KR20020097200A - 원핵세포에서의 필수유전자의 동정 - Google Patents

원핵세포에서의 필수유전자의 동정 Download PDF

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Abstract

원핵생물의 증식을 저해하는 안티센스 핵산 서열들이 기술되어 있다. 또한, 항생제를 동정하고 개발하기 위하여 전기 안티센트 핵산을 이용하는 세포에 기초한 분석법이 기술되어 있다. 전기 안티센스 핵산은 또한, 증식에 필요한 단백질들을 동정하고, 이러한 단백질들 또는 그부분을 발현시켜서, 전기 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 수득하는데 사용될 수 있고, 이러한 전기 발현된 단백질들을 사용하여 합리적 약물 탐색 프로그램을 이용하여 후보 분자들을 탐색할 수 있다. 또한, 전기 핵산들을 사용하여Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae,및Pseudomonas aeruginosa이외의 세포에서 증식에 필요한 상동 핵산을 탐색할 수 있다. 본 발명의 전기 핵산들은 다른 개체들에서 증식에 필요한 유전자들을 탐색하는 어떤 다양한 시스템에도 사용될 수 있다.

Description

원핵세포에서의 필수유전자의 동정{Identification of Essential Genes in Prokaryotes}
페니실린(penicillin)의 발견 이래로, 세균 감염으로 인한 손상을 치료하는데 항생제(antibiotics)의 사용은 수백만의 생명을 구해왔다. 이 "기적의 약"의 출현 후 얼마동안, 인류가 세균 감염의 참화로부터 완전히 벗어날 것이라는 믿음이 널리 퍼졌다. 실제로, 1980년 대부터 1990년대 초까지 많은 대규모 제약회사들이 항생제 연구와 개발을 줄이거나 중단하였다. 그들은 세균으로 인한 감염성 질병은 정복되었고, 신약 시장은 제한적이라고 믿었다. 불행히도, 이 믿음은 지나치게 낙관적인 것이었다.
약제 내성 세균의 보고가 잇따름에 따라 조류는 세균에 유리하게 변하고 있다. 미국 질병통제센터(United States Centers for Disease Control)는 주지된 가장 강력한 항생제 중 하나인 반코마이신(vancomycin)이 일반적인Staphylococcus aureus(이하 포도상구균(staph))의 감염을 치료할 수 없다고 발표했다. 이 개체는 우리 주변에서 흔히 발견되며, 많은 원내감염(nosocomial infection)의 원인이다. 반코마이신이 수년간 포도상구균 등의 강력한 세균주들에 의해 유발된 감염을 치료하는 데에 사용된 것을 고려할 때, 이 발표의 중요성은 분명해진다. 간단히 말해서, 세균은 가장 강력한 항생제에 대하여 저항성을 가지기 시작했다. 이러한 경향이 계속될 경우, 현재는 중요치 않은 세균 감염으로 생각되는 것도 치명적인 질병이 될 날이 오리라고 예상할 수 있다.
일부 의사들의 약제 과잉 처방(over-prescription) 및 부적절한 처방 습관은 대중의 항생제 구매를 무차별적으로 증가하게 한 원인이다. 환자들 또한 부분적으로 책임이 있는데, 환자들은 항생제가 적당히 처치된 경우에도 종종 전기 약제를 부적절하게 사용하게 때문이다. 그 결과로, 종래의 항생제에 대하여 완전히 또는 부분적으로 내성을 가진 또다른 개체의 세균이 발생한다.
인간을 괴롭혀온 세균성 질병은 이를 다루는 현대 과학 기술의 발전에도 불구하고 여전히 남아있다. 약제 내성 세균은 이제 인류의 건강을 위협하고 있다. 세균과 관계된 질병 위협 현안을 다시 한번 다루는 차세대 항생제가 필요한 때이다.
신규한 항생제의 발견
세균주들이 유효한 항생제 단(pannel)에 대하여 점점 더 내성을 가지게 됨에 따라, 감염을 치료할 신규한 항생제가 필요시되고 있다. 과거에는, 약리학 종사자들이 전통적인 신약 개발(drug discovery) 방법에 의지하여 질병의 치료를 위한 새롭고 안전하며 효능있는 화합물을 제조하여야만 했을 것이다. 전통적인 신약 개발 방법에는, 어느 하나가 어떤 질병들에 대하여 효과적인 치료제로 판명될 것이라는 희망을 가지고 종종 무작위로 선택된 가능성있는 약제 후보 분자들을 맹목적으로테스트(blindly testing)하는 방법이 있다. 전기 방법은 인내를 요하는 힘든 방법이다. 오늘날, 하나의 신약을 발견하고 개발하는 데 드는 평균 비용은 미화로 거의 5억 달러 정도이며, 실험 단계에서부터 환자에 투여하기까지는 평균 15년이 걸린다. 이러한 방법을 증량적으로라도 향상시키는 것은 신규한 항균제 제조에 커다란 진보를 의미할 것이다.
신약 개발에 새롭게 등장하고 있는 방법들에서는 신약을 무작위적으로 발견하기 보다는 오히려 그들을 창조함에 있어서 통제된 접근법을 제공하는 수많은 생화학적 방법들을 이용한다. 예를 들어, 개체의 증식에 필요한 유전자 서열들 및 이들에 의하여 암호화되는 단백질은 훌륭한 표적(target)이 되는데, 이 표적들에 대한 활성이 있는 화합물들을 세균에 노출시키면, 전기 개체를 불활성시킬 수 있다. 표적물이 동정되면, 그에 대한 생화학적 분석을 통하여 전기 표적물과 상호작용하여 그 기능을 변경시킬 분자(molecule)들을 발견하거나 또는 설계할 수 있다. 물리적 및 컴퓨터 이용을 통한 방법을 사용하여, 표적물과 상호작용하는 화합물을 유도하기 위하여 전기 표적물을 구조적 및 생화학적으로 분석하는 것을 합리적 약품 설계(rational drug design)이라고 부르며, 이는 훌륭한 향후 잠재성을 제공한다. 따라서, 등장하고 있는 신약 개발 방법들은 분자 모델링(molecular modeling) 방법, 조합 화학(combinatorial chemistry) 접근법, 및 기타 다수의 후보 화합물들을 생산하고 선별하며, 및/또는 설계하는 방법들을 사용한다.
그러나, 신약 개발에 대한 이러한 접근법은 분명히 미래지향적이나, 문제는 남아있다. 예를 들어, 조사할 분자적 표적물을 동정하는 처음 단계는 극도로 시간을 소비하는 일일 수 있다. 또한, 컴퓨터 모델링(computer modeling) 방법을 사용하여 전기 표적물과 상호작용하는 분자를 설계하는 것 역시 어려울 수 있다. 나아가, 전기 표적물의 기능이 알려져 있지 않거나 또는 불충분하게 알려져 있는 경우에, 전기 표적물과 상호작용하여 그 기능을 변경시킬 분자를 검출할 방법을 설계하기가 어려울 수 있다. 신약의 발견 및 개발의 속도를 향상시키기 위하여, 병원성 미생물내의 중요한 분자적 표적물을 동정하는 방법 및 이러한 표적물과 상호작용하여 그 기능을 변경시킬 분자들을 찾아내는 방법이 시급히 필요하다.
포도상구균(Staphylococcus aureus)은 많은 감염성 질환의 원인이 되는 그람 양성균이다. 포도상구균에의한 국지적 감염은 피부 상의 농양과 피하조직의 봉와직염을 유발할 수 있으며, 독소에 의한 쇼크나 화상 표피 증후군 같은 독성 관련 질병을 유발할 수도 있다. 또한, 포도상구균은 골수염, 심장내막염, 폐렴, 그리고 패혈증같은 심각한 전신성 감염을 유발할 수 있다. 포도상구균은 감염된 식료품 생산 공장 종사자와 그에의해 제조되는 식료품의 접촉으로인해 흔히 야기되는 식중독의 보편적인 원인이기도 하다. 현재 유용한 모든 항생제에 대해 내성을 가지는 항생제 내성 포도상구균이 최근 동정되었고, 이로인해 의사들이 활용가능한 치료법이 제한되고 있다.
녹농균(Psedomonas aeruginosa)은 중요한 그람 음성 기회감염 원인균으로 원내감염에서 가장 흔히 발견된다. 전기 녹농균은 원내 감염성 폐렴의 16%, 원내 감염성 요로 감염의 12%, 외과 수술 후 감염의 8%, 그리고 혈류 감염의 10%를 차지하는 원인균이다. 호중구 감소 암이나 골수 이식 환자같은 면역타협성 환자들은 특히이러한 기회감염이 일어나기 쉽다. 이러한 환자군에서, 녹농균에 의한 폐렴이나 패혈증으로인해 30%에 달하는 환자가 사망한다. 또한, 녹농균은 관을 삽입한 환자에서 삽입된 관과 관련된 폐렴의 원인중 가장 보편적이고도 가장 위험하며, 직접적으로 이에의한 사망률이 38%에 달한다. 화상 환자에서는 녹농균의 출현이 드문 일이긴 하지만, 감염되면 60%의 사망률을 보이며, AIDS 환자에서는 녹농균이 50%의 사망률과 연관된다. 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자는 특히 녹농균의 급성 감염이 일어나기 용이하며 이는 높은 수준의 발병률과 사망률을 초래한다. 현재의 항생제는 이러한 낭포성 섬유증 감염(CF infection)에 거의 작용하지 않는다.(참조: 반 델덴 & 아이젤위스키, 1998, Emerging Infectious Diseases, 4:551-560)
그람 음성 장내세균 속인 살모넬라(Salmonella)는 적어도 2종의 균종을 포함한다. 이중 하나는 장염균(S. enterica)으로 다수의 아종과 수천의 세로타입(serotype, 항원형), 혈청형(serovars)로 분류된다(참조: 브레너, 외., 2000, J. Clin. Microbiol., 38:2465-2467). 인간 병원체인 장염균은 Typhi, Paratyphi, Typhimurium, Cholerasuis 및 종내에 널리 분포하는 변종들과 밀접하게 연관되는 수많은 서로 다른 혈청형을 포함한다. 전세계적으로, 살모넬라속에 의해 야기되는 인간 질병은 매우 심각한 문제이다. 많은 개발도상국에서, S. enterica ser. Typhi는 여전히 치명적인 장티푸스열을 유발한다. 이러한 문제는 부유한 공업국가에서는 감소하거나 거의 사라진 상태이지만, 살모넬라에 의해 유발되는 장염은 널리 퍼져있으며, 미국에서 오염된 음식물에의해 야기되는 질병 중 두번째로 흔한 질병이다(참조: 에드워드 비에이치., 1999, "Salmonella and Shigellaspecies", Clin. Lab Med., 19(3):469-487). 건강한 사람에서는 스스로 억제가 가능하지만, 아이들이나 노인들 또는 잠재성 질환을 가진 사람들은 심각한 질병이나 죽음에 이를 위험이 훨씬 더 크다.
몇몇 장염균 혈청형(e.g. Typhimurium)은 위장관 내에 지엽적인 감염을 유발한다. 또다른 혈청형들은(i.e. Typhi 및 Paratyphi) 훨씬 더 심각한 전신 감염을 일으킨다. 쥐에서 장티푸스열을 유발하는 장염균 혈청형 Typhi 의 대리자(surrogate)로서 보다 안전한 장염균 혈청형 Typhimurium을 사용한 동물모델 실험에서는 이들의 역할이 반전되는 양상을 보인다. 쥐에서,S. entericaser.Typhimorium은 장티푸스열과 유사한 전신 감염 증상을 유발한다. 살모넬라에 대한 수년간의 연구에서, 동물과 사람에서의 독성에 대한 많은 결정인자들을 동정해냈다. 살모넬라는 장내 상피에 위치, 침범하며, 세포 리모델링 단백질을 세포에 주입하여 세포의 형태변화를 일으키고, 세포막에 결합된 소포형태로 세포내에 존재하는 능력을 가진다는 면에서 흥미롭다(참조: 월리스 티에스와 갈료브 이이., 2000 "Molecular basis of Samonella-induced enteritis", Mole. Microbiol., 36:997-1005; 팔코우, 에스., "The ewolution of pathogenicity in Eschrichia, Shigella, and Samonella", Chap. 149 in 네이드하트 외. eds pp2723-2729; 굴릭, 피에이., "Pathogenesis of Systemic Disease", Chap 152 in 네이드하트 외. eds pp2774-2787). 급성감염은 심각한 물같은 설사를 일으키기도 하지만, 어떤 경우에 살모넬라는 개체내에 정착하여 무증상 보균자 상태로 존재하기도 하며, 분비물로 오염된 음식물을 통하여 전파된다.
살모넬라의 발병과 관련된 유전자 생성물에는 엔도톡신이나 분비된 엔도톡신등의 "전통적인" 인자뿐만 아니라, 제 3형 분비계(type three secretion systems, TTSS), 표적세포의 세포 구조에 영향을 주는 단백질, 그리고 숙주세포에서 살모넬라의 생존과 증식을 위해 필요한 기능을 수행하는 많은 단백질들이 포함된다. 또한 종 특이성 질병(species-specific illness)을 매개하는 인자들도 반드시 포함된다. 장염균 혈청형 Typhi(참조:http://www.sanger.ac.uk/Projects/S.typhifor the genome database)와 장염균 혈청형 Typhimurium(참조:http://genome.wustl.edu/gsc/bacterial/salmonella.shtmlfor the genome database)의 유전체는 대부분이 높은 보존성을 보임에도 불구하고 이들은 다양한 혈청형의 유전자 동정에 서로 유용하게 사용된다. 살모넬라는 지난 세기동안 생의학 연구의 촛점이 되어온 대장균등의 다른 그람 음성 장내 세균과 유사한 질병을 일으키지만 그들과는 다른 장내 세균의 복잡한 그룹이다.
그람 양성균인Enterococcus faecalis은 사람에게 감염되는 장구균(Enterococci)중 가장 대표적인 종이며, 일반적으로Enterococcus faecium은 임상에서 분리했을 때, 20%미만을 차지한다. 장구균은 몇몇 경우에 집단 감염(community-aquired infection)과 연관됨에도 불구하고 대부분 원내 감염(hospital-aquired infection) 된다. 장구균의 원내 감염은 균혈증(bacteremia)의 12%, 수술 후 감염의 15%, 요로 감염의 14%, 그리고 심근내막염 케이스의 5-15%를 차지하는 원인이다(참조: 후이크, 엠.엠., 디.에프.,샴 과 엠.에스., 길모어. 1998. Emerging Infecious Disease 4:239-249). 또한, 장구균은 흔히 복강내 감염과 골반염과 연관된다. 장구균 감염은 치료하기 어려운 경우가 종종 있는데 이는 이들이 아미노글리코시드(aminoglycoside), 페니실린, 암피실린, 반코마이신등을 포함하는 방대한 계열의 항생제에 내성을 가지기 때문이다. 다약제 내성(Multiple-drug resistant, MDR)을 가지는 장구균의 발달로, 이 균은 원내 감염 치료를 위한 주요 고려대상이 되었다.
이와 같은 이유로, 포도상구균(Staphylococcus aureus), 쥐티프스균(Samonella typhimurium), 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 그리고 장구균(Enterococcus faecalis) 등에 효과적인 새로운 항생제의 개발이 시급하다. 따라서, 증식에 필요한 유전자 생성물을 암호화하며, 항생제 개발의 새로운 표적이 될 수 있는 세균 유전자 서열을 동정하고 그 특징을 밝힐 수 있는 더 새로운 방법이 시급히 필요하다. 본 발명 이전에, 포도상구균, 쥐티프스균, 페렴균, 녹농균 그리고 장구균의 증식에 필요한 유전자의 발견은 고생스럽고 매우 느린 과정이었다. 본 발명 이전의 약제 표적 탐색 방법은 수년간의 노력이 필요한 고생스러운 과정을 요구하지만, 포도상구균, 쥐티프스균, 페렴균, 녹농균 또는 장구균 세포내에서 새로운 세포내 약제 표적을 찾는 것은 새로운 항생제 개발의 열쇠이다.
요약
본 발명의 간단한 설명을 아래의 번호를 붙인 단락에서 서술하고자 한다.
1. 서열번호 8-3795 중 하나로 구성된 뉴클레오티드 서열을 필수적으로 포함하는 분리 또는 정제된 핵산 서열, 이때, 전기 핵산의 발현은 세포의 증식을 억제한다.
2. 단락 1의 핵산 서열에서, 전기 뉴클레오티드 서열은 그 발현이 세포의 증식에 요구되는 유전자의 암호화 서열의 적어도 일부분에 상보적이다.
3. 단락 1의 핵산에서, 전기 핵산 서열은 세포 증식에 필요한 RNA의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분에 상보적이다.
4. 단락 3의 핵산에서, 전기 RNA는 적어도 하나 이상의 유전자 산물을 암호화 할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 구성된 RNA이다.
5. 서열번호 8-3795 중 하나의 절편(fragment)을 포함하는 분리 또는 정제된 핵산 서열. 이때, 전기 절편은 서열번호 8-3796중 하나의 뉴클레오티드 서열의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 및 50개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편들로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
6. 단락 5의 절편에서, 전기 절편은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacterioides fragilis Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae,Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Entrococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia aseroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis carinii, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택된 미생물에서 수득한 핵산을 포함한다.
7. 단락 5의 절편에서, 전기 절편은 대장균(Escherichia coli) 이외의 미생물에서 수득한 핵산을 포함한다.
8. 단락 1 내지 7 중의 어느 하나의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
9. 단락 8의 벡터에서, 이때 전기 프로모터는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacterioides fragilis Bordetellapertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccediodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Entrococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia aseroides, Pasteurella haamolytica, Pasteurella multocida, Pneunocystis carinii, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택된 미생물에서 활성이 있다.
10. 단락 8 또는 단락 9의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
11. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스(antisense)핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 증식에 필요한 유전자를 포함하는 오페론(operon)내의 유전자내 서열(intragenic sequence)의 적어도 일부분, 유전자간 서열(intergenic sequence), 둘 이상의 유전자의 적어도 일부분을 채우는(spanning) 서열, 5' 비암호화(noncoding) 영역, 또는 3' 비암호화 영역에 상보적인 핵산서열을 포함하는 정제되거나 분리된 안티센스 핵산
12. 단락 11의 정제되거나 분리된 안티센스 핵산에서, 이때 전기 안티센스 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacterioides fragilis Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccediodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Entrococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,Nocardia aseroides, Pasteurella haamolytica, Pasteurella multocida, Pneunocystis carinii, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택된 미생물의 핵산에 상보적이다.
13. 단락 11의 정제되거나 분리된 핵산에서, 전기 뉴클레오티드 서열은 대장균이외의 다른 미생물유래 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적이다.
14. 단락 11의 정제되거나 분리된 핵산에서, 전기 발현에 필요한 유전자는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 및 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
15. BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795과 서열번호 8 내지 3795의 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 절편들, 서열번호 8 내지 3795에 상보적인 서열들 및, 서열번호 8 내지 3795의 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 절편들에 상보적인 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산
16. 단락 15의 정제되거나 분리된 핵산에서, 전기 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
17. 단락 15의 핵산에서, 전기 핵산은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
18. 그 발현이 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센트 핵산에 의해 저해되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
19. 단락 18의 벡터에서, 전기 폴리펩티드를 암호화하는 전기 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터선택되는 개체로부터 수득된 것이다.
20. 단락 18의 벡터에서, 전기 폴리펩티드는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 및 10013 및 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
21. 단락 18의 벡터를 포함하는 숙주세포.
22. 단락 18의 벡터에서, 전기 폴리펩티드는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 및 10013 및 14110으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
23. 단락 18의 벡터에서, 이때, 전기 프로모터는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다.
24. 발현이 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의해 저해되는 폴리펩티드, 또는 전기 폴리펩티드들 중 하나의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속적 아미노산을 포함하는 절편들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 절편을 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩티드.
25. 단락 24의 폴리펩티드에서, 전기 폴리펩티드는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 및 10013 내지 14110 중 하나를 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 및 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속적 아미노산을 포함하는 절편을 포함할 수 있다.
26. 24단락의 폴리펩티드에서, 전기 폴리펩티드는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
27. 단락 24의 폴리펩티드에서, 폴리펩티드는 대장균이외의 개체로부터 수득한 것이다.
28. FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지거나, 발현이 서열번호 8 내지 3795으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 저해되는 폴리펩티드의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속적 아미노산을 포함하는 절편과 적어도 25%의 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩티드.
29. 단락 28의 폴리펩티드에서, 전기 폴리펩티드는, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110중 하나를 포함하는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지거나 또는, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나를 포함하는 폴리펩티드의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속적 아미노산을 포함하는 절편과 적어도 25%의 동일성을 가진다.
30. 단락 28의 폴리펩티드에서, 전기 폴리펩티드는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candidaguilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
31. 단락 28의 폴리펩티드에서, 전기 폴리펩티드는 대장균 이외의 개체로 부터 수득한 것이다.
32. 단락 28 내지 31 중 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합가능한 항체
33. 발현이 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 방법이다.
34. 단락 33의 전기 방법은 전기 폴리펩티드를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
35. 단락 33의 방법에서, 전기 폴리펩티드는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
36. 단락 33의 방법에서, 전기 폴리 펩티드를 암호화하는 전기 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigellaflexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
37. 단락 33의 방법에서, 전기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
38. 단락 33의 방법에서, 전기 프로모터는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 작동가능하게 연결된다.
39. 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계, 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 미생물의 증식을 저해하는 방법.
40. 단락 39의 방법에서, 전기 방법은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum,Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체에서 유전자 산물의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계를 포함한다.
41. 단락 39의 방법에서, 전기 방법은 대장균 이외의 개체에서 유전자 산물의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계를 포함한다.
42. 단락 39의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체에 존재한다.
43. 단락 39의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3806, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
44. 증식에 필요한 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는방법으로서, 전기 유전자 산물은 그 활성이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물을 포함하며, 전기 방법은, 전기 유전자 산물을 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및, 전기 화합물이 전기 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는지를 결정하는 단계를 포함한다.
45. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcusepidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
46. 단락 44의 방법에서 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
47. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 효소 활성이다.
48. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은이화(catabolism) 활성이다.
49. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 생합성(biosynthetic) 활성이다.
50. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 수송체(transporter) 활성이다.
51. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 전사(transcriptional) 활성이다.
52. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 DNA 복제 활성이다.
53. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이고 전기 활성은 세포분열 활성이다.
54. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 RNA이다.
55. 단락 44의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
56. 단락 44의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
57. 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물 또는 핵산을 동정하는 방법, 이때, 전기 유전자 산물은 활성 또는 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물을 포함하고, 전기 방법은,
(a) 전기 유전자 산물을 암호화하는 표적 유전자 또는 RNA를 후보 화합물 또는 핵산과 접촉시키는 단계; 및,
(b) 전기 표적물의 활성을 측정하는 단계
를 포함한다.
58. 단락 57의 방법에서, 표적 유전자 또는 RNA는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilusinfluenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
59. 단락 57의 방법에서, 전기 표적 유전자 또는 RNA는 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
60. 단락 57의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
61. 단락 57의 방법에서, 전기 표적물은 mRNA(messenger RNA) 분자이고, 전기 활성은 전기 mRNA의 번역(translation)이다.
62. 단락 57의 방법에서, 전기 표적물은 mRNA 분자이고, 전기 활성은 전기 mRNA를 암호화하는 유전자의 전사이다.
63. 단락 57의 방법에서, 전기 표적물은 유전자이고, 전기 활성은 전기 유전자의 전사이다.
64. 단락 57의 방법에서, 전기 표적물은 비번역(nontranslated) RNA이고, 전기 활성은 전기 비번역 RNA의 처리(processing) 또는 폴딩(folding) 또는 전기 비번역 RNA의 단백질/RNA 복합체로의 조립(assembly)이다.
65. 단락 57의 방법에서, 전기 표적은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 분자이다.
66. 단락 57의 방법에서, 전기 표적은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
67. 단락 57의 방법을 사용하여 동정된 화합물 또는 핵산.
68. 미생물의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법. 이때, 전기 유전자 산물의 활성 또는 발현은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해된다. 전기 방법은 하기의 각 단계를 포함한다:
(a) 세포내에서 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 준치사량(sub-lethal level)의 안티센스 핵산을 제공하여, 전기 세포내의 전기 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키고, 이로써 감작(sensitized)세포를 생산하는 단계;
(b) 전기 감작세포를 화합물에 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 저해하는지 결정하는 단계.
69. 단락 68의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 세포의 성장을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작세포의 성장을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
70. 단락 68의 방법에서, 전기 세포는 그람 양성 세균(bacterium)이다.
71. 단락 68의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
72. 단락 68의 방법에서, 전기 세균은Staphylococcus aureus이다.
73. 단락 72의 방법에서,Staphylococcus종은 응고효소(coagulase) 음성이다.
74. 단락 72의 방법에서, 전기 세균은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
75. 단락 68의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae,Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체이다.
76. 단락 68의 방법에서, 전기 세포는 대장균 세포가 아니다.
77. 단락 68의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
78. 단락 68의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 유도가능한 프로모터로부터 전사된다.
79. 단락 68의 방법에서, 전기 방법은 전기 세포를 전기 안티센스 핵산을 준치사량으로 유도하는 어떤 농도의 유발물질(inducer)과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
80. 단락 68의 방법에서, 성장저해는 배양 성장 용액(culture growth solution)의 흡광도를 모니터링하여 측정한다.
81. 단락 68의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이다.
82. 단락 81의 방법에서, 전기 폴리펩티드는 서열번호 3801 내지 3805, 4861내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
83. 단락 68의 방법에서, 전기 유전자 산물은 RNA이다.
84. 단락 68의 방법에서, 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
85. 단락 68의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
86. 활성 또는 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자에 대하여 활성을 가지는 화합물, 또는 전기 유전자의 산물에 대한 활성을 가지는 화합물을 전기 유전자를 발현하는 세포 개체군(population)내로 도입하는 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 방법.
87. 단락 86의 방법에서, 전기 화합물은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산, 또는 그의 증식억제 부위이다.
88. 단락 86의 방법에서, 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 증식억제 부위는 서열번호 8 내지 3795 중 하나에서 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 51개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편이다.
89. 단락 86의 방법에서, 전기 개체군은 그람 양성 세균의 개체군이다.
90. 단락 89의 방법에서, 전기 그람 양성 세균의 개체군은Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
91. 단락 86의 방법에서, 전기 세균의 개체군은Staphylococcus aureus의 개체군이다.
92. 단락 91의 방법에서, 전기 개체군은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
93. 단락 86의 방법에서, 전기 개체군은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세균의 개체군이다.
94. 단락 86의 방법에서, 전기 개체군은 대장균이외의 개체로 구성된다.
95. 단락 86의 방법에서, 전기 유전자의 전기 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
96. 단락 86의 방법에서, 전기 유전자는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다.
97. 단락 86의 방법에서, 전기 유전자는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
98. 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 내에 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 유효한 농도의 안티센스 핵산, 또는 그 증식억제 부위를 포함하는 조성물.
99. 단락 98의 조성물에서, 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 전기 증식억제 부위는 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 50개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다.
100. 증식에 필요한 오페론내의 유전자의 활성 또는 발현을 저해하는 방법, 이때 전기 오페론내의 적어도 한 유전자의 활성 또는 발현은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되며, 전기 방법은 세포 개체군내의 세포를 적어도 전기 오페론의 증식억제 부위를 포함하는 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
101. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열 또는 그것의 증식억제 부위를 포함한다.
102. 단락 100의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum,Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
103. 단락 100의 방법에서, 전기 세포는 대장균이외의 세포이다.
104. 단락 100의 방법에서, 전기 유전자의 전기 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
105. 단락 100의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포 개체군내로 전기 안티센스 핵산을 암호화하는 플라스미드(plasmid)를 도입하여 전기 안티센스 핵산과 접촉된다.
106. 단락 100의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포 개체군내로 전기 안티센스 핵산을 암호화하는 파아지(phage)를 도입하여 전기 안티센스 핵산과 접촉된다.
107. 단락 100의 방법에서, 전기 세포 개체군 내에서 전기 세포의 염색체로부터 전기 안티센스 핵산을 발현시켜, 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
108. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 핵산의 염색체 복제(chromosomal copy)에 인접한 프로모터를 도입하여 전기 프로모터가 전기 안티센스 핵산의 합성을 이끌도록 함으로써 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
109. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 핵산을 발현하는 레트론(retron)을 전기 세포 개체군으로 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
110. 단락 100의 방법에서, 리보자임(ribozyme)을 전기 세포 개체군내로 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킬 수 있는데, 이때, 전기 리보자임의 결합 부위는 전기 안티센스 핵산을 포함한다.
111. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포솜(liposome)을 전기 세포에 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
112. 단락 100의 방법에서, 안티센스 핵산을 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법을 사용함으로써 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킬 수 있다.
113. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 50개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편이다.
114. 단락 100의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 합성된(synthetic) 올리고뉴클레오티드이다.
115. 단락 100의 방법에서, 전기 유전자는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
116. 하기의 단계를 포함하는, 미생물의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법:
(a) 세포를 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계; 이때, 전기 세포는 전기 핵산을 수득한 세포를 제외한 세포이다.
(b) 전기 핵산이 전기 미생물의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계; 및,
(c) 전기 안티센스 핵산 또는 그 부분에 상보적인 mRNA를 암호화하는 전기 미생물내의 유전자를 동정하는 단계.
117. 단락 116의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
119. 단락 116의 방법에서, 전기 세포는 대장균이 아니다.
120. 단락 116의 방법에서, 전기 방법은 벡터에 포함된 전기 세포에서 기능하는 프로모터에 안티센스 핵산을 작동가능하게 연결하고, 전기 벡터를 전기 세포에 도입시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
121. 하기의 단계를 포함하는, 미생물의 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 시험 세포에서 활성 또는 양이 서열번호 8 내지 3795로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산에 의하여 저해되는 유전자 또는 유전자 산물의 상동체(homolog)를 동정하는 단계, 이때 전기 시험 세포는 전기 핵산을 수득한 세포 이외의 것이다;
(b) 전기 시험 세포 내에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해 핵산서열을 동정하는 단계;
(c) 전기 시험 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산과 접촉시켜 전기 시험 세포를 감작시키는 단계;
(d) 전기 단계 (c)의 감작된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(e) 전기 화합물이 전기 저해 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 감작된 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
122. 단락 121의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 미생물의 증식을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작미생물의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
123. 단락 121의 방법에서, 단계 (a)는, 활성 또는 양이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 저해되는 유전자 또는 유전자 산물과 상동인 핵산 또는, 활성 또는 양이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 저해되는 폴리펩티드와 상동인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함한다. 이때, 데이타베이스(database)내에서 전기 상동인 핵산 또는 상동인 폴리펩티드를 동정하기 위하여 디폴트 변수를 가진 BLASTN 버전 2.0 및 FASTA 버전 3.0t78d으로 구성된 그룹으로부터 알고리즘을 선택하여 사용한다.
124. 단락 121의 방법에서, 단계 (a)는 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전기 핵산 또는 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전기 핵산의 상보체와 혼성화하는(hybridize) 핵산들을 동정함으로써, 상동 핵산 또는 상동 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
125. 단락 121의 방법에서, 단계 (a)는 전기 시험 세포 내에서 서열번호 8-3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
126. 단락 121의 방법에서, 단계 (a)는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei,Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 시험 세포에서 상동 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 상동 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
127. 단락 121의 방법에서, 단계 (a)는 대장균을 제외한 시험 세포에서 상동 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 상동 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
128. 단락 121의 방법에서, 전기 저해 핵산은 안티센스 핵산이다.
129. 단락 121의 방법에서, 전기 저해 핵산은 전기 상동체의 부위에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
130. 단락 121의 방법에서, 전기 저해 핵산은 전기 상동체를 암호화하는 오페론의 부위에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
131. 단락 121의 방법에서, 전기 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산에 접촉시키는 단계는 전기 세포의 표면에 전기 저해 핵산에 직접적으로 접촉시키는 단계를 포함한다.
132. 단락 121의 방법에서, 전기 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산에 접촉시키는 단계는 전기 세포에서 전기 상동체로부터 전사되는 RNA의 적어도 한부분에 상보적인 안티센스 핵산을 전사하는 단계를 포함한다.
133. 단락 121의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
134. 단락 121의 방법에서, 전기 유전자는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
135. 단락 21의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
136. 하기의 단계를 포함하는, 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 시험 세포를 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 준치사량의 핵산 또는 전기 핵산을 수득한 세포의 증식을 저해하는 부위와 접촉시켜 전기 미생물을 감작시키는 단계;
(b) 전기 단계 (a)의 감작 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여, 전기 감작 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
137. 단락 136의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 시험 세포의 증식을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작 시험 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
138. 단락 136의 방법을 이용하여 동정한 화합물.
139. 단락 136의 방법에서, 전기 시험 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigellaflexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
140. 단락 136의 방법에서, 시험 세포의 대장균이 아니다.
141. 하기의 단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로(pathway)에 대하여 활성을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 세포 내에서 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키기 위하여, 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 준치사량의 안티센스 핵산을 제공함으로써 세포를 감작시키는 단계, 이때, 전기 유전자 산물의 활성 또는 발현은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해된다.;
(b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 감작세포의 성장을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
142. 단락 141의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 세포의 성장을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작세포의 성장을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
143. 단락 141의 방법에서, 전기 세포는 세균 세포, 진균 세포, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
144. 단락 141의 방법에서, 전기 세포는 그람 양성 세균이다.
145. 단락 144의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
146. 단락 145의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus aureus이다.
147. 단락 146의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
148. 단락 141의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
149. 단락 141의 방법에서, 전기 세포는 대장균 세포가 아니다.
150. 단락 141의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
151. 단락 141의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 유도가능한 프로모터로부터 전사된다.
152. 단락 141의 방법에서, 전기 방법은 전기 세포에 전기 유도가능한 프로모터로부터 전기 안티센스 핵산의 전사를 준치사 수준으로 유도하는 시약(agent)를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
153. 단락 141의 방법에서, 증식의 저해는 액체 배양액(liquid culture)의 흡광도를 모니터링하여 측정된다.
154. 단락 141의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
155. 단락 141의 방법에서, 전기 유전자 산물을 암호화하는 전기 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
156. 단락 141의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
157. 하기의 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 세포를, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(b) 전기 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 유전자 산물에 작용하여 전기 접촉된 세포의 증식을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계.
158. 단락 157의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 전기 작용제와 접촉하지 않은 세포의 증식을 감소시키는 것보다 더 큰 정도로 전기 접촉된 세포의 증식을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
159. 단락 157의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae,Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
160. 단락 157의 방법에서, 전기 세포는 대장균 세포가 아니다.
161. 단락 157의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
162. 단락 157의 방법에서, 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 전기 작용제는 증식에 필요한 유전자 또는 오페론에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
163. 단락 157의 방법에서, 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 전기 작용제는 미생물의 성장 또는 증식을 저해하는 것으로 알려진 화합물을 포함한다.
164. 단락 157의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포의 증식에 필요한 전기 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 변이(mutation)를 가진다.
165. 단락 157의 방법에서, 전기 변이는 온도에 민감한(temperature sensitive) 변이다.
166. 단락 157의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
167. 단락 157의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
168. 증식에 필요한 유전자 또는 그 유전자 산물이 포함된 생물학적 경로를 밝혀내는 방법, 이때, 전기 유전자 또는 유전자 산물은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물을 포함한다. 전기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 시험 세포내에 전기 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 준치사량의 안티센스 핵산을 제공하는 단계;
(b) 전기 시험 세포를, 작용하는 생물학적 경로가 알려져 있으며, 미생물의 성장 또는 증식을 저해하는 것으로 알려진 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 시험 세포가 전기 화합물과 접촉하지 않은 세포에 비하여 전기 화합물에 민감한지의 정도를 결정하는 단계.
169. 단락 168의 방법에서, 전기 결정 단계는, 전기 세포가 전기 화합물에 대하여 전기 준치사량의 안티센스 핵산을 발현하지 않은 세포보다 실질적으로 더큰 민감성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
170. 단락 168의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
171. 단락 168의 방법에서, 전기 시험 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
172. 단락 168의 방법에서, 전기 시험 세포는 대장균 세포가 아니다.
173. 단락 168의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
174. 하기의 단계를 포함하는 시험 화합물이 작용하는 생물학적 경로를 결정하는 방법:
(a) 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 준치사량을 최초 세포에 제공하는 단계, 이때 전기 증식에 필요한 핵산은 활성 또는 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되며, 그 또는 그에 의하여 암호화되는 단백질이 존재하는 생물학적 경로가 알려져있다;
(b) 전기 첫번째 세포를 전기 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 세포에서 전기 시험 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 최초 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
175. 단락 174의 방법에서, 전기 결정 단계는, 전기 시험 세포가 전기 시험 화합물에 대하여 전기 준치사량의 안티센스 핵산을 발현하지 않은 세포보다 실질적으로 더 큰 민감성을 가지는지의 정도를 결정하는 단계를 포함한다.
176, 전기 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(d) 전기 단계 (a)에서의 전기 증식에 필요한 핵산과 다른 생물학적경로에 존재하는, 증식에 필요한 두번째 핵산에 상보적인 두번째 안티센스 핵산 준치사량을 두번째 세포내에 도입하는 단계; 및,
(e) 전기 두번째 세포가 전기 시험 화합물에 대하여 전기 준치사량의 두번째 안티센스 핵산을 발현하지 않는 세포보다 실질적으로 더 큰 민감성을 갖지 않는지의 여부를 결정하는 단계 (이때, 전기 최초 세포가 전기 두번째 세포보다 전기 시험 화합물에 대하여 실질적으로 더 큰 민감성을 가질 경우, 전기 시험 화합물은 전기 단계 (a)에서의 안티센스 핵산이 작용하는 생화학적 경로에 대하여 특이적이다).
177. 단락 174의 방법에서, 전기 첫번째 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
178. 단락 174의 방법에서, 전기 시험 세포는 대장균 세포가 아니다.
179. 단락 174의 방법에서, 전기 증식에 필요한 핵산은 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
180. 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
181. 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성이나 발현이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물과 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물.
182. 단락 181의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나를 포함하는 폴리펩티드이다.
183. 단락 181의 방법에서, 전기 유전자는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
184. 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물.
185. 하나 이상의 후보 화합물을 탐색하여, 서열번호 8 내지 3795으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 산물을 포함하는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 단계 및, 이렇게 동정된 전기 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 항생제를 제조하는 방법.
186. 단락 185의 방법에서, 전기 탐색 단계는 단락 44, 68, 121,136,141,157의 방법들 중 어느 하나를 수행하는 단계를 포함한다.
187. 단락 185의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나를 포함하는 폴리펩티드이다.
188. 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물의 유효한 양을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 전기 대상에서 세포 증식을 저해시키는 방법.
189. 단락 188의 방법에서, 전기 대상은 척추동물(vertebrate), 포유동물(mammal), 조류(avian), 및 인간으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
190. 단락 188의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
191. 단락 188의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
192. 단락 188의 방법에서, 전기 세포는 대장균이 아니다.
193. 단락 188의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득된 것이다.
194. 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나의 암호화 서열로 필수적으로 구성되는 정제되거나 분리된 핵산.
195. 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에서 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 및 50개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단락 8의 핵산의 절편.
196. BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 절편들, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012에 상보적인 뉴클레오티드 서열들 및, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 절편들에 상보적인 뉴클레오티드 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
197. 단락 196의 방법에서, 전기 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae,Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
198. 단락 196의 방법에서, 전기 핵산은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
199. 세포 내에서 유전자 산물의 활성을 저해하거나 양을 감소시키는 단계, 또는 전기 세포에서 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 양을 감소시키는 단계를 포함하는 세포의 증식을 저해하는 방법. 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 사지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 그 활성이 유전자 산물에 의한 서열번호 8 내지 3795으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 서로 상보적인 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
200. 단락 199의 방법에서, 전기 방법은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacterpylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체에서, 전기 유전자 산물의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 단계, 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 단계를 포함한다.
201. 단락 199의 방법에서, 전기 방법은 대장균 이외의 개체에서, 전기 유전자 산물의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 단계, 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 단계를 포함한다.
202. 단락 199의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득된 것이다.
203. 단락 199의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된 것으로서 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드와 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 의하여 그 활성이 상보되는(complemented) 폴리펩티드를 포함한다.
204. 단락 199의 방법에서, 전기 유전자 산물은, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 암호화된다.
205. 하기의 단계를 포함하는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 방법:
후보 화합물을 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 그 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 유전자 산물와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물에 접촉시키는 단계; 및
전기 후보 화합물이 전기 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 단계.
206. 단락 205의 방법에서, 전기 유전자 산물은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans,Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
207. 단락 205의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균이외의 개체로부터 수득한 것이다.
208. 단락 205의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된 것으로서 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드와 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 의하여 그 활성이 상보되는(complemented) 폴리펩티드를 포함한다.
209. 단락 205의 방법에서, 전기 유전자 산물은, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화 되는 핵산 등으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 암호화된다.
210. 단락 205의 방법을 사용하여 동정되는 화합물.
211. 하기의 단계를 포함하는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물 또는 핵산을 동정하는 방법:
(a) 유전자 또는 RNA인 표적물을 제공하는 단계, 이때, 전기 표적물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 포함한다;
(b) 전기 표적물을 후보 화합물 또는 핵산과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 표적물의 활성을 측정하는 단계.
212. 단락 211의 방법에서, 표적 유전자 또는 RNA는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeriamonocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 개체로부터 수득한 것이다.
213. 단락 211의 방법에서, 표적 유전자 또는 RNA는 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
214. 단락 211의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
215. 단락 211의 방법에서, 전기 표적물은 전령 RNA 분자 이며, 전기 활성은 전기 전령 RNA의 번역(translation)이다.
216. 단락 211의 방법에서, 전기 화합물은 핵산이며, 전기 활성은 전기 유전자 산물의 번역이다.
217. 단락 211의 방법에서, 전기 표적물은 유전자이고, 전기 활성은 전기 유전자의 전사이다.
218. 단락 211의 방법에서, 전기 표적물은 비번역(nontranslated) RNA이고,전기 활성은 전기 비번역 RNA의 처리(processing) 또는 폴딩(folding) 또는 전기 비번역 RNA의 단백질/RNA 복합체로의 조립(assembly)이다.
219. 단락 211의 방법에서, 전기 표적 유전자는 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된 것으로서 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드와 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 의하여 그 활성이 상보되는(complemented) 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 분자이다.
220. 단락 11의 방법에서, 전기 유전자는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화 되는 핵산 등으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
221. 단락 211의 방법을 사용하여 동정되는 화합물 또는 핵산.
222. 하기의 단계를 포함하는 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 세포 내에서 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키기 위하여, 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 준치사량의 안티센스 핵산을 제공함으로써 감작 세포를 생산하는 단계, 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 포함한다;
(b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 감작세포의 성장을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
223. 단락 222의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작 세포의 성장을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 감작 세포의 증식을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
224. 단락 222의 방법에서, 전기 감작 세포는 그람 양성 세균이다.
225. 단락 224의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은 Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
226. 단락 225의 방법에서, 전기 세균은Staphylococcus aureus이다.
227. 단락 224의 방법에서 전기 Staphylococcus종은 응고효소 음성이다.
228. 단락 226의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
229. 단락 222의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis,Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된 개체이다.
230. 단락 222의 방법에서, 전기 세포는 대장균 이외의 개체이다.
231. 단락 222의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
232. 단락 222의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 유도가능한 프로모터로부터 전사된다.
233. 단락 222의 방법에서, 전기 방법은 전기 세포를 전기 안티센스 핵산의 준치사량의 전사를 유도하는, 어떤 농도의 유발 물질(inducer)과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
234. 단락 222의 방법에서, 성장 저해는 액체 배양액(liquid culture)의 흡광도를 모니터링하여 측정된다.
235. 단락 222의 방법에서, 전기 유전자 산물은 폴리펩티드이다.
236. 단락 235의 방법에서, 전기 폴리펩티드는 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된 것으로서, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드와 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드에 의하여 그 활성이 상보될 수 있는(complemented) 폴리펩티드를 포함한다.
237. 단락 222의 방법에서, 전기 유전자 산물은 RNA이다.
238. 단락 222의 방법에서, 전기 유전자 산물을 암호화하는 전기 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70% 이상의 핵산 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화 되는 핵산 등으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
239. 단락 222의 방법을 사용하여 동정되는 화합물.
240. 유전자 산물에 대하여 활성을 가지는 화합물, 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 유전자에 대한 활성을 가지는 화합물을 전기 유전자 산물을 발현하는 세포 개체군(population)내로 도입하는 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 방법. 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 유전자 산물와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
241. 단락 240의 방법에서, 전기 화합물은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산이다.
242. 단락 240의 방법에서, 서열번호 8 내지 3795중 하나의 전기 증식 저해 부분은 전기 서열번호 8 내지 3795중 하나에서 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 51개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편이다.
243. 단락 240의 방법에서, 전기 개체군은 그람 양성 세균의 개체군이다.
244. 단락 243의 방법에서, 전기 그람 양성 세균의 개체군은Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종의 개체군으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
245. 단락 243의 방법에서, 전기 개체군은Staphylococcus aureus의 개체군이다.
246. 단락 245의 방법에서, 전기 개체군은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세균의 개체군이다.
247. 단락 240의 방법에서, 전기 개체군은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세균의 개체군이다.
248. 단락 240의 방법에서, 전기 개체군은 대장균이외의 개체군이다.
249. 단락 240의 방법에서, 전기 유전자의 전기 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득된 것이다.
250. 단락 240의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된 것으로서, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드와 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드에 의하여 그 활성이 상보될수 있는(complemented) 폴리펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
251. 단락 240의 방법에서, 전기 유전자는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70% 이상의 핵산 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 핵산을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화 되는 핵산을 포함하는 핵산 등으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
252. 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 내에 유효한 농도의 안티센스 핵산을 포함하는 제제(preparation), 이때, 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 증식 저해 부위와 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산 , 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
253. 단락 252의 제제에서, 전기 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 증식 저해 부분은 서열번호 8 내지 3795 중 하나에서 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 50개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다.
254. 세포 개체군 내의 세포를 안티센스 방향으로 오페론의 증식저해 부위를 적어도 하나 포함하는 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 오페론 내의 유전자의 발현 또는 활성을 저해하는 방법, 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
255. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 증식 저해 부위와 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등을 포함한다.
256. 단락 254의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacterpylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
257. 단락 254의 방법에서, 전기세포는 대장균 세포가 아니다.
258. 단락 254의 방법에서, 전기 유전자는 대장균 이외의 개체로부터 수득한 것이다.
259. 단락 254의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포 개체군내로 전기 안티센스 핵산을 전사하는 플라스미드(plasmid)를 도입하여 전기 안티센스 핵산과 접촉된다.
260. 단락 254의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포 개체군내로 전기 안티센스 핵산을 전사하는 파아지(phage)를 도입하여 전기 안티센스 핵산과 접촉된다.
261. 단락 254의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포 개체군내에서 전기 세포의 염색체로부터 전기 안티센스 핵산을 전사함으로써, 전기 안티센스 핵산과 접촉된다.
262. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 핵산의 염색체 복제(chromosomal copy)에 인접한 프로모터를 도입하여 전기 프로모터가 전기 안티센스 핵산의 합성을 이끌도록 함으로써 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
263. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 핵산을 발현하는 레트론(retron)을 전기 세포 개체군으로 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
264. 단락 254의 방법에서, 리보자임(ribozyme)을 전기 세포 개체군내로 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킬 수 있는데, 이때, 전기 리보자임의 결합 부위는 전기 안티센스 핵산에 상보적이다.
265. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포솜(liposome)을 전기 세포에 도입하여 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
266. 단락 254의 방법에서, 안티센스 핵산을 전기 세포내로 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 사용함으로써 전기 세포를 전기 안티센스 핵산과 접촉시킨다.
267. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 50개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가진다.
268. 단락 254의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 합성된(synthetic) 올리고뉴클레오티드이다.
269. 단락 254의 방법에서, 전기 유전자는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
270. 하기의 단계를 포함하는, 세포의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법:
(a) 세포를 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 증식 저해 부위와 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 , 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계, 이때, 전기 세포는전기 핵산을 수득한 세포를 제외한 세포이다;
(b) 전기 핵산이 전기 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계; 및
(c) 전기 안티센스 핵산 또는 그 부분에 상보적인 mRNA를 암호화하는 전기 세포 내의 유전자를 동정하는 단계.
271. 단락 270의 방법에서, 전기 세포는Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
272. 단락 270의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
273. 단락 270의 방법에서, 전기 세포는 대장균이 아니다.
274. 단락 270의 방법에서, 전기 방법은 벡터에 포함된 전기 세포에서 기능하는 프로모터에 안티센스 핵산을 작동가능하게 연결하고, 전기 벡터를 전기 세포에 도입시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
275. 하기의 단계를 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 시험 세포에서 그 활성 또는 양이 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 또는 유전자 산물의 상동체(homolog)를 동정하는 단계, 이때, 시험 세포는 전기 안티센스 핵산을 수득한 미생물이 아니며, 전기 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다;
(b) 전기 시험 세포 내에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해 핵산서열을 동정하는 단계;
(c) 전기 시험 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산과 접촉시켜 전기 시험 세포를 감작시키는 단계;
(d) 전기 단계 (c)의 감작된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(e) 전기 화합물이 전기 저해 핵산을 발현하지 않는 세포에 비하여 전기 감작된 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
276. 단락 275의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 세포의 증식을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
277. 단락 275의 방법에서, 단계 (a)는, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 그 활성또는 양이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물과 상동인 핵산 또는, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 그 활성또는 양이 저해되는 폴리펩티드와 상동인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함한다. 이때, 데이타베이스(database)내에서 전기 상동인 핵산 또는 상동인 폴리펩티드를 동정하기 위하여 매개변수를 가진BLASTN 버전 2.0 및 FASTA 버전 3.0t78로 구성된 그룹으로부터 알고리즘을 선택하여 사용한다.
278. 단락 275의 방법에서, 단계 (a)는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 전기 핵산 또는 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전기 핵산 뉴클레오티드 서열의 상보체와 혼성화되는(hybridize) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산들을 동정함으로써, 상동 핵산 또는 상동 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
279. 단락 275의 방법에서, 단계 (a)는 전기 시험 세포 내에서 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
280. 단락 285의 방법에서, 단계 (a)는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae,Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 시험 세포에서 상동 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 상동 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
281. 단락 275의 방법에서, 단계 (a)는 대장균을 제외한 시험 세포에서 상동 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 상동 핵산을 동정하는 단계를 포함한다.
282. 단락 275의 방법에서, 전기 저해 핵산은 안티센스 핵산이다.
283. 단락 275의 방법에서, 전기 저해 핵산은 전기 상동체의 부위에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
284. 단락 275의 방법에서, 전기 저해 핵산은 전기 상동체를 암호화하는 오페론의 부위에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
285. 단락 275의 방법에서, 전기 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산에 접촉시키는 단계는 전기 세포를 전기 저해 핵산에 직접적으로 접촉시키는 단계를 포함한다.
286. 단락 275의 방법에서, 전기 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산에 접촉시키는 단계는 전기 세포에서 전기 상동체에대한 안티센스 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
287. 단락 275의 방법에서, 전기 유전자 산물은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
288. 단락 275의 방법에서, 전기 유전자는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
289. 단락 275의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
290. 하기의 단계를 포함하는, 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 시험 세포를 준치사량의 안티센스 핵산과 접촉시켜 전기 세포를 감작시키는 단계, 이때, 전기 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다;
(b) 전기 단계 (a)의 감작 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여, 전기 감작 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
291. 단락 290의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 시험 세포의 증식을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작 시험 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
292. 단락 290의 방법을 이용하여 동정한 화합물.
293. 단락 290의 방법에서, 전기 시험 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus,Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
294. 단락 290의 방법에서, 시험 세포는 대장균이 아니다.
295. 하기의 단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로(pathway)에 대하여 활성을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 세포 내에서 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키기 위하여, 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 준치사량의 안티센스 핵산을 제공함으로써 세포를 감작시키는 단계, 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 그 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
(b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 감작 세포의 성장을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
296. 단락 295의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 비감작(nonsensitized) 세포의 성장을 저해하는 것보다 더 큰 정도로 전기 감작세포의 성장을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
297. 단락 295의 방법에서, 전기 세포는 세균 세포, 진균 세포, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
298. 단락 295의 방법에서, 전기 세포는 그람 양성 세균이다.
299. 단락 298의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus종,Streptococcus종, Enterococcus종, Mycobacterium종,Clostridium종, 및Bacillus종으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
300. 단락 299의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus aureus이다.
301. 단락 298의 방법에서, 전기 그람 양성 세균은Staphylococcus aureusRN450과Staphylococcus aureusRN4220으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
302. 단락 295의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae,Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
303. 단락 295의 방법에서, 전기 세포는 대장균 세포가 아니다.
304. 단락 295의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
305. 단락 295의 방법에서, 전기 안티센스 핵산은 유도가능한 프로모터로부터 전사된다.
306. 단락 305의 방법에서, 전기 방법은 전기 세포를 전기 유도가능한 프로모터로부터 전기 안티센스 핵산의 발현을 준치사 수준으로 유도하는 시약(agent)과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
307. 단락 295의 방법에서, 증식의 저해는 액체 배양액(liquid culture)의 흡광도를 모니터링하여 측정된다.
308. 단락 295의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어오 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
309. 단락 295의 방법에서, 전기 유전자 산물을 암호화하는 전기 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
310. 단락 295의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
311. 하기의 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
(a) 세포를 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 작용제와 접촉시키는 단계, 이때, 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ;
(b) 전기 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 작용제에 접촉되지 않은 세포에 비하여 전기 접촉된 세포의 증식을 감소시키는 정도를 결정하는 단계.
312. 단락 311의 방법에서, 전기 결정 단계는 전기 화합물이 전기 작용제와 접촉하지 않은 세포의 증식을 감소시키는 것보다 더 큰 정도로 전기 접촉된 세포의 증식을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
313. 단락 311의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
314. 단락 311의 방법에서, 전기 세포는 대장균 세포가 아니다.
315. 단락 311의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
316. 단락 311의 방법에서, 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 전기 작용제는 증식에 필요한 유전자 또는 오페론에 대한 안티센스 핵산을 포함한다.
317. 단락 311의 방법에서, 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 전기 작용제는 세포의 성장 또는 증식을 저해하는 것으로 알려진 화합물을 포함한다.
318. 단락 311의 방법에서, 전기 세포는 전기 세포의 증식에 필요한 전기 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 변이(mutation)를 가진다.
319. 단락 311의 방법에서, 전기 변이는 온도에 민감한(temperature sensitive) 변이다.
320. 단락 311의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
321. 단락 311의 방법을 사용하여 동정된 화합물.
322. 증식에 필요한 유전자 산물 또는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 유전자가 포함되는 생물학적 경로를 밝혀내는 방법:
(a) 시험 세포내에 전기 증식에 필요한 유전자 산물 또는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 전기 유전자의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 준치사량의 안티센스 핵산을 제공하는 단계, 이때 전기 증식에 필요한 유전자 산물은BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다;
(b) 전기 시험 세포를, 작용하는 생물학적 경로가 알려져 있으며, 세포의 성장 또는 증식을 저해하는 것으로 알려진 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기시험 세포의 성장 또는 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
323. 단락 322의 방법에서, 전기 결정 단계는, 전기 시험 세포가 전기 화합물에 대하여 전기 준치사량의 안티센스 핵산을 발현하지 않은 세포보다 실질적으로 더 큰 민감성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
324. 단락 322의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
325. 단락 322의 방법에서, 전기 시험 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
326. 단락 322의 방법에서, 전기 시험 세포는 대장균 세포가 아니다.
327. 단락 322의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터수득된 것이다.
328. 하기의 단계를 포함하는 시험 화합물이 작용하는 생물학적 경로를 결정하는 방법:
(a) 세포에 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 준치사량을 제공하여 감작세포를 제조하는 단계, 이때, 전기 안티센스 핵산은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열또는 그의 증식 저해 부위와 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 전기 증식에 필요한 핵산 또는 전기 증식에 필요한 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 포함되는 생물학적 경로는 알려져 있다;
(b) 전기 세포를 전기 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
(c) 전기 시험 화합물이 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 전기 감작 세포의 증식을 저해하는 정도를 결정하는 단계.
329. 단락 328의 방법에서, 전기 결정 단계는, 전기 시험 세포가 전기 시험 화합물에 대하여 전기 준치사량의 안티센스 핵산을 발현하지 않은 세포보다 실질적으로 더 큰 민감성을 가지는지의 정도를 결정하는 단계를 포함한다.
330. 전기 방법은 하기의 단계를 추가로 포함한다:
(d) 증식에 필요한 두번째 핵산에 상보적인 두번째 안티센스 핵산 준치사량을 두번째 세포내에 제공하는 단계, 이때 전기 증식에 필요한 두번째 핵산은 단계 (a)의 증식에서의 필요한 핵산과 서로 다른 생물학적 경로에 존재한다; 및,
(e) 전기 두번째 세포가 전기 시험 화합물에 대하여 전기 준치사량의 두번째 안티센스 핵산을 발현하지 않는 세포보다 실질적으로 더 큰 민감성을 갖지 않는지의 여부를 결정하는 단계, 이때, 전기 감작 세포가 전기 두번째 세포보다 전기 시험 화합물에 대하여 실질적으로 더 큰 민감성을 가질 경우, 전기 시험 화합물은 전기 단계 (a)에서의 안티센스 핵산이 작용하는 생화학적 경로에 대하여 특이적이다.
331. 단락 328의 방법에서, 전기 감작 세포는Anaplasama marginale,Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
332. 단락 328의 방법에서, 전기 감작 세포는 대장균 세포가 아니다.
333. 단락 328의 방법에서, 전기 증식에 필요한 핵산은 대장균 이외의 개체로부터 수득된 것이다.
334. 증식에 필요한 유전자 산물 또는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 유전자와 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물, 이때 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다;.
335. 단락 334의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
336. 단락 334의 방법에서, 전기 유전자는 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열또는 그의 증식 저해 부위와 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
337. 하기의 단계를 포함하는 항생제를 제조하는 방법
하나 이상의 후보 화합물을 탐색하여, 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 단계, 이때 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 및,
이렇게 동정된 화합물을 제조하는 단계.
338. 단락 337의 방법에서, 전기 탐색 단계는 단락 205, 211, 222, 275, 290, 295, 311의 방법들 중 어느 하나를 수행하는 단계를 포함한다.
339. 단락 337의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
340. 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물의 유효한 양을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 전기 대상에서 세포 증식을 저해시키는 방법, 이때 전기 유전자 산물은 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 유전자 산물, BLASTN 버전 2.0을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산으로부터 암호화되는 유전자 산물, FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물, 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 혼성화가 용이한 조건하에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물, 및 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
341. 단락 340의 방법에서, 전기 대상은 척추동물(vertebrate), 포유동물(mammal), 조류(avian), 및 인간으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
342. 단락 340의 방법에서, 전기 유전자 산물은 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 그 매개변수에 의해, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
343. 단락 340의 방법에서, 전기 세포는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
344. 단락 340의 방법에서, 전기 세포는 대장균이 아니다.
345. 단락 340의 방법에서, 전기 유전자 산물은 대장균 이외의 개체로부터 수득된 것이다.
정의
"생물학적 경로(biological pathway)"는, 유전자 산물 또는 유전자 산물들의 부분집합(subset)에 의하여 수행되는 어떠한 분리된 세포 기능 또는 과정을 의미한다. 생물학적 경로는 세포벽(cell wall) 등의 세포 구조물 생산에 관련된 경로들 뿐 아니라, 동화(anabolic), 이화(catabolic), 효소적, 생화학적 및 대사(metabolic) 경로들을 포함한다. 세포 또는 미생물의 증식에 보통 필요한 생물학적 경로들에는, 세포분열, DNA 합성 및 복제, RNA 합성(전사), 단백질 합성(번역), 단백질 처리(processing), 단백질 수송(transport), 지방산 생합성, 전자 전달 사슬(electron transport chain), 세포벽 합성, 세포막 생산, 합성 및 유지 등이 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.
"유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해한다"는 것은 유전자의 발현을 감소시키는 방식, 전기 유전자의 산물의 양 또는 그 활성을 감소시키는 방식 또는 유전자 또는 유전자 산물과 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자와의 상호작용을 저해하는 방식으로 유전자 또는 유전자 산물의 기능을 방해하는 능력을 가진다는 것을의미한다. 유전자의 활성을 저해하는 작용제로는 전기 유전자의 전사를 저해하는 작용제, 전기 유전자의 전사물의 처리를 저해하는 작용제, 전기 유전자의 전사물의 안정성(stability)을 감소시키는 작용제, 및 전기 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 저해하는 작용제가 있다. 미생물내에서, 유전자의 활성을 저해하는 작용제는 전기 유전자가 위치한 오페론의 발현을 감소시키거나 또는 오페론 RNA의 폴딩 또는 처리를 변경시켜 전기 유전자 산물의 양 또는 활성을 감소시키는데 작용할 수 있다. 전기 유전자 산물은 리보솜 RNA(ribosomal RNA) 등의 비번역 RNA, 번역 RNA(mRNA) 또는 전기 유전자 mRNA의 번역의 결과로서 생긴 단백질 산물일 수 있다. 본 발명에 대한 특별한 이용 중에는, 그들이 특이적으로 혼성화하는 오페론 또는 유전자에 대하여 활성을 가지는 안티센스 RNA들이 있다.
"유전자 산물에 대항하는 활성(activity against a gene product)"이라는 것은 세포 내에서 전기 유전자 산물의 기능을 저해하거나 또는, 그 양 또는 그 활성을 감소시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다. 이는, 전기 유전자 산물의 효소활성 또는 전기 유전자 산물의 다중 구조(multimeric structure)로의 조립(assembly)을 저해하는 것을 포함하여 전기 유전자 산물이 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자들과 상호작용하는 능력을 저해하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"단백질에 대항하는 활성"이라는 것은 세포 내에서 전기 단백질의 기능을 저해하거나 또는, 그 양 또는 그 활성을 감소시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다. 이는, 전기 단백질의 효소활성 또는 전기 단백질의 다중 구조(multimeric structure)로의 조립(assembly)을 저해하는 것을 포함하여 전기 단백질이 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자들과 상호작용하는 능력을 저해하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"핵산에 대항하는 활성"이라는 것은 세포 내에서 전기 핵산의 기능을 저해하거나 또는, 그 양 또는 그 활성을 감소시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다. 이는, 전기 핵산의 다중 구조(multimeric structure)로의 조립(assembly)을 저해하는 것을 포함하여 전기 핵산이 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자들과 상호작용하는 능력을 저해하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"유전자에 대항하는 활성"이라는 것은 세포 내에서 전기 유전자의 기능 또는 그 발현을 저해하는 능력을 갖고 있음을 의미한다. 이는, 전기 유전자가 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자들과 상호작용하는 능력을 저해하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"오페론에 대항하는 활성"이라는 것은 세포 내에서 전기 오페론의 기능을 저해하거나 또는 전기 오페론의 하나 이상의 산물들의 양을 감소시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다. 이는, 오페론의 하나 또는 그이상의 산물들의 효소적 활성을 저해하거나, 오페론의 하나 또는 그이상의 산물들이 그 활성에 필요한 다른 생물학적 분자들과 상호작용하는 능력을 저해하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"항생제(antibiotic)"는 미생물의 증식을 저해하는 작용제를 의미한다.
"E. coli또는Escherichia coli"는Escherichia coli또는Shigella boydii, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Shigella 2A등을 포함하는Shigella종으로서 이전에 분류된 어떤 개체를 의미한다.
"상동 암호화 핵산(homologous coding nucleic acid)"은 서열 번호 8 내지 3795 또는 그 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에의하여 그 발현 또는 활성이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상동인 핵산을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 상동 암호화 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 와 그의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편들로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 705의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 상동 암호화 핵산은 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드와 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 그의 절편들로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80% 또는 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가질 수 있다. 전기 동일성은 매개변수를 가지는 BLASTN 버전 2.0 또는 tBLASTX를 사용하여 측정된다(참조: 알츠철, 에스.에프. 외. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res., 25: 3389-3402(1997)). 다른 의미로, "상동 암호화 핵산"은 기능적인 오르토로그 집합(orthologue cluster)의 관점에서의 유전자의 구성원으로 정의될 수 있다. 전기 오르토로그 집합의 모든 다른 구성원들은 상동인 것으로 간주된다. 이러한 기능적 오르토로그 집합들의 라이브러리는http://www.ncbi.nlm.gov/COG에서 찾을 수 있다. 하나의 유전자는 전기 웹사이트에서 활용가능한 COGNITOR 프로그램을 사용하거나 또는 관심있는 유전자를 COG의 구성원과 직접 BLASTP 비교하고 그 결과를 타투소브, 알.엘., 갈페린, 엠.와이., 나탈, 디.에이 및 쿠닌, 이.브이. (2000) The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution. Nucleic Acids Res., v. 28 n. 1, pp33-36 에서 서술한 대로 분석하여 어떤 오르토로구스 그룹의 집합(cluster of orthologous group) 또는 COG로 분류될 수 있다.
"상동 암호화 핵산"은 또한, 매개변수를 가지는 FASTA 버젼 3.0t78을 사용하여 결정되는 것으로서 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 그 발현이 저해되는 폴리펩티드 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 그의 절편에 대하여 적어도 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40% 또는 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 또 다른 의미로, 단백질 동일성 또는 유사성은 매개변수를 가지는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 또는 tBLASTX를 사용하여 밝혀질 수 있다(참조: 알츠철, 에스.에프. 외. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res., 25: 3389-3402(1997)).
또한 "상동 암호화 핵산"은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916내지 10012 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 혼성화 되는 암호화 핵산과 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 서열에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지않은 조건 하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화 핵산을 포함한다. 여기에서 사용되는 "혼성화가 용이하지 않은 조건(stringent condition)"은 약 45℃의 6xSSC에서 필터에 결합된 핵산을 혼성화 시킨 후, 약 68℃의 0.1xSSC/0.2% SDS로 한번 또는 그이상 세척함을 의미한다. 혼성화가 용이하지 않은 조건의 다른 예는 특정 탐침에 사용되는 것으로서 37℃, 48℃, 55℃, 및 60℃의 6xSSC/0.05% sodium phosphate로 세척하는 것이다.
또한 "상동 암호화 핵산"은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산에 혼성화가 용이한 조건 하에서 혼성화 되는 암호화 핵산과 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 서열에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이한 조건 하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화 핵산을 포함한다. 여기에서 사용되는 "혼성화가 용이한 조건(moderate condition)"은 약 45℃의 6xSSC에서 필터에 결합된 핵산을 혼성화 시킨 후, 약 42-65℃의 0.1xSSC/0.2% SDS로 한번 또는 그 이상 세척함을 의미한다.
또한 "상동 암호화 핵산"은 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 그 활성이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 전기 상동 암호화 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물을 암호화할 수 있다. 다른 실시 태양에서, 상동 암호화 핵산은 서열번호 3745 내지 4773의 폴리펩티드중 하나에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
"상동 안티센스 핵산"은 서열번호 8 내지 3795의 서열 중 하나로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 그의 절편에 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80% 또는 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 상동 안티센스 핵산은 또한 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 서열 중 하나에 상보적인 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 그의 절편에 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80% 또는 적어도70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 전기 상술한 바에 의하여 결정될 수 있다.
또한, "상동 안티센스 핵산"은 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산과 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 포함한다. 아울러, 상동 안티센스 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화가 용이하지않은 조건하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산과 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 포함한다.
"상동 안티센스 핵산"은 또한, 혼성화가 용이한 조건 하에서 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산과 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이한 조건 하에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 포함한다. 아울러, 상동 안티센스 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 혼성화가 용이하지않은 조건하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산과 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지 않은 조건 하에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 포함한다.
"상동 폴리펩티드"는 서열번호 8 내지 3795로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 상동 안티센스 핵산에 의하여 그 발현 또는 활성이 저해되는 폴리펩티드에 상동인 폴리펩티드를 의미한다. "상동 폴리펩티드"는 서열번호 8 내지 3795로 구성되는 그룹으로부터 선택된 핵산 또는 그 상동 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이나 활성이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40% 또는 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가지는 폴리펩티드, 또는 서열번호 8 내지 3795로 구성되는 그룹으로부터 선택된 핵산 또는 그 상동 안티센스 핵산에 의하여 그 발현이나 활성이 저해되는 폴리펩티드의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 절편과 적어도 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40% 또는 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 동일성 또는 유사성은 매개변수를 가지는 FASTA 버젼 3.0t78 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 방법으로, 단백질 동일성 또는 유사성은 매개변수를 가지는 BLASTP, BLASTX, 또는 TBLASTN으로 밝혀낼 수 있다(참조: 알츠철, 에스.에프. 외. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res., 25: 3389-3402(1997)).
"상동 폴리펩티드"는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드와 적어도 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40% 또는 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가지는 폴리펩티드, 또는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 절편과 적어도 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40% 또는 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 8 내지 3795, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산 중 하나 또는 전기 핵산 중 어떤 것의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 혼성화는 전기 상술한 혼성화가 용이하지않은 또는 용이한 조건, 또는 특정 혼성화를 일어나도록 하는 조건하에서 수행된다. 이러한 DNA 서열에 혼성화 되는 본 발명의 핵산분자는 혼성화가 매우 용이하지 않은, 또는 용이하지않은 조건하에서 표적 유전자에 혼성화되는 올리고디옥시뉴클레오티드("올리고(oligos)")를 포함한다. 일반적으로, 14 내지 70개의 뉴클레오티드 길이의 올리고의 녹는 점(melting temperature)은 하기의 식을 이용하여 계산된다:
Tm(℃) = 81,5+16.6(log[monovalent cations(molar)]+0.41(% G+C)-(500/N)
이때, N은 탐침의 길이이다. 혼성화가 포름아미드(formamide) 용액에서 수행되는 경우, 녹는 점은 하기 식으로 계산된다.
Tm(℃) = 81,5 + 16.6(log[monovalent cations(molar)]+ 0.41(% G+C)-(0.61) (%formamide)-(500/N)
이때 N은 탐침의 길이이다. 일반적으로, 혼성화는 Tm 이하의 약 20-25도에서(DNA-DNA 혼성화의 경우), 또는 Tm 이하의 약 10-15도에서(RNA-DNA 혼성화의 경우) 수행된다.
다른 혼성화 조건은 선행 기술에 명시된 바와 같다(참조: 어서벨, 에프.엠. 외., eds., 1989,Current Protocols in Molecuare Biology, Vol. Ⅰ, Green Publishing Associates, Inc. 과 존 윌리 & 손스, Inc., New York, at pp 6.3.1-6.3.6 & 2.10.3).
Salmonella는 Escherichia coli에 밀접하게 연과된 그람 음성 장내 세균의 커다란 그룹의 속명이다.Salmonella에 의해 야기되는 질병은 흔히 식료품 또는 급수의 오염때문이며 매년 수백만의 사람에게 발생한다.Salmonella분류의 전통적인 방법은 각각 혈청학적으로 구별할 수 있는 계통에 따란 분리된 종명을 부여하는 방법에 기초하였다(참조: 코프만, 에프., 1996, The vacterology of theEnterobacteriaceae,Munksgaard, 코펜하겐).Salmonella의 혈청학은 표면 항원에 기초한다(O[체강, somaitc] 와 H[편모, flagellar]). 2400 종 이상의Salmonella혈청형(serotypes 또는 serovars)이 알려져있다(참조: 포포프, 외., 2000, Res. Microbiol.. 151:63-65). 따라서, 각각의 혈청형은 분리된 종으로 간주되었으며, 흔히 그에 따라 명명되었다(e.g.S. paratyphi, S. typhimurium, S. typhi, S. enteriditis,등).
그러나, 1970년대와 1980년대 까지 이러한 시스템은 귀찮을 뿐 아니라 정확하지도 않은 것으로 간주되었다. 이어 많은Salmonella종들이S. bongorii로도 인식되는 보조적인 아종을 포함하는 하나의 단일 종(모든 혈청형과 아속 Ⅰ, Ⅱ, 및 Ⅳ그리고 모든 Arizona의 혈청형)으로 합쳐졌다. 종 명칭이 매우 다양한 표면 항원에 근거함에도 불구하고, 다른 경우에 있어서Salmonellas는 발병 결정인자(pathogenecity determinants)가 되는 주요 예외로 취급됨에 있어서 매우 유사하다.
Salmonella종의 올바른 명칭에 대하여 몇몇 논쟁이 있어왔다. 현재(참조: 브레너, 외., 2000, J. Clin. Microbiol., 38:2465-2467). 수용된 명칭은Salmonella enterica이다.S. enterica는 6개의 아종으로 나누어진다(Ⅰ,S. entericasubsp.enterica; Ⅱ,S. entericasubsp.salamae;Ⅲa,S. entericasubsp.arizonae; Ⅲb,S. enterica subsp.diarizonae;Ⅳ,S. entericasubsp.houtenae;Ⅵ,S. entericasubsp.indica) 아종 Ⅰ내에서, 혈청형은 각 혈청형(serotypes 또는 serovars)을 구분하는데 사용된다(예,S. entericaserotype Enteriditis,S. entericaTyphimurium,S. entericaserotype Typhi, 및S. entericaserotype Choleraesuis, 등). 본 발명에서는 첫번째 사용에서는 이것을 생략하지 않고 모두 표기하고(Salmonella enterica ser, Typhimurium), 이후에는 간략한 형태로(SalmonellaTyphimurium 또는 Typhimurium) 사용한다. 특히 속명과 종명(Salmonella enterica)은 이탤릭체로 표기하고 혈청형(serotype/serovar) 명칭(Typhimurium)은 그렇지 않다. 분류학회(taxonomic commitee)가 이미 공식적으로 현행 종명을 발표했기때문에, 이러한 후자의 시스템은 CDC에 의하여 채택된 것이다(참조: 브레너, 외., 2000, J. Clin. Microbiol., 38:2465-2467). 분류학적 우위와 의학적 중요성을 모두 고려하여, 이러한 혈청형들의 일부는 결국 정식 종 명칭을 부여받을 수 있었다(S.Typhi가 가장 유명하다).
그러므로, 여기에서 사용되는 "Salmonella enterica또는S. enterica"는 혈청형 Typhi, Typhimurium, Paratyphi, Choleraesuis, 등을 포함한다. 한편, "공식적인" 명칭화 시도가 진행 중에 있으며, 분류학적 명칭은 바뀔 것이다(S. choleraesuis는 단독으로 우선권에 기초하여S. enterica를 대신할 수 있는 종명이다).
"화합물을 동정한다"는 것은 조합 화학 라이브러리(combinatorial chemical library) 또는 기타 화학적 화합물들의 라이브러리 등의 화합물들의 집합 내에서 하나 이상의 화합물을 선별하거나 또는, 하나의 화합물에 대하여, 주어진 분석 방법(assay)으로 전기 화합물을 테스트하고 그것이 원하는 활성을 나타내는지의 여부를 결정함으로써 그 특성을 밝히는 것을 의미한다.
"유발자(inducer)"라는 것은, 세포 또는 미생물과 접촉시켰을 때, 원하는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 작용제 또는 용액을 의미한다.
여기에 사용된 "핵산"은 DNA, RNA 또는 변형된(modified) 핵산들을 의미한다. 따라서, "서열번호 X의 핵산" 또는 " 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산"이라는 술어는 서열번호 X의 DNA 서열 및, 전기 DNA 서열의 티미딘(thymidine)이 우리딘(uridine)으로 치환되었으며 전기 DNA 서열의 디옥시리보스(deoxyribose) 주쇄(backbone)가 리보스(ribose) 주쇄로 치환된 RNA 서열 둘 다를 포함한다. 변형된 핵산은, 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 포스포라미데이트(phosphoramidate) 및 포스페이트 에스테르(phosphate ester)의 뉴클레오티드간(internucleotide) 포스페이트 잔기(residue)를 가진 핵산 등의 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드 또는 구조를 가진 핵산들이다. 실록산(siloxane) 가교(bridge), 카보네이트(carbonate) 가교, 티오에스테르(thioester) 가교 및, 당업계에 알려진 다른 많은 것들 등의 포스페이트 아닌 것으로 뉴클레오티드들이 연결된 유사체들 또한 변형된 핵산으로 사용될 수 있다. 변형된 핵산에는 또한, α-아노머형 뉴클레오티드 단위(α-anomeric nucleotide unit)들을 포함할 수 있으며, 1,2-다이디옥시-d-리보푸라노스(1,2-dideoxy-d-ribofuranose) 1,2-다이디옥시-l-페닐리보푸라노스(1,2-dideoxy-l-phenylribofuranose) 및 N4,N4-에타노-5-메틸-시토신 (N4,N4-ethano-5-methyl-cytosine) 등의 변형된 뉴클레오티드들이 본 발명에서의 사용에 고려된다. 변형된 핵산들은 또한 전체 디옥시리보스-포스페이트 주쇄가 구조적으로는 유사하지만, 화학적으로 완전히 다른 2-아미노에틸 글리신(2-aminoethyl glycine) 단위를 함유한 폴리아미드(펩티드) 주쇄로 교환된 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)일 수도 있다.
여기서 사용된 "준치사(sub-lethal)"라는 것은 세포 성장을 완전히 저해하는데 필요한 농도 이하의 작용제의 농도를 의미한다.
도 1은, 단백질 합성에 필요하고 세포증식에 필수적인 리보솜 단백질(ribosomal protein)을 암호화하는E. coli rplW유전자(AS-rplW)에 대한 안티센스 클론(clone), 또는 단백질 합성에 관여하는 것으로는 알려져 있지 않지만 증식에는 필수적인elaD유전자(AS-elaD)에 대한 안티센스 클론 둘 중 하나를 함유한, IPTG로 유도가능한 플라스미드로 형질전환된E. coli내에서의 IPTG 반응곡선(IPTG dose response curve)이다.
도 2A는 IPTG가 결과적으로 20% 와 50%의 성장저해를 일으키는 농도로 존재하거나 존재하지 않는 조건에서,rplW유전자(AS-rplW)에 대한 안티센스를 함유한 IPTG로 유도가능한 플라스미드로 형질전환된E. coli내에서의 테트라사이클린(tetracycline) 반응 곡선이다.
도 2B는 IPTG가 결과적으로 20% 와 50%의 성장저해를 일으키는 농도로 존재하거나 존재하지 않는 조건에서,elaD유전자(AS-elaD)에 대한 안티센스를 함유한 IPTG로 유도가능한 플라스미드로 형질전환된E. coli내에서의 테트라사이클린 반응 곡선이다.
도 3은 필수 리보솜 단백질 유전자인L23(AS-rplW) 및L7/L12및L10(AS-rplLrplJ)에 대한 안티센스 클론으로 형질전환된E. coli의 테트라사이클린 민감성의 증가 배수(fold increase)를 보여주는 그래프이다. 단백질 합성에 관여하지 않는 것으로 알려진 유전자들에 대한 안티센스 클론들(atpB/E(AS-atpB/E), visC(AS-visC), elaD(AS-elaD), yohH(AS-yohH))은 테트라사이클린에 대하여 훨씬 덜 민감하다.
도 4는 자이레이즈 β소단위(gyrase βsubunit)을 암호화하는gyrB유전자에 상보적인 안티센스 핵산을 전사하는Staphylococcus aureus세포를 표적이 알려진 몇가지 항생제에 접촉시킨 시험 결과를 나타낸다.
본 발명은 세포 증식에 필요한 일군의 원핵세포 유전자 및 유전자 족(family)을 기술한다. 일례의 유전자 및 유전자 군들이Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi로부터 제공된다. 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 족은, 전기 유전자의 전사물(transcript) 및/또는 산물이 없을 때 전기 세포 또는 미생물의 성장 또는 생존력이 감소되거나 제거되는 유전자이다. 따라서, 여기서 사용되는 "증식에 필요한(proliferation-required)" 또는 "증식에 대하여 필요한(required for proliferation)"이라는 술어는 유전자의 전사물 및/또는 그 산물의 부재로 인하여 단순히 세포 성장이 감소되는 예 뿐 아니라, 유전자의 전사물 및/또는 그 산물의 부재또는 실질적 감소로 인하여 세포 성장이 완전히 일어나지 않는 예도 포함한다. 이러한 증식에 필요한 유전자들은 신규한 항균제 생성에 유력한 표적물로 사용할 수 있다. 전기 목적을 성취하기 위하여, 본 발명은 또한, 증식에 필요한 유전자들을 분석하는 신규한 분석법 및 전기 증식에 필요한 유전자들의 유전자 산물들과 상호작용하는 화합물들을 밝혀내는 방법을 다룬다. 나아가, 본 발명은 증식에 필요한 유전자로서 밝혀지고 여기에 보고된 유전자들의 발현 및 전기 핵산서열에 의하여 암호화되는 단백질의 정제를 다룬다. 전기 정제된 단백질은, 신규한 항균 화합물 산출을 위하여 추가로 개발될 수 있는 화합물들을 동정하기 위하여 시약을 제조하고, 소규모 분자 라이브러리들 또는 기타 후보 화합물 라이브러리들을 탐색하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산에 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드에 상동인 폴리펩티드를 포함하는, 전기 폴리펩티드와 유전자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 동정하기위한 방법을 기술한다. 예를 들면, 이러한 서열들은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni,Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종 등의 미생물에서 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 상동 폴리펩티드를 밝히는데 사용될 수 있다.
전기 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드는 여기에서 기술되는 각각의 방법에서 사용될 수 있으며, 여기에는 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식을 저해하는 화합물을 동정하는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 성장을 저해하는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식에 필요한 유전자 산물의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식에 필요한 유전자 산물의 발현 또는 활성을 감소시키는 능력을 가지는 핵산 또는 화합물을 동정하는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물이 존재하는 생물학적 경로를 밝혀내는 방법, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식에 필요한 생물학적 경로에 대하여 활성을 가지는 화합물을 동정하는 방법, 어떤 시험 화합물이 기능하는 생물학적 경로를 결정하는 방법, 및 어떤 대상에서 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드를 포함하는 개체의 증식을 저해하는 방법 등이 포함된다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 전기 방법들은 대장균 이외의 개체, 또는 대장균 이외의 개체로부터의 유전자 또는 유전자 산물을 사용한다.
본 발명은 증식에 필요한 서열들을 동정하기 위하여 신규한 방법을 사용한다. 일반적으로, 주어진 출처로부터의 핵산서열 라이브러리를 서브클로닝(sub-clone)하거나, 그렇지 않으면Staphylococcus aureus/E. coli또는Pseudomonas aeruginosa/E. coli셔틀 벡터(shuttle vector)같은 적절한 벡터나Salmonella Thyphimurium및Klebsiella pneumoniae에서 모두 복제되는 벡터, 또는 의도하는개체에서 기능하여 발현 라이브러리(expression library)를 생성할수 있는 셔틀 벡터 또는 다른 벡터 상의 유도가능한 프로모터 다음에 바로 삽입한다. 일반적으로, 배양액에 다양한 농도의 유발자 분자나 저해 분자를 첨가함으로써 그 발현이 조절될 수 있는 조절가능한 프로모터에 의하여 발현이 조절되는 것을 선호한다. 온도에 민감한 억제인자(repressor)에 의하여 조절되는 프로모터나, 온도에의해 활성화되는 프로모터(temperature activated promotor)도 계획될 수 있다. 전기 삽입 핵산이 전기 발현 벡터가 도입된 개체의 염색체로부터 유래된 것일 수 있지만, 전기 삽입체가 그 본래의 염색체 위치에 있지 않으므로, 본 논의를 위한 전기 삽입 핵산은 외인성(exogenous) 핵산이다. '발현'이라는 용어는 유전자, 유전자 절편, 게놈 절편, 오페론 또는 그 부분으로부터 센스 또는 안티센스 RNA 분자 생산이라는 뜻으로 정의된다. '발현'은 또한 펩티드 또는 폴리펩티드 합성 과정을 지칭하는 것으로도 사용될 수 있다. '발현 벡터'라는 것은, 그 안에 포함된 핵산서열로부터 리보핵산(RNA) 서열이 전사되는 운반체(vehicle)로 정의된다. 전기 '발현 벡터'는 또한, 그 안에 포함된 전기 외인성 핵산서열로부터 발현된 전기 전사된 RNA 메세지(message)로부터의 단백질 산물 번역을 허용하는 특징을 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 유일한 산물로서 RNA 분자를 생산하거나 또는, 최종적으로 단백질 산물로 번역되는 RNA 분자를 생산할 수 있다.
전기 외인성 핵산서열을 함유한 발현 라이브러리는 일단 생성되면, 어떤 세포의 개체군 내로 도입되어 세균 증식에 필요한 유전자를 찾는데 사용된다. 전기 라이브러리 분자는 전기 세포 개체군에게는 외래의 것이기 때문에, 전기 발현 벡터및 그 안에 함유된 핵산 단편들을 외인성 핵산으로 간주한다.
그 후, 전기 발현 벡터 라이브러리를 함유한 전기 시험 세포 개체군에서 전기 외인성 핵산 절편들의 발현을 활성화시킨다. 전기 발현 벡터의 활성화는, 전기 벡터들을 함유한 전기 세포들을 전기 발현 벡터 라이브러리에 포함된 전기 외인성 핵산서열이 발현되게 하는 조건에 두는 단계로 구성된다. 그 후, 전기 시험 개체군의 세포들을 분석하여 전기 외인성 핵산 절편들의 발현이 전기 시험 개체군 세포들에 대하여 미치는 영향을 결정한다. 그 안에 포함된 무적위 서열의 발현을 유도했을 때, 전기 세포의 성장에 부정적인 영향을 미치는 발현 벡터들을 동정하고 분리하며, 이후의 연구를 위하여 정제한다.
발현시에 성장에 부정적인 영향을 미치는 핵산서열을 밝혀내는 데에 다양한 분석법들을 주시할 수 있다. 한가지 실시태양으로, 외인성 핵산서열들을 발현하는 배양액에서의 성장 상태와 이러한 서열들을 발현하지 않는 배양물 내에서의 성장 상태를 비교한다. 성장 측정은 흡광도를 측정하여 전기 성장의 정도를 조사하여 분석된다. 다르게는, 효소 분석법을 사용하여 세균의 성장 속도를 결정함으로써 관심 대상의 외인성 핵산서열을 동정할 수 있다. 집락(colony)의 크기, 집락의 형태(morphology) 및 세포 형태는 전기 숙주세포들의 성장을 평가하는 데에 사용되는 또다른 요인들이다. 발현 조건하에서 성장하지 않거나 또는 감소된 속도로 성장하는 배양물들은 증식에 필요한 유전자에 부정적인 영향을 미치는 핵산 절편을 암호화하는 발현 벡터를 함유하는 것으로 간주된다.
일단 관심 대상인 외인성 핵산서열들이 밝혀지면, 그들을 분석한다. 분석에서 첫번째 단계는 전기 관심 대상인 핵산 절편의 핵산서열을 획득하는 것이다. 이를 위하여, 당업계에 잘 알려진 표준 방법들을 사용하여 관심 대상 서열을 함유하고 있는 것으로 나타난 전기 발현 벡터내의 삽입체(insert)의 서열을 밝혀낸다. 전기 과정의 다음 단계는 전기 핵산서열의 출처를 결정하는 것이다. 여기서 사용되는 "출처(source)"라함은 클로닝된 절편을 포함하는 게놈 영역(genomic region)을 의미한다.
전기 수득한 서열 데이타를 다양한 미생물의 단백질과 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데이타베이스와 비교함으로써 뉴클레오티드 서열에 따른 유전자를 결정할 수 있다. 따라서, 초기 유전자 동정은Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 또는 Enterococcus faecalis유전자 또는 그로부터 암호화되는 단백질 또는 다른 종의 상동체에 대한 중요한 서열의 유사성이나 동일성을 기초로 수행된다.
데이타베이스 시스템에서 입수할 수 있는 DNA 및 단백질 서열들의 수는 수년동안 기하급수적으로 증가해 왔다. 예를 들어, 1998년 말에는,Caenorhabditis elegans와E. coli, Aeropyrum pernix, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Bacillus subtilix, Borrelia burgdorferi, Chlamydia pneumoiae, Chlamydia trachoatis, Clostridium tetani, Corynebacterium diptheria, Deinococcus radiodurans Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori 26695, Helicobacter pylori J99, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus jannaschii, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasmapnemoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Rickettsia prowazekii, Synechocystis PCC6803, Thermotoga maritima, Treponema pallidum, Bordetella pertussis, Campylobacter jejuni, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium tuberculosis CSU#93, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, Pseudomonas aeruginosa, Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus furiosus, Rhodobacter capsuatus, Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Ureaplasma urealyticum 및 Vibrio cholera를 포함한 몇몇 세균 게놈의 전체 서열이 활용가능하다 . 이러한 뉴클레오티드 서열 정보는 GenBank, National Center for Biotechnology Information(NCBI), Genome Sequencing Center(참조: http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml) 및 Sanger Center(참조:http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)등의 수많은 정보은행(databank)에 저장되어 있으며, 일반인들이 이용할 수 있다. 다양한 컴퓨터 프로그램들이 이러한 데이타베이스에 저장된 서열들의 분석을 돕는데 유용하다. FASTA(참조: 피어슨 더블유알., 1990, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63-98), 서열 검색 시스템(SRS)(참조: 에졸드 & 아르고스, "SRS an indexing and retrieval tool for flat file data libraries", Comput. Appl. Biosci., 9:49-57, 1993)은 관심 대상 서열을 분석하는데 사용할 수 있는 컴퓨터 프로그램의 두 가지 예이다. 본 발명의 한가지 실시태양에서, 그 매개변수들을 가진 BLASTN 버전 2.0, 또는 BLASTX 버전2.0을 포함한 BLAST 군(family)의 컴퓨터 프로그램들이 핵산서열을 분석하는데 사용된다. "Basic Local Alignment Search Tool"의 두문자어인 "BLAST"는 데이타베이스의 유사성 조사용 프로그램 군이다. 전기 BLAST 군 프로그램들에는 하기의 것들이 있다: 뉴클레오티드 서열 데이타베이스 검색 프로그램인 BLASTN, 단백질 데이타베이스 검색 프로그램인 BLASTX(이때, 입력 정보는 핵산서열이다), 및 역시 단백질 데이타베이스 검색 프로그램인 BLASTP(이때, 입력 정보는 아미노산 서열이다). BLAST 프로그램들은 빠른 서열 매칭(matching) 알고리즘, 매칭된 결과의 중요도를 평가하는 정확한 통계적 방법, 및 특별한 상황에 맞게 프로그램을 재단하는 다양한 옵션(option)들을 구현한다.blast@ncbi.nlm.nih.gov로의 전자우편으로 전기 프로그램 사용에 대한 지원을 받을 수 있다. tBLASTX는 세개의 가능한 해독틀(reading frame) 모두에서 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열로 번역하는데 사용될 수 있다.
종종 세균 유전자들은 폴리시스트론(polycistronic) 그룹에서 전사된다. 이 그룹들은 오페론들로 구성되어 있는데, 이들은 보통 조절되는 유전자 및 유전자간 서열들의 집합체이다. 오페론 내의 유전자들은 함께 전사되며, 종종 연관된 기능들을 갖고 있다. 전기 주어진 선별 방법에서는, 전기 동정된 외인성 핵산서열이, 인접 비암호화 서열, 유전자내 서열(즉, 유전자의 내부에 있는 서열), 유전자간 서열(즉, 유전자들 사이의 사열), 둘 이상의 유전자들의 적어도 한 부분을 채우는(spanning) 서열, 세균 증식에 필요한 실제 서열의 윗쪽(upstream) 또는 아랫쪽(downstream)에 위치한 5' 비암호화 영역 또는 3' 비암호화 영역을 가지거나,가지지 않은 유전자 또는 그 일부에 해당할 수 있다. 따라서, 전기 오페론들 내에서 암호화되는 유전자(들)가 개별적으로 증식에 필요한지를 결정하는 것이 종종 바람직하다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 오페론을 동정한 다음, 유전자 또는 유전자들이 증식에 필요한지를 결정하기 위하여 오페론을 절단한다. 당업계에 공지된 여러가지 방법으로 오페론들을 동정할 수 있다. 예를 들어, 후에르타(Huerta) 등이 기술한 RegulonDB DataBase(참조:Nucl. Acids Res.,26:55-59, 1998)(이는 또한 웹사이트 http://www.cifn.unam.mx/Computational_Biology/regulondb/에서도 찾을 수 있다)는 대장균의 오페론들에 대한 정보를 제공한다. Subtilist database(http://bioweb.pasteur.fr.Genolist/SubtiList),(참조: 모스저 아이., 글레이저 피. 및 단친 에이., 1995, Microbiology, 141: 261-268; 모스저 아이., 1998, FEBS Letter, 430:28-36)는 또한 오페론을 예견하는데 사용될 수 있다. 이 데이타베이스는 예견된 프로모터와 터미네이터 영역과 함께, 모든 서열이 분석된 그람 양성 세균인Bacillus subtilis로 부터의 유전자들의 목록을 제시한다. 이 정보는 오페론을 예견하기위한Staphylococcus aureus게놈 서열 데이타와 함께 사용되어, 본 발명의 안티센스 핵산에 의하여 영향받는 서열 목록을 생성할 수 있다.Pseudomonas aeruginosa웹 사이트(참조: http://www.pseudomonas.com)는 이 세균군에서 오페론 구성을 예견에 도움을 주기위해 사용될 수 있다. 게놈 서열분석 센터(참조: http://gonome.wustle.edu/gsc/salmonella.shtml) 및 Sanger Centre(참조: http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)로부터 활용가능한 데이타 베이스는Samonella typhimurium에서 오페론을 예견하는데 사용될 수 있다. TIGR 미생물 데이타 베이스에는E.faecalis의 불완전한 버젼의 게놈서열이 있다(참조: http://www.tigr.org/cgi-bin/BlastSearch/blast/cgi/organism=e_faecalis). 이중 하나를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 입력하고 상동체를 분석할 수 있다. 당업계에 공지된 많은 방법들을 사용하여 전기 오페론을 절단할 수 있다. 노던 블럿이나 프라이머 증폭 기술(primer extention technique)에의한 RNA 전사물의 분석은 보편적으로 오페론 전사물의 분석에 사용된다. 이러한 실시태양의 한가지 양상에서는, 상동 재조합(homologous recombination)으로 유전자를 파괴하여 증식에 필요한 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 오페론의 유전자들을 개별적으로 불활성화한다.
여러 유전자 파괴(disruption) 방법들이 기능적인 유전자를 변이된 비기능적(null) 대립유전자(allele)로 대체하는 것으로 기술되어 왔다. 이러한 방법들은 일반적으로 상동 재조합을 사용한다.Staphylococcus aureus에서의 상동 재조합을 이용한 한가지 기술이 시아 외., 1999, Plasmid, 42: 144-149에 기술되어 있다. 이 방법은 교차 PCR(crossover PCR)을 사용하여 표적 유전자의 암호화 영역의 인프레임 결실(in-frame deletion)을 가진 무기능(null) 대립유전자를 생성한다. 전기 무기능 대립유전자는 전기 야생형(wild type) 유전자(ca. 500bp)에 인접한 서열들을 보유하는 방식으로 구축된다. 전기 결실 무기능 대립유전자를 둘러싸고 있는 이 상동 서열들은 상동 재조합의 표적물로 작용하여 전기Staphylococcus aureus염색체 상의 전기 야생형 유전자를 전기 구축된 무기능 대립유전자로 대체할 수 있게 한다. 이 방법은Salmonella및Klebsiella종 뿐만아니라 다른 세균에도 사용될 수 있다. 역선택 표지자 sacB(참조: 슈바이져 에이치피., 클라센 티. 및 호앙 티., 1996, Mol. Biol. ofPseudomonas,ASM press, 229-237)를 이용하는 유사한 유전자 파괴 방법은Pseudomonas, Salmonella 및 Klebsiella종에 활용가능하다.E.faecalis유전자들은 그 유전자의 내부 절편을 포함하는 비-복제 플라스미드에서의 재조합에의하여 파괴될 수 있다.
전기 교차 PCR 증폭 산물은 약 저항성 표지자(drug resistance marker)같은 선택 표지자를 가지는 적합한 벡터 내로 서브클로닝 된다. 일부 실시태양들에서, 전기 벡터는 상동 재조합이 일어나는 개체 이외의 대장균 또는 개체에서 성장가능 하도록, 상동 재조합이 일어나는 개체와 상이한 대장균이나 다른 개체에서 기능하는 복제 기점(origin of replication)을 가질 수 있으며,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi에서 기능하는 복제 기점은 없으므로, 전기Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi염색체의 상동 영역에 삽입을 위하여 전기 선택 표지자의 채택이 필요할 수도 있다. 보통 단 한번의 교차시에만 이러한 통합이 일어나서 전기 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi염색체는 벡터 서열에 의하여 분리된 하나의 야생형 대립유전자와 하나의 무기능 대립유전자로 구성된 전기 표적 유전자의 직렬복사(tandem duplication)를 포함할 수 있다. 전기 복사의 다음 해법의 결과로 벡터 서열의 제거 및 야생형 유전자의 복구 또는 인프레임 결실에 의한 대체가 일어난다. 후자의 결과는 유전자가 필수적인 것으로 밝혀질 경우 일어나지 않을 것이다. 이 방법은 아래의 실시예 5에서 기술된다. 여기에서 기술되는 핵산 또는 개체에 이 방법을 실행하는 것이 좋다.
증식에 필요한 것으로 밝혀진 유전자의 전체 암호화 서열을 발현시키기 위하여 재조합 DNA 방법들을 사용할 수 있다. 그 과발현된 단백질들은 이후의 연구에서 시약으로 사용될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하여 전기 동정된 외인성 서열들을 분리하고, 정제하여 적절한 발현 벡터내로 클로닝한다. 바람직하게는, 전기 핵산서열이 전기 발현 단백질의 분비를 용이하게 하기 위하여 신호 펩티드(signal peptide)를 암호화하는 서열을 함유할 수 있다.
증식에 필요한 것으로 밝혀진 세균 유전자들의 절편들을 발현시키는 것 또한 본 발명에서 고려된다. 전기 동정된 유전자들의 절편들은 전기 본 발명의 밝혀진 서열들 중 하나에 상보적인 유전자의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 75개 또는 75개 이상의 연속적 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 전기 발현 벡터들로 삽입된 핵산들은 또한, 전기 암호화 서열의 윗쪽 및 아랫쪽의 서열들을 함유할 수 있다.
세균 증식에 필요한 것으로 밝혀진 전체 유전자 또는 그 절편의 암호화 서열을 발현시킬 때, 그 발현될 핵산서열을 종래의 클로닝 방법을 사용하여 발현 벡터내에 프로모터에 작동가능하게 연결시킨다. 전기 발현 벡터로는 당업계에 알려진 세균, 곤충, 효모(yeast), 또는 포유동물 발현 시스템 중 어느 것이라도 가능하다. 상업적으로 구매가능한 벡터 및 발현 시스템들은 제네틱 인스티튜드(Genetics Institute, 매사추세츠 캠브리지), 스트라타진(Stratagene, 캘리포니아 라졸라), 프로메가(Promega, 위스콘신 매디슨), 및 인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고) 등의 다양한 공급업체들로부터 구매가능하다. 바람직하다면, 발현을 강화시키고 적절한 단백질 폴딩을 용이하게 하기 위하여, 하트필드(Hatfield) 등의 미국 특허 제 5,082,767에 설명된 것처럼 전기 서열의 코돈 사용량 및 코돈 바이어스를 전기 발현 벡터가 도입되는 특정 발현 벡터에 대하여 최적화시킬 수 있다. 본 발명에서는 융합(fusion) 단백질 발현 시스템도 고려되었다.
전기 동정된 외인성 핵산서열에 의하여 암호화되는 단백질을 발현시킨 후, 전기 단백질을 정제한다. 단백질 정제 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 밝혀진 외인성 핵산서열들로부터 암호화되고 발현된 단백질들을 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 이용한 침전 등의 침전 방법들을 이용하여 부분적으로 정제할 수 있다. 다르게는, 전기 단백질의 간단한 단일 단계 정제를 위하여 전기 단백질을 항원결정기(epitope)로 표지할 수 있다. 덧붙여, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 겔 여과(gel filtration), 수산화인회석(hydroxyapaptite) 컬럼(column) 사용, 고정 반응염료(immobilized reactive dye), 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 고속액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography) 등의 크로마토그래피법들이 단백질 정제에 사용된다. 정제 방법으로는 1차원 겔전기영동(one-dimensional gel electrophoresis), 고분별능 2차원 폴리아크릴아미드(high-resolution two-dimensional polyacrylamide) 전기영동, 등전 포커싱(isoelectric focusing), 및 기타 방법 등의 전기영동법들을 고려할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 정제 방법들로서는, 항체 컬럼, 리간드 존재 컬럼 및 기타 친화(affinity) 크로마토그래피 주형(matrix)을 포함한 친화 크로마토그래피법이 고려된다.
증식에 필요한 것으로 밝혀진 유전자 암호화 서열로부터 생산된 정제 단백질들을 다양한 실험법들에서 사용하여 유용한 항균 시약으로 제조할 수 있다. 본 발명의 한가지 실시태양에서는, 전기 동정된 외인성 핵산서열들로부터 발현된 단백질들에 대한 항체들을 제조한다. 전기 발현 단백질에 대하여 단클론성(monoclonal) 및 다클론성(polyclonal) 항체 둘 다를 제조할 수 있다. 단클론성 및 다클론성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 상기 논의된 생산된 항체로부터 제조되는 항체 절편 제제(preparation)도 고려되었다.
추가적으로, 전기 정제 단백질, 그 절편 또는 그 유도체들을 약학적으로 허용가능한 담체를 통하여 어떤 개체에 투입하여 전기 단백질에 대한 면역 반응을 유도하게 할 수 있다. 바람직하게는, 전기 면역 반응은 전기 개체를 보호하는 방어적 면역 반응이다. 전기 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체의 적절한 양을 결정하는 것은 당업계의 숙련된 자에게 친숙하다.
본 발명의 전기 정제 단백질에 대한 또다른 응용은, 소규모 분자 라이브러리를 탐색하여 본 발명의 다양한 표적 단백질에 대하여 활성을 가진 후보 화합물들을 찾는 것이다. 조합 화학의 분야의 진보로, 표적 단백질에 결합할 수 있는 또는 그에 대한 저해 효과를 가진 수많은 후보 화합물들을 제조하는, 당업계에 잘 알려진 방법들이 제공되었다. 따라서, 본 발명에서는 소규모 분자 라이브러리를 탐색하여 어떤 밝혀진 유전자 서열로부터 생산된 표적 단백질에 대하여 결합 친화력 또는 저해 활성을 가지는 화합물들을 찾는 것을 고려한다.
본 발명은 나아가 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi에 더하여 다양한 다른 병원성 개체들에 대한 효용성을 고찰한다. 예를 들어, 여기에서 기술되는 방법을 사용하여, 다른 병원성 미생물들로부터 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산에 상동인 핵산, 서열번호 8재지 3795의 안티센스 핵산에 상동인 핵산, 및 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드에 상동인 폴리펩티드를 포함)를 밝혀낼 수 있다. 전기 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드는 여기에서 기술되는 방법을 사용하여 다른 병원성 미생물의 증식을 저해하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 여기에서 기술되는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi부터의 전기 증식에 필요한 핵산, 안티센스 핵산, 및 폴리펩티드(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산에 상동인 핵산, 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산에 상동인 핵산, 및 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드에 상동인 폴리펩티드를 포함)를 사용하여 원핵 생물(prokaryote) 및 진핵 생물(eukaryote)에서 증식에 필요한 상동 암호화 핵산 , 상동 안티센스 핵산, 상동 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 예를 들어,Plasmodium종(spp.)등의 원생생물(protist);Entamoeba종 및Contracaecum종 등의 식물;Candida종(즉,Candida albicans)을 포함하는 진균,Cryptococcus neoformans, 및 Aspergillus fumigatus등의 증식에 필요한 핵산 및 폴리펩티드를 밝혀낼 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 그람 양성 과 그람 음성 모두를 포함하는, 모네라계(monera), 특히 세균은 증식에 필요한 신규한 유전자 서열 조사에서 탐구된다.마찬가지로, 이러한 개체들의 성장을 저해하거나 항생제를 동정하는데 사용될수 있는 상동 안티센스 핵산 또한 동정할 수 있다. 본 실시태양은 특히 약물 저항 세균의 출현시 특히 중요하다.
기존의 항생제에 내성을 가지게 되는 세균종의 수가 점점 증가하고있다. 이러한 미생물들의 일부 목록은 다음과 같다:E.coli등의Escherichia종; E.faecalis등의Enterococcus종;P. aeruginos등의Pseudomonas종;C.botulinum등의Clostridium종;H. influenzae등의Haemophilus종;E. cloacae등의Enterobacter종;V. cholera등의Vibrio종;M. catarrhalis등의Moraxala종;S. pneumoniae등의Streptococcus종;N. gonorrhoeae등의Neisseia종;Mycoplasma pneumoniae등의Mycoplasma종;Salmonella typhimurium; Helicobacter pyroli; Escherichia coli;및Mycobacterium tuberculosis.여기에서 기술되는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 것으로 밝혀진 유전자 및 폴리펩티드(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산에 상동인 핵산, 및 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드를 포함)를 사용하여, 핵산 혼성화 및 컴퓨터 데이타베이스 분석등의 방법을 통하여, 전기 개체 및 다른개체들로부터 증식에 필요한 상동 암호화 핵산 또는 상동 폴리펩티드를 밝혀낼 수 있다. 이와 마찬가지로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 안티센스 핵산(서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 또는 그에 상보적인 서열을 포함)을 사용하여, 핵산 혼성화 및 컴퓨터 데이타베이스 분석등의 방법을 통하여, 전기 개체 및 다른 개체 또는 세포의 증식을 저해하는 안티센스 핵산도 동정할 수 있다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 핵산서열들(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산, 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산을 포함)은Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi및 관심있는 다른 세균종으로부터 제조된 게놈 라이브러리를 선별하는데 사용된다. 예를 들어, 전기 게놈 라이브러리는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종을 포함하는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균 또는 다른 개체로부터 유래된다. 다양한 미생물들로부터의 게놈 라이브러리를 제조하는 데에는 표준 분자 생물학적 방법들이 사용된다. 한가지 양상은 전기 라이브러리들을 제조하여 니트로셀룰로스(nitrocellulose)지(紙)에 결합시키는 것이다. 그 후, 본 발명의 전기 동정된 외인성 핵산서열들을, 전기 라이브러리들을 조사하여 상동 서열들을 찾는 데에 탐침으로 사용할 수 있다.
예를 들어, 전기 라이브러리를 탐색하여 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화가 용이하지않은 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상동 암호화 핵산 또는 상동 안티센스 핵산, 서열 번호 8 내지 3795 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 핵산의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 핵산에 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등을 동정할 수 있다.
또한 전기 라이브러리를 탐색하여 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상동 암호화 핵산 또는 상동 안티센스 핵산, 서열 번호 8 내지 3795 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상보적인 핵산의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 3860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 핵산에 혼성화가 용이한 조건에서 혼성화 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등을 동정할 수 있다.
또한, 전기 방법을 사용하여 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 덧붙여, 상기 공정들을 사용하여, 매개변수들을 이용하는 FASTA 버전 3.0t78 알고리즘을 사용하여 결정된 것으로서, 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나의 서열을 가진 폴리펩티드 또는 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드에 대하여 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 및 적어도 25%의 아미노산 동일성 또는 유사성을 가진 폴리펩티드, 또는 선행 폴리펩티드들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산들을 포함하는 절편들을 암호화하는 핵산들을 분리할 수 있다. 다르게는, 매개변수를 이용하는 BLASTP, BLASTX, 또는 TBLASTN을 사용하여 단백질 동일성 또는 유사성을 밝힐 수 있다(참조: 알철 에스에프., et al., 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, NucleicAcid Res., 25:3389-3402).
다르게는, 증식에 관련된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 또는 미생물 증식에 관련된 핵산에 대한 안티센스 핵산에 대하여 원하는 수준의 뉴클레오티드 또는 아미노산 상동성을 가진 서열을 밝혀내는 데이타베이스를 조사함으로써, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산 또는 상동 폴리펩티드들을 동정할 수 있다. GenBank 및 GenSeq를 포함한 다양한 이러한 데이타베이스들이 당업계에 숙련된 자들에게 이용가능하다. 일부 실시태양들에서는, 전기 데이타베이스들을 검색하여 증식에 관련된 핵산 또는 증식을 저해하는 안티센스 핵산, 증식에 필요한 핵산의 일부 또는 증식을 저해하는 안티센스 핵산의 일부에 대하여 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 유사성을 가진 핵산을 동정한다. 예를 들어, 전기 데이타베이스를 검색하여 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상동이거나, 그에 대하여 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편들에 상동인 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상동이거나, 그에 대하여 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 절편들에 상동인 핵산, 또는 전기 핵산중 어느 하나에 상보적인 서열들에 상동인 핵산들을 동정할 수 있다. 다른 실시태양으로, 전기 데이타베이스들을 검색하여 증식에 관련된 어떤 폴리펩티드 또는 그 일부분에 대하여 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%,적어도 40%, 또는 적어도 25%의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가진 폴리펩티드들을 동정할 수 있다. 예를 들어, 전기 데이타베이스를 검색하여 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 중 하나를 포함하는 폴리펩티드 또는 발현이 서열번호 8-3795 중 하나의 핵산에 의하여 저해되는 폴리펩티드에 상동인, 또는 선행 폴리펩티드들 중 어느 하나에 대하여 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산들을 포함하는 절편들에 상동인 폴리펩티드들을 동정할 수 있다. 일부 실시태양들에서는, 전기 데이타베이스를 검색하여 그들을 수득한 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi등의 이외의 다른 미생물이나 세포들로부터의 상동 암호화 핵산 , 상동 안티센스 핵산 또는 폴리펩티드들을 동정할 수 있다. 예를 들어, 전기 데이타베이스를 검색하여, 응고효소(coagulase)가 없는Staphylococcus를 포함하여Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum,Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종 등의 미생물들로부터 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 상동 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 일부 실시에서, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 상동 폴리펩티드는 대장균 이외의 개체로부터의 것이다.
또다른 실시태양에서는, 유전자 발현 배열(array) 및 미세배열(microarray)를 이용할 수 있다. 유전자 발현 배열은 유리 칩(glass chip), 나일론 막(nylon membrane) 등의 특정 위치에 놓인 DNA 표본들의 고밀도 배열이다. 연구원들은 서로 다른 조건하에서의 유전자 발현을 상대적으로 정량하기 위하여 이러한 배열들을 사용한다. 연구원들은 유전자 발현 배열을 사용하여 최적의 약물 표적물을 찾아내고, 새로운 화합물들을 규명하며, 질병의 경로들을 결정하는데 도움을 받는다. 미국 특허 제 5807522는 이러한 방법의 한 예를 보여준다.
단 하나의 배열을 사용하여 특정 미생물의 게놈에 있는 전체 유전자 발현을 연구할 수 있다. 예를 들어, 전기 배열들은 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 ORF들에 해당하는 PCR 산물들을 담고 있는 12 x 24 cm의 나일론 필터(filter)로 구성되어 있다(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산을 포함하는). 각각의 PCR 산물 10ng씩을 필터위에 1.5mm마다 점적(spotting)한다. 전기 배열에 혼성화하기 위한 단일 가닥의 표지된 cDNA들을 준비하여 (두번째 가닥 합성이나 증폭 단계는 실시하지 않는다) 전기 필터에 접촉시킨다. 따라서, 전기 표지된 cDNA들은 "안티센스" 배향(orientation)에 있다. 포스포이매저(phosphorimager)로 정량 분석한다.
세포의 전체 mRNA 표본으로부터 제조된 cDNA를 이러한 어떤 배열에 혼성화한 후, 당업계에 있는 자들에 알려진 다양한 방법들 중 하나 이상을 사용하여 결합을 확인하면, 전기 배열 상에서 cDNA가 혼성화한 위치마다 신호가 발견된다. 전기 배열 내의 각 위치에서 수득한 혼성화 신호의 강도는, 결국 전기 표본에 있던 그 특정 유전자의 mRNA의 양을 나타낸다. 따라서, 서로 다른 조건하에서 배양된 세포로부터 분리한 mRNA로 얻어진 결과들을 비교하는 것은, 서로 다른 조건하에서의 배양 동안에 각 개별 유전자의 상대적인 발현 양을 비교하는 것이 된다.
유전자 발현 배열은, 증식에 필요한 유전자에 상보적인 안티센스 핵산 유도 후 여러 시점에서 전체 mRNA 발현 패턴을 분석하는데 사용될 수 있다. 전기 배열로의 혼성화로 나타난 발현 패턴 분석으로, 안티센스 발현에 의하여 그 발현에 영향을 받는 다른 유전자에 관한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 전기 안티센스가 50S 부단위(subunit) 내의 리보솜 단백질인 L7/L12에 대한 유전자에 대하여 상보적일 경우, L7/L12 유전자 에대한 안티센스의 발현 이후 다른 mRNA들의 수준이 증가, 감소하거나 또는 동일한 상태로 유지되는 것으로 관찰될 것이다. 만약 전기 안티센스가 어떤 다른 50S 부단위 리보솜 단백질 mRNA(예로서 L25)에 대한 것이라면, 다른 mRNA 발현 패턴을 보일 것이다. 따라서, 증식에 필요한 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산의 발현 후 관찰되는 전기 mRNA 발현 패턴으로, 다른 증식에 필요한 핵산들을 동정할 수 있다. 부가적으로, 후보 약물 화합물 또는 알려진 항생제에 노출되었을때 세균에서 관찰되는 mRNA 발현 패턴들을 어떤 증식에 필요한 핵산에 대한 안티센스 핵산들로 관찰된 패턴들과 비교할 수 있다. 전기 후보 약물 화합물로 관찰된 mRNA 발현 패턴이 전기 안티센스 핵산으로 관찰된 패턴과 유사할 경우, 전기 약물 화합물은 치료적 화합물로 가능할 것이다. 따라서, 이 분석법은 약물 개발에 사용할 유력한 후보 약물 화합물 선택에 있어서 유용한 도움이 된다.
전기 배열 상에 놓인 핵산의 출처 및 전기 배열에 혼성화되는 핵산의 출처가 서로 다른 세포나 미생물일 경우, 유전자 발현 배열들로 전기 두 세포 또는 미생물내의 상동 핵산들을 밝힐 수 있다.
본 발명은 또한 다른 미생물들을 조사하여 증식에 필요한 유전자를 찾는 또다른 방법들을 상고한다. 이 실시태양의 한 양상에서, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 서열들에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산 또는 그 부분을 안티센스 배향(orientation)에서 전사하여, 어떤 동원성(autologous) 또는 이종성(heterologous) 세포나 미생물의 증식에 필요한 핵산의 양 또는 그 활성을 변화시킨다. 예를 들어, 전기 안티센스 핵산은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 상동인 안티센스 핵산, 서열번호 8 내지 3795 중 하나에 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산, 또는 전기 핵산 중 어느 것의 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산 등의 상동 안티센스 핵산일 수 있다. 전기 안티센스 핵산을 전사하는 전기 세포 또는 미생물을 여기에서 기술되는 바와 같은 세포 기반 분석법(cell-based assay)에 이용하여, 후보 항생 화합믈을 동정할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 증식에 필요한 것으로 밝혀진 서열들의 보존 부분(conserved portion)들을 사용하여, 중합효소 연쇄반응(PCR)에서 사용할 디제너레이트 탐침(degenerate primer)들을 제조할 수 있다. 전기 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 여기에서 밝혀진 서열들로부터 제조된 디제너레이트 탐침들을 사용하여서 어떤 PCR 산물이 성공적으로 생산되는 것은, 전기 조사 대상 종 내에 상동 유전자 서열이 존재한다는 것을 가리키는 것이다. 이 상동 유전자를 분리하고 발현하여 후보 항생 화합물의 표적으로 사용한다. 이 실시태양의 또다른 양상에서는, 동정된 전기 상동 유전자(예를들어 상동 암호화 핵산)또는 그 부분을 어떤 동원성(autologous) 세포나 미생물 또는 이종성(heterologous) 세포나 미생물 내에서 발현시켜, 전기 동원성 또는 이종성 세포나 미생물 내의 증식에 필요한 상동 유전자의 양 또는 그 활성을 변경시키도록 한다. 다르게는, 어떤 상동 안티센스 핵산을 동원성 또는 이종 세포나 미생물에서 발현시켜, 전기 동원성 또는 이종 개체의 증식에 필요한 유전자 산물의 양 또는 그 활성을 변경시킨다.
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 유전자에 상동인 핵산 또는 그것에 상보적인 서열을 사용하여, 하기한 바와 같이 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi이외의 다른 개체들 내의 전기 동정된 상동 암호화 핵산 또는 상동 폴리펩티드의 활성을 저해하거나 또는 그 양을감소시킴으로써, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi이외의 다른 개체들로부터 상동 암호화 핵산 또는 상동 안티센스 핵산을 동정할 수 있다. 예를들어, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 유전자에 상동인 핵산 또는 그것에 상보적인 서열을 사용하여,Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa,Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종 등의 미생물의 성장을 저해하는 화합물들을 동정할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 서열에 상동인 전기 핵산들(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나에 상동인 핵산을 포함하는) 또는 그에 상보적인 서열들(서열번호 8 내지 3795중 하나에 상동인 핵산을 포함하는)을 사용하여E. coli가 아닌 개체에서 증식에 필요한 서열들을 동정할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서는, 증식에 필요한 것으로 밝혀진 서열들, 또는 그부분에 상보적인 안티센스 핵산(서열번호 8 내지 3795의 핵산 등의, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나 또는 그 부분에 상보적인 핵산을 포함하는) 을 전기 서열들을 수득한 종이외의 어떤 종 내에서 기능할 수있는 벡터들로 전이한다. 예를 들어, 전기 벡터는Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종에서 기능할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 태양에서, 전기 벡터는E. coli가 아닌 개체에서 기능한다. 당업계의 숙련된 자들에게 명백한 바로서, 벡터들은 종 특이적(species specific)인 어떤 요소들을 갖고 있어야 한다. 이러한 요소들에는 프로모터 서열,작동자(operator) 서열, 억제인자(repressor) 유전자, 복제 기점(origin of replication), 리보솜 결합 서열, 종결(termination) 서열 등이 있다. 당업계의 숙련된 자는, 본 발명의 전기 안티센스 핵산들을 사용하기 위하여, 배양된 세균 세포들로부터의 관심 대상 서열들을 함유한 벡터를 분리하고, 전기 서열들을 분리 및 정제하며, 전기 서열들을 조사될 세균 종에서 사용하기 위하여 개조된 발현 벡터내로 서브클로닝하는 표준 분자 생물학적 방법들을 알고 있을 것이다.
기타 다양한 종들에 대한 발현 벡터들은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어,E. coli내에서 기능하는 수많은 벡터들이 당업계에 알려져 있다. 또한, 플라(Pla) 등은Salmonella typhimurium, Pseudomonas putida 및 Pseudomonas aeruginosa를 포함한 많은 관련된 숙주내에서 기능적인 발현 벡터를 보고한 바 있다(참조: J. Bacteriol., 1990, 172(8):4448-4455). 브런츠위그와 다진은Pseudomonas aeruginosa에대한 셔틀 발현 벡터를 기술한다(참조: Gene, 1992, 111:35-4). 다양한 그람-양성 미생물들에서 자유롭게 전이 가능한 발현 벡터의 많은 유사한 예들이 존재한다.Enterococcus faecalis에 대한 발현 벡터는 pAK80 주쇄에 적합한 프로모터를 삽입하여 작제될 수 있다(참조: 이스랠센 에이치., 매드센 에스엠., 브랭 에이., 한센 이비., 요한센 이., 1995, Appl. Environ. Microbiol., 61:2540-2547).
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 서열 또는 그 부분에 상보적인 전기 안티센스 핵산들을 관심 대상 두번째 세포 또는 미생물(예. 전기 동정된 서열을 수득한 세포나 미생물 이외의 세포나 미생물) 내에서 기능적인 발현 벡터내로 서브클로닝한 후, 전기 안티센스 핵산들을 조건적으로 전사하여 세균의 성장저해를 평가한다. 전사시 전기 두번째 세포 또는 미생물의 성장을 저해하는 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 핵산의 뉴클레오티드 서열들을 전기 두번째 세포 또는 미생물의 알려진 게놈 서열과 비교하여, 전기 두번째 개체로부터 전기 상동 유전자를 동정한다. 전기 두번째 세포, 또는 미행물의 전기 상동 서열이 알려지지 않은 경우, 관심 대상의 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 서열에 혼성화 시키거나, 상술한 대로 관심대상의 전기 증식에 필요한 뉴클레오티드 서열을 기초로하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켜서 이를 밝혀내고, 분리할 수 있다. 이러한 방법으로, 전기 두번째 세포또는 미생물의 증식에 필요할 수 있는 서열들을 동정할 수 있다. 예를들면, 전기 두번째 미생물은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종일 수 있다. 본 발명의 일부 실시 태양에서, 전기 두번째 미생물은E.coli이외의 개체일 수 있다.
그 후, 상기한 바대로 밝혀진 두번째 개체로부터의 상동 핵산 서열을 유도가능한 프로모터 등의 어떤 프로모터에 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결하고 전기 두번째 세포 또는 미생물 내로 도입할 수 있다. 여기에 기술된, 증식에 필요한 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi유전자들을 밝혀내기 위한 방법들을 사용하여 전기 동정된 두번째 세포 또는 미생물로부터의 뉴클레오티드 서열들이 전기 두번째 세포 또는 미생물의 증식을 저해하는지를 결정할 수 있다. 예를들어, 전기 두번째 미생물은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 속하는 아무 종일 수 있다. 본 발명의 일부 실시 태양에서, 전기 두번째 미생물은E.coli이외의 개체일 수 있다.
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi가 아닌 다른 미생물들의 증식에 필요한 안티센스 핵산 또는 그에 해당하는 유전자들을 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalisORF, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi를 포함하는 미세배열에 또한 혼성화시켜서, 전기 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalisORF, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi서열들(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 의 핵산을 포함)과 다른 세포 또는 미생물들의 증식에 필요한 핵산들 사이의 상동성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 전기 증식에 필요한 핵산은Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로부터 수득한 것일 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,Enterococcus faecalisORF, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 전기 뉴클레오티드 서열들 또는 상동 핵산들을 사용하여,E. coli이외의 개체에서 증식에 필요한 서열을 동정할 수있다. 본 발명의 실시태양에서 전기 증식에 필요한 서열들은E. coli이외의 개체로부터 수득한 것일 수 있으며, 전기 속하는 어떤 종들로부터 수득한 것일 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalisORF, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,또는Salmonella typhi를 제외한 세포 또는 미생물로부터의 전기 증식에 필요한 핵산은 전기 탐침이 미세배열 상의 뉴클레오티드 서열에 서로 다른 정도의 상동성을 가질 때 혼성화가 일어나도록 허용하는 다양한 조건하에서 전기 배열에 혼성화될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 세균의 성장 또는 증식을 저해하는 본 발명의 전기 안티센스 핵산들(서열 번호 8 내지 3795 또는 상동 안티센스 핵산을 포함)을 살균용 안티센스 치료제로 사용할 수 있다. 전기 안티센스 서열들은 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 중 하나, 상동 핵산 또는 그 부분에 상보적일 수 있다(즉, 전기 안티센스 핵산은 전기 증식에 필요한 유전자가 존재하는오페론 내의 어느 유전자의 뉴클레오티드 서열에도 혼성화될 수 있다). 나아가, 안티센스 치료제들은 인접 비암호화 서열, 유전자내 서열(즉, 유전자의 내부에 있는 서열), 유전자간 서열(즉, 유전자들 사이의 서열), 둘 이상의 유전자들의 적어도 한 부분을 채우는(spanning) 서열, 세균 증식에 필요한 실제 서열 또는 증식에 필요한 유전자를 포함하는 오페론의 윗쪽 또는 아랫쪽에 위치한 5' 비암호화 영역 또는 3' 비암호화 영역을 가지거나, 가지지 않은 증식에 필요한 유전자 또는 그 일부에 상보적일 수 있다.
치료적 응용에 더하여, 본 발명은 증식에 필요한 서열들에 상보적인 핵산서열들을 진단(diagnostic) 도구로 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 증식에 필요한 서열들에 상보적인, 특정 세포 또는 미생물 종에 특이적인 핵산 탐침들을 임상 재료(clinical specimen)들에서 특정 미생물 종을 동정하는 탐침으로 사용할 수 있다. 이러한 이용으로, 어떤 세균의 감염의 원인이 되는 작용제 또는 작용제들을 밝히는 신속하고 신뢰할 만한 방법을 얻을 수 있으며, 임상 의사들은 그러한 감염들을 치료하는 종 특이적 항균 화합물들을 처방할 수 있게 된다. 이러한 이용의 연장선으로, 증식에 필요한 서열들로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 단백질들에 대하여 제조된 항체들을 또한, 전기 단백질들을 생산하는 특정 미생물들을 종 특이적 방식으로 선별하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양들은 세포증식에 필요한 유전자 산물의 활성을 저해하는 화합물을 동정하여 합리적인 약물 설계에 이용하는 방법들을 포함한다. 아래에서 좀더 자세히 논의하는 바와 같이, 이러한 방법에서, 엑스선결정학(x-raycrystallography) 또는 컴퓨터 모델링등의 기술을 이용하여 전기 유전자 산물의 구조를 결정한다. 화합물을 탐색하여, 전기 유전자 산물 또는 그 부분과 상호작용하여 그 활성을 저해할 수 있도록 하는 어떤 구조를 가지는 것들을 동정한다. 전기 화합물들은 조합 화학을 포함하는, 당 업계에서 숙련된 자에게 익숙한 다양한 방법들 중 어떤 것을 사용하여 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, 전기 화합물은 천연물 라이브러리(natural product library)로부터 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, 효소활성 영역등의 어떤 유전자 산물의 활성 영역 또는 복합체를 형성하는 또다른 생분자와 상호작용하여 어떤 복합체를 형성하는 전기 유전자 산물의 일부와 상호작용하도록 하는 구조를 가지는 화합물을 동정한다. 바람직하게는, 선행 화합물들을 동정하고 나아가 최적화시켜서 전기 유전자 산물에 매우 효과적인 화합물을 제공할 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 전기 유전자들과 증식에 필요한 것으로 밝혀진 전기 유전자들의 일부 사용예들을 개시한다. 하기 실시예들은 단지 예시적인 것일 뿐이며, 본 발명의 영역을 제한하지 않는다.
하기 실시예들은 증식에 필요한 유전자들의 동정 및 그 이용에 관한 것이다.전기 동정된 서열들을 이용하는 다양한 방법들과 함께 유전자 동정의 방법들을 논의한다. 서열번호 8 내지 3795의 전기 안티센스 핵산, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 전기 핵산, 또는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 전기 폴리펩티드를 포함하는, 전기 안티센스 핵산들, 증식에 필요한 유전자들 또는 여기에서 기술되는 증식에 필요한 유전자 산물 또는 그 일부를 하기와 같은 방법으로 사용하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 상동 암호화 핵산 및 그 부분을 아래에서 기술하는 방법중에서 임의로 사용할 수 있다.
S taphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 또는 Enterococcus faecalis 의 증식에 필요하다고 밝혀진 유전자
게놈 절편들을 벡터내의 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결하고 성장저해 활성을 조사하였다. 실시예 1은 유도가능한 프로모터를 포함하는 벡터내로 클로닝된 게놈 절편의 라이브러리에 대한 조사를 기술한다. 자일로즈(xylose)또는 IPTG로 유도하면 전기 벡터는 부차 클로닝된 게놈 절편에 해당하는 RNA 분자를 생성한다. 전기 게놈 절편이 전기 프로모터를 향하여 안티센스 배향으로 위치하는 예에서, 전기 생성된 전사물은 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis유전자 산물을 암호화하는 mRNA(전령 RNA)의 적어도 일부분에 상보적이므로, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis의 다양한 유전자로부터 생성되는 센스 RNA와 상호작용하여, 전기 센스 mRNA의 양 또는 변역 효율을 감소시키고, 이러한 센스 mRNA 분자에의하여 암호화되는 전기 단백질 생산을 감소시킨다. 이때 전기 센스 mRNA가 증식에 필요한 어떤 단백질을 암호화하는 경우, 전기 프로모터로부터 전사가 유도된 벡터를 함유하는 세균 세포들은 성장이 멈추거나 실제적으로 감소된 속도로 자란다. 전기 유전자가 리보솜 RNA 등의 비번역 RNA를 암호화하는 경우에도 전기 프로모터로부터 전사가 유도된 벡터를 함유하는 세균 세포들은 성장이 멈추거나 실제적으로 감소된 속도로 자란다.
실시예 1: 안티센스 발현 유도 후 세균 증식 저해
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae의 증식에 포함되는 핵산을 다음과 같이 동정하였다. Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들은 유도가능한 프로모터로부터 전사되었다.
Staphylococcus aureus의 경우에, Staphylococcus aureus의xylA프로모터로 부터 변형되었고xylO에 융합된 T5 프로모터를 포함하는 새로운 유도가능한 프로모터 시스템, XylT5를 사용하였다. 전기 프로모터는 미국 특허 제 60/259,434에 기술되었다. 이 혼성 프로모터로부터의 전사는 자일로즈로 유도가능하다.
Salmonella typhimurium게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들은 pLEX5BA 내의 IPTG로 유도가능한 프로모터들 또는 그 파생물로부터 전사되었다(참조: 크라우스 외., 1997, J. Mol. Biol., 274:365).Klebsiella pneumoniae게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들은 pLEX5BA-Kan 내의 IPTG로 유도가능한 프로모터들로부터 발현되었다. pLEX5BA-Kan을 제작하기 위하여, pLEX5BA를Cla1으로 절단하여bla유전자를 제거하고 완성하였다. 이후, 전기 플라스미드를 NotⅠ으로 부분 절단하고 T4 중합효소로 둔단화(blunted)시켰다. 3.2kbp의 절편을 겔 정제한후 pKanπ벡터의 둔단화된 1.3kbp의 kan 유전자에 연결하였다. Kan에 저항성을 가지는 형질전환체를 Kan 배양접시 상에서 선별했다. SmaⅠ절단으로 전기 kan 유전자의 배향을 검사하였다. 전기 kan 유전자가 전기 bla 유전자와 같은 배향에 있는 클론을 사용하여,Klebsiella pneumoniae의 증식에 필요한 유전자들을 동정한다.
Pseudomonas aeruginosa게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들은 두가지 요소로 유도가능한 시스템으로부터 전사됐다. 염색체 상에 삽입된 T7 RNA 중합효소는lacUV5/lacO에 의하여 조절되었다(참조: 브런스취비 이. 와 다진 메이., 1992, Gene, 111:35-41). 분리된 플라스미드 상에서, T7 RNA 중합효소에 의하여 전사되는 T7 유전자 10 프로모터를 복합 클로닝 영역(multiple cloning site) 앞의lacO작동자에 융합시켰다.
전기 프로모터 아랫쪽의 게놈 DNA는 증식에 포함되는 어떤 유전자 산물을 암호화하는 mRNA 또는 비-번역 RNA의 적어도 일부를 안티센스 배향으로 포함하며, 프로모터로부터 전사를 유도하면 식별가능한 증식의 저해가 일어난다.
Staphylococcus aureus의 경우에, Staphylococcus aureus게놈 절편의 샷건(shotgun) 라이브러리는 pXyIT5-P15 벡터내로 클로닝되었으며, 이는 XyIT5 유도가능한 프로모터/작동자를 포함한다. 전기 선형화된 벡터에 전기 선형화된 말단이 다시 연결되는 것을 막기 위하여 새우 알칼리성포스파타아제를 처리하였다. Staphylococcus aureus균주 RN450으로부터 분리된 게놈 DNA를 제한효소 Sau3A로 완전히 절단하거나, 다르게는 DNaseI으로 부분 절단하고 T4 DNA 중합효소를 처리하여 "둔단화(blunt-ended)" 시켰다. 200 내지 800 염기 쌍 사이의 길이를 가지는 무작위 게놈 절편들을 겔 정제(gel purification)로 선별하였다. 크기로 선별된 게놈 절편을 선형화되고 탈인산화된 벡터에 0.1:1의 몰비로 첨가하고, 접합시켜 샷건 라이브러리를 형성하였다.
전기 접합된 산물들을 전기적인 방법으로 형질전환 가능한 (electrocompetent)E.coli균주 XL1-Blue MRF(스트라타진, Stratagene) 내로 도입시키고, 100㎍/㎖의 카르베니실린(carbenicillin)을 포함하는 LB 배양 접시에 도포한다. 결과적으로 생기는 5x105또는 그 이상의 집락(colony)을 모아서 합친 후, 그로부터 플라스미드를 정제하였다.
전기 정제된 라이브러리를 이후, 전기적인 방법으로 형질전환 가능한 Staphylococcus aureusRN4220에 도입하였다. 생성되는 형질전환체를 0.2% 글루코스를 포함하는 LB배지인 LBG 한천 배지 및 전기 LBG 배지에 15㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 LBG+CM15 한천 배지 도포하여 개당 500개의 집락을 가지는 배양접시를100에서 150개 정도 수득하였다. 전기 집락들을 자동 수확(robotic picking)하여 384 웰 배양 접시의 웰에 배열하였다. 각각의 웰에는 100㎕의 LBG+CM15 배지가 포함된다. 접종된 384 웰 배양접시를 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 각각의 웰은 2% 자일로즈를 포함하거나 포함하지 않는 LBG+CM15 고형 배지로 자동으로(robotically) 격자화(gridded)시켰다. 격자화된 배양접시들을 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 자일로즈의 존재하에서 성장이 둔화되는(growth-compromised) 배열된 집락 수를 수작업으로 기록하였다.
2%의 자일로즈를 포함하는 배지에서 성장 민감도를 가지지만 자일로즈가 없는 유사 배지에서도 성장이 가능한 배열된 집락들을 대상으로, 다음과 같은 성장 민감도 분석을 하였다: 자일로즈가 없는 배양접시로부터 수작업으로 집락을 수확하여, LBG+CM15 배지를 포함하는 96 웰 배양접시의 각 웰에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 신선한 배지에 1/100로 자동 희석하여 37℃에서 4시간 동안 추가 배양한 후, 그것을 384 웰 배열에 순차 희석(serial dilution)하여 2% 자일로즈를 포함하거나 포함하지 않는 배지상에 격자화시켰다. 두가지 배지 모두에서, 모든 희석배수가 유사하게 성장하는 클론들은 음성으로 기록하였고 이들은 더 이상 고려하지 않았다. 같은 희석 배수에서 자일로즈 배지에서는 성장하지만 비-자일로즈 배지에서는 자라지 못하는 클론들을 그 차이에 근거하여 기록하였다. 즉, 자일로즈 배지에서는 104또는 그 이하의 희석배수에서 성장하고, 비 자일로즈 배지에서는 108또는 그 이하의 희석배수에서 성장하는 클론들의 경우, 해당클론들은 관찰되는 성장가능 희석 배수의 로그(log) 차이에 기초하여 "4"로 표시되는 값을 갖도록 되었다.
Salmonella typhimurium와Klebsiella pneumoniae에 대하여,1mM IPTG를 함유한 또는 함유하지 않은 새 배지로 배양물을 1:200으로 역희석하고(back diluting) 30분 간격으로 OD450를 측정함으로써 성장 곡선(growth curve)을 완성하였다. 고체 배지 상에서의 전사 유도 효과를 연구하기 위하여, 하룻밤 배양물의 102, 103, 104, 105, 106, 107및 108배 희석액을 준비하였다. 이 희석액들의 0.5 내지 3㎕의 부분표본(aliquot)들을 1mM IPTG를 함유한 또는 함유하지 않은 선별 한천 플레이트(selective agar plate)에 점적(spotting)하였다. 하룻밤 배양 후, 전기 플레이트들을 비교하여 IPTG에 대한 전기 클론들의 민감성을 평가하였다.
Pseudomonas aeruginosa의 성장에 포함되는 핵산들은 다음과 같이 동정되었다.Pseudomonas aeruginosa게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들은 두가지 요소로 유도가능한 프로모터 시스템으로부터 전사됐다. 염색체 상에 삽입된 T7 RNA 중합효소는lacUV5/lacO에 의하여 조절되었다(참조: 브런스취비 이. 와 다진 에이., 1992, Gene 111:35-41). 발현 플라스미드 상에서, T7 RNA 중합효소에 의하여 전사되는 T7 유전자 10 프로모터를 복합 클로닝 영역 앞의lacO작동자에 융합시켰다. 전기 프로모터 아랫쪽의 게놈 DNA는 증식에 포함되는 어떤 유전자 산물을 암호화하는 mRNA또는 비-번역 RNA의 적어도 일부를 안티센스 배향으로 포함하며, 프로모터로부터 전사를 유도하면 식별가능한 증식의 저해가 일어난다.
Pseudomonas aeruginosa게놈 절편의 샷건 라이브러리를 유도가능한 T7lacO프로모터를 포함하는 pEP5, pEP5S 또는 다른 유사하게 제작된 벡터내로 클로닝하였다. 전기 벡터를 T7lacO프로모터/작동자의 바로 다음에 존재하는 특이한SmaI영역에서 선형화시켰다. 전기 선형화된 말단이 다시 연결되는 것을 막기위하여, 전기 선형화된 벡터에 새우 알칼리성포스파타아제를 처리하였다.Pseudomonas aeruginosa균주 PAO1으로부터 분리된 게놈 DNA를 DNaseI으로 부분 절단하고, T4 DNA 중합효소를 처리하여 "둔단화" 시켰다. 200 내지 800 염기 쌍 사이의 길이를 가지는 무작위 게놈 절편들을 겔 정제로 선별하였다. 크기로 선별된 게놈 절편을 전기 선형화되고 탈인산화된 벡터에 2:1의 몰비로 첨가하고, 접합시켜 샷건 라이브러리를 형성하였다.
전기 접합된 산물들을 전기적인 방법으로 형질전환 가능한E.coli균주 XL1-Blue MRF(스트라타진, Stratagene) 내로 도입시키고, 100㎍/㎖의 카르베니실린 또는 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sterptomycin)을 포함하는 LB 배양 접시에 도포한다. 결과적으로 생기는 5x105또는 그 이상의 집락을 모아서 합친 후, 그로부터 플라스미드를 정제하였다.
이어 전기 정제된 라이브러리를, 전기적인 방법으로 형질전환 가능한Pseudomonas aeruginosa균주 PAO1에 도입하였다. 생성되는 형질전환체를 100㎍/㎖의 카르베니실린 또는 40㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sterptomycin)을 포함하는 LB 한천배지에 도포하여 개당 500여개의 집락을 가지는 배양접시를 100에서 150개 정도 수득하였다. 전기 집락들을 자동 수확(robotic picking)하여 384 웰 배양 접시의 웰에 배열하였다. 각각의 웰에는 100㎕의 LB+CB 100 또는 스트렙토마이신 40 액체 배지가 포함된다. 접종된 384 웰 배양접시를 실온에서 16시간 동안 배양하고, 각각의 웰을 1 mM IPTG를 포함하거나 포함하지 않는 LB+CB100 또는 스트렙토마이신 40 고형 배지로 자동으로(robotically) 격자화(gridded)시켰다. 격자화된 배양접시들을 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, IPTG의 존재하에서 성장이 둔화되는 배열된 집락 수를 수작업으로 기록하였다.
1 mM IPTG를 포함하는 배지에서 성장 민감도를 가지지만 자일로즈가 없는 유사 배지에서도 성장이 가능한 배열된 집락들을 대상으로, 다음과 같은 성장 민감도 분석을 하였다: IPTG가 없는 플레이트로부터 수작업으로 집락을 수확하여, LB+CB100 또는 스트렙토마이신 40 배지를 포함하는 96 웰 배양접시의 각 웰에 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 신선한 배지에 1/100로 자동 희석하여 37℃에서 4시간 동안 추가 배양한 후, 그것을 대상으로 384 웰 배열에 순차 희석(serial dilution)하여 1 mM IPTG를 포함하거나 포함하지 않는 배지상에 격자화시켰다. 37℃에서 16시간 동안 다시 배양한 후, 두 배지사이의 생성된 순차 희석된 스폿(spot)을 비교하였다. 두가지 배지 모두에서, 모든 희석배수가 유사하게 성장하는 클론들은 음성으로 기록하였고 이들은 더 이상 고려하지 않았다. 같은 희석 배수에서 IPTG 배지에서는 성장하지만 비-IPTG 배지에서는 자라지 못하는 클론들을 그 차이에 근거하여 기록하였다. 즉, IPTG 배지에서는 104또는 그 이하의희석배수에서 성장하고, 비 IPTG 배지에서는 108또는 그 이하의 희석배수에서 성장하는 클론들의 경우, 해당 클론들은 관찰되는 성장가능 희석 배수의 로그(log) 차이에 기초하여 "4"라는 값을 갖도록 하였다.
유도 시,Pseudomonas aeruginosa의 성장 또는증식에 부정적인 영향을 미치는 벡터들을 동정한 후, 전기 벡터에 포함된 삽입체들이나 핵산 절편들을 실제 특징을 밝히고자 분리하고. 관심있는 벡터들의 핵산서열을 결정하였다.
E.faecalis의 성장에 포함되는 핵산들은 다음과 같이 동정되었다. 게놈 DNA의 무작위적으로 제조된 절편들을 xyl 작동자/억제자에 의하여 각각 조절되는 CP25 또는 P59 프로모터를 포함하는 pEPEF3 또는 pEPEF14 벡터에서 발현시켰다. 전기 프로모터 아랫쪽의 게놈 DNA는 증식에 포함되는 어떤 유전자 산물을 암호화하는 mRNA또는 비-번역 RNA의 적어도 일부를 안티센스 배향으로 포함하며, 프로모터로부터 전사를 유도하면 식별가능한 증식의 저해가 일어난다.
E.faecalis게놈 절편의 샷건 라이브러리를 자일로즈로 유도가능한 프로모터를 포함하는 pEPEF3 또는 pEPEF14 벡터내로 클로닝하였다. 전기 벡터를 프로모터/작동자의 바로 다음에 존재하는 특이한SmaI영역에서 선형화시켰다. 전기 선형화된 말단이 다시 연결되는 것을 막기위하여, 전기 선형화된 벡터에 알칼리성포스파타아제를 처리하였다.E.faecalis균주 OG1RF 으로부터 분리된 게놈 DNA를 DNaseI으로 부분 절단하고, T4 DNA 중합효소를 처리하여 "둔단화" 시켰다. 200 내지 800 염기 쌍 사이의 길이를 가지는 무작위 게놈 절편들을 겔 정제로 선별하였다. 크기로 선별된 게놈 절편을 전기 선형화되고 탈인산화된 벡터에 2:1의 몰비로 첨가하고, 접합시켜 샷건 라이브러리를 형성하였다.
전기 접합된 산물들을 전기적인 방법으로 형질전환 가능한E.coli균주 TOP 10 세포(인비트로젠, Invitrogen) 내로 도입시키고, 150㎍/㎖의 에리스로마이신(erythromycin, Erm)을 포함하는 LB 배양 접시에 도포한다. 결과적으로 생기는 5x105또는 그 이상의 집락을 모아서 합친 후, 그로부터 플라스미드를 정제하였다.
이어 전기 정제된 라이브러리를, 전기적인 방법으로 형질전환 가능한E.faecalis균주 OG1RF에 도입하였다. 생성되는 형질전환체를 10㎍/㎖의 에리스로마이신을 포함하는 Todd-Hewit(TH) 한천배지에 도포하여 개당 500여개의 집락을 가지는 배양접시를 100에서 150개 정도 제조하였다. 전기 집락들을 자동 수확하여 384 웰 배양 접시의 웰에 배열하였다. 각각의 웰에는 100㎕의 THB+Erm 10㎍/㎖ 배지가 포함된다. 접종된 384 웰 배양접시를 실온에서 16시간 동안 배양하고, 각각의 웰을 5%의 자일로즈를 포함하거나 포함하지 않는 THB 한천 + Erm 10 고형 배지로 자동으로 격자화시켰다. 격자화된 배양접시들을 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 5% 자일로즈 존재하에서 성장이 둔화되는 배열된 집락 수를 수작업으로 기록하였다. 5% 자일로즈를 포함하는 배지에서 성장 민감도를 가지지만 자일로즈가 없는 유사 배지에서도 성장이 가능한 배열된 집락들을 대상으로 성장 민감도 분석을 하였다. 자이로즈가 없는 플레이트로부터 수작업으로 집락을 수확하여, THB + Erm10 배지를 포함하는 96 웰 배양접시의 각 웰에 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 신선한 배지에 1/100로 자동 희석하여 37℃에서 4시간 동안 추가 배양한 후, 그것을 대상으로 384 웰 배열에 순차 희석하여 5% 자일로즈를 포함하거나 포함하지 않는 배지상에 격자화시켰다. 37℃에서 16시간 동안 다시 배양한 후, 두 배지사이의 생성된 순차 희석된 스폿(spot)의 배열을 비교하였다. 두가지 배지 모두에서, 모든 희석배수가 유사하게 성장하는 클론들은 음성으로 기록하였고 이들은 더 이상 고려하지 않았다. 같은 희석 배수에서 자일로즈 배지에서는 성장하지만 자일로즈가 없는 배지에서는 자라지 못하는 클론들을 그 차이에 근거하여 기록하였다. 예를들어, 자일로즈 배지에서는 104또는 그이하의 희석배수에서 성장하고, 자일로즈가 없는 배지에서는 108또는 그이하의 희석배수에서 성장하는 클론들의 경우, 해당 클론들은 관찰되는 성장가능 희석 배수의 로그(log) 차이에 기초하여 "4"라는 값을 갖게 하였다.
유도 시,E.faecalis의 성장 또는 증식에 부정적인 영향을 미치는 벡터들을 동정한 후, 전기 벡터에 포함된 삽입체들이나 핵산 절편들을 실제 특징을 밝히고자 분리하고. 관심있는 전기 벡터들 내의 삽입체들의 핵산서열을 결정하였다.
무작위 게놈 절편을 제조하기위하여 다른 제한효소 및 다른 엔도뉴클리에이즈(Endonuclease) 또는 다른 방법들을 사용할 수 있다. 또한, 물리적 전단(shearing)으로 무작위 게놈 절편들을 제조할 수 있다. DNA의 물리적 전단 방법으로 초음파 분해(sonication) 및 분무(nebulization)등의 두가지 기술이 사용된다.
테스트된 많은 클론들 중, 일부 클론들은 IPTG 유도 후 성장을 저해시킨 서열을 함유한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 전기 삽입된 핵산서열이 해당하는 유전자 또는 전기 삽입된 핵산을 함유한 오페론내의 유전자는E. coli증식에 필요할 것이다.
실시예 2: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis증식에 부정적인 영향을 미치는 핵산 절편들을 전사한다고 밝혀진 클론들의 뉴클레오티드 서열 결정
희석 플레이팅(plating) 값 "2" 또는 그 이상을 받은 클론들로부터 플라스미드를 분리하여 다음과 같이 성장 저해를 일으키는 게놈 DNA 삽입체를 수득하였다. Staphylococcus aureus를 표준 실험 배지(플라스미드 선별을 위한 15 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 가지는 LB 또는 TB)에서 배양하였다. 배양은 배양 튜브 또는 2㎖ 깊이의 웰 미세역가 플레이트에서 37℃ 조건에서 수행되었다.
Staphylococcus aureus의 분쇄는 다음과 같이 수행하였다. 배양물(2-5 ㎖)을 원심분리하고 세포 침전물(pellet)을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀(lysostaphin) 용액(배양액 ㎖ 당 20 ㎕)에 용해시킨 후, 250 ㎕의 용해 버퍼(resuspension buffer) (Qiagen, U.S.A.)를 첨가하였다. 다르게는, 세포 침전물(pellet)을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀(lysostaphin) 용액 5-20 ㎕를 첨가한 250 ㎕의 용해 버퍼(resuspensionbuffer)(Qiagen, U.S.A.)에 직접 용해시켰다.
제조자에 의하여 제공된 방법에 따라 Qiagen miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)또는 Wizard miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)을 사용하여 DNA를 분리하였다.
전기 게놈 DNA 삽입체들은 전기 정제된 플라스미드로부터 다음과 같이 PCR로 증폭되었다.
Qiagen Hot Start PCR mix의 전체 반응 부피 25 ㎕에 1 ㎕의 Qiagen 분리된 플라스미드를 첨가하였다. Staphylococcus aureus에 대하여 다음의 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
pXylT5F: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG(서열번호 1)
LexL: TGTTTTATCAGACCGCTT(서열번호 2)
Salmonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여도 유사한 방법을 수행하였다.almonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여 다음의 프라이머를 사용하였다:
5'- TGTTTTATCAGACCGCTT - 3'(서열번호 2) 및
5'- ACAATTTCACACAGCCTC - 3'(서열번호 4)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 94℃ 45초
Step 3. 45℃ 45초
Step 4. 72℃ 1분
Step 5. step 2로 복귀, 29회
Step 6. 72℃ 10분
Step 7. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
희석 플레이팅(plating) 값 "2"또는 그 이상을 받은 클론들로부터 플라스미드를 분리하여 다음과 같이 성장 저해를 일으키는 게놈 DNA 삽입체를 수득하였다. Staphylococcus aureus를 표준 실험 배지(플라스미드 선별을 위한 15 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 가지는 LB 또는 TB)에서 배양하였다. 배양은 배양 튜브 또는 2㎖ 깊이의 웰 미세역가 플레이트에서 37℃ 조건에서 수행되었다.
Staphylococcus aureus의 분쇄는 다음과 같이 수행하였다. 배양물(2-5 ㎖)을 원심분리하고 세포 침전물을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀 용액(배양액 ㎖ 당 20 ㎕)에 용해시킨 후, 250 ㎕의 용해 버퍼(Qiagen, U.S.A.)를 첨가하였다. 다르게는, 세포 침전물을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀 용액 5-20 ㎕를 첨가한 250 ㎕의 용해 버퍼(Qiagen, U.S.A.)에 직접 용해시켰다.
제조자에 의하여 제공된 방법에 따라 Qiagen miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)또는 Wizard miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)을 사용하여 DNA를 분리하였다.
전기 게놈 DNA 삽입체들은 전기 정제된 플라스미드로부터 다음과 같이 PCR로 증폭되었다.
Qiagen Hot Start PCR mix의 전체 반응 부피 25 ㎕에 1 ㎕의 Qiagen 분리된 플라스미드를 첨가하였다. Staphylococcus aureus에대하여 다음의 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
pXylT5F: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG(서열번호 1)
LexL: TGTTTTATCAGACCGCTT(서열번호 2)
almonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여 유사한 방법을 수행하였다.almonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여 다음의 프라이머를 사용하였다:
5'- TGTTTTATCAGACCGCTT - 3'(서열번호 2) 및
5'- ACAATTTCACACAGCCTC - 3'(서열번호 4)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 94℃ 45초
Step 3. 45℃ 45초
Step 4. 72℃ 1분
Step 5. step 2로 복귀, 29회
Step 6. 72℃ 10분
Step 7. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
희석 플레이팅(plating) 값 "2"또는 그 이상을 받은 클론들로부터 플라스미드를 분리하여 다음과 같이 성장 저해를 일으키는 게놈 DNA 삽입체를 수득하였다. Staphylococcus aureus를 표준 실험 배지(플라스미드 선별을 위한 15 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 가지는 LB 또는 TB)에서 배양하였다. 배양은 배양 튜브 또는 2㎖ 깊이의 웰 미세역가 플레이트에서 37℃ 조건에서 수행되었다.
Staphylococcus aureus의 분쇄는 다음과 같이 수행하였다. 배양물(2-5 ㎖)을 원심분리하고 세포 침전물을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀 용액(배양액 ㎖ 당 20 ㎕)에 용해시킨 후, 250 ㎕의 용해 버퍼(Qiagen, U.S.A.)를 첨가하였다. 다르게는, 세포 침전물을 1.5 ㎎/㎖의 리소스타핀 용액 5-20 ㎕를 첨가한 250 ㎕의 용해 버퍼(Qiagen, U.S.A.)에 직접 용해시켰다.
제조자에 의하여 제공된 방법에 따라 Qiagen miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)또는 Wizard miniprep kit(Qiagen, U.S.A.)을 사용하여 DNA를 분리하였다.
전기 게놈 DNA 삽입체들은 전기 정제된 플라스미드로부터 다음과 PCR로 증폭되었다.
Qiagen Hot Start PCR mix의 전체 반응 부피 25 ㎕에 1 ㎕의 Qiagen 분리된 플라스미드를 첨가하였다. Staphylococcus aureus에대하여 다음의 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
pXylT5F: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG(서열번호 1)
LexL: TGTTTTATCAGACCGCTT(서열번호 2)
Salmonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여 유사한 방법을 수행하였다.almonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대하여 다음의 프라이머를 사용하였다:
5'- TGTTTTATCAGACCGCTT - 3'(서열번호 2) 및
5'- ACAATTTCACACAGCCTC - 3'(서열번호 4)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp(퍼킨 엘머, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 94℃ 45초
Step 3. 45℃ 45초
Step 4. 72℃ 1분
Step 5. step 2로 복귀, 29회
Step 6. 72℃ 10분
Step 7. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
Pseudomonas aeruginosa에대하여, 희석 플레이팅(plating) 값 "2"또는 그 이상을 받은 클론들로부터 플라스미드를 분리하여 다음과 같은 방법으로 성장 저해를 일으키는 게놈 DNA 삽입체를 수득하였다.Pseudomonas aeruginosa를 표준 실험 배지(플라스미드 선별을 위한 100 ㎍/㎖의 카르베니실린 또는 40 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 가지는 LB)에서 배양하였다. 배양은 미세역가 플레이트의 100 ㎕ 웰에서 37℃ 조건에서 수행되었다. 삽입 DNA를 증폭시키기위하여 Qiagen Hot Start PCR mix의 전체 반응 부피 25 ㎕에 2 ㎕의 배양물를 첨가하였다. PCR 반응은 96 웰 미세역가 플레이트에서 수행하였다. 플라스미드 pEP5S에대하여 다음의 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
T7L1+: GTCGGCGATATAGGCGCCAAGCAACCG(서열번호 5)
pStrA3: ATAATCGAGCATGAGTATCATACG(서열번호 6)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 94℃ 45초
Step 3. 54℃ 45초
Step 4. 72℃ 1분
Step 5. step 2로 복귀, 29회
Step 6. 72℃ 10분
Step 7. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
전기 정제된 PCR 산물들을 Qiagen Hot Start PCR mix를 사용하여 직접 순환 서열분석(cycle sequencing)하였다. 전기 서열분석에 사용한 프라이머는 다음과같다:
T7/L2: ATGCGTCCGGCGTAGAGGAT(서열번호 7)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 96℃ 10초
Step 3. 50℃ 5초
Step 4. 60℃ 4분
Step 5. step 2로 복귀, 24회
Step 6. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
E. faecalis에 대하여, 희석 플레이팅(plating) 값 "2"또는 그 이상을 받은 클론들로부터 플라스미드를 분리하여 다음과 같은 방법으로 성장 저해를 일으키는 게놈 DNA 삽입체를 수득하였다.E. faecalis는 미세역가 플레이트의 100 ㎕ 웰 내 THB 10 ㎍/㎖ Erm 배지에서 30℃, 하룻밤동안 배양하였다. 삽입 DNA를 증폭시키기위하여 Qiagen Hot Start PCR mix의 전체 반응 부피 25 ㎕에 2 ㎕의 배양물를 첨가하였다. PCR 반응은 96 웰 미세역가 플레이트에서 수행하였다. 다음의 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
pXylT5: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG(서열번호 1) 및
전기 pEP/pAK1 프라이머
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 94℃ 45초
Step 3. 54℃ 45초
Step 4. 72℃ 1분
Step 5. step 2로 복귀, 29회
Step 6. 72℃ 10분
Step 7. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
전기 정제된 PCR 산물들을 Qiagen Hot Start PCR mix를 사용하여 직접 순환 서열분석하였다. 전기 서열분석에 사용한 프라이머는 다음과같다:
pXylT5: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG(서열번호 1)
다음의 주기 시간(cycle time)의 조건으로 PE GenAmp를 사용하여 PCR을 수행하였다:
Step 1. 95℃ 15분
Step 2. 96℃ 10초
Step 3. 50℃ 5초
Step 4. 60℃ 4분
Step 5. step 2로 복귀, 24회
Step 6. 4℃ 유지
전기 PCR 산물들을 제조자가 제시하는 방법에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 플레이트들을 사용하여 정제하였다.
각각의 전기 방법들로부터의 전기 증폭된 게놈 DNA 삽입체은 자동 서열분석되었다. 전기 동정된 삽입체들에 대한 서열 식별 번호(서열번호)들 및 클론명들은 표 I에 나열되어 있으며, 하기에서 논의된다.
실시예 3: 알려진 서열들과 분리된 핵산들의 비교
상기 논의된 발현 벡터로부터 수득한 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis의 부차클로닝된 절편들의 뉴클레오티드 서열들을 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis및 다음과같은 다른 미생물들의 알려진 서열들과 비교하였다. 첫째, 각각의 클론이 염색체 상의 하나의 부위(location)로부터 유래되었으며 잡종(chimeric)이 아니라는것을 확인하기위하여, 전기 선택한 클론의 뉴클레오티드 서열들을 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis의 게놈 서열들과 비교하여 염색체상의 해당 부위에 클론을 정렬시켰다. 이러한 비교를 위하여 NCBI BLASTN v2.0.9 프로그램을 사용하였고, 게놈 데이타 출처로서 NCBI비반복(nonredundant) GenBank 데이타베이스 뿐 아니라 TIGR에서 권리를 가지는 불완전한 Staphylococcus aureus게놈 서열들을 사용하였다.Salmonella typhimurium서열들은 Genome Sequencing Center(http://genome.wustle.edu /gsc /salmonella.shtml)에서 활용가능한 서열들과 비교하였다.Pseudomonas aeruginosa서열들은 독점적인 데이타베이스 및 NCBI GenBank 데이타베이스에 비교하였다.E. faecalis서열들은 독점적인 데이타베이스에 비교하였다.
전기 BASTN 분석은 필터링이 꺼진(turn off) 상태에서 매개 변수를 사용하여 수행되었다. 다중 절편의 접합으로부터 생성된 삽입체에 대하여는 더이상 분석을 수행하지 않았다.
일반적으로, 안티센스 분자 및 그의 상보 서열들을 다음과같이 동정하였다. 첫째, 모든 가능한 전체 길이의 개방 해독 틀(open reading frames, ORFs)를 활용가능한 게놈 데이타베이스에서 추출하였다. 전기 데이타베이스는 GenBank nonredundant(nr) 데이타베이스, TIGR에서 활용가능한 미완료 게놈 데이타베이스 및 Incyte Genomics에서 개발된 PathoSeq 데이타베이스를 포함한다. 후자의 데이타베이스는 완전한 ORF 분석을 포함하는 40종이상의 주석이 달인 세균 게놈들을 포함한다. 관심 대상의 세균 게놈에 대하여 데이타베이스가 불완전하다면, 게놈에서 모든 ORFs를 추출할 필요없이 관심 대상 클론들에 상보적인 게놈 서열의 활용가능한 부분 내에 존재하는 ORFs만을 추출한다. GeneMark 등의 ORFs를 밝혀내기 위한 컴퓨터 알고리즘을 활용할 수 있으며 이는 당업계에 널리 알려져있다. 클론 DNA를 상보적인 ORFs에 비교함으로써 전기 클론이 센스 또는 안티센스 클론인지 결정할수 있다. 나아가, 전기 데이타베이스로부터 추출한 각각의 ORF를 GenBank (nr) 단백질 데이타베이스, SWISSPROT 및 그와같은 것을 포함하는 상세하게 주석이 달린 데이타베이스 내의 서열들과 비교할 수 있다. 이러한 데이타베이스들에서 전기 유전자 또는 밀접하게 연관된 어떤 미생물 내의 밀접하게 연관된 유전자에 대한 상세한 설명을 빈번하게 활용할 수 있다. 유사한 방법들을 사용하여 비번역 RNA들을 암호화하는 유전자들에 해당하는 안티센스 클론을 밝여낼 수 있다.
표 IB에 수집되어있는 유전자 동정 데이타를 생성하기위하여, 서열번호 8 내지 3795에 해당하는 전기 논의된 각각의 클로닝된 핵산을 사용하여 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis에 해당하는 ORF들을 미생물 게놈 서열 PathoSeq v.4.1데이타베이스에서 동정하였다(March 2000 release). 이 목적을 위하여, NCBI BLASTN 2.0.9 컴퓨터 알고리즘을 사용하였다. 필터링을 끈것을 제외하고는 매개변수를 사용하였다. BLASTN과 BLASTX의 전기 매개변수는 다음과 같다:
기대값(Expectation value)(e)=10
정렬 보기 기능(Alignment view options: 짝(pariwise)
필터 의문 서열(Filter query sequence)(BLASTN에는 DUST, 그이외는 SEG)=T
갭(gap)을 여는 값(0는 실행을 유발)=0
갭 확장 값(0는 실행을 유발)=0
갭을 가지는 정렬에 대하여 X 떨어지는 값(dropoff value)(in bits)(0는 실행을 유발)=0
디플린(deflines)에서 GI's를 보여줌=F
부정합(mismatch)에 대한 페널티(penalty)(BLASTN에만)=-3
정합(match)에 대한 리워드(reward)(BLASTN에만)=1
한 줄당 글자수(V)=500
화면에 보이는 정렬 수(B)=250
연장되는 히트(hits)에 대한 역치(threshold)=default
갭을 가지는 정렬 실행(BLASTX에는 불가)=T
사용하는 의문 유전 코드(Query genetic code)
디비 유전 코드(DB genetic code)(TBLAST[nx]에만)=1
SeqAlign file
전기 의문 디플린(query defline) 신뢰=F
매트릭스(matrix)=BLOSUM62
데이타베이스의 유효한 길이(실제 크기에는 0을 사용)=0
지켜야할 영역으로부터 가장 잘 맞는 히트 수(Number of best hits)=100
히트 판단에 사용되는 영역의 길이(실제 크기에는 0을 사용)=0
데이타베이스 검색을 위한 의문 표준(query standards)(BLSTN[nx] 및 TBLASTX에 대하여, 3은 둘다, 1은 위, 2는 아래)=3
HTML 출력물 생성=F
다르게는, 공공의 또는 개인의 데이타베이스 출처 검색을 통하여 ORFs를 동정하고 확실하게 밝혀내었다. 이러한 개체들에 대하여 전체 길이의 유전자 단백질과 뉴클레오티드 서열을 다양한 출처로부터 구성하였다.Pseudomonas aeruginosa에 대하여는, 유전자 서열을Pseudomonas게놈 서열분석 프로젝트에서 채택하였다(http://www.pseudomonas.com에서 내려받음).Klebsiella pneumoniae,Staphylococcus aureus, Streptococcsu pneumoniae 및 Salmonella typhi에 대해서는,PathoSeq v 4.1(March 2000 release)로부터의 게놈 서열을 진프로사(GenePro Inc.,451 Bishop St., N.W.,Suite B, Atlanta, GA, 30318, USA)로부터 구입한 유전자 탐색 소프트웨어 GeneMark v. 2.4a를 사용하여 재분석하였다.
유도가능한 프로모터로부터 전사하여 결과적으로 유전자간, 유전자내 서열의 ORFs에 상보적인 RNA 안티센스를 발현하는 전기 클론들로 안티센스 클론을 동정하였다. 단입 삽입체를 포함하며 유도시 성장 민감성을 야기하는 이러한 클론들은 표 IA에 나열하였다. 전기 안티센스 핵산에 상보적인 ORFs와 그들이 암호화하는 폴리펩티드는 표 IB에 나열하였다.
전기 논의된 공공 서열 데이타베이스에서 활용가능한 주석들로부터 PathoSeq의 유전자 상세설명을 작성하였다. 이때, 두개 또는 그이상의 인접한 ORFs 중요 서열이 나누어 지는것으로 보이는 클론은 일단 각각의 ORF에 나열하고 각각의 ORF에대한 PathoSeq 정보를 표 IB에 제시하였다.
표 IA에는 증식을 저해하는 전기 삽입체들과 클론이 동정된 개체의 클론 명을 나열한다. 이러한 정보를 사용하여 그 유전자 산물(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110)이 서열번호 8 내지 3795의 뉴클레오티드서열을 포함하는 핵산에의하여 저해되는 ORFs(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012)를 동정한다. 표 IB에는 전기 클론 명, 전기 안티센스 클론의 서열 번호, 전기 클론을 포함하는 PathoSeq 위치(Locus), PathoSeq에서 동정된 전기 ORF의 서열번호(유전자 서열 번호라 표지된 열(단백질)), Genemarker로 완전히 밝혀진 전체 길이의 유전자 및 전기 완전히 밝혀진 전체 길이의 유전자에의하여 암호화되는 단백질의 서열번호(전체 길이 ORF 단백질 서열 번호라 표지된 열)를 나열한다.
표 IC는 표 IB에 나열된 PathoSeq 유전자 위치(Locus), PathoSeq 단백질의 서열번호 및 그들을 암호화하는 핵산의 서열번호 사이의 교차 참고를 제공한다.
PathoSeq 이외의 데이타 베이스를 사용하여 ORF들을 동정할 수도 있다. 예를 들어 미국특허 제 60/191,078, March 21,2000 출원에 기술된 방법을 사용하여 전기 ORF들을 동정할 수 있다.
실시예 4: 안티센스 저해에 영향받은 유전자 및 그 해당 오페론의 동정
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa또는Enterococcus faecalis포함되는 전기 유전자들을 전기와 같이 동정하였으며, 이러한 유전자가 들어있는 전기 오페론들은 알려진 미생물 게놈과의 비교를 통하여 동정한다. 세균 유전자는 폴리시스트로닉 방법으로 전사되기 때문에, 어떤 오페론의 단일 유전자의 전기 안티센스 저해는 전기 오페론의 모든 다른 유전자 또는 전기 동정된 단일 유전자 아랫쪽의 유전자들의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 어떤 오페론 내에 포함된 유전자들 각각이 증식에 영향을 미치는 것으로 분석될 수 있다.
그 사이에 커다란 비암호화 갭(gap)이 없이 동일 배향에 위치하는 한 게놈 영역의 모든 인접 유전자들을 찾음으로써, 오페론들을 예측할 수 있다. 첫째, 안티센스 분자에 상보적인 전체 길이의 ORF들을 상술한 바와같이 동정하였다. 인접합 ORF들을 동정한후, 전기 안티센스 클론에 상보적인 전기 ORF들을 둘러싸고 있는 게놈 서열들을 직접 분석하거나, 전기 전체 게놈 ORF 분석을 통하여 수득한 집합으로부터 인접 ORF들을 추출하고 배열하는 방법으로 그들의 상대적인 배향을 결정하였다. 이러한 방법으로 예측된 오페론들은 Institute Pasteur Subtilist Release R15.1(June 24,1999)에서 수집하고, http://bioweb.pasteur.fr/GenoList/ SubtiList/에서 찾을 수 있는 게놈 데이타에 의하여 보고된 바대로,Bacillus subtilis완전한 게놈 서열의 상동핵산 배열과의 비교를 통하여 확인하였다.Bacillus subtilis게놈은 그람 양성 미생물 중에서 유일하게 전체 서열분석되고 주석이 달린 게놈이며, 유전자 서열 보존 수준 및 오페론 구조를 포함하는 게놈 조직면에서Staphylococcus aureus와 높은 수준의 유사성을 보인다.Salmonella typhimurium및Klebsiella pneumoniae에 대한 오페론들은E. coli, Haemophillus또는Pseudomonas서열과의 비교를 통하여 동정된다.Pseudomonas aeruginosa웹 사이트(http://www.pseudomonas.com)은 또한 이 미생물에서 오페론 구성을 예측하는데 도움을 줄 수 있다.
Salmonella typhimurium의 광범위한 DNA 서열은 the Salmonella Genome Center(Washington University, St.Louis, MO), the Sanger Center(UnitedKingdom) 및 the PathoSeq database(Incyte)를 통하여 활용할 수 있다. 전술한 데이타베이스 중 일부의 전기 DNA 서열 중 일부의 주석이 빠져있긴 하지만 BLASTX등의 도구를 사용하여E. coli와 비교할 수 있다.
공공의 또는 독점적인 데이타베이스를 사용하여, 전기 나열한 개체로부터의 서열들뿐만 아니라E.faecalis서열들을 분석할 수 있다.
Staphylococcus aureus로부터의 클론 번호 S1M10000001A05에 적용되는 것과같은 분석의 결과들을 표 Ⅱ에 나열하였다. 표 Ⅱ에는 증식에 포함되는Staphylococcus aureus의 서열번호, 이러한 유전자에의하여 암호화되는 단백질 및Staphylococcus aureus증식을 저해하는 핵산을 포함하는 클론 명이 나열된다. 또한, 표 Ⅱ에는 전술한 바와같이 결정되는Staphylococcus aureus게놈 서열에 포함되는 오페론들에 위치하는 다른 유전자들을 나열한다. 표 Ⅱ에 기술된 유전자들 각각에 대하여 공공의 데이타베이스 중 하나에서 동정되는 가장 밀접하게 연관된 상동체를 포함하는 미생물도 표 Ⅱ에 지적되어있다.
표 II:
DNA서열 번호 단백질서열 번호 분자 번호 클론 명 유전자 유전자의동정에 사용된 개체
37963797379837993800 38013802380338043805 SaXA001 S1M10000001A05 ytmInirRnirBnirDsirB B subtilisS. carnosusS. carnosusS. carnosusS. carnosus
표 IA에 나열된 증식을 저해하는 서열 및 표 IB 및 표 IC에 나열된 ORF 각각에 대하여 전기 분석을 수행하였다. 일단 전기 전체 길이의 ORF 및/또는 그를 포함하는 오페론을 전술한 방법을 사용하여 동정한 후, 각 말단의 바람직한 서열을 가지는 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 수행하여 게놈 라이브러리로부터 수득한다. 당업계의 숙련된 자에게있어 ORF를 다른 세포 또는 미생물의 상동체와 비교하여, ORF 각 말단의 개시 및 종결 코돈을 확인을 용이하게 해 줄 것이다.
몇몇 실시태양에서, 전기 탐침들은 적합한 벡터에 유전자나 오페론을 삽입하는데 용이하도록 제한 영역(restrinction site)을 포함한다. 예를 들면, 유전자들은 발현벡터에 삽입되어 하기와 같이 증식에 필요한 단백질을 생산하는데 사용된다. 전기 전체 길이 ORF 및/또는 오페론을 수득하는 다른 방법들은 당업계의 숙련된 자에게 친숙하다. 예를 들면, 전기 전체 길이의 ORF 및/또는 오페론들은 적합한 벡터에 삽입하기 위하여 자연적인(natural) 제한 영역을 채택할 수 있다.
실시예 5: 증식에 필요한 오페론내의 개별 유전자들의 규명
하기 실시예는 전기 표적 유전자의 암호화 영역의 인프레임 결실로 염색체 상의 표적 대립유전자를 대체함으로써 오페론 내에서 어느 유전자가 증식에 필요한지를 결정하는 방법을 설명한다.
삽입을 통한 유전자 치환(integrative gene replacement)으로, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi내의 유전자의 염색체 복제부위을 결실 불활성화(deletion inactivation)할 수 있다. 이 방법의 원리는 시아 엠., 외. (1999, Plasmid, 42:144-149) 와 해밀턴 씨엠., et al. (1989,J.Bacteriol., 171:4617-4622)에 기술되어있다. 유사한 유전자 파괴 방법은 대립 선별 표지가sacB인 경우를 제외하고Pseudomonas aeruginosa에 활용가능 하다(참조: 슈바이쳐 에이치피., 클라센 티. 및 호앙 티., 1996, Mol.Biol. ofPseudomonas,ASM press, 229-237). 이러한 접근에서, 전기 표적 유전자의 어떤 변이 대립유전자를 인프레임 결실 방법으로 구축하고, 조건적 자살 벡터(conditional suicide vector)를 사용하여 전기 염색체내로 도입한다. 이 결과로, 전기 표적 유전자의 결실된(null) 대립 유전자와 그 야생형 대립유전자가 직렬로 복제된다. 벡터 서열이 결실된 세포를 대립 선별 기술을 사용하여 분리한다. 염색체 삽입에서 벡터 서열을 제거하면, 그 야생형 표적 서열이 회복되거나 야생형 서열이 결실된(null) 대립 유전자로 치환된다.E. faecalis유전자는 관심대상의 유전자 내부 절편을 포함하는 자살 벡터를 사용하여 파괴될 수 있다. 적합한 선별로써 이러한 플라스미드는 염색체에 상동 재조합 된다(참조: 날라파레디 에스알., 킨 엑스., 바이스톡 엠., 후크 엠., 머레이 비이., 2000, Infect. Immun., 68:5218-5224).
결과적인 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi집락 군을 평가하여, 영향받은 표적 서열의 PCR 증폭을 통하여 전기 표적 서열이 증식에 필요한지 여부를 결정할 수 있다. 표적 유전자가 증식에 필요하지 않다면, 전기 PCR 분석에서 야생형 또는 변이형 대립유전자중 하나를 포함하는 집락의 수가 대략 비슷한 결과를 보일 것이고, 표적 유전자에 증식에 필요한 경우에는, 야생형 대립유전자만이 PCR 분석에서 회복될 것이다.
교차(cross-over) PCR 방법을 사용하여 관심대상 유전자의 측면에 존재하지만 암호화 영역은 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열의, 결과적인 두 PCR 증폭 산물이 중복되어 혼성화되도록 하는 특별히 제작된 프라이머를 사용한 증폭으로 변이 대립유전자를 제조하였다. 5' 및 3' 최말단의 프라이머들을 사용한 이 혼성화 산물의 PCR 증폭으로 전기 암호화 영역의 인프레임 결실을 포함하지만 실제적인 측면 서열이 남아있는 증폭 산물을 생성한다.
Staphylococcus aureus에대하여, 이 증폭 산물을 자동 복제가 숙주 의존적인 자살 벡터 pSA3182에 서브클로닝하였다(참조: 시아 엠. 외., 1999, Plasmid, 42:144-149). 이 벡터는tetC(테트라사이클린-저항성 표지(tetracyclin-resistance marker)) 및 잘 알려진 Staphylococcus aureus플라스미드 pT181의 복제 기점을 포함한다(참조: 모준다 엠. 및 칸 에스에이., 1988, Characterization of the Tetracycline Resistnace Gene of Plasmid pT181, J.Bacteriol. 170: 5522). 전기 벡터는 pT181 기점(Origin)에 벡터의 자동 복제에 필요한repC유전자를 포함하지 않는다. 이 벡터는repC를 트랜스로(in trans)로 발현하는 SA3528 등의 Staphylococcus aureus균주에서 증식 가능 하다. 전기 증폭된 절단 표적 유전자 서열을 클로닝하고 pSA3528 벡터에서 증식시킨 후에는 이를 RN4220 등의 repC 음성 균주에 일렉트로포레이션으로 도입하여 테트라사이클린 선별을 할 수 있다 (참조: 크레스비스 비엔. 외., 1983, The Toxic Shock Syndrome Exotoxin Structural Gene is Not Detectably Transmitted by a Prophage, Nature 305:709).이 균주에서, 전기 벡터는 약물 저항성을 갖기위하여 염색체 내의 전기 표적 유전자에 상동 재조합으로 삽입되어야한다. 이로써 pSA3528 벡터 서열 다음에 대립 유전자의 절단된 복제물이 삽입되어 결국 완전하고 기능적인 표적유전자의 대립유전자가 된다.
테트라사이클린 저항성 Staphylococcus aureus균주를 전기 기술로 분리하고 전술한 바와 같이 표적 유전자의 절단 및 야생형 대립유전자를 포함하는 것을 확인하면 전기 균주에 일렉트로포레이션으로 두번째 플라스미드, pSA7592,를 도입한다. 이 유전자는 에리트로마이신 저항성 유전자 및 고발현되는repC를 포함한다. 이러한 형질전환체에서의repC발현은 통합된 pT181 복제 기점에서 정상 염색체 복제를 방해하므로 유독하다. 상동 재조합에의하여 벡터 서열을 제거하게되면 다음의 두가지 결과중 하나를 초래하게 된다: 전기 선택된 세포들은 표적 유전자의 야생형 대립유전자를 가지거나 절단된 대립유전자의 인프레임 결실로 치환된 야생형 대립유전자가 존재하는 유전자를 가진다.
PCR 증폭으로 결과적인 전기 에리트로마이신 저항성, 테트라사이클린 민감성 형질전환체 집락 내의 전기 과정의 유전적 결과를 결정할 수 있다. 전기 표적 유전자가 증식에 필요하지 않다면, PCR로 합성 형질 전환체 개체군에서 야생형 과 변이형 대립유전자모두를 발견할 수 있을 것이다. 그러나 표적 유전자가 증식에 필요한 경우에는 유전자의 야생형만이 결과적인 형질전환체 사이에서 증거가 될 것이다.
유사하게, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiellapneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi에대하여, 전기 표적 서열의 변이형 대립유전자를 포함하는 PCR 산물들은 적절한 넉아웃 (knockout) 벡터에 도입될 수 있으며, 야생형 표적 유전자가 파괴된 세포들을 적절한 방법을 사용하여 선택한다.
전기 방법들은 인프레임 결실 변이의 삽입이 표적 유전자와 동일한 오페론 내의 유전자들에 아랫쪽(downstream) 극 효과(polar effect)를 야기하지 않는다는 잇점을 가진다. 그러나, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi유전자의 파괴를 위하여 당업계의 숙련된 자에게 친숙한 다른 방법을 사용할 수도 있다.
전기 오페론의 각각의 유전자를 전기 방법으로 파괴하여 그것이 증식에 필요한지 여부를 결정할 수 있다.
실시예 6: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi증식에 필요한 것으로 밝혀진 유전자들에 의하여 암호화되는 단백질의 발현
하기에서는 상기 기술된 밝혀진 서열들에 의하여 암호화되는 증식에 필요한단백질들을 발현하는 한가지 예시적인 방법을 제공한다. 증식에 필요한 단백질들은 당업계에 알려진 세균, 효모, 또는 동물세포 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 일부 실시태양에서 전기 동정된 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 증식에 필요한 단백질들(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산에 의하여 암호화되는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 단백질을 포함)은E. coli에 대하여 또는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi에 대하여 설계된 발현 시스템을 이용하여 발현시킬 수 있다. 첫째로, 전기 유전자에 대한 시작 및 종결 코돈을 밝힌다. 원하는 경우, 전기 단백질의 번역 또는 발현을 향상시키는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 시작 부위로 기능하는 메티오닌(methionine) 코돈, 강력한 샤인-달가르노 서열 또는 정지 코돈이 결여되어 있다면, 이 서열들을 첨가할 수 있다. 유사하게, 전기 동정된 핵산서열에 전사 종결 신호가 결여되어 있을 경우, 적절한 공여자 서열(donor sequence)로부터 이러한 서열을 잘라내는 등의 방법으로 이 뉴클레오티드 서열을 전기 작제물에 첨가할 수 있다. 덧붙여, 원할 경우, 전기 암호화 서열을 어떤 강력한 프로모터 또는 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결할 수 있다. 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 전기 동정된 핵산 또는 그 일부분을 예를 들어, 전기 동정된 핵산 또는 그 일부분에 상보적이며, 전기 암호화서열을 전기 벡터의 프로모터로부터 발현시킬수있는 벡터에 전기 서열을 삽입할 수 있도록 적당한 엔도뉴클리아제 제한서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침들을 사용하여 전기 세균 발현 벡터또는 유전체로부터 PCR로 수득할 수 있다. 다르게는, 다른 기존의 클로닝 기술을 사용하여 전기 프로모터가 전기 암호화 서열을 조절하도록 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 전기 암호화 서열의 아랫쪽에 종결신호가 위치하여야 전기 암호화 서열의 전사가 적당한 위치에서 종결될 수 있다.
E. coli에서의 단백질 발현을 위한 몇몇 발현벡터가 잘 알려져있으며, 당업계의 숙련된 자에세 활용가능하다. 전기 암호화 서열은 이러한 벡터 중 어느것에 삽입되어 전기 프로모터의 조절하에 놓일 수 있다. 전기 발현 벡터를 DH5α또는 단백질의 과발현에 적합한 기타의E. coli주 내로 도입하여 형질전환시킨다.
다르게는,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 단백질을 암호화하는 발현 벡터를Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi에 도입할 수도 있다.
이러한 개체에 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Methods in Molecular Biology vol 47(이 제이씨., "Electroporation of Staphylococci": Electroporation Protocols for Microorganisms Edited by: J.ANickoloff Humana Press Inc., Totowa, NJ. pp209-216)에 기술된 방법들을 사용하여 핵산을Staphylococcus aureus에 도입할 수 있다. 또한, 당업계에서 숙련된 자에게 친숙한 방법들을 사용하여 핵산을Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis에 도입할 수도 있다. 전기 벡터가 저항성을 내포하는 항생제를 포함하는 플레이트에서 전기 형질전환 세포들을 배양한 후 양성 클론들을 선택한다. 한가지 실시태양에서,Staphylococcus aureus에 전기 암호화 서열이 자일로즈 작동자를 포함하는 T5 프로모터에 작동가능하게 연결된 어떤 발현 벡터로 형질전환시키면 전기 암호화되는 단백질의 발현은 자일로즈로 유도할 수 있다.
한가지 실시태양에서는, 전기 단백질들은 발현되어 원래 서열로서 그 숙주 개체의 세포질 내에 머물러 있는다. 또다른 실시태양에서, 전기 발현된 단백질은 그람 음성 또는 그람 양성의 발현 숙주들의 주변세포질(periplasmic space) 또는 세포 밖(즉, 세포 배지내로)등의 서로다른 세포 표적을 가지도록 하는 단백질 표지(tag)을 포함하도록 변형될 수 있다.
일부 실시태양에서,Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2 (Ausubel, et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1997)의 16장에 기술된 삼투 충격(osmotic shock) 세포 용해 방법을 사용하여 전기 세포로부터 전기 폴리펩티드를 유리시킬 수 있다. 또다른 실시태양에서, 이러한 단백질 표지는 친화 크로마토그래피를 통하여 분리된 세포 또는 배양 배지로부터 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다.
그 후, 배양 배지내에 있는 것이든지 또는 주변세포질 또는 세포질로부터 방출된 것이든지간에, 발현된 단백질들을 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation), 표준적 크로마토그래피, 면역침전(immunoprecipitation), 면역크로마토그래피(immunochromatography), 크기 배제형(size exclusion) 크로마토그래피, 이온 교환(ion exchange) 크로마토그래피, 및 HPLC 등의 통상적인 방법들을 사용하여 정제하거나 또는 상층액으로부터 농축한다. 다르게는, 분비된 단백질을 전기 상층액 또는 그 숙주의 성장 배지 내에 충분히 농축된 또는 순수 상태로 있게 하여 더이상의 농축없이 의도한 목적대로 사용되게 할 수 있다. 전기 수득한 단백질 산물의 순도는 당업계의 숙련된 자에게 공지된 단백질 분석 기술인, SDS PAGE 등의 기술로 평가 할 수 있다. 쿠마시(Coomassie) 또는 질산은(silver) 염색(staining), 항체를 이용한 염색은 관심 대상 단백질을 가시화 할 수 있는 전형적인 기술이다.
당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하는 합성 펩티드를 사용하여 전기 관심 대상 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 제조 할수 있다(참조: Harlow and Lane, Eds.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 예를 들어, 관심 대상인 전기 동정된 적절한 유전자 서열 또는 그 일부분에 의하여 암호화된 서열을 가진 15개 아미노산의 펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다. 전기 합성 펩티드를 쥐(mouse)에 주입하여 관심 대상인 전기 동정된 핵산서열 또는 그 일부분에 의하여 암호화되는 전기 폴리펩티드에 대한 항체를 제조한다. 다르게는, 상기 논의된 발현 벡터로부터 발현된 단백질의 일부 표본을 정제하고 그 아미노산 서열을 분석하여 전기 재조합적으로 발현된 단백질의 정체를 확인하고, 이후, 항체 생산에 사용할 수 있다. 단클론성 및 다클론성 항체 제조를 상세히 기술하고 있는 실시예는 실시예 7이다.
표준적 면역크로마토그래피법을 사용하여 관심 대상인 전기 동정된 핵산 또는 그 일부분에 의하여 암호화되는 단백질을 정제할 수 있다. 이 실험방법에서, 전기 분비된 단백질에 대한 항체가 그 크로마토그래피 주형에 부착되어 있는 어떤 컬럼에, 전기 배양 배지 또는 세포 추출물 등의, 전기 분비된 단백질을 함유한 용액을 적용시킨다. 전기 분비된 단백질이 전기 면역크로마토그래피 컬럼에 결합하게 한다. 그 이후, 전기 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거한다. 그 후, 특이적으로 결합한 전기 분비된 단백질을 전기 컬럼으로부터 방출하고, 표준적 방법들을 이용하여 회수한다. 이 실험절차는 당업계에 잘 알려져 있다.
또다른 단백질 정제 방법으로, 관심 대상인 전기 동정된 핵산서열 또는 그 일부분을 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)를 이용한 정제 방법용으로 고안된 발현 벡터내로 통합시킬 수 있다. 이러한 전략에서, 관심대상인 전기 동정된 핵산서열 또는 그 일부분의 암호화 서열을 전기 키메라의 다른 절반을 암호화하는 유전자에 인프레임으로 삽입한다. 전기 키메라의 다른 절반은 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP) 또는 니켈 결합 폴리펩티드를 암호화하는 서열일 수 있다. 그후, MBP에 대한 항체 또는 니켈이 부착되어 있는 크로마토그래피 주형을 사용하여 전기 키메라 단백질을 정제할 수 있다. 전기 MBP 유전자 또는니켈 결합 폴리펩티드와 관심 대상인 전기 동정된 핵산서열 또는 그 일부분 사이에 단백질 분해효소(protease) 절단 부위(cleavage site)를 인위적으로 생성할 수 있다. 따라서, 단백질 분해효소 절단에 의하여 전기 키메라의 두 폴리펩티드들을 서로 분리할 수 있다.
말토스 결합 단백질 융합 단백질을 제조하는 한가지 유용한 발현 벡터는 pMAL(뉴잉글랜드 바이오램, New England Biolabs)로서, 이는malE유전자를 암호화한다. 전기 pMAL 단백질 융합 시스템에서, 전기 클로닝된 유전자를 pMAL 벡터내의 전기malE유전자의 아랫쪽으로 삽입시킨다. 이 결과로서 MBP-융합 단백질이 발현된다. 친화 크로마토그래피로 전기 융합 단백질을 정제한다. 기술된 바와 같은 이러한 방법들은 분자 생물학 업계에 숙련된 자에게 잘 알려져 있다.
실시예 7: 어떤 동정된Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 단백질에 대한 항체 생산
전기 실시예 6에 기술된 형질전환된 세포들로부터 단백질 또는 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드중 하나를 포함)를 순도가 충분히 높도록 분리한다. 전기 최종 시료의 단백질 농도를, 예를 들어, 10,000 분자량 분리의 AMICON 여과 장치(filter device)(밀리포어, Millipore, U.S.A.)로 수 ㎍/㎖ 정도로 조절한다. 그 후, 전기 단백질에 대한 단클론성 또는 다클론성 항체를 다음과 같이 제조할 수 있다:
혼성세포(hybridoma) 융합에 의한 단클론성 항체 생산
콜러(Kohler, G) 및 밀슈타인(Milstein, C)의 고전적인 방법(Nature 256:495, 1975)이나 또는 그로부터 파생된 잘 알려진 방법들 중 어느 것에 따라, 쥐의 혼성세포들을 이용하여, 상기 밝혀지고 분리된 펩티드들 중 어느 하나의 항원결정기에 대한 단클론성 항체를 제조할 수 있다. 간단히 말해서, 몇 주의 기간 동안에 걸쳐 쥐 한마리에 전기 선택된 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드 수 ㎍을 반복적으로 접종한다. 그 후, 전기 쥐의 비장에서 항체생산 세포를 분리한다. 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 전기 비장 세포를 쥐의 암세포(myeloma cell)와 융합시키고, 남은 융합하지 않은 세포들은 아미노프테린(aminopterin)을 함유한 선별 배지(HAT 배지)에서 배양함으로 파괴시킨다. 전기 성공적으로 융합한 세포들을 희석하고, 그 희석액의 부분표본들을 배양물의 성장이 지속될 수 있는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 웰(well)에 둔다. 엥발(Engvall, E.)의 "Enzyme immunoassay ELISA and EMIT"(1980,Meth. Enzymol., 70:419)에 기술된 바와 같은 엘라이자(ELISA) 및 그로부터 파생된 방법들 등의 면역학적 분석법에 의하여, 전기 웰의 상층액에서의 항체 검출로 항체생산 클론들을 동정한다. 선별된 양성클론(positive clone)들을 증식하여 사용을 목적으로 그 단클론성 항체 산물을 회수할 수 있다. 단클론성 항체 생산에 대한 상세한 방법은 데이비스 등(Davis, L., et al.)의 "Basic Methods in Molecular Biology"(Elsevier, New York, Section 21-2)에 기술되어 있다.
접종(immunization)에 의한 다클론성 항체 생산
적당한 동물을 전기 발현 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드로 접종함으로써, 단일 단백질 또는 펩티드의 이질(heterogeneous) 항원결정기에 대한 항체들을 함유한 다클론성 항혈청을 제조할 수 있는데, 이때, 전기 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드는 변형되지 않은 것이거나 또는 면역원성(immunogenicity)을 강화하기 위하여 변형시킨 것일 수 있다. 효과적인 다클론성 항체 생산에는 전기 항원 및 그 숙주 종 둘 다에 관련한 많은 요인들이 작용한다. 예를 들어, 작은 분자들은 큰 분자들에 비하여 면역성이 덜한 경향이 있어서 담체 또는 아주반트(adjuvant)사용이 필요할 수 있다. 또한, 숙주 동물마다 접종 부위 및 접종양에 차이가 있는데, 불충분하거나 과도한 양의 항원을 접종할 경우 낮은 역가(titer)의 항혈청이 생길 수 있다. 소량(ng 수준)의 항원을 다수의 표피내(intradermal) 부위에서 투여하는 것이 가장 신뢰할 만한 것으로 보인다. 토끼(rabbit)에 대한 효과적인 접종 방법은 베투카이티스 등(Vaitukaitis, J., et al.)의 논문( J. Clin. Endocrinol. Metab. ,33:988-991, 1971)에서 찾아볼 수 있다.
규칙적인 간격으로 추가 주입(booster injection)할 수 있으며, 예를 들어, 알려진 농도의 전기 항원에 대한 한천(agar)에서의 이중 면역확산(double immunodiffusion)으로 반정량적으로(semi-quantitatively) 결정된, 항원에 대한 항체 역가가 감소하기 시작할 때, 항혈청을 회수한다(참조: 오털러니 오. et al., 1973, Chap. 19 in:Handbook of Experimental Immunology, D. Wier (ed) Blackwell). 항체의 고원 농도(plateau concentration)는 혈청에 대하여 보통 0.1내지 0.2 ㎎/㎖(약 12μM) 범위이다. 경쟁적 결합 곡선(competitive binding curve)을 준비함으로써 전기 항원에 대한 전기 항혈청의 친화력을 결정한다(참조: 피셔 디., 1980, Chap. 42 in:Manual of Clinical Immunology, 2d Ed., Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C.).
어느 하나의 실험절차를 따라 제조된 항체 시료는 생물학적 시료에 있는 항원을 가진 물질의 농도를 결정하는 졍량적 면역분석에 유용하다; 전기 항체 시료는 또한 반정량적으로 또는 정성적으로(qualitatively) 사용되어 어떤 생물학적 시료에 있는 항원의 존재를 밝힐 수 있다. 전기 항체는 또한 전기 단백질을 발현하는 세균 세포를 죽이는 치료적 조성물로도 사용될 수 있다.
실시예 8: 화학적 라이브러리 선별
A.단백질에 기초한 분석법
분리되고 발현된 세균 단백질이 세균 증식에 필요한지를 본 후, 본 발명은 추가적으로 잠재적 약물 후보 물질들의 라이브러리를 조사하는 분석에 전기 발현된 단백질들을 사용하는 것을 고려한다. 전기 화학적 라이브러리 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 조합 화학을 사용하여 여기에 기술된 분석법에서 조사될 어떤 화합물 라이브러리를 제조할 수 있다. 조합 화학 라이브러리는 많은 화학적 "구성 분자(building block)"들인 시약들을 화합시키는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의하여 제조되는 다양한 화학적 화합물들의 집합이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리 등의 선형(linear) 조합 화학 라이브러리는 아미노산들을 지정된길이의 펩티드를 산출하는 모든 가능한 조합으로 결합시킴으로써 형성된다. 이론적으로, 화학적 구성 분자들의 조합을 통하여 수백만 개의 화학적 화합물들을 합성할 수 있다. 예를 들어, 어떤 사람은, 상호교환가능한 100개의 화학적 구성 분자들을 전기와 같이 조직적이고 조합적으로 혼합할 경우, 이론상 4합체(tetrameric) 화합물 1억개 또는 5합체 화합물 100억개가 합성됨을 관찰하였다(참조: 갤롭 et al., 1994, Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery, Background and Peptide Combinatorial Libraries,Journal of Medicinal Chemistry, 37(9):1233-1250). 또한, 천연 산물 라이브러리 등의 당업계에 알려진 기타의 화학적 라이브러리들을 사용할 수 있다.
조합적 라이브러리를 제조한 후, 이를 조사하여 바람직한 생물학적 특성을 가지는 화합물을 찾을 수 있다. 예를 들어, 약물로서 또는 약물 개발에 유용한 화합물들은 상기 논의한 바, 동정하고, 발현 및 정제한 전기 표적 단백질에 결합하는 능력을 소유할 것이다. 나아가, 전기 동정된 표적 단백질이 효소일 경우, 후보 화합물은 전기 표적 단백질의 효소적 특성을 방해할 것이다. 예를 들어, 표적 단백질의 효소적 기능은, 단백질 분해효소, 핵산 분해효소(nuclease), 포스파타아제 (phosphatase), 탈수소효소(dehydrogenase), 수송체 단백질, 전사 효소 및 알려진 또는 미지의 어떤 형태의 효소로 작용하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명은 조합적 및 기타 화학적 라이브러리를 조사하는 데에 상기한 단백질 산물을 사용하는 것을 고려한다.
한 예에서, 전기 표적 단백질은 세린 프로테아제(serine protease)이고 전기효소의 기질은 알려져 있다. 본 예는 화합물 라이브러리들을 분석하여 전기 표적 효소의 저해제로 기능하는 화합물을 동정하는 것에 관련되어 있다. 먼저, 당업계에 잘 알려진 조합적 라이브러리 형성 방법들을 사용하여 작은 분자들의 라이브러리를 제조한다. "System and Method of Automatically Generating Chemical Compound with Desired Properties"라는 제목의 아그라피오티스(Agrafiotis) 외. 저, 미국 특허 제 5,463,564호 및 5,574,656호에 그러한 방법들이 나와있다. 그 후, 전기 라이브러리의 화합물들을 조사하여 원하는 구조 및 기능적 특성을 가진 라이브러리 화합물들을 동정한다. 미국 특허 제 5,684,711에는 라이브러리들을 조사하는 방법이 논의되어 있다.
전기 선별 과정을 설명하면, 전기 라이브러리의 표적 폴리펩티드 및 화학적 화합물들을 서로 연결시켜, 서로 상호작용하도록 하게 한다. 표지된 기질을 전기 배양물에 첨가한다. 전기 기질상의 표지는 전기 표적 폴리펩티드의 활성에 의하여기질 분자의 산물로부터 검출가능한 신호가 발산되도록 한 것이다. 이 신호 발산으로 표적 효소의 효소 활성에 대한 전기 조합적 라이브러리 화합물의 영향을, 조합 라이브러리 화합물이 존재하지 않을때 발산되는 신호와 비교하여 측정할 수 있다. 전기 효소에 대한 활성을 보이는 화합물들을 분석하고, 밝혀진 다양한 화합물들에 공통적인 특징들을 분리하고 결합하여 차후에 라이브러리들에 반복할 수 있도록 각 라이브러리 화합물의 특성을 암호화한다.
화합물들의 한 라이브러리를 조사한 후, 전기 제 1차의 선별에서 전기 표적 효소에 대한 활성을 가진 것으로 나타난 특징들을 소유한 화학적 구성 분자들을 사용하여 이후의 라이브러리들을 제조한다. 이 방법을 사용하여, 전기 효소에 대하여 높은 특이성을 가진 어떤 효소 저해제 그룹을 찾을 때까지, 후보 화합물들에 대하여 전기 방법을 잇따라 반복적으로 시행하면서, 전기 표적 효소의 기능을 저해하는데 요구되는 구조적 및 기능적 특징들을 좀 더 많이 소유하는 화합물들을 선별한다. 그 후, 이러한 화합물들에 대하여, 포유동물용 항생제로서의 안전성 및 효능에 대하여 추가적으로 테스트할 수 있다.
이 특정 선별 방법론이 단지 예시적인 것임은 자명할 것이다. 이 외의 다른 방법들이 당업계에 숙련된 자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 다수의 자연발생적인 표적물들에 대하여, 전기 표적 단백질의 생화학적 기능이 알려져 있을 때, 매우 다양한 선별방법들이 알려져 있다. 예를 들어, 어떤 방법에서는 선도적 약물을 동정하고 개발하기 위하여 표적 단백질을 생화학적으로 및 유전학적으로 조사하고 분석할 작은 펩티드를 제조하고 사용하는 것이 포함된다. 이러한 방법들에는 PCT 공개 번호 제 WO9935494, WO9819162, WO9954728에 기술된 방법들이 있다. 다른 방법들은 천연물 라이브러리나 단백질 등의 거대분자 라이브러리를 활용한다.
전기 단백질에 기초한 분석법은Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 그 일부에서 수행될 수 있다.
B.세포에 기초한 분석법
현재 약물 발견 및 개발을 위하여 화합물들을 규명하거나 또는 특성을 밝히는데 사용되는 세포에 기초한 분석법들은 종종, 시험 화합물이 세포내에 위치한 또는 세포 표면에 위치한 표적 분자의 활성을 조정하는 능력이 있는지 탐지하는 것에 의존한다. 세포에 기초한 분석법의 장점은, 표적 분자의 활성에 대한 어떤 화합물의 작용을 실험실적 조건의 환경과 반대되는, 생리학적으로 관련된 세포 환경에서 검출할 수 있다는 점이다. 이러한 표적 분자 대다수는 효소, 수용체 등의 단백질이다. 그러나, 또한, 표적 분자는 DNA, 지질, 탄수화물 및 mRNA, rRNA, tRNA, 조절(regulatory) RNA 등을 포함하는 RNA 등의 기타 분자일 수 있다. 당업계의 숙련된 자들에게 이용가능한, 시험 화합물과 특정 표적 분자의 결합 및 상호작용을 검출하는 감도가 우수한 세포에 기초한 분석 방법들이 많이 있다. 그러나, 이 방법들은 일반적으로, 전기 시험 화합물이 그 표적 분자에 보통 수준으로 또는 낮은 친화력으로 결합하거나 또는 상호작용할 때는 그다지 효과적이지 않다. 게다가, 전기 표적 분자는, 예로서, 세포의 내부 또는 세포 구회에 위치해 있는 경우에, 용액 내에서 시험 화합물에 쉽게 접근할 수 없을 수 있다. 따라서, 현재의 세포에 기초한 분석 방법들은, 그 표적물과 보통 수준으로 또는 낮은 친화력으로 상호작용하는 화합물 또는 쉽게 접근할 수 없는 표적물과 상호작용하는 화합물들을 규명하거나 그 특성을 밝히는 데는 효과적이지 않다는 면에서 한계를 갖고 있다.
본 발명의 세포에 기초한 분석 방법들은 현재 당업계에서 실행되고 있는 세포에 기초한 분석법들과 비교할 때, 실질적인 장점들을 갖고 있다. 이 장점들은, 증식에 필요한 유전자 산물(표적 분자)의 양 또는 그 활성이 특별히 그 기능의 존재 또는 부재가 세포증식에 있어서 속도결정 단계(rate-determining step)가 되는 지점까지 감소한 감작세포를 사용하여 유도된 것이다. 본 방법에서는, 세균, 진균, 식물 또는 동물 세포 모두 이용가능하다. 이러한 감작세포들은 영향받은 전기 표적 분자에 대하여 활성을 가지는 화합물에 훨씬 더 민감해진다. 따라서, 본 발명의 세포에 기초한 분석법으로는, 전기 관심 대상 표적 분자에 대하여 낮은 또는 보통 수준의 효력을 나타내는 화합물들도 검출할 수 있는데, 이는 이러한 화합물들이 비감작세포보다는 감작세포에 대하여 실제적으로 더 효력이 있기 때문이다. 전기 영향력은, 시험 화합물이 전기 감작세포에 대하여 테스트할 때, 전기 비감작세포에 대하여 할때와 비교하여 2배 내지 여러 배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 심지어 1000배 이상 더 강력한 정도이다.
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 전기 증식에 관련된 핵산 이나 폴리펩티드 또는 그 부분은 여기에서 기술되는 전기 세포에 기초한 분석방법중 어느것에 사용될 수 있다. 유사하게, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산, 또는 상동 폴리펩티드 또는 상동 핵산 또는 상동 폴리펩티드의 부분은 여기에서 언급되는 전기 세포에 기초한 분석방법 중 어느것에 사용될 수 있다.
부분적으로는 병원성 미생물들에서 항생제에 대한 저항성 증가 및 현재 사용되고 있는 일부 항생제에 관련된 심각한 부작용 때문에, 당업계에서는 새로운 표적물에 작용하는 신규한 항생제를 찾고자 예의 노력하고 있다. 그러나, 현재 당업계의 세포에 기초한 분석법에 관련된 또다른 한계점은 동일한 제한된 일련의 생물학적 경로들에서 동일 종류의 표적 분자들에 대하여 작용하는 물질들을 계속적으로 찾고 있다는 점이다. 이런 일은, 새포운 표적물에 작용하는 화합물들보다 기존의 표적물에 작용하는 화합물이 좀 더 빈번히 나타나고 좀 더 강력하기 때문에 이러한 새로운 표적물에 작용하는 화합물들이 폐기되거나 무시되거나 또는 검출되지 않을 때 일어난다. 결과로서, 현재 사용중인 항생제 대다수는 심지어 극소수의 제한된 일련의 생물학적 경로 내의 비교적 소수의 표적 분자들과 상호작용한다.
본 발명의 감작세포를 사용할 경우, 전기 문제점은 두가지 방식으로 해결된다. 첫째로, 새로운 표적물이든지 또는 기존에 알려져 있었으나 거의 연구되지 않은 표적물이든지 간에 어떤 관심 표적물에 작용하는 원하는 화합물들은, 본 발명의 감작세포로 테스트될 때 그 효력이 특이적이고도 실제적으로 증가하기 때문에, 이제는 전기 "기존의" 표적물들에 작용하는 화합물들의 "노이즈(noise)" 위로 검출될 수 있다. 둘째로, 세포를 관심 표적물에 작용하는 화합물들에 민감하게 하는데 이용되는 방법들은 또한, 이 세포들을 동일 생물학적 경로 내의 다른 표적 분자들에 작용하는 화합물에도 민감하게 할 수 있다. 예를 들어, 리보솜 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 분자를 발현시키는 것은, 그 리보솜 단백질에 기능하는 화합물에 대하여 세포를 감작시키리라 예상되며, 또한 그 리보솜 성분들(단백질 또는 rRNA) 중 어느 하나에 작용하는 화합물 또는, 심지어 전기 단백질의 합성경로의 한 부분인 어떠한 표적물에라도 작용하는 화합물에도 전기세포를 감작시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 중요한 장점은, 이전에 약물 발견 방법으로 쉽게 접근할 수 없었던 새로운 표적물 및 경로들을 드러낼 수 있다는 점이다.
표적 분자의 활성 또는 양을 감소시킴으로써 본 발명의 감작세포들을 제조한다. 전기 표적 분자는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터의 전기 증식에 필요한 핵산 또는 그 상동핵산으로부터 생산된 RNA 또는 폴리펩티드 등의 유전자 산물(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리펩티드 등의 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 핵산으로부터 생성되는 유전자산물을 포함)일 수 있다. 예를들어, 전기 표적분자는 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 전기 폴리펩티드 중 하나거나 상동 폴리펩티드일 수 있다. 다르게는, 전기 표적물은Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터의 전기 증식에 필요한 핵산과 같은 오페론 내에 있는 서열 또는 상동 핵산으로부터 생산된 RNA 또는 폴리펩티드 등의 유전자 산물일 수 있다. 나아가, 전기 표적물은,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터의 전기 증식에 필요한 핵산과같은 생물학적 경로에 속한 RNA 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 생물학적 경로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포벽 등의 세포 구조물의 생산에 관련된 경로뿐만 아니라, 효소적, 생화학적 및 대사적(metabolic) 경로를 포함한다.
의약 및 조합 화학 업계에서 현재 이용되는 방법들에서는, 직접 결합법 (direct binding assay) 및 세포에 기초한 분석법을 포함한 다양한 생물학적 분석법으로 화합물을 테스트하여 수득한 구조-활성 관계 정보를 사용할 수 있다. 경우에 따라서는, 이러한 분석법들로 약물로 개발될 잠재성이 충분한 화합물들을 직접적으로 동정할 수 있다. 보다 종종, 초기에 주목받은 화합물들이 보통 수준의 또는 낮은 효력을 보인다. 초기에 주목받은 화합물이 낮거나 또는 보통 수준의 효력을 가진 것으로 밝혀지면, 관련된 화합물 라이브러리들을 합성하고 테스트하여 좀더 강력한 것을 찾는다. 일반적으로, 이 관련 라이브러리들은 전기 히트한 화합물과 관련되지만 다양한 구조적 특징들의 첨가, 제거(subtraction) 및 치환을 포함한, 조직적 다양성을 가진 구조를 포함하는 화합물들로 구성된 조합화학 라이브러리들이다. 전기 표적 분자들의 활성이 테스트될 때, 구조적 특징들은, 홀로 또는 다른 특징들과 협력하여 활성을 강화하거나 또는 감소시키는 것으로 밝혀진다. 이 정보는 전기 표적 분자에 대하여 활성이 강화된 화합물들을 포함하는 이후의 관련 라이브러리들을 고안하는데 사용된다. 이 과정을 한번 또는 여러번 반복한 후, 전기 표적 분자에 대한 활성이 실질적으로 증가한 화합물들을 동정하고, 나아가 약물로 개발할 수 있다. 본 발명의 감작세포를 사용하여 이 과정을 촉진할 수 있는데, 이는 전기 선택된 표적물에 작용하는 화합물이 이러한 세포에 기초한 분석법에서증가된 효력을 나타내고, 따라서, 좀더 많은 화합물들이 이제 그 특성이 밝혀져서 다른 방법들로 수득한 것보다 더 유용한 정보를 제공하기 때문이다.
따라서, 이제는 본 발명의 세포에 기초한 분석법을 사용하여 이전에는 세포에 기초한 분석법들을 사용하여 쉽게 탐구되지 못했던 표적물에 작용하는 화합물들을 포함하여, 이전에 쉽게 밝혀지거나 특성이 규명되지 않았던 화합물들을 밝히거나 또는 그 특성을 규명하는 것이 가능하다. 본 발명의 세포에 기초한 분석법으로 또한, 초기에 주목받은 화합물들에서 강력한 약물 본(lead)을 이끌어내는 방법을 실질적으로 향상시킬 수 있는데, 왜냐하면, 같은 수의 시험 화합물에 대하여 좀 더 많은 구조-기능 관계 정보가 드러나기 때문이다.
세포를 감작시키는 방법은 적당한 유전자 또는 오페론을 선택하는 단계를 수반한다. 적당한 유전자 또는 오페론은 그 전사 및/또는 발현이 감작되는 세포의 증식에 필요한 것이다. 다음 단계는 전기 감작될 세포에 전기 적당한 유전자 또는 오페론, 또는 적당한 유전자 또는 오페론에 의하여 암호화되는 RNA와 혼성화할 수 있는 안티센스 RNA를 도입하는 단계이다. 전기 안티센스 RNA는, 그것이 유도가능한 프로모터의 통제하에서 생산되는 발현 벡터의 형태로 도입될 수 있다. 전기 세포에 접촉시키는 유도자(inducer)의 농도를 다양화하고, 그에 의하여 전기 안티센스 RNA의 전사를 유도하는 프로모터의 활성을 변화시킴으로써 전기 생산된 안티센스 RNA의 양을 제한한다. 따라서, 세포를 준치사량의 안티센스 RNA가 발현되게 하는 농도의 유도자에 노출시킴으로써 전기 세포를 감작시킨다.
세포에 기초한 분석법의 한가지 실시태양으로, 전기 동정된Staphylococcusaureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi뉴클레오티드 서열에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분, 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분, 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여 증식에 필요한 단백질의 생산을 저해할 수 있다. 증식에 필요하다고 밝혀진 유전자들에 상보적인 안티센스 RNA 또는 그 부분을 생산하는 발현 벡터들을 사용하여 성장을 심하게 저해하지 않고 증식에 필요한 단백질의 농도를 제한한다. 전기 증식에 필요한 단백질은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 단백질 중 하나 또는 상동 폴리펩티드일 수 있다. 전기 목표를 달성하기 위하여, 전기 안티센스의 발현에 의하여 야기된 해당 성장저해에 대한 유도자의 다양한 양을 표시함으로써 유도자의 성장저해량 곡선을 계산한다. 이 곡선으로부터, 1에서 100%까지의 다양한 비율의 안티센스로 유도된 성장저해를 결정할 수 있다.
전기 안티센스 핵산을 생성하기 위하여 다양한 서로 다른 조절가능한 프로모터들이 사용된다. 전기 조절가능한 프로모터로부터의 전사는 전기 프로모터에 기능하는 전사 인자 억제자의 활성을 조절함으로써 조정할 수 있다. 예를들어, 전사가 억제자의 활성에 영향을 미침으로써 조절된다면, 사용될 유도자의 선택은 전기 안티센스 핵산의 전사를 조절하는 억제자/작동자에 의존한다. 만약 전기 조절가능한 프로모터xylO(자일로즈 작동자; 즉,Staphylococcus aureus로부터 유래(참조: 슈나핀저 디. 외., 1995, FEMS Microbiol. Let. 129: 121-128)에 융합된 T5 프로모터를 포함한다면, 전기 안티센스 핵산의 전사는 자일로즈 억제자에의하여 조절될 것이다. 전기 자일로즈 억제자는 S. aureus 세포 내에서 외인성 자일로즈 억제자 유전자, 예로 S. xylosis DNA로부터 유래된 것의 장소외(ectopic) 발현으로 제공될 수 있다. 이러한 경우에, 전기 프로모터로부터의 안티센스 RNA전사는 자일로즈 첨가로 유도될 수 있으며, 전기 프로모터는 따라서 "자일로즈 유도가능"하다. 유사하게, IPTG 유도가능한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를들어, 전기 곡선으로부터 심각한 성장률 감소를 일으키지않는 유도자의 최고 농도를 추정할 수 있다. OD 측정으로 성장 배지의 탁도(turbidity)를 조사함으로써 세포증식을 모니터링할 수 있다. 또 다른 실시예에서는, 전기 곡선으로부터 성장을 25% 감소시키는 유도자의 농도를 예측할 수 있다. 또 다른 실시예에서는, 성장을 50% 감소시키는 유도자의 농도를 계산할 수 있다. 집락형성단위(colony forming unit, cfu) 등의 추가적인 변수들을 사용하여 세포의 생존력을 측정할 수 있다.
분석될 세포를 상기 결정된 농도의 유도자에 노출시킨다. 이 준치사 농도의 유도자는 세포 내에서 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 양을 성장을 막지는 않지만 제한하는 낮은 양으로 감소시킨다. 이 농도의 유도자의 존재하에서 성장하는 세포는 따라서, 관련없는 단백질 또는 RNA들의 저해제가 아닌, 특별히 관심 대상인 증식에 필요한 단백질 또는 RNA의 저해제 또는 전기 관심 대상인 증식에 필요한 단백질 또는 RNA와 같은 생물학적 경로에 있는 단백질 또는 RNA들의 저해제들에 더 민감하다.
그 후, 준치사적인 농도의 유도자로 선처리되어 증식에 필요한 표적 유전자산물이 감소된 양으로 존재하는 세포를 세포 성장을 감소시키는 화합물들을 찾는데 사용한다. 전기 유도자의 준치사 농도는 전기 세포가 좀더 민감한 후보 화합물을 찾는 분석법에서의 의도한 목적에 따라 어떤 농도도 가능하다. 예를 들어, 전기 유도자의 준치사 농도는, 성장저해가 적어도 약 5%, 적어도 약 8%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 75%, 90%, 95% 또는 그 이상이 되도록 하는 농도일 수 있다. 전기 선행 방법을 사용하여 선감작화된(pre-sensitized) 세포는 저해되는 표적 단백질을 야생형 세포보다 더 적게 갖고 있기 때문에, 전기 표적 단백질의 저해제에 좀더 민감하다.
본 발명의 세포에 기초한 분석법은 전기Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 핵산 중 어느 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 포함하는 안티센스 핵산 및 상동 암호화 핵산 또는 그 일부에 상보적인 안티센스 핵산 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여 수행될 수 있음이 자명할 것이다. 이 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터의 증식에 필요한 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드 중 어느 것 등의 어떤 표적물의 양 또는 그 활성을 감소시킨다.
본 발명의 전기 세포에 기초한 분석법의 또다른 실시태양에서, 어떤 증식에 필요한 유전자 산물의 양 또는 활성은 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 유전자 및 증식에 필요한 유전자 산물 또는 그 일부를 암호화하는 전기 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산 내에서, 온도민감 변이 등의 변이를 사용하여 증식에 필요한 유전자 산물의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있다.
전기 변이가 어떤 증식에 필요한 유전자내에 있는 세포를 전기 온도민감 변이에 대한 허용 온도와 제한 온도 사이의 중간 온도에서 배양하여, 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 활성이 감소된 세포를 생산한다. 전기 증식에 필요한 서열에 상보적인 안티센스 RNA는 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 활성을 더욱 감소시킨다. 전기 안티센스 핵산 발현을 유도하였으며 그 허용 온도와 제한 온도 사이의 어떤 온도에서 배양된 세포가 전기 안티센스 핵산 발현이 유도되지 않았고 어떤 허용 온도에서 배양된 세포보다 시험 화합물에 대하여 실질적으로 더 민감한지를 결정함으로써, 전기 온도민감 변이 또는 전기 안티센스 핵산 둘 중 하나만으로 발견되지 않은 약물들도 밝혀질 수 있다. 또한, 이전에 안티센스 핵산 또는 전기 온도민감 변이 둘 중 하나만으로 발견된 약물들도 전기 두 접근법을 조합한 세포에 사용할 때 다른 수준의 민감성을 가질 수 있으며, 전기 민감 수준은 전기 약물이 전기 유전자 산물의 한가지 이상의 활성을 저해함에 있어서 좀더 특이적인 작용을 한다는 것을 가리킬 수 있다.
온도민감 변이를 그 단백질의 상이한 영역(domain)에 해당하는 서로 다른 부위에 위치시킬 수 있다. 예를 들어,Escherichia coli의dnaB유전자는 복제분기점(replication fork) DNA 헬리카제(helicase)를 암호화한다. DnaB는, 올리고머형성(oligomerization), ATP 가수분해, DNA 결합, 프리마제(primase)와의 상호작용, DnaC와의 상호작용, 및 DnaA와의 상호작용에 대한 영역들을 포함하는 여러 영역들을 갖고 있다(참조: 비스바스 이이. et al., 1999, Mechanism and DnaB helicase ofEscherichia coli: structural domains involved in ATP hydrolysis, DNA binding, and oligomerization,Biochem., 38:10919-10928; 히아사 에이치. et al., 1999, Initiation of bidirectional replication at the chromosomal origin is directed by the interaction between helicase and primase,J. Biol. Chem., 274:27244-27248; 산 마틴 씨. et al., 1998, Three-dimensional reconstructions from cryoelectron microscopy images reveal an intimate complex between helicase DnaB and its loading partner DnaC,Structure, 6:501-509,; 수톤 엠디. et al., 1998,Escherichia coliDnaA protein: The N-terminal domain and loading of DnaB helicase at theE. colichromosomal,J. Biol. Chem., 273:34255-34262). DnaB의 상이한 영역에 도입된 온도민감 변이는 그 제한 온도에서 DNA 파괴를 수반하는 또는 수반하지 않는, 갑작스런 또는 완만한 DNA 복제 중단(참조: 베슬러 제이에이. et al., 1971,Escherichia colimutants temperature-sensitive for DNA synthesis,Mol. Gen. Genetics, 113:273-284) 및, 성장 중지 또는 세포 사멸 등을 포함한 상이한 현상으로 나타난다. 그 제한 온도에서 세포 사멸을 야기하는danB유전자 내의 온도민감 변이들과 전기danB유전자에 대한 안티센스를 조합하여 사용할 경우, DnaB에 의하여 나타나는 하나 또는 일련의 활성에 대하여 매우 특이적이고 효과적인 저해제를 발견할 수 있을 것이다.
전기 세포에 기초한 분석법이 온도 변이 등의 변이 및Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli로부터의 증식에 필요한 산물 또는 그 일부(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012)를 암호화하는 전기 유전자중 어느 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산 또는 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여 수행될 수 있음이 자명하다. 이 방법으로, 상기 방법이 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 제거하지는 않고 감소시키는 어떤 변이로라도 수행될 수 있음은 자명할 것이다.Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli로부터의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110의 폴리립티드등을 포함) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느 것 등의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있다.
증식에 필요한 어떤 유전자 산물에 대한 항균제를 선별할 때, 증식에 필요한 유전자 산물을 제한된 양으로 가진 세포의 성장저해를 분석할 수 있다. 그 성장 배지의 흡광도로 측정한 실험군과 대조군 사이의 성장의 양을 직접 비교함으로써 성장저해를 측정할 수 있다. 세포증식을 분석하는 또다른 방법으로는, 녹색형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 리포터(reporter) 작제물의 발산 측정,다양한 효소 활성 분석 및 당업계에 잘 알려진 기타의 방법들이 있다.
전기 방법이 고체상(solid phase), 액체상 또는 전기 두 상의 조합으로 수행될 수 있음은 자명할 것이다. 예를 들어, 전기 안티센스 작제물의 유도자를 함유한 영양한천(nutrient agar) 상에서 배양한 세포에 대하여 화합물들을 전기 한천의 표면에 스포팅함으로써 노출시킬 수 있다. 원한다면, 전기 세포를 전기 유도자가 다양한 농도로 포함된 한천에서 배양할 수 있다. 전기 화합물 적용점 주위의 세포가 자라지 않는 지역인 결과적인 살상 구역(killing zone)의 직경으로 어떤 화합물의 효력을 판단할 수 있다. 다수의 화합물을 한천 플레이트로 이동시켜, 이에 제한되는 것은 아니나, 다채널 파이펫(multi-channel pipette)(예로서, Beckman Multimek), 및 다채널 스포터(multi-channel spotter)(예로서, Genomic Solutions Flexys) 등을 포함하는 자동 및 반자동 장비를 사용하여 동시적으로 테스트할 수 있다. 이러한 방식으로, 하루에, 다수의 플레이트 및 수천 내지 수백만의 화합물들을 테스트할 수 있다.
또한, 하기에 기술된 바와 같은 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 전기 화합물들을 완전히 액체상에서 테스트할 수 있다. 한 마이크로타이터 플레이트 당 96, 384, 1536 또는 그 이상의 웰을 포함하는 마이크로타이터 플레이트로 액체상 선별을 수행하여 하루에 다수의 플레이트 및 수천 내지 수백만의 화합물들을 조사할 수 있다. 반응 시약들(예를 들어, 세포 및 화합물)을 첨가하고 세포 농도를 측정하기 위하여 자동 및 반자동 장비들을 사용할 수 있다.
실시예 9: 리보솜 단백질들을 암호화하는 유전자들에 상보적인 안티센스들을
이용한 세포에 기초한 분석법
리보솜 단백질 L7/L12, L10, 및 L23을 각각 암호화하는, 증식에 필요한E. coli유전자rplL, rplJ,및rplW에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 작제물들을 사용하여 상기한 세포에 기초한 분석법의 유효성을 확인하였다. 이 단백질들은 세포의 단백질 합성 기관의 한 부분이며, 세포증식에 필요하다. 이 작제물들을 사용하여, 전기 안티센스 발현이 전기 리보솜에 결합하여 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려진 항생제들에 대한 세포의 민감성에 미치는 영향을 테스트하였다. 그 산물이 단백질 합성에 관련되어 있지 않은 여러 다른 유전자들(elaD, visC, yohH및atpE/B)에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 작제물들을 비교에 사용하였다.
먼저,rplW또는elaD에 대한 안티센스 작제물을 포함하는 pLEX5BA(참조: 크라우제 et al., 1997,J. Mol. Biol., 274:365) 발현 벡터를 별개의E. coli세포군으로 도입하였다. 벡터 도입은 당업계의 숙련된 기술을 가진 자에게는 잘 알려진 방법이다. 본 실시예의 발현 벡터들은 IPTG의 존재하에서 전기 안티센스 RNA 발현을 이끄는 IPTG 유도가능 프로모터를 함유하고 있다. 그러나, 당업계의 숙련된 자에게 다른 유도가능한 프로모터들도 역시 사용될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 적합한 발현 벡터들 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 리보솜 단백질들인 L7/L12, L10 및 L23을 암호화하는 유전자들에 대한E. coli안티센스 클론들을 사용하여, 안티센스의 발현이 전기 단백질들에 결합하는 것으로 알려진 항생제들에 대한 세포의 민감성에 미치는 영향을 테스트하였다.elaD, visC, atpE/atpB및yohH에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 각각 AS-elaD, AS-visC,AS-atpE/atpB및 AS-yohH이라 일컫는다. 이 유전자들은 단백질 제조에 포함된다고 알려져있지 않다.rlpL, rplL&rplJ 및 rplW유전자들에 대한 안티센스 핵산들을 AS-rlpL, AS-rplL&rplJ 및 AS-rplW.이러한 유전자들은 L7/L12(rlpL), L10(rplJ)및 L23(rplW)을 암호화한다. 전기 안티센스들을 함유한 발현 벡터들을 각각 별개의E. coli세포군으로 도입하였다.
AS-elaD또는AS-rplW를 발현하는 벡터를 포함하는 전기 세포군들을 액체 배지에서 어떤 범위의 IPTG 농도에 노출시켜 각 클론들에 대한 성장저해 곡선을 수득하였다(참조: 도 1). 먼저, 종배양물(seed culture)을 전기 배양액의 흡광도(OD)를 측정하여 특정 탁도가 될 때까지 배양하였다. 전기 용액의 OD를 그 안에 포함된 세균 세포의 수와 직접적으로 관련시킨다. 이후, 200㎕ 액체 배지 배양물 16개를, 37℃에서 1600 μM 부터 12.5 μM(최종농도)까지의 2배씩 순차적으로 희석한 한 쌍의 희석액으로인 IPTG 농도범위를 가진 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 추가적으로, 대조군 세포는 IPTG를 함유하지 않은 한 쌍에서 배양하였다. 이 배양물들은 관심 대상인 어떤 클론의 동일한 초기 종배양물로부터 유래한 같은 양의 세포들로부터 출발하였다. 전기 세포들을 15시간까지 배양하고 600nm에서 전기 배양물의 흡광도를 측정하여 그 성장 정도를 결정하였다. 전기 대조군 배양액이 대수증식기 중기(mid-log phase)에 도달했을 때, 전기 IPTG의 대수 농도(log concentration)에 대하여 전기 IPTG 함유 배양물들 각각의 (전기 대조군 배양물에 대한) 성장 백분율을 표시하여 전기 IPTG의 성장저해 반응곡선을 작성하였다. 그후, 전기 곡선으로부터 0mM IPTG의 대조군(0% 성장저해)과 비교하여 세포 성장을 50%(IC50) 저해하는 IPTG 농도를 계산하였다. 이러한 조건하에서,rplW및elaD의 발현 수준을 성장이 50% 저해될 정도까지 감소시킨 양의 안티센스 RNA를 생산하였다.
성장을 측정하는 다른 방법들 또한 고려하였다. 이러한 방법들의 예로는, 테스트되는 세포 안에서 발현이 가공되고 쉽게 측정될 수 있는 단백질의 측정이 있다. 이러한 단백질의 예로서 녹색형광 단백질(GFP) 및 다양한 효소들이 있다.
세포들을 전기 선택된 농도의 IPTG로 전처리한 후, 테트라사이클린, 에리트로마이신 및 기타 단백질 합성 저해제들에 대한 세포 개체군들의 민감성을 테스트하는데 사용하였다. 도 1은, 단백질 합성에 필요하며 세포증식에 필수적인 리보솜 단백질 L23을 암호화하는E. coli rplW유전자에 대한 안티센스 클론(AS-rplW), 또는 단백질 합성에 관련된 것으로는 알려져 있지 않으나 증식에는 역시 필수적인elaD유전자에 대한 안티센스 클론(AS-elaD) 중 하나를 함유한 IPTG 유도가능 플라스미드로 형질전환된E. coli에서의 IPTG 반응곡선이다.
rplW및elaD유전자의 테트라사이클린 반응곡선의 한 예가 도 2A 및 도 2B에 각각 나와있다. 세포를 대수증식기(log phase)까지 배양한 후, 배지만으로 또는 IPTG 반응곡선으로 결정된 것으로서 20% 및 50%의 성장저해를 야기하는 농도의 IPTG를 함유한 배지로 희석하였다. 2.5시간 후, 전기 세포들을 (1)전기 2.5시간의 선배양 동안에 사용된 것과 같은 농도의 +/- IPTG; 및, (2) 테트라사이클린의 최종농도가 1㎍/㎖ 내지 15.6ng/㎖, 및 0㎍/㎖인 순차적으로 두배씩 희석한 테트라사이클린 희석액을 포함하는 96웰 플레이트로 최종적으로 0.002의 OD600가 되도록 도입하였다. 전기 96웰 플레이트들을 37℃에서 배양하고 15시간이 될때까지 매 5분마다 플레이트 판독기(plate reader)로 그 OD600값을 측정하였다. 전기 대조군(테트라사이클린 부재)의 OD600값이 0.1에 도달했을 때, 각 IPTG 농도 및 IPTG 없는 대조군에 대하여, 테트라사이클린 반응곡선을 결정하였다. IPTG 존재시 및 부재시의 테트라사이클린 민감도를 비교하기 위하여, 전기 반응곡선으로부터 테트라사이클린 IC50s를 결정하였다(참조: 도 3A-B). 리보솜 단백질 L7/L12 및 L23을 암호화하는 유전자에대한 안티센스 핵산 AS-rlpL또는AS-rplW을 발현하는 세포들은elaD유전자 산물의 양이 감소한 세포(AS-elaD)(도 2B)에 비하여 상대적으로 테트라사이클린에 대하여 민감성이 증가된 것으로 나타났다(참조: 도 2A). 도 3은 50%의 성장저해를 야기하는 IPTG의 존재하에서 결정된 테트라사이클린 IC50s대 IPTG 부재하에서 결정된 테트라사이클린 IC50s의 비(테트라사이클린 민감성에서의 배수 증가)를 그린 요약 막대도표(summary bar chart)를 보여준다. L7/L12(rplL, rplJ유전자들에 의하여 암호화됨) 또는 L23(rplW유전자에 의하여 암호화됨) 둘 중 하나의 양이 감소한 세포는 테트라사이클린에 대하여 민감성이 증가된 것으로 나타났다(참조: 도 3). 단백질 합성에 관여한다고 알려지지 않은 유전자에 대한 안티센스(AS-elaD, AS-visC,AS-atpE/atpB및 AS-yohH)은 이 분석법에대한 전기 특이성을 평가할 때, 테트라사이클린에 대한 민감성 증가를 보이지 않는다.
상기 사실에 더하여, 초기 실험에서, 단백질 합성에 관련된 유전자들(리보솜 단백질들인 L7/L12 & L10, L7/L12 단독, L22 및 L18을 암호화하는 유전자 및, rRNA 및 연장인자 G(Elongation Factor G)를 암호화하는 유전자들 포함)에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 클론들은 마크로라이드(macrolide), 에리트로마이신에 대하여 민감성이 증가한 반면, 단백질 합성에 관련되지 않은 유전자들인elaD, atpB/E및visC에 대한 안티센스를 발현하는 클론들은 그렇지 않다. 나아가,rplL및rplJ에 대한 안티센스(AS-rplL/j)를 발현하는 클론은 단백질 합성을 저해하지 않는 항생제들인 날리딕스 산(nalidixic acid) 및 오플록사신(ofloxacin)에 대하여 민감성이 증가하지 않는다.
리보솜 단백질 유전자들인rplL, rplJ및rplW로의 결과 및 다른 다양한 안티센스 클론 및 항생제들을 사용한 초기 결과들은, 항생제 표적물의 농도 제한시 세포가 전기 단백질에 특이적으로 상호작용하는 항균제에 좀더 민감해짐을 보여준다. 전기 결과들은 또한, 이 세포들이 전기 단백질 표적물이 관련된 전체 기능을 저해하는 항균제에 민감해지며, 다른 기능들을 저해하는 항균제에는 민감해지지 않음을 보여준다. 전기 세포에 기초한 분석법은 여기에서 기술하는 증식에 필요한 유전자의 활성을 저해하는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi안티센스 뉴클레오티드 서열(서열번호 8-3795 포함) 또는 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 포함하는 안티센스 핵산을 사용하여 수행될 수 있음이 자명하다.
상기한 세포에 기초한 분석법을 또한,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 또는 그 부분, 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 암호화 핵산 중 어느것을 사용하여 사용할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느것 등의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다. 전기 세포에 기초한 분석법을 어떤 증식에 필요한 유전자 또는 그 유전자 산물이 존재하는 생물학적 경로를 밝히는데 사용할 수 있다. 이러한 방법들에서, 어떤 증식에 필요한 표적 핵산에 대한 준치사량의 안티센스를 발현하는 세포 및 전기 안티센스 발현이 유도되지 않은 대조군 세포를 다양한 경로에 작용하는 것으로 알려진 항생제 단(panel)에 접촉시킨다. 전기 항생제가 전기 증식에 필요한 표적 핵산 또는 그 유전자 산물이 존재하는 경로에 작용할 경우, 전기 안티센스 발현이 유도된 세포는 전기 안티센스 발현이 유도되지 않은 세포보다 전기 항생제에 대하여 좀더 민감해질 것이다.
대조군으로서, 본 분석법의 결과들을 안티센스 핵산을 발현하는 세포 단을전기 증식에 필요한 표적 유전자을 포함하는 많은 다른 증식에 필요한 유전자들에 접촉시킴으로써 확증할 수 있다. 전기 항생제가 특이적으로 작용할 경우, 어떤 증식에 필요한 표적 유전자에 대한 안티센스를 발현하는 세포(또는 전기 증식에 필요한 표적 유전자와 동일한 경로에 있는 증식에 필요한 다른 유전자들에 대한 안티센스를 발현하는 세포)에서만 전기 항생제에 대하여 민감성이 증가한 것이 관찰될 것이고, 증식에 필요한 유전자들에 대한 안티센스를 발현하는 모든 세포에서는 일반적으로 관찰되지 않을 것이다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 또는 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 포함), 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 암호화 핵산 중 어느것을 사용하여 사용할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느것 등의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
유사하게, 상기한 방법을 사용하여 어떤 시험 항생제 등의 시험 화합물이 작용하는 경로를 결정할 수 있다. 각각 어떤 알려진 경로에 있는 증식에 필요한 핵산에 대한 안티센스를 발현하는 세포 단을 원하는 화합물과 접촉시켜 그 화합물이 작용하는 경로를 결정한다. 전기 안티센스의 발현이 유도된 세포 및 전기 안티센스 발현이 유도되지 않은 대조군 세포에서 전기 시험 화합물에 대한 전기 세포 단의 민감성을 결정한다. 전기 시험 화합물이 안티센스 핵산이 작용하는 경로에 작용한다면, 전기 안티센스의 발현이 유도된 세포는 전기 화합물에 대하여 전기 안티센스의 발현이 유도되지 않은 세포보다 더 민감할 것이다. 추가적으로, 다른 경로들에 있는 증식에 필요한 유전자에 대한 안티센스의 발현이 유도된 대조군 세포들은 전기 화합물에 대한 민감성이 증가되지 않을 것이다. 이러한 방식으로, 전기 시험 화합물이 작용하는 경로를 결정한다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 또는 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 포함), 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 암호화 핵산 중 어느것을 사용하여 사용할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느것 등의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
하기 실시예는 이러한 분석법을 수행하는 한가지 방법을 제시한다.
실시예 10: 증식에 필요한 유전자가 존재하는 경로 또는 항생제가 작용
하는 경로의 동정
A.분석용 세균 저장물(bacterial stock) 제조
조사할 세포들의 출처를 일관되게 하기 위하여, 표준 미생물학적 방법들을 사용하여 원하는 안티센스 작제물을 포함하는 숙주 세균의 동결 저장물을 제조한다. 예를 들어, 세포 성장을 위한 영양분 및 항생제(전기 안티센스 작제물은 이에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 갖고 있다)를 함유한 한천 플레이트 위로 전기 원래의 저장물의 표본을 스트리킹(streaking)함으로써, 전기 개체의 단일 클론을 분리할 수 있다. 하룻밤 배양 후, 어떤 분리된 집락을 멸균 바늘로 찍어내어 전기 플라스미드의 유지에 필요한 항생제를 함유한 적당한 액체 성장 배지로 옮긴다. 전기 세포들을 30℃ 내지 37℃에서 4 내지 6시간동안 진탕 배양하여 지수 성장기(exponential growth)에 있는 배양물을 생산한다. 멸균 글리세롤(glycerol)을 15%(v/v) 되도록 첨가한 후, 100㎕ 내지 500㎕의 부분표본들을 멸균 냉동튜브(cryotube)로 분배하고, 액체 질소(liquid nitrogen)에서 급속 동결하여 추후의 분석을 위하여 -80℃에 저장한다.
B.분석용 세균 배양
분석 하루전에, 저장 용기(stock vial)를 냉동기(freezer)에서 꺼내어 재빨리 해동하고(37℃ 수조), 세포 성장을 위한 영양분을 및 그 안티센스 작제물이 그에 대한 저항성을 갖고 있는 항생제를 함유한 한천 플레이트에 배양물을 선모양으로 스트리킹한다. 37℃에서 하룻밤 배양 후, 전기 플레이트에서 무균 접종 루프로 10개의 집락을 무작위적으로 선택하고 분리하여, 전기 안티센스 벡터가 그에 대한 저항성을 갖고 있는 전기 항생제를 함유한 LB 배지 5㎖가 담긴 무균 튜브로 옮긴다. 강하게 혼합하여 균일한 세포 현탁액을 형성한 후, 600nm에서 전기 현탁액의 흡광도(OD600)를 측정하고, 필요한 경우 전기 현탁액의 부분표본을 항생제가 함유된 5㎖ 멸균 LB 배지가 담긴 두번째 튜브로 옮겨 희석하여 OD600≤0.02 흡광단위(absorbance unit)가 되게 한다. 그 후, 전기 배양물을 그 OD600이 OD 0.2 내지 0.3이 될때까지 37℃에서 1 내지 2시간동안 진탕 배양한다.
C.분석에 사용할 배지 선택
그 유도자가 전기 안티센스 작제물의 확인을 위한 적당한 항생제를 함유한 배양 배지내에 2배씩 순차적으로 희석되어 있는 희석액들을 제조한다. 여러 배지들을 차례로 테스트하고, 3 내지 4개의 웰을 사용하여 각 배지내의 각 농도의 유도자의 효과를 평가한다. 예를 들어, 다음의 농도, 즉, 50mM, 100mM, 200mM, 400mM, 600mM, 800mM 및 1000mM의 유도자 자일로스를 함유한 LB 액체배지, TBD 액체배지 및 뮬러-힌톤(Muller-Hinton) 배지를 테스트할 수 있다. 유도자를 함유한 시험 배지와 세포들을 동일한 부피로 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합하였다. 마이크로타이터 플레이트 웰들에 첨가하기에 앞서, 세포들을 상기한 바처럼 준비하고, 즉시 전기 시험 항생제를 함유한 적당한 배지에 1:100으로 희석하였다. 대조군으로서, 세포들을 또한, 0mM 자일로스 등 유도자를 포함하지 않은 여러 웰의 각 배지에 첨가하였다. 전기 웰들의 OD600을 모니터링하는 37℃의 마이크로타이터 플레이트 판독기내에서 18시간 동안에 걸쳐 배양하여 세포 성장을 계속해서 모니터링한다. 전기 대수 성장율을 유도자 없는 배지에서 배양한 세포에 의하여 나타나는 대수 성장율과 비교하여 각 농도의 유도자에 의하여 야기된 성장저해율을 계산한다. 유도자에 대하여 가장 민감함을 나타내는 배지를 선택하여 하기 기술한 분석에 사용한다.
D.안티센스 작제물을 유도하지 않았을 때의 시험 항생제 민감도 측정
작용 기작이 알려진 항생제를, 이후의 분석용으로 선택된 전기 작제물을 유지하는데 사용되는 전기 항생제가 보충된 배양 배지로 2배씩 순차적으로 희석한 희석액을 제조한다. 상이한 경로들에 작용하는 것으로 알려진 시험 항생제 단을 3 내지 4개의 웰로 차례로 테스트하여 각 농도의 시험 항생제가 세포 성장에 미치는 영향을 평가한다. 시험 항생제와 세포들을 동일한 부피로 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합하였다. 분석용으로 선택된, 전기 안티센스 작제물을 유지하는데 사용되는 항생제가 보충된 배지를 이용하여 상기한 바처럼 세포들을 준비하고, 마이크로타이터 플레이트 웰들에 첨가하기 직전에 동일 배지에 1:100으로 희석하였다. 대조군으로서, 세포들을 또한, 전기 항생제를 용해하는데 사용될, 항생제를 포함하지 않은 용매가 담긴 여러 웰에 첨가하였다. 전기 웰들의 OD600을모니터링하는 37℃의 마이크로타이터 플레이트 판독기내에서 18시간 동안에 걸친 배양으로 세포 성장을 계속해서 모니터링한다. 그 대수 성장율을 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세포들에 의하여 나타나는 대수 성장율과 비교하여 각 농도의 항생제에 의한 성장저해율을 계산한다. log[항생제 농도]에 대한 저해율 그래프 작성으로 각 항생제에 대한 IC50값의 외삽법(extrapolation)이 가능해진다.
E.안티센스 작제물 유도자의 존재하에서 시험 항생제 민감도 측정
전기 분석용으로 선택된 배양 배지에, 상기한 바와 같이 세포 성장을 50% 및 80% 저해하는 것으로 나타난 농도의 유도자 및, 전기 작제물을 유지하기 위하여 사용된 항생제를 첨가한다. 이 배지들 각각에 상기 사용된 시험 항생제 단을 2배씩 순차적으로 희석한 희석액을 제조한다. 여러 항생제들을 3 내지 4개의 웰로 차례로 테스트하여 각 배지내에서의 각 농도의 항생제가 세포 성장에 미치는 영향을 평가한다. 시험 항생제와 세포들을 동일한 부피로 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 혼합하였다. 분석용으로 선택된, 전기 안티센스 작제물을 유지하는데 사용되는 항생제가 보충된 배지를 이용하여 상기한 바처럼 세포들을 준비한다. 전기 세포들을, 세포 성장을 각각 50% 및 80% 저해하는 것으로 나타난 농도의 유도자를 함유한 동일 배지의 두 50㎖ 부분표본으로 1:100으로 희석하고, 37℃에서 2.5시간 동안 진탕 배양한다. 마이크로타이터 플레이트 웰들에 첨가하기 직전에, 전기 배양물들을 전기 안티센스 작제물을 유지하는데 사용되는 항생제 및 전기와 동일한 농도의 유도자가 첨가된 더운(37℃) 멸균 배지에 희석하여 적당한 OD600값(일반적으로 0.002)이 되도록 조절한다. 대조군으로서, 세포들을 또한, 시험 항생제들을 용해하는데 사용될, 항생제를 포함하지 않은 용매가 담긴 여러 웰에 첨가한다. 전기 웰들의 OD600을 모니터링하는 37℃의 마이크로타이터 플레이트 판독기내에서 18시간 동안에 걸친 배양으로 세포 성장을 계속해서 모니터링한다. 그 대수 성장율을 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세포들에 의하여 나타나는 대수 성장율과 비교하여 각 농도의 항생제에 의한 성장저해율을 계산한다. log[항생제 농도]에 대한 저해율 그래프 작성으로 각 항생제에 대한 IC50값의 외삽법 (extrapolation)이 가능해진다.
F.전기 시험 항생제들에 대한 특이성 결정
안티센스 유도 및 비유도(non-induced) 조건하에서, 작용 기작이 알려진 항생제들에 의하여 생성된 IC50값들을 비교하여, 어떤 증식에 필요한 핵산이 놓여진 경로를 밝힐 수 있다. 어떤 증식에 필요한 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산을 발현하는 세포가 특정 경로를 통하여 작용하는 항생제에 대하여 선택적으로 민감하다면, 전기 안티센스가 작용하는 전기 유전자는 전기 항생제가 작용하는 경로에 관련되어 있다.
G.시험 항생제가 작용하는 경로의 동정
상기 논의한 바처럼, 전기 세포에 기초한 분석법은 또한 어떤 시험 항생제가 영향력을 행사하는 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 어떤 분석에서, 안티센스 핵산 단의 각 핵산이 작용하는 경로를 상기한 바와 같이 밝힌다. 각각 어떤 알려진, 증식에 필요한 경로에 있는 유전자에 상보적인 유도가능한 핵산을 포함하는 세포 단을, 유도 및 비유도 조건하에서 장용하는 경로를 결정하기에 바람직한 시험 항생제와 접촉시킨다. 다른 경로들에 있는 유전자들에 상보적인 안티센스를 발현하는 유도된 세포에서는 그렇지 않은데, 특정 경로에 있는 유전자에 상보적인 안티센스를 발현하는 유도된 세포에서 민감성이 증가한 것이 관찰된다면, 전기 시험 항생제는, 민감성이 증가한 것이 관찰된 경로에 대하여 작용하는 것이다.
안티센스 발현을 유도하는데 사용된 유도자의 농도 및/또는 전기 분석에 사용된 성장 조건(예를들어 배양 온도 또는 배지 조성) 등의 분석 조건을 한층 더 최적화함으로써 전기 나타난 항생제 민감화(antibiotic sensitization)의 선택성 및/또는 크기가 더욱 증가할 것임은 당업계의 숙련된 자에게 자명할 것이다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 또는 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 포함), 상동 안티센스 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 암호화 핵산 중 어느것을 사용하여 사용할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonellatyphi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느것 등의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
하기 실시예는 상기한 방법들의 유효성을 확증한다.
실시예 11: 증식에 필요한 유전자가 놓여있는 경로의 확증
전술한 것과 유사한 방법을 사용하여 동정된E.coli로부터 증식에 필요한 유전자를 사용하여 전기 분석법의 효용성을 검증하였다. 시그마 케미컬즈(Sigma Chemicals, U.S.A.)로부터 다양한 화학적 부류 및 작용 양식의 항생제를 구매하였다. 제조자에 의하여 제공된 정보에 기초하여 작당한 수용액에 각 항생제를 용해시킴으로써 보존 용액(stock solution)을 준비하였다. 각 항생제의 최종 작용 용액에는 어떤 유기 용매도 0.2%(w/v) 이상 포함되지 않았다. 50S 리보솜 단백질을 암호화하는 어떤 증식에 필요한 유전자에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스가 발현되도록 가공된 세균주에 대하여 이들의 효력을 결정하기 위하여, 전기 안티센스 작제물의 유지를 위한 적당한 항생제가 첨가된 성장 배지로 각 항생제를 두 배 또는 세 배씩 순차적으로 희석하였다. 각 항생제에 대하여 적어도 10개씩의 희석액을 준비하였다. 다채널 파이펫을 사용하여 각 희석액에 대하여 25㎕의 부분표본들을 384-웰 마이크로플레이트(분석 플레이트)의 개별 웰들로 옮겼다. 각 처치 조건(유도자 존재 및 부재)하에서 항생제의 각 희석액에 대하여 4개로 된 웰(quadruplicate)들을 사용하였다. 각 분석 플레이트에는 항생제를 성장 배지로 대체한 세포 성장 대조군에 대한 20개 웰, 및 각 처치(유도자-이번 실시예의 경우 IPTG- 존재 및 부재)에 대하여 10개 웰을 포함하는 것이었다. 분석 플레이트들을 분할하여 전기 두 처치 조건하에 두었다: 절반의 플레이트들은 유도된 세포 및 전기 유도 상태를 유지하게 하는 적당한 농도의 유도자(이번 실시예의 경우 IPTG)를 포함하였고, 나머지 절반은 IPTG의 부재하의 유도되지 않은 세포들을 포함하였다.
분석용 세포들을 하기한 바와 같이 준비하였다. 증식에 필요한 50S 리보솜 부단위 단백질을 암호화하는rplL및rplJ에 상보적인 안티센스 핵산(AS-rplL/J) 발현을 IPTG로 유도할 수 있는 어떤 작제물을 포함하는 세균 세포들을 지수 성장기(OD6000.2 내지 0.3)까지 배양한 후, 400μM 또는 0μM 둘 중 하나의 농도의 유도자(IPTG)를 함유한 새 배지로 1:100으로 희석하였다. 이 배양물들을 37℃에서 2.5시간 동안 배양하였다. 2.5시간 배양 후, 유도된 세포 및 유도되지 않은 세포들을 각각 최종 OD600값이 0.0004가 되도록 어떤 분석용 배지로 희석하였다. 전기 배지는 전기 안티센스 작제물의 유지를 위한 적절한 농도의 전기 항생제를 포함하였다. 추가적으로, 유도된 세포들을 희석하는데 사용된 배지에는, 전기 분석 플레이트로 첨가시 그 최종 농도가 400μM이 되는 800μM의 IPTG가 함유되어 있었다. 유도된 세포 및 유도되지 않은 세포들을 이전에 논의한 바와 같이 전기 분석 플레이트의 적당한 웰들에 분배하였다(25㎕/웰). 그 후, 전기 플레이트를 어떤 플레이트 판독기에 두어 일정한 온도로 배양하고, 595nm에서 산란하는 빛을 측정함으로 각 웰에서의 세포 성장을 모니터링하였다. 전기 세포 배양물이 성장정지기(stationary growth phase)에 도달할 때까지 매 5분마다 성장을 모니터링하였다. 각 항생제 농도에 대하여, 전기 관련된 대조군 웰(항생제 불포함, IPTG 존재 또는 부재)이 지수 증식기 중기(mid-exponential growth)에 도달한 시점에서 성장저해율을 계산하였다. 각 항생제 및 각 조건(IPTG 존재 또는 부재)에 대하여, 항생제 농도의 로그 대 저해 백분율의 그래프를 작성하고 그 IC50값을 결정하였다. IPTG의 존재 및 부재하에서의 각 항생제에 대한 IC50값을 비교하여 전기 안티센스 작제물 유도시 그 세포가 전기 항생제에 의하여 나타나는 작용 기작에 민감해지는지를 밝혀내었다. 유도자 존재하에서 IC50값이 현저한 (표준 통계학적 분석) 수로 감소된 세포들을 전기 시험 항생제에 대하여 민감성이 증가한 세포로 간주하였다.
전기 결과들이 하기 표에 제공되어 있으며, 이에는 전기 분석에 사용된 항생제의 부류 및 명칭, 항생제의 표적, IPTG 부재하에서의 IC50값, IPTG 존재하에서의 IC50값, 전기 IC50값에 대한 농도 단위, IPTG 존재하에서 IC50값의 증가 배수, 및 IPTG 존재하에서 민감성의 증가가 관찰되었는지의 여부가 나와있다.
표 III: rplL 과 rplJ 에 대한 안티센스 RNA 발현이 항생제 민감성에 미치는영향
상기 결과들은, 50S 리보솜 부단위 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 RNA 유도시 세포들이 리보솜 기능 및 단백질 합성을 저해하는 항생제들에 대하여 선택적이고 매우 크게 민감해짐을 증명한다. 상기 결과들은, 나아가, 어떤 필수 유전자에 대한 안티센스 작제물의 유도로 어떤 개체가 전기 유전자 산물의 생물학적 역할을 방해하는 화합물들에 대하여 민감해짐을 증명한다. 이러한 민감화는 전기 표적 유전자 및 그 산물에 관련된 경로들을 방해하는 화합물로 제한된다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcusfaecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012 또는 서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 포함), 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산 중 어느것을 사용하여 사용할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느것 등의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
아래의 실시예 11A는Staphylococcus aureus에서 실행되는 분석을 기술한다.
실시예 11A:Staphylococcus aureus의 증식에 필요한 유전자가 존재하는 생물학적 경로의 동정
시그마 케미컬즈(Sigma Chemicals, U.S.A.)로부터 다양한 화학적 부류 및 작용 양식의 항생제를 구매하였다. 제조자에 의하여 제공된 정보에 기초하여 작당한 수용액에 각 항생제를 용해시킴으로써 보존 용액(stock solution)을 준비하였다. 각 항생제의 최종 작용 용액에는 어떤 유기 용매도 0.2%(w/v) 이상 포함되지 않았다.
자일로즈로 유도가능한 프로모터의 조절하에서 증식에 필요한 DNA 자이레이즈(xyrase)의 베타 아단위(subunit)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스를 함유하는 세균주에 대하여 이들의 효력을 결정하기 위하여, 전기 안티센스 작제물의 유지를 위한 적당한 항생제가 첨가된 성장 배지로 각 항생제를 두 배 또는 세 배씩 순차적으로 희석하였다. 각 항생제에 대하여 적어도 10개씩의 희석액을 준비하였다.
다채널 파이펫을 사용하여 각 희석액에 대하여 25㎕의 부분표본들을 384-웰 마이크로플레이트(분석 플레이트)의 개별 웰들로 옮겼다. 각 처치 조건(유도자 존재 및 부재)하에서 항생제의 각 희석액에 대하여 4개로 중복된 웰(quadruplicate)들을 사용하였다. 각 분석 플레이트에는 세포 성장 대조군(성장 배지, 항생제 없음)에 대한 20개 웰, 및 각 처치(유도자-이번 실시예의 경우 자일로즈-존재 및 부재)에 대하여 10개 웰을 포함하는 것이었다. 절반의 플레이트들은 유도된 세포(이번 실시예의 경우Staphylococcus aureus세포) 및 전기 유도 상태를 유지하게 하는 적당한 농도의 유도자(이번 실시예의 경우 자일로즈)를 포함하였고, 나머지 절반은 유도자의 부재하의 유도되지 않은 세포들을 포함하였다.
분석용 세포 준비
자일로즈로 유도가능한 프로모터(S1M10000001F08)의 조절하에서, 증식에 필요한 DNA 자리레이즈의 베타 아단위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 어떤 작제물을 가지는 세균 세포들을 지수 성장기(OD6000.2 내지 0.3)까지 배양한 후, 12mM 또는 0mM 둘 중 하나의 농도의 유도자(xylose)를 함유한 새 배지로 1:100으로 희석하였다. 이 배양물들을 37℃에서2.5시간 동안 배양하였다. 배지에 전기 유도자, 자일로즈의 존재하에서 전기 안티센스 작제물의 생성이 시작되며 유지된다. 2.5시간 배양 후, 유도된 세포 및 유도되지 않은 세포들을 안티센스 작제를 유지하기위한 전기 항생제의 적합한 각각 최종 OD600값이 0.0004가 되도록 어떤 분석용 배지로 희석하였다. 추가적으로, 유도된 세포들을 희석하는데 사용된 배지에는, 전기 분석 플레이트로 첨가시 그 최종 농도가 12mM이 되는 24mM의 자일로즈가 함유되어 있었다.
유도된 세포 및 유도되지 않은 세포 현탁액을 이전에 논의한 바와 같이 전기 분석 플레이트의 적당한 웰들에 분배하였다(25㎕/웰). 그 후, 전기 플레이트를 어떤 플레이트 판독기에 두어 일정한 온도로 배양하고, 595nm에서 산란하는 빛을 측정함으로 각 웰에서의 세포 성장을 모니터링하였다. 전기 세포 배양물이 성장 정지기(stationary growth phase)에 도달할 때까지 매 5분마다 성장을 모니터링하였다. 각 항생제 농도에 대하여, 전기 관련된 대조군 웰(항생제 불포함, IPTG 존재 또는 부재)이 지수 증식기 중기(mid-exponential growth)에 도달한 시점에서 성장저해율을 계산하였다. 각 항생제 및 각 조건(IPTG 존재 또는 부재)에 대하여, 항생제 농도의 로그 대 저해 백분율의 그래프를 작성하고 그 IC50값을 결정하였다.
유도자(본 실시예에서는 자일로즈)의 존재 및 부재하에서의 각 항생제에 대한 IC50값을 비교하여 전기 안티센스 작제물 유도시 그 세포가 전기 항생제에 의하여 나타나는 작용 기작에 민감해지는지를 밝혀내었다. 만약 전기 항생제가 DNA 자이레이즈 베타 아단위에 기능한다면 유도된 세포의 IC50값이 유도되지않은 세포의IC50에비해 현저히 낮을 것이다.
도4에는 시험한 항생제, 그 표적물 및 유도된 세포들과 비유도된 세포들 사이의 잠재력의 배수 증가 등이 나열되어 있다. 도2에 나타낸 바대로, 자이레이즈 베타 아단위 이외의 표적물에 각각 작용하는 세포탁심(cefotaxim), 세폭시틴(cefoxitin), 푸시딕산(fusidic acid), 링코마이신(lincomycin), 토브라마이신(tobramycin), 트리메토프림(trimethoprim) 및 반코마이신(vancomycin) 등의 능력은 유도된 세포와 비유도되 세포를 비교할 때 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 DNA 자이레이즈의 베타 아단위에 기능한다고 알려진 노보마이신(novomycin)의 능력은 유도된 세포와 비유도된 세포 사이에 큰 차이를 보였다.
그러므로, 자이레이즈 베타 아단위를 암호화하는 전기 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산의 유도로 인하여 이 단백질의 활성을 저해하는 항생제에 대하여Staphylococcus aureus세포가 선택적이으로 현저하게 감작된다. 나아가, 전기 결과는 필수 유전자에대한 어떤 안티센스 작제물의 유도가 그 유전자 산물의 생물학적 역할을 방해하는 화합물에 대하여 어떤 세포나 미생물을 감작시킨다는 것을 보여준다. 이러한 민감화는 전기 표적 유전자 및 그 산물을 방해하는 화합물로 제한된다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느 것에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 8 내지 3795 등의 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 안티센스 핵산 포함), 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산 등을 사용하여 수행할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느 것의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
필수 유전자들 또는 그 부분들에 대한 안티센스 작제물을 이용하는 분석법을 사용하여 전기 유전자 산물의 활성을 방해하는 화합물들을 밝힐 수 있다. 이러한 작제물들을 사용하여 항생제 등의 약물 선도물질들을 밝혀낼 수 있다.
서로 다른 안티센스 작제물을 전사하는 세포 단들을 사용하여, 작용 기작이 알려지지 않은 항생제들을 포함한, 필수 생물학적 경로에 영향을 미치는 어떤 화합물이라도 그 방해 지점(point of intervention)의 특징을 밝힐 수 있다.
필수 유전자들에대한 안티센스 작제물을 활용하는 분석법을 사용하여 어떤 경로내의 다중의 표적물을 활성을 특이적으로 방해하는 화합물을 동정할 수 있다. 이러한 작제물들을 사용하여 한번의 반응으로 하나의 경로에서 다중 표적물에대하여 검체를 탐색할 수 있다(조합(combinatorial) HTS).
나아가, 상기 논의한 바와같이 안티센스 작제물을 포함하는 세포 단을 이용하여 활성 경로가 알려지지않은 항생제를 포함한 필수 생물학적 경로에 영향을 주는 어떤 화합물의 방해 지점을 밝혀낼 수 있다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느 것에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 8 내지 3795 등의 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 안티센스 핵산 포함), 상동 암호화 핵산 또는 그 부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산 등을 사용하여 수행할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느 것의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양은 어떤 항생 화합물이 작용하는 경로를 결정하는 방법이며, 이때, 증식에 필요한 경로들에 관련된 표적 단백질 또는 핵산들의 활성은 전기 표적 단백질 또는 핵산에 대하여 작용하는 어떤 알려진 항생제가 준치사 농도로 세포에 접촉될 때 감소한다. 한가지 실시태양에서, 전기 표적 단백질 또는 핵산은 서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110 또는 상동 폴리펩티드 등의 상기 기술한 방법들을 사용하여 밝혀진 어떤 증식에 필요한 핵산에 해당하는 표적 단백질 또는 핵산이다. 전기 방법은 시험 항생제가 어떤 경로에 작용하는지를 결정하는 상기 기술된 방법들과 유사하나, 증식에 필요한 핵산에 대한 안티센스를 준치사량 사용하여 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키기 보다는 오히려, 전기 증식에 필요한 유전자 산물에 대하여 작용하는 어떤 알려진 항생제를 준치사량 사용하여 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 점이 다르다. 증가된 민감도는 전기 시험 화합물이 작용하는 경로를 결정한다.
동일 생물학적 경로에 영향을 미치는 약물들 사이의 상호작용에 관하여 문헌에 발표되어 왔다. 예를 들어, 메실리남(Mecillinam), 암디노실린(Amdinocillin)은 페니실린 결합 단백질 2(PBP2,E. coli의mrdA의 산물)에 결합하여 이를 불활성화시킨다. 이 항생제는 PBP2를 저해하는 다른 항생제들 뿐만 아니라, PBP3 등의 다른 페니실린 결합 단백질을 저해하는 항생제들과도 상호작용한다(참조: 구트만 엘. et al., 1986, Involvement of penicillin-binding protein 2 with other penicillin-binding proteins in lysis ofEscherichia coliby some beta-lactam antibiotics alone and in synergistic lytic effect of amdinocillin(mecillinam),Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 30:906-912). 따라서, 약물들 사이의 상호작용은 동일 표적 단백질 또는 핵산을 저해하는, 또는 동일 경로내의 상이한 단백질 또는 핵산들을 저해하는 두 약물을 포함한다(참조: 후쿠오카 티., 도몬 에이치., 카쿠타 엠., 이시이 씨., 히라사와 에이., 웃수이 와이., 오햐 에스., 야수다 에이치., 1997, Combination effect between panipenem and vancomycin on highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus,Japan. J. Antibio., 50:411-419; 스미스 씨이., 플레노 비이., 바레트 제이에프., 프로스 엠비., 1997, Assessment of the synergistic interactions of levofloxacin and ampicillin againstEnterococcus faeciumby the checkerboard agar dilution and time-kill methods,Diagnos. Microbiol. Infect. Disease, 27:85-92; 덴 홀랜더 제이지., 호레볼츠 에이엠., 반 구어 엠엘,, 1997, Synergism between tobramycin and ceftazidime against a resistant Pseudomonas aeruginosa strain, tested in an in vitro pharmacokinetic model,Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 41:95-110).
심지어 상이한 표적물을 저해하는 두 약물들도 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 양성자 펌프(proton pump) 저해제인 오메프라졸(Omeprazole) 및 항생제인 아목실린(Amoxycillin) 두 함께 작용하는 상조적인 화합물을 사용하여Helicobacter pylori감염을 치료할 수 있다[(참조: 가브렐레비츠 에이., 라제비츠 더블유., 지에니제스키 제이., 키옥 제이., 말릭쯔 제이., 비엘렉키 디., 포피엘라 티, 레구토 제이., 나피크 제트., 포니에비에르카 이., 1997, Multicenter evaluation of dual-therapy(omeprazol and amoxycillin) forHelicobacter pylori-associated duodenal and gastric ulcer (two years of the observation),J. Physiol., Pharmacol., 48 Suppl 4:93-105).
준치사 농도의 전기 알려전 항생제로 인한 성장저해는 적어도 약 5%, 적어도약 8%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 75% 또는 그 이상이 될 수 있다.
다르게는, 성장저해를 측정하기 보다는 전기 증식에 필요한 표적 유전자 산물의 활성을 측정함으로써 전기 알려진 항생제 준치사 농도를 결정할 수 있다.
세포를, 어떤 준시차량의 알려진 항생제 단에 속한 각 항생제와 다양한 농도의 전기 시험 항생제 조합에 접촉시킨다. 대조군으로, 전기 세포들을 다양한 농도의 시험 항생제에만 접촉시킨다. 전기 알려진 항생제의 존재 및 부재시의 전기 시험 화합물의 IC50을 결정한다. 전기 알려진 약물의 존재 및 부재시의 IC50값이 실질적으로 유사하다면, 전기 시험 약물 및 전기 알려진 약물은 상이한 경로들에 작용한다. 그 IC50값들이 실질적으로 다르다면, 전기 시험 약물 및 전기 알려진 약물은 동일한 경로에 작용하는 것이다.
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느것의 산물 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 전기 산물들을 포함) 또는 상동 암호화 핵산의 산물 또는 그 부분에 대하여 기능하는 알려진 항생제를 준치사농도로 사용하여 수행할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonasaeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드(서열번호 3801 내지 3805, 4861 내지 5915, 10013 내지 14110) 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느 것의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양은, 항생제로 사용할 어떤 후보 화합물을 동정하는 방법이며, 이때, 증식에 필요한 경로에 관련된 표적 단백질 또는 핵산들의 활성은 세포들을 전기 표적 단백질 또는 핵산에 작용하는 준치사 농도의 알려진 항생제에 접촉시킴으로써 감소된다. 한가지 실시태양에서, 전기 표적 단백질 또는 핵산은 상기한 방법으로 밝혀진 증식에 필요한 단백질 또는 핵산에 해당하는 표적 단백질 또는 핵산이다. 전기 방법은 항생제로서 사용할 후보 화합물들을 찾아내는 상기한 방법들과 유사하나, 준치사량의 증식에 필요한 핵산에 대한 안티센스를 사용하여 어떤 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키기 보다는, 전기 증식에 필요한 유전자 산물에 대하여 작용하는 준치사량의 어떤 알려진 항생제를 사용하여 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킨다는 점이 다르다.
준치사 농도의 전기 알려전 항생제로 인한 성장저해는 적어도 약 5%, 적어도 약 8%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 75% 또는 그 이상이 될 수 있다.
다르게는, 성장저해를 측정하기 보다는 전기 증식에 필요한 표적 유전자 산물의 활성을 측정함으로써 전기 알려진 항생제 준치사 농도를 결정할 수 있다.
관심 대상인 시험 화합물의 특성을 규명하기 위하여, 세포들을 준치사량의 알려진 항생제 단 및 하나 이상의 농도의 전기 시험 화합물에 접촉시킨다. 대조군으로, 전기 세포들을 동일 농도의 전기 시험 화합물에만 접촉시킨다. 전기 알려진 항생제의 존재 및 부재시의 전기 시험 화합물의 IC50을 결정한다. 전기 알려진 항생제의 존재 및 부재시의 IC50값들이 실질적으로 다르다면, 전기 시험 화합물은 항생제로 사용하기에 좋은 후보가 된다. 상기 논의한 바와 같이, 상기한 방법으로 어떤 후보 화합물이 밝혀지면, 조합 화학 등의 표준 방법들을 사용하여 그 최적 구조를 유추한다.
상기한 각 방법에 사용할 수 있는 대표적인 알려진 항생제들이 하기 표 Ⅳ에 제시되어 있다. 그러나, 다른 항생제들 역시 사용가능함은 자명할 것이다.
표 IV:항생제 및 그 표적물
항생제 저해/표적 저항성변이
전사 저해제
리파마이신(Rifamycin),리팜피신(Rifampicin),리파부틴(Rifabutin)리팍시민(Rifaximin)스트렙토디긴(Streptodigin)스트렙토바리신(Streptovaricin)악티노마이신(Actinomycin) D +EDTA RNA 중합효소rpoB베타 아단위의 전사 개시를저해RNA 중합효소 베타 아단위의전사 연쇄 종결을 가속화비환식 안사마이신(ansamycin)RNA 중합효소 저해2개의 성공적인 G-C pairrpoBRNA 합성 저해 rpoB, crp, cyaA r poB rpoB pldA
핵산 대사의 저해제
퀴놀론계(Quinolones)날리디식산(Nalidixic acid)옥솔리닉산(Oxolinic acid)플로로퀴놀론(Fluoroquinolones)시프로플록사신(Ciprofloxacine)노르플록사신(Norfloxain)쿠머린계(Coumerins)노보비오신(Novobiocin)쿠머마이신(Coumermycin)알비시딘(Albicidin)메트로니다졸(Metronidazole) 자이레이즈 아단위 및 또는topoisomerase Ⅳ,gyrA아단위 자이레이즈,gyrA및/또는 Topoisomerase Ⅳ(Staph의 가능한 표적)자이레이즈 베타 아단위,gryB의 ATPase activity 저해자이레이즈 베타 아단위,gryB의 ATPase activity 저해DNA 합성DNA내의 단일가닥 파괴 야기 gyrA or B, sloB gyrA norA(Staph내유출)hipO gyrB, cysB, cysE nov,ompA gyrB, hisW tsx(뉴클레오시드 채널)nar
대사 경로의 저해
설폰아미드(Sulfonamides)설파닐아미드(Sulfanilamide)트리메토프림(Trimethoprim)쇼우도마이신(Showdomycin)티오락토마이신(Thiolactomycin)시코프라닌(Psicofuranine)트리클로산(Triclosan)디아조보린(Diazoboines)이소니아지드(Isomiazid)에티오나마이드(Ethionamide) 디하이드로폴레이트(dihydrofolate)디하이드로프테로에이트(dihydro-pteroate합성 차단디하이드로폴레이트(dihydrofo late) 환원효소,folA저해alkylating sulfhydryl group가능한 뉴클레오사이드 아날로그제2형 지방산 합성효소 저해제아데노신 글리코시드 항생제표적은 GMP synthease지방산 합성 저해boron을 포함하는 이환형지방산 합성 저해enoyl-ACP 환원효소,fabI folP, gpt, pabA pabB, pabC folA, thyA nupC, pnp emrf fadB, emrB 유전자 양때문 guaA,B fabI(envM) fabI(envM)
번역저해
페닐프로파노이드(Phenylpropanoid) 클로람페니콜테트라사이클린, 제2형polyketidesMinocyclineDoxycyclineMacrolides(1형 polyketides)에리트로마이신카르보마이신스피라마이신(Spiramycin) 등아미노글리코시드(Aminoglycoside)스트렙토마이신네오마이신스펙티노마이신가나마이신가수가마이신(Kasugamycin)젠타마이신(Gentoamycin)아미카신(Amikacin파로마이신(Paromycin)린코사미드계린코마이신클린다마이신스트렙토그라민계비르지니아마이신프리스티나마이신시너시드(Synercid): 퀴누프리스틴/달포프리스틴푸시단계푸시딘산키로마이신(모시마이신)풀보마이신티오펩틴 리보솜의 펩티딜 전달 센터에 결합, 펩티드 위치변화 차단S6, L3, L6, L14, L16, L25,L26, L27에 결합하나 L16선호30S 리보솜 아단위, "A"에 결합, 펩티드 길이연장 차단S7에 가장 강력하게 결합50S 리보솜 아단위, 23S rRNA에결합, L14, L4, L12 위치이동 저해30S 리보솜 부단위에 불가역적으로 결합, 번역 방해 또는mRNA 오역 야기/ 16S rRNA50S 리보솜 부단위에 결합,펩티드 전위 차단두 구성분자인 스트렙토그라A&B가 50S 리보솜 부단위에 결합하여 펩티드 전위 및 펩티드 결합 형성 차단연장 인자 G(EF-G)를 저해하여펩티드 전위를 방해한다.연장 인자 TU(EF-Tu)를 저해하여 펩티드 결합 방해한다.EF-TU에 결합하여 저해황(sulfur) 함유 항생제, 단백질 합성저해, EF-G rrn, cmlA, marA, ompF, ompR clmA(cmr), mar, ompF rrn, rplC, rplD, rplV, mac rpsL, strC,M, ubiF atpA-E, ecfB, hemA,C,D,E,G, topA rpsC,D,E, rrn, spcB atpA-atpE, cpxA, ecfB, hemA,B,L, topA ksgA,B,C,D, rplB,K rpsI,N.M,R rplF, ubiF cpxA rpsL linB, rplN,O, rpsG fusA tufA,B rplE
티아물린네가마이신옥사졸리디논계리네졸리드이소니아지드니트로푸란토인슈도몬산무피로신인돌마이신비오마이신티오펩티드계티오스트렙톤마이크로코신 단백질 합성 저해단백질 합성 종결 과정 저해23S rRNA단백질 합성 저해, 질소환원 효소들은 니트로푸란토인 반응성높은 친전자성(electrophilic) 중간체들로 변환시키는데, 이 중간체들은 세균의 리보솜 단백질들을 비특이적으로 공격한다이소루실 tRNA 합성효소 (synthetase) 저해- 국소적(박트로반)크림, 나잘 분무액 용형태로 포도상 구균에 사용트립토파닐-tRNA 합성효소저해L11-23S RNA 복합체에 결합EF-G에 의한 GTP 가수분해 저해EF-G에 의한 GTP 가수분해촉진 rplC, rplD prfB pdx nfnA,B ileS trpSrrmA(23S rRNA 메틸 전이효소; 변이는 성 장 속도 및 사슬 연 장 속도가 느리며, 비오마이신 저항성을 갖고 있다)
세포벽/세포막 저해제
β-락탐계페니실린,암피실린메티실린,세팔로스포린계, 1962메실리남(암디노실린)아즈트레오남(푸라즈로실린)바실린, 테테인글리코펩티드계반코마이신, 1955폴리펩티드계바시트라신시클릭 리포펩티드답토마이신, 1980시클릭 폴리펩티드계폴리믹신, 1939포스포마이신, 1969시클로세린 알라포스팔린 하나 이상의 세포벽 트랜스펩티다제, 엔도펩티다제 및 글리코펩티다제(PBP) 저해, 12 개의 PBP 중 단 2개만 필수적 이다:mrdA(PBP2) 및ftsI(pbpB, PBP3) PBP2(mrdA)에 결합하여 불활성화시킨다PBP3(ftsI)를 불활성화디펩티드(dipeptide), 글루코사민 합성효소(synthase) 저해G+ 세포벽 합성 저해, 펜타펩티드 의 말단의 D-ala-D-ala에 결합 방해 펩티도글리칸 합성, 리포타이 코산 합성, 및 세균 막전위를 포함하는 다양한 막기능 파괴계면활성 작용으로 세포막 파괴, LPS의 리피드 A에 결합P-에놀피루베이트 유사체, 펩티도글리칸 합성의 첫번째 단계인 UDP-N-아세틸글루코사민에놀피루빌, murA저해. 또한 면역억제제로도 작용D-ala 이합체 형성 방해D-ala 리가아제,ddlA,B저해포스포노디펩티드, 세포벽 합성 저해제,β-락탐강화제(potentiator) ampC, ampD, ampE,envZ, galU, hipA, hipQ, ompC, ompF,ompR, ptsI, rfa, tolD, tolE tonB alaS, argS, crp, envB, mrdA,B, mreB,C,D dppA pmrA murA, crp, cyaA, glpT, hipA, ptsI, uhpT hipA, cycA pepA, tpp
단백질 처리/운송 저해제
글로보마이신 신호 펩티데이즈(signal peptidase) II(프로리포프로틴을 절단하여 지질 변형 유도) 저해,lspA lpp, dnaE
상기한 세포에 기초한 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느것의 산물 또는 그 부분(서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 전기 산물들을 포함) 또는 상동 암호화 핵산의 산물에 대하여 기능하는 알려진 항생제를 준치사농도로 사용하여 수행할 수 있음이 자명하다. 이러한 방법으로,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드 중의 어느 것의 표적물의 양 또는 활성이 감소될 수 있다.
실시예 12: 다른 세균종에서 외인성 핵산서열을 다른 세균종으로 전이
두번째 개체의 증식을 저해하는 첫번째 개체내에서 동정된 안티센스 분자의 능력(이로써 첫번째 개체로부터의 유전자에 상동인 두번째 개체의 유전자가 두번째 개체 증식에 필요하다는 것을 확인)을 전기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 동정된E. coli의 성장을 저해하는 안티센스 핵산을 사용하여 검증하였다. IPTG로 안티센스 RNA 발현 유도시E. coli성장을 저해한 발현 벡터들을Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae또는Salmonella typhimurium로 직접 도입하였다. 그후, 실시예 1의 방법에 따라 전기 형질전환된 세포들의 성장저해를 분석하였다. 액제 배지에서 배양한 후, 세포들을 다양한 순차적 희석액들에 두고, 하나의 집락이 관찰된 최대 10배 희석액으로 결정된 것으로서, 안티센스 RNA 발현 유도(INDUCED) 대 비유도(UNINDUCED)시 성장에서의 로그 차(log difference)를 계산함으로써, 어떤 점수를 결정하였다. 이 실험의 결과가 하기 표 V에 나와 있다. 미생물에서 안티센스 RNA 발현이 아무런 영향력이 없을 경우, 하기 표 V에서 전기 클론은 '-'이다. 반대로, 표 V에서 '+'는, 사용된 조건하 및 전기 미생물에서, 유도된 플레이트 상에서 하나의 집락을 관찰하기 위하여는 전기 비유도 플레이트에서보다 적어도 10배 이상의 세포가 필요하였음을 의미한다.
표 V: E. coli 에서 증식을 억제하는 안티센스 핵산에 대한 다른 미생물의 민감도
따라서,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi성장을 저해하는 안티센스 핵산이 다른 개체들의 성장도 저해할 수 있는지는, 전기 안티센스 핵산을 핵산을 수득한 개체 이외의 종으로 직접 도입함으로써 평가할 수 있다. 특히, 전기 안티센스 핵산이Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonellatyphi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 속하는 아무 종들의 성장을 저해할 수 있는지를 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서 전기 안티센스 핵산이 E. coli를 제외한 개체의 성장을 저해할 수 있는 지를 평가할 수 있다. 이러한 실시태양에서, 전기 안티센스 핵산을 전기 안티센스가 평가될 개체 내에서 기능하는 발현 벡터들 내로 삽입한다.
어떤 이종 개체의 증식을 저해하는 안티센스 핵산의 능력을 평가하기 위하여 전기 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느것에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 등 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012에 상보적인 안티센스 핵산을 포함) 또는 상동 암호화 핵산또는 그부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여 수행할 수 있음이 자명하다.
어떤 이종 미생물에서 음성적인(negative) 결과가 나왔다고 해도 그것이 전기 미생물이 전기 유전자를 갖고 있지 않다거나 또는 전기 유전자가 필수적이지 않다는 것을 의미하는 것은 아님은, 당업계의 숙련된 자들에게 자명할 것이다. 그러나, 양성적인 결과는 전기 이종 미생물이 그의 증식에 필요한 상동 유전자를 포함하고 있다는 것을 의미한다. 전기 상동 유전자는 이에 기술된 방법들을 사용하여 수득할 수 있다. 안티센스에 의하여 저해되는 전기 세포들을 이에 기술된 바와같이 세포에 기초한 분석법에 사용하여 이 미생물들에 효과적인 항생제를 개발하기 위하여 화합물들을 찾고 그 특성을 규명할 수 있다. 그를 분리해 낸 미생물에서 작용한 안티센스 분자가 어떤 이종 세포 또는 미생물에서 항상 작용하지는 않을 것이라는 것은 당업계의 숙련된 자들에게 자명할 것이다.
실시예 12A:Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi발현 벡터또는 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi이외의 세균중에서 기능하는 발현 벡터들을 사용하여 다른 세균 종에 외인성 핵산 서열을 전달
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi또는 그 일부의 성장을 저해하는 전기 안티센스 핵산이Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi이외의 다른 개체들의 성장도 저해할 수 있는지를 평가할 수 있다. 예를 들어Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 성장을 저해하는 전기 안티센스 핵산이 다른 개체의 성장을 저해할 수 있는지 평가할 수 있다. 특히, 전기 안티센스 핵산이Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigelladysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들의 성장을 저해할 수 있는지를 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서 전기 안티센스 핵산이E. coli를 제외한 개체의 성장을 저해할 수 있는 지를 평가할 수 있다.
이러한 실시태양에서, 유도가능한 프로모터의 조절하에서Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식을 저해하는 어떤 안티센스 핵산을 발현하는 발현벡터를 평가될 전기 세포나 미생물내로 도입한다. 일부 실시태양에서 전기 안티센스 핵산은Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi와 밀접하게 연관된 세포들이나 미생물들에서 평가될 수 있다. 이러한 안티센스 핵산이 유도자의 존재하에서 전기 연관된 세포들이나 미생물들의 성장을 저해할 수 있는지를 측정하였다.
예를들어, 여기에서 언급된 방법들을 사용하여Staphylococcus aureus의 성장을 저해하는 39개의 안티센스 핵산을 동정하고 그 발현이 자일로즈로 유도가능한 Xyl-T5 프로모터에의해 조절되는 발현벡터 내로 도입하였다. Xyl-T5 프로모터로조절되는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)를 가지는 벡터를 사용하여,Staphylococcus epidermidis내에서의 Xyl-T5 프로모터로부터의 발현을 보이고Staphylococcus aureus내에서의 그것과 비교하였다.
전기 벡터를 다음과 같이 일렉트로포레이션으로Staphylococcus epidermidis내로 도입하였다:
액체배지에서Staphylococcus epidermidis를 대수증식기 중기까지 배양한 후, 원심분리로 수확하였다. 세포 펠렛을 1/3 부피의 얼음으로 차게한 EP 버퍼(0.625M 수크로즈, 1mM MgCl2, pH=4.0)에 용해시킨 후 다시 원심분리로 수확하였다. 전기 세포 펠렛을 1/40 부피의 EP 버퍼에 용해한 후, 얼음에 1시간 동안 방치하였다. 전기 세포들은 그후 -80 ℃에서 동결, 보관되었다. 일렉트로포레이션(Electroporation)을 위하여, 녹인 일렉트로콤피턴트 (electrocompetent) 세포 50 ㎕를 0.5 ㎍ 플라스미드 DNA와 결합시킨 후, biorad gene pulser electroporation 장치를 사용하여 10㎸/㎝, 25㎌, 200 ohm 의 전기 파동을 주었다. 전기 세포들을 즉시 200 ㎕ 외성장 배지에 용해시키고 전기 플라스미드 벡터를 유지할 수 있는 약물 선별을 가지는 고체 성장배지에 플레이팅 하기전에 2시간동안 배양하였다. 이렇게 플레이팅 한후 하롯밤 동안 배양하여 생긴 집락을 선별하여, 약물 선택성을 가지는 액체배지에서 배양하고, 유도자 자일로즈의 존재하에서 성장 민감도를 시험하기 위하여 실시예 10에서Staphylococcus aeurus에 대하여 기술된 희석 플레이팅 분석방법을 수행하였다.
이 실험의 결과가 하기 표 Ⅵ에 나와 있다. 첫번째 열은Staphylococcus epidermidis내로 도입된Staphylococcus aeurus안티센스 핵산의 분자 수를 나타낸다. 두번째 열은 전기 안티센스 핵산이Staphylococcus epidermidis의 성장르 저해하는지 여부를 나타내는데, 성장을 저해할 경우를 "+"로 나타낸다. 39종의Staphylococcus aeurus안티센스 핵산을 감정한 결과, 20종이Staphylococcus epidermidis의 성장을 방해하였다.
표 VI: Staphylococcus aeurus 의 증식을 저해하는 안티센스 핵산에 대한 다른 미생물의 민감도
위에서 보여준 결과는 본 발명의 전기 핵산들 중의 한 부분집합을 사용하여수득하였지만, 본 발명의 나머지 다른 핵산들을 사용하여Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi이외의 세포나 미생물들의 증식을 저해하는지 여부를 결정하는 유사한 분석법을 수행할 수 있음은 자명할 것이다.
어떤 이종 개체의 증식을 저해하는 안티센스 핵산의 능력을 평가하기 위하여 전기 분석법을,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산 중 어느것에 상보적인 안티 센스 핵산 또는 그 부분(서열번호 8 내지 3795의 안티센스 핵산 등 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012에 상보적인 안티센스 핵산을 포함) 또는 상동 암호화 핵산또는 그부분에 상보적인 안티센스 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여 수행할 수 있음이 자명할 것이다.
실시예 12C
어떤 필수 유전자에 대한 상동체를 발견하기위한 방법으로서, 9종의 원핵세포 개체를 분석하고 자세히 비교하였다. 첫째로, 전기 공공의 및 개인의 데이타 원천(source)을 탐색하여 가장 신뢰할만한 각각의 개체의 유전자 서열의 원천(source)을 결정하였다. 연구된 9종의 개체는Escherichia coli, Haemophilusinfluenzae, Helicobacter pyroli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi이다. 이러한 개체들을 위하여 전체 길이의 단백질과 뉴클레오티드 서열들을 여러가지 원천들로부터 결합하였다.Escherichia coli,Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli를 위하여, 공공의 서열분석 프로젝트들과 GenPept 115 데이타베이스(NCBI에서 활용가능)로부터 유전자 서열들을 채택하였다.Pseudomonas aeruginosa의 경우에는, Pseudomonas 게놈 프로젝트로부터 유전자 서열들을 채택하였다(http://www.pseudomonas.com).Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi를 위하여는 PathoSeq v 4.1(2000. 3. 배포)의 게놈 서열들을 GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USA로 부터 구입한 유전자 탐색용 소프트웨어 GeneMark v 2.4a를 사용하여 ORF를 재분석하였다.
실질적으로, 전기 안티센스 방법론에의한 전기 필수 유전자들을 주어진 유전자에 대한 상동 유전자를 찾기위하여 관심 대상으로부터 유래된 프로테옴(proteom)들과 비교하였다. 이러한 비교는 FASTA 프로그램 v3.3으로 수행하였다. 25%이상 동일하거나 두 유전자를 정렬하였을 때 한 유전자의 70%이상을 포함하는 경우 두 유전자는 상동이라 간주한다. 전기 9종의 미생물에 대하여 전기 기준을 만족하는 가장 우수한 조화 점수로 결정되는 가장 우수한 상동체들이 표 ⅦA에 보고되었다. 표 ⅦA는 전기와 같이 밝혀진 가장 유수한 ORF(LOCUSID로 표기된 열), 서열명, %동일성, 및 전기와 같이 감정된 9종의 미생물 각각에서 동정된 유전자에 대하여 전기의문서열과 잘 정렬되는(적용범위, coverage) 단백질의 양 등이 나열되어 있다.
표 ⅦB에는 여기에서 언급되는 방법들을 사용하여Entero faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus에서 증식에 필요하다고 밝혀진 유전자들에대한 PathoSeq cluster 번호를 나열하였다. PathoSeq cluster 번호라 표지된 열에서 지적되는 바와 같이, 이 서열들은 서로 상동성을 공유하면 결과적으로 동일 PathoSeq cluster로 분류된다. 따라서, 여기에서 기술하는 방법을 사용하여 몇몇 종에서 상동성을 공유하는 증식에 필요한 유전자들을 밝여내었다.
표 VII A:
표 VII B:
실시예 13: 밝혀진 핵산서열들의 탐침(probe)으로서의 사용
본 발명의 여기에서 기술되는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 서열, 상동 암호화 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산을 탐침으로 사용하여, 두번째 세포나 개체로부터 추가적인 관심 대상 유전자 서열을 수득할 수 있다. 예를 들어,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 전기 동정된 서열, 상동 암호화 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산을 사용하여Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi,Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종에서 상동 서열을 동정할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 서열, 상동 암호화 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산 등을 사용하여, E. coli이외의 이종 개체로부터 상동 핵산을 동정할 수 있다.
여기에서 기술되는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 핵산들과 상동 암호화 핵산 또는 상동 안티센스 핵산과 인간의 핵산의 혼성화로 전기 프로브에 해당하는 전기 유전자에 의하여 암호화되는 단백질이 인간에서 발견되므로 이상적인 약물 표적이 될 수 없다는 것을 알 수 있었다.
여기에서 기술되는Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 핵산 서열, 상동 암호화 핵산, 또는 상동 안티센스 핵산들 또는 그일부로부터 유래된 탐침들을 식별가능하게 하기위하여 당업계의 숙련된 자에게 친숙한 방사성 동위원소 및 비방사성표지를 포함하는 식별가능한 표지자로 표지할 수 있다. 전기 검출가능 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 시험관내(in vitro) 전사, 틈 번역(nick translation), 또는 인산화효소(kinase) 반응을 포함한, 당업계에 알려진 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 전기 표지된 탐침에 혼성화할 수 있는 서열을 함유한 핵산 표본을 전기 표지된 탐침과 접촉시킨다. 전기 표본내의 전기 핵산이 이중 가닥일 경우, 그를 전기 탐침과 접촉시키기 전에 변성(denature)할 수 있다. 일부 응용에서는, 전기 핵산 표본을 니트로셀룰로오스 (nitrocellulose) 또는 나일론 막(nylon membrane) 등의 표면에 고정화시킬 수 있다. 전기 핵산 표본의 핵산들은 게놈 DNA, cDNA 라이브러리, RNA, 또는 조직(tissue) 표본을 포함한, 다양한 출처로부터 수득된 것일 수 있다.
전기 검출가능 탐침에 혼성화할 수 있는 핵산의 존재를 검출하는 방법에는, 서던 블랏팅, 노던 블랏팅, 점 블랏팅, 집락 혼성화(colony hybridization), 및 플라크(plaque) 혼성화 등의 잘 알려진 방법들이 있다. 일부 응용에서는, 전기 검출가능 탐침에 혼성화할 수 있는 전기 핵산을, 발현 벡터, 서열분석(sequencing) 벡터, 또는 시험관내 전사 벡터 등의 벡터들내로 클로닝하여 전기 표본내의 혼성화하는 핵산의 특성 규명 및 발현을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법들을 사용하여, 실시예 5 및 6에서 밝혀진 서열들로부터 제조된 탐침들에 혼성화할 수 있는, 다양한 세균 종들로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터의 서열들을 분리 및 정제하고, 클로닝할 수 있다.
실시예 14: PCR 프라이머 제조 및 DNA 증폭
증식에 필요한 핵산서열들에 직접적으로 해당하는 또는 그 오페론내에 위치한 전기 동정된Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi유전자, 상동 암호화 핵산 이나 상동 안티센스 핵산 또는 그 부분을 사용하여, 다른 종들로부터의 상동 서열 확인 또는 분리를 포함한, 다양한 응용에 사용할 PCR 프라이머를 제조할 수 있다. 예를들어Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi를 사용하여Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacteriumtuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종들로부터 상동 서열을 동정하고 분리할 PCR 프라이머를 제조할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 전기 PCR 프라이머를 사용하여,E. coli이외의 개체로부터 상동 핵산은 동정하고 분리할 수 있다.
전기 PCR 프라이머를 사용하여 수득한 동정, 분리된 핵산들은 상동 핵산의 부분 또는 전체를 포함한다. 상동 유전자들은 서로 관련되어 있지만 서열이 동일하지는 않기 때문에, 당업계의 숙련된 자들은 종종 디제너레이트(degenerate) 서열의 PCR 프라이머를 이용할 것이다. 이러한 디제너레이트 서열의 프라이머들은 보존(conserved) 암호화 영역 등의, 알려져 있거나 또는 추론된, 보존 서열 영역에 기초하여 고안된다. 여기에서 밝혀진 서열들로부터 제조된 축퇴성 탐침들을 사용하여 PCR 산물이 성공적으로 생산된다는 것은, 조사되는 종내에 상동 유전자 서열이 존재함을 가리킨다. 전기 PCR 프라이머들은 적어도 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이다. 좀더 바람직하게는 전기 PCR 프라이머들은 20-30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서는, 전기 PCR 프라이머들은 30개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 전기 프라이머 쌍들은, 그 융해(melting) 온도들이 대략적으로 같도록 대략적으로 같은 G/C 비를 갖는 것이 바람직하다. 다양한 PCR 방법들이 당업계의 숙련된 자들에게 친숙하다(참조: 화이트 비에이., 1997, Molecular Cloning to Genetic Engineering inMolecular Bioloy67: Humana Press, Totowa). 전기 표적 유전자의 전체 암호화 서열이 알려져 있을 경우, 전기 표적 유전자의 5' 및 3' 영역을 PCR 탐침 제조를 위한 서열 제공자로 사용할 수 있다. 이 각 PCR 공정들에서, 증폭될 핵산서열들의 양 측면에 있는 PCR 프라이머들을 dNTP들 및, Taq 중합효소, Pfu 중합효소 또는 Vent 중합효소 등의 열안정 중합효소와 함께 적절히 제조된 핵산 표본에 첨가한다. 전기 표본내의 핵산은 변성되고, 전기 PCR 프라이머들은 전기 표본내의 상보적인 핵산서열에 특이적으로 혼성화한다. 전기 혼성화한 프라이머들은 연장된다. 그 후, 또다른 변성, 혼성화 및 연장(extension)의 사이클이 시작된다. 전기 사이클은 여러번 반복되어 전기 프라이머 부위들 사이에 전기 핵산서열을 가진 증폭된 절편을 산출한다.
실시예 15: 역 PCR
역 중합효소 연쇄반응 방법을 사용하여 실시예 5 및 6에서 밝혀진 전기 알려진 핵산서열을 연장할 수 있다. 전기 역 PCR 반응은 오크만(Ochman) 등에 의하여 PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification(Hwnry A. Eflich,Ed) W. H. Freeman and Co., 1992)의 제 10장에 기술되어 있다. 전통적인PCR은 DNA의 상보적인 가닥들의 합성을 시발하는데 사용되는 두 프라이머를 필요로한다. 역 PCR에서는, 단지 하나의 핵심 서열만이 필요한 것으로 알려져 있다.
실시예 5 및 6에 개시된 방법들 및 다른 종의 세균에 적용되는 방법들에 관련된 것으로 밝혀진 서열들을 사용하여, 세균 증식에 필요한 유전자 또는 오페론에 해당하는 어떤 외인성 핵산서열 부집합을 밝힌다. 게놈 서열이 알려지지 않은 종에서, 역 PCR 방법은 그 서열을 결정하거나 또는 전기 탐침 서열을 전기 동정된 외인성 핵산서열이 결합하는 전기 표적 서열에 완전히 일치하게 하기 위하여 전기 유전자를 수득하는 방법을 제공한다.
이 방법을 수행하기 위하여, 전기 표적 개체의 게놈을 적절한 제한효소로 절단하여 전기 동정된 서열 및 그에 접해 있는 미지의 서열을 포함하는 핵산 절편들을 창조한다. 이 절편들을 그 후, 원형으로 만들고, 전기 PCR 반응의 주형(template)으로 사용한다. 실시예 15에 개시된 바에 따라 PCR 프라이머들을 고안하고, 전기 동정된 서열의 말단으로 보낸다. 전기 프라이머들은 핵산 합성이 전기 알려진 서열로부터 멀어지고 전기 원형화된 주형내에 포함된 미지의 서열쪽으로 일어나게 이끈다. 전기 PCR 반응이 완결된 후, 그 결과적인 PCR 산물의 서열을 분석하여 전기 동정된 외인성 핵산서열의 핵심 서열을 지나 연장된 서열을 밝힐 수 있다. 이러한 방식으로, 각 신규 유전자의 전체 서열을 밝힐 수 있다. 부가적으로, 인접한 암호화 및 비암호화 영역의 서열들을 밝힐 수 있다.
실시예 16:Escherichia coli증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Escherichia coli의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 17:Neisseria gonorrhoeae증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Neisseria gonorrhoeae의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 18:Salmonella enterica증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Salmonella enterica의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 19:Enterococcus faecalis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Enterococcus faecalis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 20:Haemophilus influenzae증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Haemophilus influenzae의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 21:Aspergillus fumigatus증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Aspergillus fumigatus의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 22:Helicobacter pylori증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Helicobacter pylori의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 23:Mycoplasma pneumoniae증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Mycoplasma pneumoniae의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 24:Plasmodium ovale증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Plasmodium ovale의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 25:Entamoeba histolytica증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Entamoeba histolytica의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 26:Candida albicans증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Candida albicans의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 27:Histoplasma capsulatum증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Histoplasma capsulatum의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 28:Salmonella typhi증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Salmonella typhi의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 30:Salmonella paratyphi증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Salmonella paratyphi의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 30:Salmonella cholerasuis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Salmonella cholerasuis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 31:Staphylococcus epidermis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Staphylococcus epidermis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 32:Mycobacterium tuberculosis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Mycobacterium tuberculosis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 33:Mycobacterium leprae증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Mycobacterium leprae의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 34:Treponema pallidum증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Treponema pallidum의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 35:Bacillus anthracis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Bacillus anthracis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 36:Yersinia pestis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Yersinia pestis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 37:Clostridium botulinum증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Clostridium botulinum의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 38:Campylobacter jejuni증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Campylobacter jejuni의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 39:Chlamydia trachomatis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Chlamydia trachomatis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 40:Staphylococcus aureus증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Staphylococcus aureus의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 41:Salmonella typhimurium증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Salmonella typhimurium의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 42:Klebsiella Pneumoniae증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Klebsiella Pneumoniae의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 43:Pseudomonas aeruginosa증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Pseudomonas aeruginosa의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
실시예 44:Enterococcus faecalis증식에 필요한 유전자 동정
상기 기술된 방법들에 따라Enterococcus faecalis의 증식에 필요한 유전자를 밝혀낸다.
분리한 외인성 핵산 절편들의 안티센스 항생제로서의 용도
전기 동정된 서열들을 사용하여 분자 라이브러리들을 조사하여 항생제를 밝혀내는데 유용한 화합물들을 밝히는 것에 더하여, 전기 증식에 필요한 서열또는 그부분에 상보적인 안티센스 핵산, 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 상동 안티센스 핵산들을 치료제로 사용할 수 있다. 특히, 안티센스 배향의 전기증식에 필요한 서열 또는 상동 암호화 핵산 또는 그부분, 또는 상동 안티센스 핵산들을 어떤 개체에 주입하여 어떤 세균의 표적 유전자의 번역 또는 처리, 폴딩, 또는 비번역 RNA의 단백질/RNA 복합체 구성을 저해하게 할 수 있다.
실시예45: 밝혀진 외인성 서열들로부터 안티센스 치료제 제조
여기에서 기술되는 전기 증식에 필요한 서열 또는 그부분에 상보적인 안티센스 핵산, 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 핵산 또는 그부분, 또는 상동 안티센스 핵산서열 또는 그부분들을 시험관내에서 또는 생체내에서 세균 감염의 처치 또는 단순히 세균 성장저해를 위한 안티센스 치료제로 사용할 수 있다. 예를들어 전기 안티센스 치료법을 사용하여Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi으로 야기된 세균 감염을 치료하거나 이러한 개체의 성장을 저해할 수 있다. 전기 치료법을 사용하여Anaplasama marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata(Torulopsis glabrata라고도 불림),Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr(Candida pseudotropicalis라고도 불림),Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae,Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Yersinia pestis및 전기 종들 중 어느 것의 속(genus)에 포함되는 어떤 종으로 야기되는 감염을 치료하고 전기 성장을 억제할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 전기 안티센스 치료법은E. coli이외의 개체로 야기된 감염을 치료하고 개체의 성상을 억제할 수 있다.
전기 치료법은 유전자가 mRNA로 전사되고 그 후 단백질로 번역되는 세포내의 생물학적 과정을 이용한다. 안티센스 RNA 방법은 그 표적 핵산에 결합하여 그 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 저해하는, 표적 유전자에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 핵산들의 사용을 고려한다. 예를 들어, 전기 안티센스 핵산은 전기 표적 핵산의 번역 또는 전사를 저해할 수 있다. 한가지 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, 원하는 세포 개체군이 세균으로 오염되어 있는 세포 배양물의 세균 감염을 치료하고 통제할 수 있다. 또다른 실시태양으로, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세균 감염을 가진 개체를 치료할 수 있다.
당업계의 잘 알려진 방법들을 사용하여, 본 발명의 서열들 중 어느 것으로부터도 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 인위적인 방법을 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성한다. Chemical Rev. 90:543-584(1990)(울만 & 페이만)는 안티센스 올리고뉴클레오티드 방법을 상세히 개관한다. 변형된 또는 변형되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 치료제로서 사용할 수 있다. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 뉴클레오티드간 인산 잔기들을 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포라미데이트(phosphoramidate), 및 인산염 에스테르(phosphate ester)로 치환하여, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 인산 골격(backbone)을 변형시킬 수 있다. 실록산(siloxane) 가교(bridge), 탄산염(carbonate) 가교, 티오에스테르(thioester) 가교, 및 당업계에 알려진 많은 기타의 가교 등의 뉴클레오티드간 비인산 가교 유사체들을 사용할 수 있다. 뉴클레오티드간 연결이 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 제조는 미국 특허 제 5,142,047호에 개시되어 있다.
전기 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 누클레오시드 단위들을 변형하는 것 또한 고려된다. 이러한 변형은 그 반감기를 증가시키며, 생체내에서 전기 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수율(cellular rate of uptake)을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, α-아노머형(α-anomeric) 뉴클레오티드 단위 및, 1,2-다이디옥시-d-리보푸라노스(1,2-dideoxy-d-ribofuranose), 1,2-다이디옥시-l-페닐리보푸라노스(1,2-dideoxy-l-phenylribofuranose), 및 N4,N4-에타노-5-메틸-시토신(N4,N4-ethano-5-methyl-cytosine) 등의 변형된 뉴클레오티드들의 사용이 본 발명에서 고려된다.
변형된 안티센스 분자들의 또다른 형태는 펩티드 핵산들에서 발견된다. 펩티드 핵산(PNA)들은 단일 및 이중 가닥 핵산에 혼성화시키기 위하여 개발되었다. PNA는, 그 전체 디옥시리보스-인산(deoxyribose-phosphate) 골격이 화학적으로 완전히 다른, 그러나 구조적으로는 유사한, 2-아미노에틸 글리신(2-aminoethyl glycine) 단위를 포함하는 폴리아미드(펩티드) 골격으로 교환된 핵산 유사체이다. 음전하가 많은 DNA와 달리, 전기 PNA 골격은 중성이다. 따라서, PNA-DNA 혼성체(hybrid)의 상보 가닥들 사이의 반발 에너지(repulsive energy)는 그에 필적하는 DNA-DNA 혼성체에서보다 훨씬 적으며, 따라서, PNA-DNA 혼성체가 훨씬 더 안정하다. PNA는 왓슨/크릭(Watson/Crick) 또는 훅스틴(Hoogsteen) 방식 둘 중 하나로 DNA에 혼성화할 수 있다(참조: 데미도브 et al., 1995,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:2637-2641; 에그홀름, 1993,Nature, 365:566-568; 닐슨 et al., 1991,Science, 254:1497-1500; 듀홀름 et al., 1997,New J. Chem., 21:19-31).
두 동일한 PNA 서열들이 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid) 단위 세 개를 포함하는 유연성 있는 헤어핀(hairpin) 링커(linker)로 연결되어 있는, PNA "겸자(clamp)"로 불리는 분자들이 합성되어 왔다. PNA 겸자를 상보적인 호모퓨린(homopurine) 또는 호모피리미딘 (homopyrimidine) DNA 표적 서열과 혼합할 때, 극히 안정한 것으로 나타난 PNA-DNA-PNA 삼중 혼성체가 형성된다(참조: 벤틴 et al., 1996,Biochemistry, 35:8863-8869; 에그홀름 et al., 1995,Nucleic Acids Res., 23:217-222; 그리피스 et al., 1995,J. Am. Chem. Soc., 117:831-832).
서열-특이적이고 친화력이 높은, PNA의 이중 및 삼중 결합은 광범위하게 기술되어 왔다(참조: 닐슨 et al., 1991,Science, 254:1497-15001; 이그홀름 et al.,1992, J. Am. Chem. Soc., 114:9677-9678; 에그홀름 et al., 1993,Nature, 365:566-568; 알마르손 et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:9542-9546; 데미도브 et al., 1995,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:2637-2641). 이들은 또한 핵산분해효소 및 단백질분해효소 절단에 저항성 있는 것으로 나타났다(참조: 데미도브 et al., 1994,Biochem. Pharm., 48:1010-1313). PNA는 유전자 발현을 저해하는 데에(참조: 한베이 et al., 1992,Science, 258:1481-1485; 닐슨 et al., 1993,Nucl. Acids Res., 21:197-200; 닐슨 et al., 1994,Gene, 149:139-145; 굳 & 닐슨, 1998,Science, 95:2073-2076), 제한효소 활성을 차단하는 데에(참조: 닐슨 et al., 1993,supra), 인위적 전사 프로모터로(참조: 몰리가르드, 1994,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:3892-3895) 및 유사(pseudo) 제한효소로(참조: 데미도브 et al., 1993,Nucl. Acids Res., 21:2103-2107) 작용하는 데에 사용되어 왔다. PNA는 또한, 안티센스 기작을 통하여 중재되는 항바이러스(antiviral) 및 항종양(antitumoral) 활성을 갖는 것으로 최근 밝혀졌다(참조: 노톤, 1996,Nature Biotechnol., 14:615-619; 허쉬만 et al., 1996,J. Investig. Med., 44:347-351). PNA가 세포내로 들어가는 것을 촉진하기 위하여, PNA들을 다양한 펩티드에 연결하여 왔다(참조: 바수 et al., 1997,Bioconj. Chem., 8:481-488; 파드리지 et al., 1995,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:5592-5596).
당업계에 잘 알려진 표준적 방법을 사용하여, 대상체에 대하여 올리고뉴클레오티드의 직접 적용으로 본 발명에서 고려되는 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여할 수 있다. 플라스미드 또는 파지(phage)를 사용하여 전기 대상체내에서 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성시킬 수 있다. 다르게는, 전기 대상 세포의 염색체내에 있는 서열로부터 전기 안티센스 핵산을 발현할 수 있다. 예를 들어, 어떤 프로모터를 전기 대상 세포의 그 표적 유전자 가까이에 있는 염색체내로 도입하여 전기 프로모터가 전기 안티센스 핵산의 전사를 지휘하도록 할 수 있다. 다르게는, 어떤 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 전기 안티센스 서열을 포함하는 핵산을 전기 대상 세포의 염색체내로 도입할 수 있다. 나아가, 고려되는 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 어떤 리보자임(ribozyme) 서열내로 통합하여 전기 안티센스가 그 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 이를 절단하도록 하는 것도 고려된다(참조: 로시 et al., 1991,Pharmacol. Ther., 50(2):245-254). 본 발명은 또한 레트론을 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포 안으로 도입하는 것도 고려한다. 레트론 방법은 미국특허 제 5,405,775호에 예시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 또한, 리포좀 또는 당업계에 잘 알려진 일렉트로포레이션 방법을 사용하여 옮길 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산을 또한, 세포내에서 삼중 나선을 형성하여 기능하는 핵산들로 구성된 항생 화합물을 고안하는데 사용할 수 있다. 삼중 나선 올리고뉴클레오티드는 어떤 게놈으로부터의 전사를 저해하는데 사용된다. 본 발명에서 증식에 필요한 것으로 밝혀진 서열들 또는 그 부분들을, 미생물에 감염된 개체내에서 전기 미생물 유전자의 발현을 저해하는 주형으로 사용할 수 있다. 전통적으로, 호모퓨린 서열들은 삼중 나선 전략에 가장 유용한 것으로 간주되어 왔다. 그러나, 호모피리미딘 서열들 역시 유전자 발현을 저해할 수 있다. 이러한 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드들은 호모퓨린:호모피리미딘 서열의 큰 홈(major groove)에 결합한다. 따라서, 증식에 필요한Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi서열들 또는 상동 핵산에 기초한 두 유형의 서열 모두, 항생 화합물 주형으로 사용하는 것이 고려된다.
이 실시예의Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi의 증식에 필요한 핵산, 또는 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드들 또는 그부분 등의 전기 안티센스 핵산들을 사용하여 표적 핵산의 전사 또는 번역을 저해함으로써, 세균 세포 사멸 또는 적어도 세균 정체(stasis)를 유도한다. 여기에서 언급되는 증식에 필요한 핵산 서열들의 약 8 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 생리적 조건하에서 전기 표적 서열들과 이중 가닥(duplex)을 형성하기에 충분한 상보성을 지닌다.
세균 세포를 죽이거나 그 성장을 저해하기 위하여, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드들을, 그 흡수를 용이하게 하는 조건하에서 전기 세균 또는 전기 대상 세포에 적용한다. 이 조건들에는, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 전기 세포에 의하여 흡수되기에 충분한, 세포 및 올리고뉴클레오티드 배양 시간이 포함된다. 한가지 실시태양에서는, 7 내지 10일의 배양 기간이면 어떤 표본내의 세균을 죽이는데 충분하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최적 농도는 사용 목적에 따라 선택적이다.
사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도는, 조절하고자하는 세균의 종류, 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특성, 및 처치되는 배양액에서 그 원하는 세포에 대한 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상대적인 독성에 따라 다양할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 많은 상이한 농도, 바람직하게는 1x10-10M 내지 1x10-4M 사이의 농도로 세포 표본들에 도입할 수 있다. 유전자 발현을 적절하게 조절할 수 있는 최소 농도가 밝혀지면, 전기 최적 투여량을 생체내에서의 사용에 적합한 양으로 환산한다. 예를 들어, 배양액에서 1x10-7의 저해 농도는 대략 0.6㎎/㎏(체중)의 투여량으로 환산된다. 100㎎/㎏(체중)에 근접한 또는 그 보다 높은 올리고뉴클레오티드 양은 실험용 동물에서 전기 올리고뉴클레오티드의 독성을 테스트한 후에나 가능할 것이다. 추가적으로, 전기 개체로부터 세포들을 제거하여 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처치한 후, 전기 개체로 다시 도입하는 것이 고려된다. 이 범위는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 당업계의 숙련된 자는 주어진 개체에 사용할 최적 농도를 결정할 수 있다.
어떤 희망하는 배양물에서 세균 세포를 죽이거나 조절한 후, 전기 희망하는 세포 개체를 다른 목적에 사용할 수 있다.
실시예 46: 오염된 세포 배양물을 치료하기위한 안티센스 올리고뉴클리오티드의 사용
하기 실시예는,Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 상동 암호화 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그 부분이 오염된 세포 배양 시스템을 처치하는 살균 또는 정균(bacteriostatic)제로 작용하는 능력을 증명한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전기와 같이 응용함으로 증식에 필요한 세균 유전자 산물의 번역이 저해되는 것으로 여겨진다.
본 발명의 한가지 실시태양에서, 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 표1A에 나열된 어떤 안티센스 핵산의 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개 또는 40개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형 올리고뉴데옥시클레오티드에 해당한다. 전기 안티센스 서열에 상보적인 센스 올리고뉴클레오티드를 합성하여 대조군으로사용한다. 전기 올리고뉴클레오티드들을 마츠쿠라(Matsukura) 등의 방법(Gene, 72:343, 1988)에 따라 합성하고 정제한다. 전기 시험 올리고뉴클레오티드들을 작은 부피의 고압멸균수(autoclaved water)에 용해한 후, 배양 배지에 첨가하여 100μM의 보존 용액을 만든다.
두 환자의 말초혈(peripheral blood)에서 인간 골수(bone marrow) 세포를 수득하여 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 배양한다. 전기 배양물을Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi또는 상동 핵산을 포함하는 개체로 오염시키고 37℃에서 하룻밤 배양하여 세균 감염을 확립한다.
대조군 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액들을 전기 오염된 배양물에 첨가하고 세균 성장을 모니터링한다. 배양물과 올리고뉴클레오티드를 10시간 동안 배양한 후, 전기 대조군 및 실험군 배양물로부터의 표본들을 취하여서, 당업계에 잘 알려진 표준 미생물학적 방법들을 사용하여 전기 표적 세균 유전자의 번역에 대하여 분석하였다. 전기 표적Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi또는 상동 핵산을 포함하는 개체 유전자는 전기 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리한 대조군 배양물에서는 번역되는 것으로 나타나지만, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 실험군 배양물에서는 전기 표적 유전자 번역이 검출되지 않거나 감소한다.
실시예 47: 감염을 치료하기위한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi또는 상동 핵산을 포함하는 개체에 감염된 환자를 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드 시료로 처치한다. 전기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 어떤 약학적으로 허용가능한 담체 내에서 전기 표적 핵산의 전사 또는 번역을 저해하는데 유효한 농도로 제공된다. 본 환자에, 혈액에서 약 0.1-100μM의 농도가 되기에 충분한 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 처치한다. 1주일의 기간동안 전기 환자가 이 농도를 유지하도록 환자에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 매일 주사한다. 그 주의 마지막 날 혈액 시료를 채취하고 당업계에 잘 알려진 표준적 방법들을 사용하여 전기 개체의 존재 유무를 분석한다.Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi또는 상동 핵산을 포함하는 개체의 존재에 대한 검출가능한 증거가 없을 경우 전기 치료를 종결한다.
실시예 48: 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드의 제조 및 이용
본 발명의 증식에 필요한 핵산, 상동 암호화 핵산, 상동 안티센스 핵산의 서열을 분석하여, 유전자 발현을 저해하기 위한 삼중 나선에 기초한 전략에 사용할 수 있는 10합체(10-mer) 내지 20합체(20-mer) 호모피리미딘 또는 호모퓨린 연쇄물(stretch)을 밝힌다. 후보 호모피리미딘 또는 호모퓨린 연쇄물을 밝힌 후, 전기 후보 서열들을 포함하는 다양한 양의 올리고뉴클레오티드를 전기 표적 유전자를 정상적으로 발현하고 있는 세균 세포 개체군에 도입하여, 전기 서열들의 유전자 발현 저해 효능을 평가한다. 전기 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드 합성기(synthesizer)로 제조되거나 또는, 주문형 올리고뉴클레오티드 합성으로 특화되어 있는 회사로부터 상업적으로 구매할 수 있다.
전기 올리고뉴클레오티드를 당업계의 숙련된 자들에게 알려진 다양한 방법들을 사용하여 세포내로 도입할 수 있는데, 그 방법들로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션, 리포좀을 매개로 한 트랜스펙션(liposome-mediated transfection), 또는 자연적 흡수가 있다.
처리된 세포들을 흡광도 측정으로 처리되지 않은 세포와 성장 수준을 비교 감시하는 등의 방법들을 사용하여 증식 감소를 모니터링한다. 그런 다음, 배양된 세포에서 유전자 발현을 효과적으로 저해하는 올리고뉴클레오티드를, 당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하여, 효과적인 것으로 나타난 투여량으로 생체내로 도입할 수 있다.
일부 실시태양에서, 전기 올리고뉴클레오티드 단위들의 자연 상태의 (베타)아노머(anomer)들을 알파 아노머로 대체하여 핵산분해효소에 좀더 저항성 있는 올리고뉴클레오티드로 만들 수 있다. 나아가, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 등의 삽입성 물질(intercalating agent)을 전기 알파 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착하여 전기 삼중 나선을 안정화할 수 있다. 삼중 나선 형성에 적합한 올리고뉴클레오티드 제조에 관한 정보는 그리핀(Griffin) 등의 Science 245:967-971(1989)에 나와있다.
실시예 49: PCR로 분리된 시료로부터 세균종 동정
다양한 세균종들을 검출하는 고전적인 세균학적 방법들은 시간이 많이 소모되고 비용이 많이 든다. 이 방법들에는, 특화된 배지내의 대상 개체로부터 분리한 세균 배양, 선별 한천 배지에서 배양 후, 8 내지 10일 또는 그이상의 기간을 거쳐 완결되는 일련의 확인 분석이 포함된다. 본 발명의 전기 확인된 서열들은 어떤 표본내에 존재하는 특정 세균종을 검출하고 동정하는데 필요한 시간을 놀라울 정도로 감소시키는 방법을 제공한다.
한가지 예시적인 방법으로, 세균을 보강 배지(enriched media)에서 배양하고, 통상적인 방법으로 혈액, 소변, 대변(stool), 타액(saliva) 또는 중추신경계액 (central nervous system fluid) 등의 시료로부터 DNA 표본을 채취한다. 그 후, 각 미생물종들에 유일한 밝혀진 서열들에 기초하여 제조한 PCR 프라이머 단을 이용하여, 실시예 12에 따라 전기 시료로부터 대략 100 내지 200개 뉴클레오티드 길이의 DNA를 증폭한다. 각 쌍의 PCR 프라이머들에 대하여 개별적인 PCR 반응을 구성하고, 전기 PCR 반응이 완결된 후, 전기 반응 혼합물에 PCR 산물이 존재하는지 분석한다. 다양한 시험 PCR 반응 튜브내 PCR 산물의 존재 유무로, 전기 PCR 프라이머쌍이 속한 종의 세균이 존재하는지를 결정한다.
전기 PCR 반응을 이용하여 전기 채취한 표본에 다양한 세균종이 존재하는지 분석할 수 있으나, 서던 블랏 혼성화 등의 기타의 분석법들 또한 고려된다.
증식에 필요한 유전자 산물의 양을 감소시키거나 활성을 저해하는 화합물을 동정하여 합리적인 약물을 고안할 수 있다. 이러한 방법은 여기에서 언급되는 증식에 필요한 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다. 이러한 방법들에서, 전기 유전자 산물의 구조는 x-선 결정학, NMR, 또는 컴퓨터 모델링 등의 방법으로 결정할 수 있다. 화합물들을 탐색하여 전기 유전자 산물과 상호작용 할 수 있는 구조를 가지는 것들을 동정할 수있다. 일부 실시태양에서는, 전기 화합물을 탐색하여 전기 유전자 산물의 그 활성에 중요한 영역과 상호작용할 수 있도록하는 구조를 가지는 것들을 밝혀낼 수 있다. 예를들어, 전기 화합물을 탐색하여, 전기 유전자 산물의 활성을 저해하는 활성 영역(active site)에 결합하도록 하는 구조를 가지는 것들을 동정할 수 있다. 예를들어, 전기 화합물은 전기 활성영역에 높은 친화도로 결합하여 유전자 산물이 그 본래의 기질에 결합하는 것을 막는 자살 기질(suicide substrate)일 수도 있다. 다르게는, 전기 화합물이 다른 생물학적 분자들과 복합체를 형성하는데 포함되는 유전자 산물의 영역에 결합할 수도 있다. 이러한 관점에서 전기 유전자 산물의 활성은 전기 유전자 산물과 전기 복합체의 다른 구성원들간의 결합을 차단함으로써 저해된다.
따라서, 본 발명의 한가지 실시태양은 본 발명의 전기 유전자 산물의 결정 및/또는 약물-탐색 분석법에서 전기 결정으로부터 수득되는 3차원 좌표를 포함하는 데이타 집합을 사용하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 전기 방법들에 의하여 밝혀진 작용제(조절자 또는 약물)를 포함하며, 본발명의 어떤 방법에의하여 동정된 작용제(조절자 또는 약물)을 사용하는 방법에 따라 필수 유전자 산물의 양을 조절하거나 활성을 저해한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 전기 유전자 산물 또는 그 부분을 포함하는 결정들을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 전기 증식에 필요한 폴리펩티드의 3차원 구조는 x-선 결정학이나 NMR을 사용하여 결정된다. 전기 결정된 구조의 좌표들은 전기 암호화된 폴리펩티드에 결합하는 및/또는 그의 양 이나 활성을 조절하는 화합물들을 동정하는 컴퓨터 보조 모델링 프로그램에 사용된다. 전기 방법은 다음의 단계를 포함한다; 1) 분석할 전기 암호화된 재조합(또는 내인성의) 폴리펩티드의 고순도 결정 제조; 2) 전기 폴리펩티드의 3차원 구조 결정; 및, 3) 전기 폴리펩티드와 화합물의 구조간 분자수준의 상호작용을 분석하기위한 컴퓨터 보조 "도킹(docking)" 프로그램의 사용(예, 약물 탐색).
전기 단계의 각각을 수행하기위한 일반적인 방법은 아래에 기술되어있고 당업계의 숙련된 자들에게 잘 알려져잇다. 여기에서 기술되는 것들을 포함하여 당업계의 숙련된 자에게 알려진 어떤 방법을 각각의 동정된 필수 유전자 산물에 대한 3차원 구조의 형성이나 그것의 약물 탐색 분석에서의 사용 등에 채택할 수 있다.
전기 증식에 필요한 유전자 산물의 결정은 다음과 같이 수득할 수 있다. 어떤 조건하에서, 분자들은 용액으로부터 전기 결정체 배열의 최소 반복 부피인 단위 셀(cell)로 정의되는 고도로 정렬된 결정체 격자로 압축되어진다. 이러한 셀의 내용물은 다른 어떤 전자기(electromagnetic) 및 소입자 파동(particle wave)(X-TJS 중성자 빔, 전자빔 등)과 상호작용할 수 있다. 전기 격자의 대칭성 때문에, 전기 회절된 파동 상호작용으로 회절 패턴이 생성된다. 전기 회절 패턴을 측정함으로써, 결정학자들은 전기 결정 내에서 원자들의 3차원적 구조를 재형성할 수 있다.
하기에 제시된 것을 포함하여 당업계에 숙련된 자에게 알려진 어떤 방법을 채택하여 고순도 결정을 제조할 수 있다. 예를들어, 전기 동정된 필수 유전자의 산물의 결정은 배치(batch) 결정화, 증기 확산(vapor diffusion)(떨어진 방울(sitting drop)이나 매달린 방울(haning drop)중 하나)을 포함하는 많은 방법들 및 미세투석 등에의하여 확대시킬수 있다. x-선 품질의 결정을 수득하기위하여 몇몇 보기에서 전기 결정을 접종하는 것이 필요하다. 결정들을 표준 미세 및/또는 거대 접종하는 것이 사용될 수 있다. 아래에 예시된 것은 전기 매달린 방울의 증기 확산 방법이다. 20 mM Tris, pH=8.0, 100 mM NaCl 내의 어떤 표준 유전자 산물(2.5 ㎕, 10㎎/㎖)의 매달린 방울(hanging drop)을 2.7-3.2 M 소디움 포메이트(Sodium formate) 및 100 mM Tris 버퍼, pH=8.0을 포함하는 동일 부피의 저장(reservoir) 버퍼와 혼합한 후, 4 ℃에 보관하였다. 1-2일 후에 거대한 단일 결정으로 나타나기 시작하고 2-3주 내에 최대 크기(0,3 X 0.3 X 0.15 mm3)로 자라난다. 3.5M 소디움포메이트, 100 mM Tris 버퍼, pH=8.0에서 결정을 수확하여3.5M 소디움포메이트, 100 mM Tris 버퍼, pH=8.0, 10%(w/v) 수크로즈 및 10%(v/v) 에틸렌 글리콜로 항냉동처리한 후 액체 프로판에서 순간 동결(flash freezing) 시킨다. 일부 실시태양에서, 전기 결정을 미국특허 제 5,869,604에서 기술된 방법을 사용하여 수득할 수도 있다. 전기 방법은 다음을 포함한다: (a) 비결정화된 폴리펩티드를 포함하는 혼합물을 전기 폴리펩티드와 적어도 90.4%의 영역 격자 맞춤(areal lattice match)를 가지는 외인성 응집 작용제(exogeneous nucleation agent)와 접촉; (b) 전기 폴리펩티드를 결정화시켜서 적어도 하나의 응집 작용제에 부착된 전기 폴리펩티드의 결정 (고순도의 부착된 결정) 및 적어도 하나의 응집 작용제에 부착되지 않은 폴리펩티드 결정(비부착된 결정은 부착된 결정에 비해 낮은 순도)을 형성; (c) 전기 응집 작용제에 비부착된 결정으로부터 전기 응집 작용제에 부착된 결정의 분리. 전기 결정화된 폴리펩티드는 다음의 단계에 의하여 오염물로부터 정제될 수 있다: (a) 비결정화된 폴리펩티드를 포함하는 혼합물을 전기 폴리펩티드와 적어도 90.4%의 영역 격자 맞춤(areal lattice match)을 가지는 외인성 응집 작용제와 접촉; (b) 전기 폴리펩티드를 결정화시켜서 적어도 하나의 응집 작용제에 부착된 전기 폴리펩티드의 결정 (고순도의 부착된 결정) 및 적어도 하나의 응집 작용제에 부착되지 않은 폴리펩티드 결정(비부착된 결정은 부착된 결정에 비해 낮은 순도)를 형성; (c) 전기 응집 작용제에 비부착된 결정으로부터 전기 응집 작용제에 부착된 결정의 분리.
본 발명의 어떤 결정이 커지게되면, 당업계의 숙련된 자에게 친숙한 방법으로 x-선 회절 데이타를 수집할 수 있다. 그러므로 본 기술을 가지는 단백질 결정학에 숙련된 사람이면 누구나 과도한 시행착오 없이 다양한 서로 다른 개체로부터의 전기 필수 유전자 산물 또는 그들의 아미노산 서열에 보존적 치환을 가지는 폴리펩티드의 수많은 서로 다른 형태를 결정화 할 수 있다.
결정 격자(crystal lattice)는 그 단위 셀(cell)과 전기 단위 셀이 포함하는 어떤 구조적 모티프(motif)의 대칭성(symmetry)으로 정의된다. 예를들어, 하나의 임의의 결정 격자에 대하여 230 가지의 가능한 대칭 그룹이 있으며, 전기 결정 격자 그룹의 단위 셀은 전기 격자를 구성하는 분자들에 의존하는 임의의 크기를 가질 수 있다. 그러나, 생물학적 거대분자들은 비대칭의 중심을 가지며 230 가지 대칭 그룹중 65개에 제한된다(참조: 캔터 et al., 1980, Biophysical Chemistry, Vol. Ⅲ, W.H. Freeman & Company).
한 결정 격자는 각각 전기 단위 셀내의 원자들사이의 공간에 따라 같은 크기 순서의 파장을 가지는 X-선, 전자빔 등의 전자기(electromagnetic) 또는 미립자 파동(particle wave)과 상호작용한다. 전기 회절된 파동들을 결정에 인접하게 위치하는 검출 표면 상의 점들의 배열로 측정할 수 있다. 각 점은 삼차원 위치, hkl, 및 강도(intensity), I(hkl)을 가지며, 이들 둘다 전자 밀도 식(Electron Density Equation)이라 불리는 결정의 삼차원 전자 밀도를 재형성 할 수 있다. 전기 단위 셀의 삼차원 전자 밀도 인 전자 밀도 식은 구조적 인자들의 Fourier의 변형이다. 따라서, 이론에 따라 전기 검출 공간 내의 충분한 수의 점들에 대하여 전기 구조적 인자들이 알려지면, 전기 단위 셀의 삼차원 전자 밀도를 전자 밀도 식을 이용하여 계산할 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 증식에 필요한 어떤 유전자 산물 또는 그 부분의 결정의 이미지를 미국특허 제 5,353,236에서 기술된 바대로 디지탈 컴퓨터와 결정 회절 패턴(crystal diffraction pattern)의 도움으로 수득할 수 있다. 전기 회절 패턴은 각각이 관련된 해상도(associated resolution)를 가지는 복수의 반사(reflection)를 포함한다. 전기 이미지를 다음의 방법으로 수득한다: (a) 전기 결정의 회절 패턴의 컴퓨터 사용가능한 표준화된 크기로의 전환, 전기 패턴은 회절분석계(diffractometor)로 측정; (b) 전기 회절 패턴으로부터 전기 결정의 어떤 단위 셀의 크기 결정; (c) 결정내의 전기 유전자 산물 또는 그 부분으로 채워지는 전기 단위 셀의 영역을 밝히는 외피(envelope)의 제공; (d) 전기 외피내의 스캐터링 바디(scattering bodies)의 수집과 분류, 다양하게 정렬되는 스캐터링 바디들의 수집, 각각은 Fourier 크기(Amplitude)의 연관된 패턴을 보임; (e) 전기 스캐터링 바디들의 수집에 대한 Fourier 크기(Amplitude)패턴과 어떤 회절 패턴 사이의 높은 연관성을 야기하는 압축된 배열로 전기 스캐터링 바디를 수집하여 압축(condense)하는 단계; (f) 전기 압축된 배열의 흩어진 인자로부터의 전기 회절 패턴의 반사중 적어도 하나와 연관되는 전기 현상(phase)의 결정; (g) 방법 f에서 결정된 전기 현상으로부터 전기 단위 셀내에서의 전기 유전자 산물 또는 그 부분의 전자 밀도 분포(electron density distribution)의 계산; 및 (h) 전기 전자 밀도 분포로부터 형성되는 전기 유전자 산물 또는 그부분의 도면 이미지(graphical image)를 나타냄.
증식에 필요한 전기 유전자 산물의 결정들은 미국특허 제 6,156,526에 기술된 등의 약물 탐색 방법에 사용될 수 있다. 간단하게 말해서, 이러한 방법들에서 전기 유전자 산물 또는 그 부분들을 포함하는 어떤 복합체의 형성을 저해하는 화합물을 동정한다. 전기 관심대상 유전자 산물이나 그 부분들을 포함하는 복합체의 삼차원 구조를 밝히는 원자 좌표(atomic coordinate)의 집합을 결정한다. 전기 유전자 산물 또는 그부분에 결합하여 복합체를 형성하는 유력한 화합물을 전기 수득한 원자 좌표를 이용하여 선택한다. 전기 화합물을 전기 유력한 화합물이 없을 때는 복합체를 형성할 수 있는 조건에서 전기 유전자 산물이나 그 부분들 및 그들의 결합 파트너들에 접촉시킨다. 전이 유전자 산물이나 그 부분들의 그들의 결합 파트너에 대한 결합 친화도를 결정하고 전기 복합체의 형성을 저해하여 전기 유전자 산물이나 그 부분들의 그들의 결합파트너에 대한 전기 결합 친화도가 감소하는 화합물로 유력한 화합물을 동정한다.
본 발명의 일부 실시예에서 전기 필수 유전자 산물의 삼차원 구조를 결정하고 컴퓨터 모델링을 통하여 유력한 작용제(agonist) 및/또는 길항제(antagonist)를 고안한다(참조: 버그 et al., 1993, Scientific American, Dec.:92-98; 베스트 et al., 1995, TIPS, 16:67-74; 던브락 et al., 1997, Folding & Design, 2:27-42).
다음을 포함하는 하나 또는 그이상의 컴퓨터 프로그램들로 컴퓨터 분석을 수행할 수 있다: QUANTA, CHARMM, INSIGHT, SYBYL, MACROMODEL 및 ICM(참조: 던브락 et al., 1997, Folding & Design, 2:27-42). 이러한 면에서 더 나아간 본 발명의 실시태양에서 어떤 초기 약물 탐색 분석은 선호적으로 도킹(docking) 컴퓨터 프로그램에 따라 수득한 전기 삼차원 구조를 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 컴퓨터모델링은 FlexX, DOC, GRAM 및 AUTO DOCK 등의 하나 또는 그이상의 도킹 프로그램으로 수행한다(참조: 던브락 et al., 1997, Folding & Design, 2:27-42).
여기에서 제공되는 각각의 약물 탐색 방법은 전기 선별을 최적화하기 위하여 전기 단계중 모두 또는 어떤 단계를 반복적으로 수행 할 수 있다. 본 발명의 전기 약물 탐색 분석은 어떤 필수 유전자 산물과 어떤 작용제 또는 약물사이의 관계를 결정하기 위하여 다수의 수단중 어느 것이나 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, NMR에 기초한 방법론을 통하여 본 발명의 어떤 필수 유전자에 결합하는 약물을 특별히 고안할 수 있다(참조: 슈커 et al., 1996, Science 274:1531-1534). NMR 분광(spectra)은 바그비 et al., Cell 82:857-867(1995)에서 기술된 바대로 분석되는 pulsed field gradient triple resonance probe를 갖춘 Varian Unity Plus 500 및 unity 600 분광계 등의 당업계에 숙련된 자에게 친숙한 장비를 이용하여 기록할 수 있다. 민감도 증가(참조: 무한디람 안 케이., 1994, J.Magn.Reson., 103:203-216) 와 최소 H2O 포화(참조: 케이 et al., 1994, J.Magn.Reson., 109:129-133)를 제외하고 전기 기술된 바와 유사한 3중 공명(resonance) 실험(참조: 바그비 et al., 1994a, Biochemistry, 33:2409-2421)으로1H,.15N, 및.13C 원자 주쇄(backbone)의 순차적인 공명 할당(resonance asignment)을 기록할수 있다.1H,. 및13C의 측쇄는 용액내의 혼합 시간이 8ms 및 16ms인 HCCH-TOCSY(참조: 백스 et al., 1990, J.Magn. Reson., 87:620-627) 실험으로 정해지며 구조 계산 포함은 필요하지않다. 2차원1H--1H NOE 분광학(spectroscopy)(NOESY)의 Nuclear Overhauser effect(NOE) 교차 정점(cross peaks), 3차원 15N-edited NOESY-HSQC(참조: 장 et al., 1994, J.Biomol, NMR, 4:845-858) 및 동시 획득15N/13C-edited NOE(참조: 파스칼 et al., 1994, J.Magn.Reson., 103:197-201) 분광은 100ms NOE 혼합 시간으로 수득할 수 있다. 표준 위-원자 거리 정정(standard pseudoatom distance corrections)(참조: 우스리치 et al., 1983, J. Mol. Biol., 169:949-961)를 통합하여 중심 평균(center averaging)을 설명할 수 있다. 추가적인 0.5.ANG.fmf 메틸 그룹을 포함하는 거리(distance)에 대한 상한선에 첨가될 수 있다(참조: 반거 et al., 1987, J.Mol.Biol., 196:611-639; 클로어 et al., 1987, Biochemistry, 26:8012-8023).
전기 구조는 전기 기술된 전략(참조: 바그비 et al., 1994b, Structure. 2:107-122)을 사용하는 X-PLOR(참조: 브룬거, 1993, X-PLOR Manual, Version 3.1, New Haven, Conn.: Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University) 내의 모의 어닐링 방법(simulated annealing protocol)(참조: 닐지스 et al., 1991, In computational Aspects of the Study of Biological Macromolecules by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, J. C. Hoch, F. M. Poulsen, and C. Redrield, eds., New York: Plenum Press, pp.451-455)을 사용하여 계산할 수 있다. 나선간 앤지(anges)는 얍 케이(K. Yap)에의해 기술된 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다. 접근 용이한 표면 영역은 Prof.J. Thornton,University College, London. 으로부터 활용가능한 전기 프로그램 Naccess를 사용하여 계산하였다.
미국특허 제 6,077,682에 기술된 방법을 사용하여, 세포 증식에 필요한 유전자 산물의 양이나 활성을 감소시킬수 있는 화합물들을 동정할 수 있다. 간단하게 말해서, 전기 유전자 산물이나 그부분의 3차원 구조를 다음의 단계를 포함하는 약물 탐색 분석에 사용할 수 있다: (a) 컴퓨터 모델링과 연계하여 전기 유전자 산물이나 그 부분의 하나 또는 그 이상의 원자 좌표 집합(sets)으로부터 결정되는 전기 3차원 구조를 가지는 합리적인 약물 고안을 수행하여 유력한 약물의 선별; (b) 전기 유력한 약물을 전기 유전자 산물도는 그 부분을 포함하는 폴리펩티드에 접촉, 및 (c) 전기 폴리펩티드와 전기 유력한 약물의 결합 검출; 이때, 전기 유력한 약물이 전기 폴리펩티드에 결합하면 그것을 약물로 선택한다. 일부 방법에서, 전기 유전자 산물 또는 그 부분의 3차원 구조는 다음을 포함하는 약물 선택 분석에 사용된다: (a) 전기 유전자 산물이나 그 부분의 하나 또는 그 이상의 원자 좌표 집합(sets)으로부터 결정되는 전기 3차원 구조를 가지는 합리적인 약물 고안을 수행하여 유력한 약물을 선별, 이때 전기 선별은 컴퓨터 모델링과 연계하여 수행; (b) 전기 유력한 약물을 전기 유전자 산물의 기질 존재 하에서 전기 유전자 산물 또는 그 부분을 포함하는 폴리펩티드에 접촉, 및 (c) 전기 유전자 산물이 전기 기질에 기능하는 정도를 결정; 이때, 전기 유력한 약물의 부재시에 비하여 존재시, 전기 기질에 대한 유전자 산물의 기능이 저하될 때 약물로 선발. 일부 실시태양에서, 전기 방법은 추가적으로 다음을 포함할 수 있다: (d) NMR 분석을 위하여 전기유전자 산물 또는 그 부분에 전기 유력한 약물을 접촉; 이때, NMR 분석을 위하여 전기 유력한 약물과 전기 유전자 산물 또는 그 부분의 결합 복합체가 형성되며; NMR 분석을 위하여 전기 유력한 약물과 전기 유전자 산물 또는 그 부분은 보존된 아미노산 치환을 포함한다; (e) NMR에의한 전기 결합 복합체의 3차원 구조 결정; 및 (f) 전기 결합 복합체에 대하여 결정되는 3차원 구조를 가지는 구조에 기초한 합리적 약물 고안(rational drug design)을 수행하여 후보 약물 선별; 이때, 전기 선별은 컴퓨터 모델링과 연계하여 수행, (g) 전기 후보 약물을 전기 유전자 산물 또는 그부분의 기질 존재하에서 전기 유전자 산물 또는 그 부분을 포함하는 두번째 폴리펩티드에 접촉; 이때, 전기 후보 약물이 존재하지 않으면 전기 두번째 폴리펩티드는 전기 기질에 기능함; 및 (h) 전기 기질에 대하여 전기 두번째 폴리펩티드가 기능하는 양을 결정; 이때, 전기 후보 약물이 존재할 때, 부재시에 비하여 전기 두번째 폴리펩티드가 기능하는 양이 감소할 때 어떤 약물이 선택된다.
어떤 필수 유전자 산물을 포함하는 결정의 3차원 구조가 결정되면, 유력한 조인절자(modulator)를 동정하기 위하여, FlexX, GRAM, DOCK, 또는 AUTODOCK 등의 도킹 프로그램을 사용하여 컴퓨터 모델링으로 그 활성의 어떤 유력한 조절인자를 시험해 볼 수 있다. 이 방법은 전기 폴리펩티드 또는 그 절편들에 대한 유력한 조절인자 등의 컴퓨터 피팅(fitting)을 포함하므로, 전기 유력한 조절인자의 모양과 화학적 구조가 얼마나 잘 결합할 지를 조사할 수 있다. 컴퓨터 프로그램들을 채택하여 전기 두 결합 파트너의 인력(attraction), 척력(repulsion), 입체 장애(steric hinderance)를 평가할 수 있다. 일반적으로 단단하게 잘 들어맞을 수록, 입체 장애가 낮을수록, 인력이 강할 수록, 이러한 특징들이 강한 결합 상수와 일치하기 때문에 유력한 조절인자의 가능성은 커진다. 게다가, 어떤 유력한 약물의 고안이 특이할수록, 전기 약물은 다른 단백질과 결합하지 않을 가능성이 크다. 이것은 다른 단백질과의 원치않는 상호작용으로 인한 심각한 부작용을 최소화할 것이다.
화합물 또는 화합물 동질체는 하나 또는 그이상의 가능성있는 유력한 동질체가 동정될 때까지 조직적으로 변형될 수 있다. 덧붙여, 선택된 동질체의 조직적 변형 또한 컴퓨터 모델링을 사용하여 하나 또는 그 이상의 유력한 동질체가 동정될 때까지 조직적으로 변형될 수 있다. 이러한 분석은 HIV 단백질분해효소 저해체를 개발하는데 효과적으로 알려져 왔다(참조: 램 et al., 1994, Science 263:380-384; 울로다버 et al., 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585; 아펠트, 1993, Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48; 에릭손. 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128). 이러한 방식으로 선별된 펩티드를 전기 기술된 컴퓨터 모델링 프로그램으로 조직적으로 변형하여 어떤 구조 동질체에 대하여 유사하게 처치할 수 있다.
실시예 45는 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 구조에 대한 컴퓨터 모델링을 기술한다.
실시예50: 컴퓨터 모델링을 사용한 전기 증식에 필요한 유전자 산물의 구조 결정
다음과 같이 전기 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 이용하는 전기Staphylococcus aureus의 증식에 필요한 유전자 산물의 일부에 컴퓨터 모델링 방법을 적용하여 3차원 구조를 형성하였다. SYBYL에대한 BIOPOLYMER 모듈내의 Tripos Associates에의해 제공되는 Sir Tom Blundell의 프로그램인 COMPOSER를 전기 모델 형성에 사용하였다. 부합형성기(Matchmaker)에서 이행되는 Skolnik의 방법인 위상 핑거프린팅(topology fingerprinting)의 방법을 사용하여 전기 평균 변이 자유 에너지 점수(average mutation free energy)를 기록하였다. 이 숫자는 볼츠만(Boltzmans, kT의 단위)내에 있으므로 음성이어야 하며, 음성일수록 더 좋은 모델이다.
Composer는 중요한 정렬들을 발견하기 위하여 뒤섞인 니들만 분치(Needleman Wunch) 정렬을 사용한다. 전기 보고된 변수들은 뒤섞인 것(the jumbling)들로부터 측정되는 백분율 동질성(identity)와 중요도(significance)이다. 30% 동일하고 규모면에서 4 이상의 중요도를 가지는 이러한 쌍들은 주형을 형성하는 모델로서 좋은 후보물질들로 판단된다. 이러한 기준에 맞는 3차원 구조가 없다면, 가장 최근의 PDB 서열 데이타베이스에 대하여 BLAST 탐색을 수행한다. 이러한 방식으로 발견되는 어떤 중요한 적중물을 바이너리(binary) 단백질 데이타베이스에 첨가하고 전기 후보물질 탐색을 반복한다.
다음 국면에서, Composer는 구조적으로 보존되고, 구조적으로 다양한 영역을 결정하고 주형구조를 형성하여 전기 다양한 루프(loop)의 구조에 대하여 전기 데이타 베이스를 탐색한다. 이것들을 통합하여 전기 단백질의 모델을 수득하였다. 정할 수 없는(unassignable) 어떤 루프들(다양한 영역들)은 수동으로 형성되었고 다이나믹스의 조합(combination of dynamics)을 사용하여 세밀화(refinement)하였다.
전기 구조가 세밀화된 후, 수소 원자가 첨가되고 불활성 응집물이 정의되었다. 암버 올 아톰(AMBER ALL-ATOM) 및 쿨만(Kollman) 전하를 사용하여 1000pS의 다이나믹스(dynamics)를 수행하였다. 다음으로 5000 최대 하강 단계(steepest decent steps)까지의 최소화 반복(minimization cycle)을 수행한 후 전기 응집물을 녹여고 전기 과정을 전체 단백질에 대하여 반복하였다.
전기 결과적인 구조는 부합형성기(MATCHMAKER)에서 검정하였다. 경험적으로 도출된 단백질의 위상으로부터 결정되는 전기 위상적으로 조사된 자유에너지(topologicaly scanned free energy)를 계산하여 볼츠만(Boltzmans)으로 알려진 평균 에너지/잔기(average energy/residue)를 기록하였다. 이 숫자는 자유에너지를 나타내므로, 음성일수록 더 선호적이게 된다.
전기Staphylococcus aureus의 증식에 필요한 66개의 단백질을 전기와 같이 표본화하였다. 이에 대하여 부합형성기 에너지를 계산하였다. 분류목록에 따라 형성된 전기 표본들의 분류는 아래의 표에 나타내었다.
표 1:kt로 나타내어지는 부합형성기 에너지로 구축된 모델의 분포
분류 모델의 갯수 평균 부합형성기 에너지
아실라제 1 -0.10
디하이드로지나제 3 -0.12
DNA 관련 3 -0.12
열충격 단백질 2 -0.16
하이드롤라제 3 -0.16
아이소머라제 1 0.05
리가제 7 -0.07
라이아제 1 -0.09
막 고정 1 -0.12
Misc 18 -0.21
옥소리덕타제 6 -0.09
프로티아제 1 -0.03
리보솜 3 -0.11
신사제 4 -0.14
트랜스퍼라제 6 -0.12
전기 방법의 타당성을 FtsZ를 사용하여 확인하였다. FtsZ의 경우에 자네치 엠(M.Janeschi)으로부터 결정구조의 활용이 가능하다. 전기 모델링을 통하여 결정되는 전반적인 구조적 면들에 대한 조사는 x-선 결정에의하여 결정되는 구조에 비해 몇몇 사소한 차이가 있긴하지만 정확한 장소에서 모든 폴드(fold)를 보여준다.
실시예51: 기능적 상보
다른 실시태양에서Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli또는Salmonella typhi로부터 수득한 증식에 필요한 유전자 산물이나 유사 한 폴리펩타이드에 의하여 그 활성이 상보되는 유전자 산물들은, 전기 필수 유전자에 변이를 가져서 전기 유전자 산물의 활성이 감소되거나 제거된 개체에 플라스미드나 세균위염색체(bacterial artificial chromosome)을 도입하여 생성되는부분이배체(merodiploids)를 사용하여 동정된다. 일부 실시태양에서, 전기 플라스미드나 세균위염색체 상의 유전자에 의한 상보가 없는 상태에서 , 전기 변이는 허용온도에서는 개체가 증식하지만, 비허용온도에서는 개체가 증식할수 없는 온도민감 변이 등의 조건 변이일 수 있다. 다르게는, 로스 et al. (1987) Biosynthesis of Aromatic Amino Acid in Escherichia coli and Salmonella typimurium, F.C. Nerdhardt, ed., American Society for Microbilolgy, publisher, pp. 2269-2270에 기술된 바대로 복제물들을 생성해낼 수 있다.
표 Ⅷ은 여기에서 언급되는 전기 뉴클레오티드 서열의 서열번호와 이 뉴클레오티드에의하여 암호화되는 전기 폴리펩티드의 서열번호에 대한 교차 참조(cross reference)를 제공한다.
표 VIII:
표 I A:
표 I B:
표 I C:

Claims (44)

  1. 서열번호 8 내지 3795의 뉴클레오티드 서열 중 하나를 필수적으로 포함하며, 발현되어 세포의 증식을 저해하는 기능을 가지는 정제되거나 분리된 핵산서열.
  2. 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 뉴클레오티드 서열의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 50개 및 50개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 절편들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 절편을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
  3. 서열번호 8 내지 3795 중 하나의 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 증식에 필요한 유전자를 포함하는 오페론에 존재하는 유전자내 서열(intragenic sequence), 유전자간 서열(intergenic sequence), 둘 또는 그 이상의 유전자의 적어도 일부분에 걸쳐있는(spanning) 서열, 5' 비암호화 영역 또는 3' 비암호화 영역의 적어도 일부분에 상보적인 핵산서열을 포함하는 정제되거나 분리된 안티센스 핵산.
  4. 기본매개 변수(default parameter)를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795의 서열, 서열번호 8 내지 3795의 서열 중 적어도 25개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 절편, 서열번호 8 내지 3795의 서열에 상보적인 서열 및 서열번호 8 내지 3795의 적어도 25개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 상보적인 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
  5. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
  6. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드, 또는 전기 폴리펩티드 중 하나의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 절편으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 절편을 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩티드.
  7. 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 폴리펩티드 또는 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 절편과 적어도 25%의 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩티드.
  8. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 세포 안으로 도입시키는 단계 및 전기 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  9. 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계, 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 또는 그 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 미생물의 증식을 저해하는 방법.
  10. 다음의 각 단계를 포함하는, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 유전자 산물을 후보 화합물(candidate compound)과 접촉시키는 단계; 및,
    (b) 전기 화합물이 전기 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는지를 결정하는 단계.
  11. 다음의 각 단계를 포함하는, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 산물을 포함하는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물 또는 핵산을 동정하는 방법:
    (a) 전기 유전자 산물을 암호화하는 표적 유전자 또는 RNA를 후보 화합물 또는 핵산과 접촉시키는 단계; 및,
    (b) 전기 표적 유전자의 활성을 측정하는 단계.
  12. 다음의 각 단계를 포함하는, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 세포증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 핵산에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 핵산의 준치사량(sub-lethal level)을 세포에서 발현시켜 전기 세포내의 전기 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킴으로써, 감작(sensitized)세포를 생산하는 단계;
    (b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계.
  13. 활성 또는 발현이 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 저해되는 유전자에 대하여 활성을 가지는 화합물, 또는 전기 유전자의 산물에 대한 활성을 가지는 화합물을 전기 유전자를 발현하는 세포 개체군(population) 내로 도입하는 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 방법.
  14. 약학적으로 허용가능한 담체 내에 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산 또는 그 증식억제 부위를 유효농도로 포함하는 조성물.
  15. 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 오페론 내 적어도 하나의 유전자의 활성 또는 발현이 저해되는 오페론에 있어서, 세포 개체군내의 세포를 전기 오페론의 적어도 한 부분과 상보적인 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 오페론 내의 유전자 활성 또는 발현을 저해하는 방법.
  16. 다음의 각 단계를 포함하는 세포증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법:
    (a) 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 핵산과 전기 핵산을 수득한 미생물이 아닌 다른 미생물을 접촉시키는 단계;
    (b) 전기 핵산이 전기 미생물의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계; 및,
    (c) 전기 미생물에서, 전기 핵산 또는 그의 일부분과 상보적인 mRNA를 암호화하는 유전자를 동정하는 단계.
  17. 다음의 각 단계를 포함하는, 미생물의 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성 또는 발현량이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물의 상동체를 전기 핵산을 수득한 세포가 아닌 다른 세포에서 동정하는 단계;
    (b) 전기 세포에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해 핵산서열을 동정하는 단계;
    (c) 전기 세포를 준치사량의 전기 저해 핵산과 접촉시킴으로써, 전기 세포를 감작시키는 단계;
    (d) 전기 단계 (c)에서 감작된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (e) 전기 화합물이 전기 감작세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계.
  18. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 세포의 증식을 저해하는 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포를 준치사량의 전기 핵산 또는 그의 일부분과 접촉시킴으로써, 전기 세포를 감작시키는 단계;
    (b) 전기 단계 (a)의 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계.
  19. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로(pathway)에 대하여 활성을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산의 준치사량을 세포 내에서 발현시킴으로써, 전기 세포를 감작시키는 단계;
    (b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계.
  20. 다음의 각 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 작용제(agent)와 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 전기 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 접촉된 세포의 증식을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계.
  21. 다음의 각 단계를 포함하는, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물을 포함하는 증식에 필요한 유전자 또는 그 유전자 산물이 작용하는 생물학적 경로를 밝혀내는 방법:
    (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시키는 단계;
    (b) 전기 세포를 작용하는 생물학적 경로가 알려져 있고, 미생물의 성장 또는 증식을 저해하는 것으로 알려진 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 세포의 증식정도를 전기 화합물과 접촉되지 않은 세포의 증식정도와 비교하여 결정하는 단계.
  22. 다음의 각 단계를 포함하는, 시험 화합물(test compound)이 작용하는 생물학적 경로를 결정하는 방법:
    (a) 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되며, 작용하는 생물학적 경로가 알려져 있는 증식에 필요한 핵산에 상보적인 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시키는 단계;
    (b) 전기 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 세포의 증식정도를 전기 화합물과 접촉되지 않은 세포의 증식정도와 비교하여 결정하는 단계.
  23. 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
  24. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물과 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물.
  25. 서열번호 8 내지 3795 중 하나를 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물.
  26. 하나 이상의 후보 화합물을 탐색하여, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 산물을 포함하는 증식에 필요한 유전자의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 단계; 및, 동정된 전기 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 항생제를 제조하는 방법.
  27. 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 서열, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 서열 중 적어도 25개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 절편, 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 서열에 상보적인 서열 및 서열번호 3796 내지 3800, 3806 내지 4860, 5916 내지 10012의 적어도 25개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 절편에 상보적인 서열들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
  28. 세포 내에서, 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건(stringent condition)에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건(moderate condition)에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물의 활성을 저해하거나 양을 감소시키는 단계 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 양을 감소시키는 단계를 포함하는 세포의 증식을 저해하는 방법.
  29. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식에 필요한 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 후보 화합물을, 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 전기 후보 화합물이 전기 유전자 산물의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 단계.
  30. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물 또는 핵산을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 또는 RNA인 표적을 제공하는 단계;
    (b) 전기 표적을 후보 화합물 또는 핵산과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 표적물의 활성을 측정하는 단계.
  31. 다음의 각 단계를 포함하는, 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시켜, 세포 내에서 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킴으로써, 감작세포를 생산하는 단계;
    (b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  32. 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 폴리펩티드와 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 산물을 발현하는 세포 개체군으로 전기 유전자 산물 또는 그를 암호화하는 유전자에 대해 억제활성을 갖는 화합물을 도입시키는 단계를 포함하는 세포증식을 저해하는 방법.
  33. 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 증식 저해 부위와 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산 , 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 및 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 안티센스 핵산을 약학적으로 허용가능한 담체 내에 유효한 농도로 포함하는 제제(preparation).
  34. 세포 개체군 내의 세포를 오페론의 적어도 하나의 증식저해 부위를 안티센스 정위(orientation)로 포함하는 안티센스 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 오페론 내의 유전자의 활성 또는 발현을 저해하는 방법.
  35. 다음의 각 단계를 포함하는, 세포의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 증식저해 부위와 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 증식 저해 부위와 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및, 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안티센스 핵산과 전기 핵산을 수득한 세포가 아닌 다른 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 전기 핵산이 전기 세포의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계;및
    (c) 전기 안티센스 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 mRNA를 암호화하는 전기 세포 내의 유전자를 동정하는 단계.
  36. 다음의 각 단계를 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및, 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안티센스 핵산에 의하여 활성 또는 발현이 저해되는 유전자 또는 유전자 산물의 상동체(homolog)를 전기 안티센스 핵산을 수득한 세포가 아닌 다른 시험세포에서 동정하는 단계;
    (b) 전기 시험세포 내에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해핵산 서열을 동정하는 단계;
    (c) 전기 시험세포를 준치사량의 전기 저해핵산과 접촉시킴으로써, 전기 시험세포를 감작시키는 단계;
    (d) 전기 단계 (c)의 감작된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (e) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 전기 안티센스 핵산을 발현하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  37. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및, 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안티센스 핵산의 준치사량을 시험세포와 접촉시킴으로써, 전기 세포를 감작시키는 단계;
    (b) 전기 단계 (a)의 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  38. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로에 대하여 활성을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시켜, 세포 내에서 전기 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킴으로써, 세포를 감작시키는 단계;
    (b) 전기 감작세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 감작세포의 성장을 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  39. 다음의 각 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 능력을 가지는 화합물을 동정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 작용제와 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 전기 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 화합물이 전기 작용제와 접촉시킨 세포의 증식을 전기 작용제에 접촉시키지 않은 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  40. 다음의 각 단계를 포함하는, 증식에 필요한 유전자 산물 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 유전자가 작용하는 생물학적 경로를 결정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 양 또는 활성을 저해하는 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시켜, 감작세포를 생산하는 단계
    (b) 전기 세포를 작용하는 생물학적 경로가 알려져 있고, 세포의 증식을 저해하는 것으로 알려진 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 시험 화합물이 전기 감작세포의 증식을 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  41. 다음의 각 단계를 포함하는, 시험 화합물이 작용하는 생물학적 경로를 결정하는 방법:
    (a) 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 증식저해 부분과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 핵산, 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및, 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 생물학적 경로가 알려진 증식에 필요한 핵산과 상보적인 안티센스 핵산의 준치사량을 세포에서 발현시킴으로써, 전기 세포를 감작시키는 단계;
    (b) 전기 세포를 전기 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및,
    (c) 전기 시험 화합물이 전기 감작세포의 증식을 전기 안티센스 핵산을 포함하지 않는 세포에 비하여 어느정도 저해하였는지를 결정하는 단계.
  42. 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물 또는 전기 유전자 산물을 암호화하는 유전자와 상호작용하여 증식을 저해하는 화합물.
  43. 하나 이상의 후보 화합물을 탐색하여, 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물을 동정하는 단계; 및 동정된 전기 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 항생제를 제조하는 방법.
  44. 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 70%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 적어도 70%의 핵산 동일성을 가지는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 기본매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t78을 사용하여 결정된, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 핵산에 의하여 발현이 저해되는 유전자 산물과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가지는 유전자 산물; 혼성화가 용이하지 않은 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 혼성화가 용이한 조건에서 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의하여 암호화되는 유전자 산물; 및, 서열번호 8 내지 3795로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산에 의하여 활성이 저해되는 유전자 산물과 상보적인 활성을 가지는 유전자 산물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 세포증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물의 유효량을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포증식을 저해하는 방법.
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