CN102712680B - 修饰的肺炎链球菌溶血素(ply)多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及修饰的肺炎球菌溶血素(PLY)蛋白，其缺少溶血活性并可在抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌疾病的免疫原性组合物或疫苗中用作免疫原。所述修饰的肺炎球菌溶血素蛋白在苏氨酸65、甘氨酸293和半胱氨酸428处包含氨基酸替代。还提供核酸、由其编码的多肽、包含它们的组合物、使用所述核酸、多肽和组合物的方法。

Description

修饰的肺炎链球菌溶血素(PLY)多肽
技术领域
本公开内容涉及包含修饰的的肺炎链球菌溶血素(PLY)多肽的免疫原性组合物。还提供核酸、由其编码的多肽、包含它们的组合物、使用所述核酸、多肽和组合物的方法。
背景
肺炎链球菌是重要的病原体，引起侵袭性疾病如肺炎、脑膜炎和菌血症。即使在可免费获得有效的抗生素疗法的地区，肺炎链球菌肺炎导致的死亡率可高达住院患者的19％。在发展中国家，每年3百万以上不到5岁的儿童死于肺炎，其中肺炎链球菌是最常见的确定病原体。肺炎链球菌还导致没那么严重但非常普遍的感染如中耳炎和鼻窦炎，在发达国家，其对健康护理成本有巨大影响。中耳炎对幼童尤其重要，而鼻窦炎影响儿童和成人。
目前，已批准的抗肺炎球菌疫苗以衍生自非常普遍的菌株的各种荚膜多糖抗原的制剂为基础。在世界上各个地区，最通常引起侵袭性肺炎球菌感染的血清型似乎稍有不同。在前免疫时代的北美，血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F是引起年龄≤5岁的儿童内的侵袭性疾病的7种最常见的血清型(Butler等人.J.Infect.Dis.171(4)：855-889(1995))。已有报道这些血清型是造成这些儿童内的70-88％侵袭性疾病的原因并占具有高水平青霉素耐药性的肺炎链球菌的100％。
两类肺炎球菌疫苗正处于临床使用：23价肺炎球菌多糖疫苗(23-PPV)和7价肺炎球菌缀合疫苗(PCV7)(Siber等人.PneumococcalVaccines：TheImpactofConjugateVaccine.WashingtonDC：ASMPress；2008)。23-PPV中的多糖抗原诱发T细胞非依赖性免疫应答，导致免疫性记忆差。此外，尽管23-PPV在成人和老人体内给予抵抗侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的60-80％保护，5年后免疫基本上衰退且在年龄≤2岁的儿童中它是低免疫原性的。在用PCV7(Prevnar，WyethPharmaceuticals，Inc.)接种的幼童中观察到具有免疫性记忆的强T细胞应答。最近，在疫苗与相关生物产品方面，美国食品与药品管理顾问委员会推荐批准Prevnar13(PCV13，其包含PCV7的血清型和血清型1、3、5、6A、7F和19A)。还正在对包含缀合到载体蛋白的10种肺炎球菌血清型(1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)的多糖的十价疫苗(Synflorix，GSK)进行研究。
尽管其巨大成功和重大公共健康影响，抗肺炎球菌缀合疫苗也有一些众所周知的缺点，包括缀合疫苗生产的复杂性，这提高了制造成本。然而，更重要的是：发现基于多糖的缀合疫苗仅保护抵抗表达该疫苗代表的特定荚膜型的细菌引起的感染。这是在例如拉丁美洲、亚洲和非洲等地区的问题，其中PCV7代表的血清型是使得侵袭性疾病比世界上其它地方少许多的原因(Black等人，In：PlotkinSA等人编辑，Vaccines，第5版.WBSaunders.第23章(2008)；Garcia等人，Rev.Panam.Salud.Publica.19(5)：340-8(2006)；Lagos，R.Pediatr.Infect.Dis.J.21(12)：1115-23(2002))。这种需求可通过目前正在开发和/或审批阶段的新一代缀合疫苗：10价和13价PCV疫苗(PCV-10和PCV-13)来满足。
本领域技术人员理解地区性问题(例如，有限的血清型覆盖范围、用非疫苗血清型、荚膜转变、载体诱导抑制替代疾病的可能性及制造和供应限制)是在对全世界人口进行接种中出现的重要问题。已知肺炎球菌是抗原和克隆多样性的(Hanage等人，Infect.Immun.73(1)：431-5(2005))，其中单一肺炎球菌血清型通常包含许多基因分歧克隆体。已知肺炎链球菌蛋白在血清型之间是相当保守的且因此被考虑作为潜在疫苗。
已报道肺炎球菌溶血素为胞内蛋白，其在肺炎球菌裂解后被释放时在体内引起多种毒性作用。在临床分离物中，该蛋白在氨基酸序列和抗原性方面都是高度保守的，因此，满足其用作疫苗抗原的一些基本标准(Paton等人.Infect.Immun.40(2)548-52(1983)；Lock等人.Microb.Pathog.5(6)：461-67(1988))。然而，它具有固有的溶血特性，因此已开发突变体并研究它们作为疫苗的可能性。从历史角度来看，最通常研究的肺炎球菌溶血素突变体为PdB，其包含单一氨基酸变化Trp433Phe(Paton等人，Infect.Immun.59(7)：2297-304(1991)；Lu等人，Infect.Immun.77(5)：2076-83(2009)；Ogunniyi等人，Infect.Immun.75(1)：350-7(2007)；Berry等人，Infect.Immun.63(5)：1969-74(1995)；Berry等人，Infect.Immun.67(2)：981-85(1999))。
最近已经描述了其它PLY突变体，包括氨基酸146缺失的ΔAla146和ΔAla146R147(Kirkham等人，Infect.Immun.74(1)：586-93(2006))。ΔAla146和ΔAla146R147都表现出缺少抵抗人红细胞的溶血活性。含铝佐剂的ΔAla146也表现出与含铝佐剂的野生型PLY相同的保护性。
尽管所用的小鼠品系中存在不同，所用的肺炎链球菌血清型和免疫路径、从采用败血症模型的研究得到的结果的汇编已经表明：与空白对照组相比，PdB或ΔAla146延长了小鼠的存活。在肺炎模型中，与空白对照相比，用PdB对小鼠免疫导致感染小鼠的肺中肺炎球菌的数量显著下降(Briles等人，J.Infect.Dis.188(3)：339-48(2003))。此外，在大多数这些发现中，当与其它毒力因子如PspA、PspC或PsaA组合使用时，发现PdB提供抵抗许多种菌株的优越保护(Lu，同上；Ogunniyi，同上；Berry(1995)，同上)。尽管PdB突变体在一些模型中提供了显著的保护，它存在具有残余溶血活性的缺点。然而，如上所述，ΔAla146提供保护性免疫并缺少溶血活性。
尽管已经开发了几种突变PLY疫苗，本领域中存在对保护性和缺少溶血活性的其它突变体的明确需要。本文中描述了一种这样的突变体PlyD1。本文中提供的数据表明PlyD1缺少溶血活性，产生中和抗体且在某些动物模型中是保护性的，所述中和抗体在体外抑制PLY的体外溶血作用。
附图简述
图1.示例性PLY氨基酸序列-等位基因和修饰。
图2.在位置293有突变的绵羊红细胞的体外溶血活性、毒素介导的裂解。
图3.用mPLY免疫后减少的PLY介导的肺组织损伤。
图4.基于SDS-PAGE分析的PlyD1蛋白纯化。
图5.用不同剂量的含佐剂Ply-D1免疫三次的CBA/J小鼠的存活率
公开内容概述
本公开内容涉及修饰的肺炎链球菌溶血素蛋白(“mPLY”)或其片段，其可在抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌疾病的免疫原性组合物或疫苗中用作免疫原。所述mPLY通常包含至少一个不同于野生型PLY(“wtPLY”；例如SEQIDNO.：2-42中的任一个)的氨基酸。将mPLY给药至宿主后，mPLY诱导抗wtPLY和/或抗mPLY抗体的产生，其可包括防止和/或抑制wtPLY的溶血活性的抗体和/或抵抗表达wtPLY的生物的保护性抗体。优选地，mPLY诱导可与wtPLY反应的抗体且与wtPLY相比，展示对红细胞降低的溶血活性(包括无溶血活性)。在一些实施方案中，wtPLY在氨基酸65(苏氨酸，“Thr65”)、氨基酸293(甘氨酸，“Gly293”)和/或428(半胱氨酸，“Cys428”)中的一个或多个处被修饰成任何其它氨基酸。在某些实施方案中，wtPLY在Gly293和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Cys428处被修饰。在某些实施方案中，Thr65被半胱氨酸替代，Gly293被半胱氨酸替代，和/或Cys428被丙氨酸替代。还提供了编码mPLY的核酸，制备mPLY的方法，对宿主免疫、保护宿主免受表达wtPLY的生物感染、治疗和/或预防宿主被表达wtPLY的生物感染的方法及用于所述方法的组合物。根据本文中提供的描述，其它实施方案将变得清楚。
详述
本文中提供修饰的肺炎球菌溶血素(PLY)多肽及其片段，包含所述多肽和/或片段(例如肽)的免疫原性组合物和疫苗，制备所述多肽和/或片段的方法，和使用所述多肽和/或片段的方法。修饰的PLY多肽(“mPLY”)和/或mPLY片段是与wtPLY序列相比，在核酸或氨基酸序列上具有差异的PLY多肽和/或PLY多肽的片段。与wtPLY和/或其片段相比，mPLY多肽通常，但不必须地，具有至少一个修饰的氨基酸序列。所述修饰通常为氨基酸替代、插入和/或缺失。与相同剂量的、基本上对应于wtPLY蛋白的蛋白相比，所述mPLY多肽和/或其片段可优选为基本无毒的。优选地，所述修饰的序列提供通常与wtPLY有关的某些mPLY活性变化，尤其不希望的活性，包括但不局限于膜渗透、细胞裂解和对人红细胞与其它细胞(细胞可为人和/或非人细胞)的溶细胞活性变化。还优选在给药至宿主(例如动物如哺乳动物，例如人)后，mPLY保持诱导抗PLY(包括但不局限于抗wtPLY)的保护性和/或中和抗体的能力。在某些实施方案中，这类抗体降低(包括消除)wtPLY的溶血活性和/或肺组织毒性，和/或结合到表达wtPLY的微生物和/或结合到wtPLY本身，和/或提供抵抗由表达wtPLY的微生物(例如肺炎链球菌)引起的疾病的感染或传播的保护。
所述wtPLY序列可为在生物内表达的任何PLY，所述生物包括但不局限于在高等生物(例如动物，如哺乳动物，例如人)体内致病的(例如“引起疾病的”)微生物。示例性致病生物为肺炎链球菌。野生型PLY多肽通常由ply基因编码，其为高度保守的基因，但确实展示一些变异(例如，Walker等人，Infect.Immun.55：1184-1187(1987)；Mitchell等人，NucleicAcidRes.18：4010(1990)；Jefferies等人，JInfectDis.196(6)：936-44(2007))。使用可从AccelrysSoftware，Inc获得的DiscoveryStudio程序套根据与产气荚膜梭菌细胞溶素O的序列相似性和同源性建模来构建PLY结构模型。该模型表明wt-PLY为～20％α-螺旋和～40％β-折叠，具有四个不同结构域：D1(残基6-21、58-147、198-243、319-342)、D2(残基22-57，343-359)、D3(残基148-197、244-318)和D4(残基360-469)。野生型PLY可在D1、D2、D3或D4中的一个或多个处被修饰。示例性wtPLY氨基酸序列包括但不局限于以下任一中显示的那些：Walker等人.(同上)、Mitchell等人.(同上)、Jeffries等人.(同上)、图1、SEQIDNO.：2-42、基因库登录号M17717、EF413923、EF413924、EF413925、EF413926、EF413927、EF413928、EF413929、EF413930、EF413931、EF413932、EF413933、EF413934、EF413935、EF413936、EF413937、EF413938、EF413939、EF413940、EF413941、EF413942、EF413943、EF413944、EF413945、EF413946、EF413947、EF413948、EF413949、EF413950、EF413951、EF413952、EF413953、EF413954、EF413955、EF413956、EF413957、EF413958、EF413959和/或EF413960。注意到这些序列之间的任何变异可与这类wtPLY中发现的任何其它变异(其可包括本文中或其它地方描述的合成修饰)结合以产生可被修饰以产生mPLY的其它wtPLY。如采用mafft确定的，这类wtPLY多肽通常，但不必须地，与SEQIDNO.：2中显示的wtPLY氨基酸序列具有至少约(独立地提及以下各值)90％、95％或99％序列同一性(Kato等人.NucleicAcidsRes.30：3059-3066(2002)；Kato等人.BriefBioinform.9：286-294(2008))。在某些实施方案中，如采用mafft确定的，wtPLY与SEQIDNO.：2中所示的wtPLY序列可具有98.8％序列同一性。为产生mPLY而引入wtPLY的修饰可对与野生型PLY具有同一性的任何多肽(包括与SEQIDNO.：2具有约90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的那些多肽)进行。wtPLY多肽的氨基酸序列中的任何差异通常，但不必须地，为表型上沉默的。应注意本文中列出的wtPLY仅为示例性的；其它合适的wtPLY序列在本领域是已知的且将适合于本文中所述的修饰。
示例性mPLY多肽包含，例如在氨基酸苏氨酸65(“Thr65”)、甘氨酸293(“Gly293”)和/或半胱氨酸428(“Cys428”)处被修饰的wtPLY。任意这些氨基酸的修饰可使用常规命名法则提及，例如通过指出被修饰的氨基酸和对其进行的修饰(例如，Thr65X、Gly293X、Cys428X，其中X通常表示替代的氨基酸或该氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，wtPLY在Thr65处被修饰成半胱氨酸(“Ply-T65C”)。在另一实施方案中，wtPLY在甘氨酸293处被修饰成丙氨酸(“Ply-G293A”)、半胱氨酸(“Ply-G293C”)、缬氨酸(“Ply-G293V”)或苏氨酸(“Ply-G293T”)。在另一实施方案中，wtPLY在Cys428处被修饰成丙氨酸(“Ply-Cys428A)。在其它实施方案中，wtPLY在Gly293和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Cys428处被修饰。在其它实施方案中，wtPLY在Thr65和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Gly293和/或Cys428处被修饰。在其它实施方案中，wtPLY在Cys428和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Gly293处被修饰。在Thr65、Gly293和/或Cys428处的修饰可对任何wtPLY进行以产生mPLY多肽。在这些实施方案的每一个中，优选的替代是半胱氨酸替代Thr65；半胱氨酸、缬氨酸或苏氨酸替代Gly293；和/或丙氨酸替代Cys428。示例性mPLY多肽显示于SEQIDNO.43和44中。可使用标准分子生物学和生物化学技术将这些修饰中任何修饰引入本文中或其它地方描述的任何wtPLY，其结合任何其它修饰以产生mPLY多肽。
可通过本领域技术人员已知的方法对PLY(wtPLY或mPLY)活性进行测定和表征(例如，Paton等人，同上；Nato等人.InfectImmun.59(12)：4641-4646(1991))。可使用本文中描述的测定中的任何一种或多种，或任何其它一种或多种合适测定来确定mPLY作为疫苗的适当性。两种合适的示例性测定是体外溶血性测定和溶血抑制测定。体外溶血测定测量mPLY相对wtPLY的溶血(例如溶细胞)活性。溶血抑制测定测量抵抗mPLY以抑制PLY的溶血作用而产生的抗血清的能力，且(通常)将抗mPLY抗血清与抗wtPLY抗血清相比。可使用这些测定中任一种或两种来确定特定mPLY的活性。也可使用体内测定，包括但不局限于基本上如实施例8中描述的败血症模型、病灶性肺炎模型和鼻内刺激模型。因此，合适的mPLY可为展示比wtPLY低的溶血活性(例如，通过体外溶血测定)的那种。合适的mPLY也可为在给药至宿主后引起宿主产生抑制wtPLY的溶血作用(例如，通过溶血抑制测定)的抗体的那种，是免疫原性的(例如免疫原性组合物，诱导抵抗wtPLY或表达wtPLY的微生物的抗体产生或细胞毒性T细胞应答的那种)，保护性的(例如，预防性或治疗性疫苗组合物，分别诱导保护宿主免受表达wtPLY的生物感染或限制已经存在的感染的免疫应答的那种)，提供如通过本文中描述的任何一种或多种体内测定(例如，败血症模型、病灶性肺炎模型、鼻内刺激、肺损伤测定)测量到的益处和/或与wtPLY相比提高或降低巨噬细胞的细胞因子表达。应理解确认和/或表征mPLY的这些方法是示例性且非限定性的；其它测定也可是合适的。
在体外溶血测定中，可在塑料微滴定板中、在系列稀释物(例如2倍)中将测试多肽(例如，wtPLY、mPLY)分别连续稀释，其中测试多肽的最高浓度通常为约0.5mg/mL。可包含牛血清白蛋白(BSA)以防止在塑料微滴定板上的吸附损失。接着可将绵羊红细胞加至所有孔中，将各板孵育足够长时间(例如30min.)。通常包括阳性对照物(例如，通过将1％TritionX-100加到特定孔中获得100％裂解测定)和阴性对照物(例如，仅PBS)。接着可将板离心以将完整细胞与裂解细胞分离。接着可将包含裂解细胞的上清液转移至新鲜板并进行A540血红蛋白释放测定(裂解细胞释放血红蛋白)。可按照相对阳性对照物发生50％溶血时的蛋白浓度(mg/mL)的倒数确定比活性。采用此测定系统，优选特定mPLY的比活性低于wtPLY。例如，mPLT的比活性可为wtPLY的比活性的约0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％或＜10％。大致在这些范围内的比活性通常表明该特定mPLY在可接受的参数内。
在溶血抑制测定中，基本上如本领域中或本文中所述生产抗PLY(wtPLY或mPLY)抗血清并在微滴定板(例如96孔板)中连续稀释(例如，两倍)并将恒量的wtPLY加入各孔中以备分析。将绵羊红细胞加入所有孔中并按照上一段中描述的体外溶血测定进行测定。将数据以百分溶血率对抗血清效价作图(对数标度)。取百分溶血率降低至50％时血清稀释物的倒数作为50％溶血抑制效价。使用此测定系统，优选特定mPLY具有与wtPLY相似(例如，约75至约100％的任何值)或比wtPLY高的50％溶血抑制效价。例如，优选特定mPLY诱导抗血清，所述抗血清的50％溶血抑制效价(使用2倍系列稀释物)为约1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048、1∶5096或1∶10,192或更大。大致在这些范围内的50％溶血抑制效价通常表明该特定mPLY在可接受的参数内。
在某些实施方案中，可能希望mPLY具有可接受的比活性(如通过体外溶血测定确定的)和可接受的50％溶血抑制效价。例如，合适的mPLY的比活性可为wtPLY的比活性的(独立提及以下各值)0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％或＜10％(如使用体外溶血测定确定的)，而50％溶血抑制效价(使用2倍系列稀释物)为约1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048、1∶5096或1∶10,192。
已知wtPLY激活巨噬细胞来产生细胞因子(Malley等人.PNASUSA，100(4)：1966-71(2003))。可通过确定巨噬细胞激活来确认合适的mPLY，所述巨噬细胞激活通过体外测定mPly诱导的细胞因子(例如，IL-1β、IL-6和IL-10)产生来确定。可用wtPLY或mPLY与巨噬细胞样细胞(例如，人MM6和小鼠J774A.1细胞)孵育过夜，并经过或不经过蛋白酶K和加热处理(以区分处理组中脂多糖(LPS)污染导致的假阳性)。可在过夜孵育后通过ELISA测定细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β)的产生。在某些实施方案中，合适的mPLY将比wtPLY更多诱导细胞因子(例如，IL-1β、IL-6和IL-10)的表达。在其它实施方案中，合适的mPLY将比wtPLY更少诱导细胞因子(例如，IL-1β、IL-6和IL-10)的表达。mPLY和wtPLY诱导的表达水平的差异可为，例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％。
还希望抵抗mPLY而产生的抗体提供较低的wtPLY或表达wtPLY的生物诱导的肺组织损伤水平。为了使用动物模型测试此类抗体的有效性，可用mPLY(例如，用于足够长时间的一剂约1、2、5或10μg)对一个或多个小鼠(或其它合适的模型动物)接种，然后用wtPLY(例如，用于足够长时间的一剂约1、2、5或10μg)或表达wtPLY的生物刺激。经过足够长时间(例如，几小时、几天、几周时间)后，可收获肺并染色以观察组织损伤。wtPLY通常引起血管周围水肿、变厚且破裂的肺泡壁、减小的肺泡腔及肺泡腔的液体和血液渗入。在某些实施方案中，与wtPLY或表达wtPLY的生物诱导的抗体相比，合适的mPLY可诱导减少肺损伤的抗体约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
此外，在某些实施方案中，优选合适的mPLY展示免疫原性(例如，在给药至宿主后，诱导中和和/或保护性免疫应答)。可通过证实在接种的个体(例如，人，或使用动物模型)中被表达wtPLY的生物感染下降来证实中和和/或保护性免疫应答的存在。合适的动物模型包括败血症模型、病灶性肺炎模型和鼻内刺激模型。在败血症模型中，可用mPLY(具有或没有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对测试动物(例如，小鼠或类似模型)进行接种(例如，皮下、静脉、肌肉、皮内、结内(intranodally)、鼻内接种)，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，107集落形成单位(cfu)的肺炎链球菌血清型6B)通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。
也可使用病灶性肺炎小鼠模型测试mPlyD1。简单而言，可用具有或不具有佐剂的纯化的重组PlyD1蛋白对动物接种(例如，皮下、静脉、肌肉、皮内、结内、鼻内接种)。可用mPLY(具有或不具有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对测试动物(例如，小鼠或类似模型)接种，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，3-7x106cfu肺炎链球菌株EF3030(血清型19F))通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。
还可使用鼻内刺激小鼠模型内部(in-house)评价mPlyD1作为疫苗的有效性。在此模型中，可用有效剂量(例如，约0.25-25μg)的纯化的重组PlyD1蛋白(具有或不具有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对小鼠接种(例如，皮下，静脉，肌肉，皮内、结内、鼻内接种)，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，致死量(5x105cfu)的肺炎链球菌株14453(血清型6B))通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。
包含mPLY多肽和/或其片段的免疫原性组合物和疫苗可用于治疗诸如例如侵袭性肺炎球菌性疾病，如肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等。与天然毒素相比，所述多肽和片段展示显著减小的毒性。还提供编码该mPLY多肽和/或片段的核酸序列、包含这类核酸序列的载体和能表达所述突变的PLY多肽和/或片段的宿主细胞。相对于wtPLY，mPLY多肽和/或片段优选展示降低的毒性(例如，降低的溶血/溶细胞活性)并诱发中和抗体，所述中和抗体与wtPLY诱发的抗体交叉反应。mPLY多肽和/或片段可用于生产免疫组合物，所述组合物可包括疫苗。免疫组合物是给药至宿主(例如动物)后，诱导或增强定向抵抗所述组合物内包含的抗原或免疫原的免疫应答的免疫组合物。该应答可包括产生抗体(例如，通过B细胞刺激)或基于T细胞的应答(例如，溶细胞活性)。这些应答可是或不是保护性或中和的。保护性或中和免疫应答有害于与该抗原对应的感染性生物(例如，从其中衍生出抗原)且有利于宿主(例如，通过减少或预防感染)。本文中所用的保护性或中和抗体和/或细胞应答可与mPLY、wtPLY或其片段反应且当在动物中测试时降低或抑制wtPLY(或表达wtPLY或mPLY的生物)的致死率。可认为在给药至宿主后产生保护性或中和免疫应答的免疫组合物是疫苗。包含一种或多种mPLY多肽的免疫组合物还可包含一种或多种其它抗原，如一种或多种肺炎链球菌抗原。示例性抗原包括，例如PcPA和/或PhtD。免疫组合物的其它变异也认为是本领域技术人员将理解的。
如上所述，mPLY多肽和/或其片段通常具有至少一个核酸和/或一个氨基酸替代。与wtPLY相比，修饰的多肽可还在生物功能(例如，免疫原性、溶血活性)上具有至少一种变化。当与相同剂量的wtPLY蛋白相比时，mPLY多肽或其片段优选基本上无毒性，诱发抗体，所述抗体优选是保护性或中和的且可与wtPLY蛋白诱发的抗体交叉反应。可使用各种方法产生mPLY多肽和/或其片段，所述方法包括但不局限于定点诱变、随机诱变、常规诱变、体外诱变、自发诱变和化学合成。诱变方法可在例如Sambrook等人，AGuidetoMolecularCloning，ColdSpringHarbour，N.Y.(1989)和Sambrook和Russel.MolecularCloning：ALaboratoryMannual(2001)中找到。
本公开内容还涉及使用mPLY多肽或其片段产生的抗体，优选保护性或中和抗体，其中所得抗体可与wtPLY和/或其片段反应。还提供诱发抗体的产生的方法，所述抗体可为保护性和/或中和的，可与所述mPLY或其片段反应。所述抗体可诱发自动和被动免疫。所述mPLY多肽和/或其片段还可用于识别和分离抗体，所述抗体可为保护性和/或中和性的，可与wtPLY诱发的那些交叉反应。
还提供编码mPLY多肽的核酸。还提供这类序列的变体，包括其简并变体。在某些实施方案中，如下面更详细讨论的，可将编码mPLY多肽和/或片段的核酸分子插入一种或多种表达载体中。在这类实施方案中，所述mPLY多肽和/或片段由与氨基酸序列对应的核苷酸编码。编码各氨基酸的核苷酸的特定组合在本领域中是众所周知的，如本领域技术人员使用的各种文献(即，Lewin，B.GenesV，OxfordUniversityPress，1994)中所述和下表1中所示。核酸变体可使用编码关注的多肽的核苷酸的任何组合。
表1
与wtPLY相比，通常选择修饰的PLY多肽和/或片段来包括至少一个氨基酸替代和任选在生物功能上的至少一种变化。可选择修饰的PLY蛋白或其片段来确保：当与同剂量的、基本上对应于wtPLY蛋白的蛋白相比时，它们基本上是无毒的，并诱发中和抗体，所述中和抗体可为可与wtPLY蛋白诱发的抗体交叉反应的。如本文中所述，mPLY多肽及其片段可用于抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌疾病(例如，肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症)的免疫原性组合物或疫苗中。
氨基酸替代可为保守性或非保守性的。导致可影响mPLY活性的结构变化的替代包括如下：
1.从一种电荷变化到另一种电荷(例如，精氨酸到谷氨酸)；
2.从带电荷变化到不带电荷(例如，谷氨酸到脯氨酸)；
3.半胱氨酸残基中的变化和形成二硫键(例如，谷氨酸到半胱氨酸和苏氨酸到半胱氨酸)；
4.从疏水残基变化到亲水残基(例如，丙氨酸到丝氨酸)；
5.从亲水残基变化到疏水残基(例如，天冬氨酸到亮氨酸)；
6.氨基酸大小的变化(例如，甘氨酸到缬氨酸)；
7.变化到构象限制性氨基酸或类似物(例如，谷氨酸到脯氨酸)；和
8.变化到非天然存在氨基酸或类似物。
保守性氨基酸替代可包括用非天然残基替代天然氨基酸残基，使得对该位置上氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性的影响很小或没有影响，具体而言，不会导致免疫原性下降。合适的保守性氨基酸替代显示于表2中。
表2
原始残基 示例性保守替代 优选的保守替代
Ala Val、Leu、Ile Val
Arg Lys、Gln、Asn Lys
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser、Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro、Ala Ala
His Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys Arg、1，4-二氨基丁酸、Gln、Asn Arg
Met Leu、Phe、Ile Leu
Phe Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr、Ala、Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr、Phe Tyr
Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
选定的具体氨基酸替代可取决于选定位点的位置。
在某些实施方案中，可根据基因密码的简并来选择编码被替代的mPLY多肽和/或片段的核酸。当核酸为可用于在细胞(例如，表达载体)中表达多肽的重组DNA分子时，这种替代可导致具有与最初由该DNA分子编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽的表达。然而，如上所述，替代可为保守性的，或非保守性的，或其任何组合。
技术人员将能使用众所周知的技术确定本文中提供的mPLY多肽和/或片段的合适变体。为了识别可能被改变而没有破坏生物活性(即，成孔活性、红细胞(RBC)凝集、RBC溶血、MHC结合、免疫原性)的分子的合适区域，本领域技术人员可靶向被认为对该活性不重要的区域。例如，当来自相同物种或来自不同物种的具有类似活性的PLY衍生物已知时，本领域技术人员可将多肽的氨基酸序列与这类相似多肽相比较。通过进行这种分析，技术人员可识别保守分子的残基和部分。应理解，相对于这类相似肺炎球菌溶血素衍生物不保守的分子区域中的变化将不太可能负面影响多肽的生物活性和/或结构。类似地，与MHC结合所需的残基是已知的，且可突变以改善PLY抗原序列与MHC分子的结合。然而，在大多数情况下导致与MHC的结合下降的修饰是不合适的。本领域技术人员还将知道，即使在相对保守区域，技术人员可用化学上类似的氨基酸替代天然残基同时保持该多肽和/或片段的所需特征。因此，即使可能对生物活性或结构重要的区域可经过保守性氨基酸替代而不破坏mPLY衍生物的生物活性或不负面影响mPLY衍生物的结构。
在其它实施方案中，本文中描述的mPLY多肽和/或片段可包含有助于该多肽的纯化或检测的融合多肽部分。可在其目标多肽变体的氨基末端或羧基末端进行融合。融合可为直接的(没有接头或衔接分子)或可通过接头或衔接分子。接头或衔接分子可为一个或多个氨基酸残基，通常约2-约50个氨基酸残基。接头或衔接分子还可设计成具有DNA限制性内切酶或蛋白酶的切割位点以允许融合部分的分离。应理解构建后，可按照本文中所述的方法衍生融合多肽。合适的融合部分包括金属结合结构域(例如，聚组氨酸部分)、免疫球蛋白结合结构域(即，蛋白A、蛋白G、T细胞、B细胞、Fc受体或补体蛋白抗体结合结构域)、糖结合结构域(例如，麦芽糖结合结构域)和/或“标签”结构域(即，α-半乳糖苷酶的至少一部分、链酶抗生素蛋白衍生的标记肽、T7标记肽、FLAG肽或可使用与该结构域结合的化合物纯化的其它肽，如单克隆抗体)等等。此标记通常在该多肽表达后被融合到该多肽，且可作为将关注的多肽的序列从宿主细胞亲和纯化出来的手段。可例如使用抗该标记的抗体作为亲和基质通过柱层析完成亲和纯化。任选，随后可通过各种方法如使用某些用于裂解的肽酶将该标记从关注多肽的纯化序列除去。
在某些实施方案中，mPLY多肽和/或片段可直接或间接地(即，使用抗体)以能够使其被识别的方式加标签或标记。标记包括荧光染料(如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、铕和德克萨斯红)、显色染料如二氨基联苯胺、放射性同位素、大分子胶粒或微粒材料如被着色的乳胶珠(磁性或顺磁性的)、结合试剂(如生物素和洋地黄毒苷)和生物或化学活性试剂，所述试剂可例如在FACS、ELISA、蛋白印迹、TRFIA、免疫组织化学法、evanescence、Luminex珠阵列或试纸条或其它侧流测定形式中直接或间接引起可检测信号以被视觉上观察到、被电子检测或以其它方式记录。用于这类方法中的合适抗体结合分子可包括免疫球蛋白结合抗体，例如抗人Ig抗体、抗人Ig抗体、Ig同型抗原或IgG亚类特异性或葡萄球菌蛋白A或G特异性的抗人抗体。
优选荧光标记蛋白包括已知为绿色荧光蛋白(GFP)、源自水母蛋白的那些。关于GFP和其它荧光团的进一步信息在以下公开物中给出：TsienRY，″TheGreenFluorescentProtein″AnnualReviewsofBiochemistry1998；67：509-544Verkhusha，V和Lukyanov，K.″TheMolecularPropertiesandApplicationsofAnthozaFluorescentProteinandChromophores″NatureBiotechnology2004；22：289-296。编码大量荧光标记蛋白的质粒载体可从各供应商商购到，包括可从ClontechLaboratories，Inc商购到的″LivingColours&#8482；FluorescentProteins″阵列。类似载体也可从包括Invitrogen和AmershamBiosciences在内的其它供应商获得。衍生自GFP的合适荧光蛋白是红移变体EGFP、青移变体ECFP和黄移变体EYFP。优选EGFP作为荧光标记，因为它产生明亮的荧光和对靶抗原的抗原性能最小的影响。替代的荧光标记蛋白是可商购的。生物或化学活性剂包括酶，其催化形成或改变颜色或引起例如电学特性变化并也可被利用的反应。它们可为分子上易激活的，使得能级之间的电子转移产生特征光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器联用的化学体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链酶抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。其它实例包括辣根过氧化物酶和化学发光。在一些实施方案中，可使用抗体检测非固定化抗体结合分子或多肽，所述抗体结合到所述非固定化抗体结合分子或多肽。合适的检测抗体可通过荧光标记。所述标记可为荧光标记(标记)，所述荧光标记用于直接标记靶抗原使得该抗原和荧光标记形成融合蛋白。
如果生物样品中存在抗靶抗原的抗体，可用结合到那些抗体的标记来标记该抗原，并使用荧光沉淀检测由此产生的复合体。然后可使用与标记相结合的荧光确定蛋白已经被沉淀(定性测定)或确定沉淀的蛋白的量(定量测定)。例如，可在4℃使用患者血清将荧光标记的抗原的可溶提取物孵育一段合适的时间如过夜(通常10-15μl血清至300-500μl提取物或更少)以让抗体与该抗原结合。接着将用低IgG胎牛血清(Sigma)预孵育以封闭非特异性结合的蛋白A或蛋白G琼脂糖珠加入包含标记蛋白/抗体复合体的该提取液/血清混合物中，并通过在室温轻轻旋转1-2小时混合。血清内的抗体(包括特异性结合标记蛋白的那些)被蛋白A/G珠结合。接着在合适缓冲液(通常10mMTris-HCl，pH7.4，100mMNaCl/ImMEDTA/1％TritonX-100)中洗涤蛋白A/G琼脂糖珠以除去任何未结合的标记蛋白。这可通过三次离心、移走上清液和在缓冲液中再悬浮的循环来实现。接着，收集这些珠子(一些附着有标记蛋白)并放入荧光分析仪，例如来自MolecularDevicesInc的SpectraMaxGeminiXS酶标仪中。对原血清样品中特异性自身抗体/抗体的存在进行定量。如果是GFP，使用波长为472nm的激发和波长为512nm的发射。荧光激发将取决于使用的发色团/标记，但可能同时结合几种不同的标记蛋白。例如，可将不同突变PLY多肽和/或其片段分开标记并分开或同时测定。该方法的灵敏度取决于检测仪器且可通过使用更灵敏的检测仪器来大大地提高。也可使用这些方法的各种改进方式。
本文中描述的用于检测与链球菌抗原的免疫反应的抗体的测定还可与可用于检测链球菌感染的其它测定结合。例如，这些测定(即ELISA)可与用于检测生物样品中的链球菌核酸的聚合酶链反应(PCR)测定结合。或者，ELISA测定可与免疫沉淀测定结合。或，基于PCR的测定可与免疫沉淀测定结合。将本文中描述的各种测定方法结合可用于甚至更进一步提高检测的灵敏度并进一步降低数据的阴性预测值。
如上所述，表达载体也可能适合使用。表达载体通常由与编码多肽的异源核酸序列(“编码序列”)可操作地连接的旁侧序列组成。在其它实施方案中，或与这类实施方案的组合，旁侧序列优选能影响编码序列的复制、转录和/或翻译且与编码序列可操作地连接。作为“可操作地连接”，表明该核酸序列的构型使得它们能进行它们的通常功能。例如，当启动子能引导编码序列的转录时，该启动子与该编码序列可操作地连接。旁侧序列不必与该编码序列相邻，只要它能正确地起作用即可。因此，例如，间插未翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，仍可认为该启动子序列与该编码序列可操作地连接。旁侧序列可为同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自与宿主细胞物种或菌株不同的物种)、杂合的(即，来自超过一个来源的旁侧序列的组合)或合成的。旁侧序列也可为正常起作用以调节在也可使用的宿主基因组中编码多肽的核苷酸序列表达的序列。
在某些实施方案中，优选旁侧序列是驱动靶细胞中高水平基因表达的转录调节区域。所述转录调节区域可包括例如，启动子、增强子、沉默基因、阻抑蛋白元件或其组合。所述转录调节区域可为组成或组织或细胞型特异性的(即，该区域在一类组织或细胞中驱动比在另一组织或细胞中更高的转录水平)。同样地，转录调节区域的来源可为任何原核生物或真核生物，任何脊椎或无脊椎生物，或任何植物，条件是该旁侧序列在宿主细胞体系中起作用且可被宿主细胞体系激活。可使用很多种转录调节区域。
合适的转录调节区域包括CMV启动子(即，CMV立即早期启动子)；来自真核基因(即雌激素可诱导的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质素可诱导的酪氨酸转氨酶基因和胸苷激酶基因)的启动子；和主要的早期和晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature290：304-10)；劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列(LTR)中包含的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell22：787-97)；单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，Nature296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)等等。组织和/或细胞类型特异性转录控制区域包括，例如，在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift等人，1984，Cell38：639-46；Ornitz等人，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature315：115-22)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl等人，1984，Cell38：647-58；Adames等人，1985，Nature318：533-38；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域(Leder等人，1986，Cell45：485-95)；肝中的白蛋白基因控制区域(Pinkert等人，1987，GenesandDevel.1：268-76)；肝中的α-胎蛋白基因控制区域(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等人，1987，Science235：53-58)；肝中的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey等人，1987，GenesandDevel.1：161-71)；髓样细胞中的β-球蛋白基因控制区域(Mogram等人，1985，Nature315：338-40；Kollias等人，1986，Cell46：89-94)；脑内少突胶质细胞中的髓鞘碱性蛋白基因控制区域(Readhead等人，1987，Cell48：703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani，1985，Nature314：283-86)；和下脑丘中的促性腺激素释放激素基因控制区域(Mason等人，1986，Science234：1372-78)，和黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.SeminOncol1996Feb；23(1)：154-8；Siders等人.CancerGeneTher1998Sep-Oct；5(5)：281-91)。其它合适启动子在本领域中是已知的。
可将核酸分子作为病毒或非病毒载体的一部分给药。在一个实施方案中，DNA载体可用于将编码靶免疫原和/或相关分子(即，共刺激分子、细胞因子或趋化因子)的核酸传递至患者。在此过程中，可使用各种策略来提高这种机理的效率，包括例如使用自复制病毒复制子(Caley等人.1999.Vaccine，17：3124-2135；Dubensky等人.2000.Mol.Med.6：723-732；Leitner等人.2000.CancerRes.60：51-55)、密码子优化(Liu等人.2000.Mol.Ther.，1：497-500；Dubensky，同上；Huang等人.2001.J.Virol.75：4947-4951)、体内电穿孔(Widera等人.2000.J.Immunol.164：4635-3640)、引入编码共刺激分子、细胞因子和/或趋化因子的核酸(Xiang等人.1995.Immunity，2：129-135；Kim等人.1998.Eur.J.Immunol.，28：1089-1103；Iwasaki等人.1997.J.Immunol.158：4591-3601；Sheerlinck等人.2001.Vaccine，19：2647-2656)、引入刺激基序如CpG(Gurunathan，同上；Leitner，同上)、用于靶向胞吞或泛素加工路径的序列(Thomson等人.1998.J.Virol.72：2246-2252；Velders等人.2001.J.Immunol.166：5366-5373)、引发-加强方案(Gurunathan，同上；Sullivan等人.2000.Nature，408：605-609；Hanke等人.1998.Vaccine，16：439-445；Amara等人.2001.Science，292：69-74)、对蛋白酶体敏感的切割位点和使用粘膜传递载体如沙门氏菌(Darji等人.1997.Cell，91：765-775；Woo等人.2001.Vaccine，19：2945-2954)。其它方法在本领域中是已知的，将在下面对其中的一些进行描述。
已被成功地用于将核酸引入宿主的各种病毒载体包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒等等。可使用本领域技术人员普遍可获得的标准重组技术构建所述载体。这类技术可在通常的分子生物文献如MolecularCloning：ALaboratoryManual(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)、GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology，第185卷，D.Goeddel编辑，1991.AcademicPress，SanDiego，CA)和PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(Innis等人.1990.AcademicPress，SanDiego，CA)中找到。
优选的反转录病毒载体是慢病毒的衍生物及鼠或鸟反转录病毒的衍生物。合适的反转录病毒载体的实例包括，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和劳斯肉瘤病毒(RSV)。一些反转录病毒载体可结合多个外源核酸序列。由于重组反转录病毒是有缺陷的，它们需要帮助以产生感染性的载体颗粒。这种帮助可由例如编码反转录病毒结构基因的辅助细胞系提供。合适的辅助细胞系包括Ψ2、PA317和PA12等等。然后可将使用这类细胞系产生的载体病毒体用于感染组织细胞系，如NIH3T3细胞，以产生大量嵌合反转录病毒体。可在邻近靶细胞群处通过传统方法(即，注射)或通过植入“生产细胞系”将反转录病毒载体给药(Culver，K.等人，1994，Hum.GeneTher.，5(3)：343-79；Culver，K.等人，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.，59：685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.GeneTher.，4(1)：39-69)。将该生产细胞系改造以产生病毒载体并在靶细胞附近释放病毒颗粒。一部分释放的病毒颗粒接触靶细胞并感染那些细胞，因此将核酸传递给靶细胞。靶细胞感染之后，载体的核酸进行表达。
已证明腺病毒载体特别可用于将基因转移到真核细胞中(Rosenfeld，M.等人，1991，Science，252(5004)：431-3；Crystal，R.等人，1994，Nat.Genet.，8(1)：42-51)、真核基因表达的研究(Levrero，M.等人，1991，Gene，101(2)：195-202)、疫苗开发(Graham，F.和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20：363-90)和用于动物模型中(Stratford-Perricaudet，L.等人，1992，BoneMarrowTransplant.，9(Suppl.1)：151-2；Rich，D.等人，1993，Hum.GeneTher.，4(4)：461-76)。将重组Ad给药至体内不同组织的实验路径包括气管内滴注(Rosenfeld，M.等人，1992，Cell，68(1)：143-55)、注射入肌肉(Quantin，B.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)：2581-3)、外周静脉注射(Herz，J.和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)：2812-6)和立体定位接种至脑(LeGalLaSalle，G.等人，1993，Science，259(5097)：988-90)等等。
腺伴随病毒(AAV)展示高水平的感染性、广谱宿主范围和整合入宿主细胞基因组的特异性(Hermonat，P.等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)：6466-70)。且1型单纯疱疹病毒(HSV-1)也是另一受青睐的载体体系，由于其向神经特性而尤其用于神经系统中(Geller，A.等人，1991，TrendsNeurosci.，14(10)：428-32；Glorioso等人，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99；Glorioso等人，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49：675-710)。
痘病毒是另一有用的表达载体(Smith等人.1983，Gene，25(1)：21-8；Moss等人，1992，Biotechnology，20：345-62；Moss等人，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38；Moss等人.1991.Science，252：1662-1667)。证明有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘(avipox)、禽痘(fowlpox)、金丝雀痘(canarypox)、ALVAC和ALVAC(2)等等。
NYVAC(vP866)通过删除编码已知或潜在毒力因子的基因组的6个非必需区衍生自牛痘病毒的哥本哈根疫苗株(参见例如美国专利5,364,773和5,494,807)。还将删除基因座改造成接受者基因座以插入外源基因。删除的区域为：胸苷激酶基因(TK；J2R)vP410；出血区域(u；B13R+B14R)vP553；A型内含体区域(ATI；A26L)vP618；血凝素基因(HA；A56R)vP723；宿主范围基因区域(C7L-K1L)vP804；和大亚基核苷酸还原酶(I4L)vP866。NYVAC是通过特异性删除编码与毒力和宿主范围有关的基因产物的18个开放阅读框而产生的遗传工程改造牛痘病毒株。NYVAC已证实可用于表达TA(参见例如美国专利6,265,189)。还根据布达佩斯条约将NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB保藏于ATCC，登录号分别为VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。
基于ALVAC的重组病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)也适合于使用(参见，例如美国专利5,756,103)。ALVAC(2)等同于ALVAC(1)，所不同的是ALVAC(2)基因组包括受牛痘启动子控制的牛痘E3L和K3L基因(美国专利6,130,066；Beattie等人，1995a，1995b，1991；Chang等人，1992；Davies等人，1993)。ALVAC(1)和ALVAC(2)都已证实可用于表达外源DNA序列，如TA(Tartaglia等人，1993a，b；美国专利5,833,975)。根据布达佩斯条约已将ALVAC保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC登录号VR-2547。
另一有用痘病毒载体是TROVAC。TROVAC是指衍生自禽痘病毒的FP-1疫苗株的噬菌克隆分离物的减毒禽痘，其已被批准用于1天大的鸡的接种。同样根据布达佩斯条约将TROVAC保藏于ATCC，登录号2553。
“非病毒”质粒载体也可适合于某些实施方案中。优选的质粒载体与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容。这类载体包括，例如PCR-II、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pBSII(Stratagene，LaJolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，PaloAlto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT公开WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，GrandIsland，NY)及Bluescript质粒衍生物(高拷贝数COLE1基噬菌粒，StratageneCloningSystems，LaJolla，CA)、设计来克隆Taq扩增PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPOTMTAcloning试剂盒，PCR2.1质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。也可使用细菌载体。这些载体包括，例如志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳酸杆菌、卡介苗(BCG)和链球菌(参见，例如WO88/6626；WO90/0594；WO91/13157；WO92/1796；和WO92/21376)。许多其它非病毒质粒表达载体和体系在本领域中是已知的且可使用。
其它传递技术也可满足需要，包括例如DNA-配体复合物、腺病毒-配体-DNA复合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔和胶态分散体系。胶态分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和包含水包油乳液的基于脂质的体系、微胶粒、混合微胶粒和脂质体。优选的胶态体系为脂质体，其为可用作体外和体内传递载体的人工膜小泡。RNA、DNA和完整病毒体可被囊封入水性内部(aqueousinterior)并可以生物活性形式传递到细胞(Fraley，R.等人，1981，TrendsBiochem.Sci.，6：77)。脂质体的组合物通常是磷脂(尤其高相变温度磷脂)的组合物，通常，与类固醇(尤其胆固醇)组合的组合物。也可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。可用于脂质体生产的脂质的示例包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。特别有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分包含14-18个碳原子，尤其16-18个碳原子，且是饱和的。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰胆碱。
还提供包括所述载体的培养细胞。所述培养细胞可为被载体转染的培养细胞或细胞的子代，其中所述细胞表达免疫原性多肽。合适的细胞系对本领域技术人员而言是已知的且可商购到，例如通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)。转染的细胞可用于生产免疫原性多肽的方法中。所述方法包括在允许所述免疫原性多肽表达的条件下，任选在表达序列的控制下培养包括所述载体的细胞。可使用标准蛋白纯化方法将所述免疫原性多肽从所述细胞或培养基中分离。
本文中描述的多肽和核酸可在给药至宿主之前与一种或多种药学上可接受的载体结合。药学上可接受的载体为不是生物学上或其它方面不需要的材料，即，可将该材料给药至受试者，而不引起任何不需要的生物作用或以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。如本领域技术人员众所周知的，可自然地选择载体以使活性成分的任何降解最小化且使在受试者中的任何不良副作用最小化。
合适的药物载体及其制剂描述于，例如Remington’s：TheScienceandPracticeofPharmacy，第21版，DavidB.Troy编辑，LippicottWilliams&Wilkins(2005)。通常，将合适量的药学上可接受的盐用于所述制剂中来使所述制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不局限于无菌水、盐水、缓冲溶液(如林格氏溶液)和葡萄糖溶液。所述溶液的pH通常为约5-约8或约7-约7.5。其它载体包括缓释制剂如包含多肽或其片段的固体疏水聚合物的半透基质。基质可为成型的制品，例如薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员将显然的是：根据例如给药路径和被给药组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。载体是适合于将多肽和/或其片段给药至人或其它受试者的那些。
除了所述免疫原性多肽以外，药物组合物还可包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、免疫刺激剂。药物组合物还可包含一种或多种活性成分如抗微生物药、消炎药和麻醉药。还可包含佐剂以刺激或增强免疫应答。合适类型的佐剂的非限定性实例包括凝胶型(即，氢氧化铝/磷酸铝(“铝佐剂”)、磷酸钙、微生物起源物(胞壁酰二肽(MDP))、细菌外毒素(霍乱毒素(CT)、天然霍乱毒素B亚基(CTB)、大肠杆菌不稳定毒素(LT)、百日咳毒素(PT)、CpG寡核苷酸、BCG序列、破伤风类毒素、单磷酰脂质A(MPL)(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或Shigellaexseri的单磷酰脂质A)；微粒佐剂(生物可降解的、聚合物微球)；免疫刺激复合物ISCOM))、油乳液和表面活性剂基佐剂(弗氏不完全佐剂(FIA)；微流态乳液(MF59，SAF)、皂角苷(QS-21))、合成(胞壁酰肽衍生物(莫拉丁酯，threony-MDP)、非离子嵌段共聚物(L121)、聚磷腈(PCCP)、合成聚核甘酸(聚A:U、聚I:C)、沙利度胺衍生物(CC-4407/ACTIMID))、RH3-配体或聚丙交-乙交酯(PLGA)微球等等。这些毒素中任何的片段、同系物、衍生物及融合物也是合适的，条件是它们保留佐剂活性。佐剂的合适突变体或变体描述于例如WO95/17211(Arg-7-LysCT突变体)、WO96/6627(Arg-192-GlyLT突变体)和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-GlyPT突变体)中。可使用的其它LT突变体包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。
金属盐佐剂如铝佐剂由于提供具有佐剂活性的安全赋形剂而在本领域中众所周知。认为这些佐剂的作用机理包括形成抗原长效制剂使得抗原可在给药后在注射部位保留长达3周，以及形成更容易被抗原呈递细胞吸收的抗原/金属盐复合物。除了铝以外，已经使用其它金属盐来吸附抗原，包括锌、钙、铈、铬、铁和铍的盐。铝的氢氧化物和磷酸盐是最常见的。包含铝盐、抗原和其它免疫刺激剂的制剂或组合物在本领域中是已知的。免疫刺激剂的一个实例是3-de-O-乙酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。
在佐剂免疫的一个实施方案中，例如，mPLY多肽和/或其片段可与细菌多糖共价偶合以形成多糖缀合物。这类缀合物可用于，例如，作为免疫原用于诱发定向抗与mPLY和/或其片段缀合的细菌多糖的T细胞依赖性免疫原性应答。
一种或多种细胞因子也可为合适的共刺激组分，与mPLY多肽和/或其片段一起使用(作为多肽或被核酸编码的)(Parmiani等人.ImmunolLett2000Sep15；74(1)：41-3；Berzofsky等人.NatureImmunol.1：209-219)。合适的细胞因子包括，例如白介素-2(IL-2)(Rosenberg等人.NatureMed.4：321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(Pardoll综述，1992；Harries等人.J.GeneMed.2000Jul-Aug；2(4)：243-9；Rao等人.J.Immunol.156：3357-3365(1996))、IL-15(Xin等人.Vaccine，17：858-866，1999)、IL-16(Cruikshank等人.J.LeukBiol.67(6)：757-66，2000)、IL-18(J.CancerRes.Clin.Oncol.2001.127(12)：718-726)、GM-CSF(CSF(Disis等人.Blood，88：202-210(1996))、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或干扰素-γ(INF-γ)。如本领域中已知的，其它细胞因子也可适合使用。
术语“抗体”或“多种抗体”包括未纯化或部分纯化形态(即，杂交瘤上清液、腹水、多克隆抗血清)或纯化形态的整个或片段化的抗体。“纯化的”抗体是从最初发现它的蛋白(即，作为杂交瘤上清液或腹水制剂的一部分)的至少约50％分离出来的那种。优选地，纯化的抗体从最初发现它的蛋白的至少约60％、75％、90％或95％分离出来。如本领域中已知的，合适的衍生物可包括片段(即，Fab、Fab2或单链抗体(例如Fv))。抗体可为任何合适来源或形式，包括例如鼠科(即，由鼠科杂交瘤细胞产生)，或表达为人源化抗体、嵌合抗体、人抗体及类似物。
制备和使用各种类型的抗体的方法对本领域技术人员而言是众所周知的且会是适合使用的(参见例如，Harlow等人.Antibody：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988；Harlow等人.UsingAbtibidues：ALaboratoryManual，PortableProtocolNo.1，1998；KohlerandMilstein，Nature，256：495(1975))；Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Verhoeyen等人(Science，239：1534-1536(1988)；Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)；Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；Marks等人，Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology14，845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；及美国专利4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016)。在某些应用中，所述抗体可包含于杂交瘤上清液或腹水中且原样直接使用或使用标准技术浓缩后使用。在其它应用中，可使用例如如下方法将所述抗体进一步纯化：盐分馏和离子交换色谱，或使用与固体载体如琼脂球珠共价偶合的蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和/或蛋白L配体的亲和色谱，或这些技术的组合。所述抗体可以任何合适的形式(包括作为冷冻制品(即，约-20℃或-70℃)、以冻干形式)或在正常冷冻条件(即，约4℃)下保存。当以液体形式保存时，优选使用合适缓冲剂如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。抗体及其衍生物可结合于本文中所述的组合物中以在体外或体内使用。本领域技术人员可用的制备和使用抗体的其它方法可能也适合使用。
本文中还提供用于通过检测患者的生物样品中的抗体或核酸来检测患者中链球菌感染的存在的试剂盒。在一个实施方案中，一种或多种抗原(例如，mPLY多肽和/或其片段)可形成用于检测或诊断生物样品中抗链球菌抗体的试剂盒的部分。可在合适容器如小瓶中提供抗原，在所述容器中内容物受到保护以免受外部环境影响。因此，用于检测样品中的抗链球菌抗体的试剂盒可包括一种或多种突变PLY多肽和/或其片段及提供用于确定样品中一种或多种抗体结合到所述抗原的一种或多种检测试剂。所述试剂盒优选包括：(i)一种或多种分离且纯化的mPLY多肽和/或其片段；和(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的体系，任选与使用说明书一起包装。所述抗原可为在溶液中游离的或可固定于固体载体如磁珠、管、微板孔或芯片上。在某些实施方案中，提供包含分离且纯化的mPLY多肽和/或其片段或吸附到其上的融合蛋白或蛋白聚集体的固体基质。在一些实施方案中，所述试剂盒可还包括抗体结合分子作为检测试剂。所述抗体结合分子可为捕捉或检测试剂且在溶液中可为游离的或可固定于固体载体如磁珠、管、微板孔或芯片上。所述抗体结合分子或多肽可用可检测的标签，例如荧光或显色标签或结合部分如生物素进行标记。上面更详细地对合适的标签进行描述。所述试剂盒可还包括检测试剂如底物，例如显色、荧光或化学发光底物，其与所述标签或与分子(如酶交联物)反应，其结合到所述标记上以产生信号，和/或用于免疫沉淀的试剂(即蛋白A或蛋白G试剂)。所述检测试剂可还包含缓冲溶液、洗涤溶液和其它有用试剂。所述试剂盒可还包含用于处理和/或储存从个体获得的样品的设备和用于从个体获得样品的设备中一种或两种(即，针、小刀和收集管或容器)。所述试剂盒还可包含所述抗原的使用说明书，例如在如本文中所述的检测测试样品中的抗链球菌抗体的方法中的使用说明书。在所述测定将与另一类型的测定如PCR结合的情况下，还可包含这类测定的所需试剂(即引物、缓冲剂及类似物)及，任选其使用说明书。
应注意的是，除非上下文中另外明确指出，如说明书和附录权利要求书中所用的，单数“一”和“所述”包括复数形式。因此，例如，片段的提及可包括片段混合物而药物载体或佐剂的提及可包括两种或更多种这类载体或佐剂的混合物。
术语“约”、“接近”及类似语，当位于一列数值或范围前面时，是指该列或范围中的各单独值，就如该列或范围中的各单独值就在该术语之后。这些术语意味着同样提及精确地、接近或类似于其的值。
如本文中所用的，受试者或宿主意指个体。所述受试者可包括家畜动物如猫和狗，牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠)和鸟。在一方面，所述受试者为哺乳动物如灵长类动物或人。
任选的或任选地意味着随后描述的事件或状况可发生或可不发生，该描述包括其中所述事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，短语“任选地所述组合物可包括组合”意味着所述组合物可包括不同分子的组合或可不包括组合使得该描述包括组合和没有组合(即所述组合的各成员)。
本文中可将范围表示成从约一个特定值和/或到约另一特定值。当表达这类范围时，另一方面包括从所述一个特定值和/或到其它特定值。类似地，当将值表示成近似值时，通过使用先行词约或大约，应理解该特定值形成另一方面。还应理解各范围的端点在与另一端点的关系上和独立于其它端点上都是重要的。范围(例如，90-100％)意味着包括该范围本身及该范围内的各独立值就如单独地列出各值。
当术语“预防”在本文中与给定病症的给定治疗一起使用(例如，预防被链球菌属感染)时，其目的是传达：被治疗的患者或者根本没有形成临床可观察水平的病症，或比他/她在没有该治疗时更缓慢地和/或更低程度地形成所述病症。这些术语不仅仅局限于其中患者无论如何不经历该病症的任何方面的情形。例如，如果在将患者暴露于已经预计产生病症的给定表现的刺激过程中给予该治疗且该治疗导致患者经历比预期的更少和/或更温和的病症症状，则治疗将会被说成已经预防了所述病症。治疗可通过如下“预防”感染：导致患者经仅展现该感染的温和的明显症状，并不暗示着一定没有任何细胞被感染微生物穿透。
类似地，本文中与感染的风险及给定治疗一起使用的“减少”(例如，减少肺炎球菌感染的风险)通常是指与在没有治疗(例如，使用mPLY给药或接种)的情况下形成感染的控制或基础水平相比，受试者更慢地或更低程度地形成感染。感染风险的减少可导致患者仅展现该感染的温和的明显症状或感染的延迟症状，它不暗示着一定没有任何细胞被感染微生物穿透。
本公开内容中引用的所有文献都通过引用其全文结合于此。在以下实施例中对某些实施方案进一步描述。提供这些实施方案仅作为示例，而非用于以任何方式限定权利要求书的范围。
实施例
实施例1
wtPLY和His-标记的wtPLY的表达质粒的产生
使用来自肺炎链球菌株R36A(SEQIDNO.1，GenBank登录号M17717)的引物Spn001(CATGCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC；SEQIDNO.45)和Spn002(CAGCCGCTCGAGCTAGTCATTTTCTACCTTATCCTC；SEQIDNO.46)通过PCR来克隆编码wtPLY的ply基因。用限制酶NcoI和XhoI消化所得PCR产物并将其克隆进入质粒pTrcK。质粒pTrcK是质粒pTrcHis2(Invitrogen)的卡那霉素耐药衍生物。如此产生的质粒(pBM46)被用于在trc启动子控制下表达wtPLY(产生未标记PLY多肽)。该扩增子的DNA序列与编码SEQIDNO.2中显示的推导氨基酸序列的SEQIDNO.1显示的已经公开的ply序列相同。接着将编码wtPLY的核酸转移到pET-28a(EMDBiosciencesCat.No.69864-3)(NcoI-XhoI)中，产生质粒pJMS102(从T7启动子提供非标记的wtPLY表达)。接着使用引物14913.JY(GAAGGAGATATCATATGGCAAATAAAGCAG；SEQIDNO.47)和14914.JY(CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC；SEQIDNO.48)通过PCR从质粒pJMS102将相同基因克隆回到pET-28a(NdeI-XhoI)，产生质粒pJMS112(从T7启动子提供His标记的wtPLY表达)。
实施例2
PLY(T65C、G293C、C428A)(PlyD1)和His-标记的PlyD1的表达质粒的产生
将来自实施例1的质粒pJMS112用作定点诱变的模板以修饰表达的PLY多肽。使用QuickChange多定点诱变试剂盒按照厂家说明书(AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行定点诱变。将以下修饰引入编码PLY的核苷酸序列：
将Thr65的密码子从ACC变为TGC，编码半胱氨酸(C)代替编码苏氨酸(T)(T65C)；
将Gly293的密码子从GGG变为TGC，编码半胱氨酸(C)代替编码甘氨酸(G)(G293C)；和
将Cys428的密码子从TGT变为GCT，编码丙氨酸(A)代替编码半胱氨酸(C)(C428A)。
将从定点诱变产生的质粒命名为pJAY7并提供表达His标记的PLY(T65C、G293C、C428A)(His-PlyD1)。用NdeI和XhoI消化质粒pJAY7以从中分离出1420bpply基因。将此1420bp片段凝胶纯化，然后连接到切掉NdeI-XhoI和去磷酸化的pET-30a(EMDBiosciencesCat.No.69909-3)中。所得质粒命名为pJMS140并从T7启动子提供非标记PlyD1表达。使用下表3中显示的引物证实编码PlyD1的突变ply基因的序列。
表3
引物名称 序列5’→3’ SEQ ID NO.
T7启动子 TAATACGACTCACTATAGGG 49
7294.BB GCTAGTTATTGCTCAGCGG 50
13002.MP CTGCTTTTGAAGCTTTGATA 51
13003.MP AGGCTTGGGACAGAAATGGG 52
13005.MP TTGAAAGGTCGCAACTACAT 53
13006.MP AAACACATCTCCTGGATTTT 54
13007.MP ACTACGAGAAGTGCTCCAGG 55
使用表3的引物对所述突变ply序列测序证实该突变序列如所预计的序列。通过具有质粒pJMS140的大肠杆菌BL21(DE3)的化学转化证实PlyD1的表达。表达了分子量为约55kDa的PlyD1。
实施例3
PlyD1PLY(T65C、G293C、C428A)的纯化
为了获得更大量的PlyD1(SEQIDNO.44；T65C、G293C、C428)，使用大肠杆菌表达体系使PlyD1作为重组蛋白(～55kDa)在pET30A质粒中表达。在20-L发酵罐中使大肠杆菌表达的重组PlyD1蛋白生长。在高压下将细胞匀浆以释放可溶的PlyD1并在Tris缓冲盐水中渗滤以产生PlyD1的粗提取物。在使用前将粗PlyD1提取物进行0.2um过滤。使过滤的粗提取物通过强阴离子交换GigaCapQ-650M柱(TosohBiosciences)。在流过中去除未结合的污染蛋白并用平衡缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.5)追踪。使用包含100mMNaCl的平衡缓冲液进行中间洗涤步骤。用包含250mMNaCl的20mMTris-HCl，pH8.5洗脱结合的PlyD1。接着用5MNaCl溶液调理从此柱色谱步骤回收的PlyD1材料，使得导电率达～80mS/cm。
接着使用苯基琼脂糖FF(GEHealthCare)将调理的PlyD1材料经过疏水柱色谱。使用结合和洗脱模式将PlyD1纯化。通过洗涤含有1MNaCl平衡缓冲液的柱子除去未结合蛋白并用20mMTris-HCl缓冲液，pH8.0洗脱结合的PlyD1。
接着用5mM磷酸钠(pH6.2)将苯基琼脂糖纯化的PlyD1材料稀释4倍以降低结合溶液的导电率和pH。接着使用CeramicHydroxyapatiteI型40um树脂(BioRad)进一步纯化该材料。平衡缓冲液为5mM磷酸钠，pH6.2。在此混合模式的柱色谱树脂上使用结合与洗脱模式第二次纯化PlyD1。使用5mM磷酸钠，pH7.0，750mMNaCl除去污染物并用包含1MNaCl的10mM磷酸钠，pH7.0洗脱结合的PlyD1。
在三个柱步骤之后，在10mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl缓冲液中将纯化的PlyD1渗滤。加入Tween-80直到最终浓度为0.05％以阻止PlyD1沉淀。将纯化的PlyDI块料进行0.2μM过滤并随后配制成不同浓度。通常的纯化过程产生600-850mg/L纯化PlyD1蛋白，根据SDS-PAGE分析(图4)纯度＞98％。
实施例4
体外溶血测定
通过体外溶血测定对PLY多肽的溶细胞活性进行常规评估。通常，在塑料微滴定板中以2倍系列稀释方式将测试蛋白系列稀释，其中最高浓度为0.5mg/mL测试蛋白。包含BSA以防止在塑料微滴定板上的吸附损失。将绵羊红细胞加入所有孔中，将各塑料微滴定板孵育30min分钟。裂解细胞释放血红蛋白。就阳性对照而言，通过加入1％TritionX-100获得100％裂解测定。就阴性对照而言，仅用PBS孵育绵羊红细胞。将微滴定板离心以将完整细胞与裂解细胞分离。将包含裂解细胞的上清液转移至新鲜板并进行A540血红蛋白释放测定。比活性确定为相对阳性对照物发生50％溶血时的蛋白浓度(mg/mL)的倒数。代表性的溶血测定体系显示如下：
1.将50μLHank缓冲盐水溶液(HBSS)+0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)加入96孔圆底微滴定板的所有孔中。
2.用HBSS+0.5％BSA稀释测试蛋白(例如，PlyD1)储存液和阴性无关蛋白对照物至最终浓度为1mg/mL。
3.通过用HBSS+0.5％BSA稀释从已洗涤汇集细胞(RocklandImmunochemical，目录号R405-0050)的10％储存液制备3％绵羊红细胞(RBC)悬浮液。
4.将50μL1mg/mL测试蛋白(例如，PlyD1)(和缓冲液与无关蛋白对照物)加入第1板第2列，并在2行(在2行中的第2-12列)中系列稀释(1∶2)。因此，包括的蛋白浓度范围将为500μg/mL-0.000238μg/mL。保留第1列以制备缓冲液空白(参见下面步骤7)、阴性对照物(参见下面步骤6)和100％裂解对照物(参见下面步骤5)。
5.100％裂解对照物的准备：从第1列/A-C行移走10μLHBSS+0.5％BSA。将10μL在HBSS+0.5％BSA中的10％TritonX-100和50μL3％绵羊RBC溶液(来自以上#3)加入那些孔中的每一个中。
6.阴性对照物的准备：将50μL1％或3％绵羊RBC溶液(来自以上步骤3)加入第1列/D-F行。
7.缓冲液空白的准备：将50μLHBSS+0.5％BSA加入第1列/G-H行。
8.引发反应：将50μL3％绵羊RBC溶液(来自以上步骤3)加入所有测试孔。
9.通过旋转振荡在37℃孵育30min。
10.将50μLHBSS加入所有孔并以1050g离心5min来使未裂解RBC旋转下来。(其它盐水促进随后取回上清液而不破坏小球的步骤。)
11.将80μL上清液转移至平底微滴定板并读取540nm处的吸光率。用来自步骤7的缓冲液空白制备空白板。通过将在各测试孔中的吸光率除以来自步骤5的100％裂解对照物的平均吸光率计算溶血百分率。
12.以溶血百分率对蛋白浓度(log刻度)将数据作图。为了以溶血单位/毫克蛋白(HU/mg)确定比活性：i)确定在50％溶血点时的蛋白浓度，ii)将蛋白浓度转化成mg/mL，和iii)取该蛋白浓度的倒数。
使用该系统来比较野生型和突变PLY多肽的溶血活性。表4提供wtPLY和PlyD1的体外溶血活性(毒素介导的绵羊红细胞裂解)的比较(＜0.001％)。如其中所示，与野生型PLY多肽相比，突变PlyD1多肽展现显著下降的溶血活性。
实施例5
抗PlyD1抗体的产生和对wtPLY活性的抗体介导的抑制的评估
使PlyD1在大肠杆菌中表达并如上所述纯化。用PBS将纯化的蛋白透析并用于兔的免疫。以具有Freund佐剂的20μg剂量将两只兔肌肉注射免疫。在初次注射2周和4周后，所述动物接受具有不完全Freund佐剂的两次另外免疫。在最后一次注射2周和4周后收集血清。通过蛋白印迹首先测试该兔中抗体的产生，以确保抗PlyD1抗体与wtPLY反应。还可使用标准步骤通过ELISA和/或IGEN竞争测定对兔血清进行测试，以检测对已知中和表位有特异性的抗体的存在。用PlyD1产生的IgG抗体对兔接种，所述抗体在ELISA和IGEN测定中以良好血清效价结合到全长PLY。因此，确定了用PlyD1接种后与wtPLY反应的抗体的产生。
通常，确定抗PlyD1抗体抑制wtPLY溶血活性的能力的测定包括以下步骤。首先，基本上如本文中所述制备抗血清，然后在微滴定板中以2倍系列稀释。将恒定量的天然wtPLY加入所有孔中。将绵羊红细胞加入所有孔中并按照上述体外溶血测定进行测定。在最后板处理之后，将数据作图以确定50％抑制效价。代表性的溶血抑制测定体系显示如下：
1.按照如下将抗血清预处理以耗尽胆固醇(其对PLY介导的溶血作用是抑制性的)：
a.制备储存液溶液：硫酸葡聚糖(Dextralip50)的20mg/mL溶液和1MMgCl2溶液
b.通过将等体积的以上(a)中列出的两种储存液溶液混合来制备工作溶液
c.将来自以上(b)的工作溶液以1∶10之比加入血清中(即，将200μL工作溶液加入2mL血清中)并充分混合10sec
d.在室温孵育15min，然后以1500xg离心30min并将上清液转移至新鲜管中(在沉淀物中发现胆固醇)
2.将50μLHank缓冲盐水溶液(HBSS)+0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)加入96孔圆底微滴定板的所有孔中。
3.将50μL各待测试血清加入第2列中的分开的行中，在整行中系列稀释(1∶2)。保留第1列以制备缓冲液空白、阳性对照物和阴性对照物。
4.制备纯化的野生型PLY(未标记的，lotDC5826)的稀释液，使得25uL包含10ng蛋白(使用HBSS+0.5％BSA)。
5.将25uL(包含10ng)稀释的野生型PLY加入除了第1列以外的所有孔并用稀释的抗血清通过以250rpm振荡在37℃将其孵育30min。
6.通过用HBSS+0.5％BSA稀释从已洗涤的汇集细胞的10％储存液(RocklandImmunochemical，目录号R405-0050)制备3％绵羊红细胞(RBC)悬浮液。
7.100％裂解对照物的准备：将15μLHBSS+0.5％BSA和10μL在HBSS+0.5％BSA中的10％TritonX-100加入第1列/A和B行。将25μL1％或3％绵羊RBC溶液(来自以上#6)加入那些孔的每一个中。
8.阳性对照物的准备：将25μL稀释的野生型Ply(来自以上#4)加入第1列/C和D行。将25μL3％绵羊RBC溶液(来自以上#6)加入那些孔的每一个中。
9.阴性对照物的准备：将25μLHBSS+0.5％BSA和25μL3％绵羊RBC溶液(来自以上#6)加入第1列/E和F行。
10.缓冲液空白的准备：将50μLHBSS+0.5％BSA加入第1列/G和H行。
11.引发反应：将25μL3％绵羊RBC溶液(来自以上#6)加入所有测试孔中。
12.通过以250rpm振荡在37℃孵育30min。
13.以1050g离心5min来除去未裂解的RBC。
14.将75μL上清液转移到平底微滴定板并读取540nm处的吸光率。用来自步骤10的缓冲液空白制备空白板。通过将在各测试孔中的吸光率除以来自步骤7的100％裂解对照物的平均吸光率计算溶血百分率。
使用该系统测试用PlyD1接种后产生的抗体。以溶血百分率对抗血清效价(log刻度)将数据作图，并取溶血百分率降低到50％时血清稀释倍数的倒数作为50％溶血抑制效价。如本文中表4中所示，PlyD1和在G293处被修饰(变成苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸)的mPLY的50％溶血抑制效价与wtPLY相似。观察到的PlyD1多肽的特征汇总提供于表4中。
表4
*his标记的PdB的观察值为约0.5％；his标记的wtPLY和PlyD1的观察值约等于对应的未标记的多肽。
图2显示：其它PLY变体，包括Ply-G293A(G293被丙氨酸替代)、Ply-G293T(G293被苏氨酸替代)、Ply-G293V(G293被缬氨酸替代)和Ply-G293C(G293被半胱氨酸替代)也显示出比wtPLY(图4中的“Ply”)低的溶血活性(包括无可检测到的活性)。也对其它独立批次的PlyD1进行测试。在任何PlyD1批次中未检测到溶血活性。
实施例6
PlyD1的免疫原性和佐剂化
为了研究不同剂量的PlyD1(单独或在AlOOH佐剂存在下或在不同温度下储存的)的免疫原性以评价其稳定性。使用PlyD1作为免疫原在小鼠中进行两个研究。在第一个研究中，以各种剂量将PlyD1(包含或不包含氢氧化铝(AlOOH)佐剂)给药。发现在所有测试剂量下PlyD1诱导高抗PLYIgG效价和溶血抑制(HI)效价。
在第二个研究中，在-70℃、2-8℃或45℃储存两周后，将PlyD1与AlOOH佐剂一起给药。以各种剂量将PlyD1(包含或不包含AlOOH佐剂)给药。将小鼠免疫三次，间隔三周，并在每次接种之后三周采集血液样品。使用PLY特异性ELISA测定来自第二和最后抽血(最后免疫之后三周)的抗体效价。ELISA效价显示了第二次和第三次抽血后抗PLY效价的剂量应答。与无佐剂PlyD1诱导的那些相比，用佐剂PlyD1免疫产生明显更高的抗PLY效价。从第三次抽血获得ELISA结果显示于表5中。
表5
用空白对照物或提高量的PlyD1(包含或不包含AlOOH)免疫的小鼠组的PLY特异性抗体效价
在此第二个研究中，在第三次抽血之后对来自PlyD1免疫小鼠的抗血清抑制绵羊红细胞的PLY介导的溶血作用的能力进行评价，所述溶血作用使用HI测定进行测定。尽管与无佐剂PlyD1相比，在用佐剂PlyD1免疫的小鼠中HI效价似乎稍高，认为这种差异在测试误差内，因此是不显著的。此外，用提高量的PlyD1产生的HI效价中似乎没有剂量应答。结果显示于表6中。
表6
用包含或不包含AlOOH的PlyD1免疫的小鼠血清中溶血抑制效价
*HI效价：能完全抑制给定量的重组野生型PLY的溶血作用的最高血清稀释倍数。该测定的检测下限为4；低于4的效价作为2列出以进行统计。
如这里所示，当使用在-70℃或2-8℃储存的PlyD1而不是在45℃储存的PlyD1免疫时，PlyD1产生了高抗PLYIgG效价。此外，与将不包含佐剂的PlyD1给药相比，在佐剂存在下，PlyD1能产生更高的抗PLY特异性抗体效价。
这些研究表明在测试的所有PlyD1量下用PlyD1免疫诱发中和抗体。此外，这些数据显示通过产生数量上更多的抗PLY中和抗体，佐剂有助于对PlyD1的免疫应答。
实施例7
TLR4测定
已知wtPLY激活巨噬细胞以产生细胞因子(Malley等人.PNASUSA，100(4)：1966-71(2003))。本测定通过体外测定PlyD1诱导的细胞因子产生来确定巨噬细胞被PlyD1激活。用经蛋白酶K和加热处理(+/+)或未处理(-/-)的PdB、PlyD1或PLY将J774(小鼠)和MM6(人)巨噬细胞样细胞孵育过夜。用加热来区分处理组中由于脂多糖(LPS)污染导致的任何假阳性。过夜孵育后通过ELISA测定细胞因子产生(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β)。在用经蛋白酶K/热处理或未处理的PlyD1协同培养小鼠或人巨噬细胞细胞系(分别为J774A.1或MM6)后没有检测到细胞因子(IL-1β、IL-6和IL-10)产生。相比之下，未处理wtPLY能在MM6细胞中诱导低量的IL-1β和IL-6细胞因子释放(PLY-/-)。
实施例8
体内PlyD1的免疫原性
在下述模型中测试PlyD1的免疫原性过程中，使用重组wtPLY作为包被抗原通过ELISA测试PlyD1或PdB诱发的IgG应答。使用标准测定方案。
A.败血症模型
在小鼠中对PlyD1诱导抗PLY抗体和诱导保护性免疫应答的能力进行评价。用在包含铝佐剂(260μg/剂)的TBS中配制的不同剂量的纯化的重组PlyD1或PdB对雌性BALB/c小鼠组(每组N＝15)进行皮下(SC)免疫。将PdB以10μg/剂而PlyD1以1μg、2.5μg、5μg和10μg/剂量给药。注射体积为每剂200μL。将包含铝佐剂的TBS空白对照物注射入阴性对照组。此研究开始之后第0、3和6周时对动物SC免疫。在第9周，通过鼻内(IN)注射用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)悬浮液中的107集落形成单位(cfu)肺炎链球菌血清型6B对动物进行刺激(每只小鼠50μL刺激体积)。刺激之后，每日监测小鼠的死亡率。刺激后14天，使所有存活的小鼠安乐死。使用Fisher精确检验来确定免疫组和空白对照组之间是否存在显著差异。此外，在第二次加强(第42天)之后和第三次免疫(第63天)后、刺激之前从所有动物采集样品血液。通过抗体ELISA分析血清的总肺炎球菌溶血素特异性IgG应答和分析血清在溶血抑制测定中肺炎球菌溶血素的中和能力。
使用存活率分布函数和乘积极限法对用疫苗注射的小鼠和用空白对照物注射的小鼠之间死亡时间的差异进行评价。尽管如下所示诱导了抗体，然而使用本败血症模型，根据Wilcoxon检验(1μg的p＝0.5458，2.5μg的p＝0.5003，5μg的p＝0.1448和10μg的p＝0.1723)，与空白对照组相比，用PlyD1接种的小鼠在死亡时间上没有显示延迟。尽管使用PlyD1存在明显的剂量影响，与空白对照组相比，用PlyD1免疫的组中没有一组显示显著的存活率或死亡延迟(p＞0.05)(表7)。
表7
用空白对照物、PdB或PlyD1免疫并用血清型6B刺激的小鼠的百分存活率
1按照fisher精确检验确定p值且将测试组与空白对照组比较。
2按照Wilcoxon检验确定p值且将测试组与空白对照组比较。
在此败血症模型下，在免疫后第42和63天进行ELISA。结果显示在所有测试剂量下抗PLY抗体效价高。在第42和63天，所有免疫小鼠具有抵抗wtPLY的抗体应答，但在第三次免疫后没有观察到抗体效价显著提高。抗PLYIgG效价不是剂量依赖性的。将第三次免疫后，PBS空白对照物免疫、PdB免疫和PlyD1免疫组中的肺炎球菌溶血素特异性抗体效价汇总于表8中。在所有测试组中，与第42天相比，在第63天通过溶血抑制测定的功能抗体效价更高(数据未显示)。
表8
用空白对照物、PdB或PlyD1免疫的小鼠组的PLY特异性抗体效价
1确定各小鼠的刺激前抗PLY效价并表示为几何平均值。
如这里所示，使用此败血症模型，用重组PlyD1蛋白免疫产生特异性IgG应答，但没有显示抵抗肺炎链球菌血清型6B株的致死IN刺激的显著保护。然而，来自用PlyD1免疫的小鼠的血清展示了中和PLY的能力。
B.病灶性肺炎模型
还使用病灶性肺炎小鼠模型对PlyD1进行测试。简单而言，用在包含铝佐剂(300μg/剂)的TBS中配制的不同剂量的纯化的重组PlyD1蛋白对10只CBA/N小鼠的组进行SC免疫。注射体积为每剂200μL。将包含铝佐剂的磷酸盐缓冲盐水空白对照物注射到阴性对照组中。研究开始后，在第0、3周和6周时，将动物SC免疫三次。最后一次免疫后三周，用3-7x106cfu肺炎链球菌株EF3030(血清型19F；每只小鼠40μL刺激体积)对动物进行鼻内(IN)刺激。刺激5天后将小鼠处死，收获肺组织并涂板以回收cfu。使用Mann-Whitney秩和检验来确定免疫组和空白对照组之间是否存在显著差异。使用此模型的研究中，没有对血清的IgG效价或中和能力进行血清分析。当与PBS免疫组相比时，用PlyD1免疫的所有组不具有显著较低的肺载菌量，因此，认为没有受到保护(数据未显示)。
C.鼻内刺激模型
还使用鼻内刺激小鼠模型对PlyD1进行内部评价。在此模型中，用剂量范围为0.25-25μg/剂的纯化的重组PlyD1蛋白对雌性CBA/j小鼠组(每组N＝15)进行IM免疫。在包含铝佐剂(65μg/剂)的TBS中配制PlyD1。注射体积为每剂50μL。将包含铝佐剂的PBS空白对照物注射入阴性对照组中。此研究开始后，在第0、3和6周时对动物IM免疫。在第9周，用在PBS悬浮液中的致死剂量(5x105cfu)的肺炎链球菌株14453(血清型6B)对动物进行IN刺激(每只小鼠40μL刺激体积)。刺激后，每日检测小鼠的死亡率。刺激后11天，使所有存活的小鼠安乐死。使用Fisher精确检验来确定免疫组和空白对照组之间是否存在显著差异。此外，第一次注射(在第0周的免疫前)前4天和每次免疫后从所有动物采集样品血液。通过抗体ELISA分析血清的总PlyD1特异性IgG应答并分析血清在溶血抑制测定中的肺炎球菌溶血素中和能力。
以0.25μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg和25μg/剂将PlyD1给药或单独将佐剂给药(空白对照物)。将小鼠免疫三次，间隔三周，每次免疫后三周采集血液样品。使用PLY特异性ELISA测定第二次抽血和最后一次抽血(最后一次免疫后三周)的抗体效价。评价第一次、第二次和最后一次抽血血清抑制PLY介导的溶血作用的能力。最后一次免疫后三周用肺炎链球菌株14453(血清型6B)以5x105cfu/剂对小鼠进行刺激并监测存活率10天。用PlyD1以5、2.5和0.25μg/剂免疫的小鼠的存活率显著优于空白对照组，表明保护不是剂量依赖性的。与空白对照组中没有一只存活相比，在2.5μg/剂观察到最佳保护，其中60％小鼠存活。结果汇总于表9中。
表9
用空白对照物或不同剂量的PlyD1免疫并用肺炎链球菌株14453刺激的小鼠的百分存活率
1按照fisher精确检验确定p值且将测试组与空白对照组比较。
还对来自使用此鼻内刺激模型免疫的小鼠的抗血清抑制绵羊红细胞的PLY介导的溶血作用的能力进行评价。在所有抽血后按照其测试组将来自所有抽血的血清汇集并使用HI测定进行测试。尽管在用2.5和5μg/剂免疫的小鼠中在第三次免疫(第3次抽血)后HI效价似乎稍微高点，认为这种差异属于测定误差，因此是不显著的。此外，使用提高量的PlyD1产生的HI效价中似乎不存在剂量应答。结果显示于表10中。
表10
用不同剂量的PlyD1免疫的小鼠血清中溶血抑制效价
*HI效价：能完全抑制给定量的重组wtPLY的溶血作用的最高血清稀释倍数。该测定的检测下限度4；低于4的效价作为2列出以进行统计。
使用定量抗PLYELISA测定第2次抽血和第3次抽血的抗体效价。在第2次抽血和第3次抽血后所有PlyD1免疫小鼠能够发起对PLY的抗体应答。用提高剂量的PlyD1免疫的组之间没有观察到显著差异(＜2倍差异)，表明所有测试剂量仍产生饱和量的抗PLY抗体。第三次抽血的ELISA结果显示于表11中。
表11
用空白对照物或提高量的PlyD1免疫的小鼠组的PLY特异性抗体效价
1通过抗PLY定量ELISA进行
还用包含或不包含佐剂的PlyD1、wtPLY以5或10μg剂量将Balb/c小鼠免疫，然后用5μg剂量的wtPLY刺激。然后收获肺来进行H&E染色以观察由wtPLY引起的组织损伤。与对照组(用Tris-盐水、15％甘油免疫的小鼠)相比，wtPLY通常引起血管周围水肿、变厚且破裂的肺泡壁、减小的肺泡腔及肺泡腔的液体和血液渗入。如图3中所示，用PlyD1、PdB或wtPLY免疫的小鼠证实在用wtPLY鼻内刺激后免受肺损伤的显著保护。在第一次、第二次和第三次抽血后，使用HI测定对来自这些免疫小鼠的抗血清抑制绵羊红细胞的PLY介导的溶血作用的能力进行测试。与第2次抽血相比，第3次抽血后，中和抗体效价提高。总之，PlyD1免疫能产生在体内直接参与PLY毒性中和的抗体。
用单独的佐剂(AlOOH)或用单价Ply-D1将CBA/J小鼠免疫(I.M)，3次，各免疫之间间隔3周。最后一次免疫后3周，用GT-14453.BM2(血清型6B)以5x105CFU/小鼠刺激小鼠并观察存活率/健康2周。将PlyD1配制成0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.5μg、5.0μg、10μg和25μg/ml。通过对小鼠的存活率/健康状态作图对数据进行分析并使用Fisher单侧检验对数据进行统计学地比较以进行统计分析。如图5中所示，用重组PlyD1免疫在小鼠中产生抵抗致死刺激的保护。
如这里所示，使用鼻内细菌刺激模型，与空白对照组相比，在用PlyD1免疫的小鼠中观察到显著保护。当与空白对照物免疫和PLY刺激的小鼠比较时，PlyD1小鼠具有明显较低的肺损伤。总地来说，这些数据显示小鼠的PlyD1免疫能产生直接参与体内PLY毒素中和并保护免受使用活细菌的致死IN刺激的抗体。
实施例9
免疫原性组合物和/或疫苗
PlyD1免疫原性组合物和/或疫苗的生产方法包括：1)在发酵罐中使用pH-Stat补料分批发酵使表达PlyD1蛋白的重组大肠杆菌细胞生长；2)通过匀浆细胞然后0.2μm澄清过滤并通过超过滤浓缩来回收PlyD1蛋白；3)使用离子交换色谱和疏水作用色谱纯化PlyD1蛋白；和4)用铝佐剂配制该纯化的P1yD1蛋白，然而，也可使用本领域中已知的其它佐剂。这些步骤描述于本文中或对疫苗配制领域的技术人员而言是众所周知的。
可在不含防腐剂的无菌Tris缓冲盐水(TBS)中将PlyD1与氢氧化铝佐剂一起配制并制备成在单剂小瓶中的无菌白色不透明液体悬浮液(包含0.28mg元素铝/剂)。还可使用本领域中已知的其它佐剂来配制疫苗。每0.5mL剂量PlyD1免疫原性组合物或疫苗通常包含以下组分：重组PlyD1(10μg(低剂量)、25μg(中剂量)、50μg(高剂量))，和Tris缓冲盐水(TBS；10mMTris-HClpH7.4，150mM氯化钠)、氢氧化铝佐剂(0.28mg元素铝/剂)和磷酸钠(2mM)以优化吸附的抗原的结合和稳定性。玻璃小瓶中装有0.72±0.05mL以得到0.50mL的可抽出体积。来自低剂量、中剂量和高剂量的0.5mL注射(肌肉，IM)将分别产生10μg、25μg或50μg剂量的PlyD1。各0.5mL剂量被0.28mg±0.10mg元素铝佐剂化。将使用的空白对照物是TBS。免疫原性组合物或疫苗通常在3mL玻璃小瓶中供应，所述玻璃小瓶具有13mm无乳胶的灰色丁基乳浆塞和13mm单片铝密封件。该组合物通常为白色浑浊悬浮液而空白对照物为透明溶液且必须在约2℃-8℃(例如，不冻结)保存。产物中的铝佐剂通常随着时间而沉降并在使用前被再悬浮。为了准备使用，应将疫苗小瓶颠倒约5-10次直到在外观上内容物是均匀的。悬浮/混合之后应立即装入注射器中并马上注射疫苗。给药路径可如本文中所述，例如，优选通过皮下(SC)、皮内(ID)、肌肉(IM)或口服路径。
尽管已经根据优选实施方案对某些实施方案进行描述，本领域技术人员应理解将会发生变型和改型。因此，附录权利要求将覆盖在以下权利要求书范围内的所有这类等同变型。

Claims (12)

1.分离的多肽，由SEQIDNO.:2-42的任一种的野生型肺炎球菌溶血素多肽组成，所述多肽在SEQIDNO.:4、8-11、15、17、18、20-22、38-40或42的任一种中的苏氨酸65或其等同物处被半胱氨酸替代、在SEQIDNO.:4、8-11、15、17、18、20-22、38-40或42的任一种中的甘氨酸293或其等同物处被半胱氨酸替代，和在SEQIDNO.:4、8-11、15、17、18、20-22、38-40或42的任一种中的半胱氨酸428或其等同物处被丙氨酸替代；其中所述分离的肺炎球菌溶血素多肽相对于SEQIDNO.:3具有较低的溶血活性。
2.免疫原性组合物，包含权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。
3.权利要求2所述的免疫原性组合物，还包含至少一种其它肺炎链球菌抗原。
4.权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌抗原为PcPA或PhtD中的至少一种。
5.权利要求3所述的免疫原性组合物，包含PcPA和PhtD。
6.分离的核酸序列，编码权利要求1所述的肺炎球菌溶血素多肽。
7.表达载体，包含编码权利要求1所述的修饰的肺炎球菌溶血素多肽的核酸序列。
8.宿主细胞，包含编码权利要求1所述的多肽的表达载体。
9.被权利要求7所述的表达载体转化、转染或感染的宿主细胞。
10.制备权利要求1所述的多肽的方法，包括用编码所述多肽的表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞使得所述多肽被表达，和分离所述多肽。
11.基本纯化的权利要求1所述的多肽在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。
12.疫苗组合物，包含权利要求1所述的多肽。
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