KR101741426B1 - 변형된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신(ｐｌｙ) 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 기재내용은 용혈 활성을 결여하고 에스. 뉴모니아에에 의해 유발된 침습성 폐렴구균성 질병에 대한 면역원성 조성물 또는 백신에서 면역원으로 사용될 수 있는 변형된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신(Streptococcus pneumonia pneumolysin: PLY) 단백질에 관한 것이다. 변형된 뉴몰리신 단백질은 트레오닌 65, 글리신 293 및 시스테인 428에서 아미노산 치환을 포함한다. 핵산, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이를 함유하는 조성물, 이러한 핵산, 폴리펩타이드 및 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

변형된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신(ＰＬＹ) 폴리펩타이드{Modified Streptococcus pneumonia pneumolysin (PLY) polypeptides}

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 뉴몰리신(PLY) 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 핵산, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이를 함유하는 조성물, 이러한 핵산, 폴리펩타이드 및 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

스트렙토코커스 뉴모니아에는 폐렴, 수막염, 수막염, 및 균혈증과 같은 침습성 질병을 유발하는 중요한 병원체이다. 효과적인 항생제 치료요법이 자유로이 이용가능한 지역에서조차, 폐렴구균성 폐렴으로부터의 사망률은 입원한 환자에서 19% 정도로 높을 수 있다. 개발도상국에서, 5세 이하의 3백만명 초과의 많은 어린이들이 매년 폐렴으로 사망하며, 이 중 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)가 가장 일반적으로 확인된 유발인자이다. 에스. 뉴모니아에는 또한 심각하지는 않지만, 개발도상국에서 보건 비용에 상당하게 영향을 미치는 중이염 및 부비동염과 같은, 매우 우세한 감염을 유발한다. 중이염은 특히 유아에게 중요한 반면, 부비동염은 어린이와 성인 둘다에 영향을 미친다.

현재, 허가된 항-폐렴구균 백신은 가장 우세한 균주로부터 기원한 각종의 협막 다당류 항원의 제형을 기초로 한다. 침습성 페렴구균성 감염을 가장 흔하게 유발하는 혈청형은 전세계의 다양한 지역에 있어 어느 정도 상이한 것으로 여겨진다. 예방접종하기 전 북아메리카에서는, 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F가 5세 이하의 어린이에서 침습성 질병을 유발하는 7개의 가장 흔한 혈청형이었다[참조: Butler, et al. J. Infect. Dis. 171(4): 855-889 (1995)]. 이들 혈청형은 이들 어린이에서 침습성 질병 중의 70 내지 88%에서 관여하는 것으로 보고되었으며 고-수준 페니실린-내성을 지닌 에스. 뉴모니아에의 100%의 원인이었다.

2가지 유형의 폐렴구균성 백신은 임상적으로 사용되고 있다: 23가 폐렴구균성 다당류 백신(23-valent Pneumococcal Polysaccharide Vaccine: 23-PPV) 및 7가 폐렴구균성 접합체 백신(7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine: PCV7)(참조: Siber, et al. Pneumococcal Vaccines: The Impact of Conjugate Vaccine. Washington DC: ASM Press; 2008). 23-PPV에서 다당류 항원은 T-세포-의존성 면역 반응을 유발함으로써 불량한 면역학적 기억을 초래한다. 또한, 23-PPV는 성인 및 노인에서 침습성 폐렴구균성 질병(IPD)에 대해 60 내지 80% 보호를 부여하는 반면, 면역은 실질적으로 5년 후 쇠퇴하며 2세 이하의 어린이에게는 불량한 면역원성을 갖는다. 면역학적 기억을 가진 로버스트(robust) T-세포 반응이 PCV7[Prevnar^®, 제조원: 와이어쓰 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)]으로 예방접종한 유아에서 관측되었다. PCV7의 혈청형 및 혈청형 1, 3, 5, 6A, 7F, 및 19A를 포함하는 프레브나르(Prevnar) 13(PCV13)이 최근 백신 및 관련 생물학적 제품에 있어서 식품의약국 자문위원회(Food and Drug Administration advisory committee)에 의한 승인으로 권장되었다. 또한, 담체 단백질에 접합된 10개의 폐렴구균 혈청형(1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 및 23F)의 다당류를 함유하는 10가 백신(Synflorix, GSK)이 연구중에 있다.

이들의 완전한 성공 및 상당한 공중보건 영향에도 불구하고, 항-폐렴구균성 접합체 백신은 또한 제조 비용을 증가시키는 접합체 백신 생산의 복잡성을 포함하는, 일부의 익히 공지된 단점을 가져왔다. 그러나, 보다 중요한 것은, 다당류-계 접합체 백신은 백신에 의해 나타난 특정 협막형을 발현하는 세균에 의해 유발된 감염에 대해서만 보호한다는 사실의 발견이다. 이는, PCV7에 의해 나타난 혈청형이 세계 도처보다는 훨씬 덜 침습성인 질병에 대해 관여하는 라틴 아메리카, 아시아 및 아프리카와 같은 지역에서 문제가 된다[참조: Black, et al. In: Plotkin SA, et al. eds. Vaccines, 5th Edition. WB Saunders. Chapter 23 (2008); Garcia, et al. Rev. Panam. Salud. Publica. 19(5):340-8 (2006); Lagos, R. Pediatr. Infect. Dis. J. 21 (12): 1115-23 (2002)]. 이러한 필요성은 접합체 백신의 새로운 생성에 초점이 맞춰질 수 있으며, 10가 및 13가 PCV 백신(PCV-10 및 PCV-13)이 현재 개발중이고/이거나 허가 단계에 있다.

지역적 문제(예를 들면, 제한된 혈청형 적용범위, 질병의 비-백신 혈청형으로의 교체 가능성, 협막 스위칭(capsular switching), 담체-유도된 억제, 및 제조 및 공급 제한)은 전세계 인구를 예방접종하는데 있어서 상당한 문제점들을 나타낸다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되어 있다. 에스. 뉴모니아에는 다수의 유전적으로 다양한 클론을 전형적으로 포함하는 단일 폐렴구균 혈청형과 함께 항원적으로 및 클론적으로 다양하다[참조: Hanage, et al. Infect. Imnnm. 73(1):431-5 (2005)]. 폐렴구균성 단백질은 혈청형들 사이에서 매우 잘 보존되어 있음이 공지되어 있으므로 강력한 백신으로 고려되어 왔다.

뉴몰리신은 뉴모코커스의 분해에 의해 방출되는 경우 생체내에서 각종 독성 효과를 유발하는 세포내 단백질인 것으로 보고되어 있다. 당해 단백질은 임상 분리주 중에서 아미노산 서열 및 항원성 둘다에 있어 고도로 보존되어 있으므로, 백신 항원으로서 이의 용도에 대한 일부의 기본적인 범주를 만족시킨다[참조: Paton, et al. Infect. Immun. 40(2) 548-52 (1983); Lock, et al. Microb. Pathog. 5(6): 461-67 (1988)]. 그러나, 이것은 고유의 용혈 특성을 가지고 있으므로, 돌연변이체가 백신으로서 이들의 효능에 대해 개발되고 연구되어 왔다. 역사적으로 가장 흔하게 연구된 뉴몰리신 돌연변이체는 하나의 아미노산 변화, Trp433Phe를 함유하는 PdB이다[참조: Paton, et al. Infect. Immun. 59(7):2297-304 (1991); Lu, et al. Infect. Immun. 77(5): 2076-83 (2009); Ogunniyi, et al. Infect Immun. 75(1):350-7 (2007); Berry, et al. Infect. Immun. 63(5): 1969-74 (1995); Berry, et al. Infect. Immun. 67(2): 981-85 (1999)].

146번 아미노산이 결실된 ΔAla146, 및 ΔAla146R147을 포함하는 다른 PLY 돌연변이체가 최근에 기술되어 있다[참조: Kirkham, et al. Infect. Immun. 74(1): 586-93 (2006)]. ΔAla146 및 ΔAla146R147 둘다는 사람 적혈구에 대해 용혈 활성을 결여한 것으로 밝혀졌다. 명반-보조된 ΔAla146은 또한 명반-보조된 야생형 PLY로서 보호성임이 밝혀졌다.

비록 사용된 마우스 계통에 있어 차이가 있었다 할지라도, 사용된 에스. 뉴모니아에 혈청형 및 면역화 경로, 패혈증 모델을 사용한 당해 연구로부터의 결과의 편집은, 위약 대조군 그룹과 비교하는 경우 PdB 또는 ΔAla146가 마우스의 생존을 연장시킴을 나타내어 왔다. 폐렴 모델에서, PdB를 사용한 마우스의 면역화는 위약 대조군과 비교하여 감염된 마우스의 폐에서 뉴모코커스의 수를 현저시 감소시켰다[참조: Briles, et al. J. Infect. Dis. 188(3): 339-48 (2003)]. 더욱이, 이들 발견들의 대부분에서, PdB는 PspA, PspC 또는 PsaA와 같은 다른 병원성 인자와 함께 사용하는 경우 광범위한 균주에 대해 우수한 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lu, supra; Ogunniyi, supra; Berry (1995), supra]. 비록, 일부 모델에서 PdB 돌연변이체가 상당한 보호를 제공하였다고 하더라도, 이는 잔류 용혈 활성을 보유한다는 단점을 가졌다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, ΔAla146는 보호 면역성 및 용혈 활성의 결여 둘다를 제공하였다.

일부 돌연변이 PLY 백신이 개발되었지만, 보호 활성 및 용혈 활성의 결여 둘다를 지닌 추가의 돌연변이체에 대해 당해 분야에서 명백한 요구가 존재한다. 하나의 이러한 돌연변이체, PlyD1은 본원에 기술되어 있다. 본원에 나타낸 데이터는, PlyD1이 용혈 활성을 결여하고 있으며, 시험관내에서 PLY에 의해 용혈을 억제하는 중화 항체를 생성하고, 특정 동물 모델에서 보호성임이 밝혀졌다.

도면의 간단한 설명

도 1은 예시적인 PLY 아미노산 서열 - 대립유전자 및 변형을 도시한다.

도 2는 293번 위치에서 돌연변이의 시험관내 용혈 활성, 양 적혈구 세포의 독소 매개된 분해를 도시한다.

도 3은 mPLY를 사용한 면역화 후 PLY에 의해 매개된 감소된 폐 조직 손상을 도시한다.

도 4는 SDS-PAGE 분석을 기초로 한 PlyD1 단백질 정제를 도시한다.

도 5는 상이한 투여량의 보조제처리된 Ply-D1을 사용하여 3회 면역화시킨 CBA/J 마우스의 생존을 도시한다.

본 기재내용은 에스. 뉴모니아에에 의해 유발된 침습성 폐렴구균병에 대한 면역원성 조성물 또는 백신에서 면역원으로 사용될 수 있는 변형된 스트렙토코커스 뉴모니아에 뉴몰리신 단백질("mPLY") 또는 이의 단편에 관한 것이다. mPLY는 전형적으로 야생형 PLY와는 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함한다("wtPLY"; 예를 들면, 서열번호 2 내지 42 중의 어느 하나). mPLY를 숙주에게 투여하는 경우, mPLY는 항-wtPLY 및/또는 항-mPLY 항체의 생산을 유도하며, 이들 항체는 wtPLY의 용혈 활성을 예방하고/하거나 억제하는 항체 및/또는 wtPLY를 발현하는 유기체에 대한 보호성 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, mPLY는 wtPLY와 반응성인 항체를 유도하며 wtPLY와 비교하여 적혈구에 대해 감소된 용혈 활성(아무 것도 포함하지 않음)을 나타낸다. 일부 양태에서, wtPLY는 65번 아미노산(트레오닌, "Thr65"), 293번 아미노산(글리신, "Gly293"), 및/또는 428번 아미노산(시스테인, "Cys428") 중 하나 이상에서 다른 임의의 아미노산으로 변형된다. 특정 양태에서, wtPLY는 Gly293, 및 Thr65 및/또는 Cys428을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 아미노산에서 변형된다. 특정 양태에서, Thr65는 시스테인에 의해 치환되고/되거나 Gly293은 시스테인에 의해 치환되고/되거나 Cys428은 알라닌에 의해 치환된다. 또한, mPLY를 암호화하는 핵산, mPLY를 제조하는 방법, wtPLY를 발현하는 유기체에 의한 감염 또는 이러한 유기체로 감염된 숙주를 면역화, 보호, 치료 및/또는 예방하는 방법, 및 이러한 것을 수행하기 위한 조성물을 또한 제공한다. 다른 양태는 본원에 제공된 기술로부터 명백해질 것이다.

본원에 제공된 것은 변형된 뉴몰리신(PLY) 폴리펩타이드 및 이의 단편, 이러한 폴리펩타이드 및/또는 단편(예를 들면, 펩타이드)을 포함하는 백신, 이러한 폴리펩타이드 및/또는 단편을 제조하는 방법 및 이러한 폴리펩타이드 및/또는 단편을 사용하는 방법이다. 변형된 PLY 폴리펩타이드("mPLY") 및/또는 mPLY의 단편은 wtPLY 서열과 비교하여 핵산 또는 아미노산 서열에 있어 차이를 가진 것이다. mPLY 폴리펩타이드는 전형적으로, 그러나 필수적이지는 않은 wtPLY 및/또는 이의 단편과 비교하여 적어도 하나의 변형된 아미노산 서열을 갖는다. 당해 변형은 전형적으로 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편은 바람직하게는 wtPLY 단백질에 실질적으로 상응하는 단백질과 비교하여 동일한 투여량에서 실질적으로 무독성일 수 있다. 바람직하게는, 변형된 서열은 전형적으로 wtPLY와 관련된 mPLY의 특정 활성, 특히 막 투과, 세포 분해 및, 사람 적혈구 및 다른 세포("세포"는 사람 및/또는 비-사람일 수 있다)에 대해 세포분해 활성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 바람직하지 않은 활성에 있어서의 변화를 제공한다. mPLY가 숙주(예를 들면, 포유동물과 같은 동물, 예를 들면, 사람)에게 투여된 후 항-PLY(항-wtPLY를 포함하나, 이에 한정되지 않음) 보호성 및/또는 중화 항체를 유도하는 능력을 보유하는 것이 또한 바람직하다. 특정 양태에서, 이러한 항체는 wtPLY의 용혈 활성 및/또는 폐 조직 독성을 감소(제거 포함)시키고/시키거나 wtPLY를 발현하는 유기체에 결합하고/하거나 wtPLY 자체에 결합하고/하거나 wtPLY를 발현하는 미생물(예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니아에)에 의해 유발된 감염 또는 전염에 대한 보호를 제공한다.

wtPLY 서열은 고등 유기체(예를 들면, 포유동물과 같은 동물, 예를 들면, 사람)에서 병원성인(예를 들면, "질병을 유발하는") 미생물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유기체내에서 발현된 임의의 PLY일 수 있다. 예시적인 병원성 유기체는 스트렙토코커스 뉴모니아에이다. 야생형 PLY 폴리펩타이드는 전형적으로 ply 유전자에 의해 암호화되며, 이는 고도로 보존된 유전자이지만 일부 변이를 나타낸다[참조: Walker, et al Infect. Immun. 55 1184-1187 (1987), Mitchell, et al Nucleic Acid Res. 18 4010 (1990), Jefferies, et al J Infect Dis. 196(6) 936-44 (2007)]. PLY 구조적 모델은 제조업자(Accelrys Software, Inc)로부터 시판되는 프로그램(Discovery Studio suite)을 사용한 퍼프린고리신 O와의 서열 유사성 및 상동성 모델링을 기초로 제작되었다. 당해 모델은, wt-PLY가 다음 4개의 명백한 구조적 도메인을 갖는 약 20% α-나선 및 약 40% β-쉬트(sheet)임을 나타낸다: D1(잔기 6 내지 21번, 58 내지 147번, 198 내지 243번, 319 내지 342번), D2(잔기 22 내지 57번, 343 내지 359번), D3(잔기 148 내지 197번, 244 내지 318번), 및 D4(잔기 360 내지 469). 야생형 PLY는 D1, D2, D3, 또는 D4 중 임의의 하나 이상에서 변형될 수 있다. 예시적인 wtPLY 아미노산 서열은 워커(Walker) 등(상기 참조), 미첼(Mitchell) 등(상기 참조), 제프리즈(Jeffries)(상기 참조), 도 1, 서열번호 2 내지 42, 진뱅크(GenBank) 등록번호 M17717, EF413923, EF413924, EF413925, EF413926, EF413927, EF413928, EF413929, EF413930, EF413931, EF413932, EF413933, EF413934, EF413935, EF413936, EF413937, EF413938, EF413939, EF413940, EF413941, EF413942, EF413943, EF413944, EF413945, EF413946, EF413947, EF413948, EF413949, EF413950, EF413951, EF413952, EF413953, EF413954, EF413955, EF413956, EF413957, EF413958, EF413959, 및/또는 EF413960에 나타낸 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 서열 사이의 임의의 변이는, 이러한 wtPLY(이는 본원 또는 다른 곳에 기술된 합성 변형을 포함할 수 있다)내에서 발견된 임의의 다른 변이와 합해져서 mPLY를 생성하도록 변형될 수 있는 추가의 wtPLY를 생성할 수 있다. 이러한 wtPLY 폴리펩타이드는 전형적으로, 그러나 필수적이지는 않지만, 마프트(mafft)[참조: Kato, et al. Nucleic Acids Res. 30 3059-3066 (2002), Kato, et al. Brief Bioinform. 9: 286-294 (2008)]를 사용하여 측정한 것으로서 서열번호 2에 나타낸 wtPLY 아미노산 서열과 적어도 약(독립적으로 다음의 값 각각을 언급함) 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 특정 양태에서, wtPLY는 마프트를 사용하여 측정한 것으로서 서열번호 2에 나타낸 wtPLY 서열과 98.8% 서열 동일성을 공유할 수 있다. mPLY를 생산하기 위해 wtPLY내로 도입된 변형은 서열번호 2와 약 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 야생형 PLY와 동일성을 공유하는 임의의 폴리펩타이드에 대해 이루어질 수 있다. wtPLY 폴리펩타이드의 아미노산 서열내 임의의 차이는 전형적으로 그러나 필수적이지 않게 표현형적으로 사일런트(silent)이다. 본원에 열거된 wtPLY는 단지 예이며, 다른 적합한 wtPLY 서열이 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기술된 변형에 적합할 수 있음을 주목하여야 한다.

예시적인 mPLY 폴리펩타이드는 예를 들면, 아미노산 트레오닌 65("Thr65"), 글리신 293("Gly293"), 및/또는 시스테인 428("Cys428")에서 변형된 wtPLY를 함유한다. 이들 아미노산 중 어느 것의 변형은 통상의 명명법, 예를 들면, 변형되는 아미노산을 및 이에 대해 이루어진 변형을 나타냄(예를 들면, Thr65X, Gly293X, Cys428X, 여기서, X는 전형적으로 치환된 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 결실을 나타낸다)으로써 언급될 수 있다. 하나의 양태에서, wtPLY는 Thr65에서 시스테인("Ply-T65C")으로 변형된다. 다른 양태에서, wtPLY는 글리신 293에서 알라닌("Ply-G293A"), 시스테인("Ply-G293C"), 발린("Ply-G293V"), 또는 트레오닌 ("Ply-G293T")으로 변형된다. 다른 양태에서, wtPLY는 Cys428에서 알라닌("Ply-Cys428A")으로 변형된다. 다른 양태에서, wtPLY는 Gly293에서 Thr65 및/또는 Cys428와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 아미노산으로 변형된다. 다른 양태에서, wtPLY는 Thr65 및, Gly293 및/또는 Cys428을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 같은 하나 이상의 추가의 아미노산에서 변형된다. 다른 양태에서, wtPLY는 Cys428 및, Thr65 및/또는 Gly293를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 아미노산에서 변형된다. Thr65, Gly293 및/또는 Cys428에서의 변형은 어떠한 wtPLY에서도 이루어져서 mPLY 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 각각의 이들 양태에서 바람직한 치환은 Thr65에 대한 시스테인; Gly293에 대한 시스테인, 발린, 또는 트레오닌; 및/또는 Cys428에 대한 알라닌이다. 예시적인 mPLY 폴리펩타이드는 서열번호 43 및 44에 나타낸다. 이들 변형 중 어느 것도 본원 또는 다른 어느 곳에 기술된 어떠한 wtPLY에도 도입시킬 수 있거나 어떠한 다른 변형과 합하여 표준 분자 생물학 및 생화학 기술을 사용한 mPLY 폴리펩타이드를 생산할 수 있다.

PLY(wtPLY 또는 mPLY) 활성을 검정하고 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법[참조: 예를 들면, Paton, et al , supra; Nato, et al Infect Immun. 59(12) 4641-4646 (1991)]으로 특성화할 수 있다. 본원에 기술된 검정들 중 어느 하나 이상, 또는 하나 이상의 적합한 다른 어떠한 검정도 사용하여 백신으로서 mPLY의 적합성을 측정할 수 있다. 2개의 적합한, 예시적인 검정은 시험관내 용혈 검정 및 용혈 억제 검정이다. 시험관내 용혈 검정은 wtPLY에 대해 상대적인 mPLY의 용혈(예를 들면, 세포분해) 활성을 측정한다. 용혈 억제 검정은 PLY에 의한 용혈을 억제하기 위한 mPLY에 대해 생성된 항혈청의 능력을 측정하고 (전형적으로) 항-wtPLY 항혈청에 대해 항-mPLY 항혈청을 비교한다. 이들 검정 중 어느 하나 또는 둘다를 이용하여 특정한 mPLY의 활성을 측정할 수 있다. 실시예 8에 기술된 바와 같이 필수적으로 패혈증 모델, 국소 폐렴 모델, 및 비강내 챌린지 모델을 포함하나, 이에 한정되지 않는 시험관내 검정을 또한 사용할 수 있다. 따라서, 적합한 mPLY는 wtPLY보다 더 낮은 용혈 활성을 나타내는 것일 수 있다(예를 들면, 시험관내 용혈 검정을 통해). 적합한 mPLY는 또한 숙주에 투여된 후, 숙주가 wtPLY에 의해 용혈분해를 억제하며(예를 들면, 용혈 억제 검정을 통해), 면역원성이고(예를 들면, 면역원성 조성물, wtPLY 또는 wtPLY를 발현하는 미생물에 대해 항체 또는 세포독성 T 세포 반응의 생산을 유도하는 것)이고, 보호성(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 백신 조성물, wtPLY를 발현하는 유기체에 의해 각각 감염에 대해 숙주를 보호하거나 이미 존재하는 감염을 제한하는 면역 반응을 유도하는 것)이고, 본원에 기술된 시험관내 검정(예를 들면, 패혈증 모델, 국소 폐렴 모델, 비강내 챌린지, 폐 손상 검정) 중 어느 하나 이상에 의해 측정된 것으로서의 이점을 제공하고/하거나 wtPLY와 비교하여 대식세포에 의한 사이토킨의 발현을 증가시키거나 감소시키는 항체를 생산하도록 할 수 있다. mPLY를 확인하고/하거나 특성화하는 이들 방법은 예시적이며 제한되지 않고; 다른 검정 또한 적합할 수 있다.

시험관내 용혈 검정에서, 시험 폴리펩타이드(예를 들면, wtPLY, mPLY)를 전형적으로 약 0.5mg/mL인 최고 농도의 시험 폴리펩타이드를 사용하여 일련 희석(예를 들면, 2배)으로 플라스틱 미세역가 플레이트에 걸쳐 별도로 일련 희석시킬 수 있다. 소 혈청 알부민(BSA)이 플라스틱 미세역가 플레이트상에서 흡수 손실을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 이후에, 양 적혈구 세포를 모든 웰에 가하고, 플레이트를 충분한 시간(예를 들면, 30분) 동안 항온처리할 수 있다. 양성 대조군(예를 들면, 100% 분해 측정은 특정 웰에 1% 트리톤 X-100을 첨가하여 수득한다) 및 음성 대조군(예를 들면, PBS 단독)이 전형적으로 포함된다. 이후에, 플레이트를 원심분리하여 분해된 세포로부터 완벽한 세포를 분리할 수 있다. 분해된 세포를 함유하는 상청액을 새로운 플레이트로 이전시켜 A₅₄₀ 헤모글로빈 방출 검정(분해된 세포는 헤모글로빈을 방출한다)에 적용시킬 수 있다. 특이 활성은, 양성 대조군에 대해 50% 용혈이 발생하는 단백질 농도(mg/mL)의 역수로 측정될 수 있다. 당해 검정 시스템을 사용하여, 특정 mPLY가 wtPLY보다 적은 특이 활성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면, mPLT는 wtPLY의 특이 활성의 약 0%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 또는 <10%의 특이 활성을 가질 수 있다. 대략 이들 범위내에 있는 특이 활성은, 특정 mPLY가 허용가능한 매개변수내에 있음을 전형적으로 나타낸다.

용혈 억제 검정에서, 항-PLY(wtPLY 또는 mPLY) 항혈청은 당해 분야 또는 본원에 기술된 바와 같이 필수적으로 생산되어 미세역가 플레이트(예를 들면, 96-웰 플레이트)를 따라 일련 희석(예를 들면, 2배)되며, wtPLY의 일정량이 분석될 각각의 웰에 가해진다. 양 적혈구 세포를 모든 웰에 가하고 검정을 앞서의 단락에 기술된 시험관내 용혈 검정에 대해 진행시킨다. 데이터를 항혈청 역가(로그 규모)에 대해 용혈 퍼센트로서 플롯팅한다. 50% 용혈 억제 역가는, 용혈 퍼센트가 50%로 감소되는 혈청 희석률의 역수로 취한다. 당해 검정 시스템을 사용하는 경우, 특정 mPLY는 wtPLY보다 유사하거나(예를 들면, 약 75 내지 약 100%로부터의 어느 범위) 더 높은 50% 용혈 억제 역가를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들면, 특정 mPLY가 약 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:5096, 또는 1:10,192, 또는 그 이상의 50% 용혈 억제 역가(일련의 2배 희석을 사용)를 갖는 항 혈청을 유도하는 것이 바람직하다. 대략 이들 범위내에 있는 50% 용혈 억제 역가는, 특정 mPLY가 허용가능한 매개변수내에 있음을 전형적으로 나타낸다.

특정 양태에서, mPLY가 시험관내 용혈 검정에 의해 측정한 것으로서 허용가능한 특이 활성 및 허용가능한 50% 용혈 억제 역가 둘다를 가지는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 적합한 mPLY는 wtPLY의 특이 활성(시험관내 용혈 분석에 의해 측정된 것으로서)의 약(독립적으로 다음 값 각각을 언급) 0%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 또는 <10%의 특이 활성 및, 약 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:5096, 또는 1:10,192의 50% 용혈 억제 역가(일련의 2배 희석 사용)을 가질 수 있다.

wtPLY는 대식세포를 활성화시켜 사이토킨을 생성하는 것으로 공지되어 있다[참조: Malley, et al PNAS USA, 100(4) 1966-71 (2003)]. 적합한 mPLY는 시험관내에서 mPly-유도된 사이토킨 생산(예를 들면, IL-1β, IL-6 및 IL-10)을 측정함으로써 대식세포 활성화를 측정하여 확인할 수 있다. 대식세포-유사 세포(예를 들면, 사람 MM6 및 마우스 J774A.1 세포)를 밤새 wtPLY 또는 mPLY와 항온처리하고, 프로테이나제 K 및 열[처리된 그룹에서 지질다당류(LPS) 오염으로 인한 거짓 양성을 구별하기 위해]로 처리하거나 처리하지 않을 수 있다. 사이토킨 생산(예를 들면, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-1β)은 밤새 항온처리 후 ELISA로 측정할 수 있다. 특정 양태에서, 적합한 mPLY는 wtPLY보다 사이토킨(예를 들면, IL-1β, IL-6 및 IL-10)의 발현을 보다 더 유도할 것이다. 다른 양태에서, 적합한 mPLY는 wtPLY보다 사이토킨(예를 들면, IL-1β, IL-6 및 IL-10)의 발현을 덜 유도할 것이다. mPLY 및 wtPLY에 의해 유도된 발현 수준에 있어서의 차이는 예를 들면, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 100% 이상일 수 있다.

mPLY에 대해 생성된 항체가 wtPLY 또는 wtPLY를 발현하는 유기체에 의해 유도된 보다 낮은 수준의 폐 조직 손상을 제공하는 것이 또한 바람직하다. 동물 모델을 사용하여 이러한 항체의 효능을 시험하기 위해, 하나 이상의 마우스(또는 다른 적합한 동물 모델)을 mPLY(예를 들면, 충분한 기간 동안 약 1, 2, 5 또는 10μg의 투여량)으로 면역화시킨 후 wtPLY(예를 들면, 충분한 기간 동안 약 1, 2, 5, 또는 10μg의 투여량) 또는 wtPLY를 발현하는 유기체로 챌린지시킬 수 있다. 충분한 기간(예를 들면, 수시간, 수일, 수주의 기간) 후, 폐를 수거하고 염색하여 조직 손상을 관측할 수 있다. wtPLY는 전형적으로 말초혈관 부종, 비후, 파열된 폐포벽, 축소된 폐포 공간, 및 폐포 공간의 유체 및 혈액 침윤을 유발한다. 특정 양태에서, 적합한 mPLY는 wtPLY 또는 wtPLY를 발현하는 유기체에 의해 유도된 것과 비교하여 예를 들면, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%까지 폐 손상을 감소시키는 항체를 생산할 수 있다.

또한, 특정 양태에서, 적합한 mPLY가 면역원성 특성(예를 들면, 숙주에 투여한 후 중화 및/또는 보호성 면역 반응을 유도)을 나타내는 것이 바람직하다. 중화 및/또는 보호성 면역 반응의 존재는 wtPLY를 발현하는 유기체에 의한 감염이 면역화된 개체(예를 들면, 사람, 또는 동물 모델 사용)에서 감소됨을 입증합으로써 증명할 수 있다. 적합한 동물 모델은 패혈증 모델, 국소 폐렴 모델, 및 비강내 챌린지 모델을 포함한다. 패혈증 모델에서, 시험 동물(예를 들면, 마우스 또는 유사한 모델)은 mPLY(0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일과 같은 적합한 시점에서 하나 이상의 보조제의 존재 또는 부재하에서)로 면역화(예를 들면, 피하내, 정맥내, 근육내, 피내, 결절내, 비강내)시킨 후, 적합한 시간(예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주) 후 적합한 양의 wt-PLY 발현 유기체[예를 들면, 에스. 뉴모니아에 혈청형 6B의 10⁷개 콜로니 형성 단위(cfu)]를 비강내(IN) 주사하여 챌린지할 수 있다. 챌린지 후, 마우스를 사망률에 대해 모니터링하고, 시료 혈액을 제거할 수 있다. 혈청을 예를 들면, 항체 ELISA를 사용하여 총 PLY-특이적인 IgG 반응에 대해서 및 예를 들면, 용혈 억제 검정을 사용하여 PLY 중화능에 대해 분석할 수 있다. 통계적 분석[예를 들면, 피셔의 정확도 시험(Fisher's exact test), 윌콕슨 시험(Wilcoxon test), 만-휘트니 시험(Mann-Whitney Test)]을 생존 및 ELISA/용혈 억제 검정 데이터에 대해 수행하여 mPLY가 효과적인지를 측정할 수 있다.

mPlyD1은 또한 국소 폐렴 마우스 모델을 사용하여 시험할 수 있다. 요약하면, 동물을 정제된 재조합 PlyD1 단백질을 사용하여 보조제의 존재 또는 부재하에 면역화(예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내, 피내, 결절내, 비강내)시킬 수 있다. 시험 동물(예를 들면, 마우스 또는 유사 모델)을 mPLY(0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일과 같은 적합한 시점에 하나 이상의 보조제의 존재 또는 부재하에)로 면역화시킨 후, 적합한 시간(예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주) 후 적합한 양의 wt-PLY 발현 유기체[예를 들면, 3 내지 7x10⁶ cfu의 에스. 뉴모니아에 균주 EF3030(혈청형 19F)]로 비강내(IN)로 챌린지할 수 있다. 챌린지 후, 마우스를 사망률에 대해 모니터링하고, 시료 혈액을 제거할 수 있다. 혈청은 예를 들면, 항체 ELISA를 사용하여 총 PLY-특이적인 IgG 반응에 대해서 및 예를 들면, 용혈억제 검정을 사용하여 PLY 중화능에 대해 분석할 수 있다. 이후, 통계적 분석(예를 들면, 피셔의 정확도 시험, 윌콕슨 시험, 만-휘트니 시험)을 생존 및 ELISA/용혈 억제 검정 데이터에 대해 수행하여 mPLY가 효과적인지를 측정할 수 있다.

백신으로서 mPlyD1의 효능을 또한 비강내 챌린지 마우스 모델을 사용하여 사내 평가할 수 있다. 당해 모델에서, 마우스를 정제된 재조합 PlyD1 단백질을 사용하여 유효량(예를 들면, 약 0.25 내지 25 μg)으로 하나 이상의 보조제의 존재 또는 부재하에 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일과 같은 적합한 시점에서 면역화(예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내, 피내, 결절내, 비강내)시킨 후, 적합한 시간(예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주) 후 적합한 양의 wt-PLY 발현 유기체[예를 들면, 에스 뉴모니아에 균주 14453(혈청형 6B)의 치사 투여량(5x10⁵ cfu)]로 챌린지할 수 있다. 챌린지 후, 마우스를 치사율에 대해 모니터링하고, 시료 혈액을 제거할 수 있다. 혈청을 예를 들면, 항체 ELISA를 사용하여 총 PLY-특이적인 IgG 반응에 대해 및 예를 들면, 용혈억제 검정을 사용하여 PLY 중화능에 대해 분석할 수 있다. 이후에, 통계적 분석(예를 들면, 피셔의 정확도 시험, 윌콕슨 시험, 만-휘트니 시험)을 생존 및 ELISA/용혈 억제 검정 데이터에 대해 수행하여 mPLY가 효과적인지를 측정할 수 있다.

mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 함유하는 면역원성 조성물 및 백신을 사용하여 예를 들면, 폐렴, 뇌수종 및 세균혈증과 같은 침습성 폐렴구균성 질병을 치료할 수 있다. 폴리펩타이드 및 단편은 천연의 독소와 비교하여 실질적으로 감소된 독성을 나타낸다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편을 암호화하는 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 함유하는 벡터, 및 돌연변이 PLY 폴리펩타이드 및/또는 단편을 발현할 수 있는 숙주 세포가 또한 제공된다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편은 바람직하게는 wTPLY와 비교하여 감소된 독성(예를 들면, 보다 낮은 용혈/세포용해 활성)을 나타내며 wtPLY에 의해 유발된 항체와 교차-반응하는 중화 항체를 유발한다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편을 사용하여 백신을 포함할 수 있는 면역학적 조성물을 생산할 수 있다. 면역학적 조성물은, 숙주(예를 들면, 동물)에게 투여시 조성물내에 함유된 항원 또는 면역원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하거나 향상시킨다. 당해 반응은 항체의 생성(예를 들면, B 세포의 자극을 통해) 또는 T 세포-계 반응(예를 들면, 세포용해 반응)을 포함할 수 있다. 이들 반응은 보호성 또는 중화성일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 보호성 또는 중화성 면역 반응은 항원에 상응하는 감염성 유기체(예를 들면, 이로부터 항원이 기원하였다)에 대해 치명적이고 숙주에 유익한(예를 들면, 감염을 감소시키거나 예방함으로써) 것이다. 본원에 사용된 보호성 또는 중화 항체 및/또는 세포 반응은 mPLY, wtPLY 또는 이의 단편에 대해 반응성일 수 있으며 동물에서 시험시 wtPLY(또는 wtPLY 또는 mPLY를 발현하는 유기체)의 사망율을 감소시키거나 억제한다. 숙주에게 투여시 보호성 또는 중화 면역 반응을 초래하는 면역학적 조성물은 백신으로 고려될 수 있다. 하나 이상의 mPLY 폴리펩타이드를 포함하는 면역학적 조성물은 또한 에스. 뉴모니아에의 하나 이상의 항원과 같은 하나 이상의 추가의 항원을 포함할 수 있다. 예시적인 항원은 예를 들면, PcPA 및/또는 PhtD를 포함한다. 면역학적 조성물의 다른 변이는 또한 당해 분야의 숙련가에게 이해될 수 있는 것으로 고려된다.

위에서 언급한 바와 같이, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편은 전형적으로 적어도 하나의 핵산 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 변형된 폴리펩타이드는 또한 wtPLY와 비교하여 생물학적 기능(예를 들면, 면역원성, 용혈 활성)에 있어서 적어도 하나의 변화를 나타낼 수 있다. mPLY 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 바람직하게는 동일한 투여량에서 wtPLY 단백질과 비교시 실질적으로 무독성이며, 바람직하게는 보호성이거나 중화성이며 wtPLY 단백질에 의해 유발된 항체와 교차-반응성인 항체를 유발한다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편은 부위-지시된 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 통상의 돌연변이유발, 시험관내 돌연변이유발, 자발적 돌연변이유발 및 화학적 합성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 돌연변이유발의 방법은 예를 들면 문헌[참조: Sambrook et al , A Guide to Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, N. Y. (1989) 및 Sambrook and Russel Molecular Cloning A Laboratory Mannual (2001)]에서 찾을 수 있다.

본 기재내용은 또한 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 사용하여 생성된 항체, 바람직하게는 보호성이거나 중화성인 항체에 관한 것이며, 여기서, 수득되는 항체는 wtPLY 및/또는 이의 단편에 대해 반응성이다. 또한, mPLY 또는 이의 단편에 대해 보호성이고/이거나 중화성이며 반응성일 수 있는 항체의 생산을 유발하기 위한 방법이 제공된다. 항체는 활성 및 수동 면역성을 유발할 수 있다. mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편은 또한 보호성 및/또는 중화성일 수 있고, wtPLY에 의해 유발된 것들과 교차-반응성인 항체를 확인하고 분리하는데 사용될 수 있다.

mPLY 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 또한 제공된다. 또한, 이의 축퇴 변이체(degenerate variant)를 포함하는, 이러한 서열의 변이체가 제공된다. 특정 양태에서, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편을 암호화하는 핵산 분자는 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이 하나 이상의 발현 벡터내로 삽입될 수 있다. 이러한 양태에서, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편은 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 각종 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드의 특정 조합은 당해 분야의 숙련가에 의해 사용된 각종 문헌(즉, Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994)에 기술되어 있고 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 핵산 변이체는 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 사용할 수 있다.

변형된 PLY 폴리펩타이드 및/또는 단편은 전형적으로 적어도 하나의 아미노산 치환, 및 임의로 wtPLY와 비교된 생물학적 기능에 있어서 적어도 하나의 변화를 포함하도록 선택된다. 변형된 변형된 PLY 단백질 또는 단편은, 이들이 동일한 투여량에서 wtPLY 단백질에 실질적으로 상응하는 단백질과 비교하여 실질적으로 무-독성이며 wtPLY 단백질에 의해 유발된 항체와 교차-반응할 수 있는 중화 항체를 유발함을 보증하기 위해 선택될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, mPLY 폴리펩타이드 및 이의 단편은 스트렙토코커스 뉴모니아에에 의해 유발된 폐렴구균성 질병(예를 들면, 폐렴, 수막염, 중이염, 세균혈증)에 대한 면역학적 조성물 또는 백신에 유용할 수 있다.

아미노산 치환은 보존성 또는 비-보존성일 수 있다. mPLY 활성에 영향을 미칠 수 있는 구조적 변화를 초래하는 치환은 다음을 포함한다:

1. 하나의 유형의 전하로부터 다른 것으로의 변화(예를 들면, 아르기닌에서 글루타메이트로);

2. 하전으로부터 비하전으로의 변화(예를 들면, 글루타메이트로부터 프롤린으로);

3. 시스테인 잔기내 변화 및 디설파이드 결합의 형성(예를 들면, 글루타메이트로부터 시스테인으로 및 트레오닌으로부터 시스테인으로);

4. 소수성 잔기로부터 친수성 잔기로의 변화(예를 들면, 알라닌으로부터 세린으로);

5. 친수성 잔기로부터 소수성 잔기로의 변화(예를 들면, 아스파테이트로부터 류신으로);

6. 아미노산의 크기의 변화(예를 들면, 글리신으로부터 발린으로);

7. 구조적으로 제한된 아미노산 또는 유사체로의 변화(예를 들면, 글루타메이트로부터 프롤린으로); 및

8. 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 또는 유사체로의 변화.

보존적 아미노산 치환은, 해당 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 대한 효과가 거의 없거나 전혀 없고 특히 감소된 면역원성을 초래하지 않도록 하는, 천연의 아미노산 잔기의 비-천연 잔기로의 치환을 포함할 수 있다. 적합한 보존적 아미노산 치환은 표 2에 나타낸다.

선택된 특정 아미노산 치환은 선택된 부위의 위치에 의존할 수 있다.

특정 양태에서, 치환된 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편을 암호화하는 핵산은 유전 코드의 축퇴성을 기초로 선택할 수 있다. 핵산이 세포내에서 폴리펩타이드를 발현하는데 유용한 재조합 DNA 분자(예를 들면, 발현 벡터)일 경우, 이러한 치환은, DNA 분자에 의해 원래 암호화된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 발현을 초래할 수 있다. 그러나, 위에서 기술한 바와 같이, 치환은 보존적 또는 비-보존적, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.

숙련가들은 익히 공지된 기술을 사용하여 본원에 제공된 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편의 적합한 변이체를 측정할 수 있을 것이다. 생물학적 활성(즉, 공극-형성 활성, 적혈구 세포(RBC) 응집, RBC 용혈, MHC 결합, 면역원성)을 파괴하지 않고 변화시킬 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인하기 위하여, 당해 분야의 숙련가는 이러한 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 동일한 종으로부터 또는 다른 종으로부터 유사한 활성을 가진 PLY 유도체가 공지되어 있는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 이러한 유사한 폴리펩타이드와 비교할 수 있다. 이러한 분석을 수행함으로써, 숙련가는 보존된 분자의 잔기 및 부위를 확인할 수 있다. 이러한 유사한 뉴몰리신 유도체에 대해 보존되지 않은 분자의 부위내 변화는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 불리하게 영향을 거의 미치지 않을 수 있음을 인지할 것이다. 유사하게, MHC에 결합시키기 위해 요구된 잔기는 공지되어 있으며 MHC 분자에 대한 PLY 항원 서열의 결합을 증진시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 그러나, MHC에 대한 감소된 결합을 초래하는 변형은 대부분의 위치에서 적절하지 않을 것이다. 당해 분야의 숙련가는 또한, 비교적 보존된 영역내에서도, 천연적으로 존재하는 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산을 치환하면서, 폴리펩타이드 및/또는 단편의 바람직한 특성을 보유할 수 있다. 따라서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 부위조차 mPLY 유도체의 구조에 불리하게 영향을 미치지 않거나 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 보존된 아미노산 치환에 적용될 수 있다.

다른 양태에서, 본원에 기술된 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편은 폴리펩타이드의 정제 또는 검출시 보조하는 융합 폴리펩타이드 분절을 포함할 수 있다. 융합은 이의 대상 폴리펩타이드 변이체의 아미노 말단 또는 카복시 말단에서 이루어질 수 있다. 융합은 링커 또는 어댑터 분자(adapter molucule)와 함께 지시할 수 있거나 링커 또는 어댑터 분자를 통해 이루어질 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 하나 이상의 아미노산 잔기, 전형적으로 약 2 내지 약 50개의 아미노산 잔기일 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 또한 DNA 제한 엔도뉴클레아제에 대한 또는 프로테아제에 대한 분해 부위를 사용하여 설계함으로써 융합된 잔기가 분리되도록 할 수 있다. 일단 작제되면, 융합 폴리펩타이드는 본원에 기술된 방법에 따라서 유도체화될 수 있음을 인식할 것이다. 적합한 융합 분절은 다른 것들 중에서, 금속 결합 도메인(예를 들면, 폴리-히스티딘 분절), 면역글로불린 결합 도메인(즉, 단백질 A, 단백질 G, T 세포, B 세포, Fc 수용체 또는 보체 단백질 항체-결합 도메인), 당 결합 도메인(예를 들면, 말토즈 결합 도메인), 및/또는 "태그" 도메인(즉, α-갈락토시다제, 스트렙타비딘-기원한 태그 펩타이드, T7 태그 펩타이드, FLAG 펩타이드, 또는 모노클로날 항체와 같이, 도메인에 결합하는 화합물을 사용하여 정제될 수 있는 다른 펩타이드)을 포함한다. 당해 태그는 전형적으로 폴리펩타이드의 발현시 폴리펩타이드에 융합되며, 숙주 세포로부터 목적한 폴리펩타이드의 서열의 친화성 정제를 위한 수단으로 제공될 수 있다. 친화성 정제는 예를 들면, 친화성 매트릭스로서 태그에 대한 항체를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 임의로, 태그는 후속적으로 목적한 폴리펩타이드의 정제된 서열로부터 분해용의 특정 펩티다제를 사용하는 것과 같은 각종 수단으로 제거할 수 있다.

특정 양태에서, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 단편은 이것이 검출될 수 있도록 하는 방식으로 직접 또는 간접적으로(즉, 항체를 사용하여) 표지되거나 태그될 수 있다. 표지는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 유로피움 및 텍사스 레드, 디아미노벤지딘과 같은 색소 염료, 방사선동위원소, 거대분자 콜로이드성 입자 또는, 착색되거나, 자성이거나 또는 반자성인 라텍스 비드와 같은 미립자 물질, 바이오틴 및 디옥시게닌과 같은 결합제, 및 직접 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 유발하여 가시적으로 관측되거나, 전기적으로 검출되거나 또는 예를 들면, FACS, ELISA, 웨스턴 블롯, TRFIA, 면역조직화학, 에바네센스(evanescence), 루미넥스 비드 어레이, 또는 딥스틱(dipstick) 또는 다른 측면 유동 검정 방식에서 기록되도록 할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제를 포함한다. 이러한 방법에 사용하기 위한 적합한 항체-결합 분자는 면역글로불린-결합 항체, 예를 들면, 항-사람 Ig 항체, 항-사람 Ig 항체, Ig 동형 또는 IgG의 하위부류에 대해 특이적인, 또는 스타필로코커스 단백질 A 또는 G에 대해 특이적인 항-사람 항체를 포함할 수 있다.

바람직한 형광 태그 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)로 공지된 해파리 단백질로부터 기원한 것들을 포함한다. GFP 및 다른 형광단에 대한 추가의 정보는 다음 공보에 제공된다: Tsien R Y, "The Green Fluorescent Protein" Annual Reviews of Biochemistry 1998, 67 509-544 Verkhusha, V and Lukyanov, K "The Molecular Properties and Applications of Anthoza Fluorescent Proteins and Chromophores" Nature Biotechnology 2004, 22 289-296. 광범위한 형광 태그 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터는 클론테크 래보러토리즈, 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.)로부터 시판되는 "Living Colours&#8482; Fluorescent Proteins"의 어레이를 포함하는 다양한 공급업자로부터 시판된다. 유사한 벡터는 또한 인비트로겐(Invitrogen) 및 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)를 포함하는 다른 공급업자들로부터 수득할 수 있다. GFP로부터 기원한 적합한 형광 단백질은 적색-이동된 변이체 EGFP, 시안 이동된 변이체 ECFP 및 황색 이동된 변이체 EYFP이다. EGFP는 표적 항원의 항원 특성에 대한 최소 효과와 결합된 밝은 형광을 제공하므로, 형광 마커로서 바람직하다. 대안의 형광 마커 단백질은 시판되고 있다. 생물학적 또는 화학적 활성제는 예를 들면, 전개되거나 색상을 변화시키거나 전기적 특성에 있어서의 변화를 유발하는 반응을 촉매하는 효소를 포함하며, 예를 들면, 또한 이용할 수 있다. 이들은 분자적으로 여기될 수 있어서, 에너지 상태들 사이의 전기적 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방사를 초래하도록 한다. 이들은 바이오센서와 함께 사용된 화학 실체를 포함할 수 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템을 사용할 수 있다. 추가의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 화학발광을 포함한다. 일부 양태에서, 고정되지 않은, 항체-결합 분자, 또는 폴리펩타이드는 상기 고정되지 않은 항체-결합 분자 또는 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 적합한 검출 항체는 형광에 의해 표지할 수 있다. 표지는 표적 항원을 직접 표지함으로써 항원 및 형광 마커가 융합 단백질을 형성하도록 사용된 형광 마커(태그)일 수 있다.

표적 항원에 대한 항체가 생물학적 시료에 존재하는 경우, 항원은 이들 항체에 결합된 태그로 표지할 수 있고, 이에 의해 형성된 복합체는 면역침전을 사용하여 검출할 수 있다. 이후에, 태그와 관련된 형광을 사용하여 단백질이 침전되는지를 측정하거나(정성적 측정) 또는 침전된 단백질의 양을 측정할 수 있다(정량적 측정). 예를 들면, 형광-태그된 항원의 가용성 추출물을 환자 혈청과 함께 밤새와 같은 적절한 기간 동안 4℃에서 항온처리(300 내지 500μl 미만의 추출물에 대하여 전형적으로 10 내지 15μl의 혈청)하여 항체가 항원에 결합하도록 할 수 있다. 이후에, 비-특이적인 결합을 차단하기 위한 저 IgG 태아 소 혈청(제조원: 시그마)와 함께 예비항온처리한 단백질 A 또는 단백질 G 세파로즈 비드를 태그된 단백질/항체 복합체를 함유하는 추출물/혈청 혼합물에 가하고, 1 내지 2시간 동안 실온에서 온화하게 회전시켜 혼합한다. 태그된 단백질에 특이적으로 결합하는 것들을 포함하는, 혈청내 항체는 단백질 A/G 비드에 의해 결합된다. 단백질 A/G 세파로즈 비드는 이후에 적합한 완충액(전형적으로 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl/1mM EDTA/ 1% 트리톤 X-100)내에서 세척하여 어떠한 결합하지 않은 표지된 단백질도 제거한다. 이는 원심분리, 상청액의 제거, 및 완충액 속에서의 재현탁의 3 라운드로 달성할 수 있다. 이후에, 부착된 태그된 단백질을 지닌 일부 비드를 수집하고 형광 판독기, 예를 들면, 스펙트라 막스 게미니 XS 플레이트 판독기[Spectra Max Gemini XS plate reader: 제조원: 몰레큘러 디바이시즈 인코포레이티드(Molecular Devices Inc)] 속에 둔다. 원래의 혈청 시료내 특이적인 자가항체/항체의 존재가 정량화된다. GFP의 경우에, 이는 472nm의 파장에서의 여기 및 512nm에서의 방사를 사용한다. 형광 여기는 사용된 형광단/태그에 의존할 것이지만 동시에 몇가지 상이한 태그된 단백질과 결합시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 상이한 돌연변이 PLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 독립적으로 태그하여 독립적으로 또는 동시에 분석할 수 있다. 이 방법의 감도는 검출 장치에 의존적이고, 보다 민감한 검출 장치를 사용함으로써 상당히 향상시킬 수 있다. 이러한 방법의 각종 변형 또한 이용할 수 있다.

스트렙토코커스 항원과 면역반응성인 항체를 검출하기 위한 본원에 기술된 검정을 또한 스트렙토코커스 감염을 검출하는데 유용한 다른 검정과 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 이들 검정(즉, ELISA)은 생물학적 시료에서 스트렙토코커스 핵산을 검출하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 검정과 결합시킬 수 있다. 달리는, ELISA 검정은 면역침전 검정과 결합시킬 수 있다. 또는, PCR-계 검정을 면역침전 검정과 결합시킬 수 있다. 본원에 기술된 각종 검정의 결합을 제공하여 검출 감도를 심지어 추가로 증가시키고 데이터의 음성적인 예측 값을 추가로 감소시킬 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 발현 벡터가 또한 사용하기에 적합할 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열("암호화 서열")에 작동적으로 연결된 플랭킹(flanking) 서열로 구성된다. 다른 양태에서 또는 이러한 양태의 조합시, 플랭킹 서열은 바람직하게는 암호화 서열의 복제, 전사 및/또는 해독에 영향을 미칠 수 있고 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. "작동적으로 연결된"으로 되는 것은, 핵산 서열이 배열됨으로써 이들의 유용한 기능을 수행함을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이러한 암호화 서열의 전사를 지시할 수 있는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 플랭킹 서열은, 정확하게 기능하지 않는 한, 암호화 서열과 연속적일 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 해독되었으나 전사되지 않은 개재 서열은 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 암호화 서열에 작동적으로 연결된 것으로 고려될 수 있다. 플랭킹 서열은 동종(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종(즉, 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터), 하이브리드(즉, 하나 이상의 공급원으로부터의 플랭킹 서열의 조합) 또는 합성일 수 있다. 숙주의 게놈내 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하도록 일반적으로 기능하는 서열일 수 있는 플랭킹 서열을 또한 이용할 수 있다.

특정 양태에서, 플랭킹 서열은 표적 세포내에서 고-수준 유전자 발현을 구동하는 전사 조절 영역인 것이 바람직하다. 전사 조절 영역은 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 리프레서(repressor) 요소, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 전사 조절 영역은 보존성이거나 조직- 또는 세포-유형 특이적일 수 있다(즉, 당해 영역은 다른 것과 비교하여 조직 또는 세포의 하나의 유형에서 보다 높은 전사 수준을 구동한다). 이와 같이, 전사 조절 영역의 공급원은 임의의 원핵 또는 진핵 유기체, 특정의 척추동물 또는 비척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있으며, 단, 플랭킹 서열은 숙주 세포 기관내에서 기능성이고 이에 의해 활성화될 수 있다. 광범위한 전사 조절 영역이 이용될 수 있다.

적합한 전사 조절 영역은 다른 것들 중에서, CMV 프로모터[즉, CMV-인터미디에이트 얼리 프로모터(CMV-immediate early promoter)], 진핵 유전자(즉, 에스트로겐-유도성 닭 오브알부민 유전자, 인터페론 유전자, 글루코코르티코이드-유도성 타이로신 아미노트랜스퍼라제 유전자, 및 티미딘 키나제 유전자); 및 주요 얼리 및 레이트(major early and late) 아데노바이러스 유전자 프로모터; SV40 얼리 프로모터 영역(참조: Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290 304-10), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스(RSV)의 3' 긴 말단 반복부(LTR) 내에 함유된 프로모터(참조: Yamamoto, et al., 1980, Cell 22 787-97); 헤르페스 단성 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 프로모터(참조: Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 1444-45), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(참조: Brinster et al., 1982, Nature 296 39-42); 원핵 세포 발현 벡터, 예를 들면, 베타-락타마제 프로모터(참조: Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31), 또는 tac 프로모터(참조: DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 21-25)를 포함한다. 조직- 및/또는 세포-유형 특이적인 전사 조절 영역은 예를 들면, 췌장 샘꽈리 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[참조: Swift et al., 1984, Cell 38 639-46, Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515]; 췌장 베타 세포내에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(참조: Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); 림프구 세포내에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(참조: Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44); 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포내에서 마우스 유선 종양 바이러스 조절 영역(참조: Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); 간내의 알부민 유전자 조절 영역(참조: Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76); 간내의 알파-페토-단백질 유전자 조절 영역(참조: Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58), 간내의 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(참조: Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71), 골수종 세포내에서 베타-글로빈 유전자 조절 영역(참조: Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46 89-94), 뇌에서 희소돌기아교세포내 수초 염기성 단백질 유전자 조절 영역(참조: Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12); 골격근내 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(참조: Sani, 1985, Nature 314 283-86); 및 시상하부내 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역(참조: Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78), 및 흑색종 세포내 타이로시나제 프로모터[참조: Hart, I. Semin Oncol 1996 Feb; 23(1): 154-8, Siders, et al. Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct; 5(5): 281-91]을 포함한다. 다른 적합한 프로모터는 당해 분야에 공지되어 있다.

핵산 분자는 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 일부로 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, DNA 벡터를 이용하여 표적화된 면역원 및/또는 관련된 분자(즉, 공동-자극 분자, 사이토킨 또는 케모킨)를 암호화하는 핵산을 환자에게 전달한다. 이렇게 함에 있어서, 각종 전략을 이용하여, 예를 들면, 자가-복제하는 바이러스 레플리콘(참조: Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55), 코돈 최적화(참조: Liu, et al. 2000. Mol. Ther., 1: 497-500; Dubensky, supra, Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951), 생체내 전기천공(참조: Widera, et al. 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640), 공동-자극 분자, 사이토킨 및/또는 케모킨을 암호화하는 핵산의 도입(참조: Xiang, et al. 1995. Immunity, 2: 129-135; Kim, et al. 1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103; Iwasaki, et al. 1997. J. Immunol. 158: 4591-3601; Sheerlinck, et al. 2001. Vaccine, 19: 2647-2656), CpG와 같은 자극성 모티프의 혼입(참조: Guainathan, supra, Leitner, supra), 세포내이입 또는 유비퀴틴-프로세싱 경로의 표적화용 서열(참조: Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166: 5366-5373), 프라임-부스트(prime-boost) 요법(참조: Guainathan, supra, Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74), 프로테아좀-민감성 분해 부위, 및 살모넬라와 같은 점막 전달 벡터의 사용(참조: Darji, et al. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine, 19: 2945-2954)을 포함하는 이러한 메카니즘의 효능을 개선시킬 수 있다. 다른 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 하기에 기술되어 있다.

핵산을 숙주내로 도입시키기 위해 성공적으로 도입된 각종 바이러스 벡터는 다른 것들 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스를 포함한다. 벡터는 당해 분야의 숙련가에게 광범위하게 이용가능한 표준 재조합 기술을 사용하여 작제할 수 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)]과 같은 일반적인 분자생물학 참조문헌에서 찾을 수 있다.

바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스의 유도체 및 쥐 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 적합한 레트로바이러스 벡터의 예는 예를 들면, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하베이 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus: HaMuSV), 쥐 유선 종양 바이러스(MuMTV), SIV, BIV, HIV 및 라우스 육종 바이러스(RSV)를 포함한다. 다수의 레트로바이러스 벡터는 다수의 외인성 핵산 서열을 혼입할 수 있다. 재조합 레트로바이러스는 결손이 있으므로, 이들은 감염성 벡터 입자를 생산하기 위한 보조를 필요로 한다. 이러한 보조는 예를 들면, 레트로바이러스 구조 유전자를 암호화하는 헬퍼 세포주에 의해 제공될 수 있다. 적합한 헬퍼 세포주는 다른 것들 중에서 Ψ2, PA317 및 PA12를 포함한다. 이후에, 이러한 세포주를 사용하여 생산된 벡터 비리온(virion)을 사용하여 NIH 3T3 세포와 같은 조직 세포주를 감염시킴으로써 다량의 키메라 레트로바이러스 비리온을 생산할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 전통적인 방법(즉, 주사)에 의해 또는 표적 세포 집단에 근접한 "생산자 세포주"의 이식에 의해 투여할 수 있다[참조: Culver, K., et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5 (3): 343-79; Culver, K., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59: 685-90); Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (1): 39-69]. 생산자 세포주는 바이러스 벡터를 생산하고 표적 세포의 주변에 바이러스 입자를 방출하기 위해 조작된다. 방출된 바이러스 입자의 일부는 표적 세포와 접촉하여 이들 세포를 감염시킴으로써, 핵산을 표적 세포내로 전달한다. 표적 세포의 감염에 이어서, 벡터의 핵산의 발현이 발생한다.

아데노바이러스 벡터는 진핵 세포내로의 유전자 전달[참조: Rosenfeld, M., et al., 1991, Science, 252 (5004): 431-3; Crystal, R., et al., 1994, Nat. Genet., 8(1): 42-51], 진핵세포 유전자 발현의 연구[참조: Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101 (2) 195-202], 백신 개발(참조: Graham, F and Prevec, L, 1992, Biotechnology, 20: 363-90), 및 동물 모델[참조: Stratford-Perricaudet, L, et al., 1992, Bone Marrow Transplant., 9 (Suppl. 1) 151-2 , Rich, D., et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (4) 461-76]에 특히 유용한 것으로 입증되어 왔다. 재조합 Ad를 생체내에서 상이한 조직내로 투여하기 위한 실험 경로는 다른 것들 중에서도 기관삽관 점적주입[참조: Rosenfeld, M., et al., 1992, Cell, 68 (1) 143-55), 근육내 주사[참조: Quantin, B., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89 (7) 2581-3], 말초 정맥내 주사[참조: Herz, J., and Gerard, R., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (7) 2812-6] 및 뇌로의 정위 접종(stereotactic inoculation)[참조: Le Gal La Salle, G., et al., 1993, Science, 259 (5097) 988-90]을 포함한다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 숙주 세포 게놈내로 통합시 고수준의 감염성, 광범위한 숙주 범위 및 특이성을 입증한다[참조: Hermonat, P., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (20) 6466-70]. 헤르페스 단성 바이러스 제1형(HSV-1)은 이의 향정신 특성으로 인하여 특히 신경계에서 사용하기 위한 또 다른 매력적인 벡터 시스템이다[참조: Geller, A , et al., 1991, Trends Neurosci., 14 (10) 428-32, Glorioso, et al., 1995, Mol. Biotechnol., 4(1): 87-99; Glorioso, et al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49 675-710].

폭스바이러스는 다른 유용한 발현 벡터[참조: Smith, et al. 1983, Crene, 25 (1): 21-8; Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38; Moss, et al. 1991. Science, 252: 1662-1667]이다. 유용할 것으로 밝혀진 폭스바이러스는 다른 것들 중에서 백시니아(vaccinia), NYVAC, 아비폭스(avipox), 포울폭스(fowlpox), 카나리폭스(canarypox), ALVAC, 및 ALVAC(2)를 포함한다.

NYVAC(vP866)는 공지되거나 강력한 발병 인자를 암호화하는 게놈의 6개의 필수적이지 않은 영역을 제거함으로써 백시니아 바이러스의 코펜하겐(Copenhagen) 백신 균주로부터 기원하였다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,364,773호 및 제5,494,807호). 결실 유전자위치는 또한 외부 유전자의 삽입을 위한 수용체 유전자위치로 조작되었다. 결실된 영역은 티미딘 키나제 유전자(TK, J2R) vP410, 출혈열 영역(u; B13R+B14R) vP553; A 유형 봉입체 영역(ATI; A26L) vP618; 헤마글루티닌 유전자(HA; A56R) vP723; 숙주 범위 유전자 영역(C7L-K1L) vP804; 및 거대 서브유닛, 리보뉴클레오타이드 리덕타제(I4L) vP866이다. NYVAC는 발병력 및 숙주 범위와 관련된 유전자 생성물을 암호화하는 18개의 개방 판독 프레임의 특이적인 결실에 의해 생성된 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스이다. NYVAC는 TA를 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,265,189호). NYVAC (vP866), vP994, vCP205, vCP1433, placZH6H4L리버스, pMPC6H6K3E3 및 pC3H6FHVB는 또한 각각 수탁번호 VR-2559, VR-2558, VR-2557, VR-2556, ATCC-97913, ATCC-97912, 및 ATCC-97914로서 부다페스트 조약 하에 ATCC에 기탁되었다.

ALVAC-계 재조합 바이러스(즉, ALVAC-1 및 ALVAC-2)는 또한 사용하기에 적합하다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,756,103호). ALVAC(2)는, ALVAC(2) 게놈이 백시니아 프로모터의 조절하에서 백시니아 E3L 및 K3L 유전자를 포함한다는 것 외에는 ALVAC(1)과 동일하다(참조: 미국 특허 제6,130,066호; Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993). ALVAC(1) 및 ALVAC(2)는 외부 DNA 서열, 예를 들면, TA(참조: Tartaglia et al., 1993 a,b; 미국 특허 제5,833,975호)를 발현시키는데 유용한 것으로 입증되었다. ALVAC는 ATCC 수탁번호 VR-2547로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 부다페스트 조약하에 기탁되었다.

다른 유용한 폭스바이러스 벡터는 TROVAC이다. TROVAC은 1일령 병아리의 백신접종용으로 허가된 포울폭스바이러스의 FP-1 백신 균주로부터 기원한 플라크-클로닝된 분리주였던 약독화된 포울폭스를 말한다. TROVAC은 또한 수탁번호 2553으로 ATCC에 부다페스트 조약하에 기탁되었다.

"비-바이러스" 플라스미드 벡터가 또한 특정 양태에서 적합할 수 있다. 바람직한 플라스미드 벡터는 세균, 곤충 및/또는 포유동물 숙주 세포에 적합하다. 이러한 벡터는 예를 들면, PCR-II, pCR3 및 pcDNA3.1[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 샌 디에고 소재], pBSII[제조원: 스트라타젠(Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라 소재], pET15[제조원: 노바겐(Novagen), 위스콘신주 매디슨 소재], pGEX[제조원: 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), 뉴저지주 피츠카타웨이 소재], pEGFP-N2[제조원: 클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로알토 소재], pETL(BlueBacII, 제조원: 인비트로겐), pDSR-알파(PCT 공보 제WO 90/14363호) 및 pFastBacDual[제조원: 기브코-비알엘(Gibco-BRL), 뉴욕주 그랜스 아일랜드 소재], 및 Bluescript^® 플라스미드 유도체[고 카피 수 COLE1-계 파지미드, 제조원: 스트라타젠 클로닝 시스템스(Stratagene Cloning Systems), 캘리포니아주 라 졸라 소재], 태크-증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드(예를 들면, TOPO™ TA cloning^® 키트, PCR2.1^® 플라스미드 유도체, 제조원: 인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 포함한다. 세균 벡터가 또한 사용될 수 있다. 이들 벡터는 예를 들면, 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 락토바실러스(Lactobacillus), 바실 칼메트 구에린[Bacille calmette guerin(BCG)], 및 스트렙토코커스(참조: 예를 들면, WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; 및 WO 92/21376)를 포함한다. 많은 다른 비-바이러스 플라스미드 발현 벡터 및 시스템은 당해 분야에 공지되어 있으며 사용될 수 있다.

예를 들면, DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접적인 주입, CaPO₄ 침전, 유전자 총 기술(gene gun technique), 전기천공 및 콜로이드성 분산 시스템을 포함하는 다른 전달 기술이 또한 충분할 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캅셀, 미세구, 비드 및 수중유 유제, 미셀(micelle), 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함한다. 바람직한 콜로이드성 시스템은 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소포인 리포좀이다. RNA, DNA 및 완전한 비리온은 수성 내부 속에 봉입될 수 있으며 생물학적으로 활성인 형태로 세포에 전달된다(참조: Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77). 리포좀 조성물은 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 배합된 인지질, 특히 고-상-전이-온도 인지질의 배합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질을 또한 사용할 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 리포좀 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드와 같은 포스파티딜 화합물을 포함한다. 디아실포스파티딜글리세롤이 특히 유용하며, 여기서, 지질 잔기의 탄소수는 14 내지 18, 특히 16 내지 18이며 포화되어 있다. 예시적인 인지질은 난황 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다.

벡터를 포함하는 배양된 세포가 또한 제공된다. 배양된 세포는 벡터 또는 세포의 후대로 형질감염된 배양된 세포일 수 있으며, 여기서, 세포는 면역원성 폴리펩타이드를 발현한다. 적합한 세포주는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)을 통해 이용가능하다. 형질감염된 세포는 면역원성 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 당해 방법은 면역원성 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건하에, 임의로 발현 서열의 조절하에서, 벡터를 포함하는 세포를 배양함을 포함한다. 면역원성 폴리펩타이드는 세포 또는 배양 배지로부터 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 분리할 수 있다.

본원에 기술된 폴리펩타이드 및 핵산은 숙주에게 투여하기 전에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 합해질 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생물학적으로 또는 달리는 바람직하지 않은 물질이며, 즉, 당해 물질은 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 이것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 어떠한 성분들과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 담체는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있는 바와 같이, 천연적으로 활성 성분의 어떠한 분해도 최소화하고 대상체에서 어떠한 부작용도 최소화하도록 선택될 수 있다.

적합한 약제학적 담체 및 이들의 제형은 예를 들면, 문헌[참조: Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, David B Troy, ed, Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기술되어 있다. 전형적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염이 등장성 제형이 되도록 하기 위해 제형 속에서 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 멸균수, 염수, 링거액(Ringer's solution)과 같은 완충 용액, 및 덱스트로즈 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 7.5이다. 다른 담체는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 서방성 제제를 포함한다. 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름, 리포좀 또는 미세입자의 형태일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게는, 특정 담체가 보다 바람직하게는 예를 들면, 투여되는 조성물의 투여 경로 및 농도에 의존할 수 있음이 명백할 것이다. 담체는 사람 또는 다른 대상체에게 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 투여하기에 적합한 것들이다.

약제학적 조성물은 또한 면역원성 폴리펩타이드 외에, 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 방부제, 표현 활성제, 보조제, 면역자극인자를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항미생물제, 소염제 및 마취제와 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 보조제는 또한 면역 반응을 자극하거나 향상시키기 위해 포함될 수 있다. 적합한 부류의 보조제의 비-제한적 예는 다른 것들 중에서 겔-형(즉, 수산화알루미늄/인산알루미늄("명반 보조제"), 인산칼슘, 미생물 기원[무라밀 디펩타이드(MDP)], 세균 외독소[콜레라 독소(CT), 천연 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB), 이. 콜라이(E. coli) 불안정 독소(LT), 백일해 독소(PT), CpG 올리고뉴클레오타이드, BCG 서열, 테타누스 독소, 예를 들면, 이. 콜라이, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 또는 시겔라 엑스세리(Shigella exseri)의 모노포스포릴 지질 A(MPL)], 입자화된 보조제(생분해가능한, 중합체 미세구), 면역자극 복합체(ISCOM)], 오일-유액 및 표면활성제-계 보조제[프로인트 불완전 보조제(FIA), 미세유동화된 유액(MF59, SAF), 사포닌(QS-21)], 합성(무라밀 펩타이드 유도체(무라부티드, 트레오니-MDP), 비이온성 차단 공중합체(L121), 폴리포스파젠(PCCP), 합성 폴리뉴클레오타이드(폴리 A:U, 폴리 I:C), 탈리도미도 유도체(CC-4407/ACTIMID), RH3-리간드 또는 폴리락타이드 글리콜라이드(PLGA) 미세구의 것들을 포함한다. 이들 독소에 대한 단편, 유사체, 유도체 및 융합체가 또한 적합하며, 단, 이들은 보조제 활성을 보유한다. 보조제의 적합한 돌연변이체 또는 변이체는 예를 들면, 제WO 95/17211호(Arg-7-Lys CT 돌연변이체), 제WO 96/6627호(Arg-192-Gly LT 돌연변이체), 및 제WO 95/34323호(Arg-9-Lys 및 Glu-129-Gly PT 돌연변이체)에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 추가의 LT 돌연변이체는 예를 들면, Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp, 및 Glu-112-Asp 돌연변이체를 포함한다.

명반 보조제와 같은 금속성 염 보조제는 안전한 부형제에 보조 활성을 제공하는 것으로 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이들 보조제의 작용 메카니즘은, 항원이 투여 후 3주까지 주사 부위에 머물 수 있도록 항원 데포트의 형성, 및 또한 항원 발현 세포에 의해 보다 용이하게 흡수되는 항원/금속성 염 복합체의 형성을 포함하는 것으로 고려된다. 알루미늄 외에, 다른 금속성 염을 사용하여 아연, 칼슘, 세륨, 크로뮴, 철 및 베릴륨의 염을 포함하는 항원을 흡수한다. 알루미늄의 수산화물 및 인산염 염이 가장 일반적이다. 알루미늄 염, 항원 및 추가의 면역자극인자를 함유하는 조성물 또는 제형은 당해 분야에 공지되어 있다. 면역자극제의 예는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다.

보조제처리된 면역화의 하나의 양태에서, 예를 들면, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편은 세균 다당류에 공유결합적으로 커플링되어 다당류 접합체를 형성할 수 있다. 이러한 접합체는 예를 들면, mPLY 및/또는 이의 단편에 접합된 세균 다당류에 대해 지시된 T 세포 의존성 면역원성 반응을 유발시키기 위한 면역원으로서 유용할 수 있다.

하나 이상의 사이토킨이 또한 폴리펩타이드로서 또는 핵산에 의해 암호화된 것으로서 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편과 함께 사용하기에 적합한 공동-자극 성분들일 수 있다[참조: Parmiani, et al Immunol Lett 2000 Sep 15; 74(1): 41-3; Berzofsky, et al Nature Immunol. 1: 209-219]. 적합한 사이토킨은 예를 들면, 인터루킨-2(IL-2)[참조: Rosenberg, et al. Nature Med. 4 321-327 (1998)], IL-4, IL-7, IL-12[참조: reviewed by Pardoll, 1992, Harries, et al. J. Gene Med 2000 Jul-Aug; 2(4): 243-9; Rao, et al. J. Immunol. 156 3357-3365 (1996)], IL-15(참조: Xin, et al. Vaccine, 17 858-866, 1999), IL-16[참조: Cruikshank, et al. J. Leuk Biol. 67(6): 757-66, 2000], IL-18[참조: J. Cancer Res. Clim. Oncol. 2001. 127(12): 718-726], GM-CSF[CSF (참조: Disis, et al Blood, 88 202-210 (1996)], 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 또는 인터페론-감마(INF-γ)를 포함한다. 다른 사이토킨도 또한 당해 분야에 공지된 바와 같이 사용하기에 적합할 수 있다.

용어 "항체" 또는 "항체들"은 정제되지 않거나 부분적으로 정제된 형태(즉, 하이브리도마 상청액, 복수, 폴리클로날 항혈청) 또는 정제된 형태의 전체 또는 단편화된 항체를 포함한다. "정제된" 항체는 초기에 발견된(즉, 하이브리도마 상청액 또는 복수액 제제의 일부로서) 단백질의 적어도 약 50%로부터 분리된 것이다. 바람직하게는, 정제된 항체는 초기에 발견된 단백질의 적어도 약 60%, 75%, 90%, 또는 95%로부터 분리된다. 적합한 유도체는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 단편[즉, Fab, Fab₂ 또는 단일쇄 항체(예를 들면, Fv)]를 포함할 수 있다. 항체는 예를 들면, 쥐(즉, 쥐 하이브리도마 세포에 의해 생산된)를 포함하는 특정의 적합한 기원 또는 형태일 수 있거나, 사람화된 항체, 키메라 항체, 사람 항체 등으로 발현될 수 있다.

각종 유형의 항체를 제조하고 이용하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며 사용하기에 적합하다[참조: 예를 들면, Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998, Kohler and Milstein, Nature, 256 495 (1975)); Jones et al Nature, 321 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-329 (1988); Presta (Curr Op. Staict. Biol., 2: 593-596(1992); Verhoeyen et al. (Science, 239 1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581(1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al. , Nature 368 856-859 (1994) Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995), 및 미국 특허 제4,816,567호; 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호]. 특정 적용에서, 항체는 하이브리도마 상청액 또는 복수액내에 함유될 수 있으며 자체로서 또는 농도에 따라 표준 기술을 사용하여 직접 이용될 수 있다. 다른 적용에서, 항체는 예를 들면, 염 분획화 및 이온 교환 크로마토그래피, 또는 아가로즈 비드와 같은 고체 지지체에 공유결합적으로 커플링된 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 및/또는 단백질 L 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 또는 이들 기술의 조합을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 항체는 동결된 제제(즉, -20℃ 또는 -70℃)로서, 동결건조된 형태로, 또는 정상의 냉장 조건(즉, 약 4℃)을 포함하는 어떠한 적합한 형식으로도 저장할 수 있다. 액체 형태로 저장하는 경우, 트리스-완충된 염수(TBS) 또는 인산염 완충된 염수(PBS)와 같은 적합한 완충제를 이용하는 것이 바람직하다. 항체 및 이들의 유도체는 시험관내 또는 생체내에서 사용하기 위해 본원에 기술된 조성물내에 혼입될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 이용가능한 항체를 제조하고 사용하는 다른 방법이 또한 사용하기에 적합할 수 있다.

또한, 환자의 생물학적 시료속에서 항체 또는 핵산을 검출함으로써 환자에서 스트렙토코커스 감염의 존재를 검출하는 키트가 제공된다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 항원(예를 들면, mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편)은 생물학적 시료속에서 항-스트렙토코커스 항체를 검출하거나 진단하기 위한 키트의 일부를 형성할 수 있다. 항원은, 성분들을 외부 환경으로부터 보호하는 바이알과 같은 적합한 용기 속에 제공될 수 있다. 따라서, 시료에서 항-스트렙토코커스 항체를 검출하기 위한 키트는 하나 이상의 돌연변이 PLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편과 함께 제공된 항원에 대해 시료속의 하나 이상의 항체의 결합을 측정하기 위한 하나 이상의 검출 시약을 포함할 수 있다. 키트는 바람직하게는: (i) 하나 이상의 분리되고 정제된 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편, 및 (ii) 임의로 사용 지침서와 함께 포장된 항원-항체 복합체의 형성을 검출하기 위한 시스템을 포함한다. 항원은 용액 속에서 유리되거나 자기 비드, 튜브, 마이크로플레이트 웰 또는 칩과 같은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 특정 양태에서, 분리되고 정제된 mPLY 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편 또는 이에 흡수된 융합 단백질 또는 단백질 응집체를 포함하는 고체 매트릭스가 제공된다. 일부 양태에서, 키트는 또한 검출 시약으로서 항체-결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 항체-결합 분자는 포획 또는 검출 시약일 수 있으며, 용액 속에서 유리될 수 있거나 자기 비드, 튜브, 마이크로플레이트 웰 또는 칩과 같은 고체 지지체상에 고정될 수 있다. 항체-결합 분자 또는 폴리펩타이드는 예를 들면, 형광 또는 발색 표지와 같은 검출가능한 표지 또는 바이오틴과 같은 결합 잔기로 표지될 수 있다. 적합한 표지는 상기에 보다 상세히 기술된다. 키트는 또한 기질, 예를 들면, 표지 또는, 효소 접합체와 같은 분자와 반응하고, 표지에 결합하여, 시그날 및/또는 면역침전용 시약(즉, 단백질 A 또는 단백질 G 시약)을 생산하는 기질, 예를 들면, 발색, 형광 또는 화학발광 기질과 같은 검출 시약을 추가로 포함할 수 있다. 검출 시약은 또한 완충제 용액, 세척 용액 및 다른 유용한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 개체로부터 시료를 수득할 수 있는 장치(예를 들면, 침, 란셋(lancet) 및 수집 튜브 또는 용기) 및 개체로부터 수득된 시료를 취급하고/하거나 저장하기 위한 장치 중 하나 또는 둘다를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예를 들면, 본원에 기술된 것으로서, 시험 시료 속에 항-스트렙토코커스 항체를 검출하는 방법에서 항원을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 검정이 PCR과 같은 다른 유형의 검정과 결합되는 경우, 이러한 검정에 요구되는 시약(즉, 프라이머, 완충제 등)이 임의로 이의 사용을 위한 지시와 함께 또한 포함될 수 있다.

명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")는, 내용이 달리 명확히 나타내지 않는 한, 복수 관계를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단편에 대한 참조는 단편들의 혼합물을 포함할 수 있으며 약제학적 담체 또는 보조제에 대한 참조는 2개 이상의 이러한 담체 또는 보조제의 혼합물을 포함할 수 있다.

용어 "약", "대략" 등은, 수치 또는 범위의 목록에 앞서있는 경우, 목록 또는 범위내 각각의 개개 수치가 이러한 용어에 의해 즉시 선행되는 경우와는 독립적인 목록 또는 범위내 각각의 개별 수치를 말한다. 당해 용어는, 동일하게 참조한 값이 정확하게, 이에 근접하여 또는 이와 유사함을 의미한다.

본원에 사용된 대상체 또는 숙주는 개체임을 의미한다. 대상체는 고양이 및 개와 같은 애완 동물, 가축(예: 소, 말, 돼지, 양 및 염소), 실험실 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피크) 및 조류를 포함할 수 있다. 하나의 국면에서, 대상체는 영장류 또는 사람과 같은 포유동물이다.

임의의 또는 임의로는, 후속적으로 기술된 현상 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없으며, 당해 기술이, 현상 또는 상황이 발생하는 예 및 발생하지 않는 예를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 어절 '임의로 조성물은 조합물을 포함할 수 있다'는, 당해 기술이 조합물 및 조합물(즉, 조합물의 개개의 구성원)의 부재 둘다를 포함함으로써 조성물이 상이한 분자의 조합물을 포함할 수 있거나 조합물을 포함할 수 없음을 의미한다.

범위는 본원에서 약 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 약 다른 특정 값까지를 나타낼 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 다른 국면은 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값들이 선행하여 약 또는 대략을 사용하여 대략치로서 표현되는 경우, 이는, 특정 값이 다른 국면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 상기 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 및 다른 종점과는 독립적으로 둘다 상당함을 이해할 것이다. 범위(예를 들면, 90 내지 100%)는 당해 범위 등 및 각각의 값이 개별적으로 열거되는 경우와 같이 범위내 각각의 독립적인 값을 포함함을 위미한다.

용어 '예방하다', '예방하는' 및 '예방'이 본원에서 제공된 상태에 대한 제공된 치료(예를 들면, 스트렙토코커스 종에 의한 감염 예방)와 관련하여 본원에서 사용되는 경우, 치료된 환자는 결국 임상적으로 관측가능한 수준의 상태로 진행되지 않거나, 그가/그녀가 치료를 받지않은 것 보다 더 서서히 및/또는 보다 적은 정도로 진행됨을 전달하기 위함임을 의미한다. 이들 용어들은, 환자가 어떠한 상태의 국면을 경험하지 않은 상태만으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 치료는, 환자가 제공된 상태의 만연을 생산하는 것으로 예측되는 자극에 노출되는 동안 제공되어, 달리 예측한 것보다 상태의 적은 및/또는 가벼운 증상에 대한 환자의 경험을 초래하는 상태를 예방하는 것으로 일컬어질 것이다. 치료는, 환자가 감염의 단지 가벼운 과잉 증상만을 나타내도록 함으로써 감염을 "예방"할 수 있으며; 이는 감염 미생물에 의한 특정 세포의 침투가 없어야 함을 내포하지는 않는다.

유사하게, 제공된 치료를 사용한 감염 리스크와 관련하여 본원에 사용된 '감소하다', '감소하는' 및 '감소'(예를 들면, 폐렴구균성 감염의 위험의 감소)는 전형적으로 치료(예를 들면, mPLY를 사용한 투여 또는 백신접종)의 부재하에서 감염으로 진행되는 기본 수준 또는 대조군과 비교하여 보다 느리거나 보다 적은 정도의 감염으로 진행되는 대상체를 말한다. 감염 위험에 있어서의 감소는, 환자가 감염의 단지 가벼운 과잉 증상 또는 감염의 지연된 증상만을 나타낼 수 있으며; 이는, 감염 미생물에 의해 어떠한 세포의 침투도 존재하지 않아야 함을 내포하지는 않는다.

본 기재내용에 인용된 모든 참고 문헌은 이의 전문이 참조로 인용되어 있다. 특정 양태는 또한 다음 실시예에 기술되어 있다. 이들 양태는 단지 예로서 제공되며 어떠한 방식으로도 특허청구범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1

wtPLY 및 His - 태그된 wtPLY 에 대한 발현 플라스미드의 생성

wtPLY를 암호화하는 ply 유전자는 PCR에 의해 에스. 뉴모니아에 균주 R36A(서열번호 1, 진뱅크 등록번호 M17717)로부터의 프라이머 Spn001 (CATGCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC; 서열번호 45) 및 Spn002 (CAGCCGCTCGAGCTAGTCATTTTCTACCTTATCCTC; 서열번호 46)을 사용하여 클로닝하였다. PCR 생성물을 제한 효소 NcoI 및 XhoI으로 분해하고 플라스미드 pTrcK내로 클로닝하였다. 플라스미드 pTrcK는 플라스미드 pTrcHis2(제조원: 인비트로겐)의 카나마이신-내성 유도체이다. 이렇게 생성된 플라스미드(pBM46)를 trc 프로모터의 조절하에 wtPLY(비-표적화된 PLY 폴리펩타이드 생산)의 발현을 위해 사용하였다. 앰플리콘의 DNA 서열은 서열번호 2에 나타낸 유추된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 1의 공개된 ply 서열과 동일하였다. wtPLY-암호화 핵산을 pET-28a[이엠디 바이오사이언시즈(EMD Biosciences) 제품 번호 69864-3] (NcoI-XhoI)내로 형질감염시켜 플라스미드 pJMS102(T7 프로모터로부터 비-표적화된 wtPLY 발현 제공)를 생성하였다. 이후에, 동일한 유전자를 PCR에 의해 플라스미드 pJMS102로부터의 프라이머 14913.JY(GAAGGAGATATCATATGGCAAATAAAGCAG; 서열번호 47) 및 14914.JY(CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC; 서열번호 48)를 사용하여 pET-28a(NdeI-XhoI)내로 역 클로닝함으로써, 플라스미드 pJMS112(T7 프로모터로부터 His-태그된 wtPLY 발현 제공)를 수득하였다.

실시예 2

PLY ( T65C , G293C , C428A )( PlyD1 ) 및 His - 태그된 PlyD1 에 대한 발현 플라스미드의 생성

실시예 1로부터의 플라스미드 pJMS112를 부위-지시된 돌연변이유발용 주형으로 사용하여 발현된 PLY 폴리펩타이드를 변형시켰다. 부위-지시된 돌연변이유발은 퀵체인지 다중 부위-지시된 돌연변이유발 키트(QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit)를 사용하여 제조업자의 지시[제조원: 아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 스트라타젠 프로덕츠 디비젼(Stratagene Products Division), 캘리포니아주 라 졸라 소재]에 따라 수행하였다. 다음 변형을 PLY 암호화 뉴클레오타이드 서열내로 도입하였다:

Thr65에 대한 코돈은 ACC로부터 트레오닌(T) 대신에 시스테인(C)을 암호화하는 TGC로 변화시켰고(T65C);

Gly293에 대한 코돈은 GGG로부터 글리신(G) 대신에 시스테인(C)을 암호화하는 TGC로 변화시켰고(G293C);

Cys428에 대한 코돈은 TGT로부터 시스테인(C) 대신에 알라닌(A)을 암호화하는 GCT로 변화시켰다(C428A).

부위-지시된 돌연변이유발로부터 수득되는 플라스미드는 pJAY7이라 명명하였고 His-태그된 PLY(T65C, G293C, C428A)(His-PlyD1)의 발현을 위해 제공하였다. 플라스미드 pJAY7을 NdeI 및 XhoI을 사용하여 분해함으로써 이로부터 1420bp의 ply 유전자를 분리하였다. 1420 bp 단편을 겔 정제한 후 NdeI-XhoI 절단 부위로 연결하고 pET-30a(이엠디 바이오사이언시즈 제품 번호 69909-3)로 탈포스포릴화하였다. 수득되는 플라스미드를 pJMS140으로 명명하고, T7 프로모터로부터 비-태그된 PlyD1 발현을 제공하였다. PlyD1을 암호화하는 돌연변이된 ply 유전자의 서열을 하기 표 3에 나타낸 프라이머를 사용하여 확인하였다.

표 3의 프라이머를 사용하여 돌연변이된 ply 서열의 서열분석으로 돌연변이된 서열이 예측된 바와 같은지를 확인하였다. PlyD1의 발현은 이. 콜라이 BL21(DE3)을 플라스미드 pJMS140으로 화학적 형질전환시켜 확인하였다. 분자량이 대략 55kDa인 PlyD1이 발현되었다.

실시예 3

PlyD1 PLY(T65C, G293C, C428A)의 정제

보다 다량의 PlyD1(서열번호 44; T65C, G293C, C428)을 수득하기 위하여 이. 콜라이 발현 시스템을 사용하여 pET30A 플라스미드내에서 재조합 단백질(약 55 kDa)로서 발현시켰다. 이. 콜라이 발현된 재조합 PlyD1 단백질을 20L 발효기 속에서 성장시켰다. 세포를 고압에서 균질화시켜 가용성 PlyD1을 방출시키고 트리스 완충된 염수 속에 여과작용시켜 PlyD1의 조 추출물을 생산하였다. 조 PlyD1 추출물은 사용 전에 0.2 μm 여과하였다. 여과된, 조 추출물을 강한 음이온 교환 기가 캡(Giga Cap) Q-650 M 컬럼[제조원: 도쇼 바이오사이언시즈(Tosoh Biosciences)]을 통과시켰다. 결합되지 않은 오염 단백질을 유동-여과로 제거하고 평형 완충액(20 mM 트리스-HCl, pH 8.5)으로 추적하였다. 중간 세척 단계를 100 mM NaCl을 함유하는 평형 완충제를 사용하여 수행하였다. 결합된 PlyD1을 250mM NaCl을 함유하는 20 mM 트리스-HCl, pH 8.5로 용출시켰다. 당해 컬럼 크로마토그래피 단계로부터 회수된 PlyD1 물질을 이후에 5M NaCl 용액으로 조건화하여 전도성이 약 80 mS/cm이 되도록 하였다.

이후에, 조건화된 PlyD1 물질을 페닐 세파로즈 FF[제조원: 지이 헬쓰 케어(GE Health Care)]을 사용하는 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다. PlyD1을 결합 및 용출 방식으로 정제하였다. 결합되지 않은 단백질은 컬럼을 1M NaCl 평형 완충제로 세척하여 제거하고 결합된 PlyD1은 20 mM 트리스-HCl 완충제, pH 8.0으로 용출시켰다.

이후에, 페닐 세파로즈-정제된 PlyD1 물질을 5 mM 인산나트륨(pH 6.2)로 4배 희석하여 결합 용액의 전도성 및 pH를 감소시켰다. 이후에, 당해 물질을 세라믹 하이드록시아파타이트 제I 유형 40 μm 수지[제조원: 바이로라드(BioRad)]를 사용하여 추가로 정제하였다. 평형 완충제는 5 mM 인산나트륨, pH 6.2이었다. PlyD1을 결합 및 용출 방식을 사용하여 당해 혼합 방식 컬럼 크로마토그래피 수지 상에서 2회 정제하였다. 오염물을 5 mM 인산나트륨, pH 7.0, 750 mM NaCl을 사용하여 제거하고 결합된 PlyD1을 1M NaCl을 함유하는 10 mM 인산나트륨, pH 7.0으로 용출시켰다.

3회 컬럼 단계 후, 정제된 PlyD1을 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 완충제 속에서 여과작용시켰다. 트윈-80을 0.05%의 최종 농도로 가하여 PlyD1 침전을 방지하였다. 정제된 PlyDI 다량의 물질을 0.2 μM 여과하고 후속적으로 상이한 농도에서 제형화하였다. 전형적인 정제 방법으로 SDS-PAGE 분석을 기초로 순도가 >98%인 정제된 PlyD1 단백질 600 내지 850 mg/L를 수득하였다(도 4).

실시예 4

시험관내 용혈 검정

PLY 폴리펩타이드의 세포용해 활성을 시험관내 용혈 검정으로 통상적으로 평가하였다. 일반적으로, 시험 단백질을 플라스틱 미세역가 플레이트를 따라 2배 일련 희석 속에서 0.5mg/mL의 시험 단백질의 최대 농도로 일련 희석한다. BSA는 플라스틱 미세역가 플레이트상에서 흡수성 손실을 방지하기 위해 포함된다. 양 적혈구 세포를 모든 웰에 가하고, 플라스틱 미세역가 플레이트를 30분 동안 항온처리한다. 분해된 세포는 헤모글로빈을 방출한다. 양성 대조군의 경우, 100% 분해 측정이 1% 트리톤 X-100의 첨가에 의해 수득된다. 음성 대조군의 경우, 양 적혈구 세포를 PBS만으로 항온처리하였다. 미세역가 플레이트를 원심분리하여 분해된 세포로부터 완전한 세포를 분리한다. 분해된 세포를 함유하는 상청액을 새로운 플레이트로 이전하여 A₅₄₀ 헤모글로빈 방출 검정에 적용시켰다. 특이적인 활성은, 50% 용혈이 양성 대조군에 대해 발생하는 단백질 농도(mg/mL)의 역수로 측정한다. 대표적인 용혈 검정 시스템은 하기에 나타낸다:

1. 50 μL의 행크스 완충된 염수 용액(HBSS) + 0.5% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 96-웰 환저 미세역가 플레이트의 웰 모두에 가한다.

2. 시험 단백질(예를 들면, PlyD1) 및 음성의 비가역적 단백질 대조군의 스톡을 1 mg/mL의 최종 농도로 HBSS + 0.5% BSA를 사용하여 희석시킨다.

3. HBSS + 0.5% BSA로 희석시켜 세척된 혼주된 세포[제조원: 록랜드 이뮤노케미칼(Rockland Immunochemical), 제품 번호 R405-0050)의 10% 스톡으로부터 3% 양 적혈구 세포(RBC) 현탁액을 제조한다.

4. 50 μL의 1 mg/mL 시험 단백질(예를 들면, PlyD1)(및 완충제 및 비가역적 단백질 대조군)을 플레이트 1 컬럼 2에 가하고, 2개 행(2개 행내 2 내지 12개 컬럼)을 따라 일련 희석(1:2)한다. 따라서, 회수된 단백질 농도의 범위는 500 μg/mL 내지 0.000238 μg/mL일 것이다. 컬럼 1을 완충제 블랭크(하기 단계 7 참조), 음성 대조군(하기 단계 6 참조), 및 100% 분해 대조군(하기 단계 5 참조)를 위해 보존한다.

5. 100% 분해 대조군의 설정: 10 μL의 HBSS + 0.5% BSA를 컬럼 1/행 A 내지 C로부터 제거한다. HBSS + 0 5% BSA 중 10μL의 10% 트리톤 X-100 및 50μL의 3% 양 RBC 용액(상기 #3으로부터)을 이들 웰 각각에 가한다.

6. 음성 대조군의 설정: 50μL의 1 또는 3% 양 RBC 용액(상기 단계 3으로부터)을 컬럼 1/행 D 내지 F에 가한다.

7. 완충제 블랭크의 설정: 50μL의 HBSS + 0.5% BSA를 컬럼 1/행 G 내지 H에 가한다.

8. 반응의 개시: 50μL의 3% 양 RBC 용액(상기 단계 3으로부터)을 모든 시험 웰에 가한다.

9. 37℃에서 30분 동안 회전 진탕하면서 항온처리한다.

10. 50μL의 HBSS를 모든 웰에 가하고 1050g에서 5분 동안 원심분리하여 분해되지 않은 RBC를 가라앉힌다(추가의 염수는 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거하는 후속 단계를 촉진한다).

11. 80μL의 상청액을 평저 미세역가 플레이트에 이전시키고, 540nm에서 흡광도를 판독한다. 플레이트를 단계 7로부터 완충제 블랭크로 블랭크한다. 용혈 퍼센트는 각각의 시험에서 흡광도를 단계 5로부터의 100% 분해 대조군의 평균 흡광도로 나누어 계산한다.

12. 데이터를 단백질 농도에 대해 용혈 퍼센트로 플롯팅한다(로그 규모). 단백질 mg당 용혈 단위에서 특이 활성(HU/mg)을 측정하기 위하여: i) 50% 용혈 시점에서 단백질 농도를 측정하고, ii) 단백질 농도를 mg/mL로 전환시키며, iii) 단백질 농도의 역수를 취한다.

당해 시스템을 사용하여 야생형 및 돌연변이된 PLY 폴리펩타이드의 용혈 활성을 비교하였다. 표 4는 wtPLY 및 PlyD1(<0.001%)의 시험관내 용혈 활성(양 적혈구 세포의 독소 매개된 분해)의 비교를 제공한다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 돌연변이된 PlyD1 폴리펩타이드는 야생형 PLY 폴리펩타이드와 비교하여 유의적으로 감소된 용혈 활성을 나타낸다.

실시예 5

항- PlyD1 항체의 생성 및 wtPLY 활성의 항체- 매개된 억제의 평가

PlyD1을 이. 콜라이내에서 발현시키고 위에서 기술한 바와 같이 정제하였다. 정제된 단백질을 PBS에 대해 투석하고 토끼의 면역화에 사용하였다. 2마리의 토끼를 20μg의 투여량에서 프로인트 보조제를 사용하여 근육내로 면역화하였다. 동물에게 불완전 프로인트 보조제로 초기 주사 후 2 및 4주째에 2회 추가의 면역화를 제공하였다. 혈청을 최종 주사 후 2 및 4주째에 수집하였다. 토끼내 항체의 생성을 우선 웨스턴 블롯으로 시험하여 항-PlyD1 항체가 wtPLY와 반응하도록 하였다. 토끼 혈청을 또한 ELISA 및/또는 IGEN 경쟁 검정에 의해 표준 공정을 사용하여 시험함으로써 공지된 중화 에피토프에 대해 특이적인 항체의 존재를 검출하였다. 토끼를 ELISA 및 IGEN 검정에서 우수한 혈청 역가로 완전한 길이의 PLY에 결합하는 IgG 항체를 생산한 PlyD1으로 면역화하였다. 따라서, PlyD1으로 면역화한 후 wtPLY와 반응하는 항체의 생산을 측정하였다.

일반적으로, wtPLY 용혈 활성을 억제하기 위한 항-PlyD1 항체의 능력을 측정하는 검정은 다음 단계를 포함한다. 첫째로, 항혈청을 필수적으로 본원에 기술한 바와 같이 생산한 후 미세역가 플레이트를 따라 2배 일련 희석시킨다. 일정량의 천연 wtPLY를 모든 웰에 가한다. 양 적혈구 세포를 모든 웰에 가하고 검정을 위에서 기술한 시험관내 용혈 검정에 대해 진행한다. 최종 플레이트 프로세싱 후, 데이터를 그래프처리하여 50% 억제 역가를 측정한다. 대표적인 용혈-억제 검정 시스템은 하기 나타낸다:

1. 콜레스테롤(이는 PLY-매개된 용혈에 대해 억제성이다)을 고갈시키기 위해 항혈청을 다음과 같이 예비-처리한다:

a. 20 mg/mL의 덱스트란 설페이트(Dextralip 50) 및 1M MgCl₂의 용액의 스톡 용액을 제조한다.

b. 동일한 용적의 상기 (a)에 나타낸 스톡 용액 둘다를 혼합하여 작업 용액을 제조한다.

c. 상기 (b)로부터의 작업 용액을 혈청에 1:10의 비(즉, 2mL의 혈청에 대해 200μL의 작업 용액)로 가하고 10초 동안 완전 혼합한다.

d. 실온에서 15분 동안 항온처리한 후, 1500 xg에서 30분 동안 원심분리하고 상청액을 신선한 튜브(콜레스테롤이 침전물에서 발견된다)로 이전시킨다.

2. 50μL의 행크스 완충된 염수 용액(HBSS) + 0.5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 96 웰 환저 미세역가 플레이트의 웰 모두에 가한다.

3. 50μL의 시험할 각각의 혈청을 컬럼 2의 독립된 행에 가하고, 전체 행에 따라 일련 희석(1:2)한다. 컬럼 1을 완충제 블랭크, 및 양성 및 음성 대조군을 위해 보존한다.

4. 정제된 야생형 PLY(비-태그됨, 로트 DC5826)의 희석액을 25μL가 10 ng의 단백질(HBSS + 0.5% BSA 사용)을 함유하도록 제조한다.

5. 25μL(10 ng 함유)의 희석된 야생형 PLY를 컬럼 1을 제외한 모든 웰에 가하고 희석된 항혈청과 함께 30분 동안 37℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 항온처리한다.

6. 세척된 혼주된 세포(제조원: 록랜드 이뮤노케미칼, 제품 번호: R405-0050)의 10% 스톡으로부터 3% 양 적혈구(RBC) 현탁액을 HBSS + 0.5% BSA로 희석시켜 제조한다.

7. 100% 용해 대조군의 설정: 15μL의 HBSS + 0.5% BSA 및 HBSS + 0.5% BSA 중 10μL의 10% 트리톤 X-100을 컬럼 1/행 A 및 B에 가한다. 25μL의 1 또는 3% 양 RBC 용액(상기 #6으로부터)을 이들 웰 각각에 가한다.

8. 양성 대조군의 설정: 25μL의 희석된 야생형 Ply(상기 #4로부터)를 컬럼 1//행 C 및 D에 가한다. 25μL의 3% 양 RBC 용액(상기 #6으로부터)을 이들 웰 각각에 가한다.

9. 음성 대조군의 설정: 25μL의 HBSS + 0.5% BSA 및 25μL의 3% 양 RBC 용액(상기 #6으로부터)을 컬럼 1/행 E 및 F에 가한다.

10. 완충제 블랭크의 설정: 50μL의 HBSS + 0.5% BSA를 컬럼 1/행 G 및 H에 가한다.

11. 반응의 개시: 25μL의 3% 양 RBC 용액(상기 #6으로부터)을 시험 웰 모두에 가한다.

12. 30분 동안 37℃에서 250rpm으로 진탕하면서 항온처리한다.

13. 5분 동안 1050g에서 원심분리하여 분해되지 않은 RBC를 제거한다.

14. 75μL의 상청액을 평저 미세역가 플레이트에 이전시키고, 540nm에서 흡광도를 판독한다. 플레이트를 단계 10으로부터의 완충제 블랭크로 블랭크처리한다. 용혈 퍼센트는 각각의 시험 웰에서 흡광도를 단계 7로부터의 100% 용혈 대조군의 평균 흡광도로 나누어 계산한다.

당해 시스템을 사용하여 PlyD1을 사용한 다음 면역화로 생산된 항체를 시험하였다. 데이터는 항혈청 역가에 대한 용혈 퍼센트로 플롯팅하고(로그 규모) 50% 용혈 억제 역가를, 용혈 퍼센트가 50% 감소하는 혈청 희석의 역수로 취하였다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, G293(트레오닌, 발린 또는 시스테인으로)에서 변형된 mPLY 및 PlyD1의 50% 용혈 억제 역가는 wtPLY와 유사하다. PlyD1 폴리펩타이드에 대해 관측된 특징의 요약은 표 4에 제공된다.

^*his-태그된 PdB의 관측치는 약 0.5%이었으며, his-태그된 wtPLY 및 PlyD1에 대한 관측치는 상응하는 태그되지 않은 폴리펩타이드와 거의 동등하였다.

도 2는, Ply-G293A(알라닌으로 치환된 G293), Ply-G293T(트레오닌으로 치환된 G293), Ply-G293V(발린으로 치환된 G293), 및 Ply-G293C(시스테인으로 치환된 G293)을 포함하는 다른 PLY 돌연변이체가 또한 wtPLY(도 4에서 "Ply")보다 더 낮은 용혈 활성(검출가능하지 않은 활성 포함)을 나타내었음을 나타낸다. PlyD1의 추가의 독립적인 로트를 또한 시험하였다. 용혈 활성은 어떠한 PlyD1 로트에서도 검출되지 않았다.

실시예 6

PlyD1 의 면역원성 및 보조요법

다양한 투여량의 PlyD1의 면역원성을 시험하기 위하여, 단독 또는 AlOOH 보조제의 존재하에서 또한 상이한 온도에서 저장하여 이의 안정성을 평가하였다. 2개의 연구를 면역원으로서 PlyD1을 사용하여 마우스에서 수행하였다. 제1 연구에서, PlyD1을 수산화알루미늄(AlOOH) 보조제의 존재 또는 부재하에서 변화하는 투여량으로 투여하였다. PlyD1은 시험한 모든 투여량에서 고 항-PLY IgG 역가 및 용혈 억제(HI) 역가를 유도하는 것으로 밝혀졌다.

제2 연구에서, PlyD1을 -7O℃, 2 내지 8℃, 또는 45℃에서 2주 저장 후 AlOOH 보조제와 함께 투여하였다. PlyD1를 다양한 투여량에서 AlOOH 보조제와 함께 또는 이의 부재하에 투여하였다. 마우스를 3회 면역화시키고, 3주 쉬고, 혈액 시료를 각각의 면역화 후 3주째에 취하였다. 제2 및 최종 채혈(최종 면역화 후 3주째)의 항체 역가를 PLY-특이적인 ELISA를 사용하여 측정하였다. ELISA 역가는 제2 및 제3 채혈 이후 항-PLY 역가에 대한 투여량 반응을 나타내었다. 보조제 처리된 PlyD1을 사용한 면역화는 보조제처리하지 않은 PlyD1에 의해 유도된 것들과 비교하여 유의적으로 보다 높은 항-PLY 역가를 초래하였다. 3차 채혈로부터의 ELISA 결과를 표 5에 나타낸다.

당해 제2 연구에서, 3차 채혈에 이어 HI 검정을 사용하여 시험한 양 적혈구 세포의 PLY-매개된 용혈을 억제하는 PlyD1-면역화된 마우스로부터의 항혈청의 능력을 또한 평가하였다. HI 역가는 보조제처리하지 않은 PlyD1에 비해 보조제처리한 PlyD1으로 면역화시킨 마우스에서 약간 더 높은 것으로 밝혀졌으며, 이러한 차이는, 검정 편차내 있는 것으로 고려되므로 유의적이지는 않다. 따라서, 증가하는 양의 PlyD1으로 생성된 HI 역가에 있어서 투여량 반응은 존재하지 않는 것으로 여겨진다. 결과는 표 6에 나타낸다.

* HI 역가: 재조합 야생형 PLY의 제공된 양의 용혈을 완전히 억제할 수 있는 최대 혈청 희석률. 검정의 검출 하한은 4이고; 4보다 낮는 역가는 통계적 목적을 위해 2로 기재한다.

본원에 나타낸 바와 같이, -70℃ 또는 2 내지 8℃에서 저장한 PlyD1을 면역화를 위해 사용하지만, PlyD1을 45℃에서 저장한 경우 PlyD1은 고 항-PLY IgG 역가를 생성하였다. 또한, 보조제의 존재하에서, PlyD1은 보조제없이 투여한 PlyD1과 비교하여 항-PLY-특이적인 항체의 보다 높은 역가를 생성할 수 있었다.

이들 연구는, PlyD1을 사용한 면역화가 시험한 모든 PlyD1 투여량에서 중화 항체를 유발하였음을 나타낸다. 또한, 데이터는, PlyD1에 대한 면역 반응이 PLY에 대한 중화 항체를 정량적으로 더 생성함으로써 보조제로부터 유리함을 나타낸다.

실시예 7

TLR4 검정

wtPLY는 대식세포를 활성화시켜 사이토킨을 생성하는 것으로 알려져 있다[참조: Malley, et al. PNAS USA, 100(4): 1966-71 (2003)]. 당해 검정은 PlyD1-유도된 사이토킨 생산을 시험관내에서 측정함으로써 PlyD1에 의한 대식세포 활성화를 측정한다. J774(마우스) 및 MM6(사람) 대식세포-유사 세포를 밤새 프로테이나제 K 및 열로 처리하거나(+/+) 처리하지 않은(-/-) PdB, PlyD1 또는 PLY와 함께 항온처리하였다. 열은 처리된 그룹에서 지질다당류(LPS) 오염으로 인한 어떠한 거짓 양성 결과도 구별하기 위해 사용하였다. 사이토킨 생산(IL-6, IL-10, TNF-α, IL-1β)은 밤새 항온처리한 후 ELISA로 측정하였다. 사이토킨(IL-1β, IL-6 및 IL-10)의 유도는 마우스 또는 사람 대식세포 세포주(각각 J774A.1 또는 MM6)를 프로테이나제 K/열로 처리하거나 처리하지 않은 PlyD1와 함께 공동-배양한 후 검출하였다. 비교시, 처리되지 않은 wtPLY는 MM6 세포(PLY -/-)에서 적은 양의 IL-1β 및 IL-6 사이토킨 방출을 유도할 수 있었다.

실시예 8

생체내 PlyD1의 면역원성

하기 기술한 모델에서 PlyD1의 면역원성을 시험하는데 있어서, PlyD1 또는 PdB에 의해 유발된 IgG 반응을 피복 항원으로서 재조합 wtPLY를 사용하여 ELISA로 시험하였다. 표준 검정 프로토콜을 사용하였다.

A. 패혈증 모델

마우스에서 항-PLY 항체를 유도하고 보호성 면역 반응을 유도하는 PlyD1의 능력을 평가하였다. 암컷 BALB/c 마우스(N = 15마리/그룹)의 그룹을 알루미늄 보조제(260μg/투여량)을 함유하는 TBS 속에 제형화시킨, 다양한 투여량에서 정제된 재조합 PlyD1 또는 PdB로 피하(SC) 면역화하였다. PdB를 lOμg/투여량에서 및 PlyD1을 1μg, 2.5μg, 5μg, 및 10μg/투여량에서 투여하였다. 주사 용적은 투여량당 200μL였다. 알부미늄 보조제를 함유하는 TBS 위약을 음성 대조군 그룹에 주사하였다. 동물을 연구 개시 후 0, 3 및 6주째에 면역화하였다. 9주째에, 동물을 포스페이트-완충된 염수(PBS) 현탁액(마우스당 50μL 챌린지) 중 에스. 뉴모니아에 혈청형 6B의 10⁷ 콜로니 형성 단위(cfu)로 비강내(IN) 주사하여 챌린지하였다. 챌린지한 후, 마우스를 매일 사망율에 대해 모니터링하였다. 챌린지한지 14일 후, 모든 생존하는 마우스를 안락사시켰다. 피셔 정확도 시험을 사용하여 면역화된 그룹(들)과 위약 대조군 사이에 유의적인 차이가 있었는지를 측정하였다. 또한, 시료 채혈을 2차 부스트(42일째) 이후 및 챌린지 전에, 3회 면역화 후(63일째), 모든 동물로부터 취하였다. 혈청을 항체 ELISA에 의해 총 뉴몰리신-특이적인 IgG 반응에 대해서 및 용혈 검정의 억제시 뉴몰리신 중화능에 대해 분석하였다.

백신을 주사한 마우스와 위약을 주사한 마우스 사이에서 시간-대-사망에 있어서의 차이를 생성물-제한 시도로 생존 분포 기능을 사용하여 평가하였다. 패혈증 모델을 사용하여, 항체가 하기 나타낸 바와 같이 유도되었다고 해도, PlyD1으로 백신접종된 마우스는 윌콕슨 시험(Wilcoxon test)(1μg의 경우 p=0.5458, 2.5μg의 경우 p=0.5003, 5μg의 경우 p=0.1448, 및 10μg의 경우 p=0.1723)을 기초로, 위약 그룹으로 비교한 시간-대-사망에서 지연을 나타내지 않았다. 비록 PlyD1을 사용하여 명백한 투여량 효과가 있었다고 해도, PlyD1으로 면역화시킨 그룹 중 어느 것도 위약 대조군 그룹(p>0.05)과 비교하여 유의적인 생존 또는 사망에 대한 지연을 나타내지 않았다(표 7).

¹p 값은 피셔 정확도 시험에 따라 결정하였고 시험 그룹은 위약 대조군과 비교하였다.

²p 값은 윌콕슨 시험에 따라 결정하였고 시험 그룹은 위약 대조군과 비교하였다.

패혈증 모델을 사용하여, ELISA를 면역화 후 42 및 63일째에 수행하였다. 결과는, 시험한 모든 투여량에서 고 역가의 항-PLY 항체를 나타내었다. 42일 및 63일째에, 모든 면역화된 마우스는 wtPLY에 대해 항체 반응을 가졌으나, 항체 역가에 있어서 유의적인 증가는 3차 백신접종후 관측되지 않았다. 항-PLY IgG 역가는 투여량 의존적이지 않았다. PBS 위약-, PdB- 및 PlyD1-면역화된 그룹에서 뉴몰리신-특이적인 항체 역가는 3차 면역화 후 표 8에 요약한다. 용혈의 억제로 측정한 것으로서 기능적 항체 역가는 시험한 모든 그룹에서 42일째와 비교하여 63일째에서 더 높았다(데이터는 나타내지 않음)

¹챌린지 전 항-PLY 역가는 개개의 마우스에 대해 측정하였으며 기하 평균으로 나타낸다.

본원에 나타낸 바와 같이, 당해 패혈증 모델을 사용하여, 재조합 PlyD1 단백질을 사용한 면역화는 특이적인 IgG 반응을 생성하였으나 에스. 뉴모니아에 혈청형 6B 균주를 사용한 치사 IN 챌린지에 대해 유의적인 보호는 나타내지 않았다. 그러나, PlyD1으로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 PLY-중화능을 입증하였다.

B. 국소 폐렴 모델

PlyD1을 또한 국소 폐렴 마우스 모델을 사용하여 시험하였다. 요약하면, 10마리의 CBA/N 마우스의 그룹을 정제된 재조합 PlyD1 단백질을 사용하여 알루미늄 보조제(300 μg/투여량)을 함유하는 TBS 속에 제형화시킨 각종 투여량으로 SC 면역화하였다. 주사 용적은 투여량당 200μL이었다. 알루미늄 보조제를 함유하는 포스페이트-완충된 염수 위약을 음성 대조군 그룹내로 주사하였다. 동물을 연구 초기 이후에 0, 3 및 6주째에 3회 SC 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주째에, 동물을 3 내지 7x10⁶ cfu의 에스. 뉴모니아에 균주 EF3030(혈청형 19F; 마우스당 40μL 챌린지 용적)을 비강(IN)으로 챌린지하였다. 마우스를 챌린지한 후 5일째에 희생시키고 폐 조직을 수거하고 cfu 회수를 위해 플레이팅하였다. 만-휘트니 시험(Mann-Whitney Test)을 사용하여 면역화된 그룹(들)과 위약 대조군 그룹 사이에 유의적인 차이가 있는지를 측정하였다. 당해 모델을 사용한 연구에서, IgG 역가 또는 혈청의 중화능에 대한 혈청 분석은 수행하지는 않았다. PlyD1으로 면역화시킨 모든 그룹은 PBS-면역화된 그룹과 비교하는 경우 유의적으로 보다 낮은 세균 폐 부하(burden)를 지니지 않았으므로, 보호되지 않은 것으로 고려하였다(데이터는 나타내지 않음).

C. 비강내 챌린지 모델

PlyD1을 또한 비강내 챌린지 마우스 모델을 사용하여 사내 평가하였다. 당해 모델에서, 암컷 CBA/j 마우스(그룹당 N = 15마리)의 그룹을 정제된 재조합 PlyD1 단백질을 사용하여 0.25 내지 25μg/투여량의 범위의 투여량으로 IM 면역화하였다. PlyD1을 알루미늄 보조제(65μg/투여량)를 함유하는 TBS 속에서 제형화하였다. 주사 용적은 투여량당 50μL이었다. 알루미늄 보조제를 함유하는 PBS 위약을 음성 대조군 그룹내로 주사하였다. 동물을 연구 초기이후에 0, 3 및 6주째에 IM 면역화하였다. 9주째에, 동물을 치사량(5x10⁵ cfu)의 에스. 뉴모니아에 균주 14453(혈청형 6B)을 사용하여 PBS 현탁액(마우스당 40μL의 챌린지 용적) 속에서 IN 챌린지하였다. 챌린지에 이어서, 마우스를 사망율에 대해 매일 모니터링하였다. 모든 생존하는 마우스를 챌린지 후 11일째에 안락사시켰다. 피셔 정확도 시험을 사용하여 면역화된 그룹(들)과 위약 대조군 사이에 유의적인 차이가 있는지를 측정하였다. 또한, 시료 채혈을 1차 주사 전(0주째 면역화 전) 4일째에 및 각각의 면역화 이후에 모든 동물로부터 취하였다. 혈청을 항체 ELISA에 의해 총 PlyD1-특이적인 IgG 반응에 대해 및 용혈 검정의 억제시 뉴몰리신 중화능에 대해 분석하였다.

PlyD1을 0.25μg, 0.5μg, 1μg, 5μg, 10μg 및 25μg/투여량에서 또는 보조제 단독(위약)을 투여하였다. 마우스를 3회, 3주 간격으로 면역화하고, 혈액 시료를 각각의 면역화이후에 3주째에 취하였다. 2차 채혈 및 최종 채혈(최종 면역화에 이어서 3주째)로부터의 항체 역가를 PLY-특이적인 ELISA로 측정하였다. 1차, 2차 및 최종 채혈 혈청의 PLY-매개된 용혈을 억제하는 능력을 평가하였다. 마우스를 최종 면역화에 이어서 3주째에 5x10⁵ cfu/투여량에서 에스. 뉴모니아에 균주 14453(혈청형 6B)로 챌린지하고, 생존을 10일 동안 모니터링하였다. PlyD1으로 면역화시킨 마우스의 생존은 5, 2.5 및 0.25μg/투여량에서 위약 그룹보다 유의적으로 우수하였으며, 이는, 보호가 투여량-의존적이지 않음을 나타낸다. 가장 우수한 보호는 2.5μg/투여량에서 관측되었으며, 여기서, 위약 그룹에서 0%인 것과 비교하여 마우스의 60%가 생존하였다. 결과는 표 9에 나타낸다.

¹p 값은 피셔 정확도 시험에 따라 측정하였으며 시험 그룹은 위약 대조군과 비교하였다.

당해 비강 챌린지 모델을 사용하여 면역화한 마우스로부터의 항혈청의 능력을 또한 양 적혈구 세포의 PLY-매개된 용혈의 억제에 대해 평가하였다. 모든 채혈로부터의 혈청을 이들의 처리 그룹에 따라 혼주시키고 모든 채혈에 이어 HI 검정을 사용하여 시험하였다. HI 역가는 2.5 및 5μg/투여량으로 면역화시킨 마우스에서 3차 면역화(채혈 3) 후 약간 더 높은 것으로 보이나, 이러한 차이는 검정 편차이내인 것으로 고려되어 유의적이지 않다. 따라서, 증가하는 양의 PlyD1를 사용하여 생성시킨 HI 역가에 있어서 투여량 반응은 존재하지 않는 것으로 여겨졌다. 당해 결과는 표 10에 나타낸다.

^*HI 역가: 제공된 양의 재조합 wtPLY의 용혈을 완전히 억제할 수 있는 최고 혈청 희석률. 검정의 검출 하한은 4이고; 4보다 낮은 역가는 통계 목적을 위해 2로 기재한다.

2차 채혈 및 3차 채혈로부터의 항체 역가는 정량적 항-PLY ELISA를 사용하여 측정하였다. 모든 PlyD1 면역화시킨 마우스는 채혈 2 및 채혈 3에 이어서 PLY에 대한 항체 반응을 증가할 수 있었다. 증가하는 투여량의 PlyD1으로 면역화시킨 그룹들 사이에 관측된 유의적인 차이(< 2배 차이)는 없었으며, 이는, 시험한 모든 투여량에서 항-PLY 항체의 포화량이 여전히 생성되었음을 시사한다. 3차 채혈로부터의 ELISA 결과는 표 11에 나타낸다.

¹항-PLY 정량적 ELISA로 수행함

Balb/c 마우스는 보조제의 존재 또는 부재하에서 PlyD1으로, 5 또는 10μg의 투여량에서 wtPLY으로 면역화시킨 후, 5μg 투여량의 wtPLY로 챌린지하였다. 이후에, 폐를 H&E 염색을 위해 수거하여 wtPLY에 의해 유발된 조직 손상을 관측하였다. 대조군(트리스-염수, 15% 글리세롤로 면역화시킨 마우스)과 비교하여, wtPLY는 전형적으로 말초혈관 부종, 비후되고, 파괴된 페포벽, 축소된 폐포 공간, 및 폐포 공간의 유액 및 혈액 침윤을 유발한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, PlyD1, PdB, 또는 wtPLY로 면역화된 마우스는 wtPLY를 사용한 비강내 챌린지 후 폐 손상으로부터 유의적인 보호를 입증하였다. 이들 면역화된 마우스로부터의 항혈청의 양 적혈구 세포의 PLY-매개된 용혈을 억제하는 능력을 1차, 2차 및 3차 채혈에 이어 HI 검정을 사용하여 시험하였다. 중화 항체 역가는 채혈 2와 비교하여 채혈 3 이후 증가하였다. 종합하면, PlyD1 면역화는 생체내에서 PLY 독성의 중화시 직접적으로 관여하는 항체를 생성할 수 있다.

CBA/J 마우스를 보조제 단독(AlOOH)으로 또는 1가 Ply-D1과 함께 각각의 면역화 사이에 3주간의 간격으로 3회 면역화(I.M)하였다. 최종 면역화 후 3주째에, 마우스를 GT-14453.BM2(혈청형 6B)로 5x10⁵ CFU/마우스에서 챌린지하고 생존/건강에 대해 2주 동안 관측하였다. PlyD1은 0.25μg, 0.5μg, 1.0μg, 2.5μg, 5.0μg, 10μg 및 25μg/ml로서 제형화하였다. 데이터를 마우스의 생존/건강 상태를 플롯팅함으로써 분석하고 통계적 분석을 위한 피셔-단측 시험을 사용하여 통계적으로 비교하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 재조합 PlyD1을 사용한 면역화는 마우스에서 치사 챌린지에 대한 보호를 유도하였다.

본원에 나타난 바와 같이, 비강 세균 챌린지 모델을 사용하여, 유의적인 보호가 위약 대조군과 비교하여 PlyD1을 사용하여 면역화시킨 마우스에서 관측되었다. PlyD1 마우스는 위약-면역화시킨 및 PLY 챌린지된 마우스와 비교하여 유의적으로 보다 낮은 폐 손상을 가졌다. 총체적으로 이들 데이터는, 마우스의 PlyD1 면역화가 생체내에서 PLY 독성의 중화에 직접적으로 관여되는 항체를 생성할 수 있으며 생 세균을 사용한 치사 IN 챌린지로부터 보호할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9

면역원성 조성물 및/또는 백신

PlyD1 면역원성 조성물 및/또는 백신에 대한 생산 방법은 1) pH-스타트(pH-Stat) 유가식 발효를 사용하여, 발효기 속에서 PlyD1 단백질을 발현하는 재조합 이. 콜라이 세포를 성장시키고; 2) 세포를 균질화시킨 후 0.2μm 정화 여과 및 한외여과법으로 농축시킴에 의해 PlyD1 단백질을 회수하고; 3) 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 PlyD1 단백질을 정제하고; 4) 정제된 PlyD1 단백질을 알루미늄 보조제와 함께 제형화함을 포함하나, 당해 분야에 공지된 다른 보조제도 또한 사용할 수 있다. 이들 과정은 본원에 기술되어 있거나 백신 제형 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.

PlyD1은 방부제의 부재하에서 멸균된 트리스-완충된 염수(TBS) 속에 수산화알루미늄 보조제와 함께 제형화하고, 단일-투여량 바이알내에 멸균된, 불투명 액체 현탁액(0.28mg의 원소 알루미늄/투여량 함유)으로서 제조할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다른 보조제를 또한 사용하여 백신을 제형화할 수 있다. 각각 0.5 mL 투여량의 PlyD1 면역원성 조성물 또는 백신은 전형적으로 다음 성분들을 함유한다: 재조합 PlyD1[10μg(저 투여량), 25μg(중간 투여량), 50μg(고 투여량)], 및 트리스-완충된 염수(TBS; 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 150 mM 염화나트륨), 수산화알루미늄 보조제(0.28 mg 원소 알루미늄/투여량), 및 흡수된 항원의 결합 및 안정성을 최적화하기 위한 인산나트륨(2 mM). 유리 바이알은 0.72 ± 0.05 mL로 충전하여 0.50 mL의 제거가능한 용적을 수득한다. 저 투여량, 중간 투여량 및 고 투여량으로부터 0.5mL의 주사(근육내, IM)는 각각 10μg, 25μg 또는 50μg의 PlyD1의 용량을 제공할 것이다. 각각의 0.5 mL 투여량은 0.28 mg ± 0.10 mg의 원소 알루미늄으로 보조제처리한다. 사용될 위약은 TBS이다. 면역원성 조성물 또는 백신은, 라텍스가 없고 13mm의 일체 알루미늄 밀봉(one-piece aluminum seal)된 13mm 회색 부틸 혈청 마개가 있는 3mL의 유리 바이알 속에 전형적으로 공급된다. 조성물은 전형적으로 백색의 탁한 현탁액이며 위약은 투명한 용액이고 약 2℃ 내지 8℃(예를 들면, 동결되지 않음)에 저장되어야만 한다. 생성물 중 알루미늄 보조제는 전형적으로 시간에 걸쳐 침강되며 사용전 재-현탁시킨다. 사용을 위한 제조시, 백신 바이알은 성분이 외관상 균일하게 될 때까지 약 5 내지 10회 뒤집어야 한다. 주사기는 현탁/혼합직 후 채워서 즉시 백신을 주사하여야 한다. 투여 경로는 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 바람직하게는 정맥내(SC), 피내(ID), 근육내(IM) 또는 경구 경로일 수 있다.

비록 특정 양태가 바람직한 양태의 측면에서 기술되어 있다고 하더라고, 변화 및 변형을 당해 분야의 숙련자가 생각할 수 있음은 이해될 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 다음 특허청구범위 내에 있는 이러한 모든 등가의 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.

서열목록

<110> Netherlands Vaccine Institute <120> Modified Streptococcus pneumonia pneumolysin (PLY) polypeptides <130> APL-08-03-PCT-US <150> US 61/140,804 <151> 2008-12-24 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1416 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60 ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120 gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180 tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240 accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggttgatc gtgctccgat gacttatagt 300 attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360 tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag 420 gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaataa cggctcacag catggaacaa 480 ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt 540 aactctgtcc attcaggtga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat 600 acagtcagcg tagacgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta 660 gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt 720 gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag 780 gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaagcag 840 attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc 900 cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt 960 acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta 1020 gttgcgacct ttcaaaacag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac 1080 ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttgggat 1140 gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat 1200 gggcaggatt tgacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat 1260 ctctctgtca aaattagaga gtgtaccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat 1320 gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc 1380 tatcctcagg tagaggataa ggtagaaaat gactag 1416 <210> 2 <211> 471 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe 20 25 30 Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala 50 55 60 Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro 85 90 95 Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe 100 105 110 Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val 130 135 140 Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln 145 150 155 160 Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu 165 170 175 Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile 180 185 190 Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys 195 200 205 Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys 210 215 220 Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val 225 230 235 240 Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser 245 250 255 Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val 260 265 270 Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys 275 280 285 Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr 290 295 300 Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe 305 310 315 320 Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu 325 330 335 Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu 340 345 350 Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser 355 360 365 Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr Tyr Ile Thr Trp Asp Glu Leu Ser Tyr 370 375 380 Asp His Gln Gly Lys Glu Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn 385 390 395 400 Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly 405 410 415 Asn Val Arg Asn Leu Ser 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Leu Ala 420 425 430 Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val 435 440 445 Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val 450 455 460 Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 465 470 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 45 catgccatgg caaataaagc agtaaatgac 30 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 46 cagccgctcg agctagtcat tttctacctt atcctc 36 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 47 gaaggagata tcatatggca aataaagcag 30 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 48 cctttcgggc tttgttagca gc 22 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 49 taatacgact cactataggg 20 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 50 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 51 ctgcttttga agctttgata 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 52 aggcttggga cagaaatggg 20 <210> 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Claims (26)

1. 서열번호 2 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 트레오닌 65, 글리신 293 및 시스테인 428, 또는 이에 상응하는 아미노산(equivalents)에서 아미노산 치환을 포함하는 야생형 뉴몰리신 폴리펩타이드로 이루어진 분리된 폴리펩타이드로서,
   상기 야생형 뉴몰리신 폴리펩타이드가 서열번호 2에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는, 분리된 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 상기 야생형 뉴몰리신 폴리펩타이드가 서열번호 2에 대해 적어도 95%의 동일성을 갖는, 폴리펩타이드.
3. 제1항에 있어서, 상기 야생형 뉴몰리신 폴리펩타이드가 서열번호 2에 대해 적어도 99%의 동일성을 갖는, 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 트레오닌 65가 시스테인에 의해 치환되고, 상기 글리신 293이 시스테인, 발린 및 트레오닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산에 의해 치환되며, 상기 시스테인 428이 알라닌에 의해 치환되는, 폴리펩타이드.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 에스. 뉴모니아에 항원이 PcPA 또는 PhtD 중 적어도 하나인, 면역원성 조성물.
8. 제7항에 있어서, PcPA 및 PhtD를 포함하는, 면역원성 조성물.
9. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 뉴몰리신 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
10. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
11. 제9항에 따른 발현 벡터로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 감염된 숙주 세포.
12. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 발현시키고, 상기 폴리펩타이드를 분리함을 포함하는, 방법.
13. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드와 반응성인 분리된 항체.
14. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물.
15. 제1항에 있어서, 상기 야생형 뉴몰리신 폴리펩타이드가 상기 트레오닌 65, 또는 서열번호 4, 8 내지 11, 15, 17, 18, 20 내지 22, 38 내지 40 또는 42 중 어느 하나에서 상기 트레오닌 65에 상응하는 아미노산(equivalent)에서 시스테인에 의해 치환되고, 상기 글리신 293, 또는 서열번호 4, 8 내지 11, 15, 17, 18, 20 내지 22, 38 내지 40 또는 42 중 어느 하나에서 상기 글리신 293에 상응하는 아미노산에서 시스테인에 의해 치환되며, 상기 시스테인 428, 또는 서열번호 4, 8 내지 11, 15, 17, 18, 20 내지 22, 38 내지 40 또는 42 중 어느 하나에서 상기 시스테인 428에 상응하는 아미노산에서 알라닌에 의해 치환되는, 분리된 폴리펩타이드.
16. 제4항에 따른 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 에스. 뉴모니아에 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 에스. 뉴모니아에 항원이 PcPA 또는 PhtD 중 적어도 하나인, 면역원성 조성물.
19. 제18항에 있어서, PcPA 및 PhtD를 포함하는, 면역원성 조성물.
20. 제4항에 따른 변형된 뉴몰리신 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
21. 제4항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
22. 제20항에 따른 발현 벡터로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 감염된 숙주 세포.
23. 제4항에 따른 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 발현시키고, 상기 폴리펩타이드를 분리함을 포함하는, 방법.
24. 제4항에 따른 폴리펩타이드와 반응성인 분리된 항체.
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