存直至使用。操作菌种用于生产富含铁调节膜蛋白的包含铁调节膜蛋白的组合物。
所有的菌株均适合在铁高度耗尽的介质(即，含有非常低游离铁水平的介质)中生长。这是通过在含有逐步增加浓度的2，2-联吡啶(从300至1600μM)的TSB中次级培养细菌完成的。
从细菌中制备蛋白如下所述。通过将冷冻的操作原菌种在25ml铁耗尽的介质(含有1000μM2，2′-联吡啶)和铁充足介质中在37℃培养和400rpm摇动下次级培养使细菌生长。在培养12小时后，取每种培养物5ml转移到500ml铁耗尽的或铁充足的介质中在37℃预培养。将培养物在37℃培养8小时同时在100rpm下摇动，然后通过在10,000xg离心20分钟使细胞结球。将细菌团粒重新悬浮在100ml灭菌生理盐水中，在10,000xg离心10分钟。然后将团粒重新悬浮在45mlTris-缓冲盐水pH7.2(TBS；25mM Tris，150mM NaCl)中，将得到的细菌悬浮液以9-ml等份分装到5个单独的管中。将1毫升含有50单位溶葡球菌酶(Sigma、St.Louis，MO)的TBS加入到每个管中至5单位/ml的最终体积。在37℃培养30分钟同时在200rpm下摇动后，将1ml含有0.1mg溶菌酶(Sigma)的TBS加入到每个管中。然后将细菌悬浮液在200rpm下摇动下再培养45分钟。接着，将悬浮液在4℃在3050xg离心12分钟使大的细胞片段结球。通过抽吸而不扰动团粒收集上清液。然后将上清液在39,000xg离心2.5小时。将得到的含有蛋白的团粒重新悬浮在200μL pH7.2不含盐的Tris缓冲液中。将每个分离菌的蛋白溶液合并至总体积1ml，并在-90℃储存。
对从金黄色葡萄球菌得到的富含蛋白的提取液，使用4％积层凝胶和10％分离凝胶在SDS-PAGE凝胶上进行尺寸分级。通过将10μl样品与30μl SDS还原样品缓冲液(62.5mM Tris-HCL pH6.8，20％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇)混合并煮沸4分钟制备毛细管电泳用样品。使用Protein II xi cell power supply(BioRad Laboratories，Richmond，CA、型号1000/500)在4℃将样品在18mA恒电流下毛细管电泳5小时。在SDS-PAGE凝胶上的每个真实可见的单个蛋白分子量，使用GS-800密度计(BioRad)使用宽范围分子量标志物作为参考标准(BioRad)估计得到。
当在1600μM联吡啶存在下生长时，来自每个分离菌蛋白的SDS-PAGE式样，与相同菌株当在300μM联吡啶存在下生长时比较，表现出非常不同的蛋白表达式样。例如，当在300μM联吡啶存在下生长时分离菌SAAV1得到90kDa、84kDa、72kDa、66kDa、36kDa、32kDa和22kDa的金属调节蛋白，当在1600μM联吡啶存在下生长时得到87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的金属调节蛋白。同样地，当在300μM联吡啶存在下生长时分离菌19636得到42kDa和36kDa的蛋白，当在1600μM联吡啶存在下生长时得到87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的金属调节蛋白。在所有的条件下，包括在铁充足介质中的生长，导致表达下列推测不是金属调节的蛋白：150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
而且，不同金黄色葡萄球菌菌株在1600μM联吡啶下生长得到类似的蛋白表达式样。来自鸟类分离菌(SAAV1)富含铁调节膜蛋白的组合物包括分子量87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的蛋白。来自ATCC分离菌19636的蛋白分子量与那些来自鸟类分离菌的基本完全相同。两种牛分离菌，当在1600μM2，2-联吡啶下生长时，与鸟类和ATCC分离菌表达的主要蛋白(87.73kDa、54.53kDa、37.7kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa)具有相似的带谱。但是，两种牛分离菌都不产生在鸟类和ATCC分离菌中可见的38.42kDa蛋白，而且牛分离菌表达的3种蛋白(80.46kDa、65.08kDa和31.83kDa)在鸟类和ATCC菌株中观察不到(参见图1和表10)。所有的条件下都可以得到下列不是金属调节的蛋白表达：150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
表10.从金黄色葡萄球菌分离菌获得的金属调节多肽的分子量
 
鸟类SAAV1 人类19636 牛1477 牛2176
87.73 87.73 87.73 87.73
- - 80.46 80.46
- - 65.08 65.08
54.53 54.53 54.53 54.53
38.42 38.42 - -
37.37 37.37 37.37 37.37
35.70 35.70 35.70 35.70
34.91 34.91 34.91 34.91
33.0 33.0 33.0 33.0
31.83 31.83
有趣的是，在将细菌用溶葡球菌酶/溶菌酶处理后，通过SDS-PAGE检测，澄清的上清液和细菌团粒之间的蛋白特征没有差异。通过SDS-PAGE检测，两种提取的细菌团粒和上清液具有完全相同的蛋白特征。当使用Avestin均质器在30,000psi将细菌细胞破碎时也观察到相同的结果。在慢速离心后得到的细菌团粒，与在4℃在30,000xg高速离心2.0小时后的澄清上清液比较具有相同的蛋白特征。
实施例2
从金黄色葡萄球菌得到的免疫组合物的制备
将生长在铁耗尽的条件下和按照实施例1描述制备的来自人类分离菌ATCC19636和牛分离菌1477的蛋白，用于配制二种疫苗组合物。来自ATCC分离菌的蛋白具有分子量87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa，然而牛分离菌表达的蛋白具有分子量87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83。每种组合物还含有下列不是金属调节的蛋白：150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。原疫苗由两个菌株制得，通过使用IKA Ultra Turrax T-50均质容器(IKA、Cincinnati，OH)，将每个蛋白水溶液悬浮液(500μg总蛋白/ml)乳化到商业助剂(EMULSIGEN，MVP Laboratories，Ralston，Nebraska)中，得到在0.1ml可注射的体积中的最终剂量50μg总蛋白，助剂浓度22.5％vol/vol。作为对照接种疫苗，从按照实施例1描述的在铁充足的条件下(TSB中补充300μM氯化铁)生长的牛分离菌1477中制备蛋白组合物。在上述方案中通过用生理盐水替代蛋白水悬浮液制备安慰剂疫苗。
实施例3
小鼠接种疫苗
将来自Harlan Breeding实验室(Indianapolis，IN)重量16-22克的七十只(N＝70)雌性CF-1小鼠平均分成7组(10只小鼠/组)。将小鼠圈养在聚碳酸酯小鼠笼(Ancore Corporation，Bellmore，NY)中。单个笼子用于每个治疗组，食物和水对所有小鼠都随时供应。对所有小鼠按如下所述在14天时间间隔腹膜内免疫接种0.1ml适当的组合物两次：
组-1：安慰剂-免疫接种
组-2：使用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种。
组-3：安慰剂-免疫接种。
组-4：用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种。
组-5：用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种。
组-6：用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种。
组-7：牛1477FeCl3-免疫接种，其中“牛1477FeCl3”是指在补充有300μM氯化铁的TSB中生长的牛1477中获得的蛋白。
实施例4
激发生物体的制备
以前描述的金黄色葡萄球菌菌株ATCC19636和菌株1477被用作激发生物体。简而言之，将来自冷冻原菌种(以前描述的)的分离菌划线血琼脂盘上，在37℃培养18小时。将每个分离菌的单集落在含有1600μM2，2′联吡啶的50ml胰蛋白酶大豆培养基(Difco)中次级培养。将培养物在37℃在200rpm旋转下培养6小时，然后在4℃10,000xg离心10分钟使细菌结球。通过在4℃在TBS中离心两次洗涤细菌团粒。将最终团粒重新悬浮在TBS中至在562nm光密度下在体积约25ml TBS下透光率42(T)％，用于激发。刚好在激发之前，将1ml这些细菌悬浮液序列稀释，在琼脂上平皿培养，计算每个小鼠剂量集落形成单位(CFU)的数目。
实施例5
激发
在第二次接种疫苗后第14天，对所有组(1-7)的小鼠用0.1ml适当的生物体在颈背部皮下激发。七组小鼠按如下所述被激发：
组-1(安慰剂-免疫接种)：用ATCC19636激发
组-2(用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种)：用ATCC19636激发
组-3(安慰剂-免疫接种)：用牛1477激发
组-4(用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种)：用牛1477激发
组-5(用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种)：用ATCC19636激发
组-6(用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种)：用牛1477激发
组-7(牛1477FeCl3-免疫接种)：用牛1477激发
通过在实施例4描述的计数方案确定，用于激发的金黄色葡萄球菌19636的浓度为每小鼠剂量1.35x108CFU，用于激发的金黄色葡萄球菌1477的浓度为每小鼠剂量1.65x108集落CFU。在激发7天后记录发病率、死亡率和粗略的病理学。
当比较用ATCC19636分离菌激发的小鼠时，在激发7天之内，安慰剂-免疫接种组1的70％小鼠死亡(表11和图2)。这证明19636菌株在施用的剂量水平导致小鼠高死亡率。与组1小鼠相比，在激发后7天之内组2的小鼠只有10％的死亡。这些结果说明用菌株19636激发的小鼠显著地被19636组合物疫苗接种保护(p＝0.020，Fischer准确检验)。而且，时间-与-死亡数据的Kaplan-Meier分析显示所述疫苗对对抗同源激发提供显著的保护作用(p＝0.0042，logrank检验)(图3)。此外，在激发7天之内组5的小鼠只有20％死亡，显示牛1477组合物提供对抗用ATCC19636菌株激发的显著保护作用(p＝0.015对于死亡率的logrank检验)。当数据通过Kaplan-Meier生存曲线和logrank检验分析时(图4)，对抗死亡率的保护作用确定是显著的(p＝0.015，对于死亡率的logrank检验)，显示从菌株1477得到的疫苗组合物提供对抗用菌株19636激发的异源保护作用。
表11.用金黄色葡萄球菌(人类ATCC分离菌19636和牛分离菌1477)激发后免疫接种和未免疫接种小鼠的死亡率。
 
组 #小鼠 #死亡 死亡百分率(％)
组-1*(安慰剂，ATCC19636激发) 10 7/10 70
组-2*(ATCC19636，同源激发) 10 1/10 10
组-3*(安慰剂，牛1477激发) 10 2/10 20
组-4*(牛1477，同源激发) 10 1/10 10
组-5*(牛1477，异源激发) 10 2/10 20
组-6*(ATCC19636，异源激发) 10 0/10 0
组-7*(牛1477FeCl3，牛1477激发) 10 2/10 20
*组-1，(安慰剂-免疫接种/用ATCC19636激发)
*组-2，(用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种/用ATCC19636激发)
*组-3，(安慰剂-免疫接种/用牛1477激发)
*组-4，(用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种/用牛1477激发)
*组-5，(用在限制铁下表达的牛1477蛋白免疫接种/用ATCC19636激发)
*组-6，(用在限制铁下表达的ATCC19636蛋白免疫接种/用牛1477激发)
*组-7，(牛1477FeCl3-免疫接种/用牛1477激发)
当比较用牛1477分离菌激发的小鼠时，在激发7天之内在安慰剂-免疫接种组(组3)只有20％小鼠死亡。但是，用牛1477分离菌激发引起组3中6只(75％)存活小鼠出现坏死的皮肤损伤。测定了这些损伤，在存活小鼠上损伤的平均大小为18.5mm(表12)。与之对比，在激发7天之内组4中20％小鼠死亡，但是只有3只存活小鼠(38％)出现损伤(平均直径，2.7mm)。这些结果显示牛1477组合物对用牛菌株1477激发的小鼠提供对抗损伤发展的显著的同源保护作用(p＝0.009，Student’s t-检验)。此外，用ATCC19636组合物接种疫苗保护对抗用菌株1477的激发，因为在组6中没有小鼠死亡只有3只小鼠(30％)发展皮肤损伤(平均直径，3.7mm)。总之，在组5和6中小鼠死亡率和/或损伤发展的减小证明从菌株19636和1477得到的组合物具有显著的交叉-保护作用性质(p＝0.012，基于损伤大小的Student’s t-检验)。与非铁调节蛋白比较，所述组合物效力的证明是在组7中20％小鼠死亡和4只存活者发展皮肤损伤(平均直径，15.8mm)。组7小鼠证明通过用1477分离菌蛋白接种疫苗的一定程度保护作用，因为与安慰剂-免疫接种组3比较，较少的小鼠发展损伤。但是，在组7中观察到的小鼠皮肤损伤更频繁，比组4的小鼠损伤直径更大，显示相对于从在铁充足条件下生长的细胞分离的蛋白，从在限制铁下生长的细菌中分离的蛋白提供更好对抗相同激发的保护作用。
Figure S06804903020070816D000701
在小鼠激发研究中观察到的蛋白的交叉-保护作用性质，得到在实施例1中描述的来自金黄色葡萄球菌菌株蛋白类似分子量的支持(图1)。尽管在来自牛分离菌蛋白的SDS-PAGE特征中存在显著差异，特别是不存在38.4kDa蛋白，且存在另外的3个蛋白，来自两种菌株1477和ATCC19636的蛋白可引起异源保护作用。这些结果显示菌株19636和1477之间类似的蛋白很可能是在组5和6中观察到的交叉-保护作用的原因。通过对比，来自在铁耗尽的和铁充足的条件下生长的菌株1477的蛋白特征可观察到不同。当与在铁充足条件下分离的蛋白比较时，在铁耗尽条件下那些分离的蛋白更具保护作用，对其的证明是与组7小鼠比较，在组4小鼠中发展的损伤减小。
实施例6
在哺乳动物中，已经证明对组织损伤或细菌感染的响应导致急性炎症响应。这种响应增加了毛细管渗透性和导致被识别为炎症的临床征候的吞噬细胞的渗透；肿胀、发烧、疼痛和红肿；如果不加以控制，可能会导致死亡。体液因子的活化和细胞因子的释放介导了全身事件，统称之为急性期蛋白响应，其导致生理学和生物化学活动的级联。响应的持续与损伤的严重性和全身感染的程度直接相关。已经充分证明在细菌脓毒症、外科大手术、烧伤和其它身体创伤期间，许多金属离子例如铁、铜和锌等在血清中的浓度会变化。例如，在感染的急性期，出现铁和锌血浆水平减小和铜血浆水平的增加。这些痕量金属离子在血清中的变化可能直接影响任何细菌感染的严重性和发展。
在本研究中，我们检测了金黄色葡萄球菌的蛋白在各种金属离子限制的条件下表达，为了模拟可能在全身发病期间表达的新蛋白的表达。在本研究中评价的金黄色葡萄球菌菌株来源于3种不同种类动物的临床样品：鸟类(菌株SAAV1)，人类(菌株19636)和牛(菌株1477和2176)。简而言之，每种分离菌的培养物是从主要原菌种在200ml胰蛋白酶大豆培养基(TSB)中制备的。每种培养物在37℃在200rpm搅拌下生长6小时。将10ml每种培养物转移到含有四种金属离子螯合剂2，2-联吡啶(Dp)、2-吡啶基甲基-亚乙基二胺(TPEN)、儿茶酚和4，5，7-三羟黄烷酮(全部来自Sigma、St.Louis，MO)之一的500ml耗尽的TSB中。此外，每种培养物还生长在含有制备为300μM浓度的氯化铁、氯化锌和/或氯化铜的阳离子-充足的介质中。金属离子螯合剂以下列浓度使用：2，2-联吡啶(800μM)，儿茶酚和4，5，7-三羟黄烷酮使用300μM和2-吡啶基甲基-亚乙基二胺使用浓度100μM。培养物在每种螯合剂中生长8小时，此时将培养物第二次次级培养另外的12小时。将每种培养物进行3次连续12-小时时间间隔的次级培养。在第三次结束时，将每种培养物通过10,000xg离心20分钟收集。每种培养物通过两次10,000xg离心洗涤，重新悬浮在4℃20ml pH7.2的Tris-缓冲液盐水中。
将每种细菌团粒重新悬浮在45ml pH7.2(25mM Tris和150mMNaCl)的Tris-缓冲液盐水中，将得到的细菌悬浮液以9-ml等份分装到5个单独的管中，总计20管。向每管中加入1毫升含有50单位溶葡球菌酶(Sigma、St.Louis，MO)的TBS，得到最终浓度5单位/ml。在37℃培养同时在200rpm下摇动30分钟后，向每管中加入1ml含有0.1mg溶菌酶(Sigma)的TBS。然后将细菌悬浮液再培养同时在200rpm下摇动45分钟。接着，将悬浮液在4℃在3050xg离心12分钟使大的细胞碎片结球。通过抽吸而不扰动团粒收集上清液。然后将上清液在39,000xg离心2.5小时。将得到的富含金属-调节膜蛋白的团粒重新悬浮在200μLpH7.2的Tris缓冲液中。每种分离菌的蛋白溶液合并至总体积1ml并在-90℃储存。
从SAAVl、19636、1477和2176金黄色葡萄球菌分离菌在铁、锌和铜耗尽的条件下生长获得的蛋白包括金属-调节的多肽。
使用4％积层凝胶和10％分离凝胶将从每个分离菌得到的细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上粒度分级。用于毛细管电泳的样品通过将10μl样品与30μl SDS还原样品缓冲液(62.5mM Tris-HCL ph6.8，20％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇)混合煮沸4分钟来制备。使用Protein II xi细胞电源(B ioRad Laboratories，Richmond，CA，型号1000/500)在4℃将样品在18mA恒电流毛细管电泳5小时。
在锌和/或铜螯合下生长的蛋白的SDS-PAGE式样在所有的分离菌中表现出独特条带式样，将这些条带式样与在2，2′-联吡啶存在下在限制铁下生长的那些分离菌相比是不同的。例如，当19636分离菌在限制铁下或在螯合剂2，2′-联吡啶存在下生长时，独特的铁调节蛋白在87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa区域表达。当分离菌在氯化铁存在下生长时这些蛋白下调。但是，当相同分离菌在锌或铜螯合剂存在下生长时，相对于在限制铁下表达的蛋白，表达新的蛋白亚类；新蛋白具有分子量约115kDa、88kDa、80kDa、71kDa、69kDa、35kDa、30kDa、29kDa和27kDa。此外，87.73kDa蛋白在铁限制或铜限制条件下表达，但是在锌-限制的培养时不表达。当在锌-限制和/或铜-限制下生长时，在限制铁下表达的蛋白看上去下调，但是没有完全停止，如在分离菌在氯化铁下生长时观察到的那样。
生物体在铜-限制和/或锌-限制下生长看来存在新表达的蛋白，这些新表达的蛋白是相同分离菌在限制铁条件下生长不表达的。因为生物体通过使用过渡金属构建催化各种生化反应的酶，在全身感染期间金属离子可以对微生物生存发挥着必不可少的作用。也许由于这个原因，脓毒症期间这些过渡金属的可获得性存在短暂的下降，使它们不能提供给微生物生长。这些新蛋白非常好地增强了在限制铁下生长现存组合物的保护作用效力，因为它们还可能通过细菌在全身感染期间遭受的金属离子限制下表达。
实施例7
本发明组合物还可以在大规模商业条件下生产
发酵
使用在实施例1描述的操作菌种(2ml，109CFU/ml)低温小瓶，接种到预升温至37℃含有0.125g/l2，2-联吡啶(Sigma)、2.7克BiTek酵母提取物(Difco)和甘油(3％vol/vol)的不含葡萄糖(Difco)的500ml胰蛋白酶大豆培养基(TSB)中。将培养物在37℃在200rpm搅拌下培养12小时，此时将其用于接种到2升上述介质中，使其在37℃再生长4小时。将该培养物用于接种到装有13升上述介质的20-升Virtisbench-top发酵罐(Virtis，Gardiner，NY)中。通过用50％NaOH和10％HCl自动滴定将pH保持恒定在6.9和7.1之间。搅拌速度调节为400转/分钟，将培养物在37℃用11升空气/分钟充气。通过加入11ml消泡剂(Mazu DF204Chem/Serv，Minneapolis，MN)泡沫被自动控制。使培养物在这些条件下连续生长4小时，此时灭菌泵入150-升发酵罐(W.B.Moore，Easton，PA)中。该发酵罐中装入120升不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆培养基(3,600.0克)、BiTek酵母提取物(600克)、甘油(3,600ml)、2，2-联吡啶(3.0克)和Mazu DF204消泡剂(60ml)。发酵参数如下所述：通过增加搅拌至220转/分钟，用60升空气/分钟鼓泡和10磅每平方英寸(psi)的背压使溶解氧(DO)保持在30％+/-10％。通过用50％NaOH和10％HCl自动滴定将pH保持恒定在6.9和7.1之间，温度保持在37℃。在发酵4.5小时(OD5408-9)，将培养物转移到装有不含葡萄糖的1200升胰蛋白酶大豆培养基(36,000克)、BiTek酵母提取物(6,000克)、甘油(36,000ml)、2，2-联吡啶(30.0克)和Mazu DF204消泡剂(600ml)的1,500升New Brunswick Scientific发酵罐IF-15000中。发酵参数如下所述：通过增加搅拌至300转/分钟，用300至1100升空气/分钟鼓泡和5磅每平方英寸(psi)的背压补充氧使溶解氧(DO)保持在60％+/-10％。在发酵进行中以0-90升/分钟加入补充氧辅助控制溶解氧。通过用50％NaOH和10％HCl自动滴定将pH保持恒定在6.9和7.4之间，温度保持在37℃。
在接种到大发酵罐约5小时后，通过加入70升含有18,000克不含葡萄糖的TSB、3,000克酵母提取物、30.0克2，2-联吡啶和18,000ml甘油的介质向培养物中补充另外的营养素。喂料速度调节至约28升/小时同时增加搅拌。在喂料结束后，再连续发酵4小时，此时，通过降低发酵罐温度至18℃(在1：100稀释时OD54035-40)终止发酵。收获
使用配备有与Waukesha型号U-60喂料泵(Waukesha Cherry-Burrell，Delevan，WI)连接的三个30ft2α300-K开口通道过滤器，货号AS300C5(Pall Filtron)的Pall Filtron Tangential Flow Maxiset-25(PallFiltron Corporation，Northboro，MA)将细菌发酵液浓缩并洗涤。使用过滤入口压30psi和保留压5-6psi将最初的培养物体积1250升减少至50升(2.5升/分钟)。使用pH8.5的Tris-缓冲液盐水将细菌保留液调节至150升，然后再次浓缩至50升以帮助去除任何污染的外源性蛋白，例如包括分泌毒素和蛋白酶的外蛋白。tris-缓冲液盐水升高的pH帮助防止更多的在全细胞悬浮体储存过程中可能发生的蛋白水解降解。可以使用蛋白酶抑制剂替代升高的pH或除升高的pH外还使用它。在底部设置了磁力驱动搅拌器的200-升罐中充分混合保留物。将保留物灭菌下分装(3.5升)到灭菌的4升编号2122的Nalgene容器中，放入-20℃冰箱中储存作为生产中的转换点，或者可以进一步被处理。通过离心30ml发酵培养样品和最终收获物计算细胞团粒质量。简而言之，使用JA-2l转子(Beckman Instruments，Palo Alto CA)在Beckman J2-21离心机上将预先称重的50ml Nalgene圆锥形管在39,000xg下离心90分钟。在运行的终点，倾出上清液，将管再次称重。计算每个阶段的团粒质量。发酵过程得到大约60千克湿团粒质量。
破碎
在pH8.5Tris-缓冲液盐水中的80千克细菌细胞浆液无菌转移流入1000升带夹套处理罐(Lee，型号259LU)中，该罐配有上置搅拌器(Eastern，型号TME-1/2，EMI Incorporated，Clinton，CT)，含有900升pH8.5的TBS。在200rpm连续混合18小时将细菌悬浮液激冷至4℃，此时通过均质化破碎。简而言之，将1000升含有细菌悬浮液的罐与型号C-500-B Avestin的均质器(Avestin Inc，Ottawa Canda)连接。将第二个1000升带夹套的处理罐(空的)与均质器连接，以使在处理罐中的流体能通过均质器进入空罐并可再次返回，保证多次均质化通过同时还保持在密闭体系中。均质期间温度保持在4℃。在第一次通过的开始，将流体在70psi循环经过Waukesha型号10DO泵(Waukesha)通过均质器(500加仑/小时)，同时将均质器压力调节至30,000psi。在第一次通过之前，将两批预先均质样品从均质器中抽出以建立确定破碎程度和检测pH的基础。依靠与未均质化样品比较透光率(在1：100稀释下的540nm的％T)检测破碎的程度。标准化通过均质器的次数为在1:100稀释给出最终百分透光率78-91％T之间，优选86-91％之间。在均质后，将罐从均质器移开，放到4℃的冷却循环上，在240rpm混合。
蛋白收获
使用T-1Sharples(Alfa Laval Seperations，Warminster，PA)通过离心收集含有如图1说明的铁调节蛋白的破碎细菌悬浮液。简而言之，将含有破碎细菌匀浆的1000升带夹套的处理罐在17psi和60,000xg离心力下以250ml/分钟的喂料速率喂料给12个Sharples。通过密封无菌环路将流出物收集到第二个1000升带夹套的处理罐中，保证多次通过离心机同时保持密闭体系。离心期间温度保持在4℃。将匀浆经过离心机8次。在第二次经过后，约50％的蛋白被收集，在此时，将均质流体浓缩至其最初体积的1/3，其缩短了后面6次的时间。将均质罐与离心机无菌断开连接，与Millipore Pellicon切线流过滤组件(Millipore Corporation，Bedford，MA)连接，该组件配备有与浓缩用的Waukesha型号U30喂料泵连接的25ft2筛子通道系列α30KCentrasette过滤器(Pall Filtron)。在浓缩之后，连续离心直至过程完成。每次通过后收集蛋白。将蛋白收集、重新悬浮和分装在pH8.5含有0.15％福尔马林(Sigma)作为防腐剂的50升Tris-缓冲液盐水中。
透滤法
在4℃通过透滤法洗涤蛋白悬浮液，去除任何外源性的蛋白(蛋白酶、毒素、细胞质和代谢酶等)。简而言之，将50升蛋白灭菌转移到200升处理罐中，该罐中含有150升pH8.5的灭菌Tris-缓冲液盐，配备有底部安装Dayton，型号2Z846(Dayton Electric，Chicago，IL)的125转/分钟旋转的搅拌器。将处理罐与Millipore Pellicon切线流过滤组件(Millipore Corporation)无菌连接，该组件配备有与Waukesha型号U30喂料泵连接的25ft2筛子通道系列α30K Centrasette过滤器(Pall Filtron)。通过过滤将200升蛋白溶液浓缩至目标体积50升，此时加入150升灭菌盐水。然后将蛋白悬浮液浓缩至约50升。将蛋白浓缩液储存在配备有顶部安装搅拌机的50升带夹套的处理罐中，在4℃储存。
很有趣地注意到从大规模过程得到的组合物，使用均质化作为破碎方法，相比于在实施例1中描述的较小规模方法，产生了如SDS-PAGE检测的完全一样的谱带特征。这些结果表明使用Avestin均质器C500-B，溶葡球菌酶可以被代替作为细菌溶解剂。这个发现保证了从葡萄球菌低成本大量生产铁调节的蛋白。
实施例8
小鼠的超免疫化和多克隆抗体的制备
用来自金黄色葡萄球菌菌株19636在铁限制条件下生长得到的蛋白免疫接种小鼠，从该小鼠中分离出来纯化抗体，用该抗体进行的被动免疫化是保护对抗同源和异源金黄色葡萄球菌激发。按照在实施例3中的描述，用按照在实施例1和2中描述的金黄色葡萄球菌菌株ATCC19636在铁耗尽的条件下生长得到的蛋白组合物对15只成年CD1小鼠免疫接种。每次接种用50μg蛋白组合物以7天的时间间隔对小鼠腹膜内免疫接种3次。在第三次免疫化7天后，将小鼠通过心脏穿刺完全放血。收集血清，使用标准硫酸铵沉淀法纯化抗体。通过在抗体沉淀之前加入0.5体积pH7.2饱和的硫酸铵去除外源性的血清蛋白。在4℃将溶液在100rpm搅拌24小时。将溶液在3000xg再次离心30分钟。收集上清液，通过加入足够的饱和硫酸铵再次沉淀使最终浓度至55％饱和度。在4℃将溶液在100rpm搅拌24小时。将沉淀在3000xg离心30分钟。将来自每个样品的最终团粒重新悬浮在2ml pH7.2的PBS中。然后使用50,000分子量截止透滤管(Pierce，Rockford IL)透析沉淀的抗体30小时，三次更换1升的磷酸盐-缓冲液盐水以去除硫酸铵。开始的2升缓冲液更换用.02％叠氮化钠防腐。最终的1升缓冲液更换不含防腐剂。收集透析液，再次在3000xg离心30分钟以去除任何残余的片段。将抗体溶液储存在4℃，使用前储存时间不超过48小时。每个样品在输注前，应放在血琼脂上确证无菌性。
实施例9
被动免疫化和激发
为了评价对抗金黄色葡萄球菌在限制铁下表达蛋白的输注抗体的保护作用，两组小鼠，每组15只，分别腹膜内输注200μL的纯化抗体制剂(组1)或生理盐水(组2)。另外的两组各15只的小鼠，每个皮下注射纯化抗体制剂(组3)或生理盐水(组4)。在60分钟后，对两组接受腹膜内输注的各15小鼠用1.3x108cfu金黄色葡萄球菌菌株19636腹膜内激发。类似地，对两组接受皮下注射的各15小鼠用1.3x108cfu金黄色葡萄球菌菌株1477皮下激发，以检验对抗不同的金黄色葡萄球菌菌株激发的交叉-保护作用。记录5天死亡率和/或损伤大小，在尸体检查后取出所有小鼠的肝脏，均质化，平皿培养以确定作为全身感染量度的存在的金黄色葡萄球菌的数目。Kaplan-Meier生存曲线(图5和6)显示通过输注来自在铁限制期间表达的金黄色葡萄球菌蛋白免疫接种的小鼠的抗体提供的保护作用。尽管被输注组和ATCC19636-激发对照组之间的差异是不显著的(p＝0.076，log-rank检验)，将抗体输注组在第一天死亡的单只小鼠的肝脏在血琼脂上培养，以确定激发生物体(金黄色葡萄球菌)的不存在和/或存在。来自这只小鼠的培养物对于葡萄球菌属是阴性的，表明在血琼脂板或培养物介质上没有生长。与之对比，在安慰剂组死亡小鼠的肝脏对葡萄球菌属的存在全部是阳性，事实上，在从这些小鼠肝脏得到的每个血琼脂板上都得到纯的培养物。尽管肝脏数据不排除抗体输注组死亡小鼠由于金黄色葡萄球菌感染死亡的可能性，但是感染不是全身性的，与在安慰剂组一样，小鼠可能死于其它原因。对这种抗体输注小鼠死亡的检查得到抗体输注和安慰剂处理之间显著的差异(p＝0.015，log-rank检验)。交叉-激发的数据也显示了保护作用的趋势，其中小鼠被输注来自ATCC19636蛋白接种疫苗后产生的抗体，并通过金黄色葡萄球菌菌株1477激发。在激发后7和14天之间，输注和非输注组中所有的小鼠开始发展坏死的皮肤损伤。但是，粗略地检查小鼠清楚地显示，不同组间可观察的损伤的形成上和损伤的严重性上有明显的延迟。与非输注对照小鼠比较，输注小鼠发展损伤更缓慢，非输注对照小鼠比输注小鼠发展损伤更快且严重程度更大。输注小鼠比非输注小鼠治愈更快。这一点在激发后21和35天之间是非常明显的。粗略地检查激发后35天的小鼠表明非输注小鼠外貌严重损伤，显示更大程度的疤痕。事实上，这些小鼠中许多失去正常的体态，它们在外观出现扭曲，与之相比输注小鼠几乎不发展全面的疤痕组织和/或畸形(如在非输注小鼠发展的扭曲外观所示)。总的说来，这些数据提示腹膜内输注对抗金黄色葡萄球菌铁诱导蛋白的抗体可以保护对抗和限制金黄色葡萄球菌感染严重性。
实施例10
从慢性感染的牛奶场牛群中金黄色葡萄球菌
得到的疫苗组合物的评价
选择有可归于金黄色葡萄球菌的慢性菌体高细胞计数历史的商业牛奶场牛群用于评价在实施例1描述的疫苗组合物。建立该试验研究疫苗效力的标准是：1)与未免疫接种对照比较在免疫接种者中金黄色葡萄球菌导致的临床乳房炎发病率减少，2)与对照比较在免疫接种者中菌体细胞计数改善(即减少)，以及3)在免疫接种者和未免疫接种对照之间金黄色葡萄球菌培养物阳性分离率减小。在第一次接种的时间(0天)和在最初免疫3和6周后取血。在整个研究中检测接种疫苗后注射位点或全身反应。此外，培养大罐牛奶样品，定量计数确定在接种疫苗后金黄色葡萄球菌培养物的CFU数的减少。
将三种从牛群中感染慢性的分泌奶的奶牛中分离的葡萄球菌属分离菌在如实施例1描述的限制铁和非铁限制的条件下生长。三个分离菌指定为TTX101、TTX102和TTX103。通过SDS-PAGE检测提取样品以比较分离菌之间的谱带特征。在检测的分离菌中观察到相同的谱带特征；从每个分离菌制备的组合物包括具有以下分子量的蛋白：87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83kDa。这些蛋白与以前在表10中描述的有相同分子量。此外，当比较分离菌时，看到那些在所有条件下表达的不受铁的调节的蛋白具有相同的谱带特征：150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。这些结果与以前的观察是一致的。选择被称作TTX101的一种分离菌作为分离菌制备在本研究中使用的组合物。
实施例11
金黄色葡萄球菌(TTX101)疫苗制备
按照在实施例1中的描述使用分离菌TTX101制备组合物。组合物包括在铁耗尽条件下表达的具有分子量87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83kDa的蛋白以及具有分子量150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa43kDa41kDa和40kDa的非金属调节蛋白。从菌株TTX101得到的免疫组合物用于制备试验疫苗，通过使用IKAUltra Turrax T-50均质容器(IKA、Cincinnati，OH)将提取的蛋白悬浮液(每毫升400μg总蛋白)乳化到商业助剂(EMULSIGEN，MVPLaboratories，Ralston NE)中，得到助剂浓度22.5％vol/vol在2.0ml可注射的体积中的800μg总蛋白的最终剂量。所述疫苗在21天时间间隔皮下施用2次。
实施例12
试验设计和牛群接种疫苗
在第一次接种疫苗前18天，将所有产奶的奶牛(N＝80)招募到本研究中，通过标准的好氧细菌培养方法培养从每个产奶奶牛得到的单个的奶样品对金黄色葡萄球菌进行实验。此外，使用标准方法通过牛奶场牛群改善协会对菌体细胞计数。80头奶牛中有14头被临床诊断为乳房炎，培养物对金黄色葡萄球菌呈阳性。其余奶牛(N＝66)对金黄色葡萄球菌为阴性。将80头奶牛平均分成两组，指定为组-1，免疫接种(N＝40)和组-2，未免疫接种(N＝40)。将14头临床诊断葡萄球菌属阳性的奶牛平均分配到两组中，使每个研究组中含有7头患有临床乳房炎的奶牛。在第一次接种疫苗之前组间平均SCC为未免疫接种对照的203，219与免疫接种组的240，443比较(没有统计学差异p＝0.7)。
在第一次取样18天后，组1中所有的奶牛用2ml在实施例11描述的疫苗在上右肩皮下免疫接种。在第一次接种疫苗10天后，提取牛奶样品，在此期间通过DHIA对每个奶牛菌体细胞计数。在此期间的牛奶样品不进行细菌学检验确定葡萄球菌属的存在。在此期间组间SCC之间差异为125,241(免疫接种)对比196,297(对照)。免疫接种组与未免疫接种对照之间比较菌体细胞数有36％的差异。在这次采样期间对照和免疫接种之间SCC的差异没有统计学差异(p＝0.5)。在两次采样期间组间SCC没有统计学差异是由于在奶牛之间个体SCC有大量的变量。在此相同期间还检查了每个免疫接种奶牛的注射位点。通过身体检查，被检查的奶牛在注射位点没有表现出任何不良组织反应。此外，未检测到由于接种疫苗牛奶产量的损失。
在第一次接种疫苗21天后，给组-1中所有的奶牛(免疫接种)第二次接种疫苗或加强剂量。在第一次和第二次接种疫苗之间的期间，由于环境温度突然下降两组奶牛(免疫接种和对照)都发展了奶头损伤，导致损伤在奶头顶端的形成，导致感染奶头的发展，潜在地增加了采样期间葡萄球菌属的分离，这在第三次采样时观察到了。在第二次接种疫苗后23天，通过DHIA采集用于每个的奶牛菌体细胞计数的牛奶样品。牛奶样品还进行金黄色葡萄球菌存在的细菌学检验。在此期间在第一次取样期检验为阴性的奶牛中金黄色葡萄球菌分离速率突然增加。在未免疫接种对照组中42.9％奶牛现在对金黄色葡萄球菌检验阳性，与免疫接种组相比，其仅仅表现出35.5％的增加。这是免疫接种组与未免疫接种对照组之间比较的7.4％差异。难以说免疫接种组金黄色葡萄球菌分离上的改善是单独由于所述疫苗的作用。不能忽略从奶头损伤的奶牛获取清洁牛奶样品的困难，这增加了牛奶在获取样品时被金黄色葡萄球菌污染的可能性。然而，在免疫接种组与对照比较平均SCC之间有显著的差异。免疫接种组平均SCC为222,679，比较对照组测定的404，278菌体细胞。这是当免疫接种组与未免疫接种对照组之间比较时44.9％的差异。有趣的是推测这些组间SCC中观察到的差异与组之间金黄色葡萄球菌分离率的差异也是一致的。但是，由于单个的动物和动物数量上小的实验样本量上之间的SCC有大的变化，因此该差异没有统计学地差异(p＝0.28)。
在相同时间期间，检查了每个免疫接种奶牛注射位点的可能由于疫苗组合物导致的不良组织反应。通过身体检查，没有奶牛被检查出在注射位点有任何不良反应。所述疫苗组合物是高度组织相容性的，在每次接种疫苗后对牛奶产量没有造成可测定的损失。
通过测定SCC和牛奶样品中存在或不存在金黄色葡萄球菌连续监测奶牛。每个组中一些奶牛在第二次接种疫苗42天后第三次免疫接种。看上去有有利于使用疫苗组合物降低菌体细胞计数和控制金黄色葡萄球菌导致的感染的差异。进一步的监测包括基于抗体对疫苗组合物滴定量的血清学，由于健康改善免疫接种奶牛牛奶产量改变，和免疫接种动物与未免疫接种种群比较SCC的降低。此外，进行了其它试验以考察用恶性金黄色葡萄球菌激发后基于剂量响应的疫苗保护作用指数。
实施例13
因为在不同的金黄色葡萄球菌菌株中蛋白的分子量被证明是类似的，并因为在小鼠激发研究中观察到异源保护作用，我们探索确定是否有在图1中类似分子量的蛋白是类似的蛋白。选择用于表征蛋白的技术是基质辅助激光解吸/离子化质谱(MALDI-MS)。如在实施例1中描述的使用SDS-PAGE分离部分组合物，凝胶用Coomassie亮蓝染色以使蛋白可视化。
材料和方法
切除和洗涤。凝胶用水洗涤两次10分钟。通过尽量靠近蛋白带切断而切除每个目标蛋白带，以减少在样品中存下的凝胶量。
将每个凝胶切片切成1x1mm立方，放到1.5ml管中。将凝胶片用水洗涤15分钟。在洗涤步骤使用的所有溶剂的体积约等于凝胶切片体积的两倍。接着将凝胶切片用水/乙腈(1：1)洗涤15分钟。当蛋白已经用银染色时，去除水/乙腈混合物，在SpeedVac(ThermoSavant，Holbrook，NY)中干燥凝胶片，然后按照如下所述进行还原和烷基化。当凝胶片没有被银染色时，去除水/乙腈混合物，加入乙腈覆盖直至凝胶片变为粘性的白色，在此时去除乙腈。将凝胶片再次在100mMNH4HCO3中水合，在5分钟后，加入等于凝胶片体积两倍体积的乙腈。培养15分钟，去除液体，在SpeedVac中干燥凝胶片。
还原和烷基化。将干燥凝胶片在10mM DTT和100mM NH4HCO3中再次水合，在56℃培养45分钟。在使管冷却至室温后，去除液体，立刻加入相同体积的55mM碘乙酰胺和100mM NH4HCO3混合物。在室温下黑暗中培养30分钟。去除液体，加入乙腈覆盖直至凝胶片变成粘性的白色，在此时去除乙腈。凝胶片在100mM NH4HCO3中再次水合，5分钟后加入等于凝胶片体积两倍体积的乙腈。培养15分钟，去除液体，凝胶片在Speed vac中干燥。如果凝胶被coomasie蓝染色，残留的coomassie还保留着，用100mM NH4HCO3/乙腈重复洗涤。
凝胶内消化。在Speed Vac将凝胶片完全干燥。在4℃在消化缓冲液(50mM NH4HCO3，5mM CaCl2，每毫升12.5纳克(ng/μl)胰岛素)中将片再次水合。加入足够的缓冲液覆盖凝胶片，需要时加入更多。凝胶片在冰上培养45分钟，去除上清液，用5-2μl不含胰岛素的相同缓冲液替换。在空气培养箱中在37℃培养过夜。
肽的提取。加入足够体积的25mM NH4HCO3以覆盖凝胶片，培养15分钟(典型地在超声浴中)。加入相同体积的乙腈，培养15分钟(如可能在超声浴中)，上清液被再次覆盖。使用5％甲酸替代NH4HCO3重复提取两次。加入足够体积的5％甲酸覆盖凝胶片，培养15分钟(典型地在超声浴中)。加入相同体积的乙腈，培养15分钟(典型地在超声浴中)，再次覆盖上清液。收集提取液，加入10mM DTT到最终浓度1mM DTT。将样品在SpeedVac中干燥至最终体积约5μl。
肽的脱盐。按照生产商建议使用ZIP尖端移液管尖端(C18，Millipore，Billerica，MA)使样品脱盐。简而言之，将样品在重构溶液(5:95乙腈:H2O，0.1％-0.5％三氟乙酸)中重构，离心，检查pH保证小于3。通过吸入10μl溶液1(50:50乙腈:H2O，0.1％三氟乙酸)使ZIP尖端水合，弃去吸入的等份。随后吸入10μl溶液2(在去离子H2O中的0.1％三氟乙酸)，弃去吸入的等份。通过缓慢吸入10μl样品到尖端将样品负载到尖端，排出它到样品管中，重复5至6次。将10微升溶液2吸入尖端，通过排出弃去该溶液，重复该过程5-7次以洗涤。通过吸入2.5μl冰冷却的溶液3(60:40，乙腈:H2O，0.1％三氟乙酸)洗脱肽，排出，然后再次吸入相同等份并排出尖端3次。在溶液被排出尖端后，将管盖帽，在冰上储存。
质谱肽图。将肽悬浮在10μl至30μl5％甲酸中，通过MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Inc.，Billerica，MA)分析。按照生产商的建议确定肽片段的质谱。简而言之，将含从胰蛋白酶消化液得到的肽的样品与基质氰基-4-羟基肉桂酸混合，转移至目标，使其干燥。将干燥样品放入质谱仪中，照射，检测每个离子的飞行时间，用于确定在组合物中存在的每个蛋白的肽质量指纹图谱。用已知的多肽来标准化仪器。
数据分析。将试验观察到的在每个质谱中肽的质量与使用Mascot搜索引擎(MatrixScienceLtd.，London，UK，andwww.matrixScience.com，参见Perkins等，Electrophoresis20，3551-3567(1999))的肽质量指纹图谱搜索方法预期的蛋白质量相比较。搜索参数包括：数据库、MSDB或NCB Inr；分类学，细菌(真细菌)或硬壁菌门(革兰氏阳性细菌)；搜索类型，肽质量指纹图谱；酶，胰岛素；固定修饰，甲酰胺甲基(C)或没有；可变修饰，氧化(M)，甲酰胺甲基(C)，组合或没有；质量值，单个同位素；蛋白质量，没有限制；肽质量容差，±150ppm和±430ppm之间，或±1Da；肽电荷状态，Mr；最大丢失裂片，0或1；查询数，20。
结果
搜索的结果为组合物中存在的每个蛋白的质量指纹图谱，在表2，3，4和5中显示。
本文引用的所有的专利、专利申请、出版物和可获得的电子材料(包括例如在GenBank和RefSeq中核苷序列提交，和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，和在GenBank和RefSeq中从注解密码区的翻译)引入本文作为参考。给出上述详细描述和实施例仅仅是为了清楚理解。从中没有不必要的限制。本发明不限于展示和描述的准确细节，对本领域技术人类显而易见的变化通过权利要求也将包括在本发明之内。
除非另外指明，在说明书和权利要求中表达组分量、分子量等的数字应被理解为在所有情况下被术语“大约”修饰。因此，除非另外指明与之相反，在说明书和权利要求中提出的数字参数都是大约的，可以依据本发明追求获得的性质而变化。丝毫没有尝试限制权利要求范围等价物的教义，每个数字参数应当至少以报告的有效数字的角度理解，并应用常规的取整技术。
尽管本发明的数字范围和参数设置宽范围是大约的，在特定实施例中提出的数字值以尽可能的准确性被报告。但是，所有数字值本身固有地包含在它们相应实验测定中发现的标准偏差必然导致的范围。
所有的标题是为了阅读的方便，不用于限制该标题下文本内容的含义，除非进行了如此的说明。
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Claims (40)

1.一种组合物，其包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，其中组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
2.权利要求1的组合物，进一步包含可药用载体。
3.权利要求1的组合物，其中多肽从金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离。
4.权利要求1的组合物，进一步包含具有分子量150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa或其组合的分离的多肽，并且可从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
5.一种组合物，其包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽是从金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中可分离出来的，其中组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
6.权利要求5的组合物，其中多肽从金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离。
7.权利要求5的组合物，进一步包含具有分子量150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa或40kDa的分离的多肽，且可从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
8.一种组合物在制备用于治疗患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者感染的药物中的用途，其中该组合物包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，其中该组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
9.权利要求8的用途，其中患者是哺乳动物。
10.权利要求9的用途，其中哺乳动物是人类。
11.权利要求8的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
12.一种组合物在制备用于治疗患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者症状的药物中的用途，其中该组合物包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，其中该组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
13.权利要求12的用途，其中患者是哺乳动物。
14.权利要求13的用途，其中哺乳动物是人类。
15.权利要求12的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
16.一种组合物在制备用于治疗患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者感染的药物中的用途，其中组合物包含：
与具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离多肽特异性结合的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
17.权利要求16的用途，其中患者是哺乳动物。
18.权利要求17的用途，其中哺乳动物是人类。
19.权利要求16的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
20.权利要求16的用途，其中抗体是多克隆抗体。
21.一种组合物在制备用于治疗患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者症状的药物中的用途，其中组合物包含：
与具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离多肽特异性结合的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
22.权利要求21的用途，其中患者是哺乳动物。
23.权利要求22的用途，其中哺乳动物是人类。
24.权利要求21的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
25.权利要求21的用途，其中抗体是多克隆抗体。
26.一种组合物在制备用于减少在患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者中建群的药物中的用途，其中该组合物包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，其中该组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
27.一种组合物在制备用于减少在患有或有危险患有由葡萄球菌属物种导致的感染的患者中建群的药物中的用途，其中组合物包含：
与具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少五种分离多肽特异性结合的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
28.检测与多肽特异性结合的抗体的试剂盒，在分离的容器中包含：
具有分子量88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或其组合的至少三种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来；和
检测与多肽之一特异性结合的抗体的试剂。
29.权利要求5的组合物，进一步包含可药用载体。
30.一种组合物，其包含：
具有分子量88kDa、55kDa、37kDa、35kDa、33kDa或其组合的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶上的电泳测定，其中多肽可从当在包含铁螯合剂的介质中培养时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，并且不能从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来，其中组合物保护动物对抗金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636的激发。
31.权利要求30的组合物，进一步包含可药用载体。
32.权利要求30的组合物，其中多肽从金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离。
33.权利要求30的组合物，进一步包含具有分子量150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa或其组合的分离的多肽，并且可从当在不含铁螯合剂的介质中生长时的金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636中分离出来。
34.权利要求26的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
35.权利要求26的用途，其中患者是哺乳动物。
36.权利要求35的用途，其中哺乳动物是人类。
37.权利要求27的用途，其中葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。
38.权利要求27的用途，其中患者是哺乳动物。
39.权利要求38的用途，其中哺乳动物是人类。
40.权利要求27的用途，其中抗体是多克隆抗体。
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RENE J. COURCOL et al..Siderophore Production by Staphylococcus aureus andIdentification of Iron-Regulated Proteins.INFECTION AND IMMUNITY65 5.1997,65(5),1944-1948. *

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