CN110760472A

CN110760472A - 一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株

Info

Publication number: CN110760472A
Application number: CN201911035458.XA
Authority: CN
Inventors: 彭小薇; 丁家波; 刘郁夫; 孙佳丽; 蒋卉; 冯宇; 许冠龙; 秦玉明; 沈青春
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明涉及一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株。本发明提供的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌，是将犬种布鲁氏菌菌株(Brucella canis)中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失得到的菌株。与出发菌株相比，本发明得到的菌株的毒力更弱，无需灭活就可以免疫动物，且不引起成年孕犬流产。使用本发明的菌株免疫小鼠和比格犬，在小鼠和比格犬体内能够产生较好的保护力。鉴于当前即无预防犬种布鲁氏菌的疫苗，也没有治疗犬感染犬种布鲁氏菌的有效药物，本发明对开发犬种布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，及对保护人类和犬只健康具有十分重要的意义。

Description

一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株

技术领域

本发明涉及一种犬种粗糙型布鲁氏菌基因缺失重组菌的构建及其应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌属(Brucella spp.)细菌引起的人畜共患的变态反应性传染病。陆地或海洋中的所有的哺乳动物均容易受到感染，但牛、羊、猪等家畜和野生动物最易感。布鲁氏菌是一种细胞内寄生的病原菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性，临床上动物以流产、胎衣不下、睾丸炎、附睾炎、关节炎等为特征。人感染则表现为长期发热、多汗、生殖系统疾病、关节痛、肝脾肿大以及肌肉—骨骼系统和中枢神经系统的严重并发症等，因此成为一个严重的公共卫生安全问题。

布鲁氏菌属有9个生物种，即马尔他布鲁氏菌(羊种布鲁氏菌Brucellamelltensis，含3个生物型)、流产布鲁氏菌(牛种布鲁氏菌Brucella abortus，含8个生物型)、猪种布鲁氏菌(Brucella suis，含5个生物型)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucellaovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotormae)、犬种布鲁氏菌(Brucella canis)、鲸种布鲁氏菌(Brucella ceti)、鳍足种布鲁氏菌(B.pinnipedialis)、田鼠种布鲁氏菌(Brucella microti)。临床上以羊种、牛种、猪种3种布鲁氏菌的意义最大，羊种布鲁氏菌的致病力最强。

犬是犬种布鲁氏菌的主要宿主，犬感染犬种布鲁氏菌主要引起生殖系统的病变，引起雌犬流产和雄犬不育，还能引起眼炎、椎骨椎间盘炎、淋巴结肿大、脾脏肿大、跛行、背痛、关节疼痛等非生殖系统症状。值得注意的是，当犬携带犬种布鲁氏菌时，可能通过口鼻接触或职业性接触(宠物医生、实验室人员)将犬种布鲁氏菌传播给人类。国际上已有多篇人感染犬种布鲁氏菌的报道。人类感染犬种布鲁菌时，通常呈现出轻微的或无典型的临床症状,表现出头痛、回归热、虚弱、乏力、出汗、体重减轻等症状。根据我国部分城市中犬感染犬种布鲁氏菌的调查结果显示，各地区的犬中普遍存在一定比例的犬种布鲁氏菌感染。鉴于当前即无预防犬种布鲁氏菌的疫苗，也没有治疗犬感染犬种布鲁氏菌的有效药物，因此，研究开发预防犬种布鲁氏菌的疫苗，对保护人类和犬只健康具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是构建一种缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组犬种布鲁氏菌，该重组菌可以用于对犬布病的预防。

本发明的技术方案

1.一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌的构建，是将犬种布鲁氏菌中的群体感应系统VjbR蛋白的编码基因缺失得到的菌株；

所述的该菌株的构建是根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2；同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR；重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌菌株RM6/66发生同源重组即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucella canis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌已于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18742。

2.本发明所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株的构建，其特征在于所述该菌群体感应系统VjbR蛋白是由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.如本发明所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于其菌株构建中所述缺失是通过同源重组实现的。

4.本发明所述的一株基因缺失型犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于所述的一种布鲁氏菌疫苗，其生产菌株为权利要求1-3所述的任一种犬种布鲁氏菌的重组菌。

5.本发明所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该菌株的缺失基因及其衍生物应用于犬种布鲁氏菌病新型诊断试剂中活性成分的制备。

本发明有益效果

本发明涉及一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株的构建及其应用。本发明提供的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌，是将犬种布鲁氏菌菌株(Brucella canis)中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失得到的菌株。与出发菌株相比，本发明得到的菌株的毒力更弱，无需灭活就可以免疫动物，且不引起成年母犬流产。使用本发明的菌株免疫小鼠和靶动物比格犬，在小鼠和比格犬体内能够产生保护力。本发明对犬种布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研发，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对保护人类和犬只健康具有十分重要的意义。

附图说明

图1为DVjbR-1和DVjbR-2的PCR扩增电泳图图中M：Marker 5000 1:DVjbR-1 2:DVjbR-2。

图2为DVjbR的PCR扩增电泳图图中M:Marker 5000 1:DVjbR。

图3为pUC19sacB-DVjbR转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图图中M：Marker5000 1,2,4,6,7：经PCR鉴定为阴性的菌落3,5,8：经PCR鉴定为阳性的菌落。

图4为pUC19sacB-DVjbR转化大肠杆菌DH5α后双酶切鉴定图图中M：Marker 50001：经双酶切后的阳性质粒。

图5为重组菌BCΔvjbR的PCR鉴定图图中M：Marker 5000 1:犬种RM 6/66野生型菌株；2：重组菌BCΔvjbR。

图6为重组菌BCΔvjbR接种后小鼠脾脏载菌量随时间变化图中图6A亲本菌株犬种RM6/66、重组菌BCΔvjbR和PBS对照组接种小鼠后1周和4周的脾脏重量变化；图6B亲本菌株犬种RM 6/66和重组菌BCΔvjbR接种小鼠后1周和4周的脾脏载菌量的变化。

图7为重组菌BCΔvjbR接种后比格犬脾脏载菌量随时间变化。

图8为重组菌BCΔvjbR接种小鼠的免疫保护效果图中PBS表示阴性对照组，BCΔvjbRH表示高剂量免疫接种BCΔvjbR产生的免疫保护力，BCΔvjbRL表示低剂量免疫接种重组菌BCΔvjbR产生的免疫保护力。

图9为重组菌BCΔvjbR接种比格犬的免疫保护效果图中BCΔvjbR为免疫组犬攻毒后脾脏的载度量，PBS表示阴性对照组。

本发明涉及微生物资源信息

本发明所涉及的犬种布鲁氏菌(Brucella canis)RM 6/66株取自中国兽医药品监察所；本发明构建的犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌被命名为犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌拟于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18742。

具体实施方式

1.犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌的构建

该重组菌构建是将犬种布鲁氏菌(Brucella canis)菌株中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失而获得。

根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白基因(GenBank AccessionNumber：DK60_3002)，设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2。同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR。重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66发生同源重组即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株，即通过双交换获得了缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的犬种布鲁氏菌菌株，将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucella canis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌已于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18742。

所述犬种布鲁氏菌可为现有的菌株，如野生株(包括标准株、强毒株和弱毒株)。

所述群体感应系统VjbR蛋白可为任何来源于犬种布鲁氏菌菌株的群体感应系统VjbR蛋白氨基酸序列(序列1)所示。

序列1：犬种布鲁氏菌菌株的群体感应系统VjbR蛋白氨基酸序列

所述群体感应系统VjbR蛋白的核苷酸序列2(序列)所示。

序列2：犬种布鲁氏菌菌株的群体感应系统VjbR蛋白核苷酸序列

可通过任何现有方法缺失所述群体感应系统VjbR蛋白，如基因组中该序列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等造成的该基因缺失。

所述同源重组可通过将DNA片段DVjbR导入所述犬种布鲁氏菌实现；所述DNA片段DVjbR自上游至下游依次为同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2；所述同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2能与所述菌株基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因的上游和下游相同序列发生同源重组，缺失所述群体感应系统VjbR蛋白。

所述同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DVjbR-1具体可为以犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

序列3，DVjbRFf：5’-ggggtacctt cgggacaatg tggagt-3’26；

序列4，DVjbRFr：5’-ggatacggcg atgaaaagac agcgtcataa gaacagtcag-3’40。

所述同源臂DVjbR-2具体可为以犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66为模版，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

序列5，DVjbRRf：5’-ctgactgttc ttatgacgct gtcttttcat cgccgtatcc-3’40；

序列6，DVjbRRr：5’-cgggatcccg ccttccatca ccctc-3’25。

试验证明，该重组菌的毒力明显低于出发的母本菌株，免疫保护效力显著高于空白对照。因此，该重组菌可用于进一步改造制备犬种布鲁氏菌疫苗。

所述重组菌可应用于进一步改造制备犬种布鲁氏菌病疫苗。

2.犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌的应用

本发明构建的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌可应用于进一步改造制备犬种布鲁氏菌病疫苗。

本发明构建的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌制备的犬种布鲁氏菌疫苗，它的活性成分为所述的缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌。此外本发明还保护一种犬种布鲁氏菌病新型诊断试剂，它的活性成分为所述的重组菌缺失基因及其衍生物。

本发明通过对犬种布鲁氏菌基因组中功能基因的筛选，发现群体感应系统VjbR蛋白编码基因的缺失对犬种布鲁氏菌菌株的毒力影响较大。本发明通过将犬种布鲁氏菌菌株的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失，得到了新的重组菌株，与出发菌株相比，该重组菌的毒力明显减弱，通过小鼠和比格犬体内的毒力试验以及免疫保护试验发现，该缺失菌株毒力很弱，对犬种布鲁氏菌强毒株攻毒时具有免疫保护作用。本发明可应用于犬种布鲁氏菌病疫苗、诊断鉴别试剂的研制，对促进全球犬种布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

实施例

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

以下实施例中所用的菌株和质粒如下：

犬种布鲁氏菌(Brucella canis)RM 6/66株取自中国兽医药品监察所；pUC19sacB质粒构建，主要程序是通过PvuI酶切纯化pUC19(Biolabs公司商业化产品)获得一个1791bp片段与同样PvuI酶切纯化pEX100T(美国ATCC商业化产品)获得的主要片段(4055bp)连接后得到的重组载体，具体操作方法如文献(Tung T.Hoang，Gene 1998，212：77-86)所述。

实施例1——缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因重组菌株的构建

根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因(GenBankAccession Number：DK60_3002)，设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2。同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR。重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66发生同源重组即可得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株。

1.重组载体pUC19sacB-DVjbR的构建

(1)布鲁氏菌基因组的提取

取15μl缺失的犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66，加入1ml TNE(每升含有1.21g Tris，5.84gNaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入135μl TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135μl含2％Triton X-100的TNE，混匀。加30μl新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37℃水浴孵育30min，之后加入15μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀。65℃水浴至少孵育2h。

加入RNAse(使RNAse浓度达到10μg/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的基因组DNA于4℃保存备用。

(2)PCR扩增群体感应系统VjbR蛋白编码基因的上游片段DVjbR-1(531bp)和下游片段DVjbR-2(650bp)

扩增上游片段DVjbR-1的引物(序列3和序列4)如下：

DVjbRFf：5’-ggggtacctt cgggacaatg tggagt-3’26；

DVjbRFr：5’-ggatacggcg atgaaaagac agcgtcataa gaacagtcag-3’40。

上游引物中加入KpnⅠ酶切位点，下游引物中不加入酶切位点。

扩增下游片段DVjbR-2的引物(序列5和序列6)如下：

DVjbRRf：5’-ctgactgttc ttatgacgct gtcttttcat cgccgtatcc-3’40；

DVjbRRr：5’-cgggatcccg ccttccatca ccctc-3’25。

上游引物中不加入酶切位点，下游引物中加入BamHⅠ酶切位点。

以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两个引物对进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min，首先进行20个循环：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，每个循环退火温度下降0.5℃。之后进行10个循环：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min。72℃最终延伸10min。

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图1，图1中，1：DNA分子量标准；2：DVjbR-1的PCR扩增产物；3：DVjbR-2的PCR扩增产物。结果表明，成功扩增出了目的片段。

(3)DVjbR DNA片段的获得

通过重叠PCR扩增，将上游片段DVjbR-1和下游片段DVjbR-2连接，得到片段即为DVjbR片段(1181bp)。分别以上述获得的片段DVjbR-1、DVjbR-2为模板进行PCR扩增，引物如下(序列3和序列6)：

DVjbRFf(上游引物)：5’-ggggtacctt cgggacaatg tggagt-3’26；

DVjbRRr(下游引物)：5’-cgggatcccg ccttccatca ccctc-3’25。

使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min，首先进行20个循环：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，每个循环退火温度下降0.5℃。之后进行10个循环：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min。72℃最终延伸10min。

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2，图2中，1：DNA分子量标准；2：PCR扩增产物。结果表明，成功获得了将DVjbR-1和DVjbR-2连接的DVjbR片段。

(4)pUC19sacB-DVjbR重组载体的构建

将步骤3中得到的DVjbR DNA片段与含有amp抗性基因的pUC19sacB载体分别进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物进行连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑和氨苄西林(amp)抗性筛选；挑选阳性白斑和amp抗性菌落进行扩大培养，进行PCR鉴定，鉴定引物如序列3和序列6

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图3，图3中，1：DNA分子量标准；2：重组载体PCR扩增产物。结果表明成功构建出了目的载体，得到的载体命名为pUC19sacB-DVjbR重组载体。

提取PCR阳性重组载体进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4，图4中1：DNA分子量标准；2：重组载体双酶切结果，大片段为载体、小片段为DVjbR片段。结果表明成功构建出了目的载体。

将得到的含有重组载体的菌株增殖培养，保存在-80℃备用。

2.重组菌的获得

在含有20ml TSB培养基的离心管中接种50μl犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66，37℃培养24h后，离心后收集菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1.5ml离心管中，继续离心洗涤3～4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87μl菌液和3μl质粒(pUC19sacB-DVjbR)加入1mm的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中，调整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。查询电击参数为2.22KV。电击后，向电极杯中加入1ml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10min，置于37℃摇床复苏12～18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB(含100ug/μl AMP)。5～8天后长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37℃增殖48h，再将该菌液稀释100倍后，取100μl涂布于含有5％蔗糖的TSA平板培养基。经过3～5天后长出单菌落，将阳性菌落进行PCR鉴定，鉴定引物(序列3和序列6)

重组菌的PCR鉴定结果见图5。图5中，1：DNA分子量标准；2：犬种布鲁氏菌RM 6/66对照；3：重组菌PCR扩增产物。

结果表明，通过双交换获得了缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的犬种布鲁氏菌菌株，将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucella canis)BCΔvjbR重组菌株。

实施例2——BCΔvjbR重组菌株的应用

试验动物：

(1)4～6周龄SPF级BALB/c雌鼠105只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2009-0001。

(2)12月龄比格孕犬10只(孕龄约30d)，12月龄雄犬40只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2009-0001。

1.毒力鉴定

(1)小鼠感染模型的毒力评价：

将小鼠随机分为三组，每组20只。具体接种方案如下：

第一组(试验组)：接种实施例1制备的重组菌BCΔvjbR，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷CFU(菌落形成单位)。

第二组(对照组1)：接种犬种布鲁氏菌RM 6/66株菌，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷CFU细菌。

第三组(对照组2)：接种0.01M pH7.2 PBS，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml。

分别于接种后第1和4周从每组小鼠中选10只，进行脾脏载菌量评价。

脾脏载菌量随时间的变化见图6。图6中，6/66表示接种菌株RM 6/66不同时间点载菌量，BCΔvjbR表示接种重组菌BCΔvjbR不同时间点载菌量。结果表明：重组菌BCΔvjbR接种1周后，小鼠的脾脏重量与野生菌株RM 6/66以及PBS对照组没有显著差异，而感染4周后，感染野生菌株RM 6/66的小鼠脾脏显著肿大，而接种重组菌BCΔvjbR和PBS对照组的小鼠的脾脏并没有发生显著肿大(图6A)。小鼠脾脏载菌量方面，重组菌BCΔvjbR接种1周和4周，小鼠脾脏内重组菌BCΔvjbR的数量快速降低，而且每个时间点均显著低于野生菌株RM 6/66的载菌量(图6B)。

(2)比格犬模型的毒力评价：

(A)成年孕犬毒力评价：将比格孕犬随机分为两组，每组5只。具体接种方案如下：

第一组(试验组)：接种实施例1制备的重组菌BCΔvjbR，每只比格犬肌肉接种剂量0.1ml，内含10⁶CFU细菌。

第二组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只比格犬肌肉接种剂量0.1ml。

上述菌株接种后，每7天采集比格犬的阴道分泌物样品各一次，并进行荧光定量PCR检测犬阴道分泌物中是否含有布鲁氏菌核酸。同时观察每只怀孕犬是否正常分娩，如果发生流产则还需对流产胎儿进行布鲁氏菌核酸的检测。结果显示，对上述10只比格犬均未从阴道分泌物中检测到布鲁氏菌核酸，同时10只怀孕的比格犬均正常分娩，说明重组菌BCΔvjbR免疫怀孕犬只后不会通过阴道分泌物发生排菌，且安全性好，不引起怀孕犬只流产。

(B)成年比格雄犬毒力试验：

将成年比格雄犬随机分为两组，每组15只。具体接种方案如下：

第一组：接种实施例1制备的重组菌BCΔvjbR，每只比格犬肌肉注射接种剂量0.1ml，内含10⁶CFU细菌。

第二组：接种犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66，每只比格犬肌肉注射接种剂量0.1ml，内含10⁶CFU细菌。

分别于接种后第1、4、8周从每组比格犬中选5只，安乐死后进行脾脏载菌量评价。

脾脏载菌量随时间的变化见图7。图7中，6/66表示接种菌株RM 6/66不同时间点载菌量，BCΔvjbR表示接种重组菌BCΔvjbR不同时间点载菌量。结果表明：重组菌BCΔvjbR接种1周后，比格犬的脾脏载菌量与野生菌株RM 6/66组没有显著差异，而感染4和8周后，比格犬脾脏内重组菌BCΔvjbR的数量快速降低，而且每个时间点均显著低于野生菌株RM 6/66的载菌量(图7)。

2.疫苗效力评价

(1)小鼠模型的疫苗效力评价：

将上述小鼠随机分为3组，每组15只。三组小鼠分别注射重组菌高剂量BCΔvjbR(BCΔvjbRH)、低剂量BCΔvjbR(BCΔvjbRL)和PBS，具体如下：

第1组(高剂量试验组)：接种实施例1制备的重组菌BCΔvjbR，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁸CFU细菌。

第2组(低剂量试验组)：接种实施例1制备的重组菌BCΔvjbR，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷CFU细菌。

第3组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml。

上述菌株接种后，将每组小鼠分别于接种后第4周用犬种布鲁氏菌菌株RM 6/66同源攻毒，剂量为10⁷CFU/只。两周后剖杀各组小鼠，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。试验设置三次重复，结果取平均值。

脾脏的平均载菌量变化结果如图8所示。图8中，PBS表示阴性对照组，BCΔvjbRH表示高剂量接种重组菌BCΔvjbR的免疫保护力，BCΔvjbRL表示低剂量接种重组菌BCΔvjbR的免疫保护力。小鼠体内免疫保护试验结果表明：该重组菌BCΔvjbR高剂量接种小鼠后在第4周进行同源攻毒显示其免疫保护效力高于低剂量接种组和空白对照组；从图中可见两种剂量的BCΔvjbR重组菌都具有明显的免疫保护力，其中高剂量重组菌的保护效果更好。

(2)比格犬模型的疫苗效力评价：

将比格犬随机分为两组，每组5只，具体如下：

第二组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只比格犬肌肉注射接种剂量0.1ml。

上述菌株接种后，将每组比格犬分别于接种后第4周用犬种布鲁氏菌菌株RM6/66(Brucella canis)同源攻毒，剂量为2×10⁶CFU/只。两周后安乐死各组比格犬，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量，评价免疫效力。

脾脏的平均载菌量变化结果如图9所示。图9中，PBS表示阴性对照组，ΔvjbR表示接种重组菌BCΔvjbR的免疫保护力。比格犬体内免疫保护试验结果表明：该重组菌BCΔvjbR免疫比格犬后在第4周进行同源攻毒显示其免疫保护效力显著高于空白对照组。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株

<130> 19149

<141> 2019-10-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 犬种布氏杆菌(Brucella canis)

<400> 1

Met Ser Leu Asp Leu Val His Phe Pro Asn Tyr Lys Lys Thr Phe Phe

1 5 10 15

Gly Ser Ser Phe Gln Ser Asp Thr Leu Ala Leu Leu Thr Arg Ile Arg

20 25 30

Asp Glu Ile Gly Cys Arg Tyr Val Thr His Thr Tyr Arg Gly Arg Val

35 40 45

Gly Asp Cys Thr Lys Val Asn Ser Ala Asp Leu Thr Val Leu Met Thr

50 55 60

Leu Pro Ala Thr Trp Val Ala Arg Tyr Ser Ser Lys Asn Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Ile Asp Pro Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Tyr Tyr Arg Asn Asp Thr

85 90 95

Ser Ala Ile Ala Arg Asp Leu Lys Glu Asp Ala Asp Ile Cys Pro Ala

100 105 110

Val Ala Glu Leu Leu His Asp Ala Glu Lys His Gly Leu Gly Asn Leu

115 120 125

Phe Ile Ala Val Ser Ala Arg Asn Pro Lys Gly Val Ala Gly Cys Thr

130 135 140

Val Phe Thr Phe Glu Val Glu Asp Glu Asp Arg Thr Gln Phe Leu Ala

145 150 155 160

Arg Met Arg Pro Arg Leu Leu Ser Leu Ala Gly Ile Ile His Gly Thr

165 170 175

Val Cys Gly Cys Lys Asp Ala Asn Ser Val Ala Ser Leu Leu Thr Pro

180 185 190

Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Trp Ala Ala Asn Gly Lys Thr Asp Gly

195 200 205

Glu Ile Ala Glu Ile Leu Ser Ile Ala Arg Trp Thr Val Val Thr Tyr

210 215 220

Leu Gln Asn Ala Lys Ile Lys Leu Asn Cys Ser Asn Arg Thr Ser Ala

225 230 235 240

Val Ala Thr Ala Leu Ser Leu Gly Ile Ile Asp Met Pro Glu Val Gln

245 250 255

His Leu Val

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> 犬种布氏杆菌(Brucella canis)

<400> 2

atgagtcttg atctcgttca ttttccgaat tacaaaaaaa ccttttttgg ttcttccttt 60

caaagcgata ctttggcgct tctaacccgc atccgggatg aaataggatg ccgctacgta 120

acgcatacct atcgtggtcg cgtaggcgac tgcacgaagg tgaattcagc cgatctgact 180

gttcttatga cgctgcctgc tacctgggtc gcgcgctatt cctcgaaaaa ctactttgcc 240

attgacccgg tttttcagga agacgctccg tattaccgca atgatacgag cgctattgcc 300

cgcgacctga aagaagatgc ggatatttgc ccggccgttg ccgaactgtt gcatgatgct 360

gaaaagcacg gcctgggaaa tcttttcatc gccgtatccg cgcgcaatcc caagggcgtt 420

gcgggttgta cggttttcac tttcgaggtg gaggacgaag accgtacgca attccttgcc 480

aggatgcgcc cgcgccttct aagccttgcc ggcatcattc atggaactgt ctgcggctgc 540

aaggatgcaa attcagttgc aagccttctc accccgcgcg aggtcgattg cctgcgctgg 600

gctgccaatg gcaagactga tggcgaaatc gccgaaatcc tcagcatcgc ccgctggacg 660

gtggtgactt atctacagaa tgccaaaatc aagctgaact gttccaatcg aacgtcggca 720

gtggcgacgg cgctttccct cggcattatc gatatgcccg aggtacagca tctcgtctga 780

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(DVjbRFf)

<400> 3

ggggtacctt cgggacaatg tggagt 26

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(DVjbRFf)

<400> 4

ggatacggcg atgaaaagac agcgtcataa gaacagtcag 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(DVjbRRf)

<400> 5

ctgactgttc ttatgacgct gtcttttcat cgccgtatcc 40

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(DVjbRRr)

<400> 6

cgggatcccg ccttccatca ccctc 25

Claims

所述的该菌株的构建是根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2；同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR；重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌RM6/66株菌发生同源重组，即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucella canis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌拟于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18742。

2.如权利要求1所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于所述该菌群体感应系统VjbR蛋白是由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.如权利要求1所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于其菌株构建中所述缺失是通过同源重组实现的。

4.如权利要求1所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该菌株作为生产菌株在布鲁氏菌疫苗制备中的应用。

5.如权利要求1所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该菌株的缺失基因及其衍生物应用于犬种布鲁氏菌病诊断试剂中活性成分的制备。