ES2586125T3 - Polipéptidos de Staphylococcus aureus y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
Una composición obtenida mediante un proceso que comprende: proporcionar un cultivo que comprende un Staphylococcus aureus, en donde el Staphylococcus aureus ha sido adaptado al crecimiento en condiciones de bajo nivel de hierro mediante el subcultivo del Staphylococcus aureus en medio que contiene concentraciones crecientes de 2,2'-dipiridilo de 300 μM a 1.600 μM, y en donde el Staphylococcus aureus se cultiva en presencia de 1.600 μM de 2,2'-dipiridilo; alterar el Staphylococcus aureus para producir una mezcla de células de Staphylococcus aureus rotas; disolver la mezcla para producir un preparado que contiene proteínas disueltas y no disueltas; y aislar las proteínas no disueltas, en donde el Staphylococcus aureus es la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
Description
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DESCRIPCION
Polipeptidos de Staphylococcus aureus y metodos de uso
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. n.° de serie 60/652.843, presentada el 14 de febrero de 2005.
Antecedentes
Las bacterias gram positivas son un grupo muy diverso de organismos que causan varias enfermedades tanto en seres humanos como en animales. Algunos de los patogenos reconocidos como importantes en la salud humana y/o animal incluyen bacterias pertenecientes a las familias de Corynebacteriaceae, Enterococcacae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae y Peptococcaceae, que incluyen especies bacterianas tales como Actinomyces sp., Bifidobacterium sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Eubacterium sp., Kytococcus sp., Lactobacillus sp., Micrococcus sp., Mobiluncus sp., Mycobacteria sp., Peptostreptococcus sp., Propionibacterium sp. y Staphylococcus sp. Estos patogenos producen una multitud de manifestaciones cllnicas en muchas especies animales distintas. El tratamiento de dichas infecciones ha sido historicamente el de los antibioticos que atacan a las estructuras y funciones comunes de los organismos gram positivos. Sin embargo, muchos de los organismos gram positivos mas ubicuos han desarrollado resistencia a varias clases de antibioticos, dificultando el tratamiento de las infecciones. El uso generalizado de antibioticos en el tratamiento de enfermedades bacterianas tanto en seres humanos como en animales de produccion alimentaria es probablemente un importante factor que contribuye en la proliferacion de cepas resistentes a los antibioticos de muchas especies de organismos gram positivos. Por lo tanto, hay una gran necesidad de encontrar diferentes tratamientos que prevengan o eliminen las infecciones por organismos gram positivos en animales, as! como en seres humanos.
Infecciones estafilococicas en los animales agropecuarios
En la industria agropecuaria, una serie de importantes enfermedades esta causada por organismos gram positivos. Los ejemplos de afecciones cllnicas causadas por infecciones bacterianas gram positivas incluyen mastitis, septicemia, neumonla, osteomielitis, meningoencefalitis, linfangitis, dermatitis, infecciones del tracto genital, metritis, enfermedad perinatal, abscesos hipofisarios, artritis, bursitis, orquitis, cistitis y pielonefritis, linfadenitis caseosa, tuberculosis, linfangitis ulcerosa, erisipela, laminitis, enfermedad de Tyzzer, tetanos, botulismo, enteritis, edema maligno, basquilla, hemoglobinuria bacilar, enterotoxemia. Staphylococcus sp., en particular, son capaces de infectar muchas especies diferentes de animales agricolas, y pueden causar enormes perdidas economicas. Por ejemplo, se estima que la industria lactea estadounidense pierde aproximadamente 185 dolares por vaca al ano debido a la mastitis, una enfermedad que suele estar causada por Staphylococcus aureus. Dado que hay 9,5 millones de cabezas de vacas lecheras en EE.UU., el coste anual de la mastitis es de aproximadamente 1,8 mil millones de dolares. Esto es aproximadamente el 10 % del valor total de las ventas de leche de granja, y aproximadamente dos tercios de esta perdida se debe a la reduccion de la produccion de leche en vacas infectadas subcllnicamente. Otras perdidas se deben a la leche anomala desechada y a la leche retenida de vacas tratadas con antibioticos, el coste de reemplazo temprano de vacas afectadas, la reduccion del valor de venta de vacas de desecho, el coste de los farmacos y los servicios veterinarios, y el aumento de los costes laborales. Ademas de su frecuencia dentro de la industria lactea bovina, la mastitis causada por cocos gram positivos tambien es comun entre las cabras y las ovejas. Otras enfermedades de animales adicionales causadas por S. aureus incluyen botriomicosis en caballos, sinovitis purulenta y osteomielitis en aves de corral, moqueo en conejos, abortos en el ganado porcino y piemia por garrapatas en corderos. Otras especies de estafilococos son los principales patogenos de la piel de origen canino (S. intermedius) y porcino (S. hycius). En las especies de aves de corral, los patogenos de estafilococos causan endocarditis y septicemia.
Infecciones estafilococicas en los seres humanos
Staphylococcus sp. tambien son patogenos humanos causantes de una gran variedad de infecciones. La especie Staphylococcus aureus, un colonizador comun de la mucosa y de la piel humanas, es un patogeno oportunista que puede causar diversas infecciones humanas. Por ejemplo, S. aureus es el agente causante de varias infecciones cutaneas, incluyendo impetigo, furunculosis, celulitis y el slndrome de la piel escaldada, as! como infecciones de heridas postquirurgicas potencialmente letales. Ademas, la exposicion de personas inmunocomprometidas a S. aureus en los hospitales ha dado lugar a infecciones de organos tales como neumonla, infecciones del tracto urinario, osteomielitis, artritis, bacteriemia y endocarditis. S. aureus tambien es el agente causante de la toxinosis, mas concretamente, del slndrome de choque toxico y la intoxicacion alimentaria. La intoxicacion alimentaria causada por la enterotoxina estafilococica B es la causa mas comun de enfermedades transmitidas por alimentos, superando incluso a la salmonelosis, la campilobacteriosis y la listeriosis. Otras especies de estafilococos tambien causan enfermedad en seres humanos; S. epidermidis, S. haemolyticus y S. hominis infectan los dispositivos medicos implantados y S. saprophyticus se asocia con infecciones del tracto urinario en las mujeres.
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Mecanismos de virulencia de los estafilococos
Los estafilococos infectan varios tejidos del huesped y evaden el sistema inmune a traves de la produccion de varios tipos de protelnas secretadas, factores de virulencia expresados en la superficie y sistemas metabolicos disenados para sobrevivir en medio de los recursos limitados y las defensas activas asociadas con el entorno del huesped. La colonizacion es la primera etapa necesaria en el establecimiento de la infeccion; numerosos factores, incluyendo la capsula, el acido lipoteicoico y el acido teicoico son componentes estructurales comunes que contribuyen a la colonizacion. Ademas, las protelnas de la superficie, tales como la protelna de union a la fibronectina estafilococica y las protelnas de union a la sialoprotelna osea se unen especlficamente a los componentes del tejido del huesped. Las toxinas se suelen producir entre estafilococos patogenos, y son muy perjudiciales. Varias enfermedades humanas, incluyendo la intoxicacion alimentaria, el slndrome de choque toxico y las afecciones cutaneas exfoliativas, son el resultado directo de protelnas toxinas secretadas extracelularmente. Un unico aislamiento puede codificar genes de 20-30 toxinas secretadas diferentes. Algunos de los productos proteicos secretados son superantlgenos que se pueden unir de forma inespeclfica a la molecula del MHC de clase II de una celula presentadora de antlgeno y, simultaneamente, al receptor de linfocitos T de un linfocito T. La union induce la senalizacion de los linfocitos T y conduce a la liberacion de altos niveles de factores proinflamatorios, provocando, en ultima instancia, dano en el huesped debido a la abrumadora respuesta inmune. Otra clase de factores de virulencia expresados en la superficie disfrazan las bacterias del sistema inmune del huesped. Por ejemplo, la protelna A expresada en la superficie de S. aureus inhibe la opsonizacion y la fagocitosis mediante la union del componente de Fc del anticuerpo del huesped. Numerosas proteasas, hemolisinas (alfa, beta, gamma y delta), nucleasas, lipasas, hialuronidasa y colagenasa tambien ayudan a las bacterias en la extraction de nutrientes de las celulas circundantes, protegiendolas contra las defensas del huesped.
Resistencia a los antibioticos entre los estafilococos
El CDC estima que cada ano cerca de 2 millones de personas en Estados Unidos adquieren una infeccion nosocomial, produciendo 90.000 muertes al ano. De estas infecciones letales, el 70 % estan causadas por bacterias resistentes a los antibioticos. El aumento de la resistencia a antibioticos entre las especies microbianas es particularmente destacado en la piel y en las mucosas, como las colonizadoras tales como S. aureus. Por ejemplo, la gran mayorla de los S. aureus aislados de los hospitales son resistentes a la penicilina, y el 50 % tambien son resistentes a las penicilinas semisinteticas tales como la meticilina, la nafcilina y la oxacilina. Estos aislados, conocidos como SARM (S. aureus resistente a la meticilina) fueron vistos por primera vez en la decada de los 70, y se han establecido firmemente en el entorno hospitalario. Recientemente, se han producido varios casos de infecciones por SARM en la comunidad, en la que los individuos infectados no se hablan expuesto previamente a los hospitales ni a los trabajadores sanitarios. Esta alarmante tendencia se intensifica por el aislamiento de aislados de SARM que son menos susceptibles a la vancomicina, un glucopeptido usado para tratar la SARM. Muy pocas cepas han mostrado ser verdaderamente resistentes a la vancomicina segun la definition del CDC de resistencia a la vancomicina, pero varias cepas de SARM se han caracterizado como que consisten en subpoblaciones con susceptibilidad reducida a la vancomicina o SAIV (S. aureus de susceptibilidad intermedia a la vancomicina). Dado que el aislamiento de cepas resistentes a la vancomicina y de susceptibilidad intermedia a la vancomicina es un fenomeno relativamente nuevo, hay pocos datos sobre su frecuencia en los hospitales y/o la comunidad. En alguna ocasion, tambien se ha extraldo de seres humanos SARV (S. aureus resistente a la vancomicina), con plena resistencia a la vancomicina y que porta un plasmido de resistencia probablemente adquirido de Enterococcus sp.
Estrategias para la prevention y el tratamiento de las infecciones por Staphylococcus
La aparicion de numerosos patogenos gram positivos que son resistentes a multiples antibioticos ha impulsado los esfuerzos de investigation dirigidos a desarrollar vacunas preventivas para proteger contra la enfermedad. Las vacunas estan disenadas para administrarse a los pacientes con el fin de generar una respuesta de memoria a largo plazo del sistema inmunologico, de manera que, si se encuentra el patogeno en el futuro, el sistema inmune lo pueda eliminar mas rapida y eficazmente. Hasta la fecha, no se cuenta con una vacuna ampliamente protectora contra patogenos gram positivos asociados con una serie de enfermedades humanas graves, en particular, con las enfermedades asociadas con infecciones estafilococicas. Las metodologlas de desarrollo de vacunas para la prevencion de infecciones estafilococicas incluyen las que informan del uso de componentes de la superficie microbiana que reconocen moleculas de la matriz de adhesion [MSCRAMMS (Nilsson et al. 1998. J Clin Invest 101:2640-9; Menzies et al. 2002. J Infect Dis 185:937-43; Fattom et al. 2004. Vaccine 22:880-7], polisacaridos de la superficie (McKenney et al. 2000; McKenney et al. 1999. Science 284:1523-7; Maira-Litran et al. 2002. Infect Immun 70:4433-40; Maira-Litran et al. 2004. Vaccine 45 22:872-9; Maira-Litran et al. 2005. Infect Immun 73:6752-62) y exoprotelnas mutadas (Lowell et al. 1996. Infect Immun 64:4686-93; Stiles et al. 2001. Infect Immun 69:2031-6; Gampfer et al. 2002. Vaccine 20:3675-84), como antlgenos en composiciones vacunales subunitarias, as! como una cepa avirulenta viva (Reinoso et al. 2002. Can J Vet Res 66:285-8) y varias metodologlas de vacunas de ADN (Ohwada et al. 1999. J Antimicrob Chemother 44:767-74); Brouillette et al. 2002. Vaccine 20:2348-57; Senna et al. 2003. Vaccine 21:2661-6). Aunque muchas de estas composiciones han mostrado algun grado de protection, han logrado poca proteccion cruzada contra diversas cepas estafilococicas y tampoco han logrado generar respuestas inmunes sustanciales en pacientes inmunocomprometidos, una importante poblacion de riesgo para las infecciones nosocomiales.
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Las enfermedades estafilococicas mas graves son las mediadas por las exotoxinas pirogenas superantigenicas mencionadas anteriormente (SPE) que estimulan de forma inespecifica los linfocitos T independientes de la presentacion de antigenos. Dichas enfermedades incluyen el sindrome de choque toxico, la enfermedad cutanea exfoliativa y, posiblemente, el sindrome de Kawasaki. Para estas enfermedades mediadas por SPE, los agentes inmunoterapeuticos que estimulan el sistema inmune durante una infeccion activa suelen ser mas eficaces que las vacunas, que normalmente se administran antes de la infeccion. La naturaleza abrumadora de la respuesta inmune a las SPE requiere una rapida reduccion de la actividad de la toxina como el primer objetivo de la terapia. Hasta la fecha, la neutralizacion de toxinas en la enfermedad mediada por S. aureus se ha llevado a cabo mas eficazmente mediante la administracion de inmunoglobulina humana intravenosa (IVIG), un preparado de anticuerpo humano concentrado, purificado, de varios miles de donantes humanos (Takei et al. 1993. J Clin Invest 91:602-7; Stohl y Elliot. 1996. Clin Immunol Immunopathol 79:122-33). La amplia distribucion de S. aureus, que coloniza aproximadamente el 30 % de los adultos humanos sanos, coincide con las altas tasas de exposicion para la mayoria de la poblacion, por lo que el nivel de anticuerpos anti-toxina anti-estafilococicos de IVIG suele bastar para neutralizar la toxina el tiempo suficiente para estabilizar la respuesta inmune hasta que la carga bacteriana se reduce con antibioticos (Schlievert, 2001. J Allergy Clin Immunol 108(4 Supl):S107-110). Los preparados de IVIG de multiples fabricantes han demostrado neutralizar la toxina en ensayos de proliferacion con celulas mononucleares de sangre periferica humanas, inhibir la diferenciacion de los linfocitos B impulsada por linfocitos T humanos inducidos por la toxina in vitro (Stohl y Elliot. 1996. Clin Immunol Immunopathol 79:122-33; Stohl y Elliott. 1995. J Immunol 155:1838-50; Stohl et al. 1994. J Immunol 153:117-27) y reducir la secrecion de IL-4 y iL-2 en PBMC estimuladas con enterotoxina estafilococica B (Takei et al. 1993. J Clin Invest 91:602-7; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42). La terapia con IVIG, con su capacidad demostrada para neutralizar la SPE, es ahora una terapia recomendada para el sindrome de Kawasaki y esta ganando terreno como metodo de tratamiento para el sindrome del choque toxico estafilococico (Schlievert 2001. J Allergy Clin Immunol 108(4 Supl):S107-110). Tambien se ha investigado el uso de IVIG como lavado de heridas inmunoprotector durante la cirugia en ratones (Poelstra et al. 2000. Tissue Eng 6(4):401-411). Aunque la IVIG convencional tiene utilidad para limitar el avance de alguna enfermedad mediada por SPE estafilococica, la seguridad, la eficacia y la consistencia de los preparados de IVIG humanos generados a partir de miles de donantes humanos no seleccionados sigue siendo controvertida (Baker et al. 1992. N Engl J Med 327:213-9; Miller et al. 2001. J Allergy Clin Immunol 108:S91-4; Sacher, 2001. J Allergy Clin Immunol 108:S139-46; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42). Ademas, el beneficio de IVIG en la prevencion de algunas infecciones estafilococicas es dudoso (Baker et al. 1992. N Engl J Med 327:213-9; Hill, H. R. 2000. J Pediatr 13147:595-7; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42). Con el fin de aumentar la eficacia de IVIG en el tratamiento de las infecciones estafilococicas en ciertas poblaciones de riesgo, se creo una IgG humana anti-estafilococica policlonal, seleccionada de donantes, derivada de plasma, con altos titulos de anticuerpo dirigido hacia el factor de aglutinacion A de MSCRAMMS estafilococico (ClfA) y la proteina de union a fibrinogeno G (SdrG), y se ensayo con exito en recien nacidos de muy bajo peso al nacer para prevenir la sepsis estafilococica (Vernachio et al. 2003. Antimicrob Agents Chemother 47:3400-6; Bloom et al. 2005. Pediatr Infect Dis J 24:858-866; Capparelli et al. 2005. Antimicrob Agents Chemother 49:4121-7). Tambien se esta desarrollando un anticuerpo monoclonal humanizado especifico hacia el factor de aglutinacion A de MSCRAMMS de S. aureus. Se selecciono el anticuerpo de un grupo de miles de anticuerpos anti-ClfA murinos por su capacidad para unirse a ClfA de una manera que inhibe la union de S. aureus a la fibronectina humana, y posteriormente se humanizo mediante la mutacion de restos especificos dirigidos para imitar el anticuerpo del subgrupo de la linea germinal humana homologa (Hall et al. 2003. Infect Immun 71:6864-70; Domanski et al. 2005. Infect Immun 73:5229-32). El anticuerpo especifico se esta disenando para su uso en combinacion con antibioticos para el tratamiento de la infeccion por S. aureus grave potencialmente mortal, aunque los estudios en animales tambien demostraron un efecto protector profilactico.
Sumario
La presente invencion proporciona una composicion obtenida mediante un proceso que comprende proporcionar un cultivo que comprende un Staphylococcus aureus, en el que el Staphylococcus aureus se ha adaptado al crecimiento en condiciones de bajo nivel de hierro mediante el subcultivo del Staphylococcus aureus en medio que contiene concentraciones crecientes de 2,2’-dipiridilo de 300 uM a 1.600 uM, y en el que el Staphylococcus aureus se cultiva en presencia de 2,2'-dipiridilo 1.600 uM; alterar el Staphylococcus aureus para producir una mezcla de celulas de Staphylococcus aureus rotas; disolver la mezcla para producir un preparado que contiene proteinas disueltas y no disueltas; y aislar las proteinas no disueltas, en el que el Staphylococcus aureus es la cepa ATCC 19636 de S. aureus. Tambien se desvelan composiciones que incluyen dos o mas polipeptidos aislados. Los dos polipeptidos aislados pueden tener un peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, una composicion puede incluir proteinas aisladas de 88 kDa y 55 kDa. En algunos aspectos, la composicion puede incluir polipeptidos aislados que tienen pesos moleculares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa y 33 kDa. El peso molecular se determina por electroforesis en un gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Los polipeptidos se pueden aislar a partir de un Staphylococcus aureus cuando se incuban en medios que incluyen un quelante del hierro, y no se pueden aislar cuando se cultivan en los medios sin el quelante del hierro. La composicion protege a un animal, tal como un raton o una vaca, o a un ser humano contra el desafio con una cepa de S. aureus, por ejemplo, la cepa ATCC 19636. La composicion puede incluir ademas un vehiculo farmaceuticamente aceptable, y puede incluir ademas un polipeptido aislado que tenga un peso molecular de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa, 40 kDa, o una
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combinacion de los mismos, y que se puede aislar de un S. aureus cuando se cultiva en el medio sin el quelante del hierro. En algunos aspectos, los polipeptidos de la composition se pueden aislar de la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
La presente invention tambien proporciona usos de las composiciones de la invention. En un aspecto, el uso es para el tratamiento de una infection en un sujeto, e incluye el uso de una cantidad eficaz de una composicion de la presente invencion en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener una infeccion causada por un Staphylococcus aureus. En otro aspecto, el uso es para el tratamiento de un slntoma en un sujeto, y este incluye el uso de una cantidad eficaz de una composicion de la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para tratar un sintoma en un sujeto que tiene una infeccion causada por un Staphylococcus aureus. El sujeto puede ser un mamlfero, tal como un ser humano, un caballo o una vaca.
La presente divulgation proporciona ademas metodos de uso de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo policlonal, que se une especlficamente a polipeptidos desvelados en el presente documento. En un aspecto, el metodo es para tratar una infeccion en un sujeto, e incluye la administration de una cantidad eficaz de una composicion a un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener una infeccion causada por un Staphylococcus sp., en el que la composicion incluye el anticuerpo que se une especlficamente a dos polipeptidos aislados de la presente divulgacion. En otro aspecto, el metodo es para tratar un slntoma en un sujeto, e incluye la administracion de una cantidad eficaz de una composicion a un sujeto que tiene una infeccion causada por un Staphylococcus sp., en el que la composicion incluye el anticuerpo que se une especlficamente a dos polipeptidos aislados de la presente divulgacion. El sujeto puede ser un mamlfero tal como un ser humano, un caballo o una vaca. El Staphylococcus sp. puede ser S. aureus.
La presente invencion tambien proporciona usos para reducir la colonization en un sujeto. En un aspecto, el uso incluye el uso de una cantidad eficaz de una composicion de la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o que esta en riesgo de tener una infeccion causada por un Staphylococcus aureus, en el que se reduce la colonizacion en un sujeto colonizado, en el que la composicion incluye el anticuerpo que se une especlficamente a polipeptidos aislados de la presente divulgacion.
La presente divulgacion proporciona un kit para la detection del anticuerpo que se une especlficamente a un polipeptido. El kit incluye, en recipientes separados, un polipeptido aislado de la presente divulgacion, y un reactivo que detecta un anticuerpo que se une especlficamente al polipeptido.
La presente divulgacion proporciona ademas una composicion que incluye dos polipeptidos aislados que tienen pesos moleculares seleccionados de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa y 33 kDa, en la que el peso molecular se determina por electroforesis en un gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Cada polipeptido de la composicion tiene un identificador genetico de masa de al menos un 80 % de similitud con un identificador genetico de masa de un polipeptido del mismo peso molecular expresado por la cepa ATCC 19636 de Staphylococcus aureus, en la que el polipeptido se puede aislar de un Staphylococcus aureus cuando se incuba en medio que comprende un quelante del hierro y no se puede aislar cuando se cultiva en medios sin el quelante del hierro. Por ejemplo, el polipeptido aislado con un peso molecular de 88 kDa tiene un identificador genetico de masa de al menos el 80 % de similitud con un identificador genetico de masa de un polipeptido de 88 kDa expresado por la cepa ATCC 19636 de Staphylococcus aureus, y el polipeptido aislado con un peso molecular de 55 kDa tiene una huella dactilar de masa de al menos un 80 % de similitud con un identificador genetico de masa de un polipeptido de 55 kDa expresado por la cepa ATCC 19636 de Staphylococcus aureus.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Perfil electroforetico de las protelnas de diferentes cepas de Staphylococcus aureus derivadas de diferentes especies cultivadas con y sin hierro (carriles marcados con Fe++ y Dp, respectivamente).
Figura 2. Diferencia en la mortalidad entre los ratones vacunados y los no vacunados tras el desaflo homologo y heterologo con Staphylococcus aureus.
Figura 3. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia tras la vacunacion y el desaflo homologo con la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
Figura 4. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia tras la vacunacion y el desaflo heterologo con la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
Figura 5. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia tras la inmunizacion pasiva y el desaflo homologo con la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
Figura 6. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia tras la inmunizacion pasiva y el desaflo heterologo con la cepa 1477 de S. aureus.
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Descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la invencion
La presente invencion proporciona composiciones segun lo definido en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, "polipeptido" se refiere a un pollmero de aminoacidos unidos por enlaces peptldicos. As! pues, por ejemplo, los terminos peptido, oligopeptido, protelna, y enzima se incluyen dentro de la definicion de polipeptido. Este termino tambien incluye modificaciones posteriores a la expresion del polipeptido, tales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. El termino polipeptido no connota una longitud especlfica de un pollmero de aminoacidos. Un polipeptido se puede aislar directamente de una fuente natural, o se puede preparar con ayuda de tecnicas qulmicas, enzimaticas o recombinantes. En el caso de un polipeptido natural, dicho polipeptido normalmente es aislado. Un polipeptido "aislado" es aquel que ha sido retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polipeptido aislado es un polipeptido que ha sido retirado del citoplasma o de la membrana de una celula, y muchos de los polipeptidos, acidos nucleicos y otras materias celulares de su entorno natural ya no estan presentes. Un polipeptido “aislable” es un polipeptido que se ha podido aislar de una determinada fuente. Un polipeptido "purificado" es aquel que esta al menos un 60 % exento, preferentemente al menos un 75 % exento, y lo mas preferentemente al menos un 90 % exento de otros componentes con los que se asocia de manera natural. Los polipeptidos que se producen fuera del organismo en el que se dan de manera natural, por ejemplo, por medios recombinantes o qulmicos, se consideran aislados y purificados por definicion, ya que nunca estuvieron presentes en un entorno natural. Como se usa en el presente documento, un "fragmento de polipeptido" se refiere a una porcion de un polipeptido que resulta de la digestion de un polipeptido con una proteasa. A menos que se especifique de otro modo, "un", “una” "el", “la” y "al menos un/a" se usan indistintamente, y significan uno o mas de uno. El termino "comprende" y sus variantes no tienen un significado llmite en que estos terminos aparecen en la descripcion y reivindicaciones.
Un polipeptido de la presente divulgacion puede caracterizarse por el peso molecular, el identificador genetico de masa o una combination de los mismos. El peso molecular de un polipeptido, normalmente expresado en kilodalton (kDa), se puede determinar usando metodos de rutina, incluyendo, por ejemplo, filtration en gel, electroforesis en gel que incluye la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS) y poliacrilamida (PAGE), electroforesis capilar, espectrometrla de masas y cromatografla de llquidos, incluyendo HPLC. Preferentemente, el peso molecular se determina mediante la resolution de un polipeptido usando un gel de SDS-poliacrilamida que tiene un gel de apilamiento del aproximadamente 4 % y un gel de resolucion del aproximadamente 10 % en condiciones reductoras y desnaturalizantes. A menos que se indique lo contrario, el peso molecular se refiere al peso molecular determinado por SDS-PAGE. Como se usa en el presente documento, un "identificador genetico de masa" se refiere a una poblacion de fragmentos polipeptldicos obtenidos a partir de un polipeptido tras la digestion con una proteasa. Por lo general, los fragmentos polipeptldicos resultantes de una digestion se analizan usando un metodo de espectrometrla de masas. Cada fragmento polipeptldico se caracteriza por una masa, o por una proportion de la masa (m) con respecto a la carga (z), que se conoce como "proporcion de m/z" o "valor de m/z". Los metodos de generation de un identificador genetico de masa de un polipeptido son habituales. En el Ejemplo 13, se desvela un ejemplo de dicho metodo.
Los polipeptidos de la presente divulgacion pueden ser polipeptidos regulados por el nivel de metal. Como se usa en el presente documento, un "polipeptido regulado por el nivel de metal" es un polipeptido que es expresado por un microbio a un nivel superior cuando el microbio se cultiva en condiciones de bajo nivel de metal en comparacion con el crecimiento del mismo microbio en condiciones de alto nivel de metal. Las condiciones de bajo y de alto nivel de metal se describen en el presente documento. Por ejemplo, una clase de polipeptido regulado por el nivel de metal producido por Staphylococcus sp. no se expresa a niveles detectables durante el crecimiento del microbio en condiciones de alto nivel de metal, pero si se expresa a niveles detectables durante el crecimiento en condiciones de bajo nivel de metal. Los ejemplos de dichos polipeptidos regulados por el nivel de metal que se pueden aislar de S. aureus tras su crecimiento en condiciones de bajo nivel de hierro tienen pesos moleculares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa y 33 kDa. Los ejemplos de dichos polipeptidos regulados por el nivel de metal que se pueden aislar de S. aureus tras el crecimiento en condiciones de bajo nivel de cinc y de bajo nivel de cobre tienen pesos moleculares de 115 kDa, 88 kDa, 80 kDa, 71 kDa, 69 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 29, kDa y 27 kDa.
La presente divulgacion tambien incluye polipeptidos que no estan regulados por el nivel de metal. Dichos polipeptidos se expresan en presencia de un ion metalico, tal como cloruro ferrico, y tambien se expresan cuando se cultivan en condiciones de bajo nivel de hierro. Los ejemplos de dichos polipeptidos que se pueden aislar de S. aureus tienen pesos moleculares de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa.
Es posible determinar si un polipeptido es un polipeptido regulado por el nivel de metal o no mediante metodos utiles para la comparacion de la presencia de polipeptidos, incluyendo, por ejemplo, filtracion en gel, electroforesis en gel, incluyendo la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), electroforesis capilar, espectrometrla de masas y cromatografla de llquidos que incluye la HPLC. Se cultivan los cultivos separados de un microbio en condiciones de alto nivel de metal y en condiciones de bajo nivel de metal, se alslan polipeptidos de la presente invencion como se describe en el presente documento, y los polipeptidos presentes en cada cultivo se resuelven y se comparan. Por lo general, se usa una cantidad igual de polipeptidos de cada cultivo. Preferentemente, los polipeptidos se resuelven usando un gel de SDS-poliacrilamida que tiene un gel de apilamiento
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Los polipeptidos de la presente divulgation pueden tener actividad inmunogenica. "Actividad inmunogenica" se refiere a la capacidad de un polipeptido para generar una respuesta inmunologica en un animal. Una respuesta inmunologica hacia un polipeptido es el desarrollo, en un animal, de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos hacia el polipeptido. Por lo general, una respuesta inmunologica incluye, pero sin limitation, uno o mas de los siguientes efectos: la production de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, linfocitos T supresores, y/o linfocitos T citotoxicos, dirigidos a un epltopo o epltopos del polipeptido. "Epltopo" se refiere al sitio en un antlgeno al que los linfocitos B y/o linfocitos T especlficos responden de modo que se produce el anticuerpo. La actividad inmunogenica puede ser protectora. "Actividad inmunogenica protectora" se refiere a la capacidad de un polipeptido para generar una respuesta inmunologica en un animal que prevenga o inhiba la infection por Staphylococcus sp., por ejemplo, S. aureus. Se puede determinar si un polipeptido tiene actividad inmunogenica protectora mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 5, 9 o 12. Por ejemplo, un polipeptido de la presente divulgacion, o una combination de polipeptidos de la presente divulgacion, protege un roedor tal como un raton contra el desaflo a un Staphylococcus sp. Un polipeptido de la presente divulgacion puede tener actividad seroactiva. "Actividad seroactiva" se refiere a la capacidad de un polipeptido candidato para reaccionar con anticuerpos presentes en el suero de convaleciente de un animal infectado con un Staphylococcus sp., por ejemplo, S. aureus. En algunos aspectos, el suero de convaleciente puede ser de un animal infectado con el aislado de ATCC 19636, la cepa SAAV1, la cepa 2176 o la cepa 1477. Los polipeptidos de la presente divulgacion pueden tener actividad inmunorreguladora. "Actividad inmunorreguladora" se refiere a la capacidad de un polipeptido para actuar de una manera inespeclfica para mejorar una respuesta inmune hacia un determinado antlgeno. Los metodos de determination de si un polipeptido tiene actividad inmunorreguladora son conocidos en la tecnica.
Un polipeptido de la presente divulgacion puede tener las caracterlsticas de un polipeptido expresado por un microbio de referencia. Las caracterlsticas pueden incluir tanto el peso molecular como el identificador genetico de masa. El microbio de referencia puede ser un gram positivo, preferentemente un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus. Los ejemplos preferidos de cepa se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1. Cepas bacterianas
- Celula bacteriana
- Designation de laboratorio
- S. aureus
- Aislado ATCC 19636
- S. aureus
- cepa SAAV1
- S. aureus
- cepa 1477
- S. aureus
- cepa 2176
Cuando el microbio de referencia es el aislado ATCC 19636 de S. aureus, un polipeptido candidato se considera que es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa 35 kDa o 33 kDa, y tiene un identificador genetico de masa que es similar al identificador genetico de masa de un polipeptido regulado por el nivel de metal expresado por un microbio de referencia y que tiene un peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa o 33 kDa, respectivamente. Preferentemente, dichos polipeptidos son regulados por el nivel de metal. Por ejemplo, un polipeptido candidato es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular de 88 kDa y tiene un identificador genetico de masa similar al identificador genetico de masa de un polipeptido regulado por el nivel de metal de 88 kDa producido por la cepa de referencia de aislado ATCC 19636 de S. aureus.
Cuando el microbio de referencia es el aislado ATCC SAAV1 de S. aureus, un polipeptido candidato se considera que es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa , 36 kDa, 35 kDa o 33 kDa, y tiene un identificador genetico de masa que es similar al identificador genetico de masa de un polipeptido expresado por un microbio de referencia y que tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa o 33 kDa, respectivamente. Preferentemente, dichos polipeptidos estan regulados por el nivel de metal. Por ejemplo, un polipeptido candidato es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular de 88 kDa y tiene un identificador genetico de masa similar al identificador genetico de masa de un polipeptido regulado por el nivel de
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metal de 88 kDa producido por la cepa de referenda de aislado SAAV1 de S. aureus.
Cuando el microbio de referencia es la cepa 2176 de S. aureus, un polipeptido candidato se considera que es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa o 32 kDa, y tiene un identificador genetico de masa que es similar al identificador genetico de masa de un polipeptido expresado por un microbio de referencia y que tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa o 32 kDa, respectivamente. Preferentemente, dichos polipeptidos son regulados por el nivel de metal. Por ejemplo, un polipeptido candidato es un polipeptido de la presente divulaacion si tiene un peso molecular de 88 kDa y tiene un
identificador genetico de masa similar al identificador genetico de masa de un polipeptido regulado por el nivel de
metal de 88 kDa producido por la cepa de referencia de aislado 2176 de S. aureus.
Cuando el microbio de referencia es la cepa 1477 de S. aureus, un polipeptido candidato se considera que es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa o 32 kDa, y tiene un identificador genetico de masa que es similar al identificador genetico de masa de un polipeptido expresado por un microbio de referencia y que tiene un peso molecular (determinado por SDS-PAGE) de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa o 32 kDa, respectivamente. Preferentemente, dichos polipeptidos son regulados por el nivel de metal. Por ejemplo, un polipeptido candidato es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular de 88 kDa y tiene un
identificador genetico de masa similar al identificador genetico de masa de un polipeptido regulado por el nivel de
metal de 88 kDa producido por la cepa de referencia de aislado 1477 de S. aureus.
Los polipeptidos expresados por un microbio de referencia y mencionados anteriormente en peso molecular se pueden obtener mediante el crecimiento del microbio de referencia en condiciones de bajo nivel de metal y el posterior aislamiento de un polipeptido mediante los procesos desvelados en el presente documento. Un polipeptido candidato es aislable de un microbio, preferentemente un microbio gram positivo, mas preferentemente, un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus.
Otros microbios gram positivos a partir de los que se pueden aislar polipeptidos incluyen Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp. y Micrococcus sp., Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp. Un polipeptido candidato tambien se puede producir usando tecnicas recombinantes, enzimaticas o qulmicas.
Un polipeptido candidato se puede evaluar mediante el analisis de espectrometrla de masas para determinar si el polipeptido candidato tiene un identificador genetico de masa similar a uno de los polipeptidos expresados por un microbio de referencia y mencionado anteriormente en peso molecular. Por lo general, el polipeptido candidato se alsla, por ejemplo, mediante la resolucion del polipeptido candidato por electroforesis en gel y la escision de la parte del gel que contiene el polipeptido candidato. Se puede usar cualquier metodo de electroforesis en gel que separa los polipeptidos basandose en diferentes caracterlsticas, incluyendo la electroforesis en gel monodimensional o bidimensional, as! como la separation cromatografica de llquidos basada en, por ejemplo, en la hidrofobicidad, pl o tamano. El polipeptido candidato se fragmenta, por ejemplo, mediante la digestion con una proteasa. Preferentemente, la proteasa escinde el enlace peptldico en el lado carboxi-terminal del aminoacido lisina y el aminoacido arginina, excepto cuando el aminoacido que sigue a la lisina o a la arginina es una prolina. Un ejemplo de dicha proteasa es la tripsina. Los metodos para la digestion de un polipeptido con tripsina son habituales y conocidos en la tecnica. En el Ejemplo 13, se desvela un ejemplo de dicho metodo.
Los metodos de analisis de espectrometrla de masas de polipeptidos son habituales y conocidos en la tecnica, e incluyen, pero sin limitation, espectrometrla de masas de desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). Por lo general, se mezcla una mezcla que contiene los fragmentos polipeptldicos obtenidos a partir de un polipeptido candidato con una matriz que funciona para transformar la energla del laser en la muestra y producir fragmentos polipeptldicos ionizados, preferentemente monoisotopicos. Los ejemplos de matrices que se pueden usar incluyen, por ejemplo, acido sinaplnico o acido ciano- 4-hidroxicinamico. En el Ejemplo 13, se describe un ejemplo de un metodo para el analisis de polipeptidos mediante MALDI-TOF MS. Los fragmentos polipeptldicos ionizados se separan de acuerdo con su proportion de m/z, y se detectan para producir un espectro de la proporcion de m/z frente a la intensidad. El espectro incluye valores de m/z que representan los fragmentos polipeptldicos derivados del polipeptido candidato. Para cualquier polipeptido dado, la cantidad de cada fragmento polipeptldico resultante de una digestion con tripsina debe ser equimolar. Sin embargo, se sabe que la digestion con tripsina no es siempre un 100 % eficaz, por ejemplo, algunos sitios se escinden de manera mas eficaz. Por lo tanto, cuando se usa MALDI-TOF MS para determinar los valores de m/z, la intensidad de cada valor de m/z normalmente no es identica. En general, un espectro tiene un nivel de fondo de ruido presente en la mayor parte del eje X (es decir, el eje que tiene los valores de las proporciones de m/z). Este nivel de fondo de ruido varla dependiendo de las condiciones de procesamiento y de la maquina usada, y se identifica facilmente examinando visualmente el espectro. En general, se considera que un valor de m/z representa un fragmento polipeptldico cuando la intensidad es al menos 2 veces superior, al menos 3 veces superior o al menos 4 veces superior al nivel de fondo de ruido. El espectro normalmente incluye otros valores de m/z que son aberraciones producidas como resultado, por ejemplo, de una digestion incompleta, una digestion excesiva, otros polipeptidos que pueden estar presentes en la mezcla o la proteasa usada para digerir el polipeptido que incluye los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
valores de m/z resultantes de la autolisis de la proteasa. En la tecnica, se reconoce que dicho metodo de digestion de un polipeptido con una proteasa da lugar a un identificador genetico de masa de gran especificidad que se puede usar para caracterizar con precision el polipeptido y distinguirlo de otros polipeptidos.
En este aspecto de la divulgacion, cuando se analiza un polipeptido candidato mediante espectroscopia de masas, preferentemente tanto el polipeptido candidato como el polipeptido del microbio de referencia se preparan y se analizan juntos, reduciendo de esta manera las posibles aberraciones resultantes de diferencias en las condiciones de tratamiento y de procesamiento de las muestras. Preferentemente, todos los reactivos usados para preparar y analizar los dos polipeptidos son los mismos. Por ejemplo, el polipeptido del microbio de referencia y el polipeptido candidato se alslan esencialmente en las mismas condiciones, se fragmentan esencialmente en las mismas condiciones y se analizan mediante MALDI-TOF MS en la misma maquina, esencialmente en las mismas condiciones. Un identificador genetico de masa de un polipeptido candidato se considera que es similar al identificador genetico de masa de un polipeptido de un microbio de referencia cuando al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o esencialmente la totalidad de los valores de m/z presentes en el espectro del polipeptido de microbio de referencia y por encima del nivel de fondo de ruido tambien estan presentes en el espectro del polipeptido candidato.
En otro aspecto, un polipeptido se considera que es un polipeptido de la presente divulgacion si tiene un peso molecular de un polipeptido de referencia descrito en la Tabla 2, 3, 4 o 5 y tiene un identificador genetico de masa que incluye la poblacion de fragmentos polipeptldicos del polipeptido de referencia que se enumeran en la Tabla 2, 3, 4 o 5. Por ejemplo, un polipeptido de la presente divulgacion incluye un polipeptido de 88 kDa y un identificador genetico de masa que incluye fragmentos polipeptldicos que tienen masas de HVDVR, YSYER, IIGDYRR, IFTDYRK, ELKELGQK, YAQVKPIR, QMQFFGAR, SMQPFGGIR, VSGYAVNFIK, NHATAWQGFK, LWEQVMQLSK, SLGKEPEDQNR, DGISNTFSIVPK, AGVITGLPDAYGR, TSTFLDIYAER, SMQPFGGIRMAK, THNQGVFDAYSR, KAGVITGLPDAYGR, TLLYAINGGKDEK, IEMALHDTEIVR, AGEPFAPGANPMHGR, VALYGVDFLMEEK, KTHNQGVFDAYSR, YGFDLSRPAENFK, TSSIQYENDDIMR, KAGEPFAPGANPMHGR, RVALYGVDFLMEEK, LWEQVMQLSKEER, MLETNkNHATAWQGFK, MHDFNTMSTEMSEDVIR, YGNNDDRVDDIAVDLVER, ETLIDAMEHPEEYPQLTIR, YAQVKPIRNEEGLVVDFEIEGDFPK. El identificador genetico de masa de un polipeptido candidato puede determinarse mediante un metodo de espectrometrla de masas, por ejemplo, mediante MALDI-TOF MS. El identificador genetico de masa de un polipeptido candidato, en general, tendra fragmentos polipeptldicos adicionales y, por lo tanto, valores de m/z adicionales distintos de los enumerados para un polipeptido en la Tabla 2, 3, 4 o 5. Preferentemente, cuando el polipeptido candidato se compara con un polipeptido de la Tabla
2, 3, 4 o 5, el polipeptido candidato es aislable de un microbio, preferentemente un microbio gram positivo, mas preferentemente, un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus. Otros microbios gram positivos incluyen Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp., Listeria sp., Micrococcus sp. y Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp. Un polipeptido candidato se puede obtener mediante el crecimiento de un microbio en condiciones de bajo nivel de metal y el posterior aislamiento de un polipeptido mediante los procesos descritos en el presente documento.
Es bien conocido en la tecnica que se pueden introducir accidentalmente modificaciones de aminoacidos durante el tratamiento de las muestras, tal como la oxidacion y la formacion de derivados de carbamidometilo. Ademas, estos tipos de modificaciones alteran el valor de m/z de un fragmento polipeptldico. Por ejemplo, si un fragmento polipeptldico contiene una metionina que se oxida, el valor de m/z se aumentara en 16 con respecto al mismo fragmento que no contiene la metionina oxidada. Por consiguiente, estos fragmentos polipeptldicos de las Tablas 2,
3, 4 o 5 que tienen la anotacion "oxidacion (M)" tienen un valor de m/z aumentado en 16 con respecto al mismo fragmento que no contiene la metionina oxidada. Se entiende que los fragmentos polipeptldicos de la Tabla 2, 3, 4 o 5 se pueden modificar durante el tratamiento de las muestras.
Tabla 2. Caracteristicas de los polipeptidos obtenidos de aislado ATCC 19636 de S. aureus
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- P23
- 88 625,4 HVDVR
- 717,3 YSYER
- 892,5 IIGDYRR
- 942,5 IFTDYRK
- 944,5 ELKELGQK
- 974,6 YAQVKPIR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 984,5 QMQFFGAR
- 992,5 SMQPFGGIR
- 1097,6 VSGYAVNFIK
- 1159,5 NHATAWQGFK
- 1261,7 LWEQVMQLSK
- 1272,7 SLGKEPEDQNR
- 1277,7 DGISNTFSIVPK
- 1289,7 AGVITGLPDAYGR
- 1315,7 TSTFLDIYAER
- 1322,7 SMQPFGGIRMAK
- 1394,7 THNQGVFDAYSR
- 1417,8 KAGVITGLPDAYGR
- 1421,8 TLLYAINGGKDEK
- 1426,8 IEMALHDTEIVR
- 1508,8 AGEPFAPGANPMHGR
- 1513,9 VALYGVDFLMEEK
- 1522,8 KTHNQGVFDAYSR
- 1543,9 YGFDLSRPAENFK
- 1571,8 TSSIQYENDDIMR
- 1636,9 KAGEPFAPGANPMHGR
- 1670,0 RVALYGVDFLMEEK
- 1676,0 LWEQVMQLSKEER
- 1876,2 MLETNKNHATAWQGFK
- 2043,1 MHDFNTMSTEMSEDVIR
- 2078,2 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2285,5 ETLIDAMEHPEEYPQLTIR
- 2892,9 YAQVKPIRNEEGLVVDFEIEGDFPK
- P25
- 55 783,6 LHSWLK
- 911,7 KLHSWLK
- 937,6 TYTFHLR
- 996,6 KFDGTGPFK
- 1025,6 QAIGHMVNR
- 1063,6 KWDVSEDGK
- 1185,6 IYNSIDDAFK
- 1277,6 NLEMAMYYDK
- 1324,7 ENKQLTYTTVK
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 1346,7 AESLLDEAGWKK
- 1381,8 TVRQAIGHMVNR
- 1394,8 TYTFHLRDDVK
- 1400,7 1400,7 KGETNFAFTDDR
- 1419,7 FHDGTPFDADAVK
- 1422,8 NVTDINFDMPTR
- 1428,8 DKIYNSIDDAFK
- 1483,8 EQAEYLQAEFKK
- 1509,8 VMPAGETAFLSMKK
- 1547,9 FHDGTPFDADAVKK
- 1550,9 NVTDINFDMPTRK
- 1559,9 LNINGETSDKIAER
- 1788,1 EILDGQEKPATQLFAK
- 1930,1 GSSSQKEQAEYLQAEFK
- 1946,0 DESADFNKNDQYWGEK
- 2100,4 IAKEILDGQEKPATQLFAK
- 2239,3 VSFTQSQYELPFNEMQYK
- 2493,5 EAY QPALAELAMPRPYVFVSPK + Oxidation (M)
- 2900,6 DIGDMNPHVYGGSMSAESMIYEPLVR + 2 Oxidation (M)
- 2916,6 DIGDMNPHVYGGSMSAESMIYEPLVR + 3 Oxidation (M)
- P26
- 38 993,6 IVYVGADEK
- 996,7 996,7 QALNNPVLK
- 1237,7 ETVKIENNYK
- 1272,7 ENPDVILAMDR
- 1502,0 IAATKPEVIFISGR
- 1507,9 NAWLDYGALDVMK
- 1523,9 ALPNFLESFKDDK
- 1559,9 LWYFAAGSTTTTIK
- 1716,0 FGGLVYDTLGFNAVDK
- 1737,0 IVYVGADEKNLIGSMK
- 1844,1 FGGLVYDTLGFNAVDKK
- 1929,1 GRFGGLVYDTLGFNAVDK
- 1998,2 TVMYLLVNEGELSTFGPK
- 2234,4 EVNFDKIAATKPEVIFISGR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 3143,8 VSNSNHGQNVSNEYVNKENPDVILAMDR
- P27
- 37 699,5 FEYIK
- 729,4 DAWPLK
- 792,5 ASVVNFR
- 852,4 VYDQLSK
- 987,5 HAMGTTEIK
- 1008,5 LIDDLYEK
- 1020,5 YKDAWPLK
- 1074,5 EKEAEDLLK
- 1083,6 LKPDLIVASK
- 1169,5 FEYIKNDLK
- 1182,5 KTESEWTSSK
- 1184,5 YDDKVAAFQK
- 1223,5 NEKVYDQLSK
- 1278,6 IAPTVSTDTVFK
- 1497,6 TESEWTSSKEWK
- 1502,7 DAW PLKASVVNFR
- 1558,8 QVDNGKDIIQLTSK
- 1605,8 LIDDLYEKLNIEK
- 1623,8 IVGQEPAPNLEEISK
- 1712,8 ESIPLMNADHIFVVK
- 1800,9 IYAGGYAGEILNDLGFK
- 1957,0 IYAGGYAGEILNDLGFKR
- 2252,0 NNQVSDDLDEITWNLAGGYK
- 3383,9 RVVTLYQGATDVAVSLGVKPVGAVESWTQKPK
- P28
- 36 646,4 DVWAR
- 725,5 IIKPVR
- 1068,4 IGDYTSVGTR
- 1185,5 KQPNLEEISK
- 1327,6 LKPDLIIADSSR
- 1343,6 VDIVDRDVWAR
- 2080,9 GPYLQLDTEHLADLNPER
- 2438,1 AGLLAHPNYSYVGQFLNELGFK
- 2789,4 IVVLEYSFADALAALDVKPVGIADDGK
- P29
- 35 760,5 AGWAEVK
- 1012,6 TVDIPKDPK
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 1107,6 KDWEETTAK
- 1204,7 VAPTVVVDYNK
- 1238,6 YLEQQEMLGK
- 1244,6 LYTYGDNWGR
- 1259,7 IAVVAPTYAGGLK
- 1281,7 GGEVLYQAFGLK
- 1516,8 AGWAEVKQEEIEK
- 1683,9 LGANIVAVNQQVDQSK
- 1877,1 EKPDLIIVYSTDKDIK
- 1884,0 AIGQDATVSLFDEFDKK
- 2227,1 VDAGTYWYNDPYTLDFMR
- 2781,4 YAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWK
- P30
- 33 834,5 QAIEFVK
- 864,5 YIAQLEK
- 946,5 QGTPEQMR
- 962,5 QAIEFVKK
- 976,5 DKFNDIPK
- 1054,5 AMITSEGAFK
- 1202,5 SNIETVHGSMK
- 1268,6 HLLVETSVDKK
- 1443,6 DIFGEVYTDSIGK
- 1450,7 TIQQTFIDNDKK
- 1454,7 VVTTNSILYDMAK
- 1571,7 KDIFGEVYTDSIGK
- 1593,7 QDPHAWLSLDNGIK
- 1818,9 DVKPIYLNGEEGNKDK
- 1836,9 DKQDPHAWLSLDNGIK
- 1911,9 QYGITPGYIWEINTEK
- 2582,3 LTDADVILYNGLNLETGNGWFEK
- 2710,2 KLTDADVILYNGLNLETGNGWFEK
- 2942,4 NVGGDNVDIHSIVPVGQDPHEYEVKPK
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE. 2. El valor de m/z de un fragmento polipeptldico se puede convertir en masa restando 1 al valor de m/z. Cada masa incluye un intervalo de mas o menos 300 partes por millon (ppm), o de mas o menos 1 Da.
Tabla 3. Caracteristicas de los polipeptidos obtenidos del aislado SAAV1 de S. aureus
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento poli peptfdico
- P33A
- 55 783,4 LHSWLK
- 911,5 KLHSWLK
- 937,5 TYTFHLR
- 996,5 KFDGTGPFK
- 1025,5 QAIGHMVNR
- 1039,4 NDQYWGEK
- 1178,5 GTDSLDKDSLK
- 1185,5 IYNSIDDAFK
- 1222,6 DKYTVELNLK
- 1229,5 ISTLIDNVKVK
- 1346,6 AESLLDEAGWKK
- 1355,5 EQAEYLQAEFK
- 1381,6 VMPAGETAFLSMK
- 1400,5 KGETNFAFTDDR
- 1419,6 FHDGTPFDADAVK
- 1422,6 NVTDINFDMPTR
- 1483,6 EQAEYLQAEFKK
- 1547,7 FHDGTPFDADAVKK
- 1550,6 NVTDINFDMPTRK
- 1559,7 LNINGETSDKIAER
- 1787,9 EILDGQEKPATQLFAK
- 1945,8 DESADFNKNDQYWGEK
- 2239,0 VSFTQSQYELPFNEMQYK
- 2354,1 QIDDEGIFIPISHGSMTWAPK
- 2868,1 DIGDMNPHVYGGSMSAESMIYEPLVR
- P33B
- 55 895,4 FPYAANGR
- 904,5 ALLHASHR
- 1045,5 EEGLAIKASK
- 1384,5 GEAYFVDNNSLR
- 1435,7 TIEADYVLVTVGR
- 1669,8 RPNTDELGLEELGVK
- 1841,0 NAIIATGSRPIEIPNFK
- 2179,2 TSISNIYAIGDIVPGLPLAHK
- 2546,2 FVEAQHSENLGVIAESVSLNFQK
- 2587,3 VVGDFPIETDTIVIGAGPGGYVAAIR
- P35
- 37 699,4 FEYIK
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 729,4 DAWPLK
- 792,4 ASVVNFR
- 852,4 VYDQLSK
- 1008,4 LIDDLYEK
- 1020,4 YKDAWPLK
- 1074,4 EKEAEDLLK
- 1083,5 LKPDLIVASK
- 1169,5 FEYIKNDLK
- 1182,4 KTESEWTSSK
- 1184,4 YDDKVAAFQK
- 1278,5 IAPTVSTDTVFK
- 1558,7 QVDNGKDIIQLTSK
- 1623,7 IVGQEPAPNLEEISK
- 1712,7 ESIPLMNADHIFVVK
- 1800,7 IYAGGYAGEILNDLGFK
- 1956,8 IYAGGYAGEILNDLGFKR
- 2251,9 NNQVSDDLDEITWNLAGGYK
- 3227,5 VVTLYQGATDVAVSLGVKPVGAVESWTQKPK
- P38
- 33 864,5 YIAQLEK
- 946,4 QGTPEQMR
- 976,5 DKFNDIPK
- 1054,5 AMITSEGAFK
- 1146,5 FNDIPKEQR
- 1268,6 HLLVETSVDKK
- 1322,5 TIQQTFIDNDK
- 1443,6 DIFGEVYTDSIGK
- 1450,6 TIQQTFIDNDKK
- 1454,6 VVTTN SILYDMAK
- 1593,7 QDPHAWLSLDNGIK
- 1818,9 DVKPIYLNGEEGNKDK
- 1836,8 DKQDPHAWLSLDNGIK
- 1911,9 QYGITPGYIWEINTEK
- 2942,4 NVGGDNVDIHSIVPVGQDPHEYEVKPK
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE. 2. El valor de m/z de un fragmento polipeptldico se puede convertir en masa restando 1 al valor de m/z. Cada masa incluye un intervalo de mas o menos 300 partes por millon (ppm), o de mas o menos 1 Da.
Tabla 4. Caracteristicas de los polipeptidos obtenidos del aislado 2176 de S. aureus
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- P478
- 88 736,35 IIGDYR
- 814,49 IFTDYR
- 942,42 IFTDYRK
- 945,36 TGNTPDGRK
- 974,40 YAQVKPIR
- 984,27 QMQFFGAR
- 992,41 SMQPFGGIR
- 1087,31 EQQLDVISR
- 1097,31 VSGYAVNFIK
- 1159,37 NHATAWQGFK
- 1261,37 LWEQVMQLSK
- 1289,46 AGVITGLPDAYGR
- 1315,42 TSTFLDIYAER
- 1322,39 LREELSEQYR
- 1394,37 THNQGVFDAYSR
- 1417,52 KAGVITGLPDAYGR
- 1426,36 IEMALHDTEIVR
- 1487,39 NHATAWQGFKNGR
- 1508,42 AGEPFAPGANPMHGR
- 1513,52 VALYGVDFLMEEK
- 1543,43 YGFDLSRPAENFK
- 1571,50 TSSIQYENDDIMR
- 1636,56 KAGEPFAPGANPMHGR
- 1859,80 DLETIVGVQTEKPFKR
- 1876,77 TMATGIAGLSVAADSLSAIK
- 2042,57 MHDFNTMSTEMSEDVIR
- 2077,68 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2158,88 AGVITESEVQEIIDHFIMK
- 2284,90 ETLIDAMEHPEEYPQLTIR
- 2575,08 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- 2628,01 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- 2756,06 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFKK
- 3262,33 VASTITSHDAGYLDKDLETIVGVQTEKPFK
- P479
- 80 625,27 HVDVR
- 736,26 IIGDYR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 814,22 IFTDYR
- 942,27 IFTDYRK
- 974,26 YAQVKPIR
- 984,18 QMQFFGAR
- 992,23 SMQPFGGIR
- 1087,16 EQQLDVISR
- 1097,24 VSGYAVNFIK
- 1159,12 NHATAWQGFK
- 1243,14 VDDIAVDLVER
- 1261,22 LWEQVMQLSK
- 1272,24 SLGKEPEDQNR
- 1277,18 DGISNTFSIVPK
- 1289,21 AGVITGLPDAYGR
- 1315,19 TSTFLDIYAER
- 1322,21 LREELSEQYR
- 1394,16 THNQGVFDAYSR
- 1417,32 KAGVITGLPDAYGR
- 1426,23 IEMALHDTEIVR
- 1487,19 NHATAWQGFKNGR
- 1508,25 AGEPFAPGANPMHGR
- 1513,21 VALYGVDFLMEEK
- 1522,25 KTHNQGVFDAYSR
- 1543,26 YGFDLSRPAENFK
- 1571,23 TSSIQYENDDIMR
- 1636,29 KAGEPFAPGANPMHGR
- 1703,43 DLETIVGVQTEKPFK
- 1751,45 EAVQWLYLAYLAAIK
- 1859,53 DLETIVGVQTEKPFKR
- 1876,50 TMATGIAGLSVAADSLSAIK
- 1936,37 NEEGLVVDFEIEGDFPK
- 2042,43 MHDFNTMSTEMSEDVIR
- 2077,45 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2158,57 AGVITESEVQEIIDHFIMK
- 2284,61 ETLIDAMEHPEEYPQLTIR
- 2574,77 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- 2627,61 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 2755,70 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFKK
- 2907,65 EFIQLNYTLYEGNDSFLAG PTEATSK
- 3261,91 VASTITSHDAGYLDKDLETIVGVQTEKPFK
- 3421,02 TPDYNELFSGDPTWVTESIGGVGIDGRPLVTK
- P480
- 65 625,35 HVDVR
- 717,38 YSYER
- 733,42 LPDNFK
- 736,44 IIGDYR
- 814,33 IFTDYR
- 853,31 YGNNDDR
- 942,33 IFTDYRK
- 944,39 ELKELGQK
- 974,52 YAQVKPIR
- 984,36 QMQFFGAR
- 992,44 SMQPFGGIR
- 1049,44 TLLYAINGGK
- 1087,43 EQQLDVISR
- 1097,51 VSGYAVNFIK
- 1159,52 NHATAWQGFK
- 1289,53 AGVITGLPDAYGR
- 1315,51 TSTFLDIYAER
- 1322,46 LREELSEQYR
- 1394,50 THNQGVFDAYSR
- 1417,65 KAGVITGLPDAYGR
- 1442,56 IEMALHDTEIVR + Oxidation (M)
- 1467,60 VSGYAVNFIKLTR
- 1522,61 KTHNQGVFDAYSR
- 1524,55 AGEPFAPGANPMHGR + Oxidation (M)
- 1529,64 VALYGVDFLMEEK + Oxidation (M)
- 1543,62 YGFDLSRPAENFK
- 1652,68 KAGEPFAPGANPMHGR + Oxidation (M)
- 1671,76 TSTFLDIYAERDLK
- 1766,76 VDDIAVDLVERFMTK + Oxidation (M)
- 1876,86 TMATGIAGLSVAADSLSAIK
- 2077,93 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2225,07 DSEHTMSVLTITSNVVYGKK + Oxidation (M)
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 2575,33 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- 2628,25 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- 2748,36 NLTSMLDGYAMQCGHHLNINVFNR
- 2756,63 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFKK
- 3001,02 DEKSGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- 3420,75 TPDYNELFSGDPTWVTESIGGVGIDGRPLVTK
- P481
- 55 634,33 AKSNSK
- 883,24 TFYPEAR
- 1014,24 QFWGHLVK
- 1131,17 WIPLMMKGR
- 1207,21 VINEEFEISK
- 1324,10 NEDWQLYTAGK
- 1360,28 TLLFGPFANVGPK
- 1386,31 LDRPAIESSNER
- 1565,30 IDEGTDVNFGELTR
- 1584,34 EFINPLPHISYVR
- 1699,29 EIEPDWNIHVYER
- 1744,36 EPPGTPPMTVPHLDTR
- 2046,52 QVTDYVFIGAGGGAIPLLQK
- 2189,43 TFYPEARNEDWQLYTAGK
- 2806,58 HLGGFPISGQFLACTNPQVIEQHDAK
- P482
- 37 699,28 FEYIK
- 729,26 DAWPLK
- 792,33 ASWNFR
- 852,28 VYDQLSK
- 1008,30 LIDDLYEK
- 1020,31 YKDAWPLK
- 1083,43 LKPDLIVASK
- 1278,36 IAPTVSTDTVFK
- 1623,44 IVGQEPAPNLEEiSK
- 1712,62 ESIPLMNADHIFVVK
- 1800,61 IYAGGYAGEILNDLGFK
- 1956,77 IYAGGYAGEILNDLGFKR
- 2251,77 NNQVSDDLDEITWNLAGGYK
- 3227,44 VVTLYQGATDVAVSLGVKPVGAVESWTQKPK
- P483
- 36 646,50 DVWAR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 672,41 KLNAVK
- 716,41 VDIVDR
- 725,61 IIKPVR
- 842,50 IAPTLSLK
- 850,47 QNINSFK
- 1068,50 IGDYTSVGTR
- 1075,42 MIIMTDHAK + Oxidation (M)
- 1185,53 KQPNLEEISK
- 1327,59 LKPDLIIADSSR
- 1343,58 VDIVDRDVWAR
- 1592,76 LKPDLIIADSSRHK
- 2081,00 GPYLQLDTEHLADLNPER
- 2438,24 AGLLAHPNYSYVGQFLNELGFK
- 2789,48 IVVLEYSFADALAALDVKPVGIADDGK
- 2917,60 IVVLEYSFADALAALDVKPVGIADDGKK
- P484
- 35 857,38 AAAIDLAGR
- 1022,23 NIEADTGMR + Oxidation (M)
- 1056,32 VVDANIAAQR
- 1075,36 ADIDLPFER
- 1285,44 LVGGAGEETIIAR
- 1435,44 AMAVATEQEMKAR
- 1632,50 HHTEVLENPDNISK
- 1813,65 VVEAESEVPLAMAEALR
- 1887,67 VIETPFIAGVAMNGIEVK
- 2299,85 AGLALTTNQLESHYLAGGNVDR
- 2806,95 TVLSKGLDSGTAFEILSIDIADVDISK
- 3337,42 AGLALTTNQLESHYLAGGNVDRVVDANIAAQR
- P485
- 33 625,28 ADYEK
- 864,28 YIAQLEK
- 946,23 QGTPEQMR
- 1045,26 ALEQAGKSLK
- 1268,35 HLLVETSVDKK
- 1443,34 DIFGEVYTDSIGK
- 1450,40 TIQQTFIDNDKK
- 1454,37 VVTTN SILYDMAK
- 1571,45 KDIFGEVYTDSIGK
- Designacion del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 1576,44 DVKPIYLNGEEGNK
- 1593,47 QDPHAWLSLDNGIK
- 1819,59 DVKPIYLNGEEGNKDK
- 1836,62 DKQDPHAWLSLDNGIK
- 1911,66 QYGITPGYIWEINTEK
- 2172,83 VIAVSKDVKPIYLNGEEGNK
- 2582,00 LTDADVILYNGLNLETGNGWFEK
- 2942,26 NVGGDNVDIHSIVPVGQDPHEYEVKPK
- P486
- 32 625,42 ADYEK
- 864,41 YIAQLEK
- 1268,48 HLLVETSVDKK
- 1443,49 DIFGEVYTDSIGK
- 1450,53 TIQQTFIDNDKK
- 1454,61 VVTTN SILYDMAK
- 1576,64 DVKPIYLNGEEGNK
- 1593,57 QDPHAWLSLDNGIK
- 1818,77 DVKPIYLNGEEGNKDK
- 1836,78 DKQDPHAWLSLDNGIK
- 1911,81 QYGITPGYIWEINTEK
- 2582,18 LTDADVILYNGLNLETGNGWFEK
- 2942,32 NVGGDNVDIHSIVPVGQDPHEYEVKPK
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE. 2. El valor de m/z de un fragmento polipeptldico se puede convertir en masa restando 1 al valor de m/z. Cada masa incluye un intervalo de mas o menos 400 partes por millon (ppm) o 1 Da.
Tabla 5. Caracteristicas de los polipeptidos obtenidos del aislado bovino 1477 de S. aureus
- Designacion del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- P487
- 88 717,39 YSYER
- 736,52 IIGDYR
- 814,46 IFTDYR
- 942,46 IFTDYRK
- 974,54 YAQVKPIR
- 984,41 QMQFFGAR
- 992,40 SMQPFGGIR
- 1087,49 EQQLDVISR
- 1097,50 VSGYAVNFIK
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento poli peptfdico
- 1159,39 NHATAWQGFK
- 1261,45 LWEQVMQLSK
- 1272,50 SLGKEPEDQNR
- 1277,50 DGISNTFSIVPK
- 1289,54 AGVITGLPDAYGR
- 1315,54 TSTFLDIYAER
- 1322,53 LREELSEQYR
- 1394,50 THNQGVFDAYSR
- 1417,62 KAGVITGLPDAYGR
- 1426,65 IEMALIDTEIVR
- 1508,59 AGEPFAPGANPMHGR
- 1522,61 KTHNQGVFDAYSR
- 1543,68 YGFDLSRPAENFK
- 1877,74 TMATGIAGLSVAADSLSAIK
- 2077,86 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2159,08 AGVITESEVQEIIDHFIMK
- 2285,07 ETLIDAMEHPEEYPQLTIR
- 2575,32 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- 2628,24 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- 2756,41 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFKK
- 3262,68 VASTITSHDAGYLDKDLETIVGVQTEKPFK
- P488
- 80 625,49 HVDVR
- 814,54 IFTDYR
- 942,66 IFTDYRK
- 974,69 YAQVKPIR
- 984,59 QMQFFGAR
- 992,55 SMQPFGGIR
- 1159,64 NHATAWQGFK
- 1261,63 LWEQVMQLSK
- 1272,74 SLGKEPEDQNR
- 1277,69 DGISNTFSIVPK
- 1289,76 AGVITGLPDAYGR
- 1315,73 TSTFLDIYAER
- 1322,72 SMQPFGGIRMAK
- 1394,73 THNQGVFDAYSR
- 1417,86 KAGVITGLPDAYGR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento poli peptfdico
- 1422,76 TLLYAlNGGKDEK
- 1426,80 IEMALHDTEIVR
- 1508,82 AGEPFAPGANPMHGR
- 1513,80 VALYGVDFLMEEK
- 1543,82 YGFDLSRPAENFK
- 1571,82 TSSIQYENDDIMR
- 1703,99 DLETIVGVQTEKPFK
- 1860,23 DLETIVGVQTEKPFKR
- 1877,07 TMATGIAGLSVAADSLSAI K
- 1937,09 NEEGLVVDFEIEGDFPK
- 2078,13 YGNNDDRVDDlAVDLVER
- 2575,56 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- 2628,30 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- 2908,63 EFIQLNYTLYEGNDSFLAGPTEATSK
- P489
- 65 733,67 IVKFAR
- 944,71 ELKELGQK
- 974,79 YAQVKPIR
- 984,69 QMQFFGAR
- 1049,83 TLLYAINGGK
- 1087,78 EQQLDVISR
- 1097,79 VSGYAVNFIK
- 1243,80 VDDIAVDLVER
- 1272,82 SLGKEPEDQNR
- 1289,87 AGVITGLPDAYGR
- 1299,92 LPDNFKTYCAK
- 1315,83 TSTFLDIYAER
- 1322,84 SMQPFGGIRMAK
- 1390,93 DQKGALSSLSSVAK
- 1394,84 THNQGVFDAYSR
- 1577,94 VASTITSHDAGYLDK
- 1637,09 KAGEPFAPGANPMHGR
- 1704,16 DLETIVGVQTEKPFK
- 2030,42 MSIKTSSIQYENDDIMR
- 2078,34 YGNNDDRVDDIAVDLVER
- 2284,60 ETLIDAMEHPEEYPQLTIR
- 2575,77 FLHSLDNLGPAPEPNLTVLWSVR
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento poli peptfdico
- 2628,64 SGAQVGPNFEGINSEVLEYDEVFK
- P490
- 55 883,81 TFYPEAR
- 1014,87 QFWGHLVK
- 1131,97 WIPLMMKGR
- 1207,99 VINEEFEISK
- 1231,97 YSFDQVIMTK
- 1325,02 NEDWQLYTAGK
- 1361,17 TLLFGPFANVGPK
- 1362,14 GREDNPGIMAASK + Oxidation (M)
- 1387,14 LDRPAIESSNER
- 1481,24 NEDWQLYTAGKR
- 1566,28 IDEGTDVNFGELTR
- 1585,34 EFINPLPHISYVR
- 1700,36 EIEPDWNIHVYER
- 1761,49 EPPGTPPMTVPHLDTR + Oxidation (M)
- 2047,67 QVTDYVFIGAGGGAIPLLQK
- 2208,82 VYGKEPPGTPPMTVPHLDTR + Oxidation (M)
- 2865,21 HLGGFPISGQFLACTNPQVIEQHDAK
- P492
- 36 857,57 AAAIDLAGR
- 1056,59 VVDANIAAQR
- 1075,61 ADIDLPFER
- 1285,74 LVGGAGEETIIAR
- 1632,95 HHTEVLENPDNISK
- 1814,09 VVEAESEVPLAMAEALR
- 2284,45 AAAIDLAGRDVLEAVQMSVNPK + Oxidation (M)
- 2300,40 . AGLALTTNQLESHYLAGGNVDR
- 2807,80 TVLSKGLDSGTAFEILSIDIADVDISK
- P493
- 35 762,46 FVFHGR
- 964,39 DGFNNIER
- 1363,56 GHVYNGISGGQFK
- 1443,56 YTPTSILYFNPK
- 1450,64 QLAEDLQKHLGAK
- 1819,88 NHSEYVTDMRLIGIR + Oxidation (M)
- 1875,84 DLPPMEQVFDTLDLDK
- 1941,00 IRPEDMHIMANIFLPK + Oxidation (M)
5
10
15
20
25
30
- Designation del polipeptido
- Peso molecular aproximado en kilodalton (kDa)1 Valor de m/z de los fragmentos polipeptldicos procedentes de la digestion con tripsina 2 Secuencia de aminoacidos predicha del fragmento polipeptldico
- 2081,10 RIRPEDMHIMANIFLPK
- 2283,30 ISHLVLTRTGLYIIDSQLLK
- P495
- 32
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE. 2. El valor de m/z de un fragmento polipeptldico se puede convertir en masa restando 1 al valor de m/z. Cada masa incluye un intervalo de mas o menos 430 partes por millon (ppm) o 1 Da.
En otro aspecto mas, la presente divulgation incluye ademas polipeptidos que tienen similitud con una secuencia de aminoacidos. La similitud se refiere a similitud estructural y, en general, se determina mediante la alineacion de los restos de las dos secuencias de aminoacidos (es decir, una secuencia de aminoacidos candidata y una secuencia de aminoacidos de referencia) para optimizar el numero de aminoacidos identicos a lo largo de sus secuencias. Estan permitidos los huecos en una o en ambas secuencias en la fabrication de la alineacion para optimizar el numero de aminoacidos identicos, aunque los aminoacidos de cada secuencia deben permanecer sin embargo en su orden correcto. Las secuencias de aminoacidos de referencia se desvelan en las Tablas 6, 7, 8 y 9. Se pueden comparar dos secuencias de aminoacidos usando algoritmos disponibles en el mercado. Preferentemente, las dos secuencias de aminoacidos se comparan usando el programa BLASTP del algoritmo de busqueda BLAST 2, segun lo descrito por Tatusova et al., (FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250), y que se puede obtener en Internet, por ejemplo, en el sitio de Internet mantenido por el Centro Nacional de Information sobre Biotecnologia, Institutos Nacionales de Salud. Preferentemente, se usan los valores por defecto para todos los parametros de busqueda de BLAST 2, incluyendo la matriz = BLOSUM62; la penalization por apertura de hueco = 11; la penalization por extension de hueco = 1; hueco x_dropoff = 50; esperado = 10; tamano de palabra = 3; y opcionalmente, con el filtro activado. En la comparacion de dos secuencias de aminoacidos usando el algoritmo de busqueda BLAST, la similitud estructural se denomina "identidades”. Preferentemente, una secuencia de aminoacidos candidata tiene una identidad del al menos 80 %, identidad del al menos 90 %, identidad del al menos 95 %, identidad del al menos 96 %, identidad del al menos 97 %, identidad del al menos 98 % o identidad del al menos 99 % con una secuencia de aminoacidos de referencia. Preferentemente, el peso molecular de la secuencia de aminoacidos candidata y la secuencia de aminoacidos de referencia son esencialmente el mismo valor. Preferentemente, el peso molecular de la secuencia de aminoacidos candidata y la secuencia de aminoacidos de referencia se determina por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se puede obtener un polipeptido candidato mediante el crecimiento de un microbio en condiciones de bajo nivel de metal y el posterior aislamiento de un polipeptido mediante los procedimientos desvelados en el presente documento.
Por lo general, una secuencia de aminoacidos candidata que tiene similitud estructural con una secuencia de aminoacidos de referencia tiene actividad inmunogenica, actividad inmunogenica protectora, actividad seroactiva, actividad inmunorreguladora o una combinacion de los mismos.
Tabla 6. Aislado ATCC 19636 de S. aureus
- Peso molecular del polipeptido de referencia (kDa)1
- Identificador de secuencia del NCBI del polipeptido identificado por el algoritmo informatico como el de mejor coincidencia con el identificador genetico de masa del polipeptido de referencia
- 88
- 49243545
- 55
- 81762012
- 38
- 82750440
- 37
- 49243435
- 36
- 57286380
- 35
- 49245508
- 33
- 49243946
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE.
5
10
Tabla 7. SAAV1 de S. aureus
- Peso molecular del polipeptido de referencia (kDa)1
- Identificador de secuencia del NCBI del polipeptido identificado por el algoritmo informatico como el de mejor coincidencia con el identificador genetico de masa del polipeptido de referencia
- 55
- 57286470
- 55
- 48874
- 37
- 49243435
- 33
- 49243946
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE.
Tabla 8. 2176 de S. aureus
- Peso molecular del polipeptido de referencia (kDa)1
- Identificador de secuencia del NCBI del polipeptido identificado por el algoritmo informatico como el de mejor coincidencia con el identificador genetico de masa del polipeptido de referencia
- 88
- 57285406
- 80
- 57285406
- 65
- 57285406
- 55
- 57286528
- 37
- 49482358
- 36
- 57286380
- 35
- 15927153
- 33
- 57285658
- 32
- 57285658
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE.
Tabla 9. 1477 de S. aureus
- Peso molecular del polipeptido de referencia (kDa)1
- Identificador de secuencia del NCBI del polipeptido identificado por el algoritmo informatico como el de mejor coincidencia con el identificador genetico de masa del polipeptido de referencia
- 88
- 49482458
- 80
- 57285406
- 65
- 57285406
- 55
- 57286528
- 36
- 15927153
- 35
- 49484031
- 1. Peso molecular determinado por SDS-PAGE.
Los polipeptidos expresados por un microbio de referencia y mencionados anteriormente en peso molecular se pueden obtener mediante el crecimiento del microbio de referencia en condiciones de bajo nivel de metal y el posterior aislamiento de un polipeptido mediante los procesos desvelados en el presente documento. Un polipeptido candidato se puede aislar de un microbio, preferentemente de un microbio gram positivo, mas preferentemente, de un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus. Otros microbios gram positivos incluyen Corynebacterium sp., Erysipelothrix sp., Mycobacterium sp., y Erysipelothrix sp. Un polipeptido candidato tambien se puede producir usando tecnicas recombinantes, enzimaticas o qulmicas.
La presente divulgacion tambien proporciona preparados de celulas enteras de un microbio, donde el microbio expresa uno o mas de los polipeptidos de la presente divulgacion. Las celulas presentes en un preparado de celulas enteras estan preferentemente inactivadas de modo que las celulas no se pueden replicar, pero la actividad inmunogenica de los polipeptidos de la presente divulgacion expresados por el microbio se mantiene. Por lo general,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
las celulas se destruyen mediante la exposicion a agentes tales como glutaraldehldo, formalina o formaldehldo. Composiciones
Una composicion de la presente invention es como se define en las reivindicaciones. Las composiciones de la presente divulgation pueden incluir al menos un polipeptido descrito en el presente documento, o una serie de polipeptidos, es decir, un numero entero superior a 1 (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4). Por ejemplo, una composicion puede incluir 2, 3, 4, 5 o mas polipeptidos regulados por el nivel de metal aislados que tienen pesos moleculares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa, o cualquier subconjunto o combination de los mismos. Una composicion puede incluir polipeptidos que se pueden aislar de 1 microbio, o que se pueden aislar de una combinacion de 2 o mas microbios. Por ejemplo, una composicion puede incluir polipeptidos que se pueden aislar de 2 o mas especies de Staphylococcus o de una especie de Staphylococcus y un microbio diferente que no forme parte del genero Staphylococcus. La presente divulgacion tambien proporciona composiciones que incluyen un preparado de celulas enteras, en el que la celula entera expresa uno o mas de los polipeptidos de la presente divulgacion. Por ejemplo, la celula entera puede ser una especie de Staphylococcus. En algunos aspectos, una composicion puede incluir preparados de celulas enteras de 2, 3, 4, 5 o 6 cepas.
Opcionalmente, un polipeptido de la composicion de la presente invencion puede estar unido covalentemente o conjugado con un polipeptido portador para mejorar las propiedades inmunologicas del polipeptido. Los polipeptidos portadores utiles son conocidos en la tecnica. El acoplamiento qulmico de los polipeptidos de la presente divulgacion puede llevarse a cabo usando metodos conocidos y habituales. Por ejemplo, pueden usarse diversos reactivos reticuladores homobifuncionales y/o heterobifuncionales tales como bis(sulfosuccinimidil)suberato,
bis(diazobenzidina), dimetil-adipimidato, dimetil-pimelimidato, dimetil-superimidato, disuccinimidil-suberato,
glutaraldehldo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida,
sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, sulfosuccinimidil-4-(p-maleimido-fenil)butirato y (1- etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual”, en general y Capltulo 5, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, NY (1988)).
Las composiciones de la presente invencion opcionalmente incluyen ademas un vehlculo farmaceuticamente aceptable. "Farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, vehlculo, excipiente, sal, etc. que es compatible con los otros ingredientes de la composicion, y no perjudicial para el receptor del mismo. Por lo general, la composicion incluye un vehlculo farmaceuticamente aceptable cuando la composicion se usa como se describe en el presente documento. Las composiciones de la presente invencion se pueden formular en preparados farmaceuticos en varias formas adaptadas a la via de administration seleccionada, incluyendo las vlas adecuadas para estimular una respuesta inmune hacia un antlgeno. As! pues, una composicion de la presente invencion se puede administrar por vlas conocidas incluyendo, por ejemplo, oral; parental incluyendo intradermica, transcutanea y subcutanea; intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc., y topicamente, tal como intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradermica, transcutanea y rectal etc. Se preve que una composicion se puede administrar en una superficie mucosa, tal como por administracion en la mucosa nasal o respiratoria (por ejemplo, pulverizado o aerosol), para estimular la inmunidad mucosa, tal como la production de anticuerpos IgA secretores, por todo el cuerpo del animal.
Una composicion de la presente invencion tambien se puede administrar por medio de un implante de liberation sostenida o retardada. Los implantes adecuados para su uso de acuerdo con la invencion son conocidos e incluyen, por ejemplo, los desvelados en Emery y Straub (documento WO 01/37810 (2001)), y Emery et al. (documento WO 96/01620 (1996)). Los implantes se pueden producir en tamanos suficientemente pequenos para su administracion por aerosol o pulverizado. Los implantes tambien incluyen nanoesferas y microesferas.
Una composicion de la presente invencion se puede administrar en una cantidad suficiente para tratar ciertas afecciones como se describe en el presente documento. La cantidad de polipeptidos o celulas enteras presentes en una composicion de la presente invencion puede variar. Por ejemplo, la dosis de polipeptidos puede ser de entre 0,01 microgramos (pig) y 300 mg, normalmente de entre 0,1 mg y 10 mg. Cuando la composicion es un preparado de celulas enteras, las celulas pueden estar presentes a una concentration de, por ejemplo, 102 bacterias/ml, 103 bacterias/ml, 104 bacterias/ml, 105 bacterias/ml, 106 bacterias/ml, 107 bacterias/ml, 108 bacterias/ml o 109 bacterias/ml. Para una composicion inyectable (por ejemplo, subcutanea, intramuscular, etc.) los polipeptidos pueden estar presentes en la composicion en una cantidad tal que el volumen total de la composicion administrada sea de 0,5 ml a 5,0 ml, normalmente de 1,0-2,0 ml. Cuando la composicion es un preparado de celulas enteras, las celulas estan presentes preferentemente en la composicion en una cantidad de modo que el volumen total de la composicion administrada sea de 0,5 ml a 5,0 ml, normalmente 1,0-2,0 ml. La cantidad administrada variara dependiendo de varios factores incluyendo, pero sin limitation, los polipeptidos especlficos seleccionados, el peso, el estado flsico y la edad del animal, y la via de administracion. Por lo tanto, el peso absoluto del polipeptido incluido en una forma de dosificacion unitaria dada puede variar ampliamente, y depende de factores tales como la especie, la edad, el peso y el estado flsico del animal, as! como del metodo de administracion. Dichos factores pueden ser determinados por un experto en la materia. Otros ejemplos de dosis adecuadas para la invencion se desvelan en Emery et al., (Patente de EE.UU. n.° 6.027.736).
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Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias, y se pueden preparar mediante metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. Los metodos de preparacion de una composicion con un vehlculo farmaceuticamente aceptable incluyen la etapa de asociar el compuesto activo (por ejemplo, un polipeptido o una celula entera de la presente divulgacion) con un vehlculo que constituye uno o mas ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e Intimamente el compuesto activo con un vehlculo llquido, un vehlculo solido finamente dividido, o ambos, y despues, si es necesario, conformando el producto en las formulaciones deseadas.
Una composicion que incluye un vehlculo farmaceuticamente aceptable puede incluir tambien un adyuvante. Un "adyuvante" se refiere a un agente que puede actuar en un modo no especlfico para mejorar una respuesta inmune hacia un determinado antlgeno, reduciendo as! potencialmente la cantidad de antlgeno necesaria en una composicion inmunizadora dada y/o la frecuencia de inyeccion necesaria para generar una respuesta inmune adecuada hacia el antlgeno de interes. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, IL-1, IL-2, emulsionantes, dipeptidos de muramilo, bromuro de dimetildiocradecilamonio (DDA), avridina, hidroxido de aluminio, aceites, saponinas, alfa-tocoferol, polisacaridos, parafinas emulsionadas (incluyendo por ejemplo, las disponibles con la marca comercial EMULSIGEN de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), ISA-70, RIBI y otras sustancias conocidas en la tecnica. Se espera que los polipeptidos de la composicion de la presente invencion tengan actividad inmunorreguladora y que dichos polipeptidos se puedan usar como adyuvantes que actuen directamente como activadores de los linfocitos T y/o B o que actuen en ciertos tipos de celulas para aumentar la slntesis de diversas citocinas o activar las vlas de senalizacion intracelular. Se espera que dichos polipeptidos aumenten la respuesta inmune para aumentar el Indice protector de la composicion existente.
En otra realizacion, una composicion de la invencion que incluye un vehlculo farmaceuticamente aceptable puede incluir un modificador de la respuesta biologica tal como, por ejemplo, IL-2, IL-4 y/o IL-6, TNF, IFN-alfa, IFN-gamma, y otras citocinas que afectan a las celulas inmunes. Una composicion inmunizadora tambien puede incluir otros componentes conocidos en la tecnica tales como un antibiotico, un conservante, un antioxidante o un agente quelante.
Metodos de preparacion
La presente divulgacion tambien proporciona metodos de obtencion de los polipeptidos descritos en el presente documento. Los polipeptidos y las celulas enteras descritos en el presente documento se pueden aislar de un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus. Otros microbios gram positivos de los que se pueden aislar los polipeptidos incluyen Corynebacterium sp., Erysipelothrix sp., Mycobacterium sp., y Erysipelothrix sp. Los microbios utiles para la obtencion de polipeptidos de la presente divulgacion y la fabricacion de preparados de celulas enteras se encuentran disponibles en el mercado, en un deposito tal como la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Ademas, dichos microbios se pueden obtener facilmente mediante tecnicas habituales y conocidas en la materia. Los microbios pueden obtenerse de un animal infectado como un aislado de campo, y usarse para obtener polipeptidos y/o preparados de celulas enteras de la presente divulgacion, o almacenarse para su uso futuro, por ejemplo, en un deposito congelado a una temperatura de -20 °C a -95 °C o de -40 °C a -50 °C, en medios bacteriologicos que contengan glicerol al 20 % y otros medios similares.
Cuando un polipeptido de la presente divulgacion se ha de obtener de un microbio, el microbio puede incubarse en condiciones de bajo nivel de metal. Como se usa en el presente documento, la expresion "condiciones de bajo nivel de metal" se refiere a un entorno, normalmente medios bacteriologicos, que contiene cantidades de un metal libre que hacen que un microbio exprese polipeptidos regulados por el nivel de metal a un nivel detectable. Como se usa en el presente documento, la expresion "condiciones de alto nivel de metal" se refiere a un entorno que contiene cantidades de un metal libre que hacen que un microbio bien no exprese uno o mas de los polipeptidos regulados por el nivel de metal descritos en el presente documento a un nivel detectable, o reduzca la expresion de dicho polipeptido. Los metales son los presentes en la tabla periodica, en los Grupos 1 a 17 (notacion IUPAC; tambien denominados Grupos I-A, II-A, III-B, IV-B, V-B, VI-B, VII-B, VIII, I-B, II-B, III-A, IV-A, V-A, VI-A y VII-A, respectivamente, con la notacion CAS). Preferentemente, los metales son los de los Grupos 2 a 12, mas preferentemente, Grupos 3-12. Incluso mas preferentemente, el metal es hierro, cinc, cobre, magnesio, nlquel, cobalto, manganeso, molibdeno o selenio, mas preferentemente, hierro.
En general, las condiciones de bajo nivel de metal son el resultado de la adicion de un compuesto quelante de metales a un medio bacteriologico, el uso de un medio bacteriologico que contiene bajas cantidades de un metal o la combinacion de los mismos. En general, las condiciones de alto nivel de metal estan presentes cuando un quelante no esta presente en el medio, se anade un metal al medio o la combinacion de los mismos. Los ejemplos de quelantes de metales incluyen compuestos naturales y sinteticos. Los ejemplos de compuestos naturales incluyen compuestos fenolicos vegetales tales como flavonoides. Los ejemplos de flavonoides incluyen los quelantes de cobre catequina y naringenina, y los quelantes de hierro miricetina y quercetina. Los Ejemplos de quelantes de cobre sinteticos incluyen, por ejemplo, tetratiomolibdato, y los ejemplos de quelantes de cinc sinteticos incluyen, por ejemplo, W,W,W,W-tetraquis(2-piridilmetil)-etilendiamina. Los ejemplos de quelantes de hierro sinteticos incluyen 2,2'- dipiridilo (tambien denominado en la tecnica V,V'-bipiridilo), 8-hidroxiquinolina, acido etilendiamina-di-O-
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hidroxifenilacetico (EDDHA), metanosulfonato de desferrioxamina (desferol), transferrina, lactoferrina,
ovotransferrina, sideroforos biologicos tales como los catecolatos e hidroxamatos, y citrato. Un ejemplo de un quelante de cationes divalentes general es la resina Chelex®. Preferentemente, el 2,2'-dipiridilo se usa para la quelacion del hierro. Por lo general, se anade 2,2'-dipiridilo al medio a una concentracion de al menos 300 microgramos/mililitro (jg/ml), al menos 600 jg/ml o al menos 900 jg/ml. Los niveles altos de 2,2'-dipiridilo pueden ser de 1.200 jg/ml, 1.500 jg/ml o 1.800 jg/ml.
El genoma de S. aureus codifica tres homologos de Fur: Fur, PerR y Zur. Mientras que las protelnas Zur y PerR parecen estar principalmente implicadas en la regulacion de la homeostasis del cinc y los genes del estres del peroxido, respectivamente, se ha demostrado que la protelna Fur regula varios sistemas de captacion del sideroforo del hierro en respuesta a la limitacion del hierro. La protelna Fur tambien desempena un papel en la resistencia al estres oxidativo y la virulencia. Se espera que un organismo gram positivo, preferentemente, un S. aureus, con una mutacion en un gen fur de lugar a la expresion constitutiva de muchos, si no todos, los polipeptidos regulados por el nivel de metal de la presente divulgacion. La produccion de una mutacion de fur en un organismo gramo positivo, preferentemente, un S. aureus, se puede producir usando metodos habituales, incluyendo, por ejemplo, mutagenesis de transposon, qulmica o dirigida util para generar mutaciones de desactivacion de genes en bacterias gram positivas.
El medio usado para incubar el microbio y el volumen de los medios usado para incubar el microbio puede variar. Cuando se esta evaluando un microbio para determinar la capacidad de producir uno o mas de los polipeptidos descritos en el presente documento, el microbio se puede cultivar en un volumen adecuado, por ejemplo, de 10 mililitros de 1 litro de medio. Cuando un microbio se cultiva para obtener polipeptidos para su uso en, por ejemplo, la administracion a animales, el microbio puede cultivarse en un fermentador para permitir el aislamiento de grandes cantidades de polipeptidos. Los metodos para el cultivo de microbios en un fermentador son habituales y conocidos en la tecnica. Las condiciones usadas para el cultivo de un microbio incluyen preferentemente un quelante de metal, mas preferentemente un quelante del hierro, por ejemplo, 2,2'-dipiridilo, un pH de entre 6,5 y 7,5, preferentemente de entre 6,9 y 7,1, y una temperatura de 37 °C.
En algunos aspectos de la invencion, un microbio se puede recoger tras el crecimiento. La recogida incluye concentrar el microbio en un volumen mas pequeno y suspenderlo en un medio diferente al medio de crecimiento. Los metodos de concentracion de un microbio son habituales y conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, filtracion o centrifugacion. Por lo general, el microbio concentrado se suspende en un tampon apropiado. Un ejemplo de un tampon que se puede usar contiene Tris-base (7,3 gramos/litro), a un pH de 8,5. Opcionalmente, el tampon final tambien minimiza la degradation proteolltica. Esto se puede lograr teniendo el tampon final a un pH superior a 8,0, preferentemente, de al menos 8,5, y/o incluyendo uno o mas inhibidores de proteinasas (por ejemplo, fluoruro de fenilmetanosulfonilo). Opcional y preferentemente, el microbio concentrado se congela a -20 °C o a una temperatura inferior hasta que se altera.
En un aspecto de la divulgacion, el microbio es para su uso como un preparado de celulas enteras, y las celulas recogidas se pueden procesar usando metodos habituales y conocidos para inactivar celulas. Para preparar Ja composition de la presente invencion, el S. aureus se puede alterar usando metodos qulmicos, flsicos o mecanicos habituales y conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, ebullition, prensa francesa, sonicacion, digestion de peptidoglicano (por ejemplo, por digestion con lisozima) u homogenization. Un ejemplo de un dispositivo adecuado util para la homogenizacion es un Homogeneizador modelo C500-B Avestin, (Avestin Inc, Ottawa Canada). Como se usa en el presente documento, "alteration" se refiere a la ruptura de la celula. La alteration de un microbio se puede medir mediante metodos que son habituales y conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, cambios en la densidad optica. Por lo general, un microbio se somete a la alteracion hasta que el porcentaje de transmitancia se aumenta en un 20 % cuando se mide la dilution de 1:100. Cuando se usan metodos flsicos o mecanicos, la temperatura durante la alteracion normalmente se mantiene baja, preferentemente a 4 °C, para minimizar aun mas la degradacion proteolltica. Cuando se usan metodos qulmicos, la temperatura se puede aumentar para optimizar la alteracion de las celulas. Tambien se puede usar una combination de metodos qulmicos, flsicos y mecanicos para solubilizar la pared celular del microbio. Como se usa en el presente documento, el termino "solubilizar" se refiere a disolver los materiales celulares (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos, hidratos de carbono) en la fase acuosa del tampon en el que se altero el microbio, y la formation de agregados de materiales celulares insolubles. Sin el deseo de quedar limitados por la teorla, se cree que las condiciones de solubilization dan lugar a la agregacion de polipeptidos de la presente invencion en agregados insolubles que sean lo suficientemente grandes como para permitir el aislamiento facil mediante, por ejemplo, centrifugacion.
Los agregados insolubles que incluyen uno o mas de los polipeptidos se pueden aislar mediante metodos que son habituales y conocidos en la tecnica. Preferentemente, los agregados insolubles se alslan por centrifugacion. Por lo general, la centrifugacion de polipeptidos, tales como polipeptidos de membrana, se puede realizar mediante fuerzas centrlfugas de 100.000 x g. El uso de dichas fuerzas centrlfugas requiere el uso de ultracentrifugadores, y el aumento a escala para procesar grandes volumenes de muestra suele ser diflcil y no es economico con estos tipos de centrifugadores. Los metodos descritos en el presente documento proporcionan la produccion de agregados insolubles lo suficientemente grandes como para permitir el uso de centrifugadores de flujo continuo, por ejemplo, Sharples T-1 (Alfa Laval Separations, Warminster, PA), que se pueden usar con un caudal de 250 ml/minuto en
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117,21 kPa (17 psi) a una fuerza centrlfuga de 46.000 x g a 60.000 x g. Se pueden usar otros centrifugadores de gran escala tales como las configuraciones de recipiente tubular, camara y disco. Dichos centrifugadoras se usan habitualmente y se conocen en la tecnica, y estan disponibles en el mercado en fabricantes tales como Pennwalt, Westfalia y alfa-Laval.
Las protelnas recogidas finales se lavan y/o se someten a dialisis frente a un tampon apropiado usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, diafiltracion, precipitacion, cromatografla hidrofoba, cromatografla de intercambio ionico o cromatografla de afinidad, o la ultrafiltracion y el lavado de los polipeptidos, por ejemplo, en alcohol, mediante diafiltracion. Despues del aislamiento, los polipeptidos se suspenden en tampon y se almacenan a baja temperatura, por ejemplo, a -20 °C o temperatura inferior.
En los aspectos de la presente divulgacion en los que se debe fabricar un preparado de celulas enteras, tras el cultivo, el microbio se puede destruir mediante la adicion de un agente tal como glutaraldehldo, formalina o formaldehldo, a una concentracion suficiente para inactivar las celulas en el cultivo. Por ejemplo, se puede anadir formalina a una concentracion del 0,3 % (vol:vol). Tras un perlodo de tiempo suficiente para inactivar las celulas, las celulas se pueden recoger, por ejemplo, mediante diafiltracion y/o centrifugacion, y lavarse.
Metodos de uso
Las composiciones de la presente invencion se pueden usar en diversos metodos, segun lo desvelado en el presente documento. Los metodos incluyen administrar a un animal una cantidad eficaz de una composition de la presente invencion. El animal puede ser, por ejemplo, aviar (incluyendo, por ejemplo, pollos o pavos), bovino (incluyendo, por ejemplo, ganado), caprino (incluyendo, por ejemplo, cabras), ovino (incluyendo, por ejemplo, ovejas), porcino (incluyendo, por ejemplo, cerdos), bisonte (incluyendo, por ejemplo, bufalo), equino (incluyendo, por ejemplo, caballos), un animal de companla (incluyendo, por ejemplo, perros o gatos), miembros de la familia Cervidae ( incluyendo, por ejemplo, ciervos, alces, caribues y renos) o ser humano.
En algunos aspectos, los metodos pueden incluir ademas administraciones adicionales (por ejemplo, una o mas administraciones de refuerzo) de la composicion al animal para mejorar o estimular una respuesta inmune secundaria. Se puede administrar un refuerzo en un momento despues de la primera administration, por ejemplo, de 1 a 8 semanas, preferentemente de 2 a 4 semanas, despues de la primera administracion de la composicion. Se pueden administrar refuerzos posteriores una, dos, tres, cuatro o mas veces al ano. Sin pretender quedar ligados a teorla alguna, se espera que, en algunos aspectos de la presente invencion, no sean necesarios refuerzos anuales, pues el animal se expondra en el campo a microbios que expresen polipeptidos presentes en las composiciones que tengan epltopos que sean identicos o esten relacionados estructuralmente con los epltopos presentes en los polipeptidos de la composicion administrada al animal.
En un aspecto, la divulgacion se dirige a metodos de fabrication de anticuerpos, por ejemplo, mediante la induction de la production de anticuerpos en un animal o mediante tecnicas recombinantes. El anticuerpo producido incluye el anticuerpo que se une especlficamente al menos a un polipeptido presente en la composicion. En este aspecto de la divulgacion, una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz para dar lugar a la produccion de anticuerpos en el animal. Los metodos para determinar si un animal ha producido anticuerpos que se unen especlficamente a los polipeptidos presentes en una composicion de la presente invencion se pueden determinar como se describe en el presente documento. La presente divulgacion incluye ademas anticuerpos que se unen especlficamente a un polipeptido de la presente divulgacion, y composiciones que incluyen dichos anticuerpos. El metodo se puede usar para producir el anticuerpo que se une especlficamente a polipeptidos expresados por un microbio que no sea el microbio del que se aislaron los polipeptidos de la composicion. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que puede "unirse especlficamente" a un polipeptido es un anticuerpo que interactua con el epltopo del antlgeno que indujo la slntesis del anticuerpo, o interactua con un epltopo relacionado estructuralmente. Al menos algunos de los polipeptidos presentes en las composiciones de la presente invencion normalmente incluyen epltopos que se conservan en los polipeptidos de diferentes especies y diferentes generos de los microbios. Por consiguiente, se espera que los anticuerpos producidos usando una composicion derivada de un microbio se unan a polipeptidos expresados por otros microbios y proporcionen protection de amplio espectro contra organismos gram positivos. Los ejemplos de microbios gram positivos a los que el anticuerpo puede unirse especlficamente son Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, Staphylococcus aureus; miembros de la familia Streptococcaceae, preferentemente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi o Streptococcus dysgalactiae; y Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Listeria sp., Micrococcus sp. y Mycobacterium sp., Kytococcus sp. y Erysipelothrix sp.
La presente divulgacion tambien se dirige al uso de dicho anticuerpo para dirigirse a un microbio que exprese un polipeptido de la presente divulgacion o un polipeptido que tenga un epltopo relacionado estructuralmente con un epltopo presente en un polipeptido de la presente divulgacion. Un compuesto se puede unir covalentemente a un anticuerpo, pudiendo ser el compuesto, por ejemplo, una toxina. Del mismo modo, dichos compuestos pueden unirse covalentemente a un sideroforo bacteriano para dirigirse al microbio. El acoplamiento qulmico o la conjugation de un anticuerpo de la presente divulgacion. o una parte del mismo (tal como un fragmento Fab), se
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pueden llevar a cabo usando metodos conocidos y habituales. En un aspecto, la divulgacion tambien se dirige a tratar una infeccion en un animal, incluyendo un ser humano, causada por un microbio gram positivo, preferentemente por un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, S. aureus; miembros de la familia Streptococcaceae, preferentemente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi o Streptococcus dysgalactiae; Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp., Listeria sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp. Como se usa en el presente documento, el termino "infeccion" se refiere a la presencia de un microbio gram positivo en el organismo de un animal, que puede o no puede ser cllnicamente evidente. Un animal con una infeccion por un miembro del genero Staphylococcus que no es cllnicamente evidente se suele denominar vehlculo asintomatico. El metodo incluye la administracion de una cantidad eficaz de la composicion de la presente invencion a un animal que tiene una infeccion causada por un microbio gram positivo, y determinar si el numero de microbios que causan la infeccion ha disminuido. Los metodos para determinar si una infeccion esta causada por un microbio gram positivo son habituales y conocidos en la tecnica, como lo son metodos para determinar si la infeccion ha disminuido.
En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a metodos para el tratamiento de uno o mas slntomas de ciertas afecciones en un animal que pueden estar causadas por la infeccion por un microbio gram positivo, preferentemente por un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, S. aureus; miembros de la familia Streptoococcaceae, preferentemente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi o Streptococcus dysgalactiae; Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp., Listeria sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp. El metodo incluye administrar una cantidad eficaz de una composicion de la presente invencion a un animal que tiene o esta en riesgo de tener una afeccion o los slntomas de una afeccion, y determinar si se cambia al menos un slntoma de la afeccion, preferentemente, se reduce. Los ejemplos de afecciones causadas por las infecciones microbianas incluyen, por ejemplo, mastitis, septicemia, neumonla, meningoencefalitis, linfangitis, dermatitis, infecciones del tracto genital, paperas, metritis, enfermedad perinatal, abscesos hipofisarios, artritis, bursitis, orquitis, cistitis y pielonefritis, linfadenitis caseosa, tuberculosis, linfangitis ulcerosa, listeriosis, erisipela, laminitis, carbunco, enfermedad de Tyzzer, tetanos, botulismo, enteritis, edema maligno, basquilla, hemoglobinuria bacilar, enterotoxemia, lesiones cutaneas necroticas e infecciones nosocomiales. Los ejemplos de afecciones causadas por S. aureus tambien incluyen, por ejemplo, botriomicosis en caballos, sinovitis purulenta y osteomielitis en aves de corral, abortos en el ganado porcino y piemia por garrapatas en corderos. Los ejemplos de afecciones causadas por Streptococcus sp. tambien incluyen, por ejemplo, dolor de garganta, fiebre escarlatina, impetigo, endocarditis ulcerosa, fiebre reumatica y glomerulonefritis cervicitis postestreptococica en seres humanos, cervicitis equina y porcina, y meningitis y abscesos en la quijada porcinos.
El tratamiento de los slntomas asociados con estas afecciones puede ser profilactico o, como alternativa, se puede iniciar tras el desarrollo de una afeccion descrita en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el termino "slntoma" se refiere a pruebas objetivas en un sujeto de una afeccion causada por la infeccion por un microbio. Los slntomas asociados con las afecciones mencionadas en el presente documento y las evaluaciones de dichos slntomas son habituales y conocidos en la tecnica. El tratamiento que es profilactico, por ejemplo, que se inicia antes de que un sujeto manifieste los slntomas de una afeccion causada por un microbio, se denomina en el presente documento el tratamiento de un sujeto que esta "en riesgo" de desarrollar la afeccion. Por lo general, un animal "en riesgo" de desarrollar una afeccion es un animal presente en una zona en la que se han diagnosticado animales que tienen la afeccion y/o que es probable que este expuesto a un microbio causante de la afeccion. Por consiguiente, la administracion de una composicion se puede realizar antes, durante o despues de la aparicion de las afecciones descritas en el presente documento. El tratamiento iniciado tras el desarrollo de una afeccion puede reducir la gravedad de los slntomas de una de las afecciones, o la eliminacion total de los slntomas. En este aspecto de la invencion, una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz para prevenir la manifestacion de slntomas de una enfermedad, disminuir la gravedad de los slntomas de una enfermedad y/o eliminar por completo los slntomas. El exito del tratamiento de una infeccion microbiana gram positiva en un animal se desvela en el Ejemplo 5, que demuestra la protection contra la enfermedad causada por S. aureus en modelos de ratones mediante la administracion de una composicion de la presente invencion. Estos modelos de raton son un modelo comunmente aceptado para el estudio de la enfermedad humana causada por estos microbios. Tambien se desvela el exito del tratamiento de una infeccion microbiana gram positiva en un animal en los Ejemplos 10-12, que demuestran la proteccion contra la enfermedad causada por S. aureus en vacas mediante la administracion de una composicion de la presente invencion.
La presente divulgacion tambien proporciona metodos de reduction de la colonization por microbios gram positivos, por ejemplo, el bloqueo de los sitios de union del microbio gram positivo, incluyendo tejidos del sistema esqueletico (por ejemplo, huesos, cartllagos, tendones y ligamentos), sistema muscular, (por ejemplo, musculos esqueleticos y lisos), sistema circulatorio (por ejemplo, corazon, vasos sangulneos, capilares y sangre), sistema nervioso (por ejemplo, cerebro, medula espinal y nervios perifericos), sistema respiratorio (por ejemplo, nariz, traquea, pulmones, bronquios, bronquiolos, alveolos), sistema digestivo (por ejemplo, boca, glandulas salivales, esofago, hlgado, estomago, intestino grueso e intestino delgado), sistema excretor (por ejemplo, rinones, ureteres, vejiga y uretra), sistema endocrino (por ejemplo, hipotalamo, hipofisis, tiroides, pancreas y glandulas suprarrenales), sistema
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reproductive (por ejemplo, ovarios, oviducto, utero, vagina, glandulas mamarias, testlculos y las veslculas seminales), sistema linfatico/inmunologico (por ejemplo, linfa, ganglios y vasos linfaticos, celulas mononucleares o globulos blancos, tales como macrofagos, neutrofilos, monocitos, eosinofilos, basofilos, linfocitos T y linfocitos B), y linajes celulares especlficos (por ejemplo, celulas precursoras, celulas epiteliales, celulas madre), y similares. Preferentemente, el microbio gram positivo es un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, S. aureus; un miembro de la familia Streptooccaceae, preferentemente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis,
Streptococcus bovis, Streptococcus equi o Streptococcus dysgalactiae; Bacillus sp., Clostridium sp., Corynehacterium sp., Enterococus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp., Listeria sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp. El metodo incluye administrar una cantidad eficaz de una composicion de la presente invencion a un animal colonizado por, o en riesgo de ser colonizado por, un microbio gram positivo. En este aspecto de la divulgacion, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para disminuir la colonizacion del animal por el microbio. Los metodos de evaluacion de la colonizacion de un animal por un microbio son habituales y conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la colonizacion del tracto intestinal de un animal por un microbio se puede determinar midiendo la presencia del microbio en las heces del animal. Se espera que la reduccion de la colonizacion de un animal por un microbio reduzca la transmision del microbio a los seres humanos.
Una composicion de la invencion se puede usar para proporcionar la inmunizacion activa o pasiva frente a la infeccion bacteriana. En general, la composicion se puede administrar a un animal para proporcionar la inmunizacion activa. Sin embargo, la composicion tambien se puede usar para inducir la generacion de productos inmunes tales como anticuerpos, que se pueden extraer del animal que los produce y administrarse a otro animal para proporcionar inmunidad pasiva. Se pueden extraer componentes inmunes, tales como anticuerpos, para preparar composiciones (preferentemente que contengan anticuerpos) a partir de suero, plasma, sangre, calostro, etc. para las terapias de inmunizacion pasiva. Tambien se pueden preparar composiciones de anticuerpos que incluyan anticuerpos monoclonales y/o anti-idiotipos usando metodos conocidos. Los anticuerpos quimericos incluyen regiones constantes de origen humano de cadenas tanto pesadas como ligeras, y regiones variables de origen murino que son especlficas del antlgeno (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1984, 81 (21 ):6851-5; LoBuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1989, 86(11): 4220-4; Boulianne et al., Nature, 1984, 312(5995): 6436). Los anticuerpos humanizados sustituyen la region constante y marco (FR) murina (de la region variable) con los homologos humanos (Jones et al., Nature, 1986, 321(6069): 522-5; Riechmann et al., Nature, 1988, 332(6162): 3237; Verhoeyen et al., Science, 1988, 239(4847): 1534-6; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1989, 86(24):10029-33; Daugherty et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19(9): 2471-6). Como alternativa, se pueden usar ciertas cepas de raton que han sido disenadas geneticamente para producir anticuerpos que son casi completamente de origen humano; tras la inmunizacion, se recogen los linfocitos B de estos ratones y se inmortalizan para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Bruggeman y Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 1997, 8(4): 455-8; Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol., 1995; 13(1): 65-93; Lonberg et al., Nature, 1994, 368: 856-9; Taylor et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:6287-95). Las composiciones de anticuerpos y los fragmentos de las mismas, por ejemplo, scFv, Fab, F(ab')2 o Fv u otras formas modificadas de los mismos, se pueden administrar a un receptor en forma de suero, plasma, sangre, calostro y similares. Sin embargo, los anticuerpos tambien pueden aislarse del suero, plasma, sangre, calostro, y similares, usando metodos conocidos para su uso posterior en una forma concentrada o reconstituida, tal como, por ejemplo, soluciones de lavado, apositos impregnados y/o agentes topicos, y similares. Los preparados de inmunizacion pasiva pueden ser particularmente ventajosos para el tratamiento de la enfermedad sistemica aguda o la inmunizacion pasiva de animales jovenes que no hayan recibido los niveles adecuados de inmunidad pasiva a traves del calostro materno. Los anticuerpos utiles para la inmunizacion pasiva tambien pueden ser utiles para conjugarse con diversos farmacos o antibioticos que se podrlan dirigir directamente a las bacterias que expresan durante una infeccion sistemica o localizada un polipeptido de la presente divulgacion o un polipeptido que tenga un epltopo relacionado estructuralmente con un epltopo presente en un polipeptido de la presente divulgacion.
Se dispone de modelos animales, en particular, de modelos de raton, para evaluar experimentalmente las composiciones de la presente invencion. Estos modelos de raton son modelos comunmente aceptados para el estudio de las enfermedades humanas causadas por miembros del genero Staphylococcus y S. aureus en particular. En aquellos casos en los que los miembros del genero Staphylococcus causan la enfermedad en un animal, por ejemplo, en una vaca, el huesped natural se puede usar para evaluar experimentalmente las composiciones de la presente invencion.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona metodos de deteccion del anticuerpo que se une especlficamente a los polipeptidos de la presente divulgacion. Estos metodos son utiles, por ejemplo, en detectar si un animal tiene anticuerpo que se une especlficamente a los polipeptidos de la presente divulgacion. y diagnosticar si un animal puede tener una afeccion causada por un microbio que exprese los polipeptidos descritos en el presente documento o que exprese polipeptidos que comparten epltopos con los polipeptidos descritos en el presente documento. Dichos sistemas de diagnostico pueden estar en forma de kit. Los metodos incluyen poner en contacto un anticuerpo con un preparado que incluye un polipeptido de la presente divulgacion para producir una mezcla. El anticuerpo puede estar presente en una muestra biologica, por ejemplo, sangre, leche o calostro. El metodo incluye ademas la incubacion de la mezcla en condiciones que permitan que el anticuerpo se una especlficamente al polipeptido para formar un complejo de polipeptido:anticuerpo. Como se usa en el presente
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documento, la expresion complejo de polipeptido:anticuerpo se refiere al complejo que se produce cuando un anticuerpo se une especificamente a un polipeptido. El preparado que incluye los polipeptidos de la presente divulgacion puede incluir tambien reactivos, por ejemplo, un tampon, que proporcionen las condiciones adecuadas para la formacion del complejo de polipeptido:anticuerpo. A continuation, se detecta el complejo de polipeptido:anticuerpo. La detection de anticuerpos es conocida en la tecnica, y puede incluir, por ejemplo, inmunofluorescencia o peroxidasa. Los metodos de deteccion de la presencia de anticuerpos que se unen especificamente a polipeptidos de la presente divulgacion se pueden usar en diversos formatos que se han usado para detectar anticuerpos, incluyendo el radioinmunoensayo y el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas.
La presente divulgacion tambien proporciona un kit para la deteccion de anticuerpo que se une especificamente a los polipeptidos de la presente divulgacion. El anticuerpo detectado se puede obtener de un animal sospechoso de tener una infection causada por un microbio gram positivo, mas preferentemente, un miembro de la familia Micrococcaceae, preferentemente, Staphylococcus sp., mas preferentemente, S. aureus; Streptococcus sp., Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Enterococus sp., Erysipelothrix sp., Kytococcus sp., Listeria sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. y Erysipelothrix sp.
El kit incluye al menos uno de los polipeptidos de la presente divulgacion o un numero de polipeptidos que sea un numero entero superior a 1 (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, etc.), en un material de envasado adecuado en una cantidad suficiente para al menos un ensayo. Opcionalmente, tambien se incluyen otros reactivos tales como tampones y soluciones necesarios para la practica de la divulgacion. Por ejemplo, un kit puede incluir tambien un reactivo que permita la deteccion de un anticuerpo que se una especificamente a un polipeptido de la presente divulgacion, tal como un anticuerpo secundario marcado de forma detectable disenado para unirse especificamente a un anticuerpo obtenido de un animal. Normalmente, tambien se incluyen instrucciones de uso de los polipeptidos envasados. Como se usa en el presente documento, la expresion "material de envasado" se refiere a una o mas estructuras fisicas usadas para albergar el contenido del kit. El material de envasado se construye mediante metodos bien conocidos, en general, para proporcionar un ambiente esteril, exento de contaminantes. El material de envasado puede tener una etiqueta que indique que los polipeptidos se pueden usar para la deteccion de anticuerpo que se una especificamente a los polipeptidos de la presente divulgacion. Ademas, el material de envasado contiene instrucciones que indican como se emplean los materiales del kit para detectar el anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el termino "envase" se refiere a un recipiente, tal como de vidrio, plastico, papel, papel de aluminio, y similares, capaz de contener dentro de Kmites fijos los polipeptidos y otros reactivos, por ejemplo, un anticuerpo secundario. Asi pues, por ejemplo, un envase puede ser un pocillo de una placa de microvaloracion en el que se hayan fijado cantidades en microgramos de polipeptidos. Un envase tambien puede contener un anticuerpo secundario. Las "instrucciones de uso" normalmente incluyen una expresion tangible que describe la concentration de reactivo o al menos un parametro del metodo de ensayo, tal como las cantidades relativas de reactivo y de muestra que se han de mezclar, los periodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas de reactivo/muestra, la temperatura, las condiciones de tampon, y similares.
Ejemplos
En la medida en que los ejemplos no se refieren a la composition definida en las reivindicaciones, se incluyen en el presente documento meramente a efectos de referencia.
Ejemplo 1
Preparation de las proteinas reguladas por el hierro Escala de laboratorio
Se evaluaron composiciones derivadas de diferentes cepas de Staphylococcus aureus incluyendo nuevas proteinas expresadas bajo restriction de hierro y/u otros grados de quelacion de iones metalicos para determinar la eficacia contra un desafio virulento en ratones. La eficacia de la composicion se evaluo mediante la recopilacion de datos sobre los siguientes parametros: (1) la eficacia de cada composicion para proporcionar protection homologa y heterologa contra un desafio virulento vivo en ratones; (2) la eficacia de cada composicion para reducir las lesiones cutaneas necroticas; y (3) la eficacia de las composiciones derivadas de Staphylococcus cultivadas en condiciones de saturation y de empobrecimiento de hierro para proporcionar proteccion.
Las cepas de Staphylococcus aureus evaluadas en este estudio procedian de tres especies de animales; aviar, humana y bovina. El aislado SAAV1 aviar era un aislado de campo procedente de una multitud de pavos enfermos que tenian un alto grado de osteomielitis y sinovitis. Los aislados bovinos (cepa 1477 y cepa 2176) se obtuvieron de dos grupos lecheros comerciales diferentes que tenian una alta incidencia de mastitis clinica. El aislado humano se obtuvo de la ATCC (cepa 19636), y procedia de un paciente que tenia osteomielitis clinica.
Se prepararon reservas de semillas maestras de cada aislado mediante la inoculation del aislado apropiado en 200 ml de caldo de soja triptico (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI) que contenia 2,2-dipiridilo 300 pM (Sigma- Aldrich St. Louis, MO). El cultivo se desarrollo mientras se agitaba a 200 rpm durante 6 horas a 37 °C, y se recogio
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por centrifugacion a 10.000 x g. Se volvio a suspender el sedimento bacteriano en 100 ml de caldo TSB que contenla glicerol al 20 %, y se dispenso de forma esteril en viales criogenicos de 2 ml (1 ml por vial) y se almaceno a -90 °C hasta su uso.
Se expandio cada reserva de semillas maestras en una semilla de trabajo. Se inoculo un vial de cada aislado de semilla maestra en 200 ml de caldo de soja trlptico (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI) que contenla 2,2-dipiridilo
1.000 pM (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). El cultivo se desarrollo mientras se agitaba a 200 rpm durante 6 horas a 37 °C, y se recogio por centrifugacion a 10.000 x g. Se resuspendio el sedimento bacteriano en 100 ml de caldo TSB que contenla glicerol al 20 %, y se dispenso de forma esteril en viales criogenicos de 2 ml (1 ml por vial) y se almaceno a -90 °C hasta su uso. La semilla de trabajo se uso para la produccion de composiciones enriquecidas con protelnas de membrana reguladas por el nivel de hierro, que inclulan protelnas de membrana reguladas por el nivel hierro.
Todas las cepas estaban adaptadas para crecer en medios altamente empobrecidos en hierro (es decir, medios que contenlan niveles muy bajos de hierro libre). Esto se realizo mediante el subcultivo de las bacterias en TSB que contenla concentraciones crecientes de 2,2-dipiridilo (300-1.600 pM).
Se prepararon protelnas a partir de las bacterias de la siguiente manera. Se cultivaron las bacterias a partir de las reservas de semillas de trabajo congeladas mediante el subcultivo en 25 ml de medios empobrecidos en hierro (que contenlan 2,2'-di piridilo 1.000 pM) y medios saturados de hierro, y luego se incubaron a 37 °C con agitacion a 400 rpm. Tras 12 horas de incubacion, se transfirieron 5 ml de cada cultivo a 500 ml de medios empobrecidos en hierro o medios saturados de hierro previamente incubados a 37 °C. Se incubaron los cultivos durante 8 horas a 37 °C con agitacion a 100 rpm, y luego se sedimentaron las celulas mediante centrifugacion a 10.000 x g durante 20 minutos. Se volvieron a suspender los sedimentos bacterianos en 100 ml de solucion salina fisiologica esteril y se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos. Luego, se volvieron a suspender los sedimentos en 45 ml de solucion salina tamponada con Tris, pH 7,2 (TBS; Tris 25 mM, NaCl 150 mM) y se dispensaron las suspensiones bacterianas resultantes en forma de allcuotas de 9 ml en 5 tubos individuales. Se anadio un mililitro de TBS que contenla 50 unidades de lisostafina (Sigma, St. Louis, MO) a cada tubo para dar un volumen final de 5 unidades/ml. Tras la incubacion a 37 °C durante 30 minutos con agitacion a 200 rpm, se anadio 1 ml de TBS que contenla 0,1 mg de lisozima (Sigma) a cada tubo. A continuacion, se incubaron las suspensiones bacterianas durante otros 45 minutos con agitacion a 200 rpm. A continuacion, se centrifugaron las suspensiones a 3.050 x g durante 12 minutos a 4 °C para sedimentar los residuos celulares de gran tamano. Se recogieron los sobrenadantes mediante aspiracion sin perturbar el sedimento. Se centrifugo el sobrenadante a 39.000 x g durante 2,5 horas. Se volvieron a suspender los sedimentos resultantes que contenlan las protelnas en 200 pl de tampon Tris, pH 7,2, sin solucion salina. Se combinaron la solucion de protelnas para cada aislado para un volumen total de 1 ml y se almacenaron a -90 °C.
Se fraccionaron de tamano los extractos enriquecidos en protelnas derivados de S. aureus en geles de SDS-PAGE usando un gel de apilamiento al 4 % y gel de resolucion al 10 %. Se prepararon las muestras para la electroforesis combinando 10 pl de muestra con 30 pl de tampon reductor de muestra SDS (Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, glicerol al 20 %, SDS al 2 %, p-mercaptoetanol al 5 %) y se hirvieron durante 4 minutos. Se sometieron las muestras a electroforesis a corriente constante de 18 mA durante 5 horas a 4 °C usando una fuente de alimentacion de celulas Protein II xi (BioRad Laboratories, Richmond, CA, modelo 1000/500). Se estimo el peso molecular de cada protelna individual observada visualmente en el gel de SDS-PAGE usando un densitometro GS-800 (BioRad) usando un marcador del peso molecular de intervalo amplio como patron de referencia (BioRad).
Al cultivar los patrones de SDS-PAGE de las protelnas de cada aislado en presencia de dipiridilo 1.600 pM mostraron un patron de expresion de la protelna muy diferente en comparacion con la misma cepa cultivada en presencia de dipiridilo 300 pM. Por ejemplo, cuando se cultivo en dipiridilo 300 pM, el aislado de SAAV1 dio lugar a protelnas reguladas por el nivel de metal de 90 kDa, 84 kDa, 72 kDa, 66 kDa, 36 kDa, 32 kDa y 22 kDa, mientras que el cultivo en dipiridilo 1600 pM dio lugar a protelnas reguladas por el nivel de metal de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y 33,0 kDa. Del mismo modo, cuando se cultivo en dipiridilo 300 pM, el aislado 19636 dio lugar a protelnas de 42 kDa y 36 kDa, mientras que el crecimiento en dipiridilo 1.600 pM dio lugar a protelnas reguladas por el nivel de metal de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y
33.0 kDa. Todas las condiciones, incluyendo el crecimiento en medios saturados de hierro, dieron como resultado la expresion de las siguientes protelnas que, presumiblemente, no estaban reguladas por el nivel de metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa.
Ademas, el crecimiento de las diferentes cepas de S. aureus en dipiridilo 1.600 pM dio como resultado patrones de expresion de protelnas similares. Las composiciones enriquecidas en protelnas de membrana reguladas por el nivel de hierro del aislado aviar (SAAV1) inclulan protelnas con pesos moleculares de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y 33,0 kDa. Los pesos moleculares de las protelnas del aislado ATCC 19636 resultaron ser esencialmente identicos a los del aislado aviar. Ambos aislados bovinos, cuando se cultivaron con 2,2- dipiridilo 1.600 pM, expresaron perfiles de bandas similares a los de los aislados aviar y ATCC para la mayorla de las protelnas (87,73 kDa, 54,53 kDa, 37,7 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y 33,0 kDa). Sin embargo, ninguno de los aislados bovinos produjo la protelna de 38,42 kDa observada con los aislados aviar y ATCC, y los aislados bovinos expresaron tres protelnas (80,46 kDa, 65,08 kDa y 31,83 kDa) no observadas con las cepas aviar y ATCC (vease la
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Figura 1 y la Tabla 10). Todas las condiciones dieron como resultado la expresion de las siguientes protelnas que no estaban reguladas por el nivel de metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa.
Tabla 10. Pesos moleculares de los polipeptidos regulados por el nivel de metal obtenidos de aislados de _________________________________Staphylococcus aureus________________________________
- SAAV1 aviar
- 19636 humana 1477 bovina 2176 bovina
- 87,73
- 87,73
- 87,73
- 87,73
- -
- -
- 80,46 80,46
- -
- -
- 65,08 65,08
- 54,53
- 54,53
- 54,53
- 54,53
- 38,42
- 38,42
- - -
- 37,37
- 37,37
- 37,37
- 37,37
- 35,70
- 35,70
- 35,70
- 35,70
- 34,91
- 34,91
- 34,91
- 34,91
- 33,0
- 33,0
- 33,0
- 33,0
- 31,83 31,83
Curiosamente, no hubo diferencia en los perfiles de protelnas examinados por SDS-PAGE entre el sobrenadante aclarado y el sedimento bacteriano tras tratar las bacterias con lisostafina/lisozima. Tanto el sedimento bacteriano extraldo como el sobrenadante resultaron tener exactamente los mismos perfiles de protelnas examinados mediante SDS-PAGE. Esta misma observacion tambien se observo al alterar las celulas bacterianas usando un homogeneizador Avestin a 206.842,72 kPa (30.000 psi). El sedimento bacteriano resultante, tras la centrifugacion a baja velocidad, resulto tener un perfil de protelnas identico al del sobrenadante aclarado tras la centrifugacion a alta velocidad a 30.000 x g durante 2,0 horas a 4 °C.
Ejemplo 2
Preparacion de las composiciones inmunizantes derivadas de Staphylococcus aureus
Se usaron las protelnas del aislado ATCC humana 19636 y del aislado bovino 1477, cultivadas en condiciones de empobrecimiento de hierro y preparadas como se describe en el Ejemplo 1, para formular dos composiciones de vacuna. Las protelnas del aislado ATCC tenlan pesos moleculares de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y 33,0 kDa, mientras que el aislado bovino expreso protelnas que tenlan pesos moleculares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa, 33,0 kDa y 31,83. Cada composicion tambien contenla las siguientes protelnas que no estaban reguladas por el nivel de metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa. Se prepararon vacunas de reserva a partir de las dos cepas mediante la emulsion de cada suspension acuosa de protelnas (500 pg de protelna total/ml) en un adyuvante comercial (EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) usando un recipiente de homogenizacion IKA Ultra Turrax T-50 (IKA, Cincinnati, OH), dando una dosis final de 50 pg de protelna total en un volumen inyectable 0,1 ml con una concentracion de adyuvante del 22,5 % vol/vol. Como vacuna de control, se preparo una composicion de protelna a partir del aislado bovino 1,477 cultivado en condiciones de saturacion de hierro (TSB suplementado con cloruro ferrico 300 pM) como se describe en el Ejemplo 1. Se preparo una vacuna de placebo sustituyendo la solucion salina fisiologica por la suspension acuosa de protelnas en el protocolo anterior.
Ejemplo 3
Vacunacion de ratones
Se distribuyeron en partes iguales setenta (N = 70) ratones hembra CF-1 obtenidos en Harlan Breeding Laboratories (Indianapolis, IN) con un peso de 16-22 gramos en 7 grupos (10 ratones/grupo). Los animales fueron alojados en jaulas de policarbonato para ratones (Ancore Corporation, Bellmore, NY). Se uso una sola jaula por cada grupo de tratamiento, y se suministraron comida y el agua a voluntad a todos los ratones. Todos los ratones fueron vacunados por via intraperitoneal con 0,1 ml de la composicion apropiada dos veces en intervalos de 14 dlas de la siguiente manera:
Grupo 1: vacunado con placebo.
Grupo 2: vacunado con protelnas de ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro.
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Grupo 3: vacunado con placebo.
Grupo 4: vacunado con proteinas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro.
Grupo 5: vacunado con proteinas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro.
Grupo 6: vacunado con proteinas ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro.
Grupo 7: vacunado con 1477 bovino con FeCl3, en el que “1477 bovino con FeCb” se refiere a proteinas
obtenidas de 1477 bovino cultivado en TSB suplementado con cloruro ferrico 300 pM.
Ejemplo 4
Preparacion del organismo de desafio
Se usaron las cepas ATCC 19636 y la cepa 1477 de Staphylococcus aureus descritas anteriormente como organismos de desafio. En resumen, se sembraron en estrias los aislados procedentes de las reservas congeladas (descritas anteriormente) en placas de agar de sangre y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. Se subcultivo una sola colonia de cada aislado en 50 ml de caldo de soja triptico (Difco) que contenia 2,2'-dipi ridilo 1.600 pM. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 6 horas mientras se centrifugaban a 200 rpm, luego se centrifugaron a
10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar las bacterias. Se lavaron los sedimentos bacterianos dos veces mediante centrifugacion en TBS a 4 °C. Se volvieron a suspender los sedimentos finales en TBS a una densidad optica del 42 % de transmitancia (T) a 562 nm en un volumen de aproximadamente 25 ml de TBS y se usaron para el desafio. Justo antes del desafio, se diluyo en serie 1 ml de estas suspensiones bacterianas y se sembro en agar para enumerar el numero de unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis de raton.
Ejemplo 5
Desafio
Catorce dias despues de la segunda vacunacion, se desafiaron subcutaneamente los ratones de todos los grupos (1-7) en la parte posterior del cuello con 0,1 ml del organismo apropiado. Los siete grupos de ratones se desafiaron de la siguiente manera:
Grupo 1: (vacunado con placebo): desafiado con ATCC 19636.
Grupo 2: (vacunado con proteinas de ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro): desafiado con ATCC 19636.
Grupo 3: (vacunado con placebo): desafiado con 1477 bovino.
Grupo 4: (vacunado con proteinas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion con 1477 bovino.
Grupo 5: (vacunado con proteinas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion con ATCC 19636.
Grupo 6: (vacunado con proteinas ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion con 1477 bovino.
Grupo 7: (vacunado con 1477 bovino con FeCE): desafiado con 1477 bovino.
Como se determino mediante el protocolo de enumeracion descrito en el Ejemplo 4, la concentracion de 19636 de S. aureus usada para el desafio fue de 1,35 x 108 UFC por dosis de raton, y la concentracion de 1477 de S. aureus usada para el desafio fue de 1,65 x 108 UFC por dosis de raton. Se registraron la morbilidad, la mortalidad y la patologia macroscopica diariamente durante 7 dias tras el desafio.
Al comparar los ratones desafiados con el aislado ATCC 19636, el 70 % de los ratones del Grupo 1 vacunado con placebo murio en los 7 dias de desafio (Tabla 11 y la Fig. 2). Esto demostro que la cepa 19636 causo una alta tasa de mortalidad en los ratones a la dosis administrada. En contraste con los ratones del Grupo 1, solo el 10 % de los ratones del Grupo 2 murio en los 7 dias posteriores al desafio. Estos resultados ilustraban que los ratones desafiados con la cepa 19636 fueron protegidos de manera significativa por la vacunacion con la composicion 19636 (p = 0,020, prueba exacta de Fischer). Ademas, un analisis de Kaplan-Meier de los datos del tiempo transcurrido hasta la muerte indico que la vacuna proporciono proteccion significativa (p = 0,0042, prueba de rango logaritmico) contra el desafio homologo (Fig. 3). Ademas, solo el 20 % de los ratones del Grupo 5 murio en los 7 dias de desafio, lo que indica que la composicion 1477 bovina ofrecio una proteccion significativa contra el desafio con la cepa ATCC 19636 (p = 0,015, prueba de rango logaritmico para la mortalidad). Cuando se analizaron los datos mediante una curva de supervivencia de Kaplan-Meier y la prueba de rango logaritmico (Fig. 4), se determino que la proteccion contra la mortalidad resulto ser significativa (p = 0,015, prueba de rango logaritmico para la mortalidad), lo que indica que la composicion de vacuna derivada de la cepa 1477 proporciono proteccion heterologa contra el desafio con la cepa 19636.
de hierro): desafiado de hierro): desafiado de hierro): desafiado
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Tabla 11. Mortalidad de los ratones vacunados y no vacunados tras el desaflo con Staphylococcus aureus (aislado ___________________________ATCC ^ 19636 humano y aislado^ 1477 bovino).___________________________
- Grupos
- N.° de ratones N.° de muertes Porcentaje de mortalidad (%)
- Grupo 1* (Placebo, desaflo con ATCC 19636)
- 10 7/10 70
- Grupo 2* (ATCC 19636, desaflo homologo)
- 10 1/10 10
- Grupo 3 (Placebo, desaflo con 1477 bovino)
- 10 2/10 20
- Grupo 4* (1477 bovino, desaflo homologo)
- 10 1/10 10
- Grupo 5* (1477 bovino, desaflo heterologo)
- 10 2/10 20
- Grupo 6* (ATCC 19636, desaflo heterologo)
- 10 0/10 0
- Grupo 7* (1477 bovino con FeCb, desaflo con 1477 bovino)
- 10 2/10 20
- *Grupo 1: (vacunado con placebo/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 2: (vacunado con protelnas de ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 3: (vacunado con placebo/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 4: (vacunado con protelnas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 5: (vacunado con protelnas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 6: (vacunado con protelnas ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 7: (vacunado con 1477 bovino con FeCb/desafiado con 1477 bovino)
Al comparar los ratones inoculados con el aislado 1477 bovino, solo el 20 % de los ratones del grupo vacunado con placebo (Grupo 3) murio en los 7 dlas de desaflo. Sin embargo, el desaflo con el aislado 1477 bovino provoco el desarrollo de lesiones cutaneas necroticas en 6 (75 %) de los ratones supervivientes del Grupo 3. Se midieron estas lesiones, y el tamano medio de las lesiones en los ratones que sobrevivieron fue de 18,5 mm (Tabla 12). Por el contrario, el 20 % de los ratones del Grupo 4 murio en los 7 dlas de desaflo, pero solo tres (38 %) de los ratones supervivientes desarrollaron lesiones (diametro medio de 2,7 mm). Estos resultados indican que la composicion de 1477 bovino ofrecio protection homologa significativa contra el desarrollo de lesiones en los ratones desafiados con la cepa bovina 1477 (p = 0,009, prueba t de Student). Ademas, la vacunacion con la composicion de ATCC 19636 protegio contra el desaflo con la cepa 1477, ya que ningun raton del Grupo 6 murio y solo tres (30 %) de los ratones desarrollaron lesiones cutaneas (diametro medio de 3,7 mm). En conjunto, la reduction de la mortalidad y/o del desarrollo de lesiones en los ratones de los Grupos 5 y 6 demuestra la importante naturaleza protectora cruzada de las composiciones derivadas de las cepas 19636 y 1477 (p = 0,012, prueba t de Student basada en el tamano de las lesiones). En demostracion de la eficacia de la composicion en comparacion con las protelnas no reguladas por el nivel de hierro, el 20 % de los ratones del Grupo 7 murio y 4 de los sobrevivientes desarrollaron lesiones cutaneas (diametro medio de 15,8 mm). Los ratones del Grupo 7 demostraron cierto grado de proteccion mediante la vacunacion con las protelnas del aislado 1477, ya que menos ratones desarrollaron lesiones en comparacion con el Grupo 3 vacunado con placebo. Sin embargo, las lesiones cutaneas observadas en los ratones del Grupo 7 fueron mas frecuentes y de un diametro mayor que las lesiones de los ratones del Grupo 4, lo que indica que, en relation con las protelnas aisladas de celulas cultivadas en condiciones de saturation de hierro, las protelnas aisladas de bacterias cultivadas en condiciones de restriction de hierro ofrecieron una proteccion superior contra un desaflo identico.
Tabla 12. Induction de lesiones necroticas en ratones siete dlas despues del desaflo con Staphylococcus aureus __________________________(aislado ATCC 19636 y/o aislado 1477 bovino)__________________________
- Diametro de las lesiones (millmetros) por raton
- Grupo 1
- Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7
- Sin lesiones
- Sin lesiones
- 26 5 5 5 25
- Sin lesiones
- Sin lesiones
- 25 2 Sin lesiones 5 25
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- Diametro de las lesiones (millmetros) por raton
- Sin lesiones
- Sin lesiones
- 24 1 Sin lesiones 1 10
- Muerto
- Sin lesiones 24 Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones 3
- Muerto
- Sin lesiones 7 Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones
- Muerto
- Sin lesiones 5 Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones
- Muerto
- Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones
- Muerto
- Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones Sin lesiones
- Muerto
- Sin lesiones Muerto Sin lesiones Muerto Sin lesiones
- Muerto
- Muerto
- Muerto
- Muerto
- Muerto
- Muerto
- Sin lesiones
- Muerto
- Diametro medio de las lesiones (mm) entre los ratones supervivientes
- 0
- 0
- 18,5 2,7 5 3,7 15,8
- *Grupo 1: (vacunado con placebo/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 2: (vacunado con protelnas de ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 3: (vacunado con placebo/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 4: (vacunado con protelnas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 5: (vacunado con protelnas 1477 bovinas expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con ATCC 19636) *Grupo 6: (vacunado con protelnas ATCC 19636 expresadas en condiciones de restriccion de hierro/desafiado con 1477 bovino) *Grupo 7: (vacunado con 1477 bovino con FeCl3/desafiado con 1477 bovino)
La naturaleza de proteccion cruzada de las protelnas observadas en el estudio de desaflo de los ratones se apoya en los pesos moleculares similares de las protelnas de las cepas de S. aureus que se describen en el Ejemplo 1 (Figura 1). Aunque no hubo diferencias apreciables en el perfil de SDS-PAGE de las protelnas de los aislados de origen bovino, en concreto, la ausencia de una protelna de 38,4 kDa y la presencia de 3 protelnas adicionales, las protelnas de las dos cepas 1477 y de ATCC 19636 generaron proteccion heterologa. Estos resultados indican que las protelnas similares entre las cepas 19636 y 1477 probablemente son responsables de la proteccion cruzada observada en los Grupos 5 y 6. Por el contrario, los perfiles de protelnas de la cepa 1477 cultivada en condiciones de empobrecimiento de hierro y de saturacion de hierro son diferentes. Esas protelnas aisladas en condiciones de empobrecimiento de hierro son mas protectoras que las protelnas aisladas en condiciones de saturacion de hierro, demostrado por la reduccion del desarrollo de lesiones entre los ratones del Grupo 4 en comparacion con los ratones del Grupo 7.
Ejemplo 6
En los mamlferos, se ha demostrado que la respuesta a la lesion tisular o la infeccion bacteriana produce una respuesta inflamatoria aguda. Esta respuesta aumenta la permeabilidad capilar y la infiltracion fagocltica que da lugar a signos cllnicos reconocidos como inflamacion; hinchazon, fiebre, dolor y enrojecimiento, que, si no se controlan, pueden conducir a la muerte. La activacion de factores humorales y la liberacion de citocinas median acontecimientos sistemicos conocidos colectivamente como la respuesta de protelnas de fase aguda que genera una cascada de acontecimientos fisiologicos y bioqulmicos. La duracion de esta respuesta esta directamente relacionada con la gravedad de la lesion y la magnitud de la infeccion sistemica. Se ha documentado bien que, durante la sepsis bacteriana, la cirugla mayor, las quemaduras y otros traumatismos corporales, se produce una alteracion en la concentracion de una serie de iones metalicos en suero tales como hierro, cobre y cinc. Por ejemplo, durante la fase aguda de una infeccion, se produce una reduccion de los niveles plasmaticos de hierro y cinc, y un aumento del cobre. La alteracion de estos iones metalicos traza en suero puede afectar directamente a la gravedad o a la progresion de cualquier infeccion bacteriana.
En este estudio, se examino la expresion de protelnas de Staphylococcus aureus en diversas condiciones de restriction de iones metalicos para imitar la expresion de nuevas protelnas que pueden expresarse durante la invasion sistemica. Las cepas de Staphylococcus aureus evaluadas en este estudio procedlan de muestras cllnicas de tres especies diferentes de animales; aviar (cepa SAAV1), humana (cepa 19636) y bovinas (cepas 1477 y 2176). En resumen, se prepararon cultivos de cada aislado de las reservas de semillas maestras en 200 ml de caldo de soja trlptico (TSB). Se dejo crecer cada cultivo mientras se agitaba a 200 rpm durante 6 horas a 37 °C. Se transfirieron diez ml de cada cultivo a 500 ml de TSB empobrecido que contenla uno de los cuatro quelantes de iones metalicos; 2,2-dipiridilo (DP), 2-piridilmetil-etilendiamina (TPEN), catequina y naringenina (todos obtenidos de
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Sigma, St. Louis, MO). Ademas cada cultivo tambien se cultivo en medios saturados en cationes que contenlan cloruro ferrico, cloruro de cinc y/o cloruro de cobre preparados a concentraciones de 300 pM. Los quelantes de iones metalicos se usaron a la siguiente concentracion: el 2,2-dipiridilo (800 pM), la catequina y la naringenina se usaron a 300 pM, y la 2-piridilmetil-etilendiamina se uso a una concentracion de 100 pM. Los cultivos se cultivaron con cada quelante durante 8 horas, momento en el que el cultivo se subcultivo una segunda vez durante 12 horas mas. Se subcultivo cada cultivo durante tres pasadas consecutivas a intervalos de 12 horas. Al final de la tercera pasada, cada cultivo se recogio mediante centrifugacion a 10.000 x g durante 20 minutos. Se lavo cada cultivo dos veces mediante centrifugacion a 10.000 x g y se volvio a suspender en 20 ml de solucion salina tamponada con Tris, pH 7,2 a 4 °C.
Se volvio a suspender cada sedimento bacteriano en 45 ml de solucion salina tamponada con Tris, pH 7,2 (Tris 25 mM y NaCl 150 mM) y se dispensaron las suspensiones bacterianas resultantes como allcuotas de 9 ml en 5 tubos individuales, veinte tubos en total. Se anadio un mililitro de TBS que contenla 50 unidades de lisostafina (Sigma, St. Louis, MO) a cada tubo para dar una concentracion final de 5 unidades/ml. Tras la incubacion a 37 °C durante 30 minutos con agitacion a 200 rpm, se anadio 1 ml de TBS que contenla 0,1 mg de lisozima (Sigma) a cada tubo. A continuacion, se incubaron las suspensiones bacterianas durante 45 minutos con agitacion a 200 rpm. Despues, se centrifugaron las suspensiones a 3.050 x g durante 12 minutos a 4 °C para sedimentar los restos celulares de gran tamano. Se recogieron los sobrenadantes por aspiracion sin perturbar el sedimento. Luego se centrifugo el sobrenadante a 39.000 x g durante 2,5 horas. Se volvieron a suspender los sedimentos resultantes, enriquecidos en protelnas de membrana reguladas por el nivel de metal, en 200 pl de tampon de Tris, pH 7,2. Se combinaron las soluciones de protelna para cada aislado para un volumen total de 1 ml y se almacenaron a -90 °C.
Las protelnas obtenidas de los aislados SAAV1, 19636, 1477 y 2176 de S. aureus cultivadas en condiciones de empobrecimiento de hierro, cinc y cobre inclulan polipeptidos regulados por el nivel de metal.
Los extractos celulares, derivados de cada aislado se fraccionaron de tamano en geles de SDS-PAGE usando un gel de apilamiento al 4 % y gel de resolucion al 10 %. Se prepararon las muestras para la electroforesis combinando 10 pl de muestra con 30 pl de tampon reductor de muestra SDS (Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, glicerol al 20 %, SDS al 2 %, mercaptoetanol al 5 %) y se hirvieron durante 4 minutos. Se sometieron las muestras a electroforesis a corriente constante de 18 mA durante 5 horas a 4 °C usando una fuente de alimentacion de celulas Protein II xi (BioRad Laboratories, Richmond, CA, modelo 1000/500).
Los patrones de SDS-PAGE de las protelnas cultivadas en quelacion de cinc y/o de cobre mostraron patrones de bandas unicos en todos los aislados que eran diferentes en comparacion con los mismos aislados cultivados en condiciones de restriccion de hierro en presencia de 2,2'-dipiridilo. Por ejemplo, cuando se cultivo el aislado 19636 en condiciones de restriccion de hierro o en presencia del quelante de 2,2'-dipiridilo, se expresaron protelnas unicas reguladas por el nivel de hierro en las regiones de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa y 33,0 kDa. Estas protelnas se regularon por reduccion cuando el aislado se cultivo en presencia de cloruro ferrico. Sin embargo, cuando el mismo aislado se cultivo en presencia de quelante de cinc y de cobre, se expresaron nuevos subconjuntos de protelnas con respecto a las protelnas expresadas en condiciones de restriccion de hierro; nuevas protelnas que tenlan pesos moleculares de aproximadamente 115 kDa, 88 kDa, 80 kDa, 71 kDa, 69 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 29 kDa y 27 kDa. Ademas, se expreso una protelna de 87,73 kDa en condiciones de restriccion de hierro o de restriccion de cobre, pero no en condiciones de restriccion de cinc. Las protelnas expresadas en condiciones de restriccion de hierro parecieron regularse por reduccion cuando el crecimiento se produjo en condiciones bien de restriccion de hierro y/o de restriccion de cobre, pero no se inactivaron por completo segun lo observado al cultivar el aislado en cloruro ferrico.
Parece que se expresan nuevas protelnas cuando el organismo se cultiva en condiciones de restriccion de cobre y/o de restriccion de cinc, que no se expresan cuando el mismo aislado se cultiva en condiciones de restriccion de hierro. Dado que los metales de transicion son usados por los organismos para crear enzimas que catalicen las diversas reacciones bioqulmicas, los iones metalicos pueden desempenar un papel vital en la supervivencia microbiana durante una infeccion sistemica. Es quizas por esta razon que, durante la sepsis, se produce una reduccion transitoria de la disponibilidad de estos metales de transicion, haciendo que no esten disponibles para el crecimiento del organismo. Estas nuevas protelnas podrlan aumentar muy bien la eficacia protectora de la composicion existente cultivada en condiciones de restriccion de hierro, porque tambien pueden ser expresadas por las bacterias en las condiciones de restriccion de iones metalicos experimentadas durante la invasion sistemica.
Ejemplo 7
Las composiciones de la presente invention tambien se pueden producir en condiciones comerciales a gran escala. Fermentacion
Se uso un vial criogenico de la semilla de trabajo (2 ml en 109 UFC/ml) como se describe en el Ejemplo 1 para inocular 500 ml de caldo de soja trlptico (TSB) sin dextrosa (Difco) previamente calentado hasta 37 °C que contenla 0,125 g/l de 2,2-dipiridilo (Sigma), 2,7 gramos de extracto de levadura BiTek (Difco) y glicerol (3 % vol/vol). Se
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incubo el cultivo a 37 °C durante 12 horas mientras se agitaba a 200 rpm, momento en el que se uso para inocular 2 litros de los medios anteriores y se dejo crecer durante 4 horas mas a 37 °C. Se uso este cultivo para inocular un fermentador de sobremesa de 20 litros de Virtis (Virtis, Gardiner, NY) cargado con 13 litros de los medios anteriormente descritos. Se mantuvo el pH constante entre 6,9 y 7,1 mediante valoracion automatica con NaOH al 50 % y HCl al 10 %. Se ajusto la velocidad de agitacion a 400 rev/minuto, y se aireo el cultivo con 11 litros de aire/minuto a 37 °C. Se controlo la formacion de espuma automaticamente mediante la adicion de 11 ml de antiespumante (Mazu DF 204 Chem/Serv, Minneapolis, MN). Se dejo crecer el cultivo de forma continua en estas condiciones durante 4 horas, y despues se bombeo de forma esteril en un fermentador de 150 litros (W. B. Moore, Easton, PA). Se cargo el fermentador con 120 litros de caldo de soja trlptico sin dextrosa (3.600,0 gramos), extracto de levadura BiTek (600 gramos), glicerol (3.600 ml), 2,2-dipiridilo (3,0 gramos) y antiespumante Mazu DF 204 (60 ml). Los parametros de la fermentacion fueron las siguientes: el oxlgeno disuelto (OD) se mantuvo al 30 % ± 10 % aumentando la agitacion hasta 220 rev/minuto rociado con 60 litros de aire/minuto y 68,9476 kPa (10 psi) de contrapresion. El pH se mantuvo constante entre 6,9 y 7,1 mediante valoracion automatica con NaOH al 50 % y HCl al 10 %, y la temperatura se mantuvo a 37 °C. A las 4,5 horas (DO540 = 8-9) de la fermentacion, se transfirio el cultivo a un fermentador de 1,.500 litros IF-15000 de New Brunswick Scientific cargado con 1.200 litros de caldo trlptico de soja sin dextrosa (36.000 gramos), extracto de levadura BiTek (6.000 gramos), glicerol (36.000 ml), 2,2-dipiridilo (30,0 gramos) y antiespumante Mazu DF 204 (600 ml). Los parametros de la fermentacion fueron las siguientes: el oxlgeno disuelto (OD) se mantuvo al 60 % ± 10 % con oxlgeno suplementario aumentando la agitacion hasta 300 rev/minuto rociado con de 300 a 1.100 litros de aire/minuto y 34,4738 kPa (5 psi) de contrapresion. A medida que avanzaba la fermentacion, se anadio oxlgeno suplementario de 0-90 litros/minuto para ayudar en el control del oxlgeno disuelto. El pH se mantuvo constante entre 6,9 y 7,4 mediante valoracion automatica con NaOH al 50 % y HCl al 10 %, y la temperatura se mantuvo a 37 °C.
Aproximadamente a las 5 horas de la inoculacion del fermentador grande, se suplemento el cultivo con nutrientes adicionales mediante la carga de 70 litros de un medio que contenla 18.000 gramos de TSB y sin dextrosa, 3.000 gramos de extracto de levadura, 30,0 gramos de 2,2-dipiridilo y 18.000 ml de glicerol. Se ajusto la velocidad de la carga a aproximadamente 28 litros/hora, mientras se aumentaba la agitacion. Al final de la carga, se dejo que la fermentacion continuara durante 4 horas mas, tras lo que se finalizo la fermentacion mediante la reduction de la temperatura del fermentador a 18 °C (DO540 = 35-40 en una dilution de 1:100).
Recogida
Se concentro la fermentacion bacteriana y se lavo usando un Maxiset-25 de flujo tangencial de Pall Filtron (Pall Filtron Corporation, Northboro, MA) dotado de tres filtros de canal abierto Alfa 300-K de 2,79 m2 (30 pies2), n.° de catalogo AS300C5, (Pall Filtron) conectado a una bomba de alimentation de Waukesha Modelo U-60 (Waukesha Cherry-Burrell, Delevan, WI). Se redujo el volumen de cultivo original de 1.250 litros a 50 litros (2,5 litros/minuto), usando una presion de entrada del filtro de 206,84 kPa (30 psi) y una presion de la fraction retenida de 34,4741,37 kPa (5-6 psi). Se volvio a ajustar la fraccion bacteriana retenida hasta 150 litros usando solution salina tamponada con Tris, pH 8,5, y luego se concentro de nuevo hasta 50 litros para ayudar a eliminar las protelnas exogenas contaminantes tales como las exoprotelnas para incluir toxinas y proteasas secretadas. El pH elevado de la solucion salina tamponada con Tris ayuda a evitar gran parte de la degradation proteolltica que puede ocurrir durante el almacenamiento de la suspension de celulas enteras. Los inhibidores de proteasa se pueden usar en lugar de, o ademas de, un pH elevado. Se mezclo bien la fraccion retenida en el tanque de 200 litros usando un mezclador accionado magneticamente montado en la parte inferior. Se dispenso de forma esteril la fraccion retenida (3,5 litros) en recipientes Nalgene esteriles de 4 litros n.° 2122 y se dispuso en un congelador a -20 °C para su almacenamiento como punto de ruptura en la fabrication o para su posterior procesamiento. Se calculo la masa de sedimentos mediante la centrifugation de muestras de 30 ml del cultivo fermentado y la recogida final. En resumen, se centrifugaron tubos conicos Nalgene de 50 ml previamente pesados a 39.000 x g durante 90 minutos en un centrifugador Beckman J2-21 usando un rotor JA-21 (Beckman Instruments, Palo Alto CA). Al finalizarse el ciclo, se separo el sobrenadante mediante vertido y se volvieron a pesar los tubos. Se calculo la masa de sedimentos para cada etapa. El proceso de fermentacion produjo una masa de sedimentos humedos de aproximadamente 60 kilogramos.
Alteracion
Se transfirieron ochenta kilogramos de suspension celular bacteriana en solucion salina tamponada con Tris, pH 8,5, asepticamente a un tanque de procesamiento revestido de 1.000 litros colocado de vapor (Lee, Modelo 259LU) con un mezclador montado en la parte superior (Eastern, modelo TME-1/2, EMI Incorporated, Clinton, CT) que contenla 900 litros de TBS, pH 8,5. Se enfrio la suspension bacteriana a granel hasta 4 °C con mezcla continua durante 18 horas a 200 rpm, momento en el que se altero mediante homogenization. En resumen, se conecto el tanque de
1.000 litros que contenla la suspension bacteriana a un homogeneizador Avestin modelo C-500-B (Avestin Inc, Ottawa Canada). Se conecto un segundo tanque de procesamiento revestido de 1000 litros (vaclo) al homogeneizador de modo que el fluido del tanque de procesamiento se pudiera pasar a traves del homogeneizador, al tanque vaclo y volver, permitiendo multiples pasadas de homogenizacion, manteniendo un sistema cerrado. La temperatura durante la homogenizacion se mantuvo a 4 °C. Al comienzo de la primera pasada, se hizo circular el fluido a 482,633 kPa (70 psi) por una bomba modelo 10DO de Waukesha (Waukesha) a traves del homogeneizador
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(1892,7 litros/hora [500 galones/hora]), mientras se ajustaba la presion del homogeneizador a 206.842,72 kPa (30.000 psi). Antes de la primera pasada, se retiraron dos muestras previas a la homogenizacion del homogeneizador para establecer un valor inicial para la determinacion del grado de alteration y la monitorizacion del pH. El grado de alteracion se controlo mediante la transmitancia (% de T a 540 nm en dilution a 1:100) en comparacion con la muestra no homogenizada. Se normalizo el numero de pasadas a traves del homogeneizador para dar un porcentaje de transmitancia final de entre el 78 y el 91 % de T en una dilucion a 1:100, preferentemente de entre el 86 y el 91 %. Tras la homogenizacion, se retiro el tanque del homogeneizador y se dispuso en un bucle de enfriadores en 4 °C y se mezclo a 240 rpm.
Recogida de las protefnas
Se recogio la suspension bacteriana alterada que contenla las protelnas reguladas por el nivel de hierro ilustradas en la Figura 1 por centrifugation usando centrifugadoras Sharples T-1 (Alfa Laval Seperations, Warminster, PA). En resumen, se cargo el tanque de procesamiento revestido de 1.000 litros que contenla el material bacteriano homogenizado alterado en 12 Sharples con una velocidad de carga de 250 ml/minuto a 117,211 kPa (17 psi) a una fuerza centrlfuga de 60.000 x g. Se recogio el efluente en un segundo tanque de procesamiento revestido de 1.000 litros a traves de un bucle esteril cerrado, permitiendo multiples pasadas a traves de las centrifugadoras, manteniendo un sistema cerrado. La temperatura durante la centrifugacion se mantuvo a 4 °C. Se paso el material homogenizado 8 veces a traves de las centrifugadoras. Se recogio aproximadamente el 50 % de la protelna tras la segunda pasada, momento en el que se concentro el fluido homogenizado hasta 1/3 de su volumen original, acortando la duration del proceso para las 6 siguientes pasadas. Se desconecto el tanque de material homogenizado de forma aseptica de las centrifugadoras y se conecto a un montaje de filtration de flujo tangencial Millipore Pellicon (Millipore Corporation, Bedford, MA), dotado de un filtro Centrasette serie Alpha 3K con canales de detection de 2,32 m2 (25 pies2) (Pall Filtron) conectado a una bomba de alimentation Waukesha Modelo U30 para la concentration. Tras la concentration, se continuo la centrifugacion hasta que el proceso se hubo completado. La protelna se recogio tras cada pasada. Se recogio la protelna, se volvio a suspender y se dispenso en 50 litros de solution salina tamponada con Tris, pH 8,5 que contenla formulina al 0,15 % (Sigma) como conservante.
Diafiltracion
Se lavo la suspension de protelnas mediante diafiltracion a 4 °C para eliminar las protelnas exogenas (proteasas, toxinas, enzimas citoplasmicas y metabolicas, etc.). En resumen, se transfirieron los 50 litros de protelna de forma esteril a un tanque de procesamiento de 200 litros que contenla 150 litros de solucion salina tamponada con Tris esteril, pH 8,5, dotado de un mezclador Dayton, Modelo 2Z846, montado en la parte inferior (Dayton Electric, Chicago, IL) que giraba a 125 rev/minuto. Se conecto el tanque de procesamiento de forma esteril a un montaje de filtracion de flujo tangencial Millipore Pellicon (Millipore Corporation), dotado de un filtro Centrasette serie Alpha 3K con canales de deteccion de 2,32 m2 (25 pies2) (Pall Filtron) conectado a una bomba de alimentacion Waukesha Modelo U30. Se concentro la solucion de protelnas de 200 litros mediante filtracion hasta un volumen final de 50 litros, momento en el que se anadieron 150 litros de solucion salina esteril. A continuation, se concentro la suspension de protelnas hasta aproximadamente 50 litros. El concentrado de protelnas se almaceno en un tanque de procesamiento revestido de 50 litros dotado de un mezclador montado en la parte superior y se almaceno a 4 °C.
Es interesante observar que la composition derivada del proceso a gran escala usando la homogenizacion como medio de alteracion genera perfiles de bandas identicos, examinados mediante SDS-PAGE, a los generados con el proceso a pequena escala descrito en el Ejemplo 1. Estos resultados muestran que se podrla reemplazar la lisostafina como agente de lisis bacteriana usando el homogeneizador Avestin C500-B. Este hallazgo permite la generation a bajo coste de grandes volumenes de protelnas reguladas por el nivel de hierro a partir de estafilococos.
Ejemplo 8
Hiperinmunizacion de ratones y preparation de anticuerpo policlonal
La inmunizacion pasiva con anticuerpo purificado aislado de ratones vacunados con protelnas derivadas de las cepas 19636 de S. aureus cultivadas en condiciones limitantes en hierro fue protectora frente a un desaflo homologo y heterologo con S. aureus. Se vacunaron quince ratones CD1 adultos como se describe en el Ejemplo 3 con la composicion de protelna derivada de la cepa ATCC 19636 de S. aureus cultivada en condiciones de empobrecimiento de hierro como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los ratones se vacunaron por via intraperitoneal 3 veces a intervalos de 7 dlas con 50 pg de la composicion de protelna en cada vacunacion. Siete dlas despues de la tercera inmunizacion, se sangraron los ratones por completo mediante puncion cardiaca. Se combino el suero y se purifico el anticuerpo usando precipitation con sulfato de amonio convencional. Se retiraron las protelnas sericas exogenas antes de la precipitacion de los anticuerpos mediante la adicion de 0,5 volumenes de sulfato de amonio saturado, pH 7,2. Se agito la solucion a 100 rpm durante 24 horas a 4 °C. Se centrifugo la solucion de nuevo a
3.000 x g durante 30 minutos. Se recogio el sobrenadante y se volvio a hacer precipitar mediante la adicion de suficiente sulfato de amonio saturado para llevar la concentracion final al 55 % de saturation. Se agito la solucion a 100 rpm durante 24 horas a 4 °C. Se centrifugo el precipitado a 3000 x g durante 30 minutos. Se volvio a suspender
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el sedimento final de cada muestra en 2 ml de PBS a pH 7,2. Se sometieron a dialisis los anticuerpos precipitados usando una entubacion de dialisis de corte molecular de 50.000 (Pierce, Rockford IL) durante 30 horas contra tres cambios de 1 litro de solucion salina tamponada con fosfato para eliminar el sulfato de amonio. Los dos primeros litros de cambio se preservaron con azida de sodio al 0,02 %. El ultimo cambio de 1 litro no contenla conservante. Se recogio la sustancia sometida a dialisis y se volvio a centrifugar para eliminar cualquier residuo restante a 3000 x g durante 30 minutos. La solucion de anticuerpo se almaceno a 4 °C durante menos de 48 horas antes de su uso. Cada muestra se sembro en agar de sangre para verificar la esterilidad antes de la infusion.
Ejemplo 9
Inmunizacion pasiva y desaflo
Para evaluar el efecto protector de los anticuerpos infundidos generados contra protelnas de S. aureus expresadas en condiciones de limitacion del hierro, dos grupos de 15 ratones cada uno recibieron por infusion intraperitoneal bien preparado de anticuerpo purificado (Grupo 1) o solucion salina fisiologica (Grupo 2) en una infusion de 200 pl. Otros dos grupos mas de 15 ratones cada uno recibieron por infusion subcutanea bien preparado de anticuerpo purificado (Grupo 3) o solucion salina fisiologica (Grupo 4). Tras 60 minutos, los 2 grupos de 15 ratones que hablan recibido una infusion intraperitoneal fueron desafiados por via intraperitoneal con 1,3 x 108 UFC de cepa 19636 de S. aureus. Del mismo modo, los 2 grupos de 15 ratones que hablan recibido una infusion subcutanea fueron desafiados por via subcutanea con 1,3 x 108 UFC de la cepa 1477 de S. aureus para ensayar la proteccion cruzada contra el desaflo por una cepa diferente de S. aureus. Se registraron la mortalidad y/o el tamano de las lesiones durante 5 dlas, y se extirpo el hlgado de todos los ratones post-mortem, se homogenizo y se sembro para determinar el numero de S. aureus presente como medida de la infeccion sistemica. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (Figuras 5 y 6) muestran el efecto protector proporcionado por la infusion de anticuerpos de ratones vacunados con las protelnas de S. aureus expresadas en condiciones de restriction de hierro. Aunque la diferencia entre los grupos que hablan recibido infusion y de control para los grupos desafiados con ATCC 19636 no fue significativa (p = 0,076, prueba de rango logarltmico), se cultivo el hlgado del unico raton muerto del grupo de infusion de anticuerpos el Dla 1 en agar de sangre para determinar la ausencia y/o la presencia del organismo de desaflo (S. aureus). El cultivo derivado de este raton fue negativo en Staphylococcus y no mostro crecimiento en la placa de agar de sangre ni de medio de cultivo. Por el contrario, los hlgados de los ratones muertos del grupo de placebo, dieron todos positivo en la presencia de Staphylococcus. De hecho, se obtuvieron cultivos puros en cada placa de agar de sangre derivada de los hlgados de estos ratones. Aunque los datos hepaticos no exclulan la posibilidad de que la causa de la muerte del raton del grupo de infusion de anticuerpos fuera la infeccion por S. aureus, la infeccion no fue sistemica, como lo fue en el grupo de placebo, y el raton pudo haber muerto por otras razones. La censura de la muerte de este raton que habla recibido infusion de anticuerpos da lugar a una diferencia significativa entre los tratamientos con infusion de anticuerpos y con placebo (p = 0,015, prueba de rango logarltmico). Los datos del desaflo cruzado, en el que los ratones recibieron infusion de anticuerpos generados tras la vacunacion con protelnas derivadas de ATCC 19636 y desafiados con cepa 1477 de S. aureus, tambien mostraron una tendencia protectora. Entre 7 y 14 dlas despues del desaflo, todos los ratones de los grupos infundidos y no infundidos comenzaron a desarrollar lesiones cutaneas necroticas. Sin embargo, el examen macroscopico de los ratones revelo claramente un retraso visible en la formation de una lesion observable, as! como la gravedad de la lesion entre los grupos. Los ratones infundidos desarrollaron lesiones mas lentamente en comparacion con los ratones no infundidos de control, que desarrollaron lesiones mas rapido que los ratones infundidos y de mayor gravedad. Los ratones infundidos se curaron mas rapido que los ratones no infundidos. Esto fue claramente evidente entre los 21 y los 35 dlas despues de la inoculation. El examen macroscopico de los ratones a los 35 dlas del desaflo mostro que los ratones no infundidos estaban gravemente desfigurados y revelo un mayor grado de cicatrization. De hecho, muchos de estos ratones perdieron la postura normal, ya que pareclan estar retorcidos, en contraste con los ratones infundidos que casi no desarrollaron el extenso tejido cicatricial ni/o la desfiguracion ilustradas por el aspecto retorcido desarrollado por los ratones no infundidos. En general, estos datos sugieren que la infusion intraperitoneal de anticuerpos dirigidos contra protelnas de S. aureus inducidas por hierro puede tanto proteger contra como limitar la gravedad de la infeccion por S. aureus.
Ejemplo 10
Evaluation de una composition de vacuna derivada de Staphylococcus aureus en una cabana lechera infectada cronicamente
Se escogio una cabana lechera comercial que tenia un historial de recuento de celulas somaticas cronicamente elevado atribuible a Staphylococcus aureus para la evaluacion de una composicion de vacuna descrita en el Ejemplo 1. El criterio para establecer la eficacia de la vacuna de este estudio experimental fue: 1) reduction de la incidencia de la mastitis clinica causada por Staphylococcus aureus entre los vacunados en comparacion con los controles no vacunados; 2) mejora (es decir, una reduccion) del recuento de celulas somaticas entre los animales vacunados en comparacion con los controles; y 3) reduccion de las tasas de aislamiento de cultivo positivo de S. aureus entre los vacunados y los controles no vacunados. La sangre se extraera en el momento de la primera vacunacion (dia 0) y de nuevo a las 3 y 6 semanas despues de la inmunizacion inicial. Las reacciones en el sitio de inyeccion o las reacciones sistemicas tras las vacunas se monitorizaron durante todo el estudio. Ademas, se cultivaron muestras de leche de tanque a granel y se enumeraron cuantitativamente para determinar si se habia producido una reduccion
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del numero de UFC de Staphylococcus aureus cultivadas tras la vacunacion.
Se cultivaron tres de los aislados de Staphylococcus derivados de las vacas lactantes infectadas cronicamente de la cabana en condiciones de restriccion de hierro y en condiciones sin restriccion de hierro como se describe en el Ejemplo 1. Los tres aislados se designaron TTX101, TTX102 y TTX103. Se examinaron las muestras extraldas por SDS-PAGE para comparar los perfiles de bandas entre los aislados. Se observaron perfiles de bandas identicos entre los aislados examinados; las composiciones fabricadas de cada aislado inclulan protelnas que tenlan pesos moleculares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa, 33,0 kDa y 31,83 kDa. Estas protelnas tienen los mismos pesos moleculares descritos anteriormente en la Tabla 10. Ademas, al comparar los aislados, se observaron perfiles de bandas identicos con aquellas protelnas que se expresaron en todas las condiciones que no estaban reguladas por el nivel de hierro: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa. Estos resultados coincidieron con las observaciones anteriores. Se escogio un aislado designado TTX101 como el aislado para la fabricacion de una composicion para su uso en este estudio.
Ejemplo 11
Preparacion de la vacuna de Staphylococcus aureus (TTX101)
Se preparo una composicion como se describe en el Ejemplo 1 usando el aislado TTX101. La composicion inclula protelnas expresadas en condiciones de empobrecimiento de hierro, que tenlan pesos moleculares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa, 33,0 kDa y 31,83 kDa, as! como protelnas no reguladas por el nivel de metal, que tenlan pesos moleculares de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa y 40 kDa. Se uso la composicion inmunizante derivada de la cepa TTX101 para preparar la vacuna experimental mediante la emulsion de la suspension de protelna extralda (400 gg de protelnas en total por mililitro) en un adyuvante comercial (EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston NE) usando un recipiente homogeneizador Ultra Turrax T-50 de IKA (IKA, Cincinnati, OH), dando una dosis final de 800 gg de protelna total en un volumen inyectable de 2,0 ml con una concentration de adyuvante del 22,5 % vol/vol. La vacuna se administro por via subcutanea 2 veces en intervalos de 21 dlas.
Ejemplo 12
Diseno experimental y vacunacion de la cabana
Dieciocho dlas antes de la primera vacunacion, se analizaron todas las vacas lactantes incluidas en el estudio (N = 80) para determinar la presencia de S. aureus a traves de metodos de cultivo bacteriologico aerobicos estandarizados mediante el cultivo de las muestras de leche individuales derivadas de cada vaca lactante. Ademas, los conteos de celulas somaticas (SCC) fueron realizados por la Asociacion de Mejora de las Cabanas Lecheras usando metodos convencionales. Catorce de las 80 vacas fueron diagnosticadas cllnicamente de mastitis y dieron positivo en S. aureus. El resto de las vacas (N = 66) dieron negativo en S. aureus. Se dividieron las ochenta vacas en partes iguales en dos grupos designados Grupo 1, animales vacunados (N = 40), y Grupo 2, animales no vacunados (N = 40). Las catorce vacas positivas en Staphylococcus diagnosticadas cllnicamente se distribuyen por igual entre los dos grupos para que cada grupo de estudio contuviera 7 vacas con mastitis cllnica. El SCC medio entre los grupos antes de la primera vacunacion fue de 203,219 en los controles no vacunados en comparacion con 240,443 en los animales vacunados (p = 0,7 no estadlsticamente diferente).
Dieciocho dlas despues de la primera extraction de muestras, se vacunaron todas las vacas del Grupo 1 por via subcutanea en el hombro superior derecho con 2 ml de vacuna descrita en el Ejemplo 11. Diez dlas despues de la primera vacunacion, se extrajeron muestras de leche en este perlodo de tiempo mediante el DHIA para el recuento de las celulas somaticas de cada una de las vacas. Las muestras de leche no se analizaron bacteriologicamente en este perlodo de tiempo para determinar la presencia de Staphylococcus. La diferencia en el SCC entre los grupos en este perlodo de tiempo fue de 125,241 (animales vacunados) en comparacion con 196,297 (controles). Esta fue una diferencia del 36 % en el numero de celulas somaticas entre los animales vacunados en comparacion con los controles no vacunados. La diferencia en el SCC entre los controles y los animales vacunados en este perlodo de muestreo no fue estadlsticamente diferente (p = 0,5). La falta de diferencia estadlstica en el SCC entre los grupos en los dos perlodos de muestreo se debio a la gran variation en el SCC individual entre las vacas. Tambien se examino el sitio de inyeccion de cada vaca vacunada en este mismo perlodo de tiempo. Ninguna de las vacas examinadas mostro una reaction adversa en el tejido del sitio de inyeccion segun un examen flsico. Ademas, no hubo perdida apreciable en la production de leche debido a la vacunacion.
Veintiun dlas despues de la primera vacunacion, todas las vacas del Grupo 1 (animales vacunados) recibieron una segunda vacunacion o refuerzo. Durante el perlodo de tiempo entre la primera y la segunda vacunacion, las vacas de ambos grupos (animales vacunados y controles) desarrollaron lesiones en los pezones debido a una calda drastica de la temperatura ambiental que dio lugar a la formation de lesiones en el extremo del pezon, dando lugar al desarrollo de infecciones en los pezones y aumentando potencialmente el aislamiento de Staphylococcus durante el muestreo, lo que se observo en el tercer perlodo de muestreo. Veintitres dlas despues de la segunda vacunacion,
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se extrajeron muestras de leche mediante el DHIA para el recuento de las celulas somaticas de cada una de las vacas. Las muestras de leche tambien se analizaron bacteriologicamente para determinar la presencia de Staphylococcus aureus. Hubo un aumento drastico en la tasa de aislamiento de S. aureus en este perlodo de tiempo en las vacas que hablan dado negativo en el primer perlodo de muestreo. En los controles no vacunados, el 42,9 % de estas vacas ahora dio positivo en S. aureus, en contraste con los animales vacunados, que solo mostraron un aumento del 35,5 %. Esta fue una diferencia del 7,4 % entre los animales vacunados en comparacion con los controles no vacunados. Es diflcil decir que la mejora en la tasa de aislamiento de S. aureus del grupo vacunado se debio solo al efecto de la vacuna. No se puede pasar por alto la dificultad en la obtencion de muestras de leche de las vacas con danos en los pezones, que podrla aumentar el potencial de contaminacion de la leche por S. aureus en la obtencion de la muestra. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en el SCC medio entre los animales vacunados en comparacion con los controles. El SCC medio del grupo vacunado fue de 222,679 en comparacion con 404,278 celulas somaticas medidas en el grupo de control. Esta fue una diferencia del 44,9 % entre los animales vacunados en comparacion con los controles no vacunados. Es interesante especular que la diferencia observada en el SCC entre estos grupos tambien coincide con la diferencia en la tasa de aislamiento de S. aureus entre los grupos. Sin embargo, debido a la gran variacion en el SCC entre los animales individuales y el pequeno tamano de la muestra del ensayo experimental en el numero de animales, la diferencia no fue estadlsticamente diferente (p = 0,28).
En este mismo perlodo de tiempo, se examino el sitio de la inyeccion de cada vaca vacunada para determinar cualquier reaccion adversa en el tejido que pudiera estar causada por la composicion de la vacuna. Ninguna de las vacas examinadas mostro reaccion adversa alguna en el sitio de inyeccion segun un examen flsico. Las composiciones de vacuna pareclan ser altamente compatibles con los tejidos y no causaron ninguna perdida apreciable en la produccion de leche tras cada vacunacion.
Se prosigue con la monitorizacion de las vacas mediante la medicion del SCC y las muestras de leche para determinar la presencia o la ausencia de Staphylococcus aureus. Algunas de las vacas de cada grupo se vacunan por tercera vez a los 42 dlas de la segunda vacunacion. Parece que hay una diferencia que favorece el uso de la composicion de vacuna para la reduccion de los recuentos de celulas somaticas y el control de la infeccion causada por Staphylococcus aureus. La monitorizacion posterior incluye la serologla basada en los tltulos de los anticuerpos hacia la composicion de vacuna, los cambios en la produccion de leche en las vacas vacunadas debido a la mejora en la salud y la reduccion del SCC de los animales vacunados en comparacion con las cohortes no vacunadas. Ademas, se realizan otros experimentos para investigar el Indice de proteccion de la vacuna basandose en la respuesta a la dosis tras el desaflo con un S. aureus virulento.
Ejemplo 13
Dado que se ha demostrado que los pesos moleculares de las protelnas entre las diferentes cepas de S. aureus son similares y que se observo proteccion heterologa en el estudio de desaflo en los ratones, se ha tratado de determinar si las protelnas que comparten pesos moleculares similares en la Figura 1 eran protelnas similares. La tecnica escogida para caracterizar las protelnas fue espectrometrla de masas de desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz (MALDI-MS). Una parte de la composicion se resolvio mediante SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 1, y se tino el gel con azul de Coomassie Brilliant para visualizar las protelnas.
Materiales y metodos
Escision y lavado. Se lavo el gel durante 10 minutos con agua dos veces. Se escindio cada banda de protelna de interes cortando tan cerca de la banda de protelna como fue posible para reducir la cantidad de gel presente en la muestra.
Se corto cada corte de gel en cubos de 1 x 1 mm y se colocaron en un tubo de 1,5 ml. Se lavaron los fragmentos de gel con agua durante 15 minutos. Todos los volumenes de disolvente usados en las etapas de lavado eran aproximadamente iguales al doble del volumen del corte de gel. A continuacion, se lavo el corte de gel con agua/acetonitrilo (1:1) durante 15 minutos. Cuando las protelnas se hubieron tenido con plata, se retiro la mezcla de agua/acetonitrilo, se secaron los fragmentos de gel en un SpeedVac (ThermoSavant, Holbrook, NY) y despues se redujeron y se sometieron a alquilacion como se describe mas adelante. Cuando los fragmentos de gel no se tineron de plata, se retiro la mezcla de agua/acetonitrilo, y se anadio acetonitrilo para cubrirlos hasta que los fragmentos de gel se volvieron de un blanco pegajoso, tras lo que se retiro el acetonitrilo. Se rehidrataron los fragmentos de gel en NH4HCO3 100 mM, y tras 5 minutos, se anadio un volumen de acetonitrilo igual al doble del volumen de los fragmentos de gel. Se incubo esto durante 15 minutos, se retiro el llquido y se secaron los fragmentos de gel en un SpeedVac.
Reduccion y alquilacion. Se rehidrataron los fragmentos de gel secos en DTT 10 mM y NH4HCO3 100 mM, y se incubaron durante 45 minutos a 56 °C. Tras permitir que los tubos se enfriaran hasta la temperatura ambiente, se retiro el llquido y se anadio de inmediato el mismo volumen de una mezcla de yodoacetamida 55 mM y NH4HCO3 100 mM. Se incubo esto durante 30 minutos a temperatura ambiente a oscuras. Se retiro el llquido, se anadio acetonitrilo para cubrir hasta que los fragmentos de gel se volvieran de un blanco pegajoso, tras lo que se retiro el
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acetonitrilo. Se rehidrataron los fragmentos de gel en NH4HCO3 100 mM, y tras 5 minutos, se anadio un volumen de acetonitrilo igual al doble del volumen de los fragmentos de gel. Se incubo esto durante 15 minutos, se retiro el llquido y se secaron los fragmentos de gel en un SpeedVac. Si el gel se tino con azul de Coomasie, y segula quedando azul de Coomassie residual, se repitio el lavado con NLHCO3 100 mM/acetonitrilo.
Digestion en gel. Se secaron por completo los fragmentos de gel en una Speed Vac. Se rehidrataron los fragmentos en tampon de digestion (NH4HCO3 500 mM, CaCh 5 mM y 12,5 nanogramos por microlitro (ng/pl) de tripsina) a 4 °C. Se anadio suficiente tampon para cubrir los fragmentos de gel, y se anadio mas cuando fue necesario. Se incubaron los fragmentos de gel en hielo durante 45 minutos, y se retiro el sobrenadante y se reemplazo por 5-2 pl de mismo tampon sin tripsina. Se incubo esto a 37 °C durante la noche en una incubadora de aire.
Extraccion de los peptidos. Se anadio un volumen suficiente de NH4HCO3 25 mM para cubrir los fragmentos de gel, y se incubo durante 15 minutos (normalmente en un sonicador de bano). Se anadio el mismo volumen de acetonitrilo y se incubo durante 15 minutos (en un sonicador de bano cuando fue posible), y se recupero el sobrenadante. La extraccion se repitio dos veces, usando acido formico al 5 % en lugar de NH4HCO3. Se anadio un volumen suficiente de acido formico al 5 % para cubrir los fragmentos de gel, y se incubo durante 15 minutos (normalmente en un sonicador de bano). Se anadio el mismo volumen de acetonitrilo y se incubo durante 15 minutos (normalmente en un sonicador de bano), y se recupero el sobrenadante. Se combinaron los extractos, y se anadio DTT 10 mM hasta una concentracion final de DTT 1 mM. Se seco la muestra en un SpeedVac hasta un volumen final de aproximadamente 5 pl.
Desalacion de los peptidos. Se desalaron las muestras usando puntas de pipeta ZipTip (C18, Millipore, Billerica, MA) segun lo sugerido por el fabricante. En resumen, se reconstituyo una muestra en solucion de reconstitucion (acetonitrilo:H2O, 5:95, acido trifluoroacetico del 0,1 % al 0,5 %), se centrifugo y se comprobo el pH para verificar que era inferior a 3. Se hidrato una ZIPTIP mediante la aspiracion de 10 pl de solucion 1 (acetonitrilo:H2O, 50:50, acido trifluoroacetico al 0,1 %) y desechando las partes allcuotas aspiradas. A esto, le siguio la aspiracion de 10 pl de solucion 2 (acido trifluoroacetico al 0,1 % en H2O desionizada) y el desechado de las partes allcuotas aspiradas. Se cargo la muestra en la punta mediante la aspiracion de 10 pl de la muestra lentamente en la punta, expulsandolos en el tubo de muestra, y repitiendo esto de 5 a 6 veces. Se aspiraron diez microlitros de la solucion 2 en la punta, se desecho la solucion mediante su expulsion, y se repitio este proceso 5-7 veces para lavar. Los peptidos se eluyeron mediante la aspiracion de 2,5 pl de solucion 3 enfriada con hielo (acetonitrilo:H2O, 60:40, acido trifluoroacetico al 0,1 %), expulsando, y luego volviendo a aspirar la misma parte allcuota dentro y fuera de la punta 3 veces. Una vez expulsada la solucion de la punta, el tubo se tapo y se almaceno en hielo.
Cartografia de peptidos mediante espectrometrfa de masas. Se suspendieron los peptidos en de 110 pl a 30 pl de acido formico al 5 %, y se analizaron mediante MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA). Se determino el espectro de masas de los fragmentos peptldicos segun lo sugerido por el fabricante. En resumen, se mezclo una muestra que contenla los peptidos resultantes de una digestion trlptica con acido ciano-4-hidroxicinamico matriz, se transfirio a una diana, y se dejo secar. Se dispuso la muestra seca en el espectrometro de masas, se irradio y se detecto el tiempo de vuelo de cada ion, y se uso para determinar un identificador genetico de masa peptldico para cada protelna presente en la composicion. Los polipeptidos conocidos se usaron para normalizar la maquina.
Analisis de los datos. Se compararon las masas observadas experimentalmente para los peptidos en cada espectro de masas con las masas esperadas de las protelnas usando el metodo de busqueda de identificadores geneticos de masa de peptidos del motor de busqueda Mascot (Matrix Science Ltd., Londres, RU, y
www.matrixscience.com, vease Perkins et al., “Electrophoresis” 20, 3551-3567 (1999)). Los parametros de busqueda incluyeron: base de datos = MSDB o BCNInr; taxonomla = bacterias (eubacterias) o Firmicutes (bacterias gram positivas); tipo de busqueda = identificador genetico de masa de peptido; enzima = tripsina; modificaciones fijas = carbamidometilo (C) o nada; modificaciones variables = oxidacion (M), carbamidometilo (C), la combinacion o nada; valores de masa = monoisotopica; masa proteica = sin restricciones; tolerancia de la masa peptldica = entre ± 150 ppm y ± 430 ppm; o ± 1 Da; estado de carga peptldica, Mr; escisiones max perdidas = 0 o 1; numero de consultas = 20.
www.matrixscience.com, vease Perkins et al., “Electrophoresis” 20, 3551-3567 (1999)). Los parametros de busqueda incluyeron: base de datos = MSDB o BCNInr; taxonomla = bacterias (eubacterias) o Firmicutes (bacterias gram positivas); tipo de busqueda = identificador genetico de masa de peptido; enzima = tripsina; modificaciones fijas = carbamidometilo (C) o nada; modificaciones variables = oxidacion (M), carbamidometilo (C), la combinacion o nada; valores de masa = monoisotopica; masa proteica = sin restricciones; tolerancia de la masa peptldica = entre ± 150 ppm y ± 430 ppm; o ± 1 Da; estado de carga peptldica, Mr; escisiones max perdidas = 0 o 1; numero de consultas = 20.
Resultados
El resultado de esta busqueda fue un identificador genetico de masa para cada protelna presente en la composicion, que se muestra en las Tablas 2, 3, 4 y 5.
Claims (12)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Una composicion obtenida mediante un proceso que comprende:proporcionar un cultivo que comprende un Staphylococcus aureus, en donde el Staphylococcus aureus ha sido adaptado al crecimiento en condiciones de bajo nivel de hierro mediante el subcultivo del Staphylococcus aureus en medio que contiene concentraciones crecientes de 2,2'-dipiridilo de 300 pM a 1.600 pM, y en donde el Staphylococcus aureus se cultiva en presencia de 1.600 pM de 2,2'-dipiridilo;alterar el Staphylococcus aureus para producir una mezcla de celulas de Staphylococcus aureus rotas; disolver la mezcla para producir un preparado que contiene protelnas disueltas y no disueltas; y aislar las protelnas no disueltas,en donde el Staphylococcus aureus es la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
- 2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la composicion comprende polipeptidos aislados que tienen pesos moleculares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa y 33 kDa, en donde el peso molecular esta determinado por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida, y en donde la composicion protege a un animal contra la exposicion a la cepa ATCC 19636 de S. aureus.
- 3. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en medicina.
- 4. El uso de una cantidad eficaz de una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o que esta en riesgo de tener una infeccion provocada por un Staphylococcus aureus.
- 5. El uso de una cantidad eficaz de una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un slntoma en un sujeto que tiene una infeccion causada por un Staphylococcus aureus.
- 6. El uso de las reivindicaciones 4 o 5, en el que el sujeto es un mamlfero.
- 7. El uso de la reivindicacion 6, en el que el mamlfero es un ser humano.
- 8. El uso de una cantidad eficaz de una composicion de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o que esta en riesgo de tener una infeccion causada por un Staphylococcus aureus, en donde se reduce la colonizacion en el sujeto colonizado por Staphylococcus aureus.
- 9. La composicion de la reivindicacion 1 que comprende ademas un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
- 10. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o que esta en riesgo de tener una infeccion causada por Staphylococcus aureus.
- 11. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de un slntoma en un sujeto que tiene una infeccion causada por Staphylococcus aureus.
- 12. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de una infeccion en un sujeto que tiene o que esta en riesgo de tener una infeccion causada por Staphylococcus aureus, en donde se reduce la colonizacion en el sujeto colonizado por Staphylococcus aureus.
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