CN104364650B - 人肺炎链球菌抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特定的单克隆抗体及其片段，其发现用于检测、预防和治疗肺炎链球菌感染。尤其是，这些抗体可以杀灭肺炎链球菌或限制肺炎链球菌的复制。还公开了产生此类单克隆抗体的改进的方法。

Description

人肺炎链球菌抗体及其用途

发明背景

本发明用政府支持在基金号P20RR015577、P20RR015577-10S1、P30RR031152、P30AR053483和U19AI062629和合同号HHSN266200500026C (N01-AI500026)下，由NationalInstitutes of Health资助完成。政府在本发明中具有某些权利。

本申请要求享有于2012年2月1日提交的美国临时申请系列号61/593,654的优先权，其完整内容通过引用并入本文。

包含于文件中名为“OMRFP0108US_ST25”的序列表（其为～91.8 KB并且在2013年1月8日产生）与本文一同通过电子申请提交，并通过引用并入本文。

1. 技术领域

本发明总体涉及微生物学、免疫学及病理学领域。更具体而言，其涉及用于肺炎链球菌（Steptococcus pneumoniae）感染的诊断、预防和治疗的人单克隆抗体的开发。

2. 发明背景

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起一系列临床感染诸如中耳炎、肺炎、脑膜炎和菌血症的普遍存在的人病原体。更严重的表现尤其在无免疫应答的(immunocompromised)和老年个体中是致命的。超过90种不同的肺炎链球菌血清型已被表征，每一种具有不同的荚膜多糖结构。这些多糖在成人中是免疫原性的，并且Pneumovax®23 疫苗由23种最常见的和/或强毒的肺炎链球菌菌株的混合物组成。该疫苗推荐用于超过60岁的每个人以及所有无免疫应答个体，以确保针对这些菌株的血清保护。

已深度研究了对Pneumovax®23以及缀合疫苗Prevnar®（用于免疫儿童）应答的血清学关于在血清和唾液中的体液多克隆IgG和IgA应答(Anttila等, 1999; Nieminen等,1998a; Nieminen等, 1998b)。记忆细胞和抗体分泌细胞（ASC）对这些疫苗的应答之前也已在细胞水平上用B细胞ELISpot测定和流式细胞术进行研究Nieminen等, 1998b;Clutterbuck等, 2006)，并且接种后两种应答的存在现在完全确定。然而，利用ASC来产生人单克隆抗体将提供完全阐释接种后对病原体血清型的回忆应答的新的方法，并甚至提供了勘察过去应答的进化的窗口。

与两种或多种肺炎球菌多肽交叉反应的抗体在免疫前和免疫后存在于血清中(Lee等, 1984; Soininen等, 2000)；然而，仍不知晓这是否由于能够交叉反应的单一抗体特异性或是由于广泛的多克隆抗体特异性。尽管已报道在患有SLE的患者中用Pneumovax®23免疫不诱导新的自身特异性(Elkayam等, 2005)，但一个报道已显示在患有SLE的患者中肾结合抗体还与肺炎球菌多糖交叉反应(Chowdhry等, 2005)。因此，可能从SLE供体的B细胞中产生的抗体可以显示增加的多反应性(poly-reactivity)或自反应性(auto-reactivity)。仅仅可以通过从SLE供体的人单克隆抗体的表征来确定此类经抗体(per-antibody)的现象。

发明概述

因此，根据本发明，提供包含多种抗体的人单克隆抗体组(panel)，其中所述组中的抗体结合至少15种肺炎链球菌的血清型。所述组中的抗体可以结合至少18种肺炎链球菌血清型或21种肺炎链球菌血清型。至少15种抗体可以是血清型特异性的，至少17种抗体可以是血清型特异性的，或者19种抗体可以是血清型特异性的。抗体组可以附着在支持物上，诸如珠、浸渍片(dipstick)、滤器、膜、板或芯片。血清型可以选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和CWPS。抗体组可以包含与两种血清型反应的抗体。

在另一个实施方案中，提供评估主体中肺炎链球菌的方法，所述方法包括从所述主体中获得第一含抗体的样品，并评估所述样品中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体组的结合，其中所述组中的抗体结合至少15种肺炎链球菌的血清型。所述组中的抗体可以结合至少18种肺炎链球菌血清型或21种肺炎链球菌血清型。至少15种抗体可以是血清型特异性的，至少17种抗体可以是血清型特异性的，或者19种抗体可以是血清型特异性的。抗体组可以附着在支持物上，诸如珠、浸渍片(dipstick)、滤器、膜、板或芯片。血清型可以选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和CWPS。抗体组可以包含与两种血清型反应的抗体。

主体可以是无免疫应答的和/或60岁龄或更老的。主体可以是怀疑具有肺炎链球菌。方法可以进一步包括用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体，如果发现所述第一含抗体的样品对一种或多种血清型是阳性的。方法可以进一步包括用万古霉素或左氧氟沙星(levoflaxin)治疗所述主体，如果发现所述第一含抗体的样品对血清型19A和/或19F是阳性的。所述第一含抗体的样品可以是血液、血清、血浆、痰(sputum)或唾液(saliva)。

方法可以进一步包括从所述主体中获得第二含抗体的样品，并评估所述第二样品中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体组的结合，其中所述组中的抗体结合至少15种肺炎链球菌的血清型。所述第二含抗体的样品可以是血液、血清、血浆、痰(sputum)或唾液(saliva)。主体可以在确定所述第一含抗体样品对于一种或多种血清型是阳性后已用抗肺炎链球菌疗法治疗，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价的降低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是有效的。主体可以在确定所述第一含抗体样品对于一种或多种血清型是阳性后已用抗生素治疗，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价未降低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是无效的，并且任选所述方法可以进一步包括用不同的抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。

在仍另一个实施方案中，提供选择性结合肺炎链球菌的抗体，其中所述抗体具有选自表2中所述的那些的重链和轻链CDR。抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、Fab片段或IgG。抗体可以进一步包含与其连接的抗生素，诸如经光不稳定的接头或经酶促切割的接头连接至所述抗体的抗生素。抗体可以缀合至纳米颗粒或脂质体。

在还仍另一个实施方案中，提供治疗主体中肺炎链球菌感染的方法，其包括如上所述向所述主体施用抗体。方法可以进一步包括向所述主体施用第二抗肺炎链球菌治疗，其可以在所述抗体的同时给予或在所述抗体之前和/或之后给予。抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、Fab片段或IgG。

抗体可以进一步包含与其连接的抗生素，诸如经光不稳定的接头或经酶促切割的接头连接至所述抗体的抗生素。抗体可以缀合至脂质体或纳米颗粒。施用多抗肺炎链球菌抗体，诸如结合2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种肺炎链球菌血清型的多抗肺炎链球菌抗体。

考虑本文描述的任何方法或组合物可以就本文描述的任何其他方法或组合物来实现。

在权利要求和/或说明书中当与术语“包含（comprising）”结合使用时，词语“一个（a）”或“一个（an）”的用法可以表示“一个（one）”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。词语“约”表示所述数字的正负5％。

本发明的其他目标、特征和优点将从以下详述中变得显而易见。然而，应该理解，详述和具体实施例尽管说明了本发明的具体实施方案，但仅是通过举例说明的方式给出，因为从该详述中本发明的精神和范围内的多种改变和变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图简述

以下附图构成本说明书的部分并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些附图中的一幅或多幅并组合本文呈现的具体实施方案的详述而被更好理解。

图1A-B. Pneumovax®23引起大量ASC爆发，其可以用作高亲和力抗多糖抗体的来源。（图1A）在用Pneumovax®23接种后7天从四个供体中收获PBMC。将它们染色并对作为CD3和CD20阴性和CD19中间体的细胞进行分选。呈现的点图表明在所有四个供体中的大ASC爆发（CD27高、CD38高；循环门控）。将来自这四个供体（命名为Con1、Con2、SLE1和SLE2）的ASC的百分比平均，外周血中16.3％的总B细胞是ASC。（图1B）将A中所示的ASC分选至96孔板。进行RT-PCR和几轮嵌套PCR来制备V区用于克隆。然后将DNA克隆入表达载体，扩增，并转染入HEK293人细胞系。

图2A-C. 平均上，用Pneumovax®23接种后产生的77％的抗体结合疫苗组分。（图2A）通过ELISA，平均77％(Con1, 62%; Con2, 90%; SLE1, 75%; SLE2, 75%)的表达的抗体结合肺炎链球菌荚膜或细胞壁多糖。（图2B）尽管显著百分比的抗体是交叉反应性的（12％），但产生的大部分抗体对单一血清型是特异性的。（图2C）52％的来自SLE2的抗体是多反应性的，结合以下五种抗原的至少两种：Ro、La、Sm、nRNP或心磷脂。

图3A-D. 个体可以产生对同一血清型的多种抗体，其中的一些是特异性的，并且其他是交叉反应性的。（图3A）血清型9N和9V具有非常相似的结构，但Con1p2D02仅结合9N，且SLE1p1E01仅结合9V。（图3B）相反，Con1p4B03结合9N和9V。如由亲和力(affinity)和抗体亲抗原性(avidity)测量所示，对9N的结合强于对9V的结合。（图3C）SLE1p1A03结合9N，但与14而非9V交叉反应。其对9N和14的亲和力和抗体亲抗原性相似。（图3D）SLE2p2D03结合19A和19F，其也具有相似结构。对19A和19F的亲和力相似，然而，对19A的抗体亲抗原性比对19F的强4倍。亲和力ELISA通过用抗体的连续稀释包被具有单一纯化的多糖的板来进行。亲和力(Kd’s)以摩尔浓度表示。抗体亲抗原性离液序列高的ELISA以相同方式进行，但加入使用硫氰酸铵的多种稀释的15分钟洗脱步骤。抗体亲抗原性图作为保留的百分比结合(OD₄₀₅具有SCN/OD₄₀₅无SCN * 100)相比于硫氰酸盐浓度的log来呈现。抗体亲抗原性等于引起结合50％降低（或保留）的硫氰酸铵的浓度。

图4A-C. B细胞产生对血清型15B和14，以及17F和33F的交叉反应性的抗体。（图4A）两种抗体SLE2p2G06和SLE2p2C04分别单独结合17F和33F。（图4B）然而，SLE2p1C03结合两种血清型。对33F的亲和力比对17F的亲和力要好一个数量级，然而，它们的抗体亲抗原性是相似的。（图4C）SLE2p1B01结合15B和14两者。尽管亲和力几乎比对15B的高一个数量级，但它常常显示对14的高两倍的抗体亲抗原性。

图5 从用Pneumovax®23接种产生的ASC产生高度突变的抗体。每一数据点是来自每一供体的每条序列的体细胞突变（核苷酸）的平均频率（在方法中为n值）。平均上，抗多糖ASC已积累了与季节性流感接种后抗流感ASC的相似数目的突变¹⁴。GC = 生发中心群。

图6A-B. 由Pneumovax®23诱导的ASC特异性通过由疫苗引起的供体的记忆应答来确定。（图6A）来自四个供体的‘记忆指纹(anamnestic fingerprint)’。之前均未接受Pneumovax®23，因此由于之前暴露于肺炎链球菌而从记忆中产生克隆的ASC‘回忆’抗体。每一供体具有独特的血清型（针对其他们已产生抗体）的“指纹”。（图6B）在排除克隆库成员并组合所有四幅图后，供体具有非常不同的‘肺炎球菌指纹’，其中仅三种血清型（9V、15B和17F）表示来自三个供体，且仅两种来自所有四个供体（8和33F）。

图7A-B. 显示来自每一供体的交叉反应性和多反应性的抗体。在此再现还显示抗体（其以红色为交叉反应性的（图7A）和以橙色为多反应性的（图7B））的来自图2A的ELISA曲线。来自SLE2的四种交叉反应性抗体的三种也是多反应性的（但均不来自其他供体）。

示例性实施方案描述

为了探究通过Pneumovax®23疫苗产生的抗体应答，本发明人从SLE患者和健康对照产生并表征了大量针对存在于疫苗中的肺炎链球菌血清型的高亲和力人单克隆抗体。尽管在过去已制备了针对肺炎链球菌的人单克隆抗体(Baxendale和Goldblatt, 2006;Baxendale等, 2000; Zhou等, 2002; Zhou等, 2004)，但这些研究还受以下两个因素限制：一，它们利用Fab表达文库筛选并且二，它们利用杂交瘤的随机产生。此外，之前研究要么集中于一种血清型（6B和23F）要么利用用缀合疫苗Prevnar（其仅由七种荚膜血清型组成）接种。相反，本发明人的技术提供了及时的（接种后7天）在一个特定点上抗多糖应答的代表性表征；因此，用于克隆抗体的每一细胞已从针对于该特定接种的记忆应答产生。该系统将告知在多糖免疫应答和自身免疫领域中大量仍未解答的问题。具体而言，本文数据具体解决不同血清型间交叉反应的人单克隆多糖抗体的百分比，个体的ASC对Pneumovax®23的应答如何是由于对肺炎链球菌的前期暴露，并且该应答在患有SLE的供体中如何不同。结果是，目前存在可用的广泛范围的针对肺炎链球菌的完全人单克隆抗体，其可以应用于诊断学、治疗诊断学和治疗学应用。本发明的这些和其他方面在下文详细描述。

II. 肺炎链球菌

A. 概述

肺炎链球菌或肺炎球菌是属链球菌属(Streptococcus)的革兰氏阳性、α溶血的、胆汁可溶的耐氧性厌氧成员。重要的人病原性细菌肺炎链球菌被认为是19世纪后期肺炎的主要原因，并且是许多体液免疫研究中的主题。

肺炎链球菌与草绿色链球菌（Streptococcus viridans）有所区别，其一些也是α溶血的，使用奥普托欣试验，如同肺炎链球菌是奥普托欣敏感的。肺炎链球菌还可以基于其对胆汁溶菌的敏感性而区别。该有荚膜的、革兰氏阳性球形细菌在革兰氏染色上具有特征性形态学，所谓的“柳叶刀形的(lancet-shaped)”双球菌。它们具有多糖荚膜，其充当生物的毒力因子；多于90种不同的血清型是已知的，并且这些类型在毒力、流行性和药物抗性程度上不同。

肺炎链球菌的基因组是闭合的、环形DNA结构，根据菌株不同，其含有2.0-2.1百万个碱基对。它具有1553个基因的核心组，加在其毒力组(virulome)中的154个基因（其负责毒力）和维持非侵袭性表型的176个基因。遗传信息在菌株间可以变化高至10％。

肺炎链球菌是正常的上呼吸道菌群的部分，但是，如同许多天然菌群，它在合适条件下可以变为致病性的（例如，如果宿主的免疫系统受到抑制）。侵染素诸如肺炎链球菌溶血素、抗吞噬的荚膜、多种黏附素和免疫原性的细胞壁组分是所有主要的毒力因子。

社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia, CAP）变得越来越普遍，并且代表世界范围内死亡率和发病率的重要成因。尽管大量不同的病原体可以产生CAP，但肺炎链球菌是最普遍之一。

CAP常常经吸入或抽吸肺致病性生物进入肺区或肺叶中而获得。更不常见的，CAP产生于来自远源的继发菌血症。

严重CAP通常在患有心肺疾病、受损的脾功能、和/或致病性毒力的患者中发生，但甚至年轻和/或健康宿主也可以发生严重CAP，如果成因的病原体足够有毒力。CAP中的并发症依赖于感染性病原体和患者健康。由于社区获得性肺炎（CAP）的发热可能促成心肌梗塞。而且，具有受损的脾功能的患有CAP的患者可以发生无法抗拒的肺炎球菌败血病，可能在12-24小时内导致死亡，而与所用的抗微生物疗法无关。

CAP发病率和死亡率在老年患者中和在无免疫应答的宿主中是最高的。预测患有CAP患者中升高的死亡率风险的其他因素包括显著并存病的存在、升高的呼吸速率、低血压、发热、牵连多叶(multilobar involvement)、贫血和缺氧。

B. 相关疾病状态

无关名称，肺炎链球菌导致除肺炎外的许多类型的肺炎球菌感染，包括急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血病、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝组织炎和脑脓肿。

C. 多药物抗性

肺炎链球菌疗法中日益增长的关注是菌株许多对青霉素及其他对β内酰胺（如阿莫西林）的抗性，其在全世界范围内增加。抗性的主要机制涉及编码青霉素结合蛋白的基因中引入突变。该发展使得治疗极大地复杂化，并且当疗法失败时还增加了不必要的花费。

在2000年，Whitney等检查了在Centers for Disease Control and Prevention的活性细菌核心监视(Active Bacterial Core Surveillance)计划中从1995年至1998年鉴定的患者中侵袭性肺炎球菌疾病的数据。在1998年间，报道了4013例侵袭性肺炎链球菌疾病，并且3475例可获得隔离群（87％）。总体上，来自1998年的24％的隔离群对青霉素是抗性的。青霉素抗性隔离群比易感性隔离群更可能具有高水平的对其他抗微生物剂的抗性。包括在7价缀合物和23价肺炎球菌多糖疫苗中的血清型分别占了青霉素抗性菌株的78％和88％。在1995年至1998年之间，对三类或更多类药物有抗性的隔离群的比例从9％增加至14％；在对青霉素（从21％至25％）、头孢噻肟（从10％至14％）、美罗培南（从10％至16％）、红霉素（从11％至15％）、和甲氧苄啶磺胺甲噁唑（从25％至29％）有抗性的隔离群的比例中也存在增加。这些趋势可能持续，给予临床医生更大的压力以求诸药物诸如万古霉素和左氧氟沙星(levoflaxin)。

D. 诊断

肺炎链球菌可以基于α溶血测试而与其他链球菌感染区分开。草绿色链球菌（其中一些也是α溶血的）可以使用奥普托欣测试来区别，因为肺炎链球菌是奥普托欣敏感的，而草绿色链球菌不是。肺炎链球菌还可以基于其对胆汁溶菌的敏感性而区别。该有荚膜的、革兰氏阳性球形细菌在革兰氏染色上具有特征性形态学，所谓的“柳叶刀形的(lancet-shaped)”双球菌。它们具有多肽荚膜，其充当生物的毒力因子；多于90种不同的血清型是已知的，并且这些类型在毒力、流行性和药物抗性程度上不同。

在区别血清型方面，目前可获得对血清型1、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、18C、19F和23F的抗体(ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT)。

E. 治疗

抗生素是对肺炎链球菌感染的治疗选择，并且通风（氧补充）作为细菌性肺炎的支持疗法。抗生素选择依赖于在地理区域中最常引起肺炎的微生物，以及具体生物的性质，个体的免疫状态和根本健康，感染的严重程度以及之前的治疗史。在英国，将阿莫西林用作绝大部分在社区中获得肺炎的患者的一线疗法，有时并加入克拉霉素。在北美，在那社区获得性肺炎的“非典型性”形式变得越来越普遍，克拉霉素、阿奇霉素或氟喹诺酮类作为单一疗法已经取代了阿莫西林作为一线疗法。在开始药物治疗时，应该总是考虑抗生素抗性的本地模式。在住院个体或具有免疫缺陷的那些个体中，本地指导方针决定抗生素的选择。这些抗生素通常经静脉内路线给予。具体而言，用阿莫西林（或在对青霉素过敏的患者中为红霉素）治疗肺炎链球菌，并且在严重情况下用头孢呋辛和红霉素。

III. 产生单克隆抗体

A. 总体方法

应理解结合肺炎链球菌的单克隆抗体将用于几种应用中。这些包括产生用于检测和诊断疾病的诊断试剂盒。在这些背景下，技术人员可以将此类抗体与诊断剂或治疗剂连接，或者使用它们作为竞争性测定中的俘获剂或竞争物。用于制备并表征抗体的方法是本领域中熟知的(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, 1988; 美国专利4,196,265)。

用于产生单克隆抗体（MAb）的方法通常与用于制备多克隆抗体的方法沿相同路线开始。这两种方法的第一步是免疫合适宿主或鉴定由于之前天然感染而被免疫的主体。如本领域中熟知的，用于免疫的给定组合物可以在其免疫原性上不同。因此，加强宿主免疫系统通常是必要的，如同可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性且优选的载体是匙孔槭血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）。其他白蛋白诸如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于缀合多肽与载体蛋白的方法是本领域中熟知的，并且包括戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺(carbodiimyde)和双重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。本领域中还熟知的是，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物（称为佐剂）来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂（含有杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答非特异性刺激物）、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。

用于制备多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而不同。多种途径可用于施用免疫原（皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内）。多克隆抗体产生可以通过在免疫后多个点取样经免疫的动物的血液来监测。还可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定过程直到达到合适的效价。当获得期望水平的免疫原性时，可以将免疫的动物放血并分离血清并储存，和/或将动物用于产生MAb。

在人单克隆抗体的情况下，技术人员可以改为简单寻找已经知道已产生免疫应答的个体，在这种情况下，为已暴露于肺炎链球菌或用Pneumovax®23免疫。为了鉴定具有对多种肺炎链球菌菌株的免疫性的主体，技术人员通常能够从主体获得血液并测试它们的肺炎链球菌抗体。本发明中描述的许多抗体以这种方式使用来自其他健康个体（之前感染过肺炎链球菌）的外周血来产生。

免疫或从如上所述的之前感染过的主体中获得细胞后，具有产生抗体潜力的体细胞（具体为B淋巴细胞（B细胞））选择用于MAb产生方案。这些细胞可以从活检的脾或淋巴结或从循环血中获得。来自免疫的动物的产生抗体的B淋巴细胞随后与无限增殖的骨髓瘤细胞（通常为与已免疫的动物相同的物种或人或人/小鼠嵌合细胞之一）的细胞融合。适合用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系优选为非抗体产生性的，具有高融合效率，和酶缺乏，所述酶缺乏进而使得无法在某些仅支持期望的融合细胞（杂交瘤）生长的选择性培养基中生长。

可以使用大量骨髓瘤细胞的任何一种，如本领域技术人员所知的(Goding, 第65-66页, 1986; Campbell, 第75-83页, 1984)。例如，其中免疫的动物是小鼠时，技术人员可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，技术人员可以使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于与人细胞融合相关中。一种具体的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系（也称为P3-NS-1-Ag4-1），其通过要求细胞系储存号GM3573可容易地获自NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。更近期，已描述了用于与人B细胞的另外的融合伴侣系，包括KR12 (ATCC CRL-8658;K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668)和HMMA2.5 (Posner等, 1987)。本发明中的抗体使用HMMA2.5系产生。

用于生成产生抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，尽管在促进细胞膜融合的一种或多种试剂（化学的或电的）存在的情况下，该比例可以分别从约20:1至约1:1变化。使用仙台病毒的融合方法已由Kohler和Milstein (1975; 1976)描述，以及使用聚乙二醇（PEG）的方法，诸如37% (v/v) PEG，由Gefter等(1977)描述。电诱导的融合方法的使用也是合适的(Goding, 第71-74页, 1986)。本发明中分泌流感抗体的杂交瘤可以通过电融合获得。

融合程序通常以低频率（约1 × 10^-6至1 × 10^-8）产生活的杂交物。然而，这不会产生问题，因为通过在选择性培养基上培养，活的、融合的杂交物与亲代、未融合的(infused)细胞（特别是未融合的骨髓瘤细胞，其将通常持续不确定地分裂）被区分。选择性培养基通常是含有阻断组织培养基中核苷酸的重新合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤、和偶氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的重新合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源（HAT培养基）。在使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞来源是转化EB病毒（EBV）的人B细胞系，则加入哇巴因，以排除未与骨髓瘤融合的EBV转化的系。

优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够运行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，并且它们无法存活。B细胞可以运行该途径，但它们在培养中具有有限的生存期，并且通常在约两周内死亡。因此，只有能够在选择性培养基中存活的细胞是那些从骨髓瘤和B细胞形成的杂交物。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，同样，也使用哇巴因用于杂交物的药物选择，因为EBV转化的B细胞对于药物杀死是易感的，而所用的骨髓瘤伴侣被选为哇巴因抗性的。

培养提供了杂交瘤的群，从中选择特定的杂交瘤。通常，通过培养细胞由在微量滴定板中单克隆稀释，随后测试单独的克隆上清液（在约2至3周后）的期望的反应性来完成杂交瘤的选择。测定应该是灵敏、简单且快速的，诸如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。

然后将所选的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆入单独的抗体产生细胞系，该克隆可以随后不确定地繁殖以提供mAb。可以以两种基本方式开发细胞系的MAb产生。可以将杂交瘤样品注射（通常注射入腹膜腔）入动物（例如小鼠）。任选地，注射前用烃引发动物，尤其是油诸如姥鲛烷（四甲基十五烷）。当以这种方式使用人杂交瘤时，优选注射无免疫应答的小鼠，诸如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥。注射的动物发生由融合的细胞杂交物产生的分泌特异性单克隆抗体的肿瘤。动物的体液诸如血清或腹水液可随后放出以提供高浓度的MAb。单独的细胞系还能够体外培养，其中MAb天然分泌入培养基中，从中可以容易地将它们以高浓度获得。或者，可以体外使用人杂交瘤细胞系来在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适应于在无血清培养基中生长以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。

如需要，由任一种方法产生的MAb可以进一步纯化，其使用过滤、离心和多种层析方法诸如FPLC或亲和层析。本发明的单克隆抗体的片段可以获自纯化的单克隆抗体，其通过包括用酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化在内的方法，和/或通过化学还原裂解二硫键。或者，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪来合成。

还考虑的是可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。为此，可以从杂交瘤系分离RNA并通过RT-PCR获得抗体基因并克隆入免疫球蛋白表达载体。或者，从分离自细胞系的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用病毒抗原淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是多至大约10⁴倍的抗体可以在单一轮次中产生并筛选，并且通过H链和L链组合产生新的特异性，其进一步增加了发现合适抗体的机会。

教导了用于本发明中的抗体产生的其他美国专利（其每一个通过引用并入本文）包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体治疗剂缀合物。

B. 本发明的抗体

在第一种情况下，本发明的抗体可以通过其结合特异性来确定。通过使用本领域技术人员熟知的技术来评估给定抗体的结合亲和力，本领域技术人员能够确定此类抗体是否落入本权利要求的范围内。

在本发明的上下文中，抗体特异性涉及肺炎链球菌血清型。存在由Pneumovax®23代表的24种不同血清型，由以下命名所代表：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F和CWPS。代表性抗体的CDR区序列包括在所附的序列表中。

另一个分类本发明的抗体的方法是通过它们的活性。这可以包括在存在或不存在补体的情况下，中和或杀灭肺炎链球菌的能力。最后，抗体可以具体参考重/轻链可变区序列来确定。本发明人提供了以下抗体，其在调理吞噬测定（OPA）中已显示出针对肺炎链球菌的活性，所述测定测量抗体介导的通过吞噬细胞系的细菌摄入。这也可以通过如表2中所述的可变区来呈现。

C. 抗体序列的工程化

在多个实施方案中，技术人员可以由于多种原因选择来工程化鉴定的抗体的序列，诸如改进表达、改进交叉反应性或消除脱靶(off-target)结合。以下内容是用于抗体工程化的相关技术的一般讨论。

可以培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可以使用随机六聚物用RT来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增全部人可变基因序列的PCR引物的多重混合物来进行PCR。可以将PCR产物克隆入pGEM-T Easy®载体，然后通过自动DNA测序使用标准载体引物来测序。结合和中和测定可以使用从杂交瘤上清液收集并通过FPLC使用蛋白G柱纯化的抗体来进行。

重组全长IgG抗体可以通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆入第二载体中，诸如Lonza pConIgG1或pConK2质粒载体，转染入293自由式(Freestyle)细胞或LonzaCHO细胞来产生，并且抗体可以随后从细胞上清液中收集并纯化。

pCon Vectors^TM是再表达完整抗体的简单方法。恒定区载体是一组提供一定范围的克隆入pEE载体中的免疫球蛋白恒定区载体的载体。这些载体提供具有人恒定区的全长抗体的简单构建和GS System™的便利。

抗体分子将包含片段(诸如F(ab’)、F(ab’)₂)，其例如通过mAb或例如可经重组方法产生的单链免疫球蛋白的蛋白水解切割来产生。此类抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，此类片段可以彼此组合，或与其他抗体片段或受体配体组合，以形成“嵌合”结合分子。值得注意的是，此类嵌合分子可以含有能够结合相同分子的不同表位的取代基(substituent)。

在相关的实施方案中，抗体是公开的抗体的衍生物，例如包含与公开的抗体中的CDR序列相同的CDR序列的抗体（例如，嵌合或CDR移植抗体）。在仍进一步的实施方案中，抗体是完全人重组抗体。或者，技术人员可以期望进行更多轻微改变，诸如向抗体分子引入保守改变。在进行这种改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予对蛋白的相互作用的生物学功能上的重要性是本领域通常理解的(Kyte和Doolittle, 1982)。接受的是氨基酸的相关亲水特征促成产生的蛋白的二级结构，其进而确定蛋白与其他分子（例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等）的相互作用。

在本领域还理解的是基于亲水性可以有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101（其通过引用并入本文）陈述了蛋白的最高局部平均亲水性（由其相邻的氨基酸的亲水性所控制）与蛋白的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中详述，以下亲水性值已分配于氨基酸残基：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0 ± 1)、谷氨酸(+3.0 ± 1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性、非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫的氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5 ± 1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。

理解的是氨基酸可以取代为另一个具有相似亲水性的氨基酸，并且产生生物学上或免疫学上修饰的蛋白。在这种改变中，优选其亲水性值在± 2以内的氨基酸的取代，在±1以内的那些是尤其优选的，并且在± 0.5以内的那些是甚至更尤其优选的。

如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

本发明还考虑同种型修饰。通过修饰Fc区以具有不同的同种型，可以实现不同的功能性。例如，对IgG₁的改变可以增加抗体依赖性细胞细胞毒性，转换至A类可以改进组织分布，并且转换至M类可以改进效价。

修饰抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术来进行，包括通过标准分子生物学技术来表达，或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件中其他处提及。

D. 单链抗体

单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体，用短（通常为丝氨酸、甘氨酸）接头连接在一起。该嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。该修饰通常使特异性未改变。这些分子历史上产生以促进噬菌体展示，其中极大地方便于表达作为单一肽的抗原结合域。或者，scFv可以直接从来源于杂交瘤的亚克隆的重链和轻链产生。单链可变分子缺少在完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并因此缺少用于纯化抗体的常用结合位点(例如，蛋白 A/G)。这些片段常常可以使用蛋白L来纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。

柔性接头通常由促螺旋和促转角(helix- and turn-promoting)氨基酸残基诸如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸构成。然而，其他残基也可以起作用。Tang等(1996)使用噬菌体展示作为快速选择来自蛋白接头文库的单链抗体(scFvs)的定制接头的方法。构建随机接头文库，其中重链和轻链可变域的基因通过编码可变组成的18个氨基酸多肽的区段来连接。scFv所有组成成分（约5 × 10⁶个不同成员）在丝状噬菌体上展示并进行用半抗原的亲和力选择。选择的变体的群展示出结合活性中的显著增加，但保留了相当大的序列多样性。筛选1054个单独的变体随后产生了以可溶形式有效产生的催化活性的scFv。序列分析揭示了接头中在V_H C末端后两个残基的保守脯氨酸和在其他位置处精氨酸和脯氨酸的丰富，其作为所选范围的唯一共同特征。

本发明的重组抗体还可能涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包括来源于IgA的那些，其允许缀合有J链的多聚物的形成。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在其他实施方案中，链可以用试剂诸如生物素/抗生物素蛋白来修饰，其允许两种抗体的组合。

在一个单独的实施方案中，单链抗体可以通过使用非肽接头或化学单元将受体轻链和重链结合来产生。通常，轻链和重链将在不同细胞中产生，纯化并随后以合适方式连接在一起（即，重链的N末端经合适的化学桥键(chemical bridge)连接至轻链的C末端）。

使用交联剂来形成将两个不同分子的官能团连在一起形成分子桥键，例如稳定剂和混凝剂。然而，应考虑可以产生相同类似物的二聚体或多聚体或者不同类似物构成的异聚化复合体(heteromeric complex)。为了以分步(step-wise)方式连接两种不同的化合物，可以使用消除不想要的均聚物形成的异-双功能交联剂(hetero-bifunctional cross-linker)。

示例性异-双功能交联剂包含两个反应基团：一个与伯胺基反应（即N-羟基琥珀酰亚胺）并且另一个与巯基反应（例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等）。经伯胺反应基团，交联剂可以与一个蛋白（例如选择的抗体或片段）的一个或多个赖氨酸残基反应并且经过巯基反应基团，已连接至第一蛋白的交联剂可以与另一个蛋白（例如选择剂）的半胱氨酸残基（游离巯基）反应。

优选将使用在血液中具有合理的稳定性的交联剂。许多类型的含二硫键的接头是已知的，其可以成功用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有为空间位阻的二硫键的接头可以证实提供更大的体内稳定性，防止靶向肽在达到作用位点之前释放。这些接头因此是一组连接剂。

另一种交联剂是SMPT，其是含有二硫键的双功能交联剂，所述二硫键通过邻近的苯环和甲基而是“空间位阻的”。认为二硫键的空间位阻起到保护键免于硫醇盐阴离子（诸如谷胱甘肽，其可能存在于组织和血液中）的攻击的作用，并由此帮助防止在递送连接的试剂到目标位点前缀合物的解偶联。

SMPT交联剂，如同许多其他已知的交联剂一样，带来交联官能团诸如半胱氨酸的SH或伯胺（例如，赖氨酸的ε氨基）的能力。另一种可能类型的交联剂包括异-双功能光反应性苯基叠氮化物，其含有可裂解的二硫键，诸如磺基琥珀酰亚胺基-2-（对-叠氮水杨酰基氨基）乙基-1,3'-二硫代丙酸盐/酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应并且苯基叠氮化物（光裂解后）非选择性地与任何氨基酸残基反应。

除了位阻的交联剂外，无位阻的接头也可以一同使用。其他有用的交联剂（不考虑含有或生成受保护的二硫化物）包括SATA，SPDP和2-亚氨基硫烷(iminothiolane)(Wawrzynczak和Thorpe, 1987)。使用此类交联剂是本领域熟知的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。

美国专利4,680,338描述了用于产生配体与含胺的聚合物和/或蛋白的缀合物，尤其是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双功能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在许多温和条件下可裂解的不稳定键的可裂解的缀合物。该接头尤其可用于目标试剂可以与接头直接成键并且裂解导致释放活性试剂的情况中。具体用途包括向蛋白（诸如抗体）或药物添加游离氨基或游离巯基。

美国专利5,856,456提供了用于连接多肽组分以形成融合蛋白例如单链抗体的肽接头。该接头长度多至约50个氨基酸，含有至少出现一次的带电荷的氨基酸（优选精氨酸或赖氨酸）随后为脯氨酸，并且其特征在于更大的稳定性和降低的聚集。美国专利5,880,270公开了含氨基氧基的接头，其用于多种免疫诊断和分离技术。

在具体的实施方案中，抗体是重组抗体，其适合于在细胞内部作用－此类抗体称为“细胞内抗体(intrabodies)”。这些抗体可能由于多种机制（诸如通过改变胞内蛋白运输）而干扰目标功能，干扰酶功能，并阻断蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用。以许多方式，它们的结构模拟上文讨论的那些单链和单结构域抗体或与其相似。的确，单转录物/单链是允许在目标细胞内胞内表达的重要特征，并还使得蛋白运输过细胞膜更可行。然而，需要另外的特征。

影响细胞内抗体治疗剂的实现的两个主要问题是递送，包括细胞/组织靶向，和稳定性。关于递送，已可以使用多种方法，诸如组织定向递送，使用细胞类型特异性启动子，基于病毒的递送和使用细胞穿透性/膜易位肽。关于稳定性，方法通常为通过蛮力(bruteforce)来筛选（包括涉及噬菌体展示并可以包括序列成熟或共有序列发展的方法），或者为更加定向的修饰诸如插入稳定序列（例如，Fc区、分子伴侣蛋白序列、亮氨酸拉链）和二硫化物置换/修饰。

细胞内抗体可能需要的另一个特征是细胞内靶向的信号。可以将细胞内抗体（或其他蛋白）靶向亚细胞区域诸如细胞质、细胞核、线粒体和ER的载体已被设计并且是可商购的(Invitrogen Corp.; Persic等, 1997)。

由于它们进入细胞的能力，细胞内抗体具有其他类型抗体无法实现的额外用途。在本发明抗体的情况下，在活细胞中与MUC1胞质结构域相互作用的能力可以干扰与MUC1CD相关的功能，诸如信号传递功能（结合至其他分子）或寡聚体形成。尤其是，考虑此类抗体可以用于抑制MUC1二聚体形成。

E. 纯化

在某些实施方案中，本发明的抗体可以纯化。如本文所用术语“纯化的”意指组合物，其可从其他组分中分离，其中将所述蛋白纯化至相对于其天然可获状态的任何程度。因此，纯化的蛋白还指这样的蛋白，其从它可能天然存在的环境中分离出来。当使用术语“基本上纯化的”时，该用法将指这样的组合物，其中蛋白或肽形成了所述组合物的主要组分，诸如构成所述组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白。

蛋白纯化技术对于本领域技术人员是熟知的。这些技术在一个水平上涉及细胞环境至多肽和非多肽级分的粗分级。已将多肽从其他蛋白中分离后，目标多肽可以使用层析和电泳技术进一步纯化以实现部分或完全的纯化（或纯化至同质性）。尤其适合于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。蛋白纯化的其他方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性，随后离心；凝胶过滤、反向、羟基磷灰石和亲和层析；和这些及其他技术的组合。

在纯化本发明的抗体中，可以期望在原核生物或真核生物表达系统中表达多肽，并使用变性条件提取蛋白。多肽可以使用亲和柱（其结合多肽的标签化部分）从其他细胞组分中纯化。如本领域中通常熟知的，认为可以改变进行多个纯化步骤的次序，或者可以去除某些步骤，并仍产生用于制备基本上纯化的蛋白或肽的合适方法。

通常，完全抗体是分级的利用试剂（即，蛋白A），其结合抗体的Fc部分。或者，抗原可以同时用于纯化并选择合适抗体。此类方法通常利用结合至支持物（诸如柱、滤器或珠）上的选择剂。将抗体结合至支持物上，去除污染物（例如洗掉），并通过施用条件（盐、热等）将抗体释放。

定量蛋白或肽纯化的程度的多种方法对于本领域技术人员在本公开的教导下将是已知的。这些包括例如确定活性级分的比活，或者通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。用于评估级分的纯度另一个方法是计算所述级分的比活，将其与起始提取物的比活比较，并因而计算纯化程度。用于代表活性的量的实际单位将当然依赖于所选的进行纯化的具体测定技术和表达的蛋白或肽是否展示出可检测的活性。

已知用不同的SDS/PAGE条件，多肽的迁移可以改变，有时显著地改变(Capaldi等,1977)。因此，应理解在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可以改变。

IV. 肺炎链球菌感染的被动免疫和治疗

A. 制剂和施用

抗体的被动转移，称为人工获得性被动免疫，通常涉及使用静脉内或肌内注射。此类免疫通常持续仅短时间周期，但提供了立即保护。抗体将在适合于注射的载体诸如无菌的且可注射的（syringeable）载体中配制。因此，本发明提供包含抗肺炎链球菌抗体和用于产生所述抗体的抗原的药物组合物。此类组合物包含预防上或治疗上有效量的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”意指通过联邦或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他通常认可的用于动物且更具体为人中的药典里。术语“载体”指稀释剂、赋形剂、或媒介物，用其可施用治疗剂。此类药学上载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内施用时，水是具体的载体。盐水溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是可注射的溶液。其他合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene, glycol)、水、乙醇等。

如需要，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。口服制剂可以包括标准载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物试剂的实例描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”。此类组合物将含有预防上或治疗上有效量的抗体或其片段，优选以纯化的形式，连同合适量的载体，以向患者提供合适施用的形式。制剂应适合施用模式，其可以是口服、静脉内、动脉内、颊内(intrabuccal)、鼻内、喷雾、支气管吸入，或通过机械通气递送。

通常，本发明的组合物的成分单独地或以单位剂量形式（例如，在气密密封容器内诸如表明活性剂的量的安瓿或小袋(sachette)内作为干燥的冷冻干燥粉末或无水浓缩物）混合在一起来提供。当组合物通过输注施用时，它可以用含无菌药用级水或盐水的输注瓶来配制。当组合物通过注射施用时，可以提供一安瓿的用于注射的无菌水或盐水，从而使成分在施用前可以混合。

本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的盐，和与阳离子诸如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形成的盐。

B. 组合疗法

为了增加本发明的抗体疗法的有效性，可以期望将该治疗与其他在治疗或预防肺炎链球菌感染上有效的药剂例如抗生素组合。该方法可以涉及向患者同时施用本发明的抗体和一种或多种其他药剂。这可以通过使用单一的药物组合物来实现，所述药物组合物包括两种药剂，或通过同时施用两种不同组合物来实现，其中一种组合物包括本发明的抗体并且另一种包括一种或多种第二药剂。

两种疗法可以以任何次序给予，并且可以以范围在数分钟至数周的时间间隔在另一种治疗之前或之后。在其中其他药剂分开应用的实施方案中，技术人员应通常保证在每次递送时刻之间重要的时间周期没有失效，从而使药剂仍能够实施对患者的有利地组合效果。在这种情况下，考虑可以在彼此的约12-24 h内并且更优选在彼此的约6-12 h内施用两种药物手段(modality)。在某些情况下，可以期望明显延长治疗时间周期，然而，其中在各次施用之间过去了若干天(2、3、4、5、6或7)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可以使用多种组合，本发明的抗体治疗是“A”，并且第二治疗为“B”：

第二药剂的施用将按照对该药物的通用方案，如存在，还考虑毒性。期望需要时治疗循环将重复。

1. 阿莫西林和红霉素

阿莫西林。阿莫西林(INN)（之前为阿莫西林(BAN)和缩写为amox）是中度谱的、溶菌的、β-内酰胺类抗生素，其用于治疗由易感性微生物引起的细菌感染。它是通常在该类别内的药物选择，因为它在口服施用后比其他β-内酰胺类抗生素更易吸收。阿莫西林是对儿童开具处方的最常用抗生素之一。该药物通过抑制细菌细胞壁合成来起效。它抑制构成革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌两者的细胞壁的主要组分的直链肽聚糖聚合物之间的交联。

它具有两个在生理范围内可电离的基团（在α位内的氨基至酰胺羰基和羧基）。阿莫西林对于由产生β-内酰胺酶的细菌的降解是敏感的，所述细菌对于广谱的β-内酰胺类抗生素诸如青霉素是有抗性的。为此原因，它通常与克拉维酸、β-内酰胺酶抑制剂组合，并在一个名称下市售。这通过降低其对β-内酰胺酶抗性的敏感性提高效力。

阿莫西林在治疗多种感染中使用，包括：急性中耳炎、链球菌性咽炎、肺炎、皮肤感染、尿路感染、沙门氏菌、莱姆病和衣原体感染。它用于预防接受牙科操作的高风险人群中的细菌性心内膜炎，用于预防在无脾的人中的肺炎链球菌感染，并用于预防和治疗炭疽。它还用于治疗囊肿性痤疮。然而，英国不推荐将它用于感染性心内膜炎的预防。这些推荐似乎尚未改变感染率。

副作用如同其他β-内酰胺类抗生素的副作用。副作用包括恶心、呕吐、疹、和抗生素相关的大肠炎。还可能发生腹泻（痢疾）。更为罕见但有患者报道，副作用包括精神改变，头晕，失眠，精神错乱，焦虑，对光和声敏感和思维不清。这些副作用的第一体征开始后需要立即的医疗护理。

对阿莫西林的过敏反应的出现可能是非常突然的并且必须尽快寻求高强度紧急医疗救护。此类反应的最初开始常常开始于精神状态的改变，伴有剧烈瘙痒的皮疹（常在指尖和环腹股沟区域开始并快速扩散），和发热、恶心和呕吐的感觉。看起来甚至关系较远地可疑的(remotely suspicious)的任何其他症状也必须非常严肃的对待。然而，更轻度的过敏症状，诸如疹可能在治疗过程中任何时候发生，甚至直至医疗已终止后一周。对于一些对于阿莫西林过敏的人而言，副作用可能是致命的。使用阿莫西林/克拉维酸组合多于一周已导致在一些患者中的轻度肝炎。已摄入急性过量的阿莫西林的幼儿显示出嗜睡、呕吐和肾功能障碍。

以三水合物形式的阿莫西林作为胶囊、咀嚼片剂或分散片剂加糖浆和儿童混悬剂用于口服使用，以及作为钠盐用于静脉内施用是可用的（尽管IV制剂在美国是不可用的）。阿莫西林最普遍口服服用。在患者可能发现难于服用片剂或胶囊时，液体形式是有帮助的。

红霉素。红霉素是大环内酯类抗生素，其具有与青霉素的抗微生物谱类似的或稍微更广的抗微生物谱，并常常用于对青霉素过敏的人。对于呼吸道感染，它对非典型性生物包括支原体和军团菌(Legionellosis)具有更好覆盖。它最初由Eli Lilly and Company市售，并且如今它通常称为EES（红霉素乙基琥珀酸酯，通常施用的酯前药）。

在结构上，该大环化合物含有14元内酯环，具有10个不对称中心和两种糖（L-克拉定糖和D-红霉脱氧糖胺），使得其成为经合成方法非常难于生产的化合物。红霉素从放线菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的菌株产生。

涵盖了该药物的美国专利2,653,899于1953年授权。产品于1952年在商品名Ilosone（在菲律宾的Iloilo区域后，从那将它最初收集到）下上市。红霉素之前称为Ilotycin。

自从发现红霉素A及其作为抗微生物剂的活性后的若干年，已进行了许多尝试来在实验室中合成它。然而，10个立体特异性碳的存在和不同取代的几个点已使得红霉素A的全合成成为棘手的任务。红霉素的相关结构及前体诸如6-脱氧红霉内酯B的全合成已实现，提供了不同红霉素及其他大环内酯类抗微生物剂的可能合成的途径。然而，Woodward及其同事于1981年的确成功完成了红霉素A的合成。

红霉素可以以肠包衣片剂、缓释胶囊、口服混悬剂、眼用溶液、软膏、凝胶和注射剂使用。商品名包括Robimycin、E-Mycin、E.E.S.、Granules、E.E.S.-200、E.E.S.-400、E.E.S.-400 Filmtab、Erymax、Ery-Tab、Eryc、Ranbaxy、Erypar、EryPed、Eryped 200、Eryped 400、Erythrocin Stearate Filmtab、Erythrocot、E-Base、Erythroped、Ilosone、MY-E、Pediamycin、Zineryt、Abboticin、Abboticin-ES、Erycin、PCE Dispertab、Stiemycine、Acnasol和Tiloryth。

由于红霉素是促胃动素激动剂，因而胃肠道紊乱诸如腹泻、恶心、腹痛、和呕吐是非常常见的。由于这一点，倾向于红霉素不作为一线药物开具处方。然而，由于该促运动作用(pro-motility effect)，红霉素可以用于治疗胃轻瘫。静脉内红霉素还可以用于内镜检查术作为助剂以清除胃内含物。更多严重的副作用包括伴有延长的QTc间隔（包括尖端扭转型室性心动过速(Torsades-de-Pointe)）的心律不齐和可逆的耳聋。过敏反应范围从荨麻疹至过敏症(anaphylaxis)。胆汁淤积、Stevens-Johnson综合征、和中毒性表皮坏死松解症是其他一些可能发生的罕见的副作用。

暴露于红霉素（尤其是以抗微生物剂剂量的长期暴露，并且还有经过母乳喂养）已与幼儿中幽门狭窄的概率升高相关。用于幼儿中喂养不耐受的红霉素尚未与肥厚性幽门狭窄相关。

依托红霉素已与妊娠妇女中可逆的肝毒性（形式为升高的血清谷氨酸-草酰乙酸氨基转移酶）相关，并且在妊娠中不推荐。一些证据暗示在其他人群中类似的肝毒性。

它还可以作用于中枢神经系统，引起精神病反应、梦魇和盗汗。它还可以改变复方口服避孕药的有效性，这是由于它对肠菌群的作用。红霉素是细胞色素P450系统的抑制剂，其表示它可以具有对由该系统代谢的其他药物（例如华法林）的水平的快速作用。

红霉素展示出杀菌活性，尤其是以更高浓度时，但该机制并未完全了解。通过结合细菌70s rRNA复合体的50S亚基，蛋白合成和随后的对生命或复制至关重要的结构和功能加工被抑制。红霉素干扰氨酰基易位，阻止结合在rRNA复合体的A位点上的tRNA转移至rRNA复合体的P位点上。没有该易位，A位点保持被占据，并因此向新生多肽链添加引进的tRNA及其连接的氨基酸受到抑制。这干扰了功能上有用蛋白的产生，这是该抗微生物作用的基础。

2. 克拉霉素、阿奇霉素、氟喹诺酮类和头孢呋辛

克拉霉素。克拉霉素是大环内酯类抗生素，其用于治疗咽炎、扁桃体炎、急性上颌鼻窦炎、慢性支气管炎的急性细菌性发作、肺炎（尤其是与肺炎衣原体或TWAR相关的非典型性肺炎）、皮肤和皮肤结构感染。此外，它有时用于治疗军团杆菌病、幽门螺旋杆菌和莱姆病。克拉霉素可以以几种商品名获得，例如Crixan、Clarac、Biaxin、Klaricid、Klacid、Klaram、Klabax、Klacid、Claripen、Clarem、Claridar、Fromilid、Clacid、Clacee、Vikrol、Infex和Clariwin、Resclar。

克拉霉素由在日本药物公司Taisho Pharmaceutical的研究人员在20世纪70年代发明。产品通过尝试开发一种形式的抗生素红霉素而出现，所述抗生素红霉素不会在消化道中经受酸不稳定性，引起副作用诸如恶心和胃痛。Taisho在1980年左右提交了对该药物的专利保护并随后于1991年向日本市场引入其药物的商品形式，称为Clarith。在1985年，Taisho与American company Abbott Laboratories就国际权利进行合伙，并且Abbott还于1991年10月获得了FDA对Biaxin的批准。该药物于2004年在欧洲和于2005年中期在美国变为非专利的(generic)。

抗菌谱与红霉素相同，但它针对鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)复合体（MAV）、麻风分枝杆菌(M. leprae)和非典型分枝杆菌是有活性的。

克拉霉素通过干扰其蛋白合成阻止细菌生长。克拉霉素结合细菌核糖体的亚基50S并因此抑制肽的翻译。克拉霉素具有与红霉素相似的抗微生物谱，但对于某些革兰氏阴性细菌尤其是嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)更为有效。除了该抑菌作用外，克拉霉素还对某些菌株诸如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)具有杀菌作用。

与红霉素不同，克拉霉素是酸稳定的，并因此可以口服服用而无需保护免于胃酸。它容易吸收并且扩散入大部分组织和吞噬细胞中。由于在吞噬细胞中的高浓度，克拉霉素活跃的转运到感染部位。在活跃的吞噬作用过程中，大浓度的克拉霉素被释放。克拉霉素在组织中的浓度可以比在血浆中高10倍多。最高浓度发现于肝和肺组织中。

克拉霉素具有相当快的首次通过肝代谢(first-pass hepatic metabolism)。然而，14-羟基克拉霉素（克拉霉素的代谢物）几乎为两倍的活性并相比于克拉霉素的5小时具有7小时的半衰期。克拉霉素及其代谢物主要消除途径为尿和胆汁排泄。在其类别中的所有药物中，克拉霉素具有以50％的最佳生物利用率，这使其顺从于口服施用。

大部分常见副作用是胃肠道的，包括腹泻、恶心、极度烦躁不安、腹痛和呕吐、面部肿胀。更少见的副作用包括头痛、幻觉（听觉和视觉上的）、眩晕/晕动病、疹、嗅觉和味觉改变（包括持续在服用它的整个时期中的金属味道）。口干燥、惊恐和/或焦虑发作和梦魇也已报道，尽管更为少见。在更严重情况下，已经知晓会导致黄疸、肝硬化、和包括肾衰竭在内的肾问题。还报道服用该药物时的心律不齐(Uneven heartbeats)、胸痛和呼吸急促。

克拉霉素在中枢神经系统中的不良作用包括眩晕、耳毒性和头痛，但精神错乱和躁狂症也是不常见的副作用。当与一些他汀类药物（用于降低血清胆固醇水平的药物）服用时，可能发生肌肉痛。还存在口腔念珠菌病的风险，这是由于从抗生素而在体内酵母产生增加。

阿奇霉素。阿奇霉素是氮杂内酯类，其是大环内酯类抗生素的一个亚类。阿奇霉素是世界上最畅销的抗生素之一，在美国以名称Zithromax市售，并且在世界范围以多种商品名和非专利标签市售。它来源于红霉素；然而，它在化学结构上与红霉素的不同之处在于甲基取代的氮原子并入内酯环内，因而使得内酯环为15元环。

阿奇霉素用于治疗或预防某些细菌感染，最常见是那些引起中耳感染、脓毒性咽喉炎、肺炎、伤寒和鼻窦炎的细菌感染。在近些年，已主要使用它用于预防婴儿和具有更弱的免疫系统的人中的细菌感染。它还对某些性传播感染有效，诸如非淋菌性尿道炎、衣原体和宫颈炎。近期研究已显示它还对于晚期发病的哮喘(late-onset asthma)有效，但这些发现存在争论并不为广泛接受。

阿奇霉素用于治疗许多不同感染，包括急性中耳炎、链球菌性咽炎、胃肠道感染诸如旅行者腹泻、呼吸道感染诸如肺炎、蜂窝组织炎、巴贝虫病、巴尔通体、软下疳、衣原体、霍乱、腹股沟肉芽肿、钩端螺旋体病、莱姆病、疟疾、结核分枝杆菌复合体、脑膜炎奈瑟菌、盆腔炎症性疾病、百日咳、恙虫病、梅毒、弓形虫病和沙门氏菌。它用于预防细菌性心内膜炎和一些性侵犯后的性传播疾病。

它具有与红霉素相似的抗微生物谱，但对于某些革兰氏阴性细菌尤其是流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)更为有效。阿奇霉素抗性已被描述并且在许多区域是地方流行性的。它对于MRSA明显无效。阿奇霉素已显示当用于与青蒿琥酯或奎宁组合使用时对于疟疾是有效的；对此的最佳剂量仍不知晓。

最常见的副作用是胃肠道的：腹泻(5%)、恶心(3%)、腹痛(3%)和呕吐。少于1％的患者由于副作用而停止服用该药物。神经质、皮肤病反应和过敏反应已经被报道。如同所有抗微生物剂，假膜性结肠炎可以在阿奇霉素治疗过程中或在直至治疗后若干周发生。该药物可以干扰避孕药的效力；在治疗期间可能需要其他形式的避孕。阿奇霉素混悬剂具有令人不快的味道，因而可能难于向幼儿（即2-5岁）施用，他们可能将其吐出。

偶见患者发生淤胆型肝炎或精神错乱。在婴儿中意外的静脉内超剂量引起严重的心传导阻滞，导致后遗症脑病。

阿奇霉素通过干扰其蛋白合成阻止细菌生长。阿奇霉素结合细菌核糖体的50S亚基并因此抑制mRNA的翻译。核酸合成不受影响。

与红霉素不同，阿奇霉素是酸稳定的，并因此可以口服服用而无需保护免于胃酸。它是容易吸收的，但它的吸收在空腹时更高。成人中到峰浓度的时间对于口服剂量形式为2.1至3.2小时，并且在剂量后1至2小时。由于在吞噬细胞中的高浓度，阿奇霉素活跃的转运到感染部位。在活跃的吞噬作用过程中，大浓度的阿奇霉素被释放。阿奇霉素在组织中的浓度可以比在血浆中高50倍多。这是由于离子障和高的脂质可溶性（分布容积太低）。

阿奇霉素的半衰期允许施用大的单一剂量，并仍在感染的组织中保持抑菌水平若干天。阿奇霉素的新扩展释放的制剂“Zmax,”A-Max是在单一2 g剂量中释放药物的液体口服混悬剂。Zmax的大环内酯技术允许药物绕过胃，降低高剂量阿奇霉素的胃肠副作用。

阿奇霉素通常以片剂或口服混悬剂（一种剂量形式在2005年成为可用）施用。它还可用于静脉内注射和在1％眼用溶液中。片剂的剂量为250 mg和500 mg。口服混悬剂的浓度为100 mg/5 mL和200 mg/5 mL。250 mg的片剂通常分配在6个包装中并通常称为“Z-Pak,”，而500 mg片剂通常以一包三个片剂或“Tri-Pak,”而可商购，其旨在用作三天治疗。口服阿奇霉素疗法的常用剂量由在治疗第一天的药疗法的“双倍剂量”和对另外4或5天的后续治疗组成。“Z-Pak,”意味着在第一天两片250 mg的片剂（总计500 mg）和随后四天每日一次一片250 mg的片剂。

Pfizer商品名即Zithromax的阿奇霉素片剂是斑状粉色、未分类的(unscored)、膜包被的、改变的椭圆形的片剂，其含有阿奇霉素一水合物和以下无活性成分：丁羟甲苯、磷酸钙、胭脂红、胶体二氧化硅、FD&C红# 40色淀(lake)、FD&C黄# 6色淀(lake)、羟丙甲纤维素(2910, 15cP)、乳糖一水合物、硬脂酸镁、预胶凝淀粉、月桂基硫酸钠、滑石、二氧化钛和三醋汀。

氟喹诺酮类。喹诺酮类是一个合成的广谱抗生素家族。术语喹诺酮类指有效的合成化学治疗抗菌药物。第一代喹诺酮类开始于在1962年将萘啶酸引入用于治疗人中的尿道感染。萘啶酸由George Lesher及其同事在氯喹合成的尝试过程中在馏出物中发现。它们阻止细菌DNA解旋和复制。

喹诺酮与其他抗生素类别相比，具有引起MRSA和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)建群的最高风险。为此原因，基于现有的证据和临床指导，推荐一般避免使用氟喹诺酮类。在临床使用的大部分喹诺酮属于亚类氟喹诺酮类，其具有连接到中心环系统（通常在6位或C-7位）的氟原子。仍在争论氟喹诺酮类用于治疗呼吸系统病症的效力是否与其他抗生素类别类似。

用于肺炎的氟喹诺酮使用在增加，并且与其一同的是对于氟喹诺酮类的细菌抗性。大部分氟喹诺酮类的处方开具是不合适的，并且根据临床指导方针少于4％的开具了喹诺酮的人是合适的。加拿大的临床指导方针推荐氟喹诺酮类仅用于少数患者的肺炎的门诊治疗中，诸如患有合并症(comorbid condition)的患者，例如具有COPD史的患者，或近期使用抗生素的患者。对于七种形式的社区获得性肺炎，氟喹诺酮类与改进的治疗率相关，但发现与在其他抗生素类别中的死亡率无差别。

氟喹诺酮类不推荐作为用于急性鼻窦炎的一线抗生素，因为该病况通常是自身限制的(self-limiting)，并且相比于其他抗生素类别风险高于益处。

包括氟喹诺酮类的抗生素在一些支气管炎病例中可以是有效的。然而，仅约5-10%的支气管炎病例是由细菌感染引起的；大部分支气管炎病例是由病毒感染引起，并且是自身限制的并且在几周内自身消退。已推荐在大部分病例中对其症状无法以其自身来消退的患者限制抗生素。

氟喹诺酮类通常用于泌尿生殖系统感染；通常仅在其他抗生素方案无效后才推荐它们。然而，对于其中患者可能需要入院治疗的肾盂肾炎或细菌性前列腺炎的严重急性病例，推荐将氟喹诺酮类作为一线疗法。前列腺炎已由著名的Stanford University泌尿科医生Thomas Stamey博士命名为“临床无知的垃圾筐(the waste basket of clinicalignorance)”。泌尿学医生最权威的参考书Campbell's Urology鉴定了所有患有前列腺炎的患者中仅约5％为具有细菌性前列腺炎，其至少可以在短期内由抗生素来“治愈”。换言之，95％的患有前列腺炎的男性对于单独用抗生素治愈而言希望渺茫，因为他们实际上并不具有任何可鉴定的细菌性感染。

通常，氟喹诺酮类是良好耐受的，并且大部分副作用为轻度至中度的。偶尔，发生严重不良作用。用氟喹诺酮类比用其他抗生素药物类别更常发生的一些严重的不良作用包括CNS和腱毒性。目前市售的喹诺酮类具有与其他抗微生物剂类别的类似的安全概况。有时氟喹诺酮类与QTc间隔延长和心律不齐、抽搐、肌腱断裂、尖端扭转型室性心动过速和低血糖相关。

这些不良反应是所有喹诺酮类的一类作用；然而，某些喹诺酮类与对某些器官增加的毒性更强烈相关。例如，莫西沙星具有更高的QTc延长的风险，并且加替沙星已最普遍地与紊乱的血糖水平相关，尽管所有喹诺酮类均具有这些风险。一些喹诺酮类由于这些不良事件而退市（例如，司帕沙星与光毒性和QTc延长相关，血小板减少和肾炎与托氟沙星相关，并且肝毒性与曲伐沙星相关）。皮质激素的同时使用存在于近三分之一的喹诺酮相关的肌腱断裂中。如果剂量没有合适地调整，例如如果存在肾机能不全，则不良事件的风险会进一步增加。

在以治疗剂量水平或急性过量的治疗使用过程中可能发生严重事件。在治疗剂量上，它们包括：CNS毒性、心血管毒性、腱/关节毒性、和罕见地，肝毒性。在患有肝疾病的患者中需要小心。在急性过量中可能发生的事件是罕见的，并包括肾衰竭和突发(seizure)。易感组的患者诸如儿童和老年人在治疗使用过程中处于不良反应的更大风险中。不良反应可以在氟喹诺酮疗法过程中以及在氟喹诺酮疗法已完成后出现。

CNS是氟喹诺酮介导的神经毒性的重要靶标。在意大利由医生报道的不良事件显示氟喹诺酮类在引起不良神经学和精神病学作用的前三种处方药中。这些神经精神病学作用包括震颤、意识错乱、焦虑、失眠、情绪激动，和在严重的情况下为精神病。莫西沙星在喹诺酮类中对于引起CNS毒性显得最严重。

氟喹诺酮类的基础药效团或活性结构基于喹诺酮环系统。在C6处添加氟原子是区别后代的氟喹诺酮类与第一代的喹诺酮类的方面。添加C6氟原子已显示对于这一类别的抗菌活性不是必需的（大约1997年）。

对喹诺酮环进行的多种取代导致如今可用的大量氟喹诺酮药物的开发。每一取代与大量特定的不良反应以及针对细菌性感染提高的活性相关，尽管喹诺酮环其内部及其本身(in and of itself)已与严重和甚至致命的不良反应相关。

头孢呋辛。头孢呋辛是第二代头孢菌素抗生素，其自从1977年已在美国作为Ceftin广泛可用。GlaxoSmithKline在英国（及其他国家诸如澳大利亚、土耳其、以色列、孟加拉国、泰国、匈牙利和波兰）以名称Zinnat销售该抗生素。

至于其他头孢菌素类，尽管作为第二代，但它对于β内酰胺酶更不易感，并因而可以具有对流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和莱姆病更高的活性。与其他第二代头孢菌素类不同，头孢呋辛可以穿过血-脑屏障。

头孢呋辛通常是良好耐受的并且副作用通常是短暂的。头孢呋辛如果与食物一同摄入，则更好吸收并更不可能引起它最常见的副作用：腹泻、恶心、呕吐、头痛/偏头痛、头晕和腹痛。

尽管存在头孢霉素和青霉素之间10％的广泛引证的交叉过敏风险，近期评估已显示不存在对头孢呋辛和几种其他第二代或后期的头孢菌素类的交叉过敏反应升高的风险。

3. 万古霉素和左氧氟沙星(Levoflaxin)

万古霉素。万古霉素（INN）是用于预防和治疗由革兰氏阳性细菌引起的感染的糖肽抗生素。它传统上用作药物的“终极手段(last resort)”，仅用于用其他抗生素治疗已无效后，尽管万古霉素抗性生物的出现意味着它日益被可用于PO和IV的利奈唑胺(Zyvox)和达托霉素(Cubicin) IV和奎奴普丁/达福普汀(Synercid) IV取代这一作用。

万古霉素首先于1953年由Edmund Kornfeld (在Eli Lilly工作)从由传教士采集于婆罗洲的内部热带雨林的土壤样品中分离。产生它的生物最后被命名为东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)。万古霉素的最初指征用于治疗青霉素抗性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。很快变得明显的一个优点是葡萄球菌尽管在含万古霉素的培养基中连续传代，但不发展明显的抗性。由葡萄球菌的青霉素抗性的快速发展导致该化合物由FDA在1958年被快速批准。Eli Lilly首先以商品名Vancocin上市盐酸万古霉素，并且在印度为来自Nucleus的COVANC。

万古霉素从未成为用于金黄色葡萄球菌的一线治疗是由于几个原因。首先，它具有差的口服生物利用率。而且，对于大部分感染它必须静脉内给予。此外，β-内酰胺酶抗性的半合成青霉素诸如甲氧西林（及其后续产品萘夫西林和氯唑西林）随后开发，其对于非MRSA葡萄球菌具有更好的活性。

万古霉素的口服形式最初由FDA于1986年批准用于治疗艰难梭菌引起的假膜性结肠炎。它不会口服吸收入血液中，并且保留在胃肠道中以根除艰难梭菌。该产品目前由ViroPharma在美国市售。

万古霉素生物合成经不同的非核糖体蛋白合酶(NRPSs)发生。在其经其7个模块的装配过程中酶决定氨基酸序列。在万古霉素经NRPS装配前，首先修饰氨基酸。将L-酪氨酸修饰成为β-羟基氯酪氨酸(β-hTyr)和4-羟基苯基甘氨酸(HPG)残基。另一方面，使用乙酸来衍生3,5-二羟基苯基甘氨酸环(3,5-DPG)。

非核糖基肽合成经不同模块发生，所述模块可以装载并经在活化结构域的接触位点的酰胺键形成而将蛋白延伸一个氨基酸。每一模块通常由腺苷酸化（A）结构域、肽基载体蛋白（PCP）结构域和缩合（C）或延长结构域组成。在A结构域中，特定氨基酸通过经硫酯化转化为结合至4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅因子的氨酰基腺苷酸酶复合体来活化。复合体随后转移至PCP结构域并排出AMP。PCP结构域使用连接的4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基来装载生长中的肽链及其前体。在万古霉素的生物合成中，存在另外的修饰结构域，诸如差向异构化（E）结构域，其被用于将氨基酸从一种立体化学异构化为另一种，并且硫酯酶结构域（TE）用作用于环化的催化剂，并经硫酯酶裂解释放分子。

合成直链七肽分子后，万古霉素必须进行进一步的修饰，诸如通过不同的酶（称为剪裁酶(tailoring enzyme)）氧化交联和糖基化（以反式），以成为生物活性的。为了转化直链七肽，使用八种酶。借助于这些酶，β-羟基被引入到酪氨酸残基2和6，并且对环5和7、环4和6、和环4和2发生偶联。此外，使用卤过氧化物酶来将氯原子经氧化过程连接到环2和6。

万古霉素通过抑制革兰氏阳性细菌中的正确细胞壁合成来起作用。由于革兰氏阴性细菌产生其细胞壁的多种机制以及涉及进入革兰氏阴性生物的外膜的多种因素，万古霉素对于革兰氏阴性细菌没有活性（除了奈瑟菌属(Neisseria)的一些非淋球菌物种外）。

大的亲水性分子能够与NAM/NAG-肽的末端D-丙氨酰基-D-丙氨酸部分形成氢键相互作用。在正常情况下，这是五点相互作用。万古霉素与D-Ala-D-Ala的这种结合以两种方式阻止细胞壁合成。它阻止N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)（其形成细菌细胞壁的骨架链）合成log聚合物，并且它阻止的确设法从彼此交联中形成的骨架聚合物。

尽管通常监测万古霉素水平（努力降低不良事件），但该值仍在讨论。通常监测峰水平和谷水平，对于研究目的，有时还使用曲线下面积。通过注视谷值最佳监测毒性。与IV万古霉素有关的常见不良药物反应(≥ 1%的患者)包括：局部疼痛，其可以是严重的和/或血栓性静脉炎。

对肾脏和对听力的损害是万古霉素的早期不纯形式的副作用，并且这些在20世纪50年代中期进行的临床试验中占主导。使用更纯形式的万古霉素的更晚一些的试验发现肾毒性是不常见的不良作用(0.1–1%的患者)，但这在氨基糖甙类存在的情况下加重。

罕见的不良作用(<0.1%的患者)包括：过敏反应、中毒性表皮坏死松解症、多形性红斑、红人综合征（见下文）、二重感染、血小板减少、中性粒细胞减少、白细胞减少症、耳鸣、眩晕和/或耳毒性（见下文）。

近期已强调万古霉素能够诱导患者中的血小板反应性抗体，导致严重的血小板减少和伴有鲜红色点状出血、瘀斑和湿紫癜的出血。

万古霉素必须静脉内（IV）给予用于全身治疗，这是由于它无法穿过肠壁(intestinal lining)。它是大的亲水性分子，其跨过胃肠粘膜分配差。口服万古霉素疗法的唯一指征是治疗假膜性结肠炎，其中它必须口服给予以达到结肠内的感染部位。口服施用后，万古霉素的排泄物浓度为500 µg/mL左右 (艰难梭菌的敏感菌株具有≤ 2 µg/mL的平均抑制浓度)。

经吸入器吸入的万古霉素还已使用（无标签(off-label)）用于治疗上呼吸道和下呼吸道的多种感染。

万古霉素的腐蚀性性质使得使用外周途径的IV疗法对血栓性静脉炎有风险。理想地，中心途径PICCs或输注口(infusion port)应该使用。

万古霉素传统上被认为是肾毒性和耳毒性药物，其基于由早期调查人员在已经历耳毒性的肾损伤患者中的升高的血清水平的观察结果，和随后经在医学文献中的病例报道。然而，随着开始于20世纪70年代MRSA的传播，增加了使用万古霉素，公认之前报道的毒性比例未再观察到。这是由于去除了药物的更早期制剂中存在的杂质，尽管这些杂质并未具体检测毒性。

万古霉素相关的肾毒性的积累的病例报道的后续综述发现许多患者还已接受了其他已知的肾毒素，尤其是氨基糖甙类。其余部分的大部分具有其他混杂因素，或关于这一点的可能性的不充足的数据，其妨碍了万古霉素与观察到的肾功能障碍的明确关联。大部分方法学上可靠的调查表明万古霉素引起的肾毒性的实际发病率在5–7%左右。结合起来看，类似比例的肾功能障碍已对头孢孟多和苄基青霉素这两种据说无肾毒性的抗生素进行报道。

此外，将肾毒性与万古霉素血清水平相关的证据也是不一致的。一些研究已表明当谷水平超过10 µg/mL时肾毒性比例增加，但其他却未能再现这些结果。肾毒性还已用在“治疗”范围内的浓度观察到。本质上，万古霉素作为肾毒素的名声被过度强调了，并且尚未证实当它们的确发生时，维持万古霉素血清水平在某些范围内会阻止其肾毒性作用。

尝试确定万古霉素引起的耳毒性的比例甚至更为艰难，这是由于缺乏可靠证据。目前意见一致的是万古霉素耳毒性明确相关的病例是很少的。万古霉素血清水平和耳毒性之间的关联也是不确定的。尽管在其万古霉素血清水平超过80 µg/mL的患者中已报道了耳毒性的病例，但在用治疗水平的患者中也报道了病例。因此，还仍不确定用于维持“治疗”水平的目的的万古霉素治疗药物监测将会防止耳毒性。

争论和不确定的另一个领域涉及万古霉素是否会增加其他肾毒素的毒性的问题，以及如果增加的话，到何种程度的问题。临床研究已产生多种结果，但动物模型表明当万古霉素添加到肾毒素诸如氨基糖甙类时，可能存在一些升高的肾毒性作用。然而，剂量作用或血清水平作用相关性尚未确立。

左氧氟沙星。左氧氟沙星是氟喹诺酮类药物类别的合成的化学治疗抗生素，并用于治疗严重的或威胁生命的细菌性感染或对其他抗生素类别无响应的细菌性感染。它在多种商品名下销售，诸如Levaquin和Tavanic最常见。以眼用溶液的形式，它称为Oftaquix、Quixin和Iquix。

左氧氟沙星是手性的氟化的羧基喹诺酮。氧氟沙星（为外消旋混合物的更早药物）的调查发现l形式[(–)-(S)对映异构体]更有活性。该特定组分是左氧氟沙星。左氧氟沙星以片剂形式、注射、口服溶液、以及如用于处方滴眼液和滴耳液可用。

左氧氟沙星与多种其他药物以及多种草本及天然添加物相互作用。此类相互作用增加了心脏毒性和心律失常的风险、抗凝作用、非吸收性复合体的形成、以及增加毒性风险。

左氧氟沙星与多种严重的和威胁生命的不良反应以及特发性腱断裂和不可逆的周围神经病变相关。此类反应可以在治疗已完成后很久出现，并且在严重病例中可能导致终身残疾。肝毒性也已与使用左氧氟沙星一同报道。

在2011年，参考特发性腱断裂和左氧氟沙星可能导致重症肌无力症状（包括肌无力和呼吸问题）恶化这一事实，FDA已对该药物添加了两项黑盒子(Black box)警告。此类不良反应是潜在的威胁生命的事件并可能需要辅助呼吸。

左氧氟沙星用于治疗多种感染，包括：呼吸道感染、蜂窝组织炎、尿道感染、前列腺炎、炭疽、心内膜炎、脑膜炎、盆腔炎症性疾病和旅行者腹泻。

在成人群体中，口服和I.V.左氧氟沙星限于治疗证明的严重和威胁生命的细菌性感染，诸如尿道感染、社区获得性肺炎、皮肤和皮肤结构感染、医院获得性肺炎、慢性细菌性前列腺炎、吸入性炭疽、急性细菌性鼻窦炎、慢性支气管炎急性细菌感染发作和急性肾盂肾炎。

口服和I.V.左氧氟沙星未通过FDA批准用于儿童中，除了特例（吸入性炭疽），这是由于对肌骨骼系统的可逆或不可逆损伤的风险。尽管声明为有效的，但不考虑左氧氟沙星为在儿童群体中用于吸入性炭疽的一线药剂，这是由于涉及肌骨骼系统的严重不良反应和其他严重的不良反应包括死亡。

CDC废除其推荐关于使用氟喹诺酮类（环丙沙星）作为治疗炭疽的一线药剂（部分上），这是由于在Antimicrobial Postexposure Prophylaxis中对炭疽研究（又名盐酸环丙沙星60天研究）记载的不良反应的风险。然而，氟喹诺酮类在英国被批准治疗患有囊性纤维化病的儿童中的下呼吸道感染。

相比于任何其他抗生素药物类别，严重的不良事件更普遍地发生于氟喹诺酮类。在大部分不良反应中为轻度至中度的；然而，偶尔，发生严重的不良作用。由于此类不良反应，存在许多监管活动，其包括发表的警告、额外的警告和对药品说明书添加的安全性信息，其包括连同关于近期添加黑盒子警告的“亲爱的医生的信”的发布一起的黑盒子警告。

在2004年，FDA要求新的警告标签被添加到所有的氟喹诺酮类（包括左氧氟沙星）上，其关于周围神经病变（不可逆的神经损伤）、腱损伤、心脏问题（延长的QT间隔/尖端扭转型室性心动过速）、假膜性结肠炎、横纹肌溶解症（肌肉萎缩）、Stevens-Johnson综合征以及同时使用NSAIDs导致这些反应的严重性。在这之后，在2007年6月25日，FDA要求制造商添加额外警告于药品说明书上，其注明“其他严重的和有时致命的事件（一些由于过敏症，并且一些由于不确定的病因学）已在接受用喹诺酮类（包括左氧氟沙星）的治疗的患者中报道”。

严重的视力并发症也已报道发生于眼用氟喹诺酮类治疗，其还可能发生于左氧氟沙星滴眼液，尤其是角膜穿孔，但还有去脏术和眼球摘除术。该增加的角膜穿孔事件可能由于氟喹诺酮类引起间质胶原中的改变，导致构造强度的降低。如之前提及，永久性复视(double vision)(复视(diplopia))也已报道。

左氧氟沙星是外消旋物氧氟沙星（喹诺酮抗微生物剂）的L-异构体。在化学方面，左氧氟沙星（手性的氟化的羧基喹诺酮）是外消旋药物氧氟沙星的纯(-)-(S)-对映体。化学名称为(-)-(S)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-1,4-苯并噁嗪-6-甲酸半水合物。经验式为C18H20FN3O4 • ½ H2O，并且分子量为370.38。左氧氟沙星是淡浅黄白色至黄白色的晶体或晶状粉末。

左氧氟沙星药代动力学在单次和多次口服或IV给药方案后是线性且可预测的。左氧氟沙星在口服施用后快速地且基本上完全吸收。峰血浆浓度通常在口服给药后1至2个小时获得。左氧氟沙星在IV施用后的血浆浓度概况与当施用相等剂量(mg/mg)时对LEVAQUIN片剂观察到的暴露程度（AUC）是相似且可比较的。左氧氟沙星大部分在尿中作为未改变的药物排泄。左氧氟沙星的平均末端血浆消除半衰期范围为口服或静脉内给予左氧氟沙星的单一或多次剂量后约6-8小时。葡萄苷酸化和羟基化已引用作为盐酸左氧氟沙星的主要代谢途径之一。然而，对左氧氟沙星的药物卡(DB01137)说明生物转化信息是不可得的。关于生物转化的特定信息在药品说明书中似乎不是可容易得到的。

左氧氟沙星是广谱抗生素，其对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有活性。它通过抑制DNA解旋酶、II型拓扑异构酶和拓扑异构酶iv（其是对单独复制的DNA必需的酶）起作用，由此抑制细胞分裂。

氟喹诺酮类通过抑制称为DNA解旋酶的酶复合体而干扰DNA复制。这也可以影响哺乳动物细胞复制。尤其是，该药物家族的一些同类物展示不仅针对细菌拓扑异构酶还针对真核生物拓扑异构酶的高活性，而且对培养的哺乳动物细胞和体内肿瘤模型是毒性的。尽管喹诺酮对在培养中的哺乳动物细胞是高毒的，但它的细胞毒性作用机制仍未知。喹诺酮引起的DNA损伤首次于1986年报道。

V. 抗体缀合物

本发明的抗体可以与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，它通常用于连接至少一个期望分子或部分或与其共价结合或与其形成复合体。此类分子或部分可以是但不限于至少一种效应物或报道分子。效应物分子包含具有期望活性例如细胞毒性活性的分子。已连接至抗体的效应物分子的非限定性实例包括毒素、抗生素、治疗性酶、放射性核素、抗癌剂、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子、和寡核苷酸或多核苷酸。

相反，报道分子定义为可以使用测定检测的任何部分。已与抗体缀合的报道分子的非限定性实例包括酶、放射标签、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和性分子、有色颗粒或配体，诸如生物素。

抗体缀合物通常优选用作诊断剂。抗体诊断剂通常落入两个类别，用于体外诊断剂的那些，诸如在多种免疫测定中，和用于体内诊断方案的那些，通常称为“抗体定向显影”。许多合适的显影剂是本领域已知的，以及用于它们连接抗体的方法是已知的(参见例如，美国专利5,021,236、4,938,948、和4,472,509)。所用的显影部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测的物质和X射线显影剂。

在顺磁离子的情况下，可以举例提及离子诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁（II）、钴（II）、镍（II）、铜（II）、钕（III）、钐（III）、镱（III）、钆（III）、钒（II）、铽（III）、镝（III）、钬（III）和/或铒（III），并且钆是尤其优选的。用于其他情况诸如X射线显影中的离子包括但不限于镧（III）、金（III）、铅（II），并且尤其是铋（III）。

在用于治疗性和/或诊断性应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝(technicium)^99m和/或钇⁹⁰。¹²⁵I通常优选用于某些实施方案中，并且锝(technicium)^99m和/或铟¹¹¹也通常优选，这是由于它们的低能量和长范围检测的适应性。本发明的放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域中熟知的方法来产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂诸如次氯酸钠或酶促氧化剂诸如乳酸过氧化物酶接触来碘化。本发明的单克隆抗体可以用锝^99m通过配体交换方法来标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，螯合还原的锝至Sephadex柱并应用抗体至该柱。或者，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂诸如SNCl₂、缓冲溶液诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。通常用于结合放射性同位素（其作为对抗体的金属离子存在）的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

在考虑用作缀合物的荧光标签中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。

本发明中考虑的抗体缀合物的另一类型是旨在主要用于体外的那些，其中将抗体与在与生色底物接触后将产生有色产物的二级结合配体和/或酶（酶标签）连接。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、（辣根）过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体为生物素和抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。此类标签的用途对于本领域技术人员是众所周知，并例如描述于美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中。

仍另一个已知的分子位点特异性连接至抗体的方法包括抗体与基于半抗原的亲和力标签的反应。基本上，基于半抗原的亲和力标签与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏该位点并阻断特异性的抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为它导致抗体缀合物的抗原结合丧失。

含有叠氮基的分子也可以用于经反应性氮烯中间体（其通过低强度紫外线产生）形成与蛋白的共价键(Potter和Haley, 1983)。尤其是，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮类似物已用作位点定向光探针来鉴定粗细胞提取物中的的核苷酸结合蛋白(Owens 和Haley, 1987;Atherton等, 1985)。2-和8-叠氮核苷酸也已用于定位纯化的蛋白的核苷酸结合结构域(Khatoon等, 1989; King等, 1989; Dholakia等, 1989)并可用作抗体结合剂。

本领域中已知用于将抗体连接或缀合至其缀合物部分的几种方法。一些连接方法涉及使用金属螯合络合物，利用例如有机螯合剂如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或连接至抗体的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3 (美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可以与酶在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐存在的情况反应。与荧光素标记物的缀合物在这些偶联剂存在情况下或通过与异硫氰酸盐/酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的显影使用单克隆抗体来实现，并且可检测的显影部分使用接头诸如甲基-对-羟基苯甲亚胺酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯连接至抗体。

在其他实施方案中，考虑使用不改变抗体结合位点的反应条件，通过在免疫球蛋白的Fc区选择性地引入巯基来衍生化免疫球蛋白。公开了根据该方法学产生的抗体缀合物以显示改进的寿命、特异性和灵敏度（美国专利5,196,066，通过引用并入本文）。效应物或报道物分子的位点特异性连接（其中报道物或效应物分子缀合至Fc区中的碳水化物残基）也已公开于文献中(O’Shannessy等, 1987)。已报道该方法以产生诊断上和治疗上有希望的抗体，其目前处于临床评价中。

VI. 免疫检测方法

在还进一步的实施方案中，本发明涉及用于结合、纯化、去除、定量或另外一般性检测肺炎链球菌的免疫检测方法。尽管此类方法可以以传统检测意义来应用，但更特异性的使用将涉及产生能够从大部分上文列出的血清型中区分中单个肺炎链球菌血清型的抗体组。通过鉴定导致感染的特定血清型，可以更好地评估治疗需求和类型。而且，保护性免疫主要归因于血清型特异性IgG。特异性肺炎球菌抗体的测量临床上用于两种情况：（1）来确定患者的保护性状态，和（2）来评估具有多次感染的患者中的B细胞功能性。使用以竞争性形式的本发明的抗体将也利于这种类型的测定。

一些免疫检测方法包括，且举几种，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和蛋白质印迹。尤其是，还提供检测并定量样品中的抗体的竞争性测定。多种可用的免疫检测方法的步骤已描述于科学文献中，诸如例如Doolittle和Ben-Zeev (1999)、Gulbis和Galand (1993)、De Jager等(1993)、和Nakamura等(1987)。通常，免疫结合方法包括获得怀疑含有肺炎链球菌的样品，并使样品与根据本发明的第一抗体接触，且情况可能是在有效使免疫复合体形成的条件下。

这些方法包括用于从样品中纯化肺炎链球菌及相关抗原的方法。抗体优选将连接至固体支持物上，诸如以柱基质的形式，并且怀疑含有肺炎链球菌或抗原组分的样品将应用于固定化的抗体上。不想要的组分将从柱上洗掉，留下与固定化的抗体形成免疫复合体的肺炎链球菌抗原，其随后通过从柱上去除生物或抗原来收集。

免疫结合方法还包括用于检测样品中的肺炎链球菌或相关组分或对其量定量的方法，以及结合过程中形成的任何免疫复合体的检测和定量的方法。在此，技术人员将获得怀疑含有肺炎链球菌或其抗原的样品，并将样品与结合肺炎链球菌或其组分的抗体接触，随后检测在特定条件下形成的免疫复合体并对其的量定量。在抗原检测方面，分析的生物样品可以是任何怀疑含有肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原的样品，诸如组织切片或标本、均质化的组织提取物、生物流体包括血液和血清、或分泌物诸如粪便或尿。

在有效条件下将所选的生物样品与抗体接触并持续足以允许免疫复合体（初级免疫复合体）形成的时间周期通常为简单地将抗体组合物添加至样品中并孵育混合物一段对于抗体足够长以与存在的肺炎链球菌或抗原形成免疫复合体（即结合至存在的肺炎链球菌或抗原）的时间周期的事件。在此时间后，样品-抗体组合物诸如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹将通常洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，允许仅那些在初级免疫复合体内特异性结合的抗体被检测。

通常，免疫复合体形成的检测是本领域中熟知的，并且可通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于检测标记或标记物，诸如任何那些放射性、荧光、生物和酶标签。涉及使用此类标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，可以通过使用第二结合配体诸如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列发现另外的优点，如本领域中已知的。

用于检测的抗体可以自身连接至可检测的标记，其中技术人员将随后简单检测该标记，由此允许组合物中的初级免疫复合体的量被测定。或者，在初级免疫复合体中结合的第一抗体可以通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测。在这些情况下，第二结合配体可以连接至可检测的标记。第二结合配体本身通常是抗体，其可以因此命名为“二级”抗体。在有效条件下将初级免疫复合体与标记的、二级结合配体或抗体结合，并持续足以允许二级免疫复合体形成的时间周期。二级免疫复合体随后通常洗涤以去除任何非特异性结合的标记的二级抗体或配体，并且随后检测二级免疫复合体中剩余的标记。

其他方法包括通过两步方法检测初级免疫复合体。第二结合配体诸如对抗体具有结合亲和力的抗体用于形成二级免疫复合体，如上所述。洗涤后，将二级免疫复合体与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体接触，再次在有效的条件下并持续足以允许免疫复合体（三级免疫复合体）形成的时间周期。第三配体或抗体连接至可检测标记，允许因此形成的三级免疫复合体的检测。如需要，该系统可以提供信号扩增。

免疫检测的一种方法使用两种不同的抗体。使用第一生物素化的抗体检测靶抗原，并且随后使用第二抗体来检测连接至形成复合体的生物素的生物素。在该方法中，待检测的样品首先在含有第一步抗体的溶液中孵育。如果靶抗原存在，一些抗体结合抗原以形成生物素化的抗体/抗原复合体。抗体/抗原复合体随后通过在链霉抗生物素蛋白（或抗生物素蛋白）、生物素化的DNA、和/或互补的生物素化的DNA的连续溶液中孵育来扩增，每一步骤向抗体/抗原复合体添加额外的生物素位点。重复扩增步骤直至实现合适水平的扩增，在那时将样品在含有针对生物素的第二步抗体的溶液中孵育。将该第二步抗体标记，如例如用酶，所述酶能够用于通过使用色素原底物的组织酶学来检测抗体/抗原复合体的存在。通过合适扩增，可以产生肉眼可见的缀合物。

免疫检测的另一个已知方法利用免疫-PCR（聚合酶链反应）方法学。直至与生物素化的DNA孵育，PCR方法都与Cantor方法类似，然而，代替使用多轮的链霉抗生物素蛋白和生物素化的DNA孵育，将DNA/生物素/链霉抗生物素蛋白/抗体复合体用释放抗体的低pH或高盐缓冲液来洗掉。所获的洗涤溶液随后用于用合适的引物与合适对照来进行PCR反应。至少理论上，PCR的巨大的扩展能力和特异性可以用于检测单个抗原分子。

A. ELISAs

免疫测定在它们最简单且直接的意义上是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解检测不限于此类技术，并且蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等也可以使用。

在一个示例性ELISA中，将本发明的抗体固定化至选择的展示蛋白亲和力的表面上，诸如聚苯乙烯微量滴定板的孔。然后，将怀疑含有肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原的检测组合物添加至孔中。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体后，可以检测结合的抗原。检测可以通过添加另一种连接至可检测标记的抗肺炎链球菌抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测可以这样实现：通过添加第二抗肺炎链球菌抗体，随后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，并且所述第三抗体连接至可检测的标记。

在另一个示例性的ELISA中，怀疑含有肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原的样品固定至孔表面，并随后与本发明的抗肺炎链球菌抗体接触。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体后，检测结合的抗肺炎链球菌抗体。在初始抗肺炎链球菌抗体连接至可检测标记的情况下，免疫复合体可以直接检测。再次，免疫复合体可以使用对第一抗肺炎链球菌抗体具有结合亲和力的第二抗体检测，并且第二抗体连接至可检测的标记。

无论所用的形式，ELISA具有某些共同的特征，诸如包被、孵育和结合、洗涤以去除非特异性结合的种类，并检测结合的免疫复合体。这些在下文描述。

在用抗原或抗体包被板中，通常将板的孔与抗原或抗体的溶液孵育，或者过夜或者持续若干小时的特定时期。板的孔随后将洗涤以去除不完全吸收的材料。孔的任何其余可用表面随后用对于测试抗血清是抗原上中性的非特异性蛋白“包被”。这些包括牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白或奶粉溶液。包被允许封闭固定化表面上的非特异性吸收位点，并因此降低了由抗血清非特异性结合至表面上造成的背景。

在ELISA中，可能更习惯使用二级或三级检测方法而非直接的程序。因此，在蛋白或抗体与孔结合，用非反应性材料包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的材料后，固定化表面与待测试的生物样品在有效地使免疫复合体（抗原/抗体）形成的条件下接触。免疫复合体的检测随后需要标记的二级结合配体或抗体、与标记的三级抗体或第三结合配体缀合的二级结合配体或抗体。

“在有效使免疫复合体（抗原/抗体）形成的条件下”意指条件优选包括用溶液诸如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)/Tween稀释抗原和/或抗体。这些添加的试剂还旨在帮助降低非特异性背景。

“合适的”条件还意指在一定温度下孵育或持续足以允许有效结合的时间周期。孵育步骤通常从约1至2至大约4小时，在优选25°C至27°C等级的温度下，或可以在约大约4°C下过夜。

在ELISA中的所有孵育步骤后，将接触的表面洗涤以去除未形成复合体的材料。优选的洗涤程序包括用溶液诸如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液洗涤。在检测材料和最初结合的材料之间形成特异性免疫复合体和随后的洗涤之后，甚至微量的免疫复合体的出现可以被测定到。

为了提供检测方法，第二或第三抗体将具有连接的标记以允许检测。优选地，这将是这样的酶，其在与合适的显色底物孵育后将产生显色。因此，例如，将期望将第一或第二免疫复合体与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育一段时间并在利于进一步的免疫复合体形成发生的条件下（例如，在室温下在含PBS的溶液中诸如PBS-Tween中孵育2小时）。

在与标记的抗体孵育并随后洗涤以去除未结合的材料后，对标记的量定量，例如，在过氧化酶作为酶标记的情况下通过与显色底物诸如尿素、或溴甲酚紫、或2,2'-叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、或H₂O₂孵育。随后通过测量产生的颜色的程度（例如使用可见光谱分光光度计）来实现定量。

在另一个实施方案中，本发明考虑使用竞争性形式。这对检测样品中的肺炎链球菌抗体尤其有用。在基于竞争的测定中，通过其替代已知量的标记的抗体或分析物的能力来测定分析物或抗体的未知量。因此，信号的可定量损失是样品中未知抗体或分析物的量的指征。

在此，本发明人提出使用标记的肺炎链球菌单克隆抗体来测定样品中肺炎链球菌抗体的量。基本形式将包括将已知量的肺炎链球菌单克隆抗体（连接至可检测的标记）与肺炎链球菌抗原或颗粒接触。肺炎链球菌抗原或生物优选连接至支持物。标记的单克隆抗体结合至支持物后，将样品添加并在允许样品中任何未标记的抗体与标记的单克隆抗体竞争并因此将其替代的条件下孵育。通过测量损失的标记或剩余的标记（并将其从原来的结合标记的量中扣除），可以确定有多少未标记的抗体结合到支持物上，并因此有多少抗体存在于样品中。

B. 蛋白质印迹

蛋白质印迹 (或者，蛋白质免疫印迹)是用于检测给定的组织匀浆或提取物的样品中特定蛋白的分析技术。它使用凝胶电泳通过多肽的长度（变性条件）或通过蛋白的3-D结构（天然/非变性条件）来分离天然的或变性的蛋白。然后将蛋白转移至膜(通称为硝酸纤维素或PVDF)，其中使用对靶蛋白特异性的抗体将它们探测（检测）。

可以从完整组织或从细胞培养物中获取样品。在大部分情况下，固体组织首先使用搅拌器 (对于更大的样品体积)、使用匀浆器(更小体积)、或通过超声来机械打碎。细胞也可以通过上述机械方法之一而破开(broken open)。然而，应注意细菌或环境样品可能是蛋白来源，因此蛋白质印迹不仅限于细胞学研究。分类的去污剂、盐和缓冲液可以用于促进细胞裂解并促进蛋白溶解。蛋白酶和硫酸酶抑制剂常常添加以防止样品被其自身的酶所消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白变性。

使用凝胶电泳将样品的蛋白分离。蛋白的分离可以通过等电点 (pI)、分子量、电荷、或这些因素的组合。分离的性质依赖于样品的处理和凝胶的性质。这是非常有用的测定蛋白的方法。还可以使用双向(2-D)凝胶，其以双向将蛋白从单一样品中分离出。在第一向中根据等电点（它们具有中性净电荷的pH）分离蛋白，并且在第二向中根据它们的分子量来分离蛋白。

为了使蛋白能够进行抗体检测，将它们从凝胶内转移至由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯 (PVDF)制成的膜上。将膜置于凝胶顶部，并将一叠滤纸置于其顶部。将整个层叠置于缓冲溶液中，其通过毛细作用将蛋白与其带着向纸上移动。另一种转移蛋白的方法称为电印迹并使用电流来将蛋白从凝胶中拉入PVDF或硝酸纤维素膜。蛋白从凝胶中移动到膜上，同时保留它们在凝胶中具有的组构(organization)。作为该印迹方法的结果，蛋白暴露于薄的表面层上用于检测（见下文）。由于它们非特异性蛋白结合特性（即，结合所有蛋白同样地好）选择两种膜。蛋白结合基于疏水性相互作用，以及膜和蛋白之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF更廉价，但更加易碎的多，并且对重复探测支持不好。从凝胶转移蛋白至膜的均一性和总体有效性可以通过用考马斯亮蓝或丽春红S染料染色膜来检查。一旦转移，使用标记的一级抗体或未标记的一级抗体随后为使用标记的蛋白A或结合至一级抗体的Fc区的二级标记的抗体直接检测来检测蛋白。

C. 免疫检测试剂盒

在仍进一步的实施方案中，本发明涉及用于上文描述的免疫检测方法的免疫检测试剂盒。由于肺炎链球菌抗体通常用于检测肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原，所有抗体将包含在试剂盒内。免疫检测试剂盒因此将在合适的容器装置中包含结合肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原的第一抗体和任选免疫检测试剂。

在某些实施方案中，抗体可以预结合至固体支持物上，诸如柱基质、浸渍片(dipstick)、膜、颗粒（例如珠或纳米颗粒）或微量滴定板的孔。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式的任一种，包括那些与给定抗体相关或连接的可检测的标记。也考虑与二级结合配体相关或连接的可检测标记。示例性的二级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些二级抗体。

用于本试剂盒中的进一步合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包括对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体，以及对二级抗体具有结合亲和力的第三抗体，第三抗体连接至可检测标记。如上所述，多种示例性标记是本领域中已知的，并且所有此类标记可以连同本发明一起使用。

试剂盒可以进一步包含肺炎链球菌或肺炎链球菌抗原的合适地等分试样的组合物，无论标记的或未标记的，可用于制备检测测定的标准曲线。试剂盒可以包含抗体-标记缀合物，或者以完全缀合的形式、以中间体的形式、或作为由试剂盒的使用者来缀合的单独的部分。试剂盒的组分可以以含水介质或以冷冻干燥形式包装。

试剂盒的容器装置将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，抗体可以置于其中，或者优选地，合适地等分入其中。本发明的试剂盒还将通常包括密闭(close confinement)含有抗体、抗原、和任何其他试剂容器的用于市售的装置。此类容器可以包括注塑或吹塑的(injection or blow-molded)塑料容器，其中含有需要的小瓶。

VII. 实施例

包括以下实施例来说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应理解随后实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明中运行良好的技术，并因此可以考虑构成其实施的优选的方式。然而，本领域技术人员在本公开的教导下，应该理解在公开的具体实施方案中可以进行许多改变，并仍获得类似的或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。

实施例1－材料和方法

免疫和供体。供体接受Pneumovax®23 (Merck, Whitehouse Station, NJ)作为基于其年龄和SLE状态的护理接种标准。健康供体Con1和Con2均为高加索人(Caucasian)，年龄分别为62和61。狼疮供体SLE1为非裔美国人，年龄47，SLE2为高加索人，年龄45。所有方案通过IRB批准并且患者同意参与该研究。接种后7天通过静脉穿刺采集血液(~40-60 ml)进入ACD管(BD, Franklin Lakes, NJ)中，并在处理前储存不超过18小时。

细胞分离和流式细胞术。外周血单核细胞（PBMC）使用淋巴细胞分离培养基(Cellgro, Manassas, VA)分离自新鲜血液，并悬浮于PBS中的2％灭活的胎牛血清中。随后将细胞计数并在分离的2小时内染色。用于染色的抗体为缀合至FITC的抗CD3和抗CD20、缀合至APC-Cy5.5的抗CD38、缀合至PE的抗CD27、缀合至PE-Alexa610的抗CD19 (均来自Invitrogen/Caltag, Carlsbad, CA)、缀合至APC的抗IgG (BD Biosciences, San JoseCA)、和缀合至生物素(Southern Biotech, Birmingham, AL)随后为链霉抗生物素蛋白-PE-Cy7 (Invitrogen/Caltag)的抗IgM 。使用Becton-Dickinson FACS Aria 细胞计数器(BD Biosciences, San Jose, CA)将B细胞大量分选(CD3/CD20^阴性、CD19^低、CD38^高、CD27^非常高、IgG^阳性)，并随后用Cytomation MoFlo细胞计数器(Dako, Carpinteria, CA)将单个细胞分选入96孔PCR板中。

单细胞RT-PCR和抗体可变区基因的PCR。如之前研究中详述(Smith等, 2009;Wrammert等, 2008)，接受如上分选的单细胞的板在每孔中含有10微升的低渗缓冲液，其由含有40 U/μl的RNase抑制剂(Promega, Madison, WI)的10 mM Tris-HCl组成。分选后，将板立即在干冰上冷冻并储存在-80℃。One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)用于扩增V_H和V_K信息，使用对基因家族中每一个的前导序列区的正向引物和对重链和κ链的恒定区的反向引物的混合物。随后将一微升的RT-PCR混合物在单独的重链和κ链PCR反应中扩增以首次获得序列，并且另一微升用于最后的PCR反应来并入限制性位点用于进一步克隆。随后将可变区克隆入表达载体（含有全长IgG₁重链或κ链恒定区），大量制备(Roche,Indianapolis IN)，并使用聚乙烯亚胺(PEI) (Polysciences, Warrington, PA)共转染入HEK293A细胞系。允许转染后的细胞分泌抗体进入添加有1％ Nutridoma (Roche,Indianapolis, IN)的无血清的DMEM中持续5天。随后使用蛋白A-琼脂糖珠(Pierce,Rockford, IL)纯化抗体。通过SDS-PAGE验证抗体纯度和完整性，并用Nanodrop分光光度计(Fisher, Pittsburg, PA)获得浓度。

多糖亲和力和抗体亲抗原性ELISA。为了筛选结合，首先通过用五或六种肺炎链球菌多糖的混合物(cocktails)包被板来进行ELISA，以这种方式筛选所有23种(ATCC,Manassas, VA)。在该混合物测定中的阳性结合物然后对每种单独的多糖再次筛选。因为细胞壁多糖(CWPS)为几乎所有的包被多糖中的混杂物(impurity)(Xu等, 2005)，结合所有四组的抗体对纯化的细胞壁多糖(CWPS) (Miravista Labs, Indianapolis, IN)进一步检测来确定CWPS结合。用10 μg的每种多糖（或总混合的多糖）包被孔，用20％ FCS封闭，并用抗人IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)和Super Aqua Blue底物(EBiosciences, San Diego CA)显色。在405 nm在微量培养板读数器(MolecularDevices, Sunnyvale, CA)上测量吸光度。通过以10 μg/ml开始的抗体的16个两倍稀释的稀释系列中作图的单独ELISA曲线的曲线拟合分析计算抗体亲和力(Kd)。对于抗体亲抗原性ELISA，使用一种浓度的抗体(1 μg/ml)，并且在添加缀合物之前加入洗脱步骤。该洗脱步骤使用PBS中不同浓度(3M至0.06M，总计8个稀释)的硫氰酸铵以及单独的PBS。对每一稀释的硫氰酸铵计算保留的结合百分比。将这些值相对于硫氰酸盐浓度作图，并且通过将数据与具有hillslope校正的剂量响应/S形曲线拟合来计算引起50％的结合保留（或损失）的硫氰酸盐浓度。

自身抗原ELISA。所有抗体也检测对五种自身抗原Ro、La、Sm、nRNP和心磷脂的结合。对于每一种，除了心磷脂，在高结合板上每孔包被1单位的抗原(ImmunoVision,Springdale, AR)。用PBS中的0.1% BSA封闭板，以1 μg/ml加入抗体，并如同上述多糖ELISA显色。对于抗心磷脂ELISA，以～5 mg/ml的心磷脂溶液(Sigma, St. Louis, MO)在乙醇中1:1000稀释，并且允许50 μl/孔在培养基结合板中蒸发。用PBS中的0.5%成年牛血清封闭板，以10 μg/ml筛选抗体，并如上显色。

序列分析和曲线拟合。所有曲线拟合使用GraphPad Prism软件进行，并且背景扣除，或使用Excel计算并平均百分比保留值。使用International ImmunogeneticsInformation System (IMGT, Montpellier, France)、以及内部软件和/或Vector NTI(Invitrogen, Carlsbad, CA)分析可变区序列。克隆相关抗体定义为分别在重链和轻链中具有相同VDJ/VJ使用以及高相关的V_HD_H、D_HJ_H和V_KJ_K连接的那些。通过（使用IMGT）分析序列的每一抗体序列中来自种系的大量核苷酸改变获得平均核苷酸体细胞高度突变值。随后将得到的每抗体值(per-antibody values)平均以获得每个供体的平均突变比例。这些分析的n值包括：来自六个供体的稚细胞(n = 18、42、21、34、15、36); 来自17个供体的IgM生发中心/记忆细胞(n = 56、158、18、91、17、10、16、30、19、28、11、36、29、13、22、20、64); 来自13个供体的IgG生发中心/记忆细胞(n = 110、37、19、28、174、40、25、15、21、18、22、24、19、71); 来自11个抗体的抗流感ASC (n = 63、18、33、46、49、11、36、11、30、35、25)。这些供体之前描述于(Wrammert等, 2008)。抗多糖ASC序列来自该研究中的四个供体(Con1, 39;Con2, 49; SLE1, 24; SLE2, 25)。

实施例2－结果

Pneumovax®23诱导强ASC应答，相比于SLE患者，其在健康对照中更为强烈。用Pneumovax®23免疫四个个体。接种后7天取血并且通过Ficoll梯度分离PBMC。随后将细胞染色并且数CD38^高/CD27^非常高细胞。本发明人的流感接种后使用这些技术的之前结果(Wrammert等, 2008)显示在第7天ASC爆发的范围为总外周血B细胞的1％-16%（平均6.4%）。Pneumovax®23诱导甚至更强烈的ASC应答（图1A），其中两名健康供体具有代表其全部外周血B细胞的22.8%-24.7%的ASC，尤其是当这是对每一供体的初次接种时。尽管两位SLE供体具有半数的健康供体的ASC，但总体百分比(10.6%和7.1%)仍相当高。该强烈的回忆应答可能是由于肺炎链球菌是引起一般人群中临床和亚临床疾病的普遍生物这一事实。图1B显示从抗体分泌细胞制备人单克隆抗体的方法的图示。该技术之前已详细描述(Smith等,2009; Wrammert等, 2008)。总体上，包括未结合抗体，产生并表征了137种抗体(Con1, n =39; Con2, n = 49; SLE1, n = 24; SLE2, n = 25)。

从ASC产生的绝大部分多糖抗体结合单一血清型。多糖ELISA曲线显示于图2A中，其中每一曲线代表一种抗体。使用1.5的OD₄₀₅截止值作为高至中等亲和力抗体与低至无结合抗体之间的任意分离。使用该截止值计算百分比作为方法来确定哪种抗体具有显著结合。从四种供体平均，76％的抗体(Con1, 62%; Con2, 90%; SLE1 75%; SLE2, 75%)结合肺炎链球菌血清型多糖或来自疫苗的细胞壁多糖。在产生的hmAbs中，SLE供体显示分离的高亲和力抗体数目中无明显差别。具有阳性结合的所有抗体列表显示于表1中，其详述了结合的血清型、表征的总克隆同胞(clonal sibling)的数目、以及V_H和V_K使用。在结合多糖的抗体中（所有中的76％），平均88％的从四个供体表征的抗体是血清型特异性的(图2B)(Con1, 88%; Con2, 90%; SLE1 94%; SLE2, 80%)。血清中目前88％的抗体以甚至在非常相近的相关结构中特异性的方式结合碳水化合物表位的观察结果补充了抗体所有成员(antibody repertoire)的众所周知的特异性。

还检测抗体对五种常见狼疮自身抗原的结合：Ro、La、Sm、nRNP和心磷脂。将结合这五种抗原中的至少两种的抗体归类为多反应性的（无论它们是否结合多糖）。图2C显示来自每一供体的多反应性抗体的百分比。SLE2显示显著的52％的抗体显示多反应性。与图2A中的那些相似但突出了来自每一供体的交叉反应性的或多反应性的抗体的图显示于图7A-B中。

从ASC产生的少但显著百分比的抗多糖抗体结合两种不同血清型的多糖。尽管大部分抗体是血清型特异性的，但12％表征的抗体结合两种血清型。在结合两种血清型的抗体中，一对多糖9N和9V由几种抗体双重结合。这两种碳水化合物具有非常相似的无支化的结构，其中在9N链重复中的四个D-Glc之一由9V中的D-Gal所替代。因此，一些抗体会与两种血清型交叉反应并不意外。然而，本发明人观察了许多种9N和9V结合抗体，其中的一些交叉反应，并且一些不会交叉反应。例如，Con1p2D02和SLE1p1E01抗体分别对9N和9V是单特异性的（图3A），显示出很少或无交叉反应性。然而，Con1p4B03结合两种血清型，以在亲和力中的一个数量级和在抗体亲抗原性中的5倍而更倾向于9N（图3B）。一个结合9N的抗体SLE1p1A03不结合9V，但以相似的亲和力和抗体亲抗原性与血清型14多糖交叉反应（图3C），其是仅检查碳水化合物序列难于解释的观察结果。这些交叉反应的抗体的几种来自相同供体，表明在单一个体中针对某一种血清型的多种抗体。血清型19A和19F具有非常相似的结构，其中19F具有含1-2键的D-Glc，和19A具有1-3键。抗体SLE2p2D03以几乎相等的亲和力结合19A和19F两者（图3D），尽管有四倍不同的抗体亲抗原性（倾向于19A）。

本发明人还检测了血清型15B和14之间的交叉反应性（图4C），以及17F和33F之间的（图4A和4B）。抗体SLE2p1B01在抗体亲抗原性上相对于血清型15B稍微倾向于血清型14，尽管在亲和力上不是这样。尽管SLE2p2G06和SLE2p2C04分别对于17F和33F是单特异性的（图4A），但SLE2p1C03（来自相同供体；图4B）以相似的抗体亲抗原性与两种血清型交叉反应。总体上，明显的是尽管血清可以在两种血清型之间交叉反应，但构成这种应答的85％的实际抗体仅对一种多糖是特异性的。本发明人没有遇到以可检测的亲和力/抗体亲抗原性与超过两种血清型反应的抗体。

这些抗体中的体细胞高度突变的高频率表明频繁的记忆性抗多糖应答。如前所报道，ASC对流感疫苗的回忆应答高度突变，甚至超过在一般IgG生发中心记忆细胞中的。本发明人假设这是由于一年一次的疫苗的重复性质，以及对多种流感毒株的频繁暴露。该研究获得的抗体具有相似的突变频率（见图5)。这尤其有趣，因为对于每一供体，这是初次接种。如果供体对于这些多糖抗原是真正地未接种的(naïve)，则ASC应答将会更小且抗体序列将显示更少突变。因此，该疫苗产生记忆性应答，其只可能产生自之前的感染或暴露于肺炎链球菌菌株。

每一供体展示抗体血清型特异性的唯一的记忆指纹。四个供体的每一个显示显著不同的抗体应答，如针对每一血清型或细胞壁多糖产生的抗体的数目所证明（图6A，无结合的抗体未显示；在具有最强的亲和力的血清型的组(bin)中对交叉反应的抗体计数）。对某些血清型的应答似乎在每一供体中占优势。供体Con1显示对血清型8的强应答（总计6种抗体，其中三种为克隆的(clonal)），Con2显示对血清型18C的强应答（9种抗体，均为克隆的），SLE1和SLE2均显示对血清型5的强应答（分别为6种抗体，其中2种为克隆的，和6种抗体，其中4种为克隆的）。本发明人假设这是由于在供体生命中的一些点上由该血清型的感染（临床上明显的或不明显的）。

本发明人对流感接种的免疫应答的前期研究(Wrammert等, 2008)突出显示了对该疫苗的ASC应答的强克隆形成能力，并且这也是用Pneumovax®23免疫后的情况。因此，本发明人表征的抗体中的几种是克隆上相关的，但显示非常相似的结合特征（参见表1以比较亲和力）。当在单一直方图展示所有四个供体并减少克隆上相关的抗体至计数为1时（图6B），非常明显的是从每一供体分离的hmAbs产生了唯一的指纹，其中三个供体结合9V、15B、17F，并且仅血清型8和33F由所有四个供体结合。而且，研究中无受试者产生结合血清型7F、10A或12F的抗体。尽管难以数学上显示来自每一供体的直方图是唯一的，但本发明人确信产生来自Con2的44种抗体产生了血清型的代表性分布，对此该个体具有记忆性应答并且其在供体与供体间不同。

实施例3－讨论

这是对Pneumovax®23免疫的人免疫应答的第一次广泛的分析，在每种抗体基础上，利用抗体分泌细胞（ASC），其在接种后7天出现作为产生单克隆抗体的来源。这些多糖特异性单克隆抗体的分析允许对针对该疫苗的人抗体所有组成成分的详细研究。它还提供了对每一抗体的特异性的洞察，并且令人惊奇地揭示“记忆性指纹”，本发明人将其解释为反映了每一参与者的前期感染史。

在更早期的研究中(Wrammert等, 2008)，本发明人发现流感接种后的记忆性应答的强度使得平均6％的全体B细胞为ASC，然而一些供体对不存在的应答表现差。使用这些相同的技术，一些疫苗(特别是Anthrax AVA)通常产生非常差的保护性应答的诱导(Crowe等,2010)。在此，本发明人报道Pneumovax®23引起比在一些流感供体中诱导的最强应答强2-4倍的应答，暗示这些多糖在引发记忆应答是格外有效的。更早期研究（2-4）也检测了用多糖和缀合疫苗两者接种后7天的抗体分泌细胞，平均每一百万个PBMC超过100个血清型特异性细胞。本发明人自己的ELISpot结果与这些前期报道相似（数据未显示），但如通过流式细胞术测定的IgG ASC应答的总体强度仍是令人惊奇的。有趣的是，SLE供体之一SLE2也参与之前的流感研究，并且没有产生对流感疫苗的应答，仍产生对多糖疫苗的令人印象深刻的ASC应答。尽管样品数少，但这提供了对疫苗的有效免疫应答（尤其是在无免疫应答的个体中）中的大量差异之间的直接比较。

在该研究中在SLE供体和健康对照之间存在少数有趣的差异。如上所讨论，从接种产生的ASC的百分比在SLE1和SLE2中显著地更少（平均8.8%，当与Con1和Con2的23.8％比较时）。尽管从这些供体产生的高亲和力抗体的百分比不同，但从SLE2产生的抗体的确似乎对非碳水化合物抗原是完全多反应性的。还重要的是注意来自SLE2的四种交叉反应性抗体中的三种也是多反应性的（参见图7A-B）。值得注意的是尽管它们结合多种自身抗原，但它们仍然对仅一或两种多糖结构是特异性的。这些结果可能表明该供体（其允许交叉反应性和多反应性B细胞）中B细胞耐受性的缺乏，这将另外被删除或无应答，以成熟并分泌抗体。尽管不知晓多反应性抗体的这种方式是否具有生理作用，但可能该个体中的任何接种将导致此类多反应性抗体。

该研究已极大地增加了对肺炎链球菌的报道的人单克隆抗体的数目，所述抗体已在结合和所有组成成分使用方面被表征。这些抗多糖抗体与产生自重复的季节性流感接种的抗体一样高突变。在比较这些抗体中的V基因使用与之前报道时，本发明人观察到相似的趋势。例如，Baxendale (Baxendale和Goldblatt, 2006; Baxendale等, 2000)暗示VH3-48可能促成偏好来自血清型23F和18C的表位的抗原结合结构域，由于他们表征的两个VH3-48家族抗体结合这两种血清型并且Zhou在23F研究中发现VH3-48 (Zhou等, 2002)，但在6B的研究中未发现(Zhou等, 2004)。类似地，该研究中表征的四种VH3-48抗体中的三种（表1）也结合这两种血清型。本发明人也已表征了结合血清型2的VH3-48 (Con2p5E05)，其是结合不同血清型的VH3-48的例子。他们还观察到表征的结合细胞壁多糖（CWPS）的抗体中的显著的相似性。比较这两种独特供体，这些抗体使用VH3-30或密切相关的VH3-33。CDR3甚至显示出显著的相似性，

。因此，重复的多糖序列的化学相似性似乎诱导甚至在不同的个体中的相似的V基因家族使用。

尽管抗体亲抗原性已显示为与保护重要相关(Anttila等, 1999; Harris等,2007; Usinger和Lucas, 1999)，但硫氰酸盐ELISA通常不在单克隆抗体上进行。本发明人在此利用它是因为在通过拟合简单ELISA曲线确定亲和力中存在若干复杂因素(complications)。这些包括小的抗体浓度错误对亲和力的放大作用，抗原结合相互作用是否是单价的或二价的不确定性，以及用大单位的重复表位包被板。还可能的是来自SLE供体（和偶尔健康对照）的多反应性抗体可以与结合位点外部的抗原相互作用。所有这些作用在硫氰酸盐抗体亲抗原性ELISA系统中最小化。图3D和4C均代表这样的抗体，对其亲和力和抗体亲抗原性ELISA结合测量不一致。这两种抗体均来自SLE2，并且两种抗体都是多反应性的。本发明人目前更详尽地研究有趣的抗体诸如这些，但在这些情况下，硫氰酸盐抗体亲抗原性是抗体-碳水化合物相互作用的更可靠的测量。

血清交叉反应性通常通过用特定的血清型碳水化合物排除血清并随后观察仍存在于血清中的血清型的结合来测定。Soininen等（2000）例如发现血清中（尤其是未接种的个体中）显著的交叉反应性。然而，这些测定需要仔细校正，以及CWPS和其他多糖的预吸附(pre-adsorption)以去除非特异性的反应性（尤其在未接种的个体中是普遍的）(Marchese等, 2006)。对该方法的现代升级使用微阵列打印和读取技术学(Pickering等, 2007)，例如，已极大改进了这些测定的可靠性；但直至本研究，技术人员不能确定观察到的交叉反应性是否由于实际交叉反应的各个抗体、或是血清抗体的多克隆性质。

本研究针对单克隆抗体中的交叉反应性，已解决了此类不确定性。Park等（2009）描述了交叉血清型单克隆抗体，推断抗体结合的共同直链碳水化合物结构。其他报道(Baxendale等, 2006; Baxendale等, 2000; Zhou等, 2004)没有详细说明交叉反应性抗体，尽管从Fab文库中产生的那些抗体仅用目标血清型淘选(panned)。然而，这些实验首次表征了大量的抗肺炎球菌人单克隆抗体，并且尽管大部分抗体是血清型特异性的，但15％不是。与上面的报道不同，解释本发明人表征的单克隆抗体中的几种的交叉反应性明显没有发现类似多糖结构那么简单。尽管9N/9V和19A/19F非常相似，但17F和33F、以及14和15B不具有相似的一级结构。Pickering等（2007）发现9V能够抑制9N结合，15B抑制14结合，19F强烈抑制19A结合，并且33F强烈抑制17F结合，所有均符合观察到的结果（图3A-D和4A-C）。有趣的是，反过来则通常不是这样（14不抑制15B，并且17F不抑制33F），但这可能是亲和力问题。使用这些结果来说明这一点，可能Con1p4B03结合9N能够通过添加9V多糖来抑制，因为其对9N的亲和力高超过一个数量级。总体上，本发明人可以自信地说在这些研究中观察到的血清交叉反应性的确是由于结合至少两种不同血清型的各个单克隆抗体。

供体的每一个对血清型的每一种产生一组独特的抗体这一观察结果非常有趣。这种现象的一种解释是看到了“记忆指纹”，或者观察到的记忆应答是每一位受试者过去已对其暴露的血清型的产物。难于接近某人已暴露于23种菌株中的多少种直至当他们接受Pneumovax®23疫苗的时候。由Pickering等 (2007)仔细检查其血清的四个供体具有对22种血清型（样品无CWPS和22F）的5-12种的可估计的IgG浓度(高于1 μg/ml)，说明有活性的血浆细胞和随后对那些血清型的前期暴露。本文的供体显示对恰好相对于11（13、13、9和10）血清型的平均的抗体，匹配该之前研究中的血清学。因此，技术人员观察到接种后7天来自记忆细胞的再活化的抗体与在血清中观察到的那些（可能来自长寿命的血浆细胞）相似。

尽管这些人单克隆抗体的产生阐释了基础记忆应答，但它还可以用于治疗目的。因为许多目前治疗由于抗生素抗性可能变得无效，但重要的是考虑可以安全靶向病原体的被动免疫治疗。几个前期报道(Casal等, 2002; Yuste等, 2002)已研究了在小鼠脓毒症模型中的特异性抗体的作用。显著地，在感染后施用超免疫血清能够将小鼠恢复所需的抗生素的量降低八倍。此外，该协同作用可以有效地用于治疗困难的或侵入性感染，诸如积脓以及无免疫应答个体中的菌血症。除了无数的完全人单克隆抗体的治疗选项外，过敏性休克和抗治疗性免疫应答的显著降低的风险暗示它们将在传染病中变得与它们目前在自身免疫环境中同等重要。

在本公开内容的教导下，本文公开并要求保护的所有组合物和方法可以被制备或实行，而不需要过度的实验。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案的形式进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是可以对组合物和方法以及在本文描述的方法的步骤中或步骤的顺序中产生变化而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，可以用化学上和生理上相关的某些试剂来替代本文描述的试剂，同时会实现相同或相似的结果，这也将是显而易见的。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修改处于由所附的权利要求所确定的发明的精神、范围和概念之内。

VIII. 参考文献

以下参考文献在它们提供了补充本文描述内容的的示例性程序或其他细节的程度上通过引用明确地并入本文。

Claims (55)

1.包含多种抗体的人单克隆抗体组，其中所述抗体组结合至少15种肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的血清型，其中，所述多种抗体中的每一个抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自表2中所述的重链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列，所述轻链可变区选自表2中所述的轻链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述多种抗体来源于产生自人类主体的抗体序列，其中所述人类主体接种过或之前暴露过肺炎链球菌。

2.权利要求1的抗体组，其中所述抗体组中的抗体结合至少18种肺炎链球菌血清型。

3.权利要求2的抗体组，其中所述抗体组中的抗体结合21种肺炎链球菌血清型。

4.权利要求3的抗体组，其中至少15种抗体是血清型特异性的。

5.权利要求4的抗体组，其中至少17种抗体是血清型特异性的。

6.权利要求5的抗体组，其中19种抗体是血清型特异性的。

7.权利要求1的抗体组，其中所述抗体组连接至支持物。

8.权利要求7的抗体组，其中所述支持物是珠、浸渍片、滤器、膜、板、或芯片。

9.权利要求1的抗体组，其中所述血清型选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和CWPS。

10.权利要求1的抗体组，其中至少一种抗体与两种血清型反应。

11.包含多种抗体的人单克隆抗体组在制备用于区别主体中肺炎链球菌血清型的试剂中的用途，其包括从所述主体中获得第一样品，如果所述第一样品中存在肺炎链球菌，评估所述人单克隆抗体组与所述第一样品中的肺炎链球菌的结合，其中所述抗体组结合至少15种肺炎链球菌的血清型，其中，所述多种抗体中的每一个抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自表2中所述的重链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列，所述轻链可变区选自表2中所述的轻链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述多种抗体来源于产生自人类主体的抗体序列，其中所述人类主体接种过或之前暴露过肺炎链球菌。

12.权利要求11的用途，其中所述抗体组中的抗体结合至少18种肺炎链球菌血清型。

13.权利要求12的用途，其中所述抗体组中的抗体结合21种肺炎链球菌血清型。

14.权利要求13的用途，其中至少15种抗体是血清型特异性的。

15.权利要求14的用途，其中至少17种抗体是血清型特异性的。

16.权利要求15的用途，其中19种抗体是血清型特异性的。

17.权利要求11的用途，其中所述抗体组连接至支持物。

18.权利要求17的用途，其中所述支持物是珠、浸渍片、滤器、膜、板、或芯片。

19.权利要求11的用途，其中所述血清型选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和CWPS。

20.权利要求11的用途，其中至少一种抗体与两种血清型反应。

21.权利要求11的用途，其中所述主体是无免疫应答的和/或60岁龄或更老。

22.权利要求11的用途，其中所述主体怀疑具有肺炎链球菌。

23.权利要求11的用途，其进一步包括如果发现所述第一样品对一种或多种血清型是阳性的，则用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。

24.权利要求11的用途，其进一步包括如果发现所述第一样品对血清型19A和/或19F是阳性的，则用万古霉素或左氧氟沙星治疗所述主体。

25.权利要求11的用途，其中所述第一样品是血液、血清、血浆、痰或唾液。

26.权利要求11的用途，其进一步包括从所述主体中获得第二样品，并评估所述第二样品从而判断在所述第一样品中确定呈阳性的肺炎链球菌的血清型的抗体效价是否降低。

27.权利要求26的用途，其中所述第二样品是血液、血清、血浆、痰或唾液。

28.权利要求26的用途，其中在确定所述第一样品对于一种或多种血清型是阳性后用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价的降低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是有效的。

29.权利要求26的用途，其中在确定所述第一样品对于一种或多种血清型是阳性后用抗生素治疗所述主体，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价中不存在降低表明所述抗生素对治疗肺炎链球菌是无效的。

30.权利要求29的用途，其进一步包括用不同的抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。

31.抗体，其选择性结合肺炎链球菌，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自表2中所述的重链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列，所述轻链可变区选自表2中所述的轻链可变区核酸序列所编码的氨基酸序列。

32.权利要求31的抗体，其中所述抗体为单链抗体。

33.权利要求31的抗体，其中所述抗体为单结构域抗体。

34.权利要求31的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。

35.权利要求31的抗体，其中所述抗体为Fab片段。

36.权利要求31的抗体，其中所述抗体为IgG。

37.权利要求31的抗体，其中所述抗体进一步包含与其连接的抗生素。

38.权利要求37的抗体，其中所述抗生素经光不稳定的接头连接至所述抗体。

39.权利要求37的抗体，其中所述抗生素经酶促切割的接头连接至所述抗体。

40.权利要求31的抗体，其中所述抗体缀合至纳米颗粒或脂质体。

41.权利要求31的抗体在制备用于治疗主体中的肺炎链球菌感染的药物中的用途。

42.权利要求41的用途，其进一步包括向所述主体施用第二抗肺炎链球菌治疗。

43.权利要求42的用途，其中所述第二抗肺炎链球菌治疗与所述抗体同时给予。

44.权利要求42的用途，其中所述第二抗肺炎链球菌治疗在所述抗体之前和/或之后给予。

45.权利要求41的用途，其中所述抗体为单链抗体。

46.权利要求41的用途，其中所述抗体为单结构域抗体。

47.权利要求41的用途，其中所述抗体为嵌合抗体。

48.权利要求41的用途，其中所述抗体为Fab片段。

49.权利要求41的用途，其中所述抗体为IgG。

50.权利要求41的用途，其中所述抗体进一步包含与其连接的抗生素。

51.权利要求41的用途，其中抗生素经光不稳定的接头连接至所述抗体。

52.权利要求41的用途，其中抗生素经酶促切割的接头连接至所述抗体。

53.权利要求41的用途，其中所述抗体缀合至脂质体或纳米颗粒。

54.权利要求41的用途，施用多抗肺炎链球菌抗体。

55.权利要求54的用途，其中所述多抗肺炎链球菌抗体结合2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种肺炎链球菌血清型。