KR20010101861A - 대장균 증식을 위한 유전자 - Google Patents

Abstract

E. coli증식에 필요한 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 개시되었다. 핵산은 단백질 또는 그것의 부분의 발현, 발현된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 생산 및, 발현된 단백질로부터 합리적인 약제 발견 프로그램에서 이용될 후보 분자를 동정하기 위한 라이브러리의 생성을 위해 이용될 수 있다. 또한, 핵산은E. coli외 다른 미생물에 존재하는 증식에 필요한 유전자의 상동체의 선별 및, 발현 벡터와 분비 벡터(secretion vector)의 설계를 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산은 항미생물제 뿐만 아니라 다른 미생물의 증식 관련 유전자를 선별하기 위한 다양한 분석 시스템에서 이용될 수 있다.

Description

대장균 증식을 위한 유전자{Genes Identified as Required for Proliferation in Escherichia coli}

페니실린의 발견 이래, 세균 감염을 치료하기 위한 항생제의 이용은 수백만의 생명을 구원해왔다. 이 '기적의 약'의 도래로 인해 인류가 세균 감염의 재앙으로부터 구원되었다는 사실은 한때 또는 전 시대를 통해 일반적으로 믿어졌다. 사실 1980년대와 1990년대에 걸쳐, 많은 대형 제약회사들은 항생제 연구와 개발을 감소하거나 중단하였다. 그들은 세균에 의한 감염성 질병이 마침내 정복되었고, 신약 시장은 한계가 왔다고 믿었다. 불행하게도 이 믿음은 지나치게 낙관적인 것이었다.

이러한 경향은 약재 내성 세균에 대한 보고가 매우 빈번해짐에 따라 세균의 편으로 돌아서기 시작하고 있다. 미국의 질병퇴치센터(The United States Centers for Disease Control)는 알려진 가장 강력한 항생제 중의 하나인 밴코마이신(vancomycin)을 일반적인Staphylococcus aureus(staph) 감염을 치료하는데 이용할 수 없다고 발표했다. 이 균은 주변 환경에서 흔히 발견되고, 질병을 일으키는 많은 감염과 관련되어 있다. 이 발표의 의미는 밴코마이신이 staph같은 세균의 내성 주(strain)에 의한 감염을 치료하는데 수년 동안 이용되어 왔다는 사실로 인해 분명해졌다. 간단히 말해, 세균은 우리의 가장 강력한 항생제에 대해 내성을 갖게 된 것이다. 만약 이러한 경향이 계속된다면, 우리는 소수의 세균 감염이 치명적 질병을 일으키는 시대로 되돌아가게 될 지도 모른다.

의학 시술자들이 그들 스스로 발견한 이러한 곤경의 많은 원인들이 있다. 몇몇 내과 의사들의 과잉처방과 부적절한 처방 습관은 대중으로의 항생제 이용을 급격히 증가시키는 원인이 되어왔다. 또한, 환자들에게도 일부의 책임이 있다. 그들은 심지어 항쟁제의 적절한 처방이 요구되는 장소에서 조차도 종종 부적절하게 약을 사용하고, 그 결과 전통적인 항생제에 대해 전체적으로 또는 부분적으로 내성을 갖는 새로운 집단의 세균을 출현시켰다.

그러나, 세균성 질환을 다루는 현대 과학의 발전에도 불구하고 인류를 괴롭히는 세균의 재앙은 남아있다. 약재 내성 세균은 지금도 인류의 건강을 위협하고 있다. 세균에 의해 위협받는 건강을 위한 차세대 항생제가 요구된다.

새로운 항생제의 발견

이용되고 있는 항생제에 대해 내성을 갖는 매우 많은 세균 주들이 생겨남에 따라, 새로운 화합물이 요구되고 있다. 과거에, 약제학자들은 새롭고 안전하며 효과적인 화합물을 제공하는 전통적인 신약의 발견에 의존하여 질병을 치료해야만 했다. 전통적인 신약의 발견은 잠재적인 신약 후보 분자들의 무분별한 선별을 포함한다. 이 후보 분자들은 이들 중 어떤 하나가 어떤 질병의 치료에 효과적일지도 모른다는 희망으로 대부분 무작위적으로 선별되었다. 이 과정은 성공의 보장이 없는 힘들고 고된 일이다. 오늘날, 신약의 발견과 개발에 소모되는 평균 비용은 거의 5억 달러이고, 평균 시간은 실험실에서 환자에게 가기까지 15년이다. 이 과정의 향상은 새로운 항생제 생성에 비약적인 발전을 가져올 것이다.

신약 발견에 있어 새롭게 출현한 방법들은 무작위적인 신약 발견보다는 오히려 신약을 창조하기 위한 직접적인 접근 방법을 제공하기 위해 많은 생화학적 기술을 이용한다. 예를 들어, 생물체의 증식에 필요한 유전자 서열과 그 유전자에 암호화되어 있는 단백질은 훌륭한 표적이 되는데, 왜냐하면, 이 표적에 대해 활성을 갖는 화합물에 세균을 노출시켰을 때, 세균이 불활성화되기 때문이다. 일단 표적이 동정되면, 표적과 상호 작용하고 표적의 기능을 변화시키는 분자를 발견 또는 설계하기 위하여 생화학적 분석을 통해 표적을 분석한다. 표적과 상호 작용하는 화합물을 유도하기 위하여, 물리 ·전산적인 기술을 이용해 구조적이고 생화학적인 표적을 분석하는 것을 합리적인 신약 설계라 하며, 이것은 미래에 대한 커다란 잠재성을 제공한다. 또한, 새롭게 출현한 신약 발견 방법은 다수의 후보 화합물을 생성하고 선별 또는 설계하기 위하여 분자 모델링 기술과 재조합생화학 접근 방법 및, 다른 방법들을 이용한다.

그러나, 신약 발견을 위한 접근 방법이 분명 미래적인 방식임에도 불구하고, 문제점들은 여전하다. 예를 들어, 분자 표적을 동정하는 초기 단계는 매우 시간 소모적인 작업일 수 있다. 또한, 컴퓨터 모델링 기술을 이용하여 표적과 상호 작용하는 분자를 설계하는 것도 어려운 작업일 수 있으며, 특히, 표적의 기능이 전혀 알려지지 않았거나 또는 널리 알려지지 않은 경우, 표적과 상호 작용하고 표적의기능을 변화시키는 분자를 탐색하기 위한 분석법을 설계하는 것은 더욱 어려울 수 있다. 신약 발견 및, 개발 속도를 향상시키기 위해서는, 병원성 미생물에서 중요한 분자 표적을 동정하는 방법과 그러한 분자 표적과 상호 작용하고 표적의 기능을 변화시키는 분자를 동정하는 방법이 시급히 요구된다.

Escherichia coli는 세균 생화학과 세균 물리학을 이해하기 위한 휼륭한 모델 시스템이다.Escherichia coli염색체의 4.6 X 10⁶염기쌍을 따라 흩어져 있는 대략 4288개 유전자들은 생화학적 과정을 이해하는데 큰 도움이 준다. 다시 말해, 이 지식은 세균성 질환의 치료와 진단을 위한 새로운 기술 개발에 도움을 줄 수 있다. 전체E. coli게놈(genome)이 서열 분석되었고, 그 총체적인 정보는 새로운 항생 화합물의 발견과 개발을 위한 큰 잠재력을 담고 있다. 그러나, 이와 같은 성과에도 불구하고, 대부분의 유전자들의 일반적인 기능과 역할이 여전히 밝혀지지 않고 있다. 예를 들어,E. coli게놈에 있는 증식 관련 유전자의 전체 개수는 밝혀지지 않았지만 200 내지 700개로 다양하게 추정되고 있다 (Armstrong, K.A.와 Fan, D.P. Essential genes in the metB-malB Region ofEscherichia coliK12, 1975, J. Bacteriol. 126: 48-55).

약제 내성 미생물의 급격한 증가와 관련하여, 새롭고 안전하며 효과적인 항생 화합물이 요구된다. 그러나, 심지어 하나의 세균 유전자를 특성화하는 작업에도 고된 과정과 노력의 시간이 필요하다. 따라서, 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 세균 게놈 서열을 동정하고 특성화하기 위한 보다 새로운 방법과 그 유전자 및, 단백질과 상호 작용하고 표적의 기능을 변화시키는 분자를 동정하기 위한 방법이 시급히 요구된다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 실시태양은 미생물의 증식을 저해하며, 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나를 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산 서열이다. 이 핵산 서열은 미생물 증식을 위해 발현이 요구되는 유전자의 암호화 서열(coding sequence)의 적어도 한 부분과 상보적일 수 있다. 이 핵산 서열은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 한 단편을 포함할 수 있으며, 전기 단편은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기(consecutive base)를 포함하는 단편들로 구성된 그룹에서 선택된다. 이 핵산 서열은 미생물 증식을 위해 발현이 요구되는 유전자의 암호화 서열에 상보적일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 포함하는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는(operably linked) 프로모터(promoter)를 포함하는 벡터이다. 전기 프로모터는Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans,Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속(genus)에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체(organism)에서 활성일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 암호화 서열을 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산이다. 이 실시태양의 한 측면은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 핵산의 한 단편이다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 실시태양의 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 오페론에 존재하는 유전자내 서열(intragenic sequence), 유전자간 서열(intergenic sequence), 둘 또는 그 이상의 유전자의 적어도 한 부분에 걸쳐있는 서열, 5' 비암호화 부위(noncoding region) 또는 3' 비암호화 부위의 적어도 한 부분과 상보적인 핵산 서열을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88 및, 90 내지 242의 서열 또는 기본 매개 변수(default parameter)를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 이용하여 결정된 그것의 상보적인 서열로 구성된 그룹에서 선택되는 서열과 적어도 70%의 상동성(homology)을 가지는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산이다. 이 핵산은Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터이다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 실시태양의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398 중 하나의 서열을 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩타이드이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357, 359 내지 398의 폴리펩타이드 중 어느 하나의 한 단편을 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩타이드이며, 전기 단편은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398의 폴리펩타이드 중 어느 하나에서 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60개 또는 60개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 단편으로 구성된 그룹에서 선택된다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 실시태양의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합(binding)할 수 있는 항체이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터를 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 생산하는 방법이다. 이 방법은 전기 단백질의 분리 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은, 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드의 활성을 저해하거나 양을 감소시키거나 또는 전기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 양을감소시키는 단계를 포함하는, 증식을 저해하는 방법이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물이 폴리펩타이드의 활성에 영향을 끼치는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 폴리펩타이드의 활성에 영향을 끼치는 화합물을 동정하는 방법이다.

전기 활성은 효소 활성, 탄소 화합물 이화 활성(catabolism activity), 생합성 활성, 수송 활성(transporter activity), 전사 활성, DNA 복제 활성 또는 세포분열 활성일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242로 구성된 그룹에서 선택되는 서열의 암호화 서열을 포함하는 표적을 제공하는 단계; 전기 표적과 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및, 전기 표적의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 폴리펩타이드의 활성이나 수준을 감소시키는 능력을 화합물에서 분석하는 방법이다.

표적은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 암호화 부위로부터 전사된 mRNA 분자일 수 있고, 전기 활성은 전기 mRNA의 번역일 수 있다. 또한, 표적은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 암호화 부위일 수 있고, 전기 활성은 전기 mRNA의 전사일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 대한 안티센스 핵산을 세포에서 발현하여 세포 내 유전자 산물의 활성이나 양을 감소시킴으로써 감작화된 세포를 생산하는 단계; 전기 감작화된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물이 전기 감작화된 세포의 생장을 비감작화된 세포의 생장보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 세포 증식에 필요한 유전자 산물의 활성이나 수준을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법이다.

세포는 세균 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 및, 동물 세포로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 세포는E. coli세포일 수 있고,Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체일 수도 있다. 안티센스 핵산은 유도성 프로모터에서 전사될 수 있다. 이 방법은 전기 안티센스 핵산을 치사 이하(sublethal) 수준으로 유도하는 농도의 유도제(inducer)와 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 전기 유도제의 치사 이하 농도는 생장 저해를 8% 까지 또는 그 이상으로 하는 농도일 수 있다. 유도제는 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드일 수 있고, 생장 저해는 배양 생장액의 광학 밀도를 조사하여 측정될 수 있다. 유전자 산물은 폴리펩타이드 또는 RNA일 수 있고, 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 상응하는 유전자에 대해 활성을 갖는 화합물 또는 전기 유전자 산물에 대해 활성을 갖는 화합물을 유전자를 발현하는 세포 집단으로 도입하는 단계를 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 방법이다. 화합물은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열 또는 그것의 증식 저해 부분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 증식 저해 부분은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 단편일 수 있다. 화합물은 삼중 나선 올리고핵산뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열 또는 그것의 증식 저해 부분을 포함하는 유효 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 포함하는 제제(preparation)이다. 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 증식 저해 부분은 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에서적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은, 세포 집단 내에서 오페론의 적어도 하나의 증식 저해 부분을 유전자의 발현 저해에 효과적인 안티센스 유래(orientation)로 가지는 안티센스 핵산과 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 상응하는 유전자를 접촉시키는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 오페론 내 유전자의 발현을 저해하는 방법이다. 안티센스 핵산은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 유전자의 서열에 상보적일 수 있으며, 서열 번호 1 내지 81 및, 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 서열 또는 그것의 한 부분일 수 있다. 세포 집단 내 세포는 안티센스 핵산을 포함하는 플라스미드, 파지(pharge), 레트론(retron), 결합 부분이 안티센스 핵산에 상보적인 리보자임(ribozyme) 및, 리포좀(liposome)을 세포 집단으로 도입함으로써 안티센스 핵산과 접촉될 수 있다. 또한, 세포는 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 세포 집단 내 염색체로 도입함으로써 안티센스 핵산과 접촉될 수 있으며, 일렉트로포레이션(electroporation)에 의하여 안티센스 핵산과 접촉될 수 있다. 안티센스 핵산은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 단편 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은, 세균 종을 함유하는 시료(sample)를 제공하는 단계; 및, 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88 및, 90 내지 242로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 포함하는 종 특이적(species-specific) 탐침을 이용하여 세균 종을 동정하는 단계를 포함하는, 세균 주를 동정하는 방법이다.

본 발명의 다른 실시태양은 하기의 단계를 포함하는, 미생물의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법으로, (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 저해 핵산을 첫 번째 미생물에서 동정하는 단계; (b) 전기 저해 핵산과 두 번째 미생물을 접촉시키는 단계; (c) 첫 번째 미생물에서 동정된 저해 핵산이 두 번째 미생물의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계; 및, (d) 전기 저해 핵산에 의해 저해되는 두 번째 미생물의 유전자를 동정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 하기의 단계를 포함하는, 화합물의 미생물 증식 저해 능력을 분석하는 방법으로, (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물을 첫 번째 미생물에서 동정하는 단계; (b) 전기 유전자 또는 전기 유전자 산물의 상동체를 두 번째 미생물에서 동정하는 단계; (c) 두 번째 미생물에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해 핵산 서열을 동정하는 단계; (d) 두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 저해 핵산과 접촉시킴으로써 전기 두 번째 미생물을 감작화하는 단계; (e) 단계 (d)의 감작화된 미생물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및, (f) 전기 화합물이 전기 감작화된 미생물의 증식을 비감작화된 미생물의 증식보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 첫 번째 미생물에서 증식 연관 유전자를 동정하는 전기 단계는, 첫 번째 미생물의 임의의 게놈 단편을 안티센스 유래로 포함하며, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 핵산을 도입하는 단계 및, 임의의 게놈 단편을 초기 수준과 낮은 수준으로 각기 전사한 전기 첫 번째 미생물의 증식을 비교하여, 증식 차이를 통해 임의의 게놈 단편이 증식 연관 유전자를 포함하고있음을 확인하는 단계를 포함한다.

두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계는, 기본 매개 변수를 가지는 BLASTN 버전 2.0과 FASTA 버전 3.0t78 알고리즘으로 구성된 그룹에서 선택된 알고리즘을 이용하여, 데이터베이스에서 상동적 핵산 또는 상동적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계는, 첫 번째 유전자와 교잡(hybridize)하는 핵산을 동정함으로써 상동적 핵산 또는 상동적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계는, 첫 번째 미생물에서 동정된 증식을 저해하는 핵산을 두 번째 미생물에서 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 저해 핵산은 안티센스 핵산일 수 있으며, 전기 상동체의 한 부분에 대한 안티센스 핵산 또는 전기 상동체를 암호화하는 오페론의 한 부분에 대한 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 핵산 서열과 접촉시키는 단계는, 두 번째 미생물을 전기 핵산과 직접적으로 접촉시키는 단계 또는 두 번째 미생물에서 전기 상동체의 안티센스 핵산을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 저해 핵산 서열을 첫 번째 미생물에서 동정하는 단계; (b) 두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 저해 핵산과 접촉시킴으로써 전기 두 번째 미생물을 감작화하는 단계; (c) 단계 (b)의 증식이 저해된 미생물을 화합물과 접촉시키는단계; 및, (d) 전기 화합물이 전기 감작화된 두 번째 미생물의 증식을 비감작화된 두 번째 미생물의 증식보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 화합물의 증식 저해 능력을 분석하는 방법이다.

저해 핵산은 전기 첫 번째 미생물의 증식을 저해하는 안티센스 핵산일 수 있고, 전기 첫 번째 미생물의 증식을 저해하는 안티센스 핵산의 한 부분을 포함할 수도 있다. 또한, 저해 핵산은 전기 첫 번째 미생물의 증식 연관 유전자의 전체 암호화 부위에 대한 안티센스 분자를 포함할 수 있으며, 전기 첫 번째 미생물의 증식 연관 유전자를 포함하는 오페론의 한 부분에 대한 안티센스 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 대한 안티센스 핵산을 세포에서 발현하여 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킴으로써 세포를 감작화하는 단계; 감작화된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물이 전기 감작화된 세포의 생장을 비감작화된 세포의 생장보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로에 대한 활성을 화합물에서 분석하는 방법이다.

세포는 세균 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 및, 동물 세포로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 세포는E. coli세포일 수 있고,Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체일 수 있다. 안티센스 핵산은 유도성 프로모터에서 전사될 수 있다. 이 방법은 유도성 프로모터로부터의 안티센스 핵산 발현을 치사 이하 수준으로 유도하는 물질(agent)과 세포를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 치사 이하 수준의 안티센스 핵산은 증식을 8% 까지 또는 그 이상으로 저해할 수 있고, 물질은 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)일 수 있다. 증식 저해는 배양액의 광학 밀도를 조사하여 측정될 수 있다. 유전자 산물은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법으로 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 세포 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 물질과 세포를 접촉시키는 단계; 전기 세포를 전기 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 세포의 증식이 전기 물질과 접촉되지 않은 세포의 증식보다 전기 화합물에 의해 크게 저해되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 화합물의 세포 증식 저해 능력을 분석하는 방법이다.

세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 전기 물질은 증식에 필요한 유전자나 오페론에 대한 안티센스 핵산 또는 항생제를 포함할 수 있다. 세포는 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 온도 민감성 돌연변이(temperature-sensitive mutation)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 도메인 중 전기 항생제가 작용하는 기능성 도메인과 같은 기능성 도메인을 암호화하는 핵산 및, 전기의 기능성 도메인과는 다른 기능성 도메인을 암호화하는 핵산에서 유래될 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 전기 방법 동정된 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은, 증식 관련 핵산에 대한 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 세포에서 발현하는 단계; 전기 세포를 이미 생화학적 작용 경로가 알려진 항생제와 접촉시키는 단계; 및, 전기 세포가 전기 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 전기 항생제에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증식 관련 핵산 또는 유전자 산물이 위치해 있는 경로를 결정하는 방법이다.

본 발명의 다른 실시태양은, (a) 이미 생물학적 작용 경로가 알려진 증식 관련 핵산에 대한 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 세포에서 발현시키는 단계; (b) 전기 세포를 조사 화합물과 접촉시키는 단계; 및, (c) 전기 세포가 전기 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 조사 화합물에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 조사 화합물이 작용하는 경로를 결정하는 방법이다.

이 방법은, (d) 단계 (a)의 전기 증식 관련 핵산과는 다른 생물학적 작용 경로에 있는 두 번째 증식 관련 핵산에 대한 두 번째 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 두 번째 세포에서 발현하는 단계; 및, (e) 전기 세포가 전기 두 번째 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 조사 화합물에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 358 및, 399 내지 402 중 어느 하나를 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88, 90 내지 242, 358 및, 399 내지 402로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 정제되거나 분리된 핵산이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 서열을 포함하는 핵산의 유전자 또는 유전자 산물과 상호 작용하는 증식 저해 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩타이드와 상호 작용하는 증식 저해 화합물이다.

본 발명의 다른 실시태양은 서열 번호 358 및, 399 내지 402 중 어느 하나를 포함하는 핵산과 상호 작용하는 증식 저해 화합물이다.

도 1은 IPTG-유도성 플라스미드에 의해 형질전환된E. coli의 ITPG 양에 따른 반응 곡선이다. IPTG-유도성 플라스미드는 단백질 합성과 세포 증식에 필수적인E. coli리보좀 단백질 rplW (AS-rplW)의 안티센스 클론(clone) 또는 단백질 합성과는 관련성은 알려져 있지 않으나 증식에는 필수적인 elaD (AS-elaD)의 안티센스 클론을 포함한다.

도 2A는 0, 20 또는 50 mM의 IPTG 존재 조건에서, rplW (AS-rplW) 안티센스를 포함하는 IPTG-유도성 플라스미드에 의해 형질전환된E. coli의 테트라싸이클린(tetracycline) 양에 따른 반응 곡선이다.

도 2B는 0, 20 또는 50 mM의 IPTG 존재 조건에서, elaD (AS-elaD) 안티센스를 포함하는 IPTG-유도성 플라스미드에 의해 형질전환된E. coli의 테트라싸이클린 양에 따른 반응 곡선이다.

도 3은 필수 리보좀 단백질 L23 (AS-rplW), L7/L12 및, L10(AS-rplLrplJ) 안티센스 클론에 의해 형질 전환된E. coli의 테트라싸이클린에 대한 감작성 증가를 보여주는 그래프이다. 단백질 합성과 관련되어 있지 않다고 알려진 유전자 atpB/E (AS-atpB/E), visC (AS-visC), elaD (AS-elaD) 및, yohH (AS-yohH)의 안티센스 클론들은 테트라싸이클린에 대해 훨씬 덜 민감하다.

정의

"생물학적 경로"란 유전자 산물 또는 유전자 산물의 하위세트(subset)에 의해 수행되는 어떤 분리된 세포 기능 또는 공정(process)을 의미한다. 생물학적 경로는 세포벽 같은 세포 구조물의 생성과 관련된 경로뿐만 아니라, 효소적, 생화학적, 대사적 경로를 포함한다. 미생물의 증식과 관련된 생물학적 경로는 세포 분열, DNA 합성과 복제, RNA 합성 (전사), 단백질 합성 (번역), 단백질 공정, 단백질 수송, 지방산 합성, 세포벽 합성, 세포막 합성과 유지 등을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다.

"유전자 또는 유전자 산물 저해 활성"이란 유전자 또는 유전자 산물의 수준이나 활성을 감소시키는 것과 같은 방식으로, 유전자 또는 유전자 산물의 기능을 방해하는 능력을 의미한다. 유전자 저해 활성을 갖는 물질은 유전자의 전사를 저해하는 물질과 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 저해하는 물질을 포함한다. 미생물에서, 유전자 저해 활성을 갖는 물질은 오페론의 발현 또는 유전자 산물의 수준이나 활성을 감소시키는 것처럼 오페론 RNA의 공정을 변화시킬 수 있다. 유전자 산물은 리보좀 RNA처럼 비번역되는 RNA, 번역되는 RNA (mRNA) 또는 유전자의 mRNA를 번역하여 생성된 단백질 산물이 될 수 있다. 본 발명의 특별한 효용은 오페론 또는 유전자에 특이적으로 교잡하여 그들에 대해 활성을 갖는 안티센스 RNA에 관한 것이다.

"유전자 산물에 대한 활성"이란 세포 내에서 유전자 산물의 기능을 저해하거나 유전자 산물의 수준 또는 활성을 감소시키는 능력을 의미한다.

"단백질에 대한 활성"이란 세포에서 단백질의 기능을 저해하거나 단백질의 수준 또는 활성을 감소시키는 능력을 의미한다.

"핵산에 대한 활성"이란 세포에서 핵산의 기능을 저해하거나 핵산의 수준 또는 활성을 감소시키는 능력을 의미한다.

본문에 사용된 "수준 이하(sublethal))"란 세포 생장을 완전히 저해하기 위해 필요한 농도 이하의 물질 농도를 의미한다.

본 발명은 생장과/또는 증식에 필요한E. coli유전자 그룹과 유전자 군(gene family)을 기술한다. 증식 관련 유전자 또는 유전자 군은 하나이고, 유전자 전사체와/또는 유전자 산물이 부재하는 경우 미생물의 생장 또는 생존력은 감소하거나 제거된다. 또한, 본문에 사용된 용어인 "증식 관련" 또는 "증식에 필요한"이란, 유전자 전사체와/또는 유전자 산물이 부재하는 경우, 세포의 생장을 감소시키기만 하는 서열뿐만 아니라 세포 생장을 완전하게 저해하는 서열을 내포하고 있음을 의미한다. 증식 관련 유전자는 새로운 항생제 개발을 위한 잠재적 표적이 될 수 있다. 이것을 위하여, 본 발명은 증식 관련 유전자를 분석하는 방법과 증식 관련 유전자 산물과 상호 작용하는 화합물을 동정하는 새로운 분석법을 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 유전자의 발현 및, 증식 관련 유전자로 동정되어 본문에 기재된 핵산 서열의 단백질 정제에 관하여 고찰하였다. 정제된 단백질은 시약 생성에 이용될 수 있고, 새로운 항생 화합물로 더욱 개발될 수 있는 화합물을 찾기 위해 작은 분자 라이브러리(library) 또는 다른 후보 분자 라이브러리를 선별하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 또한E. coli외 다른 생물체에서 상동적인 유전자를 동정하는 방법을 기술한다.

본 발명은E. coli의 증식 관련 서열을 동정하기 위해 새로운 방법을 이용한다. 일반적으로, 주어진 원천(source)의 핵산 서열 라이브러리는 서브클로닝된 다음, 유도성 발현 벡터로 삽입되어 발현 라이브러리로 형성된다. 삽입 핵산은 발현 벡터를 유도할 생물체의 염색체에서 유래된 것임에도 불구하고, 그것이 본래의 염색체 자리로 삽입되지는 않기 때문에, 본문의 토론 목적에 적합한 외부 핵산이다. 발현이란 유전자, 유전자 단편, 게놈 단편, 또는 오페론으로부터 RNA를 생산하는 것으로 정의한다. 발현은 또한 폴리펩타이드 합성이나 펩타이드 공정을 언급할 수 있다. 발현 벡터는 담체(vehicle)로 정의하며, 이 발현 담체에 의해 전달되는 핵산 서열로부터 리보핵산(RNA) 서열이 전사된다. 발현 벡터는 또한 발현 벡터에 의해 전달되는 외부 핵산 서열로부터 전사된 RNA 정보를 단백질로 번역하는 임무를 내포한다. 따라서, 발현 벡터는 RNA 분자를 유일한 산물로 생성할 수 있고 또는 최종적으로 단백질로 번역되는 RNA 분자를 생성할 수도 있다.

일단 생성된 외부 핵산을 포함하는 발현 라이브러리는 세균 증식에 필요한 유전자를 탐색하기 위해E. coli집단으로 도입된다. 라이브러리 분자는E. coli집단에게는 외부의 것이기 때문에, 그 안에 포함되어 있는 발현 벡터와 핵산 절편 또한 외부 핵산으로 간주된다.

발현 벡터 라이브러리를 포함하는E. coli조사 집단에서, 외부 핵산 단편의 발현은 세포가 발현 조건으로 진입하였을 때 활성화되고, 외부 핵산 단편의 발현 효과를 알아보기 위해E. coli조사 집단이 분석되었다. 활성화와 발현이 가능하며,E. coli조사 집단의 생장에 부정적인 영향을 끼치는 발현 벡터가 동정되었고, 앞으로의 연구를 위해 분리, 정제되었다.

발현이 생장에 부정적인 영향을 끼치는 핵산 서열을 동정하기 위한 다양한 분석법이 고찰되었다. 하나의 실시태양에서, 외부 핵산 서열을 발현하는E. coli의 생장은 이 서열을 발현하지 않는E. coli의 생장과 비교되었다. 생장 측정은 광학 밀도 측정하여 생장 정도를 조사함으로써 분석되었다. 한편, 효소 분석은 세균 생장 속도를 측정하여 관심있는 외부 핵산 서열을 동정하는 데 이용될 수 있다. 군락(colony)의 크기와 형태 및, 세포의 형태는 숙주 세포의 생장을 평가하는데 이용되는 부가적인 요소이다. 발현 조건에서, 생장에 실패하거나 또는 생장 효율이 감소된 배양액은 증식 관련 유전자에 부정적인 영향을 끼치는 핵산 단편을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 것으로 확인되었다.

일단 관심있는 외부 핵산 서열을 동정하고 난 후, 분석을 위한 첫 번째 단계는 관심있는 핵산 단편의 핵산 서열을 획득하는 것이다. 이것을 위하여, 관심있는 서열을 포함하는 것으로 확인된 발현 벡터 내부의 삽입 핵산은 본 분야에 널리 알려져 있는 기본적인 기술을 이용하여 서열 분석된다. 과정의 마지막 단계는 핵산 서열의 원천을 결정하는 것이다.

서열의 원천은 얻어진 서열 자료를 다양한 유전 데이터베이스의 알려진 서열과 비교함으로써 결정된다. 동정된 서열은 유전자 데이터베이스를 탐색하는데 이용한다. 결과로 생성된 외부 핵산 서열의 목록(list)은 증식에 필요하다고 분명히 밝혀진 유전자뿐만 아니라, 증식에 필요한 새로운 세균 유전자까지도 포함한다.

데이터베이스 시스템에서 이용 가능한 DNA 서열 및, 단백질 서열의 개수는 수년동안 지수적으로 증가해오고 있다. 예를 들어, 1998년 말에는,Caenorhabditis elegans와Saccharomyces cerevisiae및,E. coli를 포함한 19개 세균 게놈의 완전한 서열을 이용할 수 있었다. 서열 정보는 GenBank (the National Center for Biotechnology Information (NCBI))같은 데이터뱅크에 저장되어 있고, 수색(search)을 위해 대중적으로 이용 가능하다.

다양한 컴퓨터 프로그램으로 데이터베이스 내에 저장되어 있는 서열을 분석할 수 있다. FastA, (W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Method in Enzymology 183:63-98)와 Sequence Retrieval System (SRS), (Etzold & Argos, SRS an indexing and retrieval tool for flat file data libraries. Comput. Appl. Biosci. 9:49-57, 1993)은 관심있는 서열을 분석하는데 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램의 두 가지 실례이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 컴퓨터 프로그램 중에서 기본 매개 변수를 갖는 BLASTN 버전 2.0 또는 BLASTX 버전 2.0을 포함하는 BLAST 군이 핵산 서열을 분석하는데 이용된다.

"Basic Local Alignment Search Tool"의 두문자어인 BLAST는 데이터베이스에서 유사성을 수색하는 프로그램의 한 군이다. 프로그램의 BLAST 군은 하기를 포함한다 : BLASTN, 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스 수색 프로그램; BLASTX, 입력 정보로 핵산 서열을 이용하는 단백질 데이터베이스 수색 프로그램; 및, BLASTP, 단백질 데이터베이스 수색 프로그램. BLAST 프로그램은 서열 대비(matching)를 위한 빠른 알고리즘, 대비 정도를 판단하기 위한 정밀한 통계 방법, 특별한 상황에서 창작 프로그램(tailoring program)을 만들기 위한 다양한 옵션을 포함한다. 프로그램에 대한 이용 지원은blast@ncbi.nlm.nih.gov에서 이메일을 통해 얻을 수 있다.

세균 유전자는 종종 폴리시스트론성 그룹에서 전사된다. 이 그룹은 유전자간 서열 및 유전자 수집체(collection)인 오페론을 포함한다. 오페론의 유전자들은 동시에 전사되고, 대부분 기능적으로 연관되어 있다. 선별 실험의 결과가 주어졌다면, 동정된 외부 핵산 서열은, 근접해 있는 비암호화 서열을 포함하거나 포함하지 않는 유전자 또는 그것의 부분, 유전자내 서열 (다시 말해, 하나의 유전자 내부에 있는 서열), 유전자간 서열 (다시 말해, 유전자들 사이의 서열), 둘 또는 그 이상의 유전자들의 적어도 한 부분에 걸쳐있는 서열 및, 세균 증식에 필요한 실제 서열의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 위치하는 5' 비암호화 부위 또는 3' 비암호화 부위에 상응할 수 있다. 따라서, 오페론 내부의 유전자들 중 증식을 위해 독자적으로 필요한 유전자가 어느 것인지를 결정하는 것은 대부분 바람직한 일이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 오페론은 어느 유전자(들)이 증식에 필요한 것인지의 여부를 결정하기 위해 철저히 조사된다. 예를 들어, Huerta 등에 의한 RegulonDB DataBase는 미생물 게놈 내에 있는 오페론의 경계(boundary)를 밝히기 위해 이용되며, 웹싸이트는 http://www.cifn.unam.mx/Computational_Biology/regulondb/ 이다. 본 분야에 널리 알려진 많은 기술들이 오페론을 철저히 조사하기 위해 이용될 수 있다. 이 실시태양의 한 측면에서, 상동적 재조합에 의해 유전자를 파괴하는 기술은 증식에 필요한 유전자를 포함한다고 생각되는 오페론의 유전자를 독자적으로 불활성화시키는데 이용된다.

무효 돌연변이된 대립 유전자(allel)를 가진 기능적 유전자를 대체하기 위한 여러가지 유전자 파괴 기술이 알려져 왔다. 이러한 기술은 일반적으로 상동적 재조합의 이용과 연관되어 있다. Link 등에 의한 방법 (J. Bacteriol. 1997 179:6228; 내용을 참고 자료로 본문에 개시)은E. coli내 유전자를 파괴하는 여러 방법들 중에서 훌륭한 하나의 실례를 제공한다. 이 기술은 교차 PCR (crossover PCR)을 이용하여 표적 유전자의 암호화 부위에 인프레임(in-frame) 결실을 가지는 무효 대립 유전자를 생성한다. 무효 대립 유전자는 천연형(wild type) 유전자와 근접한 서열(약 500bp)은 유지시키면서 작제(construction)되었다. 결실 무효 대립 유전자를 둘러싸고 있는 상동적 서열은 상동적 재조합을 위한 표적으로 이용되고, 이로 인해E. coli염색체의 천연형 유전자를 작제된 무효 대립 유전자로 대체할 수 있다.

교차 PCR 증폭 산물은 클로람페니콜 내성 유전자, 반대-선택적 표식(counter-selectable marker) sacB, 및, 온도 민감성 자율 복제 기능을 가진 벡터 pK03으로 서브클로닝된다.

벡터는E. coli세포 집단으로 형질 전환되고, 염색체와 벡터 사이에서 상동적 재조합이 일어난 세포를 클로람페니콜이 존재하는 비허용 온도 43℃에서의 생장을 통해 선택할 수 있다. 이러한 조건에서, 플라스미드의 자율 복제는 일어나지 않고, 오직 클로람페니콜 내성 유전자가 염색체로 통합된 세포만이 클로람페니콜에 대해 내성을 갖는다. 일반적으로 단일 교차 현상은 이러한 통합 현상과 관련되어있으며, 그러므로,E. coli염색체는 하나의 천연형 대립 유전자와 하나의 결실 무효 대립 유전자로 구성된 표적 유전자의 나란한 중복체(tandem repeat)를 갖게 된다.

나란한 중복체를 가지는 이러한 새로운E. coli주는 선택된 약제(클로람페니콜)가 존재하는 허용 온도에서 유지(maintanance)될 수 있다. 다음으로, 새로운 주 세포가 선택된 약제가 부재하는 허용 온도 30℃에서 배양된다. 이러한 조건에서, 세포 집단 내 세포의 염색체에서는 내부적인 상동적 재조합 현상에 의해 플라스미드 서열이 제거될 수 있다. 재조합 결과체를 선택하기 위해, 클로람페니콜이 부재하고 자당(sucrose)이 존재하는 배지에서 그 주를 배양한다. 반대-선택적 표식 sacB가 존재할 때, 자당은 독성 대사물을 생성하게 된다. 그러므로, 이 반대-선택에서 살아남은 세포는 염색체로부터의 플라스미드 서열과 재조합 결과체의 부산물로써 생성된 자율 복제 플라스미드 둘 모두를 상실한 것이다.

상동적 재조합에 의한 전기 재조합 결과체는 표적이 된 유전자의 천연형 복제물이 염색체 안에 남아있는 것이거나 또는 무효 대립 유전자가 염색체 안에 남아있는 것이다. 필수 유전자의 경우, 무효 대립 유전자의 단일 복제물(singly copy)은 세포에게 치명적이므로, 전기 실험을 필수 유전자에 적용한다 하더라도 이러한 세포는 생성되지 않는다. 비필수 유전자의 경우에는, 무효 대립 유전자를 갖는 세포와 천연형 대립 유전자를 갖는 세포를 대략 같은 비율로 얻을 수 있다. 또한, 이 방법은 표적이 된 유전자의 필수성을 조사하는 데 이용된다: 필수 유전자에 적용되었을 경우, 오직 염색체 내에 천연형 대립 유전자를 갖는 세포만을 얻을 수 있을 것이다.

또한,E. coli에서 파괴 돌연변이를 생성하기 위한 다른 기술들이 알려져 왔다. 예를 들어, Link 등은 얻어진 재조합체의 분석을 단순하게 하기 위하여 부수적으로 인프레임 결실을 갖는 인프레임 서열 태그(tag)를 삽입하는 것에 대해 기술하였다. 추가적으로, Link 등은 카나마이신 내성 유전자같은 약제 내성 표식을 가진 유전자의 파괴를 기술하였다. Arigoni 등 (Arigoni, F. et al. Genomic-based Approch for the identification of Essential Bacterial Genes, Nature Biotechnology 16: 851-856, 개시 내용을 참고 자료로 본문에 개시)도 조사되는 유전자의 두 번째 복제물의 공작(engineering)과 조합(combination)되어 있는 유전자의 파괴를 이용하는 것에 대해 기술하였다. 이 유전자의 발현은 아라비노스(arabinose) 프로모터 같은 유도성 프로모터에 의해 조절되고, 유전자의 필수성이 조사된다. 이러한 기술의 대부분은 커다란 DNA 단편을 약재 선택 표식 같은 관심있는 유전자로 삽입한다. Link 등의 기술의 장점은 그 기술이 기능적 결함을 야기하는 유전자로의 삽입에 구애받지 않으면서 오히려 암호화 부위를 정확한 제거한다는 것이다. 이것은 표적 유전자 하류에 있는 유전자의 발현에 대한 극성 효과(polar effect)를 확실히 제거한다.

증식에 필요한 유전자로 동정된 유전자 또는 그것의 부분들의 전체 암호화 부위를 발현시키기 위해, 재조합 DNA기술을 이용할 수 있다. 과잉발현된 단백질은 앞으로의 연구를 위한 시약으로 이용할 수 있다. 동정된 외부 서열은 분리, 정제되었고, 본 분야에 널리 알려진 방법에 의해 적절한 발현 벡터로 클로닝되었다.필요하다면, 발현된 단백질의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 핵산으로 포함시키 수 있다.

증식에 필요한 유전자로 동정된 세균 유전자 단편의 발현이 본 발명에서 고찰되었다. 동정된 유전자의 단편은 본 발명의 동정된 서열 중 어느 하나와 상보적인 유전자에서 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75개 또는 75개 이상의 연속되는 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 발현 벡터로 삽입된 핵산은 암호화 서열의 상류와 하류의 서열을 포함할 수 있다.

세균 증식에 필요하다고 동정된 전체 유전자 또는 그것의 한 단편의 암호화 서열의 발현에서, 발현되어질 핵산 서열은 전통적인 클로닝 기술에 의해 발현 벡터 내의 프로모터와 작동가능하게 연결되었다. 발현 벡터는 본 분야에 알려진 세균, 곤충, 효모 또는 포유류의 발현 시스템 중 어느 것도 될 수 있다. 상업적인 벡터와 발현 시스템은 Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin)와 Invitrogen (San Diego, California) 등의 다양한 공급자로부터 구할 수 있다. 필요하다면, 단백질의 발현을 증가시키고 발현된 단백질이 적절한 구조를 갖도록 촉진하기 위해, Hatfield 등(U.S. Patent No. 5,082,767, 참고 자료로 본문에 개시)에 의해 기술된 것과 같이, 서열의 코돈 용법(usage)과 코돈 성향(bias)을 발현 벡터가 도입될 특별한 발현 생물체를 위해 최적화할 수 있다. 또한, 융합(fusion) 단백질 발현 시스템도 본 발명에서 고찰되었다.

동정된 외부 핵산 서열에 암호화된 단백질은 발현되고, 본 분야에 널리 알려진 기술에 의해 정제된다. 동정된 외부 핵산 서열에 암호화되어 발현된 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 등에 의한 침전 기술을 이용하여 부분적으로 정제될 수 있다. 본 발명에 이용된 크로마토그래피 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 수산화인회석(hydroxyapaptite) 수지, 고정된 반응 염료, 크로마토포커싱 (chromatofocusing) 및, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 이용을 포함할 수 있다. 정제 방법은 일차원 겔 전기영동, 고분해능 이차원 폴리아크릴아마이드 전기영동, 등전점전위이동 (isoelectric focusing) 및, 다른 전기 영동적 방법을 포함한다. 항체 수지와 리간드 제공 수지, 다른 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피 방법 또한 본 발명의 정제 방법으로 고찰되었다.

증식에 필요하다고 동정된 유전자의 암호화 서열에서 생산되고 정제된 단백질은 유용한 항생 시약을 생성하기 위해 다양한 실험에서 이용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 동정된 외부 핵산 서열로부터 발현된 단백질에 대한 항체가 생성된다. 모노클론성과 폴리클론성 항체를 생산하는 방법은 본 분야에 널리 알려져 있다. 또한, 생산된 항체에서 제조되는 항체 단편의 제제가 고찰되었다.

본 발명의 정제된 단백질을 위한 다른 적용은 본 발명의 다양한 표적 단백질에 대해 활성을 갖는 후보 화합물로 구성된 작은 분자 라이브러리를 선별하는 것이다. 재조합 생화학 분야의 발전은 표적 단백질에 결합하거나 또는 저해 효과를 나타내는 수많은 후보 화합물을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 동정된 유전자 서열에서 생산된 표적 단백질에 대해 결합 친화성 또는 저해 활성을 갖는 화합물로 구성된 작은 분자 라이브러리를 선별하는 것이 본 발명에서 고찰되었다.

본 발명은E. coli외 다양한 다른 병원성 생물체에서의 효용을 고찰하였다. 예를 들어, 본 발명은 원핵 생물과 진핵 생물에서 증식에 필요한 유전자를 동정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은Plasmodiumspp.같은 원생생물; 식물;Entamoebaspp. 과comtrecaeumspp. 같은 동물; 및,Candidaspp., (예를 들면Candida albicans),Saccharomyces cerevisiae,Cryptococcus neoformans와Aspergillus fumigatus를 포함하는 곰팡이에 효용을 가진다. 본 발명의 하나의 실시태양은 monera 세균에서 증식에 필요한 새로운 유전자 서열을 수색하였다. 이 실시태양은 특히 약재 내성 세균을 위해 중요하다.

현재 통용되는 항생제에 내성을 갖는 세균 종의 수는 계속해서 증가하고 있다. 이러한 생물체의 부분적인 목록은S. aureus같은Staphylococcusspp;E. faecalis같은Enterococcusspp;P. aeruginisa같은Pseudomonasspp;C. botulinum같은Clostridiumspp;H. influenzae같은Haemophillusspp;E. cloacae같은Enterobacterspp;V. cholera같은Vibriospp;M. catarrhalis같은Moraxalaspp;S.pneumoniae같은Streptococcusspp;N. gonorrhoeae같은Neisseriaspp;Mycoplasma pneumoniae같은Mycoplasmaspp;Salmonella typhimurium; Helicobacter pylori; Escherichia coli;및,Mycobacterium tuberculosis를 포함한다. 본 발명에서 증식에 필요한 것으로 동정된 서열은 전기 생물체와 다른 생물체들을 탐색하는데 이용되어 상동적인 증식 관련 유전자를 동정한다.

본 발명의 하나의 실시태양은 본문에 기재된 핵산 서열을E. coli외 다른 관심있는 세균 종에서 생성된 게놈 라이브러리를 선별하는데 이용한다. 예를 들어, 게놈 라이브러리는Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 유래될 수 있다. 기본적인 분자 생물학 기술은 다양한 미생물의 게놈 라이브러리를 생성하기 위해 이용된다. 하나의 실시태양에서 라이브러리가 생성되었고, 니트로셀룰로스 종이에 결합되었다. 본 발명의 동정된 외부 핵산 서열은 라이브러리에서 상동 서열을 선별하기 위한 탐침으로 이용될 수 있다. 동정된 상동 서열은 둘 이상의 생물체에서 활성을 갖는 새로운 항생 화합물을 동정하기 위한 표적으로 이용될 수 있다.

예를 들어, 전기 방법은 어떤 그룹에서 선택된 핵산 서열과 적어도 97%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 적어도 70%의 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 분리하는데 이용될 수 있으며, 전기 그룹은 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나, 전기 서열 번호 중 어느 하나에서적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400개 또는 500개의 연속된 염기로 구성된 단편 및, 그것의 상보적인 서열로 구성되었다. 서열 동일성은 기본 매개 변수를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 이용하여 측정될 수 있다. ( Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402 (1997), 개시 내용을 참고 자료로 본문에 개시). 예를 들어, 상동 폴리뉴클레오티드는 본문에 기재된 암호화 서열 중 어느 하나에 자연적인 대립 유전자 변이가 일어난 암호화 서열을 가질 수 있다. 이러한 대립 유전자 변이체는 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88 및, 90 내지 242의 핵산 또는 그것의 상보적인 서열의 핵산과 비교되었을 때, 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 및, 첨가를 가질 수 있다.

추가적으로, 전기 방법은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 분리하기 위해 이용될 수 있으며, 전기 폴리펩타이드는 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398 중 어느 하나의 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 적어도 40%의 동일성 또는 유사성(similarity)을 갖거나, 또는 기본 매개 변수를 가지고 FASTA 버전 3.0t7.8 알고리즘을 이용하여 결정된 서열에서 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 150개의 연속되는 아미노산을 가지는 단편을 포함한다. 한편, 단백질의 동일성 또는 유사성은 기본 매개 변수를 가지고 BLASTP, BLASTX 또는 TBLASTN을 이용하여 확인할 수 있다. (Alschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), 개시 내용을참고 자료로 본문에 개시).

한편, 상동 핵산 또는 상동 폴리펩타이드는 데이터베이스를 수색하여 동정되고, 증식에 관여하는 핵산이나 폴리펩타이드 또는 증식에 관여하는 핵산에 대한 안티센스 핵산과 바람직한 수준의 상동성을 갖는 서열을 동정하기 위해 이용된다. GenBank와 GenSeq 등의 다양한 데이터베이스는 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 유용하다. 어떤 실시태양에서, 데이터베이스는 핵산이나 폴리펩타이드 동정을 위해 선별되며, 전기 핵산이나 폴리펩타이드는 증식에 관여하는 핵산, 폴리펩타이드 또는 증식에 관여하는 핵산에 대한 안티센스 핵산과 적어도 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 적어도 40%의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 예를 들어, 서열 번호 1 내지 81, 405 내지 485, 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나와 상동적인 핵산 또는 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398과 상동적인 폴리펩타이드를 동정하기 위해 데이터베이스를 선별할 수 있다. 어떤 실시태양은E. coli외Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydiatrachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 다른 생물체에서 상동 핵산 또는 상동 폴리펩타이드를 동정하기 위해 데이터베이스를 선별한다.

다른 실시태양은 유전자 발현 어레이(array)와 마이크로어레이(microarray)를 사용한다. 유전자 발현 어레이는 유리 칩(chip), 나일론 막 또는 그 비슷한 것들 위의 특정한 지점에 놓여진 고밀도의 DNA 시료이다. 이러한 어레이는 다양한 조건에서 상대적인 유전자 발현을 정량하는 연구자들 및, 최적의 약재 표적을 동정하거나 새로운 화합물을 소개하고 질병의 경로를 결정하는 연구자들에게 이용된다. 이 기술의 한 실례로 U.S. Patent No. 5807522를 본문에 참고 자료로 개시하였다.

단일 어레이를 이용하여 특정 미생물 생물체의 게놈에 있는 모든 유전자의 발현을 연구할 수 있다. 예를 들어, Genosis 어레이는E. coli의 4290 ORFs에 상응하는 PCR 산물 10ng씩을 매 1.5 mm마다 점적하여 포함하는 12 x 24 cm의 나일론 여과지로 구성되어 있다. 단일 가닥 표지(label)된 안티센스 유래의 cDNA를 어레이와의 교잡을 위해 제조하여 여과지와 접촉시켰고, 포스포리메이저(phosphorimager)를 이용하여 정량 분석하였다.

세포의 전체 mRNA 시료에서 생성된 cDNA를 교잡시킨 후에, 알려진 다양한 기술을 이용하여 각 어레이에서의 결합을 탐지하였고, 그 결과는 cDNA와 잡종이 형성된 어레이의 각 지점에서 신호로 나타난다. 각 지점의 교잡 신호의 강도는 시료 내 존재하는 특이적 유전자에 대한 mRNA의 양을 반영한다. 다양한 조건으로 생장된 세포에서 분리된 mRNA를 통해 획득한 결과들을 비교하여 다양한 조건에서 발현되는 각 개별적인 유전자의 상대적인 양을 비교하였다.

증식 관련 유전자에 대한 안티센스 핵산을 유도한 후, 다양한 시간점에서의 전체 mRNA발현 양상을 분석하기 위해 유전자 발현 어레이를 이용할 수 있다. 어레이와의 교잡에 의해 밝혀진 발현 양상은 안티센스 핵산의 표적 유전자가 안티센스 유도에 의해 영향을 받는지, 안티센스가 얼마나 빠르게 표적 유전자에 영향을 끼치는지, 후기 시간점에서 안티센스 발현에 의해 영향을 받는 다른 유전자에는 어떤 것들이 있는지에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 만약 안티센스가 50S 하위단위(subunit)에 있는 리보좀 단백질 L7/L12를 암호화하는 유전자에서 유래한다면, 표적이 되는 mRNA는 초기에 사라지고 다른 mRNA는 증가하는 것을 관찰할 수 있을 것이다. 유사하게, 만일 안티센스가 다른 50S 하위단위 리보좀 단백질 (예를 들면, L25)의 mRNA에서 유래한다면, 그 mRNA는 초기에 사라지고, L7/L12 안티센스 발현에서 보여지는 것과 비슷하게 mRNA 발현이 변화된다. 또한, 증식 관련 유전자에 대한 안티센스 핵산에 의해 관찰된 mRNA 발현 양상은 안티센스 핵산의 표적과 같은 경로에 있는 다른 증식 관련 핵산을 동정하는데 이용될 수 있다. 추가적으로, 후보 약재 화합물에 의해 관찰된 mRNA 발현 양상은 증식 관련 핵산에 대한 안티센스 핵산에 의해 관찰된 발현 양상과 비교될 수 있다. 비교 결과 두 양상이 유사하다면, 약재 화합물은 치료(therapeutic)용 후보가 될 수 있다. 또한, 이 분석은 전기에 기술된 바와 같은 선별 방법을 이용하여 후보 약재 화합물을 선택하는데 유용한 도움을 준다.

어레이에 점적된 핵산의 원천과 어레이에 교잡하는 핵산의 원천이 다른 경우, 유전자 발현 어레이를 이용하여 두 생물체에서 상동 유전자를 동정할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 미생물에서 증식 관련 유전자를 선별하기 위한 부가적인 방법을 고찰한다. 이 실시태양은 중합효소 사슬 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 퇴행성 프라이머(degenerate primer)를 생성하기 위해 동정된 증식 관련 서열의 보존 부분(conserved portion)을 이용할 수 있다. PCR 기술은 본 분야에 널리 알려져 있다. 본문의 동정된 서열로부터 생성된 퇴행성 프라이머에 의한 PCR 산물이 성공적으로 생산되었다는 것은 선별에 이용된 종이 상동 유전자 서열을 포함하고 있음을 의미한다. 이 상동 유전자는 분리되고 발현되어, 후보 항생 화합물에 대한 표적으로 이용되었다. 본 실시태양의 다른 측면에서, 상동 유전자는 자동형(autologous) 생물체나 이종(heterologous) 생물체의 증식에 필요한 상동 유전자의 수준 또는 활성을 변화시키는 것과 같은 방식으로 안티센스 유래를 가지고 자동형 생물체 또는 이종 생물체에서 발현된다.

본문의 기술에 의해 동정된 증식 관련 유전자에 상동적인 서열은E. coli외 다른 생물체에서 증식 관련 유전자를 동정하기 위해 이용할 수 있으며, 동정된 유전자는 유전자의 양을 감소시키거나 활성을 억제함으로써E. coli외 다른 생물체의 증식을 억제할 목적으로 또는 그 생물체의 증식을 억제하는 화합물을 동정하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 동정된 증식 관련E. coli서열을 non-E. coli종에서 기능적인 발현 벡터로 이동하였다. 당 업계의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 알 수 있듯이, 발현 벡터는 종 특이적인 특정 원소(element)를 포함해야만 한다. 이러한 원소는 프로모터 서열, 작동자(operator) 서열, 복제의 기원(origin), 리보좀 결합 서열, 종결(termination) 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 동정된 외부 서열을 이용하기 위한, 배양된 세균 세포로부터 관심있는 서열을 포함하는 벡터를 분리하고, 그 서열을 분리, 정제하여, 선별될 세균 종에서 이용 가능한 발현 벡터로 서브클로닝하는, 기본적인 분자 생물학 기술은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 알 것이다.

다양한 다른 종에서 이용 가능한 발현 벡터들도 널리 알려져 있다. 예를 들어, Cao 등은Staphylococcus aureus에서 스테로이드 수용체 단편을 발현시켰다. J. Steroid Biochem Mol Biol. 44(1): 1-11 (1993). Pla 등은Salmonella typhimurium, Pseudomonas putida및,Pseudomonas aeruginnosa를 포함하는 다수의 적절한 숙주에서 기능적인 발현 벡터를 보고하였다. J. Bacteriol. 172(8): 4448-55 (1990). 이러한 실례들은 관심있는 세균 종에서 기능적인 발현 벡터를 작제(construction)하는 다양한 분자 생물학 기술이 존재함을 증명한다.

동정된 핵산 서열은 관심있는 미생물에서 기능적인 발현 벡터로 서브클로닝 된 다음, 세균 생장 저해를 분석하기 위한 최적의 상황에서 전사된다. 발현 벡터는 전사되어 세균 생장을 저해하는 서열을 포함해야 하며, 이 서열은 선별되어질 병원성 미생물의 알려진 게놈 서열과 비교되었다. 선별되어질 생물체의 상동 서열이 알려져 있지 않은 경우에는, 관심있는E. coli증식 관련 서열과의 교잡을 통해 동정하여 분리하거나 또는 관심있는E. coli증식 관련 서열에 기반하는 프라이머를 이용한 증폭을 통해 상동 서열을 얻을 수 있다.

두 번째 생물체에서 동정된 안티센스 서열은 유도성 프로모터같은 프로모터와 연결되어 두 번째 미생물로 도입된다. 또한,E. coli증식 관련 유전자를 동정하는 본문의 기술은 두 번째 생물체에서 동정된 서열이 두 번째 생물체의 증식을 억제하는지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다.

E. coli외 다른 생물체의 증식 관련 안티센스 핵산 또는 그것에 상응하는 유전자는E. coliORFs를 포함하는 마이크로어레이와의 교잡을 통해E. coli와 다른 생물체 사이의 증식 관련 서열 상동성을 측정하는데 이용된다. 예를 들어, 증식 관련 핵산은Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속에 속하는 종에서 유래될 수 있다.E. coli외 다른 생물체의 증식 관련 핵산은 다양한 조건에서 어레이와 교잡할 수 있으며, 교잡은 생물체 내에 다른 가능한 필수 유전자가 있다는 단서와 생물체간 상동성의 존재를 제공한다.

다른 실시태양에서, 세균의 생장 또는 증식과의 관련성이 증명된 본 발명의외부 핵산 서열은 세균을 죽이는 안티센스 치료제로 이용될 수 있다. 이 안티센스 서열은 본 발명의 동정된 외부 핵산 탐침에 상응하는 증식 관련 유전자로부터 생성된다. (다시 말해, 안티센스 핵산은 증식 관련 유전자 또는 그 유전자의 한 부분과 교잡할 수 있다). 한편, 안티센스 치료제는 증식 관련 유전자가 존재하는 오페론으로부터 생성될 수 있다. (다시 말해, 안티센스 핵산은 증식 관련 유전자가 존재하는 오페론 내의 어떤 유전자와도 교잡할 수 있다). 또한, 안티센스 치료제는, 근접해 있는 비암호화 서열을 포함하거나 포함하지 않는 유전자 또는 그것의 부분, 유전자내 서열 (다시 말해, 하나의 유전자 내부에 있는 서열), 유전자간 서열 (다시 말해, 유전자들 사이의 서열), 둘 또는 그 이상의 유전자에서 적어도 한 부분에 걸쳐있는 서열, 세균 증식에 필요한 실제(real) 서열의 상류 또는 하류에 위치하는 5' 비암호화 부위 또는 3' 비암호화 부위, 또는 증식 관련 유전자를 포함하는 오페론에서 생성될 수 있다.

치료적 적용뿐만 아니라, 본 발명은 증식 관련 서열과 상보적인 핵산 서열을 진단 도구로써 이용할 수 있는 가능성을 내포한다. 예를 들어, 특정 미생물 종에 특이적인 증식 관련 서열과 상보적인 핵산 탐침은 임상 표본(clinical specimen)에서 특정 미생물 종을 동정하기 위한 탐침으로 이용할 수 있다. 이것은 세균 감염의 원인이 되는 물질 또는 물질들을 동정하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고, 이러한 감염을 치료하기 위해 종 특이적 항생 화합물을 적절히 처방할 수 있는 능력을 가진 임상 의사를 제공한다. 효용의 범위를 확장하여, 증식 관련 서열에서 전사된 mRNA로부터 번역된 단백질에 대한 항체는 종 특이적으로 이러한단백질을 생산하는 특별한 미생물을 선별하는데 이용될 수 있다.

하기의 실시예들은 본 발명의 유전자 및, 증식과의 관련성이 동정된E. coli유전자를 이용하기 위한 하위세트를 제공한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

하기 실시예들은 증식에 필요한E. coli유전자의 동정과 개발에 관한 것이다. 유전자를 동정하는 방법은 동정된 서열을 이용하는 방법만큼이나 다양하다.

E. coli 증식에 필요한 유전자

외부 핵산 서열은 유도성 발현 벡터로 클로닝되었고, 생장 저해 활성이 분석되었다. 실시예 1은 IPTG 유도성 발현 벡터로 클로닝된 외부 핵산 서열 라이브러리의 조사를 기술하였다. 발현 벡터는 활성화 또는 유도되어 서브클로닝된 외부 핵산 서열에 상응하는 RNA 분자를 생산하며, RNA 산물은 그것이 본래 유래하는E. coli유전자에 대해 안티센스 방향이다. 안티센스 RNA는 다양한E. coli유전자로부터 생산된 센스 RNA와 상호 작용하고, 센스 mRNA의 번역을 방해 또는 저해함으로써, 센스 mRNA 분자로부터의 단백질 생산을 막는다. 센스 RNA가 증식 관련 단백질을 암호화하는 경우, 활성화된 발현 벡터를 포함하는 세균 세포는 전혀 생장하지 않거나 또는 충분히 감소된 속도로 생장한다.

실시예 1

IPTG 유도에 따른 세균 증식의 저해

액체 배지에서의 전사 유도 효과를 연구하기 위해, 1mM IPTG를 포함하거나 포함하지 않는 두 새로운 배지를 가지고 1:200 희석한 배양액에서 매 30분 마다 OD₄₅₀을 측정하여 생장 곡선을 만들었다. 고체 배지에서의 전사 유도 효과를 연구하기 위해, 밤새 배양(overnight culture)된 배양액의 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸배 희석액을 준비했다. 이들 희석액의 0.5 내지 3 mL를 1mM IPTG를 포함하거나 포함하지 않는 선택적 한천 배지에 점적했다. 밤새도록 배양한 후에, IPTG에 대한 클론(clone)의 감작성 평가를 위해 한천 배지들을 비교하였다.

조사된 수많은 클론들 중에서 몇 개 클론이 IPTG 유도 후에E. coli생장을 저해하는 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. 따라서, 삽입 핵산 서열과 상응하는 유전자 또는 삽입 핵산을 포함하는 오페론에 있는 유전자는E. coli의 증식에 필요하다고 할 수 있다.

E. coli 증식에 부정적인 영향을 끼치는 분리된 클론의 특성화.

발현 의존적으로E. coli의 생장 또는 증식에 부정적인 영향을 끼치는 발현 벡터의 동정에 뒤이어, 발현 벡터에 포함된 삽입체 또는 핵산 단편이 하기의 특성화 작업을 위해 분리되었고, 관심있는 발현 벡터는 핵산 서열이 결정되었다.

실시예 2

E. coli 증식에 부정적인 영향을 끼치는 핵산 단편을 발현하는 동정된 클론의 핵산 서열 결정

동정된 외부 서열에 대한 뉴클레오티드 서열은 QIAPREP(Quigen, Valencia, CA)과 제조업자에 의해 제공된 방법으로 분리한 플라스미드 DNA를 이용하여 결정되었다. 삽입 핵산의 서열 결정에 이용된 프라이머는 5'-TGTTTATCAGACCGCTT-3'(서열 번호 403)와 5'-ACAATTTCACACAGCCTC-3'(서열 번호 404)이다. 이 서열은 pLEX5BA에서 폴리연결자(polylinker)에 접해있다. 동정된 삽입체의 서열 번호(sequence identification number)는 표 I에 정리되었고, 하기에 논의된다.

실시예 3

동정된 서열과 알려진 서열과의 비교

위에서 논한 발현 벡터로부터 얻은 서브클로닝된 단편의 핵산 서열은 필터링 오프(filtering off), gap을 여는 비용=5, gap의 확장 비용=2, 운영의 blast 부분에서 비대비(mismatch)에 대한 벌점(panalty)=3, 운영의 blast 부분에서 대비(match)에 대한 보상=1, 기대값 (e)=10.0, 단어 크기=11, 한 줄 묘사 수=100 및, 보여지는 정렬 수=100 등의 기본 매개 변수를 가지고 BLAST 버전 1.4와 버전 2.0.6을 이용하여 GenBank의 알려진E. coli서열과 비교되었다. BLAST는 Altschul, J Mol Biol. 215: 403-10 (1990)에 기술되어 있고, 개시 전체가 참고 자료로 본문에 개시되었다. 발현 벡터는 센스와 안티센스 방향으로 핵산 서열을 포함한다. 알려진 유전자, 및, 리보좀 결합 자리의 존재는 유전 정보와 유전 컴퓨터 그룹 프로그램(Genetics Computer Group program)인 FRAMES과 CODONPREFERENCE같은 다양한 컴퓨터 프로그램을 담고 있는 공공적인 데이터베이스와의 비교에 의해 결정되었다. 클로닝된 단편이 프로모터 방향으로 존재하여, 생산된 RNA 전사체가 염색체 자리에서 발현된 mRNA와 상보적이라면, 클론은 "안티센스"로 지정(designation)되었고, 클론이 염색체 자리에 있는 천연형 mRNA의 부분과 동일한 RNA 단편을 암호화한다면, 그 클론은 "센스" 로 지정되었다.

세균 증식을 저해하는 안티센스 유래의 유전자 단편을 포함하는 실시예 1 내지 2에 기술된 서열은 표 1에 기록되어 있다. 표 I은 서열 동정 번호; 분자 번호; 및, NCBI, Blattner (Science 277:1453-1474 (1997); 또한,E. coliK-12 게놈 서열을 포함) 또는 Rudd (Micro. And Mol. Rev. 62:985-1019 (1998), (두 문헌은 참고 자료로 본문에 개시) 명명법에 따라 나열된 유전자에 의해 동정된 서열을 나열하고 있다.E. coli염색체에 위치하는 첫 번째와 마지막 염기쌍 자리뿐만 아니라 동정된 각 서열의 CONTIG 번호를 나타냈다. "**"를 갖는 분자 번호는 유전자간 서열에 상응하는 클론을 나타낸다.

증식을 저해하는 미국 임시특허출원번호 60/117,405의 서열 번호 1 내지 81의 핵산 서열이 추가로 분석되었다. 임시특허출원번호 60/117,405의 서열 번호 1 내지 81에 상응하는 재분석된 서열은 본 적용에서 서열 번호 405 내지 485를 갖는다.

미국 임시특허출원번호 60/117,405에 있는 서열 번호 82 내지 242는 하기의 예외를 갖는 본 적용의 서열 번호 82 내지 242와 동일하다. 본 적용의 서열 번호 148은 미국 임시특허출원번호 60/117,405에 있는 서열 번호 148의 상보적인 가닥이다. 따라서, 서열 번호 148에 암호화되어 있는 서열 번호 308의 단백질은 개정(revise)되었다. 본 적용의 서열 번호 163은 미국 임시특허출원번호 60/117,405에 있는 서열 번호 163의 상보적인 가닥이다. 따라서, 서열 번호 163에 암호화되어 있는 서열 번호 323의 단백질은 개정되었다.

미국 임시특허출원번호 60/117,405(본 적용의 서열 번호 18, 19, 422 및, 423)의 서열 번호 18 및, 19에 있는 표적 유전자는 이들 서열 번호가 ftsZ 발현을 저해하는 천연의 안티센스 분자를 포함한다는 사실을 반영하기 위해 dicF에서 ftsZ까지 개정되었다.

미국 임시특허출원번호 60/117,405 및, 본 적용에 있는 서열 번호 198 및, 239 내지 242의 핵산에 대한 유전자 산물(본 적용의 서열 번호 358 및, 399 내지 402)은 이들 핵산이 비번역되는 tRNAs와 rRNAs를 암호화한다는 사실을 반영하기 위해 개정되었다. 따라서 표 I과 표 II가 개정되었고, 표 II의 서열 번호는 서열 번호 89 및, 402가 미국 임시특허출원번호 60/117,405의 것과 동일하다는 사실을 반영하기 위해 개정되었다.

표 I: 상응하는 유전자와 오페론을 갖는 동정된 클론

실시예 4

안티센스 핵산에 의해 영향을 받는 유전자와 그에 상응하는 오페론의 동정

전체E. coli게놈의 서열이 Blattner 등 (Science 277:1453-1474 (1997),게놈 서열은 GenBank 출입 번호 U00096에 나열되어 있고, 개시 내용을 참고 자료로 본문에 개시)에 기술되었다. 증식 저해 핵산과 상응하는 오페론은 RegulonDB와 문헌 정보를 이용하여 동정되었다.E. coli게놈에서 이들 오페론의 경계 좌표는 표 III에 나열되어 있다. 표 III은 생장 저해 핵산 단편을 포함하는 삽입체의 분자 번호, 삽입체에 상응하는 오페론내 유전자, 삽입체를 포함하는 유전자의 서열 번호, 유전자에 암호화된 단백질의 서열 번호,E. coli게놈에 있는 유전자의 개시점과 종결점, 예상하거나 입증되어 있는 게놈에서의 유전자의 방향 및, 유전자의 예상되는 기능을 나열하고 있다. 동정된 오페론과 그들의 잠재적 기능 및, 그들 유전자가 현재 증식에 필요하다고 생각되어지는지의 여부를 하기에서 토의하였다.

동정된 유전자의 기능은 Blattner의 기능적 분류 지정(functional class designation)에 의해 또는 동정된 서열과 다양한 데이터베이스의 알려진 서열과의 비교에 의해 결정되었다. 본 발명의 클론에 상응하는 유전자와 관련된 다양한 생물학적 기능이 알려져 있고, 관심있는 유전자의 기능을 표 II에 나타내었다.

표 II의 단백질은 광범위한 생물학적 기능과 연관되어 있다.

표 II: 전체 염색체 좌표를 갖는 모든 오페론 자료

여러 발현 벡터는 알려지지 않은 기능의 유전자 또는 기능은 알려져 있으나 필수적인지의 여부가 알려지지 않은 유전자에 상응하는 단편을 포함한다. 예를 들어, EcXA001, 003, 007, 008, 013, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 047, 048, 049 및, 050은 모두 알려지지 않은 기능 또는 필수적인지의 여부는 결정되지 않았지만 알려진 기능을 갖는E. coli단백질에 상응하는 외부 핵산 서열이다.

본 발명은 증식에 필요한 다수의 새로운E. coli유전자와 오페론을 발표하였다. 동정된 클론 서열 목록의 각각은E. coli증식에 필요한 오페론 내에 있는 유전자의 한 부분으로 동정되었다.E. coli증식에 필요하다고 이미 알려진 유전자에 상응하는 클론 서열은 EcXA002, 004, 005, 010, 012, 014, 031, 02, 043, 045, 051, 052, 054 및, 055를 포함한다.E. coli유전자에 상응하지만 전기에 속하지 않는 동정된 서열은 본 분야에서 증식에 필요하다고 선정되지 않은 것들이다.

본 발명의 흥미로운 결과는E. coli증식에 필요하다고 생각되지 않는E. coli유전자에 상응하는 여러 개의 서열 단편이다. 그러나, 전기에 기술된 조건에서, 이들 유전자의 안티센스 발현은 세포 생장의 감소를 야기했다. 이 결과는 동정된 서열에 상응하는 유전자가 실제로는 증식에 필요한 것임을 암시한다. 이들 유전자에 상응하는 분자 번호는 EcX006, 044, 046 및, 053이다.

관심있는 서열을 동정한 후, 이들 서열은 오페론에 위치되었다. 세균 유전자는 폴리시스트론성 방식으로 발현되기 때문에, 오페론에 있는 단일 유전자의 안티센스 저해는 오페론 내 다른 모든 유전자의 발현 또는 단일 유전자 하류의 유전자 발현에 영향을 끼치게 된다. 오페론에 있는 어느 유전자 산물이 증식에 필요한 것인지를 결정하기 위해, 생존에 대한 영향이 오페론에 포함되어 있는 각 유전자에서 분석되었다.

표 3: 오페론 경계

실시예 5

증식에 필요한 오페론에 있는 각 유전자의 동정

하기 실시예는 증식에 필요한 오페론에 있는 각 유전자를 결정하는 방법을 기술한다. 분자 번호 EcXA004에 상응하는 클론 삽입체는E. coli유전자rspG 및,rspL과 핵산 서열 상동성을 가지며, 두 개의 부가적인 유전자fusA 및,tufA를 포함하는 오페론에 상응한다. 오페론에 있는 어느 유전자(들)이 증식에 필요한 것인지를 결정하기 위해, 각 유전자는 상동적 재조합에 의해 선택적으로 불활성화된다. 유전자rspL는 오페론에 있는 첫 번째 유전자이며, 동시에 불활성화되는 첫 번째 유전자이다.

E. coli유전자 염색체 복제물의 결실 불활성화(deletion inactivation)는 통합적인 유전자 대체에 의해 이루어질 수 있다. 이 방법(Hamilton, C.M., 등1989.J. Bacteriol. 171: 4617-4622)의 이론은, 표적이 되는 유전자의 돌연변이 대립 유전자를 제한적인 자살(conditional suicide) 벡터안에 작제하고, 이를 염색체 안으로 도입함으로써 본래의 천연형 대립 유전자와 벡터 서열을 제거하는 것이다. 이 방법을 이용하여, 프로모터와 작동자는 본래(original) 상태로 남겨둔 채 본래의 유전자만 원하는 돌연변이로 대체할 수 있다. 유전자의 필수성은 유전 분석에서 추론되거나 또는 표적 유전자의 천연형 복제물을 제한적으로 발현(트랜스 상보성)시킴으로써 결정된다.

번째 단계는 PCR 증폭을 이용하여 돌연변이된rspL대립 유전자를 생성하는 것이다. 두 개의 PCR 프라이머를 이용하여, 커다란 중앙 결실(central deletion)로 인해 불활성화된rspL복제물을 생산하였다. 극성 효과를 제거하기 위하여, 대부분의 인프레임 결실 또는rspL유전자의 암호화 부위를 포함하는 돌연변이 대립 유전자를 작제하는 것이 좋다. PCR 프라이머 각각은 증폭될 유전자의 측면에 있는 부위가 재조합되기에 충분히 길어지도록 선택되었고(전형적으로, 결실의 양쪽으로 적어도 500개의 뉴클레오티드), 표적이 되는 결실 또는 돌연변이는 증폭된 단편 안에 포함된다. PCR 산물의 클로닝을 용이하게 하기 위해, PCR 프라이머는 pK03(Link, 등 1997J. Bacteriol. 179(20): 6228-6237)같은 제한적인 넉아웃(knockout) 벡터의 암호화 부위에서 발견되는 NotI, SalI, BamHI 및, SmaI 등의 적절한 제한 효소 자리를 포함한다.rspL유전자 단편은 Hot Start Taq PCR kit(Quigen, Inc., Valencia, CA)의 사용 설명서에 있는 기본적인 PCR 조건에서 생산되지만, 이 조건으로 국한되지는 않는다. PCR 반응은 서로 융합될 수 있는 두개의 단편을 생산한다. 한편, 교차 PCR은 단 한번의 단계로 원하는 결실을 생성하기 위해 이용될 수 있다 (Ho, S.N., 등 1989.Gene77:51-59, Horton, R.M., 등 1989.Gene77: 61-68). 생성된 돌연변이 대립 유전자는 그것이 기능적인 유전자 산물을 생산할 수 없기 때문에 "무효(null)" 대립 유전자라 한다.

PCR 증폭을 통해 획득된 돌연변이 대립 유전자는 pK03의 다중 클로닝 자리(multiple cloning site)로 클로닝된다.rspL무효 대립 유전자의 클로닝에서 방향성은 필요하지 않다. PK03 벡터는 pSC101에서 유래한 온도 민감성 복제 기원을 가지므로, 생성된 클론은 허용 온도 30℃에서 번식한다. 또한 벡터는 클로람페니콜 내성 유전자Bacillus subtilis sacB유전자의 두 가지 선택적인 표식 유전자 모두를 포함하며,sacB유전자는 자당을 포함하는 생장 배지에서의 반대-선택(counter-selection)을 위한 것이다. 삽입된 무효 대립 유전자를 갖는 벡터 DNA를 포함하는 클론은 제한 효소 분석 및, 분리한 플라스미드의 DNA 서열 분석을 통해 확증되고,rspL무효 대립 유전자를 가지는 플라스미드는 넉아웃 플라스미드라 한다.

일단, 넉아웃 플라스미드가 작제되고, 그 서열이 확인되면, 플라스미드는 일렉트로포레이션같은 기본적인 방법에 의해 Rec⁺ E. coli숙주 세포로 형질전환된다. 형질전환된 세포의 일부에서, 플라스미드에 있는rspL무효 대립 유전자와 염색체에 있는rspL유전자 사이의 상동적 재조합에 의해 플라스미드는E. coli염색체로 통합된다. 이러한 현상이 일어난 형질전환체는 클로람페니콜이 존재하는 비허용온도 43℃에서의 생장을 통해 쉽게 선택될 수 있다. 이 온도에서, 플라스미드는 에피좀(episome)으로 복제되지 않고, 군락이 생장하고 분열함에 따라 세포로부터 상실되므로, 결국 세포도 클로람페니콜에 대한 내성을 상실하여 클로람페니콜의 존재에서 생장하지 않는다. 그러나, 넉아웃 플라스미드를E. coli염색체로 통합한 세포는 클로람페니콜에 대한 내성을 유지하여 번식한다.

단일 교차 현상의 결과, 벡터 서열에 의해 분리된rspL의 천연형과 돌연변이형 대립 유전자의 나란한 반복체를 생성한 세포는 통합된 넉아웃 플라스미드를 가지며,rspL를 여전히 발현한다. 유전자가 생장에 필수적인지의 여부를 결정하기 위해, 천연형 복제물은 플라스미드 삭제(excision)에 의해 제거되어야만 한다. 플라스미드 삭제란, 두 대립 유전자 사이의 상동적 재조합에 의해 플라스미드 서열이 구부러지면서 떨어져 나오게 되는(splicing out) 과정이다. 이러한 삭제 현상에 의해sacB유전자를 포함하는 플라스미드 서열을 상실한 세포는 자당이 포함된 배지에서 선택된다. sacB유전자 산물은 자당을 독성 분자로 변환시킨다. 그러므로, 자당에 의한 반대 선택은 선택된 클론이 더 이상 플라스미드 서열을 포함하지 않는다는 것을 증명하는 것이다. 플라스미드 서열의 상실은 클로람페니콜에 대한 감작성을 조사하여 추가로 증명된다 (클로람페니콜 내성 유전자의 상실).sacB유전자의 돌연변이는 때때로 플라스미드 복제에는 아무런 영향도 없이sacB기능만을 상실하는 결과를 가져올 수 있기 때문에, 후자의 조사는 중요하다 (Link, 등 1997J. Bacteriol. 179 (20): 6228-6237). 이들 인공적인 클론은 플라스미드 서열을 여전히 포함하고 있으므로 클로람페니콜에 대해 내성을 갖는다.

플라스미드 삭제 과정에서, 두rspL대립 유전자 중 어느 하나는 염색체에서 상실된다. 일반적으로, 무효 대립 유전자 또는 천연형의 대립 유전자는 거의 같은 비율로 상실된다. 그러므로,rspL유전자가 필수적이지 않다면, 본 실험의 클론 중 절반은 염색체에 천연형의 대립 유전자를 가질 것이고, 남은 절반은 무효 대립 유전자를 가질 것이다. 그러나,rspL유전자가 필수적이라면, 무효 대립 유전자의 단일 복제물은 세포에게 치명적이기 때문에 무효 대립 유전자를 포함하는 세포는 생성되지 않는다.

rspL의 필수성을 결정하기 위해, 생성된 클론 중 통계적으로 유효한 개수인 적어도 20개의 클론을rspL유전자의 PCR 증폭을 통해 분석하였다. 무효 대립 유전자는rspL유전자의 대부분을 상실하고 있기 때문에, 그것의 PCR 산물은 천연형 유전자의 것에 비해 매우 짧아서, 젤 전기영동 분석을 통해 쉽게 구별할 수 있다. 또한, 추가의 확증을 위해 PCR 산물을 서열 분석하였다.

전기 실험은rspL등의 유전자의 필수성을 결정하는데 일반적으로 이용된다. 그러나, 유전자의 필수성을 직접적으로 확증하는 것이 필요 또는 바람직하고, 이것을 위한 여러가지 방법들이 알려져 있다. 일반적으로, 이들 방법은 1) 천연형 대립 유전자를 포함하는 에피좀을 작제하는 단계, 2) 에피좀성 천연형 대립 유전자 및, 돌연변이 무효 대립 유전자의 단일 염색체성 복제물을 포함하는 클론을 분리하는 단계 및, 3) 에피좀성 대립 유전자의 발현이 중단되었을 때, 세포가 생존하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 전기의 세 단계와 연관되어 있다. 이러한 경우, 천연형rspL의 트랜스 복제물은rspL의 전체 암호화 부위를 PCR 클로닝한 다음,E. coli lac프로모터 같은 유도성 프로모터의 하류에 센스 방향으로 삽입함으로써 만들어진다.rspL대립 유전자의 전사는lac억제제(repressor)를 불활성시키는 IPTG에 의해 유도된다. IPTG로 유도된 상태에서,rspL단백질은 재조합 유전자가 샤인 달가노 서열(Shine-Dalgarno Sequence)로 알려진 리보좀 결합 자리를 포함하는 만큼 계속해서 발현될 것이다.rspL의 트랜스 복제물은 pSC101과 양립 가능한 p15A, pBR322 및, pUC 등의 플라스미드로 클로닝된다. 양립성 플라스미드의 복제는 온도에 민감하지 않으며,rspL대립 유전자의 통합과 최종적인 플라스미드 삭제까지의 전 과정은 기능적인rspL단백질의 발현을 완벽하게 유지하기 위하여 IPTG가 존재하는 조건에서 수행되었다.rspL무효 대립 유전자가rspL천연형 대립 유전자대신 염색체로 통합되었음을 확증한 후에, IPTG를 차단하였고, 이로써 기능적인rspL단백질의 발현도 중단되게 된다. 만약rspL유전자가 필수적이라면, 세포는 이러한 조건에서 증식을 중단할 것이지만,rspL유전자가 필수적이지 않다면, 세포는 증식을 계속할 것이다. 본 실험에서, 필수성은 의도적인 염색체성 파괴(chromosomal disruption)에 의한 무능력(inability)보다는 유전자의 천연형 복제물을 제한적인으로 발현함으로써 결정된다.

다른 여러가지 유전자 파괴 기술과 달리 이 방법이 갖는 장점은 커다란 외부 DNA 절편을 도입하지 않고 표적 유전자를 결실하거나 돌연변이시킬 수 있다는 것이다. 그러므로, 하류에 있는 유전자에 대한 극성 효과는 제거되거나 최소화된다. 잠재적인 필수 세균 유전자의 상류에 유도성 프로모터를 도입하는 여러가지 방법들이 있지만, 다중 전사 개시점으로부터의 극성이 문제가 될 수 있다. 이것을 해결하는 한 가지 방법은 강력한 전사 종결점을 포함하는 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)을 통합된 유도성 프로모터의 상류에 삽입하는 것이다 (Zhang, Y. 와 Cronan, J.E. 1996J. Bacteriol. 178 (12): 3614-3620). 이 기술은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 익숙할 것이다.

rspL유전자를 분석한 후, 오페론에 있는 다른 유전자의 증식과의 관련성 여부가 조사되어 결정되었다.

실시예 6

E. coli 증식에 필요하다고 동정된 유전자에 암호화되어 있는 단백질의 발현

하기 실시예는 전기에 동정된 서열에 암호화되어 있는 증식 관련 단백질을 발현하는 전형적인 한 가지 방법을 제공한다. 첫째, 유전자의 개시 코돈과 종결 코돈이 동정된다. 필요하다면, 널리 알려진 방법을 이용하여 단백질의 번역 또는 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 발현되어질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 개시 자리로 제공되는 메티오닌 코돈을 결핍하고 있는 경우, 강력한 샤인-달가노 서열(Shine-Delgarno sequence) 또는 종결 코돈 서열을 핵산으로 삽입할 수 있다. 이것과 유사하게, 동정된 핵산 서열이 전사 종결 신호를 결핍하고 있는 경우, 적절한 증여 서열로부터 원하는 서열을 잘라 삽입할 수 있다. 추가적으로, 암호화 서열은 강력한 프로모터 또는 유도성 프로모토에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현되어질 폴리펩타이드를 암호화하는 동정된 핵산 서열 또는 그것의 부분은 세균 발현 벡터 또는 게놈에서 PCR을 통해 획득되며, PCR은 동정된 핵산 서열과 상보적이고, 5' 프라이머의NcoI제한 효소 서열과 3' 프라이머 5' 말단의BglII서열을 포함하며, 동정된 핵산 서열이 종결 신호를 갖는 프레임(frame)내에 위치하도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 이루어진다. PCR 반응으로 획득된 단편은 정제되고,NcoI과BglII로 절단된 후 다시 정제되어 발현 벡터로 연결된다.

연결된 산물은 단백질의 과잉 발현에 적합한 DH5a 또는 다른E. coli주로 널리 알려진 방법에 의하여 형질전환된다. 예를 들어, 형질전환 방법은 Current Protocols on Molecular Biology, Vol. 1, Unit 1.8, (Ausubel, 등, Eds.) John Wiley & Sons, Inc. (1997)에 기술되어 있다. 성공적인 형질전환체는 50 내지 100mg/mL의 암피실린(ampicillin) (Sigma, St. Louis, Missouri)을 포함하는 플레이트(plate) 배양에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 발현된 단백질은 숙주 생물체의 세포질에 존재하게 된다. 다른 실시태양에서, 발현된 단백질은 배양 배지로 분비된다. 또 다른 실시태양에서, 발현된 단백질은 페리플라즘 공간(periplasmic space)에 격리되어 있으며, 본 분야에 널리 알려진 많은 세포 용해(lysis) 기술 중 하나에 의해 유리(liberation)될 수 있다. 예를 들어, 삼투 충격을 이용한 세포 용해 방법은 Current Protocols on Molecular Biology, Vol. 2, (Ausubel, 등, Eds.) John Wiley & Sons, Inc. (1997) 단원 16에 기술되어 있으며, 이들 각 방법은 증식 관련 단백질을 발현하기 위해 이용될 수 있다.

배양 배지로 발현된 단백질 또는 세포질 및, 페리플라즘 공간으로부터 유리된 단백질은 암모늄 설페이트침전(ammonium sulfate precipitation), 기본적인 크로마토그래피, 면역침전(immunoprecipitation),면역크로마토그래피(immunochromatography), 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및, HPLC같은 관습적인 기술을 이용하여 상측액(supernatant)으로부터 정제 또는 농축된다. 한편, 분비된 단백질은 추가의 농축없이 그대로 이용될 수 있을만큼 숙주의 배양 배지 상층액에 충분히 농축되고 정제된 상태로 존재할 수 있다. 획득된 단백질 산물의 순도는 쿠마시(coomassie) 염색이나 실버 염색같은 기술 또는 대조군 단백질에 대한 항체를 이용하여 평가될 수 있다. 쿠마시 염색과 실버 염색은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 익숙할 것이다.

관심있는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 본 분야에 널리 알려진 방법에 의해 합성된 펩타이드를 이용하여 생성할 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual. (Harlow and Lane, Eds) Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 예를 들어, 관심있는 유전자 서열 또는 그것의 부분에 암호화되어 있는 서열을 포함하여 15개로 구성된 펩타이드를 화학적으로 합성할 수 있다. 관심있는 핵산 서열 또는 그것의 부분에 암호화되어 있는 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성하기 위해 합성된 펩타이드가 쥐로 주사된다. 한편, 전기에 논한 발현 벡터로부터 발현된 단백질 시료는 정제되고, 재조합적으로 발현된 단백질과의 동일성을 확증하기 위해 아미노산 서열 분석되어진 다음, 항체 생성에 이용된다. 모노클론성과 폴리클론성 항체를 생성하는 자세한 실례는 실시예 7에 나타나 있다.

관심있는 핵산 서열 또는 그것의 부분에 암호화되어 있는 단백질은 기본적인 면역크로마토그래피 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 이러한 방법에서, 생장 배지 또는 세포 추출물은 분비된 단백질을 포함하는 용액은 분비된 단백질에 대한 항체가 크로마토그래피 충진물에 부착되어 있는 컬럼으로 적용되고, 분비된 단백질은 이 컬럼에 결합한다. 그런 다음, 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 컬럼을 세척하고, 특이적으로 결합되어 있는 단백질을 컬럼에서 용출하여 회수한다. 이를 위한 방법은 본 분야에 널리 알려져 있다.

다른 단백질 정제 방법은 관심있는 핵산 서열 또는 그것의 부분을 키메라(chimera) 폴리펩타이드를 수용하기 위해 설계된 발현 벡터로 삽입시킨다. 이러한 방법에서, 관심있는 핵산 서열 또는 그것의 부분에 있는 암호화 서열은 키메라 단백질의 다른 쪽 절반을 암호화하는 유전자와 같이 인프레임으로 삽입된다. 키메라의 다른 쪽 절반은 말토스 결합 단백질(MBP) 또는 니켈 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 될 수 있다. MBP 또는 니켈에 대한 항체가 부착된 크로마토그래피 충진물이 키메라 단백질을 정제하는데 이용된다. 단백질 분해 효소 절단 자리는 MBP 또는 니켈 결합 펩타이드를 암호화하는 유전자와 관심있는 유전자 사이에 공정될 수 있다. 또한, 키메라를 형성하는 두 폴리펩타이드는 단백질 분해 효소 반응에 의해 서로 분리될 수 있다.

MBP 융합 단백질을 생성하는 유용한 하나의 발현 벡터는malE유전자를 암호화하는pMAL(New England Biolabs)이다. pMal 단백질 융합 시스템에서, 클로닝된 유전자는 pMal의malE유전자의 하류에 삽입되고, 발현된 MBP-융합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된다. 이들 기술은 분자 생물학 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있다.

실시예 7

분리된 E. coli 단백질에 대한 항체의 생산

고순도의 단백질 또는 폴리펩타이드를 실시예 6의 방법을 이용하여 형질전환된 세포로부터 분리하였다. 최종 제조된 단백질의 농도는, 예를 들면, 분자량 10,000 이하를 제거시키는 AMICON 필터 기구(Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 농축함으로써 대략 mg/mL 수준으로 조정하였다. 단백질에 대한 모노클론성 또는 폴리클론성 항체는 하기와 같이 제조될 수 있다.

하이브리도마(hybridoma) 융합에 의한 모노클론성 항체의 생산

기술된 바와 같이 동정되고 분리된 펩타이드 중 어느 하나에 있는 에피톱(epitope)에 대한 모노클론성 항체는 Kohler, G.과 Milstein, C., Nature 256: 495 (1975)의 전통적인 방법 또는 그에서 파생되어 널리 알려진 방법에 의해 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 간단히 말해, 선택된 단백질 또는 그로부터 파생된 펩타이드 몇 mg을 몇 주에 걸쳐서 반복적으로 쥐에 주사하였다. 그런 다음, 쥐를 죽여 비장으로부터 항체를 생산하는 세포를 분리하였다. 비장 세포는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 쥐의 미엘로마 세포(myeloma cell)와 융합되었고, 아미노프테린(aminopterin)을 포함하는 선택적인 배지(HAT 배지)에서의 생장을 통해 융합되지 않은 세포들을 제거하였다. 성공적으로 융합된 세포를 희석하여, 그 중 일부를 마이크로타이터(microtiter)의 웰(well)에서 계속 생장시켰다. Engvall,E., "Enzyme immunoassay ELISA and EMIT", Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)의 ELISA 및, 그것에서 파생된 방법 등의 면역분석 방법에 의해 웰의 상층 용액에서 항체를 생산하는 클론이 탐지(detection)되고, 동정되었다. 선택된 클론을 대량 배양하였고, 모노클론성 항체 산물을 수집하였다. 모노클론성 항체 생산을 위한 자세한 방법은 Davis, L등의 Basic Method in Molecular Biology Elsevier, New York. 절(section) 21-2에 기술되어 있다.

면역(immunization)에 의한 폴리클론성 항체의 생산

단일 단백질 또는 펩타이드의 이종 유전형(heterogeneous) 에피톱에 대한 항체를 함유하는 폴리클론성 항혈청(antiserum)은 면역원성(immunogenicity) 증가를 위해 변형되거나 변형되지 않은 전기 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 적절한 동물을 면역시킴으로써 제조될 수 있다. 효과적인 폴리클론성 항체 생산은 항원(antigen)과 숙주 종 둘 모두에 관련된 많은 요소에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 작은 분자는 큰 분자보다 면역원성이 약한 경향이 있고, 담체 및, 어쥬번트(adjuvant)를 필요로 할 수 있다. 또한, 숙주 동물은 주사 자리 및, 낮은 타이터의 원인이 되는 항원의 부적절한 양 또는 과다 양에 대한 반응이 다양하다. 다중 피내 자리(multiple intradermal site)로 적은 양(ng 수준)의 항원을 투여하는 것이 가장 효과적이다. 토끼에 대한 효과적인 면제 실험 방법은 Vaitukaitis, J. 등의 J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-991 (1971)에서 발견할 수 있다.

규칙적인 간격을 두고 보조 주사(booster injection)를 이용할 수 있고, 예를 들면, 항혈청의 항체 타이터가 알고 있는 농도의 항원에 대한 이중의 면역확산(double immunodiffusion)에 의해 준정량적으로(semi-quantitatively) 결정된 것처럼 떨어지기 시작하면, 항혈청을 수집한다. 예를 들면, Ouchterlony, O.등의 Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973) 단원 19를 참조할 수 있다. 항체의 고원(plateau) 농도는 일반적으로 세럼의 0.1 내지 0.2mg/mL 범위(약 12M)내에 있다. 항원에 대한 항혈청의 친화성은, 예를 들면, Fisher, D.의 Manual of Clinical Immunology 2d Ed (Rose and Friedman, Eds) Amer. Soc. For Microbial., Washington. D.C. (1980) 단원 42에 기술된 바와 같이, 경쟁적 결합 곡선에 의해 결정된다.

제조된 항체는 생물학적 시료에 존재하는 항원 산출 물질(antigen-bearing substances)의 농도를 결정하는 정량적 면역분석에 유용하고, 생물학적 시료에서 항원의 존재를 동정하기 위해 준정량적 또는 준정성적으로 이용될 수 있다. 또한, 항체는 단백질을 발현하는 세균 세포를 죽이기 위한 치료용 성분으로 이용될 수 있다.

실시예 8

화학적 라이브러리의 선별

A. 단백질에 기초한 분석

증식에 필요한 세균 단백질의 동정 및, 발현에 의하여, 본 발명은 잠재적인 약제 후보 화합물 라이브러리를 선별하는 분석에 발현된 단백질을 이용하는 방법을추가로 고찰하였다. 화학적 라이브러리의 생성 방법은 널리 알려져 있다. 예를 들어, 조합 화학(combinatorial chemistry)은 본문에 기술된 분석으로 선별되어질 화합물의 라이브러리를 생성하는데 이용될 수 있다. 조합 화학 라이브러리는 많은 수의 화학적 빌딩 블록(building block) 시약의 조합을 통한 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 수집체(collection)이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 라이브러리같은 선형 조합 화학은 주어진 길이의 펩타이드를 산출하기 위한 모든 가능한 조합으로 아미노산을 조합함으로써 형성된다. 수백만의 화학적 화합물은 이론적으로는 화학적 빌딩 블록의 조합을 통해 합성될 수 있다. 예를 들어, 100개의 상호교환가능한 화학적 빌딩 블록을 체계적으로 조합할 수 있는 주석자(commentator)는 이론적으로는 1억 개의 4중 화합물(tetrameric compound) 또는 100억 개의 5중 화합물을 합성할 수 있다. (Gallop 등, "Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery, Background and Peptide Combinatorial Libraries" Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 37. No. 9, 1223-1250(1994). 천연물 라이브러리를 포함하여, 본 분야에 알려져 있는 다른 화학적 라이브러리들이 이용될 수 있다.

일단 생성된 조합 라이브러리를 바람직한 생물학적 특성을 갖는 화합물을 선별하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, 약제로서 유용하거나 또는 약제로 발전될 수 있는 화합물은 전기에 기술된 바와 같은 방법으로 동정, 발현 및, 정제된 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 추가적으로, 동정된 표적 단백질이 효소라면, 후보 화합물은 표적 단백질의 효소적 특성을 저해할 수 있다. 어느 효소라도 표적 단백질이 될 수 있으며, 예를 들어, 표적 단백질의 효소적 기능은 단백질 분해 효소(protease), 핵산 분해 효소(nuclease), 인산화 효소(phosphatase), 탈수소 효소(dehydrogenase), 전달 단백질(transpoter protein), 전사 효소 및, 알려지거나 알려지지 않은 다른 효소 타입으로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명은 전기에 기술된 단백질 산물을 조합 화학적 라이브러리를 선별하기 위해 이용하는 방법을 고찰하였다.

당 업계의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 치료제의 발견과 발전에 유용한 분자를 동정하기 위한 표적 단백질을 특성화하는 많은 기술이 존재한다는 것에 동의할 것이다. 예를 들어, 어떤 기술은 작은 펩타이드를 생성하고, 그것을 이용하여 화학적으로 그리고 유전적으로 표적 단백질을 분석하고 탐색함으로써 작은 약제 분자를 동정하고 발전시키는 것과 연관되어 있다. 이러한 기술은 PCT 발행 번호 WO9935494, WO9819162 및, WO9954728에 기술된 방법을 포함하며, 개시 내용을 온전히 참고 자료로 본문에 개시하였다.

다른 실시예에서, 표적 단백질은 세린 단백질 분해 효소이고, 이 단백질의 기질은 알려져 있다. 본 실시예는 표적 효소의 저해제로 작용하는 화합물을 동정하기 위해 화합물의 라이브러리를 분석한다. 첫째, 널리 알려져 있는 조합 라이브러리 형성 방법을 이용하여 작은 분자 라이브러리를 생성한다. Agrafiotis등의 미국 특허 번호 5,463,564 및, 5,574,656, 표제 "System and Method of Automatically Generating Chemical Compound with Desired Properties"는 관련된 두 가지 기술이다. 그런 다음, 바람직한 구조적 특성과 기능적 특성을 갖는 화합물을 동정하기 위해 라이브러리를 선별한다. 미국 특허 번호 5,684,711는 라이브리러를 선별하는 방법을 기술하고 있다.

선별 과정을 구체적으로 설명하자면, 표적과 화학적 화합물을 조합한 라이브러리는 정제된 효소에 노출되어 효소와 상호 작용하였고, 표지된 기질이 첨가되었다. 기질의 표지는 대사되는 기질 분자로부터 방출되는 탐지가능한 신호이다. 신호의 방출은 표적 효소의 효소적 활성에 대한 조합 라이브러리 화합물의 효과를 측정한다. 각 라이브러리 화합물의 특징을 암호화하여서 효소에 대한 활성이 증명된 화합물을 분석하고, 또한 동정된 다양한 화합물에 대한 공통적인 특색을 동정하여 라이브러리의 미래 반복(future iteration)과 조합한다.

일단 화합물 라이브러리가 선별되고 나면, 첫 회의 선별에서 표적 효소에 대해 활성을 가졌었던 화학적 빌딩 블록을 이용하여 다음 라이브러리를 생성한다. 이러한 방법으로 계속 반복된 후보 화합물은 표적 효소의 기능을 저해하는데 필요한 구조적이고 기능적인 특색을 점점 더 갖게 될 것이고, 이것은 표적 효소에 대해 높은 특이성을 갖는 저해제 그룹이 발견될 때까지 계속된다. 이들 화합물은 포유류에서 이용 가능한 항생제로서의 안정성과 효험이 추가로 조사될 수 있다.

이러한 특별한 선별 방법론은 하나의 좋은 예일 뿐이며, 다른 여러가지 방법들이 널리 알려져 있다. 예를 들면, 표적 단백질의 생화학적 기능이 알려져 있는 경우, 수많은 천연-발생적 표적을 선별하는 다양한 선별 방법이 널리 알려져 있다.

B. 세포에 기초한 분석

통용되고 있는 세포에 기초한 분석은 약제 발견이나 발전을 위해 화합물을 동정 또는 특성화하는데 이용되며, 주로 세포안에 위치하거나 세포 표면에 위치하는 표적 분자의 활성을 저해하는 화합물의 능력을 탐지한다. 표적 분자의 대부분은 효소, 수용체(receptor) 및, 그와 유사한 것 등의 단백질이다. 그러나. 표적 분자는 또한 DNA, 지방, 탄수화물 및, mRNA, rRNA, tRNA와 그와 유사한 것들을 포함하는 RNA 같은 다른 분자일 수 있다. 높은 감작성을 갖는 세포에 기초한 분석 방법은 조사 화합물과 표적 분자와의 특이적인 결합 및, 상호 작용을 탐지하는데 이용된다. 그러나, 이들 방법은 조사 화합물이 표적 분자와 낮은 친화성 또는 중간의 친화성으로 결합하거나 상호 작용한다면, 그다지 효과적이지 않다. 추가적으로, 표적 분자가 세포 내부에 위치하거나 또는 세균 세포의 페리플라즘 같은 세포 구획(compartment)에 위치하는 경우, 수용액 내에서 표적 분자가 조사 화합물에 접근하기란 쉽지 않은 일이다. 또한, 통용되고 있는 세포에 기초한 분석 방법은 낮은 친화성 또는 중간의 친화성으로 표적과 상호 작용하는 화합물 또는 접근하기 어려운 표적과 상호 작용하는 화합물을 동정하거나 특성화하는 데에는 효과적이지 않다.

본 발명의 세포에 기초한 분석 방법은 본 분야에서 실제적으로 통용되고 있는 세포에 기초한 분석에 비해 확실한 장점을 가진다. 이 장점은 증식 관련 유전자 산물(표적 분자)의 수준 또는 활성이, 유전자 산물의 기능 존재나 부재가 세포 증식의 속도 결정 단계가 되는 지점의 수준으로 특이적으로 감소된다는 사실에서 파생된 것이다. 세균 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 또는 동물 세포가 본 방법에이용될 수 있다. 감작화된 세포는 효과적인 표적 분자에서 활성인 화합물에 대해 훨씬 더 감작된다. 또한, 본 발명의 세포에 기초한 분석은 관심있는 표적 분자에 대해 낮은 활성 또는 중간의 활성을 갖는 화합물을 탐지해 낼 수 있으며, 이것은 그 화합물이 비감작화된 세포에서보다 감작화된 세포에서 보다 강력하기 때문이다. 조사 화합물의 효과는 두 배에서 수 배만큼 더욱 강력해지며, 감작화된 세포와 비감작화된 세포를 비교했을 경우, 그 효과는 적어도 10배 이상 또는 심지어 적어도 100배 이상으로 훨씬 강력해질 수 있다.

병원성 미생물에서 증가되는 항생제 내성 및, 현재 통용되고 있는 일부 항생제와 관련된 커다란 부수적인 효과로 인하여, 새로운 표적과 작용하는 새로운 항생제가 이후 시급히 요구되고 있다. 세포에 기초한 분석과 관련된 다른 하나의 제한점은 제한된 부위의 생물학적 경로에 있는 제한된 종류의 표적 분자에 대한 화합물들만 계속적으로 동정되고 있다는 것이다. 이러한 현상은 새로운 표적과 작용하는 분자가 탐지 과정에서 버려지거나, 무시되거나, 또는 탐지에 실패한 경우에 발생하며, 이와 같은 탐지의 문제는 기존의 표적과 작용하는 화합물들이 보다 빈번하게 탐지되는 동시에 새로운 표적과 작용하는 화합물에 비해 훨씬 강력하게 탐지되기 때문이다. 결과적으로, 현재 통용되고 있는 항생제의 대부분은 매우 제한된 범위의 생물학적 경로에 있는 비교적 적은 수의 표적 분자와 상호 작용하고 있다.

본 발명에 이용된 감작화된 세포는 두 가지 방식으로 전기의 문제를 해결한다. 첫째, 표적이 새로운 표적이든 또는 이전에도 알려지긴 했지만 미개척된 표적이든 간에, 관심있는 표적과 작용하는 바람직한 화합물은, 본 발명의 감작화된 세포에서 조사되었을 경우 바람직한 표적의 능력이 특이적으로 충분히 증가되기 때문에, 기존의 표적과 작용하는 화합물의 잡음("noise") 속에서도 탐지될 수 있다. 둘째, 관심있는 표적과 작용하는 화합물에 대해 감작화된 세포는 또한 같은 생물학적 경로에 있는 다른 표적 분자와 작용하는 화합물에 대해서도 감작될 수 있다. 예를 들어, 리보좀 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 분자의 발현은 리보좀 단백질과 작용하는 화합물에 대해 세포를 감작시키고, 리보좀 성분 (단백질 또는 RNA) 중 어느 하나와 작용하는 화합물 또는 심지어 단백질 합성 경로의 일부분에 있는 표적과 작용하는 화합물에 대해서도 세포를 감작시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 중요한 장점은 기존에는 쉽게 접근할 수 없었던 새로운 표적과 그것의 경로를 결정해 주는 것이다.

본 발명의 감작화된 세포는 표적 분자의 활성 또는 수준을 감소시킴으로써 제조된다. 표적 분자는 본문에 기술된 증식 관련 핵산으로부터 생산되는 RNA 또는 폴리펩타이드 같은 유전자 산물, 본문에 기술된 증식 관련 핵산을 포함하는 오페론 내부 서열로부터 생산되는 RNA 또는 폴리펩타이드, 또는 본문에 기술된 증식 관련 핵산과 같은 생물학적 경로에 있는 RNA 또는 폴리펩타이드 일 수 있다. 생물학적 경로는 세포벽 같은 세포 구조물 생산과 관련된 경로뿐만 아니라, 효소적 경로, 생화학적 경로 및, 대사적 경로를 포함하지만, 이것으로 국한되지는 않는다.

현대 의학 화학과 조합 화학 분야에서 통용되는 방법들은 직접 결합 분석과 세포에 기초한 분석을 포함하는 다양한 생물학적 분석으로 조사된 화합물로부터 얻은 구조-활성 관련 정보(structure-activity relationship information)를 이용한다. 때때로, 약제로 발전될 충분한 잠재력이 있는 화합물이 전기의 분석을 통해 직접적으로 동정된다. 매우 종종, 초기의 히트(hit) 화합물은 중간적이거나 낮은 효능을 나타낸다. 일단 히트 화합물이 동정되면, 보다 강력한 화합물을 동정하기 위한 화합물의 직접적인 라이브러리(directed library)가 합성되고 조사된다. 일반적으로 이들 직접적인 라이브러리는 히트 화합물과 관련된 구조를 갖는 화합물로 구성되지만, 다양한 구조적 특색의 첨가, 공제(subtraction) 및, 교체(substitution) 등의 전체적인 변이(variation)를 포함한다. 표적 분자에 대한 활성이 조사되어, 구조적 특색이 단독으로 또는 다른 특색과 조합되어 활성을 증가시키거나 감소시키는 것으로 확인되었다. 이 정보는 표적 분자에 대해 증가된 활성을 갖는 화합물을 포함하는 이후의 직접적인 라이브러리를 설계하는데 이용된다. 이러한 과정을 한 번 또는 여러 번 반복한 후에, 표적 분자에 대해 충분히 증가된 활성을 갖는 화합물이 동정되고, 약제로 발전될 수 있다. 이 과정은 본 발명의 감작화된 세포에 의해 촉진될 수 있으며, 이것은 선택된 표적과 작용하는 화합물이 감작화된 세포에 의한 세포에 기초한 분석에서 증가된 활성을 보여주고, 또한, 세포에 기초한 분석을 통해 다른 방법으로 얻어진 것보다 훨씬 유용한 정보를 제공하는 다수의 화합물들을 특성화할 수 있기 때문이다.

또한, 기존의 세포에 기초한 분석으로는 쉽게 개척되지 않았던 표적과 작용하는 화합물 및, 동정 또는 특성화가 쉽지 않았던 화합물을 동정 또는 특성화하기 위해, 본 발명의 세포에 기초한 분석을 이용할 수 있다. 초기의 히트 화합물을 강력한 약제 화합물로 발전시키는 과정도, 같은 수의 조사 화합물에서 보다 많은 구조-기능 관련 정보를 얻을 수 있는 본 발명의 세포에 기초한 분석에 의해 충분히 향상될 수 있다.

감작화된 세포를 이용하기 위해서는, 적절한 유전자 또는 오페론을 선택해야만 하며, 이들의 발현이 감작화될 세포의 증식에 필요하다. 다음 단계는 적절한 유전자 또는 오페론과 교잡할 수 있는 안티센스 RNA 또는 적절한 유전자 또는 오페론에 암호화된 RNA를 감작화된 세포로 도입하는 단계이다. 안티센스 RNA의 도입은 발현 벡터에 의해 이루어지고, 발현은 벡터의 유도성 프로모터 통제하에서 이루어진다. 생산되는 안티센스 RNA 양은 세포에 노출되는 유도제의 농도 변화를 통해 프로모터의 활성을 변화시킴으로써 제한된다. 또한, 세포는 안티센스 RNA 발현을 치사 이하 수준으로 일으키는 유도제 농도와 접촉함으로써 감작화된다.

세포에 기초한 분석과 관련된 하나의 실시태양은 본 발명의 동정된 외부E. coli핵산 서열을 증식 관련 단백질의 생산을 저해하기 위해 이용한다. 증식에 필요한 유전자에 대한 안티센스 핵산을 생산하는 발현 벡터는 심각한 생장 저해없이 증식 관련 단백질의 농도를 제한하기 위해 이용된다. 이것을 위하여, 안티센스 발현으로 인한 생장 저해에 상응되는 다양한 양의 유도제를 플랏(plot)하여 유도제의 생장 저해량 곡선을 생성하였다. 이 곡선으로부터, 생장 저해를 유도하는 1% 에서 100% 까지의 다양한 백분율이 결정될 수 있다. 발현 벡터에 포함되어 있는 프로모터는lac억제제에 의해 전사가 조절되는lac작동자를 포함하며, 프로모터로부터의 발현은 IPTG에 의해 유도된다. 예를 들어, 생장 속도를 감소시키지 않는, 다시 말해 0%의 생장 저해를 일으키는 IPTG의 최고 농도를 생장 저해량 곡선으로부터 예상할 수 있다. 세포 증식은 OD 측정에 의한 생장 배지의 혼탁도(turbidity)를 통해 나타난다. 다른 실시예는 생장을 25% 까지 감소시키는 유도제 농도와 50% 까지 감소시키는 유도제 농도를 선으로부터 예상하였다. 군락 형성 단위(colony forming unit, cfu)같은 부가적인 변수는 세포 생존력을 측정하기 위해 이용될 수 있다.

분석되어질 세포는 전기에 결정된 농도의 유도제와 접촉된다. 치사 이하 농도의 유도제는 증식 관련 유전자 산물의 양을 세균 생장이 일어나는 최소의 수준으로 감소시킨다. 그러므로, 이러한 농도의 유도제에서 생장된 세포는 관심있는 증식 관련 단백질이나 관심있는 RNA의 저해제 또는 전기 단백질이나 RNA와 같은 생물학적 경로에 있는 단백질이나 RNA의 저해제에 대해 특이적으로 훨씬 감작되지만, 관련없는 단백질이나 RNA의 저해제에 대해서는 그렇지 않다.

저해-이하(sub-inhibitory) 농도의 유도제로 전처리된 세포 및, 증식 관련 표적 유전자 산물을 감소된 양으로 포함하는 세포는 세포 생장을 감소시키는 화합물을 선별하는데 이용된다. 유도제의 치사 이하 농도는 세포를 보다 감작시키고, 후보 화합물을 동정하는 분석에 의도적으로 이용되는 농도와 일치하는 어떤 농도도 될 수 있다. 예를 들어, 유도제의 치사 이하 농도에서의 생장 저해는 적어도 대략 5%, 8%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75% 또는 그 이상이다. 전기 방법을 이용하여 감작화된 세포는 표적 단백질의 저해제에 의해 훨씬 감작되며, 이것은 이들 세포가 천연형의 세포에 비해 표적 단백질을 덜 포함하고 있기 때문이다.

본 발명의 세포에 기초한 분석과 관련되는 다른 실시태양에서, 증식 관련 유전자 산물의 수준 또는 활성은 증식 관련 서열과 증식 관련 서열에 대한 안티센스 핵산에 생성된 온도 민감성 돌연변이에 의해 감소된다. 증식 관련 유전자에 돌연변이가 일어난 온도 민감성 돌연변이체를 허용 온도와 제한 온도 사이의 중간 온도에서 생장시키면, 돌연변이체 세포는 감소된 활성의 증식 관련 유전자 산물을 갖는 세포를 생산한다. 증식 관련 서열에서 유래하는 안티센스 RNA는 증식 관련 유전자 산물의 활성을 더욱 감소시킨다. 온도 민감성 돌연변이 또는 안티센스 핵산만을 단독으로 이용해서는 발견되지 않았던 약제들은, 안티센스 발현이 유도되고 허용 온도와 제한 온도 사이의 중간 온도에서 생장된 세포가 안티센스 핵산의 발현이 유도되지 않고 허용 온도에서 생장된 세포보다 조사 화합물에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정함으로써 동정될 수 있다. 온도 민감성 돌연변이 또는 안티센스 핵산만을 단독으로 이용하여 기존에 발견한 약제는 온도 민감성 돌연변이와 안티센스 핵산을 포함하는 세포에 노출되었을 경우, 다양한 감작성 프로필(profile)을 가지며, 그 감작성 프로필은 유전자 산물의 하나 이상의 활성 저해에 대해 보다 특이적인 약제의 작용을 보여준다.

온도 민감성 돌연변이는 유전자 내의 여러 다른 자리에 위치하고, 단백질의 다양한 도메인에 상응된다. 예를 들어,Escherichia coli의dnaB유전자는 복제 포크 DNA 헬리카아제(replication fork DNA helicase)를 암호화한다. DnaB는 중합체 형성 도메인(oligomerization domain), ATP 가수분해 도메인, DNA 결합 도메인, 프리마아제(primase)와 상호 작용하는 도메인, DnaC와 상호 작용하는 도메인 및, DnaA와 상호 작용하는 도메인 등의 여러 도메인을 가진다 [(Biswas, E.E. andBiswas, S.B. 1999. Mechanism and DnaB helicase ofEscherichia coli: structural domains involved in ATP hydrolysis, DNA binding, and oligomerization. Biochem. 38: 10919-10928; Hiasa, H. and Marians, K.J. 1999. Initiation of bidirectional replication at the chromosomal origin is directed by the interaction between helicase and primase. J. Biol. Chem. 274: 27244-27248; San Martin, C., Radermacher, M., Wolpensinger, B., Engel, A., Miles, C.S., Dixon, N.E., and Carazo, J.M. 1998. Three-dimensional reconstructions from cryoelectron microscopy images reveal an intimate complex between helicase DnaB and its loading partner DnaC. Structure6: 501-9; Sutton, M.D., Carr, K.M., Vicente, M., and Kaguni, J.M. 1998.Escherichia coliDnaA protein. The N-terminal domain and loading of DnaB helicase at theE. colichromosomal. J. Biol. Chem. 273: 34255-62), 개시 내용을 온전히 참고 자료로 본문에 개시하였다]. dnaB의 다양한 도메인에 있는 온도 민감성 돌연변이는 제한 온도에서 다양한 표현형(phenotype)을 나타내며, 표현형은 DNA 손상(breakdown), 생장 중단 또는 세포 죽음을 동반하거나 동반하지 않는 DNA 복제 과정 중의 갑작스런 중단(abrupt stop) 또는 느린 중단(slow stop)을 포함한다 (Wechsler, J.A. and Gross, J.D. 1971.Escherichia colimutants temperature-sensitive for DNA synthesis. Mol. Gen. Genetics 113: 273-284, 개시 내용을 온전히 참고 자료로 본문에 개시하였다). 제한 온도에서 dnaB 유전자에 대한 안티센스를 가지는 세포의 죽음을 야기하는 dnaB 유전자의 온도 민감성 돌연변이를 조합하여 이용하면, DnaB활성 중 하나 또는 하위세트에 대한 매우 특이적이고 효과적인 저해제를 발견할 수 있다.

증식에 필요한 유전자 산물에 대한 항미생물제를 선별할 때, 제한된 양의 증식 관련 유전자 산물을 포함하는 세포의 생장 저해가 분석된다. 생장 저해는 생장 배지의 광학 밀도에 의해 측정된 실험 시료와 대조군 시료의 생장량을 직접적으로 비교함으로써 측정될 수 있다. 세포 증식을 분석하는 다른 방법은 녹색형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 리포터를 이용하는 방법, 다양한 효소 활성 분석 및, 널리 알려져 있는 여러 방법들을 포함한다.

전기 방법은 고체상(phase), 액체상 또는 두 상이 조합된 상태로 수행된다. 예를 들어, 유도제를 포함하는 영양 배지(플레이트)에서 생장된 세포는 플레이트의 배지 표면에 점적된 화합물과 접촉될 수 있다. 화합물의 효과는 생성된 킬링 존(killing zone)의 지름을 통해 판단되며, 킬링 존이란 화합물이 놓여진 지점 주변으로 세포가 생장하지 않은 지역을 나타낸다. 여러가지 화합물이 플레이트에 점적되었고, 자동 도구와 반자동 도구를 이용하여 동시에 조사되었다. 전기 도구는 멀티 채널 피펫(multiple-channel pipettes, 예: The Beckman Multimek)과 멀티 채널 점적기(multiple-channel spotters, 예: The Genomic Solutions Flexys)를 포함하지만, 이것으로 국한되지는 않는다. 이와 같은 방법으로, 많은 플레이트와 수천 내지 수백만의 화합물을 단 하루에 조사할 수 있다.

화합물은 전기에 기술된 바와 같이 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 액체 상에서 조사될 수 있다. 액체상 선별은 많은 플레이트와 수많은 화합물을 단하루에 선별하기 위하여, 96개, 384개, 1536개 또는 보다 많은 웰로 구성된 마이크로타이터 플레이트에서 행해진다. 자동 도구와 반자동 도구는 시약(예를 들면, 세포와 화합물)의 첨가와 세포 밀도 측정에 이용될 수 있다.

실시예 9

전기의 세포에 기초한 분석의 효과는 리보좀 단백질인 L7/L12, L10 및, L23을 암호화하는 rplL, rplJ 및, rplW 유전자에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 작제물을 이용하여 확인된다. 이들 단백질은 세포의 단백질 합성 기구(protein synthesis apparatus)의 일부분이며, 증식에 필요한 단백질이다. 이들 작제물은 세포 감작성에 대한 안티센스 발현의 효과를 조사하는데 이용되며, 세포 감작성은 리보좀과 결합하여 단백질의 합성을 저해하는 항생제에 대해 나타난다. 유전자 산물이 단백질 합성과 관련되지 않는 여러가지 다른 유전자(elaD, visC, yohH 및, aptE/B)에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 작제물이 비교 대상으로 이용되었다.

rplW 또는 elaD에 대한 안티센스 작제물을 포함하는 최초의 발현 벡터는 개별의E. coli세포 집단으로 도입된다. 벡터의 도입은 본 분야에 널리 알려진 기술이다. 본 실시예의 발현 벡터는 유도제가 존재할 때 안티센스 RNA를 발현하는 IPTG 유도성 프로모터를 포함하지만, 다른 유도성 프로모터를 이용할 수도 있다. 적합한 발현 벡터 또한 널리 알려져 있다. 리보좀 단백질 L7/L12, L10 및, L23을 암호화하는E. coli안티센스 클론은 세포 감작성에 대한 안티센스 발현의 효과를 조사하기 위해 이용되었고, 세포 감작성은 전기 단백질과 결합하는 항생제에 대해나타난다. 첫째, L7/L12와 L10 또는 L23을 암호화하는 유전자들에 대한 안티센스를 포함하는 발현 벡터가 개별의 세포 집단으로 도입되었다.

세포 집단은 각 클론에 대한 생장 저해량 곡선(도 1)을 위해 액체 배지에서 다양한 농도의 IPTG와 접촉되었다. 첫째, 종자 배양액(seed culture)은 특정 혼탁도를 가질때까지 배양되었고, 혼탁도는 생장 용액의 광학 밀도(OD)에 의해 특정된다. 용액의 OD는 용액에 포함되어 있는 세균 세포의 수와 직접적인 관련이 있다. 그런 다음, 액체 배양 용액을 200mL씩 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 16개 웰에 넣고, 다양한 농도의 IPTG를 첨가하여 37℃에서 배양하였다. IPTG는 1600 mM에서 12.5 mM (최종 농도)까지 절반씩 연속적으로 희석(two-fold serial dilution)하는 방법으로 첨가되었고, 하나의 농도에 대해 두 개씩 만들어졌다. 대조군 세포는 IPTG의 첨가없이 두 개씩 배양되었다. 이들 배양액은 관심있는 클론을 포함하는 동일한 종자 배양액에서 유래된 동일한 수의 세포에서 출발하여 15 시간까지 배양되었고, 생장 정도는 600nm에서 배양액의 광학 밀도를 측정하여 결정되었다. 대조군 배양액이 중간 지수기까지 배양되었을 때, 각 IPTG 농도에서의 생장 백분율을 IPTG의 로그 농도로 플랏하여 IPTG에 의한 생장 저해량 반응 곡선을 만들었다. 0mM IPTG(0% 생장 저해)와 비교하여 50%의 생장 저해를 나타내는 IPTG 농도(IC50)가 곡선을 통해 계산되었다. 이 조건에서, 발현된 안티센스 RNA 양은 rplW와 elaD의 발현 수준을 50%의 생장 저해가 나타날 정도의 수준으로 감소시킨다.

생장을 측정하는 다른 실례는 단백질을 측정하는 것으로, 이 단백질은 세포 안에서 발현된 정도를 쉽게 측정할 수 있는 것으로 선택되어야 한다. 이러한 단백질에는 녹색형광 단백질(GFP)과 다양한 효소들이 있다.

세포는 선택된 농도의 IPTG로 전처리되었고, 테트라싸이클린(tetracycline), 에리트로마이신(erythromycin) 및, 다른 단백질 합성 저해제에 대한 세포 집단의 감작성을 조사하기 위해 이용되었다. rplW와 elaD 유전자에 대한 테트라싸이클린 양 반응 곡선은 도 2A와 2B에 나타내었다. 세포는 지수기로 생장되었고, 일반적인 배지 또는 20%와 50%의 생장 저해를 일으키는 농도의 IPTG를 포함하는 배지로 희석되었다. 전기의 IPTG 농도는 IPTG 양 반응 곡선을 통해 결정되었다. 2.5 시간 후에, 세포는 최종적으로 OD600=0.002가 되도록 96-웰 플레이트에서 희석되었고, 플레이트는 (1) 배양전과 같은 농도의 IPTG를 포함하거나 포함하지 않고, (2) 최종 농도가 1mg/mL에서 15.6ng/mL까지, 그리고 0mg/mL이 되도록 절반씩 연속적으로 희석한 테트라싸이클린을 포함한다. 96웰 플레이트는 37℃에서 배양되었고, 15시간 동안 매 5분마다 플레이트 리더(plate reader)를 통해 OD600을 측정하였다. IPTG를 전혀 포함하지 않은 대조군 배양액의 OD600이 1이 되었을 때, 각 IPTG 농도에 대한 테트라싸이클린 양 반응 곡선이 결정되었다. IPTG가 존재할 때와 부재할 때의 테트라싸이클린 감작성을 비교하기 위해, 테트라싸이클린 IC50s가 반응 곡선(도 2A와 2B)에서 결정되었다. 감소된 수준의 L23(rplW)를 포함하는 세포는 감소된 수준의 elaD(도 2B)를 포함하는 세포와 비교할 때 테트라싸이클린에 대해 증가된 감작성(도 2A)을 나타낸다. 도 3은 요약된 막대 그래프를 나타낸다. 그래프는 50%의 생장 저해를 일으키는 IPTG 존재에서 결정된 IC50s와 IPTG 부재에서 결정된 IC50s의 비(ratio)로 플랏되었다. 감소된 수준의 L7/L12(유전자 rplL, rplJ) 또는L23(rplW) 을 포함하는 세포는 테트라싸이클린에 대해 증가된 감작성을 보여준다 (도 3). 단백질 합성과 관련되지 않은 유전자에 대한 안티센스를 발현하는 세포는 테트라싸이클린에 대한 증가된 감작성 또는 분석에 대한 특이성을 나타내지 않았다.

전기에 추가하여, 단백질 합성과 관련된 유전자 (rRNA와 연장 요소(elongation factor) G를 암호화하는 유전자뿐만 아니라, 리보좀 단백질 L7/L12 & L10, L7/L12, L22 및,L18을 암호화하는 유전자를 포함)에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 클론은 마크로리드(macrolide)와 에리트로마이신(erythromycin)에 대해 증가된 감작성을 보이지만, 단백질 합성에 관여하지 않는 유전자(elaD, atpB/E 및, visC)에 대한 안티센스를 발현하는 클론은 감작성을 나타내지 않는 것이 초기의 실험에서 관찰되었다. 또한, rplL과 rplJ에 대한 안티센스를 발현하는 클론은 단백질 합성을 저해하지 않는 항생제인 날리디식 산(nalidixic acid)과 오플록사신(ofloxacin)에 대해서는 증가된 감작성을 보이지 않았다.

다양한 다른 안티센스 클론과 항생제를 이용한 초기의 결과뿐만 아니라, 리보좀 단백질 유전자 rplL, rplJ 및, rplW를 이용한 결과는 제한된 농도의 항생제 표적이 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 항미생물제에 대해 세포를 보다 감작시킨다는 사실을 보여준다. 또한, 결과는 이들 세포가 단백질 표적과 연관된 전체 기능을 저해하는 항미생물제에 대해서는 감작되지만, 다른 기능을 저해하는 항미생물제에 대해서는 감작되지 않음을 보여준다.

전기에 기술된 세포에 기초한 분석은 증식 관련 핵산 또는 그것의 유전자 산물이 위치하는 생물학적 경로를 동정하는데 이용될 수 있다. 이 방법에서, 표적이 되는 증식 관련 핵산에 대한 안티센스를 치사 이하 수준으로 발현하는 세포와 안티센스의 발현이 유도되지 않은 대조군 세포는 다양한 경로에서 작용하는 한 부류의 항생제들과 접촉된다. 만약 그 항생제가 표적과 같은 경로에서 작용한다면, 안티센스 발현이 유도된 세포는 안티센스 발현이 유도되지 않은 세포보다 항생제에 대해 크게 감작될 것이다.

분석 결과는 표적을 포함하는 다양한 증식 관련 유전자에 대한 안티센스를 발현하는 한 부류의 대조군 세포와 항생제를 접촉시킴으로써 확증될 수 있다. 항생제가 특이적으로 작용할 경우, 항생제에 대한 높은 감작성은 오직 표적(또는 표적과 같은 경로에 있는 다른 증식 관련 유전자)에 대한 안티센스를 발현하는 세포에서만 관찰될 것이고, 증식 관련 유전자에 대한 안티센스를 발현하는 세포에서는 전혀 관찰되지 않을 것이다.

유사하게, 전기 방법은 조사 항생제가 작용하는 경로를 결정하는데 이용될 수 있다. 알려진 경로의 증식 관련 핵산에 대한 안티센스를 발현하는 한 부류의 세포는 작용 경로 결정이 용이한 화합물과 접촉된다. 화합물에 대한 세포의 감작성은 안티센스 발현이 유도된 세포와 유도되지 않은 대조군 세포에서 결정된다. 조사 항생제가 안티센스 핵산과 같은 경로에서 작용한다면, 안티센스를 발현하는 세포는 발현하지 않은 세포보다 조사 항생제에 대해 크게 감작될 것이다. 추가적으로, 다른 경로에 있는 증식 관련 유전자에 대한 안티센스를 발현하는 대조군 세포는 항생제에 대해 크게 감작되지 않았다. 이와 같은 방식으로, 조사 항생제가작용하는 경로를 결정할 수 있다.

하기 실시예는 전기의 분석을 수행하기 위한 한 가지 방법을 제공한다.

실시예 10

증식 관련 유전자가 위치하는 경로 또는 항생제가 작용하는 경로의 동정

A: 분석을 위한 세균 스톡(stock)의 제조

선별될 세포를 동일한 원천으로 제공하기 위해, 바람직한 안티센스 작제물을 포함하는 숙주 세균의 동결 스톡이 기본적인 미생물학적 기술을 이용하여 제조되었다. 예를 들어, 생물체의 단일 클론은 시료의 스톡을 플레이트에 스트리킹(streaking)함으로써 동정되고, 플레이트는 세포 생장을 위한 영양분과 안티센스 작제물에 의해 내성이 제공된 항생제를 포함한다. 밤새도록 배양한 후, 멸균된 니들(needle)을 이용하여 단일 군락을 플라스미드를 유지하기 위한 항생제를 포함하는 적절한 액체 배지로 옮긴 다음, 30℃ 내지 37℃에서 격렬한 쉐이킹(shaking)을 동반하여, 지수기까지 4 내지 6 시간동안 배양되었다. 멸균된 글리세롤이 15% (v/v) 첨가된 다음, 100 내지 500mL를 멸균된 튜브로 옮긴 후, 재빨리 액체 질소로 동결하여 -80℃에 보관하였다.

B: 분석에 이용되는 세균의 생장

분석하기 하루 전에, 세균 스톡을 꺼내어 재빨리 해동(37℃ water bath)한 다음, 멸균된 접종 루프(inoculum loop)를 이용하여 영양분과 항생제를 포함하는플레이트에 스트리킹되었다. 37℃에서 밤새도록 배양된 후, 선택된 임의의 10개 군락을 항생제를 포함하는 5mL의 멸균된 배지로 옮기고, 세포가 균일하게 현탁되도록 격렬하게 섞은 다음, 현탁액의 광학 밀도를 600nm에서 측정하였다. 필요하다면, OD600 ≤ 0.02가 되도록, 현탁액의 일부를 다시 희석할 수 있다. 배양액은 OD600 = 0.2 내지 0.3이 될 때까지 쉐이킹을 동반하여 37℃에서 1 내지 2 시간동안 배양되었고, 이와 같이 준비된 세포는 분석에 바로 이용할 수 있다.

C: 분석에 이용되는 배지의 선택

유도제는 안티센스 작제물을 유지시키는 적절한 항생제를 포함하는 여러가지 배양 배지에서 절반씩 연속적으로 희석되었다. 여러가지 배지들이 연속적으로 조사되었고, 각 배지의 4개 중 3개의 웰에서 유도제 농도 효과가 평가되었다. 예를 들어, M9 최소 배지, LB 배지, TBO 배지 및, Muller-Hinton 배지에서 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400mM, 600mM, 800mM 및, 1000 mM 농도의 IPTG 효과가 조사되었다. 전기의 배지-유도제는 세포와 동일한 부피로 섞여서 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 첨가되었다. 전기에 기술된 바와 같이 제조된 세포는 적절한 배지에 의해 1:100으로 희석되었고, 조사되어질 항생제는 마이크로타이터 플레이트로 첨가되기 직전에 배지로 첨가되었다. 대조군으로서, 세포는 유도제를 전혀 포함하지 않는 각 배지의 웰로 첨가되었다 (0 M IPTG). 세포 생장은 37℃에서 배양되는 18시간 동안 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용해 계속하여 OD600을 측정함으로써 결정되었다. 각 농도의 유도제에 의한 생장 저해 백분율은 유도제를 포함하지 않은 배지에서 생장한 대조군 세포의 대수(logarithmic) 생장 비(ratio)와 비교하여 계산되었고, 유도제에 대해 최대의 감작을 일으키는 배지가 하기의 분석을 위해 선택되었다.

D: 안티센스 작제물 유도가 없는 조건에서의 조사 항생제 감작 측정

작용 기작이 알려진 항생제들은 안티센스 작제물을 유지시키는 적절한 항생제를 포함하는 전기에 선택된 배양 배지에서 절반씩 연속적으로 희석되었다. 다른 경로에서 작용하는 한 부류의 조사 항생제들이 연속적으로 조사되었고, 4개 중 3개의 웰에서 세포 생장에 대한 각 농도의 조사 항생제 효과가 평가되었다. 전기의 조사 항생제는 세포와 동일한 부피로 섞여서 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 첨가되었다. 안티센스 핵산을 유지시키는 항생제를 포함하는 분석에 선택된 배지를 이용하여 전기에 기술된 바와 같이 제조된 세포는 마이크로타이터 플레이트로 첨가되기 직전에 동일한 배지에 의해 1:100으로 희석되었다. 대조군으로서, 세포는 조사 항생제를 용해할 때 이용된 용매만을 포함하는 웰로 첨가되었다. 세포 생장은 37℃에서 배양되는 18시간 동안 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용해 계속하여 OD600을 측정함으로써 결정되었다. 각 농도의 항생제에 의한 생장 저해 백분율은 조사 항생제를 포함하지 않은 배지에서 생장한 대조군 세포의 대수 생장 비와 비교하여 계산되었다. Log[항생제 농도]에 대한 생장 저해 백분율의 플랏은 각 항생제의 IC₅₀수치(value)의 외삽법을 허용한다.

E: 안티센스 작제물 유도가 있는 조건에서의 조사 항생제 감작 측정

50%와 80%의 생장 저해를 일으키는 농도의 유도제와 작제물을 유지시키는 항생제가 분석에 선택된 배양 배지로 첨가되었다. 전기에 이용된 한 부류의 조사 항생제는 이들 각 배지에서 절반씩 연속적으로 희석되었다. 여러가지 항생제가 연속적으로 조사되었고, 각 배지의 4개 중 3개의 웰에서 세포 생장에 대한 각 농도의 조사 항생제 효과가 평가되었다. 조사 항생제는 세포와 섞여서 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 첨가되었다. 안티센스 핵산을 유지시키는 항생제를 포함하는 분석에 선택된 배지를 이용하여 전기에 기술된 바와 같이 제조된 세포는 50%와 80%의 생장 저해를 일으키는 농도의 유도제를 포함하는 동일한 50mL의 배지에 의해 1:100으로 희석되었고, 37℃에서 2.5 시간 동안 쉐이킹을 동반하여 배양되었다. 마이크로타이터로 첨가되기 직전, 배양액은 동일한 농도의 유도제 및 안티센스 작제물 유지를 위한 항생제를 포함하는 37℃의 멸균된 배지에 의해 적절한 OD₆₀₀수치(전형적으로는 0.002)로 조절되었다. 대조군으로서, 세포는 조사 항생제를 용해할 때 이용된 용매만을 포함하는 웰로 첨가되었다. 세포 생장은 37℃에서 배양되는 18시간 동안 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용해 계속하여 OD600을 측정함으로써 결정되었다. 각 농도의 항생제에 의한 생장 저해 백분율은 조사 항생제를 포함하지 않은 배지에서 생장한 대조군 세포의 대수 생장 비와 비교하여 계산되었다. Log[항생제 농도]에 대한 생장 저해 백분율의 플랏은 각 항생제의 IC₅₀수치(value)의 외삽법을 허용한다.

F: 조사 항생제의 특이성 결정

작용 기작이 알려져 있는 항생제에 의해 안티센스가 유도되는 조건과 유도되지 않은 조건에서 생성된 IC50s의 비교를 통해, 증식 관련 핵산이 작용하는 경로를 동정할 수 있다. 증식 관련 유전자에 대한 안티센스 핵산을 발현하는 세포가 특별한 경로를 통해 작용하는 항생제에 대해 선택적으로 감작된다면, 안티센스가 작용하는 유전자는 항생제가 작용하는 경로와 관련되어 있다.

G: 조사 항생제가 작용하는 경로의 동정

전기에 기술된 바와 같이, 세포에 기초한 분석을 조사 항생제가 작용하는 경로를 결정하는데 이용할 수 있다. 이러한 분석에서, 안테센스 핵산이 작용하는 경로는 전기에 기술된 바와 같이 동정된다. 알려진 증식 관련 경로에 있는 유전자에 대한 유도성 안티센스 벡터를 포함하는 한 부류의 세포는 조사 항생제와 접촉되고, 이 조사 항생제는 유도 조건과 비유도 조건에서 그것이 작용하는 경로를 결정하는 것이 용이한 것이어야 한다. 증가된 감작이 특정 경로에 있는 유전자에 대한 안티센스의 발현이 유도된 세포에서는 관찰되고, 다른 경로에 있는 유전자에 대한 안티센스의 발현이 유도된 세포에서는 관찰되지 않는다면, 조사 항생제는 감작이 관찰된 경로에서 작용하는 것이다.

안티센스 발현을 유도하는 유도제의 농도 및,/또는 분석을 위한 생장 조건(예를 들면, 배양 온도 및, 배지 성분)같은 분석 조건의 최적화는 항생제 감작의 선택성 및,/또는 등급(magnitude)을 추가로 증가시킬 수 있다.

하기의 실시예는 전기에 기술된 방법의 효과를 증명한다.

실시예 11

증식 관련 유전자가 위치하는 경로의 동정

다양한 화학적 분류와 다양한 작용 모드를 갖는 항생제들은 Sigma Chemicals(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 스톡 용액은 제조업체로부터 제공된 정보에 기초하여 적절한 수용액에 각 항생제를 용해시켜 조제하였다. 각 항생제의 최종적인 작용 용액(working solution)이 포함하는 유기 용매는 0.2% (w/v)에 지나지 않는다. 증식에 관련된 50S 리보좀 단백질에 대해 안티센스를 발현하는 세균 주에 대한 항생제의 효능를 결정하기 위해, 각 항생제는 안티센스 작제물을 유지시키는 적절한 항생제를 포함하는 생장 배지를 이용하여 두 세배씩 연속적으로 희석되었다. 각 항생제에 대해 적어도 10개의 연속된 희석액이 조제되었다. 각 희석액 25mL씩을 멀티 채널 피펫을 이용하여 384-웰 마이크로 플레이트의 각각의 웰로 이동시켰다. 4개씩의 웰이 각 처리 조건(유도제의 유무)을 위한 항생제 희석에 이용되었다. 각 분석 플레이트는 세포 생장 조절을 위한 20개의 웰(항생제를 교체한 생장 배지)와 각 처리를 위한 20개의 웰(IPTG의 경우, 유도제의 유무)을 포함한다. 분석 플레이트 중 절반은 유도 상태을 유지시키기 위해 적절한 농도의 유도제와 세포로 처리되었고, 남은 절반은 IPTG없이 세포로만 처리되었다.

분석을 위한 세포는 하기와 같이 제조되었다. 증식 관련 50S 리보좀 소단위 단백질인 rplL 및, rplJ에 대한 안티센스 작제물을 포함하는 세균 세포는 지수 생장기(OD₆₀₀0.2 내지 0.3)까지 배양된 다음, 400 mM 또는 0 mM의 IPTG를 포함하는 새로운 배지를 이용하여 1:100으로 희석하였다. 희석된 배양액은 37℃에서 2.5 시간 배양되었고, 배양 후, 유도된 세포와 유도되지 않은 세포는 최종 OD₆₀₀= 0.0004가 되도록 적절한 농도의 항생제와 최종 농도 400 mM의 IPTG를 포함하는 분석 배지를 이용하여 희석되었다. 유도된 세포와 유도되지 않은 세포 현탁액은 전기에 기술된 바와 같이 분석 플레이트의 적적한 웰로 25 mL씩 첨가되고, 플레이트 리더에서 일정한 온도로 배양되면서, 595 nm에서의 빛의 분산을 통해 세포 생장이 측정되었다. 생장은 세포 배양액이 정지기에 도달할 때까지 매 5분마다 측정되었다. 각 농도의 항생제에 대한 생장 저해 백분율은 대조군 웰(항생제 첨가, IPTG 첨가 또는 무첨가)의 배양액이 중간 지수기가 되는 시점에서 계산되었다. 각 항생제와 IPTG 유무 조건에 대한 생장 저해 대(VS) 항생제 농도에 대한 로그 플랏이 생성되었고, IC50이 결정되었다. IPTG 존재와 부재 조건의 각 항생제의 IC₅₀비교는 안티센스 작제물의 유도가 항생제 작용 기작에 대해 세포를 감작화하는지의 여부를 밝혀준다. 유도제가 존재할 때, 상당한 양의 IC₅₀수치 감소(대조군 통계 분석)를 나타내는 세포는 조사 항생제에 대해 증가된 감작성을 가지는 것이다.

결과는 하기 표로 제공되며, 분석에 이용되는 항생제의 분류와 이름, 항생제의 표적, IPTG 부재 조건의 IC50, IPTG 존재 조건의 IC50, IC50s에 대한 농도단위, IPTG 존재 조건의 IC50의 배수 증가율(fold-increase) 및, 증가된 감작성이 IPTG 존재 조건에서 관찰되는지의 여부로 나열되어 있다.

표 4: rplL 및 rplJ에 대한 안티센스 RNA 발현이 항생제 감작성에 끼치는 영향

전기 결과는 50S 리보좀 소단위 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 RNA 유도가 리보좀 기능과 단백질 합성을 저해하는 항생제에 대해 세포가 크게 감작되었음을 증명해주며, 추가로, 필수 유전자에 대한 안티센스 작제물의 유도가유전자 산물의 생물학적인 역할을 방해하는 화합물에 대해 생물체를 감작화함을 증명해준다.

필수 유전자에 대한 안티센스 작제물을 이용하는 분석은 경로 내의 다양한 표적의 활성을 특이적으로 저해하는 화합물을 동정하는데 이용할 수 있다. 이러한 작제물은 하나의 반응과 관련한 하나의 경로에 있는 다양한 표적들에 대해 시료를 동시에 선별하는데 이용될 수 있다 (조합 HTS).

추가적으로, 전기에 기술한 바와 같이, 세포를 포함하는 여러 부류의 안티센스 작제물은 작용 기작이 알려지지 않은 항생제를 포함하고 필수적인 생물학적 경로에 영향을 끼치는 어떤 화합물의 간섭을 특성화하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 조사 항생 화합물이 작용하는 경로를 결정하는 방법으로, 세포와 표적 단백질 또는 핵산에 작용하는 알려진 항생제의 치사 이하 농도를 접촉함으로써 증식 관련 경로와 연관되어 있는 표적 단백질 또는 핵산의 활성은 감소된다. 이 실시태양에서, 표적 단백질 또는 핵산은 전기에 기술된 방법으로 동정된 증식 관련 핵산과 상응하는 표적 단백질 또는 핵산이다. 이 방법은 증식 관련 유전자 산물의 활성 또는 수준의 감소가 증식 관련 핵산에 대한 치사 이하 수준의 안티센스 핵산에 의한 것이 아니라, 증식 관련 유전자 산물에 작용하는 알려진 치사 이하 수준의 항생제에 의한 것이라는 점을 제외하고는, 조사 항생제가 작용하는 경로를 결정하기 위해 전기에 기술된 방법과 유사하다.

같은 생물학적 경로에서 작용하는 약제들 사이의 상호 작용은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 메실리남(Mecillinam, Amdinocillin)은 페니실린 결합 단백질 2(PBP2,E. coli의mrdA산물)에 결합하여 그 단백질을 불활성화한다. 이 항생제는 PBP2를 저해하는 다른 항생제뿐만 아니라 PBP3 등의 다른 페니실린 결합 단백질을 저해하는 항생제와도 상호 작용한다 [(Gutmann, L., Vincent, S., Billot-Klein, D., Acar, J.F., Mrena, E., and Willamson, R. (1986) Involvement of penicillin-binding protein 2 with other penicillin-binding proteins in lysis ofEscherichia coliby some beta-lactam antibiotics alone and in synergistic lytic effect of amdinocillin(mecillinam). Antimicrobial Agents & Chemotheraphy, 30: 906-9120), 개시 내용을 온전히 참고 자료로 본문에 개시하였다]. 그러므로, 약제들 사이의 상호 작용은 같은 표적 단백질 또는 같은 핵산을 저해하는 두 약제, 또는 같은 경로에 있는 다른 단백질 또는 다른 핵산을 저해하는 두 약제 사이에서 일어난다 [(Fukuoka, T., Domon, H., Kakuta, M., Ishii, C., Hirasawa, A., Utsui, Y., Ohya, S., and Yasuda, H. (1997) Combination effect between panipenem and vancomycin on highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Japan. J. Antibio. 50: 411-419; Smith, C.E., Foleno, B.E., Barrett, J.F., and Frosc, M.B. (1997) Assessment of the synergistic interactions of levofloxacin and ampillin against Enterococcus Faecium byl the checkerboard agar dilution and time-kill methods. Diagnos. Microbiol. Infect. Disease 27: 85-92; den Hollander, J.G., Horrevorts, A.M., van Goor, M.L., Verbrugh, H.A., and Mouton, J.W. (1997) Synergism between tobramycin and ceftazidime against a resistant Pseudomonas aeruginosa, tested in an invitro pharmacokinetic mosel. Antimicrobial Agents & Chemotheraphy. 41: 95-110). 내용은 참고 자료로 본문에 개시하였다].

두 약제는 그들이 서로 다른 표적을 저해한다 할지라도 서로 상호 작용 할 수 있다. 예를 들어, 함께 작용하여 상승 작용을 일으키는 화합물인 프로톤 펌프 저해제, 오메프라졸(proton pump inhibitor, Omeprazole) 및, 항생제, 아목시실린(Amoxycillin)은Helicobacter pylori에 의한 감염을 치료할 수 있다 [(Gabryelewica, A., Laszewicz, W., Dzieniszewski, J., Ciok, J., Marlicz, K., Bielecki, D., Popiela, T., Legutko, J., Knapik, Z., Poniewierka, E. (1997) Multicenter evaluation of dual-theraphy (omeprazol and amoxycillin) forHelicobacter pylori-associated duodenal and gastric ulcer (two years of the observation). J. Physiol. Pharmacol. 48 Suppl 4: 93-105), 개시 내용을 온전히 참고 자료로 본문에 개시하였다].

치사 이하 농도의 알려진 항생제에 의한 생장 저해는 적어도 약 5%, 8%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 적어도 약 75% 또는 그 이상이 될 수 있다.

한편, 알려진 항생제의 치사 이하 농도는 생장 저해 측정에 의해서가 아니라 표적이 되는 증식 관련 유전자 산물의 활성 측정에 의해서 결정된다.

세포는 알려진 한 부류에서 조합된 각 항생제들과 치사 이하 농도 및, 다양한 농도로 접촉되었다. 또한, 대조군으로서, 세포는 오직 다양한 농도의 조사 항생제와 접촉하였다. 조사 항생제의 IC50은 알려진 화합물이 존재 및, 부재하는 조건에서 결정되었다. 두 조건의 IC50이 매우 유사하다면, 조사 약제와 얄려진 약제는다른 경로에서 작용하는 것이고, 두 IC50이 매우 다르다면, 조사 약제와 알려진 약제는 같은 경로에서 작용하는 것이다.

본 발명의 다른 실시태양은 항생제로 이용가능한 후보 화합물을 동정하는 방법으로, 증식 관련 경로에 연관된 표적 단백질 또는 핵산의 활성은 표적 단백질 또는 핵산과 작용하는 치사 이하 농도의 알려진 항생제와 세포의 접촉에 의해 감소된다. 이 실시태양에서, 표적 단백질 또는 핵산은 전기에 기술된 방법으로 동정된 증식 관련 핵산에 상응하는 표적 단백질 또는 핵산이다. 이 방법은 증식 관련 유전자 산물의 수준 또는 활성의 감소가 증식 관련 핵산에 대한 치사 이하 수준의 안티센스에 의한 것이 아니라, 증식 관련 유전자 산물과 작용하는 치사 이하 수준의 알려진 항생제에 의한 것이라는 점을 제외하면, 항생제로서 이용가능한 후보 화합물을 동정하는 전기 방법과 유사하다.

치사 이하 농도의 알려진 항생제에 의한 생장 저해는 적어도 약 5%, 8%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 적어도 약 75% 또는 그 이상이 될 수 있다.

한편, 알려진 항생제의 치사 이하 농도는 생장 저해 측정에 의해서가 아니라 표적이 되는 증식 관련 유전자 산물의 활성 측정에 의해 결정된다.

관심있는 조사 화합물을 특성화하기 위해, 세포는 치사 이하 농도의 한 부류의 알려진 항생제 및, 하나 또는 그 이상의 농도의 조사 화합물과 접촉되었다. 대조군으로서, 세포는 같은 농도의 조사 화합물만으로도 접촉되었다. 조사 화합물의 IC₅₀은 알려진 항생제의 존재와 부재 조건에서 결정되었다. 두 조건의 조사 화합물IC50이 매우 다르다면, 조사 화합물은 항생제로 이용가능한 훌륭한 후보이다. 전기에 기술한 바와 같이, 일단 후보 화합물이 전기 방법으로 동정되면, 화합물의 구조는 조합 화학같은 기본적인 기술을 이용하여 최적화될 수 있다.

전기의 각 방법에서 이용가능한 알려진 대표적인 항생제들이 하기 표에 제공되어 있지만, 다른 항생제들도 이용될 수 있다.

항생제	저해/표적	내성 돌연변이체
전사 저해제
리파마이신, 1959 리파마이신리파부틴 리팍시민	전사 개시를 저해/베타 소단위 RNA중합 효소,rpoB	rpoB, crp, cyaA
스트랩톨리디긴스트랩토바리신	전사 사슬 종결을 촉진/베타 소단위 RNA 중합효소어씨클릭 안사마이신, RNA 중합효소를 저해	rpoB rpoB
안티노마이신 D+EDTA	2개의 성공적인 G-C 쌍 사이에 끼어들기,rpoB,RNA 합성 저해	pldA
핵산 대사의 저해제
퀴놀론, 1962 날리디식 산옥솔리닉 산플루오로퀴놀론 시프로플록사신,1983 노르플록사신	소단위 자이레이즈 및/또는 토포아이소머레이즈 IV, gyrA소단위 자이레이즈, gyrA 및/또는 토포아이소머레이즈 IV(Staph에 있는 가능한 표적)	gyrA또는 B, icd,sloB gyrA norA(Staph에서 유출)hipQ
쿠머린 노보바이오신쿠머마이신	베타 소단위 자이레이즈의 ATPase 활성을 저해, gyrB베타 소단위 자이레이즈의ATPase 활성을 저해, gyrB	gyrB, cysB, cyeE, nov, ompA gyrB, hisW
알비시딘	DNA 합성	tsx(뉴클레오시드 채널)
메트로니다졸	DNA의 단일 가닥 파괴를 유도	nar
대사 경로의 저해제
설폰아미드, 1932 설파닐아미드	디하이드로폴레이트의 합성 중단, 디하이드로프테로에이트 합성, folP	folP, gpt, pabA, pabC
트리메토프림, 1962	디하이드로폴레이트 리덕타아제 저해, folA	folA, thyA
쇼우도마이신	설피드릴 그룹의 알킬레이팅이 가능한 뉴클레오시드 유사체, 티미딜레이트 합성 효소의 저해	nupC, pnp
티올악토마이신	타입 II 지방산 합성 효소의 저해	emrB유전자 투여량을 일으키는fadB, emrB
프시코푸라닌	아데노신 글리코사이드 항생제, 표적은 GMP 합성 효소	guaA, B
트리클로산	지방산 합성 저해	fabl(envM)
디아조보린 이소니아지드, 에티온아미드	헤테로시클릭, 보론을 포함, 지방산 합성 저해, 에놀-ACP 리덕테이즈, fabl	fabl(envM)

번역 저해제
페닐프로파노이드클로람페니콜, 1947	리보좀 펩티딜 트랜스퍼 센터에 결합펩타이드 이동 저해/ S6,L3, L6, L14, L16, L25, L27, 특히에 결합, 특히 L16에 결합	rrn, cmlA, marA, ompF, ompR
테트라싸이클린, 1948, 타입 II폴리케타이드미노싸이클린독시싸이클린	30S 리보좀 소단위의 "A" 자리에 결합, 펩타이드 연장을 저해, S7에 가장 강력하게 결합	clmA(cmr), mar, ompF
마크로리드(타입 I 폴리케타이드)에리트로마이신, 1950카보마이신, 스피라마마이신등	50S 리보좀 소단위에 결합, 23S rRNA, 펩타이드 이동 저해, L15, L4,L12	rrn, rplC, rplD, rplV, mac
아미노글리코사이드 스트랩토마이신,1944네오마이신스펙티노마이신 카나마이신카슈가마이신젠타마이신, 1963아미카신파로마이신	30S 리보좀 소단위와 비가역적으로 결합, mRNA/16S rRNA의 이동 저해 또는 잘못된 이동을 유도	rpsL, strC, M, ubiF atpA-E, ecfB, hemAC, D, E, G, topA, rpsC, D, E, rrn, spcB atpA-atpE, cpxA, ecfB, hemA, B, L, topA ksgA, B, C, D, rplB, K, rpsl, N, M, R rplF, ubiF cpxA rpsL
린코스아미드린코마이신, 1955 클린다마이신	50S 리보좀 소단위에 결합, 펩타이드 이동 저해	linB, rplN, O, rpsG
스트랩토그라민 버지니아마이신,1955 프리스티나마이신시너시드: 퀴누프리스틴/ 달포프리스틴	2 화합물, 스트랩토그라민 A&B, 펩타이드 이동과 펩타이드 본드 형성을 저해하는 50S 리보좀 소단위에 결합
푸시단푸시딕 산	연장 요소 G(Ef-G)의 저해는 펩타이드 이동을 방해	fusA
키로마이신(모시마이신)	연장 요소 TU(EF-TU)의 저해, 펩타이드 본드 형성 방해	TufA, B

항생제	저해/표적	내성돌연변이체
플보마이신	EF-TU에 결합, 저해
티오펩틴	황-함유 항생제,단백질 합성 저해, EF-G	rplE
티아뮬린	단백질 합성 저해	rplC, rplD
네가마이신	단백질 합성의 종결을 저해	prfB
옥싸졸리돈스 리네졸리드이소니아지드	23S rRNA	pdx
니트로퓨란토인	단백질 합성 저해,니트로환원효소는 니트로퓨란토닌을, 비특이적으로 세균의 리보솜 단백질을 공격하는 고도의 반응성을 갖는 전자친화 중간체로 전환	nfnA,B
슈도모닉 산 뮤피로신(박트로반)	이소루실tRNA합성효소를저해	ileS
인돌마이신	트립토판일-tRNA 합성효소를 저해	trpS
비오마이신		rrmA(23S rRNA 메틸트랜스퍼라제; 돌연변이체는 느린 생장률, 느린 사슬 연장률을 가지며, 비오마이신 저항성이다)
티오펩티드계티오스트렙톤마이크로코신	L11-23S RNA 복합체에 결합EF-G에 의하여 GTP 가수분해를 저해EF-G에 의하여 GTP 가수분해를 자극
세포벽/막의 저해제
베타-락탐계	세포벽 저해
페니실린, 1929앰피실린메티실린, 1960세팔로스포린, 1962	트랜스펩티다제, 엔도펩티다제 및 글리코시다제(PBPs); 12PBPs 중 오직 2만 필수적:mrdA(PBP2) 및 ftsl(pbpB, PBP3)	ampC, ampD, ampE, envZ, galU, hipA, hipQ, ompC, ompF, ompR, ptsl, rfa, tolD, tolE tonB
메실리남(엠디노실린)아즈트레오남(퓨라졸로실린)	PBP2(mrdA)에 결합, 불활성화PBP3(ftsl) 불활성화	alaS, argS, crp, cyaA, EnvB, mrdA,B, MreB,C,D
바실리신, 테타인	디펩티드, 글루코사민 합성효소 저해	dppA
글리코펩티드계 반코마이신, 1955	그람양성 세포벽 합성을 저해, 펜타펩티드의 터미널 D-ala-D-에 결합
폴리펩티드계 바시트라신	탈인산화 및 지질운반체의 생성을 저해	rfa

씨클릭 리포펩티드 답토마이신, 1980	펩티도글리칸 합성, 리포티코익 산 합성 및 세균 막 포텐셜 등의 세포막 기능을 파괴,
시클릭 폴리펩티드 폴리믹신, 1939	계면활성제 작용, 세포막 지질을 파괴시키며 LPS의 리피드 A 부분과 결합함	pmrA
포스포마이신, 1969	P-에놀피루베이트 유사체, 펩티도글리칸 합성의 첫번째 단계에 관여하는 UDP-N-아세틸글루코사민 에놀피루빌 트랜스페라제를 저해함. 또한, 면역억제제로도 작용함	murA, crp, cyaA glpT, hipA, ptsI, uhpT
시클로세린	D-ala 이량체 형성을 억제하며, D-ala 리가아제인ddlA,B를 저해함	hipA, cycA
알라포스팔린	포스포노디펩티드, 세포벽 합성의 저해인자, 락탐계의 강화인자	pepA, tpp
단백질 처리/수송의 저해인자
글로보마이신	시그널 펩티다제 II를 저해함(지질 변형 후 프로리포프로틴을 절단함,lspA)	lpp, dnaE

실시예 12

E. coli 발현 벡터 또는 다른 세균 종에서 기능적인 발현 벡터를 이용한 외부 핵산 서열의 다른 세균 종으로의 이동

전기에 기술된 것과 유사한 방법으로 동정된E. coli의 생장을 저해하는 안티센스 핵산을 이용하여 전기 방법이 평가되었다. IPTG로 안티센스 RNA 발현을 유도하는E. coli의 생장 저해 발현 벡터는Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonia또는Salmonella thphimurium으로 직접 형질 전환되었다. 그런 다음, 실시예 1의 방법을 이용하여 형질 전환된 세포의 생장 저해가 분석되었다. 액체배양액에서 생장된 후, 세포는 다양하게 희석되어 플레이트에 도말되었고, 그 수치는 군락이 관찰되는 최대 10배의 희석에 의해 결정된 유도된 안티센스 RNA 발현 대(VS) 유도되지 않은 RNA 발현에 대한 생장 차이를 로그값으로 계산하여 결정되었다. 실험 결과는 하기의 표 VI에 작성되었다. 생물체에서 안티센스 RNA의 효과가 전혀 없는 경우, 그 클론은 표 VI에서 (-)로 표시되었고, (+)는 이용된 조건의 유도된 플레이트에서 군락을 관찰하기 위해서는 적어도 10배 이상의 세포가 필요함을 의미한다.

조사된 모든 생물체에서 생장을 저해하는 16개의 작제물을 획득하였다. 이종 생물체에서의 부정적인 결과는 생물체가 유전자를 소실했거나 그 유전자가 필수적인 것이 아님을 의미하지는 않는다. 그러나, 긍정적인 결과는 이종 생물체가 생물체의 증식에 필요한 상동 유전자를 포함하고 있음을 의미한다. 상동 유전자는 본문에 기술된 방법으로 획득될 수 있다. 안티센스에 의해 생장이 저해되는 세포는 이들 생물체에 효과적인 항생제를 개발하기 위해 화합물을 동정하고 특성화하는 세포에 기초한 분석에 이용될 수 있다. 그것이 유래된 생물체에서 작용하는 안티센스 분자가 이종 생물체에서 항상 작용하지는 않는다는 것은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 알 것이다.

표 6: E. coli의 증식을 저해하는 안티센스 핵산에 대한 다른 미생물의 감작성

실시예 13

동정된 외부 핵산 서열의 탐침으로서의 이용

본 발명에서 동정된 서열은 두 번째 생물체에서 관심있는 추가의 유전자 서열을 획득하기 위한 탐침으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 세균 표적 단백질에 대한 탐침은 다른 생물체의 핵산과 교잡하여, 다른 세균 및, 고등 생물체를 포함하는 다른 생물체에서 상동 서열을 동정할 수 있다. 이러한 교잡을 통해서, 탐침에 상응하는 유전자에 암호화되어 있는 단백질이 인간에게서 발견되었다면, 그것은 좋은 약제 표적으로 적합하지 않다. 한편, 그 유전자가 오직 세균에서만 발견되는 것이라면, 그것은 광범위한 항생제 또는 항미생물제를 위한 좋은 약제 표적이 될 수 있다.

관심있는 동정된 핵산 서열 또는 그것의 부분에서 유래한 탐침은 방사성 동위원소 및, 비방사성 표지 등의 탐지가능한 표지로 표지될 수 있다. 탐지가능한 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고,in vitro전사, 닉 번역(nick translation) 또는 키나아제 반응(kinase reaction) 등의 본 분야에 알려진 기술을 이용하여 만들어진다. 표지된 탐침과 교잡가능한 서열을 포함하는 핵산 시료는 표지된 탐침과 접촉된다. 핵산 시료가 이중 가닥이라면, 탐침과 접촉되기 전에 핵산은 변성되어야만 한다. 어떤 적용에서, 핵산 시료는 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 등의 표면에 고정될 수 있다. 핵산 시료는 게놈 DNA, cDNA 라이브러리, RNA 또는 조직 시료 등의 다양한 원천에서 획득한 핵산을 포함할 수 있다.

탐지가능한 탐침과 교잡하는 핵산을 탐지하는 방법은 서던 블랏팅, 노던 블랏팅, 닷(dot) 블랏팅, 군락 교잡(colony hybridization) 및, 플랙 교잡(plaque hybridization)같은 널리 알려진 기술을 포함한다. 어떤 적용에서, 표지된 탐침과 교잡하는 핵산은 시료에서 교잡하는 핵산의 발현과 특성화를 촉진하기 위해 발현 벡터, 서열 결정용 벡터(sequencing vector) 또는in vitro전사 벡터 등의 벡터로클로닝 될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기술은 다양한 세균 종에서 만들어진 게놈 라이브러리에서 실시예 5와 6에서 동정된 서열에서 만들어진 탐침과 교잡할 수 있는 클론을 동정, 정제, 서열 분석하는데 이용될 수 있다.

실시예 14

PCR 프라이머의 제조와 DNA의 증폭

증식에 필요한 핵산 서열 또는 그것의 부분을 포함하는 오페론 내부에 위치하거나 또는 직접적으로 그에 상응하는 동정된E. coli유전자는, 예를 들면, 상동 유전자 전체 또는 부분을 포함하는S. typhimurium, E. cloacae및,Klebsiella pneumoniae등의 다른 종에서 상동적인 서열을 동정 또는 분리 등에 다양한 적용되는 PCR 프라이머를 제조하는데 이용된다. 상동 유전자는 서열이 유사하지만 동일하지는 않기 때문에, 종종 퇴행성 서열 PCR 프라이머를 이용한다. 이러한 퇴행성 프라이머는 보존 암호화 부위 같은 알려지거나 추측되는 보존 서열 부위에 기초하여 설계된다. 동정된 서열에서 생성된 퇴행성 탐침을 이용한 PCR 산물의 성공적인 생산은 선별될 종에 상동 유전자 서열이 존재함을 보여준다. PCR 프라이머는 적어도 10개의 염기, 바람직하게는 적어도 20개의 염기를 가져야 하며, 보다 바람직하게는, 적어도 20 내지 30개의 염기 길이여야 한다. 어떤 실시태양에서, PCR 프라이머는 30개 이상의 염기 길이이다. 프라이머 쌍은 비슷한 융해 온도(melting temperature)를 갖게하기 위해, 대략 같은 G/C 비율을 갖는 것이 좋다. 다양한 PCR 기술은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 익숙할 것이다. PCR 기술을 회고하길 바란다면, Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. In Methods In Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa 1997을 참고하라. 표적 유전자의 전체 암호화 서열이 알려졌다면, 표적 유전자의 5' 및, 3' 부위를 PCR 탐침을 생성하기 위한 서열 원천으로 이용할 수 있다. 각 PCR 방법에서, 증폭될 핵산 서열에 대한 PCR 프라이머 쌍은 dNTPs 및, Taq 중합효소, Pfu 중합효소 또는 Vent 중합효소같은 열안정성 붕합효소와 함께 적절하게 준비된 핵산 시료로 첨가된다. 시료의 핵산은 변성되고, PCR 프라이머가 시료의 상보적인 핵산과 특이적으로 교잡한다. 교잡된 프라이머는 신장되고, 그런 후에, 프라이머 자리 사이의 핵산 서열을 증폭하기 위해 변성, 교잡, 신장의 순환(cycle)이 여러 번 반복된다.

실시예 15

역 PCR(inverse PCR)

역 중합효소 사슬 연쇄 반응 기술은 실시예 5와 6에서 동정된 알려진 핵산 서열을 신장하기 위해 이용되었다. 역 PCR 반응은 Ochman 등의 PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (Henry A. Erlich, Ed) W.H. Freeman and Co. (1992), 단원 10에 일반적으로 기술되어 있다. 역 PCR은 오직 알려진 중심 서열만을 필요로 한다.

실시예 5와 6에 관련된 기술을 다른 종의 세균으로 적용하여 동정된 서열은 증식 관련 유전자 또는 오페론과 상응하는 서열을 동정하는데 이용된다. 게놈 서열이 알려지지 않은 종에서, 역 PCR 기술은 서열을 결정하기 위해 또는 동정된 외부 핵산 서열이 결합하는 표적 서열에 대한 탐침 서열이 전체 중 어디에 위치하는지를 결정하기 위해 유전자를 획득하는 방법을 제공한다.

이 기술을 실행하기 위해, 표적 생물체의 게놈은 적절한 제한 효소로 절단되어 동정된 서열뿐만 아니라 동정된 서열에 접해있는 모르는 서열을 포함하는 핵산 단편으로 생성된 다음, 원형화되었고, 이것은 PCR 반응의 주형이 된다. PCR 프라이머는 실시예 15에 따라 설계되었고, 동정된 서열의 끝을 향하도록 합성되었다. 프라이머는 원형화된 주형안에 포함된 알려진 서열이 아닌 모르는 서열을 합성하게 된다. PCR 반응이 끝난 후, PCR 산물은 서열 분석되고, 동정된 외부 핵산 서열의 중심 서열을 포함하여 신장된 서열이 동정되었다. 이와 같은 방법으로, 각 새로운 유전자의 전체 서열이 동정될 수 있다. 추가적으로, 근접한 암호화 부위 및, 비암호화 부위의 서열이 동정되었다.

실시예 16

Staphylococcus aureus 증식에 필요한 유전자의 동정

Staphylococcus aureus에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 17

Neisseria gonorrhoeae 증식에 필요한 유전자의 동정

Neisseria gonorrhoeae에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로동정되었다.

실시예 18

Pseudomonas aeruginosa 증식에 필요한 유전자의 동정

Pseudomonas aeruginosa에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 19

Enterococcus faecalis 증식에 필요한 유전자의 동정

Enterococcus faecalis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 20

Haemophilus influenzae 증식에 필요한 유전자의 동정

Haemophilus influenza에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 21

Salmonella typhimurium 증식에 필요한 유전자의 동정

Salmonella typhimurium에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 22

Helicobacter pylori 증식에 필요한 유전자의 동정

Helicobacter pylori에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 23

Mycoplasma pneumoniae 증식에 필요한 유전자의 동정

Mycoplasma pneuminiae에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 24

Plasmodium ovale 증식에 필요한 유전자의 동정

Plasmodium ovale에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 25

Saccharomyces cerevisiae 증식에 필요한 유전자의 동정

Saccharomyces cerevisiae에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 26

Entamoeba histolytica 증식에 필요한 유전자의 동정

Entamoeba histolytica에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 27

Candida albicans 증식에 필요한 유전자의 동정

Candida albicans에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 28

Klebsiella pneumoniae 증식에 필요한 유전자의 동정

Klebsiella pneuminiae에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 29

Salmonella typhi 증식에 필요한 유전자의 동정

Salmonella typhi에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 30

Salmonella paratyphi 증식에 필요한 유전자의 동정

Salmonella paratyphi에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 31

Salmonella cholerasuis 증식에 필요한 유전자의 동정

Salmonella cholerasuis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 32

Staphylococcus epidermis 증식에 필요한 유전자의 동정

Staphylococcus epidermis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 33

Mycobacterium tuberculosis 증식에 필요한 유전자의 동정

Mycobacterium tuberculosis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 34

Mycobacterium leprae 증식에 필요한 유전자의 동정

Mycobacterium leprae에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 35

Treponema pallidum 증식에 필요한 유전자의 동정

Treponema pallidum에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 36

Bacillus anthracis 증식에 필요한 유전자의 동정

Bacillus anthracis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 37

Yersinia pestis 증식에 필요한 유전자의 동정

Yersinia pestis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 38

Clostridium botulinum 증식에 필요한 유전자의 동정

Clostridium botulinum에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 39

Campylobacter jejuni 증식에 필요한 유전자의 동정

Campylobacter jejuni에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

실시예 40

Chlamydia trachomatis 증식에 필요한 유전자의 동정

Chlamydia trachomatis에서 증식에 필요한 유전자가 전기에 기술된 방법으로 동정되었다.

분리된 외부 핵산 단편의 안티센스 항생제로서의 이용

동정된 서열은 분자 라이브러리의 선별뿐만 아니라 서열 그 자체가 치료제로 이용될 수 있는 항생제를 동정하기에 유용한 화합물을 동정하기 위해서도 이용할수 있다. 특이적으로, 안티센스 방향을 갖는 동정된 외부 서열은 세균의 표적 유전자 번역을 저해할 목적으로 생물체로 제공될 수 있다.

동정된 외부 서열로부터의 안티센스 치료제의 생성

본 발명의 서열은 세균 감염의 치료 또는 단순하게in vitro또는in vivo의 세균 생장 저해를 위한 안티센스 치료제로 이용될 수 있다. 이 치료는 유전자가 mRNA로 전사되고, 이것이 단백질로 번역되는 세포의 생물학적 과정을 이용한다. 안티센스 RNA 기술은 표적에 결합하고 표적 mRNA의 번역을 저해 또는 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 이용을 고찰한다. 하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세균에 의해 오염된 세포 배양액의 세균 감염을 치료 및, 퇴치하는데 이용되었고, 다른 실시태양에서는 세균 감염된 기관을 치료하기 위해 이용되었다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 본 발명의 서열 중 어느 하나로부터 합성될 수 있다. 우선적인 실시태양에서, 안티센스 올리고튜클레오티드는 인공적인 방법으로 합성되었다. Uhlmann & Peymann, Chemical Rev. 90:543-584 (1990)은 안티센스 올리고뉴클레오티드 기술을 자세하게 회고하고 있다. 변형되거나 변형되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 치료제로 이용할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 극도로 불안정하기때문에, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 선호되고 있다. 인산 골격(phosphate backbone)은 뉴클레오티드간 인산 잔기(internucleotide phosphate residue)를 메틸인산(methylphosphonates), 포스포로티오에이트 (phosphorothioates) 및, 인산 에스테르(phosphate esters)로 치환함으로써 변형된다. 실록산 다리(siloxane bridges), 탄산 다리(carbonate bridges), 티오에스테르 다리(thioester bridges)뿐만 아니라 다른 많은 것들이 뉴클레오티드간 비인산 유사체(anlaog)로 알려져 있다. 변형된 뉴클레오티드간 연결(modified internucleotide linkages)을 이용한 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제조는 미국 특허번호 5,142,047에 기술되어 있고, 본문에 참고 자료로 개시되었다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 단위를 변형하는 방법이 고찰되었다. 이러한 변형은 반감기를 증가시키고,in vivo에서 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수(uptake) 속도를 증가시킨다. 예를 들어, α-아노머릭 뉴클레오티드 단위(α-anomeric nucleotide units) 및, 1,2-다이데옥시-d-리보푸라노스(1,2-dideoxy-d-ribofuranose), 1.2-다이데옥시-페닐리보푸라노스(1,2-dideoxy-phenylribifuranose) , N⁴, N⁴-에타노-5-메틸-시토신(N⁴, N⁴-ethano-5-methyl-cytosine)이 본 발명에서의 이용을 위해 고찰되었다.

부가적인 형태의 변형된 안티센스 분자가 펩타이드 핵산에서 발견된다. 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)은 단일 가닥 및, 이중 가닥 핵산과 교잡하기 위해 개발된 것으로, PNA는 데옥시리보오스-인산 골격(deoxyribose-phosphate backbone) 전체가 화학적으로는 완전히 다르지만 구조적으로는 상동인, 2-아미노에틸 글리신(2-aminoethyl glycine) 단위를 포함하는 폴리아미드(펩타이드) 골격으로 교체된 핵산 유사체이다. (-) 성질이 큰 DNA와는 달리, PNA 골격은 중성이다. 그러므로, DNA-DNA 교잡체보다는 PNA-DNA 교잡체의 상동적인 가닥 사이의 반발에너지가 훨씬 작고, 결과적으로 훨씬 안정하다. PNA는 Watson/Crick 또는 Hoogsteen 식으로 DNA와 교잡할 수 있다 (Demidov et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:2637-2641, 1995; Egholm,Nature365: 566-568, 1993; Neilsen et al.,Science254: 1497-1500, 1991; Dueholm et al.,New J. Chem. 21: 19-31, 1997).

세 개의 8-아미노-3,6-다이옥사옥타오익 산(8-amino-3,6-dioxaactanoic acid) 단위를 포함하는 유동적인 헤어핀 연결자(flexible hairpin linker)에 의해 연결된 두 개의 동일한 PNA 서열을 갖는 PNA "클램프(clamp)" 라고 불리는 분자가 합성되었다. PNA 클램프가 상보적인 호모퓨린 또는 호모피리미딘 DNA 표적 서열과 섞이게 되면, 극도로 안정한 PNA-DNA-PNA 삼중 교잡이 형성될 수 있다 (Bentin et al.,Biochemistry35: 8863-8869, 1996; Egholm et al.,Nucleic Acids Res. 23: 217-222, 1995; Griffith et al.,J. Am. Chem. Soc. 117: 831-832, 1995).

PNA의 서열 특이적이고 매우 친화적인 이중 및, 삼중 결합은 자세히 기술되어 있다 (Nielsen et al.,Science254: 1497-1500, 1991; Egholm et al.,J. Am. Chem. Soc. 114: 9677-9678, 1992; Egholm et al.,Nature365: 566-568, 1993; Almarsson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90: 9542-9546, 1993; Demidov et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 92: 2637-2641, 1995). 그들은 또한 핵산 분해 효소(nuclease) 및, 단백질 분해 효소(protease)에 내성을 갖는 갖는다(Demidov et al.,Biochem. Pharm.48: 1010-1013, 1994). PNA는 유전자 발현을 저해하고 (Hanvey et al.,Science258: 1481-1485, 1992; Nielsen et al.,Nucl. Acids. Res.,21: 197-200, 1993; Nielsen et al.,Gene149: 139-145, 1994; Good & Nielsen,Science, 95: 2073-2076, 1998, 모든 것은 본문에 참고자료로 삽입), 제한 효소 활성을 차단하고 (Nielsen et al.,supra., 1993), 인공적인 전사 프로모터로서 작용하기도 하며 (Mollegaard,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 91: 3892-3895, 1994) 또한 가상의 제한 효소(pseudo restriction endonuclease)로서 작용하기도 한다 (Demidov et al.,Nucl. Acid. Res.21: 2103-2107, 1993). 또한, PNA가 안티센스 기작을 통해 매개되는 항바이러스성 및, 항암성 활성을 갖는다는 것이 최근에 보고되었다 (Norton,Nature Biotechnol.,14: 615-619, 1996; Hirschman et al.,J. Investig. Med.44: 347-351, 1996). PNA는 세포로의 PNA 흡수를 촉진시키기 위한 다양한 펩타이드와 연결되어 있다 (Basu et al.,Bioconj. Chem. 8: 481-488, 1997; Pardridge et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 92: 5592-5596, 1995).

본 발명에서 고찰된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 분야에 널리 알려진 기본적인 기술을 이용에 의해 표적으로 직접 적용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 또는 파지를 이용해 표적 안에서 생성될 수 있으며, 표적 세포의 염색체에 있는 서열로부터 발현될 수 있다. 고찰된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리보자임 서열로 삽입되어 안티센스가 특이적으로 결합한 표적 mRNA를 절단할 수 있다. 리보자임과 안티센스 올리고뉴클레오티드의 기술적인 적용에 관한Rossi 등의 Pharmacol. Ther. 50(2): 245-254, (1991)는 참고 자료로 본문에 개시되었다. 본 발명은 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포로 도입하기 위한 레트론의 이용을 고찰하였다. 레트론 기술은 미국 특허번호 5,405,775에 실시화되어 있고, 본문에 참고 자료로 개시되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 본 분야에 널리 알려진 리포좀 또는 일렉트로포레이션 기술에 의해 도입될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산은 또한 삼중 나선을 형성하여 기능하는 핵산을 포함하는 항생 화합물을 설계하기 위해 이용될 수 있다. 삼중 나선 올리고뉴클레오티드는 게놈의 전사를 저해하기 위해 이용된다. 본 발명에서 증식에 필요하다고 동정된 서열 또는 그것의 부분은 생물체에 감염된 개체(individuals)에서 미생물 유전자 발현을 저해하기 위한 주형으로서 이용된다. 전통적으로, 호모퓨린 서열은 삼중 나선 전략에 가장 유용하다. 그러나, 호모피리미딘 서열 또한 유전자 발현을 저해할 수 있다. 그러한 호모피리미딘 올리고뉴클레오디드는 호모퓨린:호모피리미딘 서열의 주요 그루브(major groove)에 결합한다. 또한 본 발명의 증식 관련 서열에 기초한 두 종류의 서열을 항생 화합물 주형으로서 이요하는 것이 고찰되었다.

본 실시예의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세균 세포의 사멸 또는 표적 유전자의 번역을 저해하여 최소한 정지상태(stasis)를 유도하기 위해 이용한다. 본 발명의 서열에 있는 약 8 내지 40개의 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 물리적 조건에서 표적 서열과 이중체(duplex)를 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는다.

세균 세포를 죽이거나 또는 그들의 생장을 저해하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 흡수가 촉진되는 조건에서 표적 세포 또는 세균으로 적용되었다. 이 조건은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포로 충분히 흡수되기에 충분한 혼합 배양 시간을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 7 내지 10일의 배양 시간은 시료내 세균을 죽이는데 충분했다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최적 농도는 이용에 따라 선택된다.

이용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 퇴치될 세균의 종류, 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상태 및, 처리된 배양액의 세포에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상대적인 독성에 따라 다양할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 1 x 10^-10M 내지 1 x 10^-4M 사이의 다양한 농도로 세포로 도입될 수 있다. 일단 유전자 발현을 적절히 조절하는 최소의 농도가 결정되고 나면, 최적화된 양은in vivo에서의 이용에 적합한 투여량으로 전환된다. 예를 들어, 1 x 10^-7의 배양액 내 저해 농도는 대략 "0.6 mg/kg 몸무게"의 양으로 전환된다. 100 mg/kg 몸무게에 해당하는 올리고뉴클레오티드 수준 또는 그 이상의 수준은 실험 동물에서의 올리고뉴클레오티드 독성을 조사한 후에 가능해질 것이다. 실험시료로부터 세포를 제거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 다음, 다시 세포로 재도입하는 것이 추가적으로 고찰되었다. 이 범위는 단지 구체적으로 설명하기 위한 것일뿐, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 주어진 조건에서 이용되는 최적의 농도를 결정할 수 있을 것이다.

세균 세포가 배양액에서 사멸되거나 퇴치된 후에, 세포 집단은 다른 목적을위해 이용될 수 있다.

실시예 41

하기의 실시예는 세균독성(bacteriocidal) 또는 세균정지성(bacteriostatic) 물질로서 작용하여 오염된 세포 배양 시스템을 처리하는E. coli안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 증명한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 적용은 증식에 필요한 세균 유전자 산물의 번역을 저해하는 것으로 사료된다.

본 실시예의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 분자 번호 EcXA001같은 증식 연관 핵산에 상보적인 30개 염기의 포스포로티오에티트가 변형된 올리고데옥시뉴클레오티드(a 30 base phosphorothioate modified loigodeoxynucleotide)에 상응한다. 안티센스 서열과 상보적인 센스 올리고데옥시뉴클레오티드가 합성되어 대조군으로 이용되었다. 올리고뉴클레오티드는 Matsukura 등의 Gene 72: 343 (1998) 방법에 따라 합성, 정제되었다. 조사 올리고뉴클레오티드는 적은 양의 멸균된 물에 용해되었고, 100 mM 스톡 용액을 만들기 위해 배양 배지로 첨가되었다.

인간 골수 세포가 두 환자의 말초 혈액으로부터 채취되어, 본 분야에 널리 알려진 기본적인 방법으로 배양되었다. 배양액은E. coliK-12 주로 오염된 다음, 세균 감염을 일으키기 위해 37℃에서 밤새도록 배양되었다.

대조군 용액과 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액이 오염된 배양액으로 첨가되고 세균 생장이 조사되었다. 10 시간 배양 후, 대조군 배양액과 실험 배양액으로부터 올리고뉴클레오티드 시료가 분리되고, 본 분야에 널리 알려진기본적인 미생물학 기술을 이용하여 표적 세균 유전자의 번역이 분석되었다.E. coli의 표적 유전자는 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 대조군 배양액에서 전사된 것으로 확인되었다. 그러나, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 실험 배양액의 표적 유전자의 전사는 탐지되지 않거나 또는 감소되었다.

실시예 42

E. coli에 감염된 실험 시료는 실시예 39에서 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자의 번역을 저해하기에 효과적인 농도로 약학적으로 허용가능한 담체 안에 포함되어 제공된다. 본 실험시료는 약 100 mM의 혈액 농도에 도달하기에 충분한 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도로 처리되었다. 이 농도를 유지하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 주일 동안 매일 환자에게 주사된다. 한 주의 마지막 날, 혈액 샘플이 채취되고 본 분야에 널리 알려진 기본적인 기술을 이용하여E. coli유무가 분석된다. E. col는 탐지되지 않았고 치료는 종결되었다.

실시예 43

삼중 나선 탐침의 제조와 사용

본 발명의 증식에 필요한 유전자 서열은 유전자 발현을 저해하는 삼중 나선 전략에 이용되는 10개 내지 20개의 호모피리미딘 또는 호모퓨린을 동정하기 위해 정밀 검사된다. 후보 호모피리미딘 또는 호모퓨린을 동정한 다음, 후보 서열을 포함하는 다양한 농도의 올리고뉴클레오티드를 표적 유전자를 정상적으로 발현하는 세균 세포 집단으로 도입함으로써 유전자 발현 저해 효과를 평가한다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성기에서 제조하거나 또는 올리고뉴클레오티드를 주문 합성하는 GENSET, Paris, France같은 회사로부터 상업적으로 구입할 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 칼슘 인산 침전(calcium phosphate precipitation), DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션, 리포좀-매개의 트랜스펙션 또는 자연적인 흡수를 포함하지만, 이것으로 국한되지는 않으며, 본 분야에 알려진 다양한 방법을 포함할 수 있다.

증식 감소는 처리된 세포의 광학 밀도를 측정하여 계산된 생장 수준에 의해 조사되고, 비처리된 세포와 비교된다. 그런 다음, 배양 세포의 유전자 발현을 저해하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드를 효과적인 투여량 수준으로 본 분야에 널리 알려진 기술을 이용하여in vivo로 도입할 수 있다.

어떤 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 단위인 자연적인 (베타) 아노머는 올리고뉴클레오티드가 핵산 분해 효소에 대해 보다 큰 내성을 갖도록 하기 위해 알파 아노머로 교체될 수 있다. 추가적으로, 에티디움 브로마이드 또는 비슷한 종류의 인터칼레이팅(intercalating) 물질은 삼중 나선을 안정화하기 위해 알파 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착될 수 있다. 삼중 나선 형성에 적합한 올리고뉴클레오티드를 생성하는 정보는 Griffin 등의 (Science 245: 967-971(1989), 참고자료로 본문에 개시)에 기술되어 있다.

실시예 44

PCR을 이용한 분리된 표본으로부터의 세균 주 동정

다양한 세균 종을 탐지하는 전통적인 세균생물학 방법은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 일이었다. 이들 방법은 실험 시료로부터 분리한 세균을 생장시킨다. 특성화되고 선택적인 배지에서의 배양 후의 확증 분석은 8 내지 10일 또는 그 이상이 소요된다. 본 발명의 동정된 서열은 시료에서 특정한 세균 주를 탐지하고 동정하는데 필요한 시간을 크게 단축시킬 수 있다.

하나의 좋은 예가 되는 방법에서, 세균은 영양이 풍부한 배지에서 생장하고, DNA 시료는 혈액, 소변, 대변, 침 또는 중추 신경계 용액 등의 표본으로부터 전통적인 방법에 의해 분리된다. 다양한 종의 미생물에 보존된 서열에 기초하는 한 부류의 PCR 프라이머는 표본으로부터 약 100 내지 200 염기 길이의 DNA를 증폭하기 위해 실시예 12에의 방법으로 이용된다. PCR 프라이머 각 쌍에 대해 개별적인 PCR 반응이 설치(set)되었고, PCR 반응이 완료된 후, 반응 혼합물에서 PCR 산물의 존재 여부가 분석되었다. 표본 내에 세균이 존재하는지의 여부는 PCR 프라이머에 의한 PCR 산물이 존재하는지의 여부에 의해 결정된다.

또한, PCR 반응 뿐만 아니라 서던 블랏 교잡같은 다양한 세균 종을 동정하는 다른 분석들이 고찰되었다.

Claims (110)

1. 미생물의 증식을 저해하며, 서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나를 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산 서열.
2. 제 1항에 있어서,

   미생물 증식을 위해 발현이 요구되는 유전자의 암호화 서열(coding sequence)의 적어도 한 부분과 상보적인 것을 특징으로 하는

   핵산 서열.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

   전기 핵산이 서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 한 단편을 포함하며, 전기 단편이 서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나에서 적 어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기(consecutive base)를 포함하는 단편들로 구성된 그룹에서 선택되 는 것을 특징으로 하는

   핵산 서열.
4. 제 3항에 있어서,

   미생물 증식을 위해 발현이 요구되는 유전자의 암호화 서열에 상보적 인 것을 특징으로 하는

   핵산 서열.
5. 서열 번호 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는(operably linked) 프로모터를 포함하는 벡터.
6. 제 5항에 있어서,

   프로모터가Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종의 어느 속(genus)에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체(organism)에서 활성 인 것을 특징으로 하는

   벡터.
7. 제 5항 또는 제 6항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
8. 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나의 암호화 서열을 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
9. 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 제 8항의 핵산의 단편.
10. 제 8항 또는 제 9항의 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터.
11. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 오페론에 존재하는 적어도 한 부분의 유전자내 서열(intragenic sequence), 유전자간 서열(intergenic sequence), 둘 또는 그 이상의 유전자에 적어도 한 부분에 걸쳐 있는 서열, 5' 비암호화 부위(noncoding region) 또는 3' 비암호화 부위에 상보적인 핵산 서열을 가지는 정제되거나 분리된 핵산.
12. 서열 번호 405 내지 485, 82 내지 88, 90 내지 242 또는 기본 매개 변수(default parameter)를 가지고 BLASTN 버전 2.0을 이용하여 결정된 그것의 상보적인 서열들로 구성된 그룹에서 선택되는 서열과 적어도 70%의 상동성(homology)을 가지는 핵산을 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
13. 제 12항에 있어서,

    핵산이Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종 의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 생물체로부터 유래하는 것을 특징으로 하는

    핵산.
14. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
15. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터.
16. 제 15항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
17. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398 중 하나의 서열을 가지는 정제되거나 분리된 폴리펩타이드.
18. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398의 폴리펩타이드 중 어느 하나에서 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60개 또는 60개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 단편으로 구성된 그룹에서 선택되는 한 단편을 포함하는 정제되거나 분리된 폴리펩타이드.
19. 제 17항 또는 제 18항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합(binding)할 수 있는 항체.
20. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 벡터를 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
21. 제 20항에 있어서,

    전기 단백질의 분리(isolation) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으 로 하는

    방법.
22. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드의 활성을 저해하거나 양을 감소시키거나 또는 전기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 활성을 저해하거나 양을 감소시키는 것을 포함하는, 증식을 저해하는 방법.
23. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드와 후보 화합물(candidate compound)을 접촉시키는 단계;및, 전기 화합물이 폴리펩타이드의 활성에 영향을 끼치는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 폴리펩타이드의 활성에 영향을 끼치는 화합물을 동정하는 방법.
24. 제 23항에 있어서,

    활성이 효소 활성인 것을 특징으로 하는

    방법.
25. 제 23항에 있어서,

    활성이 탄소 화합물 이화 활성(catabolism activity)인 것을 특징으로 하는

    방법.
26. 제 23항에 있어서,

    활성이 생합성 활성인 것을 특징으로 하는

    방법.
27. 제 23항에 있어서,

    활성이 수송 활성(transporter activity)인 것을 특징으로 하는

    방법.
28. 제 23항에 있어서,

    활성이 전사 활성인 것을 특징으로 하는

    방법.
29. 제 23항에 있어서,

    활성이 DNA 복제 활성인 것을 특징으로 하는

    방법.
30. 제 23항에 있어서,

    활성이 세포분열 활성인 것을 특징으로 하는

    방법.
31. 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242로 구성된 그룹에서 선택되는 서열의 암호화 서열을 포함하는 표적을 제공하는 단계; 전기 표적과 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및, 전기 표적의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 증식에 필요한 폴리펩타이드의 활성이나 수준을 감소시키는 능력을 화합물에서 분석하는 방법.
32. 제 31항에 있어서,

    표적은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 암호 부위로부터 전사된 mRNA 분자이고, 활성은 전기 mRNA의 번역인 것을 특징으로 하는

    방법.
33. 제 32항에 있어서,

    표적은 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 암호 부위이고, 활성은 전기 mRNA의 전사인 것을 특징으로 하는

    방법.
34. 제 31항의 방법으로 동정된 화합물.
35. 전기 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 대한 안티센스 핵산을 세포에서 발현하여 세포 내 유전자 산물의 활성이나 양을 감소시킴으로써 감작화된 세포를 생산하는 단계; 전기 감작화된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물이 전기 감작화된 세포의 생장을 비감작화된 세포의 생장보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 세포 증식에 필요한 유전자 산물의 활성이나 수준을 감소시키는 화합물을 동정하는 방법.
36. 제 35항에 있어서,

    세포가 세균 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 및, 동물 세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
37. 제 36항에 있어서,

    세포가E. coli세포인 것을 특징으로 하는

    방법.
38. 제 36항에 있어서,

    세포가Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종 의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 개체인 것을 특징으로 하는

    방법.
39. 제 35항에 있어서,

    안티센스 핵산이 유도성 프로모터(inducible promoter)에서 전사되는것을 특징으로 하는

    방법.
40. 제 39항에 있어서,

    전기 안티센스 핵산을 치사 이하(sublethal) 수준으로 유도하는 농도 의 유도제(inducer)와 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것 을 특징으로 하는

    방법.
41. 제 40항에 있어서,

    유도제의 치사 이하 농도는 생장 저해를 8% 까지 또는 그 이상으로 하 는 농도인 것을 특징으로 하는

    방법.
42. 제 40항에 있어서,

    유도제는 이소프로필-1-티오-β-갈락토시드인 것을 특징으로 하는

    방법.
43. 제 35항에 있어서,

    생장 저해가 배양 생장액의 광학 밀도를 조사하여 측정되는 것을 특징 으로 하는

    방법.
44. 제 35항에 있어서,

    유전자 산물이 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는

    방법.
45. 제 35항에 있어서,

    유전자 산물이 RNA인 것을 특징으로 하는

    방법.
46. 제 44항에 있어서,

    유전자 산물이 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징 으로 하는

    방법.
47. 제 35항의 방법으로 동정된 화합물.
48. 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 상응하는 유전자에 대해 활성을 갖는 화합물 또는 전기 유전자 산물에 대해 활성을 갖는 화합물을 유전자를 발현하는 세포 집단으로 도입하는 방법을 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 방법.
49. 제 48항에 있어서,

    화합물이 서열 번호 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열 또는 그것의 증식 저해 부분을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 인 것을 특징으로 하는

    방법.
50. 제 49항에 있어서,

    서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 증식 저해 부분이 서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또 는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는

    방법.
51. 제 48항에 있어서,

    화합물이 삼중 나선 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는

    방법.
52. 서열 번호 405 내지 485로 구성된 그룹에서 선택되는 서열 또는 그것의 증식 저해 부분을 포함하는 유효 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 포함하는 제제(preparation).
53. 제 52항에 있어서,

    서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나에 있는 증식 저해 부분이 서열번호 405 내지 485 중 어느 하나에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또 는 50개 이상의 연속적인 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는

    제제.
54. 세포 집단 내에서, 오페론의 적어도 하나의 증식 저해 부분을 유전자 발현 저해에 효과적인 안티센스 유래(orientation)로 가지는 안티센스 핵산과 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 상응하는 유전자를 발현하는 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 증식에 필요한 오페론 내 유전자의 발현을 저해하는 방법.
55. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산이 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 하나 이상 을 포함하는 유전자의 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는

    방법.
56. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산이 서열 번호 405 내지 485 중 어느 하나의 서열 또는그것의 한 부분인 것을 특징으로 하는

    방법.
57. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산을 발현하는 플라스미드를 세포 집단으로 도입함으로써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
58. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산을 발현하는 파지를 세포 집단으로 도입함으로써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
59. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 세포 집단의 염색체로 도입함으로 써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
60. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산을 발현하는 레트론(retron)을 세포 집단으로 도입함으 로써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
61. 제 54항에 있어서,

    결합 부분이 안티센스 올리고뉴클레오티드에 상보적인 리보자임(ribozyme)을 세포 집단으로 도입함으로써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
62. 제 54항에 있어서,

    안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포좀(liposome)을 세포로 도입함으로써 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
63. 제 54항에 있어서,

    일렉트로포레이션(electroporation)에 의하여 세포를 안티센스 핵산과 접촉시키는 것을 특징으로 하는

    방법.
64. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산이 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나 에서 적어도 10, 20, 25, 30, 50개 또는 50개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는

    방법.
65. 제 54항에 있어서,

    안티센스 핵산이 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는

    방법.
66. 세균 종을 함유하는 시료(sample)를 제공하는 단계; 및, 서열 번호 405 내지485, 82 내지 88 및, 90 내지 242로 구성된 그룹에서 선택되는 서열을 가지는 종 특이적(species-specific) 탐침을 이용하여 세균 종을 동정하는 단계를 포함하는, 세균 주(strain)를 동정하는 방법.
67. 하기의 단계를 포함하는, 미생물의 증식에 필요한 유전자를 동정하는 방법:

    (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 저해 핵산을 첫 번째 미생물에서 동정하는 단계;

    (b) 전기 저해 핵산과 두 번째 미생물을 접촉시키는 단계;

    (c) 첫 번째 미생물에서 동정된 저해 핵산이 두 번째 미생물의 증식을 저해하는지의 여부를 결정하는 단계; 및,

    (d) 전기 저해 핵산에 의해 저해되는 두 번째 미생물의 유전자를 동정 하는 단계.
68. 하기의 단계를 포함하는, 화합물의 증식 저해 능력을 분석하는 방법:

    (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물을 첫 번째 미생물에서 동 정하는 단계;

    (b) 전기 유전자 또는 전기 유전자 산물의 상동체(homolog)를 두 번째 미생물에서 동정하는 단계;

    (c) 두 번째 미생물에서 전기 상동체의 활성을 저해하는 저해 핵산 서 열을 동정하는 단계;

    (d) 두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 저해 핵산과 접촉시킴으로 써 전기 두 번째 미생물을 감작화하는 단계;

    (e) 단계 (d)의 감작화된 미생물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및,

    (f) 전기 화합물이 전기 감작화된 미생물의 증식을 비감작화된 미생물 의 증식보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계.
69. 제 68항에 있어서,

    첫 번째 미생물에서 증식 연관 유전자를 동정하는 단계가, 안티센스 유래의 전기 첫 번째 미생물 임의의 게놈 단편을 포함하며 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 핵산을 도입하는 단계; 및, 임의의 게놈 단편을 초기 수준과 낮은 수준으로 각기 전사한 전기 첫 번째 미생물 의 증식을 비교하여 임의의 게놈 단편이 증식 연관 유전자를 포함하고 있음을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
70. 제 69항에 있어서,

    두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계가, 기본 매개 변수를 가지는 BLASTN 버전 2.0과 FASTA 버전 3.0t78 알고리즘으 로 구성된 그룹에서 선택된 알고리즘을 이용하여, 데이터베이스에서 상동적 핵산 또는 상동적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
71. 제 69항에 있어서,

    두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계가, 첫 번 째 유전자와 교잡(hybridize)하는 핵산을 동정함으로써 상동적 핵산 또는 상동적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 동정하는 단계를 포함 하는 것을 특징으로 하는

    방법.
72. 제 69항에 있어서,

    두 번째 미생물에서 전기 유전자의 상동체를 동정하는 단계가, 첫 번 째 미생물에서 동정된 증식을 저해하는 핵산을 두 번째 미생물에서 발 현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
73. 제 69항에 있어서,

    저해 핵산이 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는

    방법.
74. 제 69항에 있어서,

    저해 핵산이 전기 상동체의 한 부분에 대한 안티센스 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
75. 제 69항에 있어서,

    저해 핵산이 전기 상동체를 암호화하는 오페론의 한 부분에 대한 안티 센스 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
76. 제 69항에 있어서,

    두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 핵산 서열과 접촉시키는 단계 가, 두 번째 미생물을 전기 핵산과 직접적으로 접촉시키는 단계를 포 함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
77. 제 69항에 있어서,

    두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 핵산 서열과 접촉시키는 단계 가, 두 번째 미생물에서 전기 상동체의 안티센스 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
78. 제 68항의 방법으로 동정된 화합물.
79. 하기의 단계를 포함하는, 화합물의 증식 저해 능력을 분석하는 방법:

    (a) 증식에 필요한 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 저해하는 저해 핵산 서열을 첫 번째 미생물에서 동정하는 단계;

    (b) 두 번째 미생물을 증식 저해량의 전기 저해 핵산과 접촉시킴으로 써 전기 두 번째 미생물을 감작화하는 단계;

    (c) 단계 (b)의 증식이 저해된 미생물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및,

    (d) 전기 화합물이 전기 감작화된 두 번째 미생물의 증식을 비감작화 된 두 번째 미생물의 증식보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단 계.
80. 제 79항에 있어서,

    저해 핵산이 전기 첫 번째 미생물의 증식을 저해하는 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는

    방법.
81. 제 79항에 있어서,

    저해 핵산이 전기 첫 번째 미생물의 증식을 저해하는 안티센스 핵산의 한 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
82. 제 79항에 있어서,

    저해 핵산이 첫 번째 미생물의 증식 연관 유전자의 전체 암호화 부위 에 대한 안티센스 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
83. 제 79항에 있어서,

    저해 핵산이 첫 번째 미생물의 증식 연관 유전자를 포함하는 오페론의 한 부분에 대한 안티센스 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
84. 제 79항의 방법으로 동정된 화합물.
85. 증식에 필요한 유전자 산물을 암호화하는 핵산에 대한 안티센스 핵산을 세포에서 발현하여 유전자 산물의 활성 또는 양을 감소시킴으로써 세포를 감작화하는 단계; 감작화된 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 화합물이 전기 감작화된 세포의 생장을 비감작화된 세포의 생장보다 크게 저해하는지의 여부를 결정하는단계를 포함하는, 증식에 필요한 생물학적 경로에 대한 활성을 화합물에서 분석하는 방법.
86. 제 85항에 있어서,

    세포가 세균 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 및, 동물 세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는

    방법.
87. 제 86항에 있어서,

    세포가E. coli세포인 것을 특징으로 하는

    방법.
88. 제 85항에 있어서,

    세포가Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, bacillus anthracis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatus, Chlamydia pneumoniae또는 전기 종 의 어느 속에 속하는 종으로 구성된 그룹에서 선택되는 개체인 것을 특징으로 하는

    방법.
89. 제 85항에 있어서,

    안티센스 핵산이 유도성 프로모터에서 전사되는 것을 특징으로 하는

    방법.
90. 제 89항에 있어서,

    유도성 프로모터로부터의 안티센스 핵산 발현을 치사 이하 수준으로 유도하는 물질(agent)과 세포를 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 것 을 특징으로 하는

    방법.
91. 제 90항에 있어서,

    치사 이하 수준의 안티센스 핵산은 증식을 8% 까지 또는 그 이상으로 저해하는 것을 특징으로 하는

    방법.
92. 제 90항에 있어서,

    물질이 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)인 것을 특징으로 하 는

    방법.
93. 제 91항에 있어서,

    증식 저해가 배양액의 광학 밀도를 조사하여 측정되는 것을 특징으 로 하는

    방법.
94. 제 85항에 있어서,

    유전자 산물이 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398로 구성된 그 룹에서 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징 으로 하는

    방법.
95. 제 85항의 방법으로 동정된 화합물.
96. 세포 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 물질과 세포를 접촉시키는 단계; 전기 세포를 전기 화합물과 접촉시키는 단계; 및, 전기 세포의 증식이 전기 물질과 접촉되지 않은 세포의 증식보다 전기 화합물에 의해 크게 저해하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 화합물의 세포 증식 저해 능력을 분석하는 방법.
97. 제 96항에 있어서,

    세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 전기 물질이 증식에 필요한 유전자 또는 오페론에 대한 안티센스 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
98. 제 96항에 있어서,

    세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시키는 전 기 물질이 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
99. 제 96항에 있어서,

    세포가 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 활성 또는 수준을 감소시 키는 온도 민감성 돌연변이(temperature-sensitive mutation)를 포함 하는 것을 특징으로 하는

    방법.
100. 제 99항에 있어서,

     안티센스 핵산이 전기 세포의 증식에 필요한 유전자 산물의 도메인 중안티센스 핵산이 작용하는 기능성 도메인과 같은 기능성 도메인을 암 호화하는 핵산으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는

     방법.
101. 제 99항에 있어서,

     안티센스 핵산이 전기 기능성 영역과는 다른 기능성 영역에서 유래하 는 것을 특징으로 하는

     방법.
102. 제 96항의 방법으로 동정된 화합물.
103. 증식 관련 핵산에 대한 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 세포에서 발현시키는 단계; 전기 세포를 이미 생화학적 작용 경로가 알려진 항생제와 접촉시키는 단계; 및, 전기 세포가 전기 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 전기 항생제에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 증식 관련 핵산 또는 유전자 산물이 위치해 있는 경로를 결정하는 방법.
104. 하기의 단계를 포함하는, 조사 화합물이 작용하는 경로를 결정하는 방법:

     (a) 이미 생물학적 작용 경로가 알려진 증식 관련 핵산에 대한 안티센 스 핵산을 치사 이하 수준으로 세포에서 발현시키는 단계;

     (b) 전기 세포를 조사 화합물과 접촉시키는 단계; 및,

     (c) 전기 세포가 전기 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 전기 조사 화합물에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계.
105. 제 104항에 있어서,

     (d) 전기 단계 (a)의 전기 증식 관련 핵산과는 다른 생물학적 작용 경 로에 있는 두 번째 증식 관련 핵산에 대한 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 세포에서 발현하는 단계; 및,

     (e) 전기 세포가 전기 두 번째 안티센스 핵산을 치사 이하 수준으로 발현하지 않은 세포보다 전기 조사 화합물에 대해 실제적으로 더 큰 감작성을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는

     방법.
106. 서열 번호 358 및, 399 내지 402 중 어느 하나를 필수적으로 포함하는 정제되거나 분리된 핵산.
107. 제 23항의 방법으로 동정된 화합물.
108. 서열 번호 82 내지 88 및, 90 내지 242 중 어느 하나에 있는 서열을 포함하는 핵산의 유전자 또는 유전자 산물과 상호 작용하는 증식 저해 화합물.
109. 서열 번호 243 내지 357 및, 359 내지 398 중 어느 하나를 포함하는 핵산의 유전자 또는 유전자 산물과 상호 작용하는 증식 저해 화합물.
110. 서열 번호 358 및, 399 내지 402 중 어느 하나를 포함하는 핵산의 유전자 또는 유전자 산물과 상호 작용하는 증식 저해 화합물.