CN109852573A

CN109852573A - A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株构建及应用

Info

Publication number: CN109852573A
Application number: CN201910196068.4A
Authority: CN
Inventors: 陈泽良; 刘宝山; 韩小虎; 隋昀原; 张欢; 刘金玲; 沈国顺
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明是关于一种A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株构建与应用，属于布鲁氏菌疫苗研究领域。通过设计VjbR的上、下游区域及kana抗性基因的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度的同源性核苷酸片段及kana抗性基因，采用PCR扩增的方法将它们定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段，将获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体，将构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。该疫苗突变株有望发展成为带标记的弱毒疫苗，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展起到积极的促进作用。

Description

A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株构建及应用

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌疫苗研究技术领域，具体涉及A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株的构建与应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，可感染动物，牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物。其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。该病进入慢性期可能引发多器官和系统损害。

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。布氏杆菌属有六种：马耳他布氏菌(羊型布氏菌)、流产布氏菌(牛型布氏菌)、猪布氏菌和狗布氏菌、林鼠布氏菌、绵羊布氏菌。其中引起人类疾病的有羊、牛、猪和狗布鲁氏菌。

为防治布鲁氏菌病流行，我国成功地研制出三种布鲁氏菌疫苗：羊种M5弱毒疫苗、牛种A19弱毒疫苗和猪种S2弱毒疫苗，并进行了大面积的推广应用，对牛、羊、猪、鹿等动物布病的防制起了巨大的作用。尤其是A19疫苗，即具有较M5低的毒力和副作用，又具有较S2疫苗高的保护力，得到了最广泛的应用。但是，现有布鲁氏菌牛种A19疫苗仍具有较强的毒力，不能用于孕畜及人，无特定的缺失标志，且免疫后所产生的各种血清反应和自然感染所产生的各种血清学反应极其相似，存在难以区分自然感染和疫苗免疫动物的问题。因此，迫切需要构建带缺失标记的弱毒布鲁氏菌疫苗，以提高疫苗的应用范围并能进行免疫动物和野毒感染动物的鉴别。

(Quorum sensing，QS)系统是一种细菌群体活动调节机制，与细菌的很多毒力相关表型，如生物膜的形成、对抗生素的抗性、迁移能力和指向性等密切相关，使菌群适应各种恶劣的生存环境。VjbR基因是布氏菌的QS系统的两个转录激活因子之一，长度为708bp。研究表明，vjbR与布氏菌的许多毒力因子和调控系统相互作用：vjbR与Ⅳ型分泌系统互为正调控，当vjbR缺失后，virB的转录水平也随之下调；vjbR还能通过调控鞭毛调控子ftcR来调控鞭毛基因的转录，影响菌体的运动性。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株及其构建方法和应用，所要解决的技术问题是将布鲁氏菌A19疫苗株进行VjbR基因的缺失，减弱其毒性并建立缺失标记，提高疫苗的应用范围并能进行免疫动物和野毒感染动物的鉴别,从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：

1)设计引物：分别依据布鲁氏菌全基因组序列中靶基因VjbR的上、下游己知区域的核苷酸序列，各设计一对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度为611bp至571bp的同源性核苷酸片段；两片段和后面扩增的974bp的kana抗性基因定向连接，构成缺失基因被kana抗性基因替换的同源性核苷酸片段，扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端分别添加一个限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，所述扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端分别分别添加kana抗性基因的上下游引物的反向互补，依据kana抗性基因序列，在kana抗性基因的两侧设计一对特异性的引物，所述引物的5’-末端分别添加了布鲁氏菌VjbR基因上游片段中下游引物和VjbR基因下游片段中上游引物的反向互补序列；

2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得:以布鲁氏菌的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对VjbR基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段，以含有kana抗性基因的质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana抗性基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到kana抗性基因片段，再将VjbR的上游同源性核苷酸片段、kana抗性基因片段、VjbR的下游同源性核苷酸片段，采用PCR扩增的方法定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；

3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体；

4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

作为优选的实施方式，本发明的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法具体包括以下步骤：

步骤一PCR引物设计

依据A19布鲁氏菌株的全基因组序列，在VjbR基因上下游设计两对特异的PCR引物VjbRKan-N-F/VjbRKan-N-R与VjbRKan-C-F/VjbRKan-C-R，在上游片段的正向引物VjbRKan-N-F和下游片段的逆向引物VjbRKan-C-R的5‘-末端分别添加限制性核酸内切酶BamH I和Sal I的识别位点及其保护性碱基，在上游片段的逆向引物VjbRKan-N-R和下游片段的正向引物VjbRKan-C-F的5’-末端分别添加kana抗性基因的上下游引物的反向互补序列。

依据pK19mobsacB载体序列，在kana抗性基因的两侧设计了一对特异性的引物VjbRKan-F/VjbRKan-R，扩增完整的kana抗性基因，并在引物的5’-末端分别添加了布鲁氏菌VjbR基因上游片段中下游引物和VjbR基因下游片段中上游引物的反向互补序列。

作为优选的实施方式，为更好地鉴定重组，步骤一的PCR引物设计还包括在VjbR基因上游片段的外侧设计了进行重组鉴定的上游引物VjbRKan-I，和VjbRKan-R配对进行重组菌株的鉴定。

引物序列如下：

引物名称	引物序列	Tm	扩增长度	序列编号
					VjbRKan-N-F	ttttggatccTGACGACGCTGATTACCTC	53.8	611	SEQ ID NO.1
VjbRKan-N-R	CGCTTGCTGTCCATAAAATGGAAATATCCTTGGTGATG	53		SEQ ID NO.2
					VjbRKan-C-F	CTTCTTGACGAGTTCTTCTGATCAACATGGTCGCGCGGA	64.6	571	SEQ ID NO.3
VjbRKan-C-R	ttttctcgagGACTTCTGGAACAGACCCTATGG	56.1		SEQ ID NO.4
					VjbRKan-F	CATCACCAAGGATATTTCCATTTTATGGACAGCAAGCG	52.1	974	SEQ ID NO.5
VjbRKan-R	TCCGCGCGACCATGTTGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAG	52.4		SEQ ID NO.6
					VjbRKan-I	CCAGGAGCTGATCGATTTCG	55.7	1611	SEQ ID NO.7

步骤二目的基因替换型同源性核苷酸片段的获得

1)上下游片段的PCR扩增:以A19布鲁氏菌株的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，扩增上游片段N和下游片段C，20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，上游引物(5uM)1μL，下游引物(5uM)1μL，水7μL，布鲁氏菌基因组DNA(20ng/μL)1μL.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,50℃(扩增上游片段)或56℃(扩增下游片段)30sec,72℃30sec，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物上游片段N和下游片段C进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。用PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对所述PCR扩增产物上游片段N(SEQ ID NO.8)和下游片段C(SEQ ID NO.9)进行纯化。

2)kana抗性基因的扩增：以pK19mobsacB质粒为模板进行PCR，扩增kana抗性基因片段，20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，上游引物(5uM)1μL，下游引物(5uM)1μL，水7μL，pK19mobsacB质粒(20ng/μL)1μL.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,50℃30sec,72℃1min，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物kana基因片段进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；用PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对所述PCR扩增产物kana基因片段(SEQ ID NO.10)进行纯化。

3)目的基因替换型同源性核苷酸片段N-K-C的扩增：以扩增回收的N片段、C片段、kana基因片段的混合液为模板，在引物的引导下进行PCR扩增，获取目的基因替换型同源核苷酸片段。20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，VjbRKan-N-F上游引物(5uM)1μL，VjbRKan-C-R下游引物(5uM)1μL，水7μL，扩增回收的N片段、C片段、kana基因片段(各20ng/μL)各0.5μl.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,56℃30sec,72℃2min，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。用PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR扩增产物目的基因替换型同源性核苷酸片段N-K-C(SEQ ID NO.11)进行纯化。

步骤三构建转染质粒

1)酶切N-K-C片段和pUC18质粒：用BamH I和Xho I各50U分别酶切约500ng的N-K-C片段和约1000ng和pUC18自杀质粒。20μl酶切反应体系及反应条件为：N-K-C片段或pUC18(500ng或1000ng)4μL,10ⅹ缓冲液2μl，水13μL，在30℃下作用12h后，分别用DNA片段纯化试剂盒纯化消化产物。

2)N-K-C片段与质粒连接：在T4DNA连接酶的作用下，将步骤1)经酶切及纯化后的N-K-C片段与pUC18酶切产物在4℃连接过夜，以将片段N-K-C插入质粒的BamH I和Xho I位点处，得到含有N-K-C片段的重组载体，命名为pUC18/N-K-C，连接反应体系为：N-K-C片段酶切产物200ng,pUC18酶切产物100ng,T4DNA连接酶1μL,10ⅹ缓冲液1μL，补加水至10μL。

3)制备大肠杆菌TOP10感受态：接种受体菌大肠杆菌TOP10于3mL LB肉汤培养基中，在37℃下150rpm摇菌至浑浊(控制OD₆₀₀值为0.4-0.6，即菌量不能太多，也不能太少)，4500rpm离心5min集菌，用1mL的0.1M CaCl2洗菌两次(用毛细管将菌轻轻悬起，4℃下5000rpm离心5min，弃上清)，加入1mL的0.1M CaCl₂重悬菌体，4℃过夜，24小时内备用。

4)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞：取100-200μL步骤3)制备的大肠杆菌TOP10感受态细菌，加入到1.5mL的离心管中，再加入10μL步骤3)获得的连接产物，冰浴30min后，于42℃(水浴)热冲击90秒，冰浴3min，加入400μL的LB肉汤，离心管口用封口膜封紧，37℃下摇动2小时，取150μL涂于含40μg/mL卡那霉素的LB抗性平板，倒置于37℃培养箱中，培养12-16小时，挑取10-20个克隆，于LB琼脂平板上在37℃下增菌培养12小时，用特异引物进行PCR鉴定，可扩增出特定大小片段的为阳性克隆。

步骤四转化布鲁氏菌

1)提取含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的质粒：用质粒DNA小量纯化试剂盒从步骤三筛选出的大肠杆菌TOP10的阳性克隆中提取质粒。

2)A19布鲁氏菌株电转化感受态细胞制备：将A19布鲁氏菌株接种到5mL LB液体培养基中，37℃低速振荡培养6小时至OD值为0.6-0.8，将电击杯(1mm)和无菌去离子水预先在冰浴上预冷，在4℃下4000rpm离心5min收集菌体，用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)洗涤两次，离心集菌，再用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)悬浮均匀，分装成50μL体系，置冰浴上备用。

3)电转化：取1μL pUC18/N-K-C的重组质粒(100ng左右)，加入到步骤2)中新鲜制备的50μL感受态细菌(预冷l0min)中，轻微混匀，置冰上继续放置15min，加入到已预冷的电击杯中(贴壁加入避免气泡产生)，于25μF、200Ω、1.8KV的电击参数下电击。电击后立即加入500μL的LB液体培养基悬浮细菌，将电击细胞转到离心管中，37℃低速振荡培养2小时，取100μ1涂于含40μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。

4)突变株筛选和鉴定：从每个LB平板上各挑取5-6个克隆，接种于含40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基内37℃增菌培养12小时后，各取100μL菌液置于含100μL无菌蒸馏水的离心管中，混匀，煮沸5分钟后，10000rpm离心l0min，以上清液为模板，用VjbRKan-I/VjbRKana-R引物对和VjbRKan-N-F/VjbRKana-R引物对分别进行PCR鉴定，继续接种液体培养基进行培养，将连续3次经PCR鉴定均为阳性克隆作为目的基因缺陷突变株。对突变株进行序列测定，表明获得了序列正确的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株。

本发明还提供由所述A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的构建方法得到的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株。

本发明的另一个目的是提供由所述A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的构建方法得到的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株的应用，所述应用为布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株在制备疫苗制品中的应用，所述疫苗制品能进行免疫动物和野毒感染动物的鉴别。

本发明的另一个目的是提供由所述A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的构建方法得到的A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株在制备用于野毒感染动物的检测的试剂盒中的应用，所述试剂盒中还包括VjbR抗体检测试剂，将所述A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株作为疫苗进行免疫后，配合VjbR抗体检测试剂盒进行野毒感染动物的检测。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过特殊设计的引物，扩增得到VjbR基因的N端和C端序列以及kana抗性基因序列，通过PCR方法将它们连接起来，获得顺序为N-K-C的同源重组序列。

2.本发明通过同源重组的方法，制备了布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株，能够与非突变株感染进行鉴别，解决了现有布鲁氏菌弱毒疫苗难以进行免疫动物和野毒感染动物的鉴别诊断等问题。

3.本发明构建的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株缺失了对病原体非常关键的VjbR基因，毒力降低，有利于扩大疫苗的使用范围。

4.本发明构建的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株中含有kana抗性基因，可用来进行突变株的筛选，有利于突变株的构建。

5.本发明构建的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株，作为疫苗进行动物免疫后，可使用VjbR抗体检测试剂盒检出非疫苗免疫的动物，在只使用该苗免疫的养殖场可进行野毒感染动物的检测和净化，对控制布鲁氏菌病的流行、传播和国民经济的健康发展具有重要的应用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的构建流程图。

图2为VjbR基因的上游片段N和下游片段C的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中：泳道1为N片段，泳道2为DNA Marker DL2000，泳道3为C片段。

图3为kana基因片段的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中：泳道1为kana抗性基因，泳道2为DNA Marker DL2000。

图4为目的基因替换型同源性核苷酸片段N-K-C的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中：泳道1为阴性对照，泳道2为N-K-C片段，泳道3为DNA Marker DL2000。

图5为用特异引物对转化了PUC18/N-K-C重组载体的大肠杆菌TOP10的阳性克隆进行PCR鉴定的结果，图中：泳道1为C片段，泳道2为N片段，泳道3为kana片段，泳道4为DNAMarker DL2000。

图6为用引物对得到的目的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株的PCR鉴定结果，图中：泳道1为VjbRkan-N-F和VjbRkan-R扩增的PCR片段，泳道2为VjbRkan-I和VjbRkan-R扩增的PCR片段，泳道3为DNA Marker DL2000。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株的构建与应用其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。

以下实施例所用材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、方法和仪器，本领域普通技术人员均可通过商业渠道获得。

在本发明以下的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”和“竖着”等指示方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此，不能理解为对本发明的限制。

在本发明以下的描述中，需要说明的是，除非另有明确规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接连接，也可以是通过中间介质间接连接，可以是两个部件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以是具体情况理解上书术语在本发明中的具体含义。

此外，在本发明以下的描述中，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多根”的含义是两个或两个以上。

下面结合附图对本发明做进一步详细说明，但以下详细说明不视为对本发明的限定。

实施例1.A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：

步骤一PCR引物设计

作为优选的实施方式，为更好地鉴定重组，步骤一的PCR引物设计还包括在VjbR基因上游片段的外侧设计进行重组鉴定的上游引物VjbRKan-I，和VjbRKan-R配对进行重组菌株的鉴定。

引物序列如下：

引物名称	引物序列	Tm	扩增长度	序列编号
					VjbRKan-N-F	ttttggatccTGACGACGCTGATTACCTC	53.8	611	SEQ ID NO.1
VjbRKan-N-R	CGCTTGCTGTCCATAAAATGGAAATATCCTTGGTGATG	53		SEQ ID NO.2
					VjbRKan-C-F	CTTCTTGACGAGTTCTTCTGATCAACATGGTCGCGCGGA	64.6	571	SEQ ID NO.3
VjbRKan-C-R	ttttgtcgacGACTTCTGGAACAGACCCTATGG	56.1		SEQ ID NO.4
					VjbRKan-F	CATCACCAAGGATATTTCCATTTTATGGACAGCAAGCG	52.1	974	SEQ ID NO.5
VjbRKan-R	TCCGCGCGACCATGTTGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAG	52.4		SEQ ID NO.6
					VjbRKan-I	CCAGGAGCTGATCGATTTCG	55.7	1081	SEQ ID NO.7

步骤二目的基因替换型同源性核苷酸片段的获得

1)上下游片段的PCR扩增:以A19布鲁氏菌株的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对引物的引导下进行PCR扩增，扩增上游片段N和下游片段C，20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，上游引物(5uM)1μL，下游引物(5uM)1μL，水7μL，布鲁氏菌基因组DNA(20ng/μL)1μL.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,56℃30sec,72℃30sec，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物上游片段N和下游片段C进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如附图2所示，经扩增获得了两个同源性核苷酸片段，即长度约为611bp的上游片段N(SEQ ID NO.8)和长度约为571bp的下游片段C(SEQ ID NO.9)，与预期结果相符。

用宝生物工程(大连)有限公司生产的PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤1)的PCR扩增产物进行纯化，纯化方法按照说明书进行。

2)kana抗性基因的扩增

以pK19mobsacB质粒为模板进行PCR，扩增kana抗性基因片段，20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，上游引物(5uM)1μL，下游引物(5uM)1μL，水7μL，pK19mobsacB质粒DNA(20ng/μL)1μL.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,50℃30sec,72℃1min，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图3所示，经扩增获得了974bp的kana抗性基因核苷酸片段(SEQ ID NO.10)，与预期结果相符。

用宝生物工程(大连)有限公司生产的PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤2)的PCR扩增产物进行纯化，纯化方法按照说明书进行。

3)目的基因替换型同源性核苷酸片段N-K-C的扩增

以扩增回收的N片段、C片段、kana基因片段的混合液为模板，在引物的引导下进行PCR扩增，获取目的基因替换型同源核苷酸片段。20μL反应体系为：2ⅹPCR mixer 10μL，VjbRSKan-N-F上游引物(5uM)1μL，VjbRKan-C-R下游引物(5uM)1μL，水7μL，扩增回收的N片段、C片段、kana基因片段(各20ng/L)各0.5μl.PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃30sec,56℃30sec,72℃2min，共30个循环，最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图4所示，经扩增获得了2145bp的同源性核苷酸片段(SEQ ID NO.11)，与预期结果相符。

用宝生物工程(大连)有限公司生产的PCR产物纯化/琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤3)的PCR扩增产物进行纯化，纯化方法按照说明书进行。

步骤三构建转染质粒

1)酶切N-K-C片段和pUC18质粒

用BamH I和Sal I各50U分别酶切约500ng的N-K-C片段和约1000ng的自杀质粒pUC18。20μl酶切反应体系及反应条件为：N-K-C或pUC18(500ng或1000ng)4μL,10ⅹ缓冲液2μl，水13μL，在30℃下作用12h后，分别用宝生物的DNA片段纯化试剂盒纯化消化产物，纯化步骤按照试剂盒操作说明进行。

2)N-K-C片段与质粒连接

在T4DNA连接酶的作用下，将步骤1)中经酶切及纯化后的N-K-C片段与pUC18酶切产物在4℃连接过夜，以将片段N-K-C插入质粒的BamH I和Sal I位点处，得到含有N-K-C片段的重组载体，命名为pUC18/N-K-C，连接反应体系为：N-K-C片段酶切产物200ng,pUC18酶切产物100ng,T4DNA连接酶1μL,10ⅹ缓冲液1μL，补加水至10μL。

3)制备大肠杆菌TOP10感受态

接种受体菌大肠杆菌TOP10于3mL LB肉汤培养基中，在37℃下150rpm摇菌至浑浊(控制OD₆₀₀值为0.4-0.6，即菌量不能太多，也不能太少)，4500rpm离心5min集菌，用1mL的0.1M CaCl₂洗菌两次(用毛细管将菌轻轻悬起，4℃下5000rpm离心5min，弃上清)，加入1mL的0.1M CaCl₂重悬菌体，4℃过夜，24小时内备用。

4)转化大肠杆菌TOP10

取100-200μL步骤3)制备的大肠杆菌TOP10感受态细菌，加入到1.5mL的离心管中，再加入10μL步骤3)获得的连接产物，冰浴30min后，于42'C(水浴)热冲击90秒，冰浴3min，加入400μL的LB肉汤，离心管口用封口膜封紧，37℃下摇动2小时，取150μL涂于含40μg/mL卡那霉素的LB抗性平板，倒置于37℃培养箱中，培养12-16小时，挑取10-20个克隆，于LB琼脂平板上在37℃下增菌培养12小时，用特异引物进行PCR鉴定，可扩增出特定大小片段的为阳性克隆。

PCR鉴定结果如图5所示，经扩增分别获得了约611bp、571bp和974bp的扩增片段，与预期结果相符。

步骤四转化布鲁氏菌

1)提取含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的质粒

用质粒DNA小量纯化试剂盒从步骤3筛选出的大肠杆菌TOP10的阳性克隆中提取质粒，提取步骤按照说明书进行。

2)A19布鲁氏菌株电转化感受态细胞制备

将A19布鲁氏菌株(购自中国药品生物制品研究所)接种到5mL LB液体培养基中，37℃低速振荡培养6小时至OD值为0.6-0.8，将电击杯(1mm)和无菌去离子水预先在冰浴上预冷，在4℃下4000rpm离心5min收集菌体，用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)洗涤两次，离心集菌，再用等体积的预冷无菌去离子水(5mL)悬浮均匀，分装成50μL体系，置冰浴上备用。

3)电转化

取1μL pUC18/N-K-C的重组质粒(100ng左右)，加入到步骤2)中新鲜制备的50μL感受态细菌(预冷l0min)中，轻微混匀，置冰上继续放置15min，加入到已预冷的电击杯中(贴壁加入避免气泡产生)，于25μF、200Ω、1.8KV的电击参数下电击。电击后立即加入500μL的LB液体培养基悬浮细菌，将电击细胞转到离心管中，37℃低速振荡培养2小时，取100μ1涂于含40μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。

4)突变株筛选和鉴定

从每个LB平板上各挑取5-6个克隆，接种于含40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基内37℃增菌培养12小时后，各取100μL菌液置于含100μL无菌蒸馏水的离心管中，混匀，煮沸5分钟后，10000rpm离心l0min，以上清液为模板，用VjbRKan-I/VjbRKana-R引物对和VjbRKan-N-F/VjbRKana-R引物对分别进行PCR鉴定，继续接种液体培养基进行培养，将连续3次经PCR鉴定均为阳性克隆作为目的基因缺陷突变株。对突变株进行序列测定，表明获得了序列正确的布鲁氏菌A19疫苗株VjbR基因缺失突变株。

PCR鉴定结果如图6所示，经扩增分别获得了1611bp和1592bp的扩增片段，与预期结果相符。

实施例2.A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的毒力和免疫保护作用测定

1、突变株的毒力测定

取TSA(tryptose soy agar)培养基(胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、葡萄糖2.5g,NaCl 5.0g,K₂HP0₄ 2.5g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL)上生长的A19布鲁氏菌株和步骤一获得的VjbR基因缺失的突变株菌落，分别用PBS制成1X 10⁵CFU菌悬液，再将75只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成三组，分别在腹膜内每只小鼠注射0.2mLA19布鲁氏菌株和VjbR基因突变株菌液，在另一组每只小鼠注射0.2mL生理盐水作空白对照。分别在感染后的第8,15,28,42和60天，从每组中取5只小鼠处死，无菌条件下取出脾脏、称重、然后加5mL的PBS匀浆，10倍系列稀释后取0.1mL接种至TSA平板培养基上，30℃培养5天后细菌记数(CFU)，推算全脾内活苗数，最后换算成对数值，结果如表1和表2所示。

表1 A19布鲁氏菌株和VjbR突变株脾内细菌记数结果

注：每组测定结果均为5只小鼠的平均值。

表2 A19布鲁氏菌株和VjbR突变株的脾重计算结果

注：每组测定结果均为5只小鼠的平均值。

表1显示了A19布鲁氏菌株和VjbR突变株脾内细菌记数情况，表2显示了二者感染小鼠后的炎症应答情况。从二者感染小鼠后脾内活菌记数和脾重可以看出，A19布鲁氏菌株和本发明的VjbR突变株的毒力无有意义的差别，即突变株的毒力未增加。

2、测定A19布鲁氏菌株VjbR基因缺失突变株的免疫保护作用

取TSA(tryptose soy agar)培养基上生长的流产布鲁氏菌2308(购自中国药品生物制品研究所)菌落，用PBS制成5ⅹ10⁹CFU/mL的菌悬液，取A19布鲁氏菌株、VjbR基因缺失突变株分别免疫小鼠10周后，各组中10只小鼠分别腹膜内攻毒0.2mL的布鲁氏菌株2308悬液，同时设空白对照组，攻毒15天后，处死小鼠，取出脾脏，用5mL的PBS匀浆，用PBS系列稀释后，取0.1mL接种TSA平板，30℃培养5天后细菌记数(CFU)，推算全脾内活菌数，结果见表3。由表3可以看出，分别由牛种菌A19株和VjbR突变株免疫的小鼠组与空白对照组相比，脾内活菌记数明显降低，表明疫苗株和疫苗突变株均具有良好的免疫保护作用。将用上述方法获得的免疫效果较好的布鲁氏菌牛种A19VjbR基因缺失突变株命名为A19-VjbR。

表3 A19布鲁氏菌株和VjbR突变株免疫保护作用测定结果

注：每组测定10只小鼠的结果。

3、A19-ΔVjbR基因缺失突变株免疫血清的测定

用纯化的VjbR蛋白以1ug/ml的浓度4℃过夜包被酶标板，经2％的BSA封闭1h后洗涤，然后在孔内分别加入50倍稀释的布鲁氏菌标准阳性血清、标准阴性血清、A19免疫血清、A19VjbR缺失株免疫血清各10份，37℃孵育30min，洗涤，加入2000倍稀释的酶标牛二抗37℃孵育30min。洗涤后加入TMB显色液显色15min，加入终止液。放入酶标仪读取OD450nm值。从表4结果可以看出，A19VjbR缺失株免疫血清和标准阴性血清值相近，和标准阳性、A19免疫血清有明显差异，能从免疫样品中检出野毒感染样品及其它非VjbR缺失疫苗株免疫样品。

表4 A19-ΔVjbR基因缺失突变株免疫血清的测定结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> A19布鲁氏菌VjbR缺失突变株构建及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> VjbRKan-N-F

<400> 1

ttttggatcc tgacgacgct gattacctc 29

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> VjbRKan-N-R

<400> 2

cgcttgctgt ccataaaatg gaaatatcct tggtgatg 38

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> VjbRKan-C-F

<400> 3

cttcttgacg agttcttctg atcaacatgg tcgcgcgga 39

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> VjbRKan-C-R

<400> 4

ttttctcgag gacttctgga acagacccta tgg 33

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> VjbRKan-F

<400> 5

catcaccaag gatatttcca ttttatggac agcaagcg 38

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> VjbRKan-R

<400> 6

tccgcgcgac catgttgatc agaagaactc gtcaagaag 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> VjbRKan-I

<400> 7

ccaggagctg atcgatttcg 20

<210> 8

<211> 639

<212> DNA

<213> PCR扩增产物上游片段N(人工序列)

<400> 8

ttttggatcc tgacgacgct gattacctcc tccatcgcca ttcgcgcgca gcgcatcgtc 60

gtcggtgtga gcgagcgcaa gccggaactt gcagcacgct tttacgagcg cggcccgaaa 120

cgcagtcatg ccatcatggc gcaatccctt caggcgatga tcgacgcggg tgtgctcgag 180

cagcacgatg taacaagaac agcctatcaa ctttctgatc tttttttcgc cgggctctat 240

cgtccccggc tcttcggtgc gcttgcggag gcaccttccg agcaggcgat tcgggacaat 300

gtggagtccg cagtagactt tttctttaga gcctatggca aaaagtagag aatgtgttcc 360

aaagtgaaac acatttagga ttttttcgat cacgaaatag tgaaaatcgt taggatcggg 420

gtttttccaa cctcgtcata ttttgacctg ttattgtgtg caaagggttg caattaagta 480

attgccggtt gccaacgact atattttttt taagtcacta ataagcgatt gaaggcctct 540

gaggggaggc gattctctcg caagcagtta tagagatacc agagcgaagc ccgcatggtt 600

tcatcaccaa ggatatttcc attttatgga cagcaagcg 639

<210> 9

<211> 592

<212> DNA

<213> PCR扩增产物下游片段C(人工序列)

<400> 9

cttcttgacg agttcttctg atcaacatgg tcgcgcggaa accttccgcg cgacgccgta 60

gcaggcgaaa agaaaagctc agacgcgttt caggcgcgtt tgcgcagggg caccgggcat 120

cctcaaaagc tttcgccagc cgcactgtgt tggcggaagg atcgccatcc gcatcctcga 180

aggcgatatg gttcaattcc acgcctgccg tcctgtccgt cagggtaatg cgaaaatagg 240

catagacgcc ctgatggcga aattccatgt cgagggtgat ggaaggcggt gactgccagt 300

cgcaatgaaa ttcaccgccg tgaccgaggc ccagtgtgcc gggatagaaa tagagctcgg 360

cagcagagct tacaagatcg gcaatattgg caaagagctc acagcgtatg aaggcaatat 420

aatctgcggg atcaaccagc cggagatcag aaacgacatc ccggatattt tccgcgatga 480

tggtttctct ctcttttgaa aactgcaagc tcttcattgc atcaccgtgc tttcagaggc 540

cataaatatt atcttatagt atttgaatgc catagggtct gttccagaag tc 592

<210> 10

<211> 991

<212> DNA

<213> PCR扩增产物kana基因片段(人工序列)

<400> 10

catcaccaag gatatttcca ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc 60

gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag 120

gatctgatgg cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat 180

gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg 240

ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc 300

gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactcca 360

agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct 420

cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga 480

tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg 540

gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat 600

cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga 660

gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgga tgcccgacgg 720

cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg 780

ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat 840

agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct 900

cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga 960

cgagttcttc tgatcaacat ggtcgcgcgg a 991

<210> 11

<211> 2145

<212> DNA

<213> 扩增的目的基因替换型同源性核苷酸片段N-K-C(人工序列)

<400> 11

ttttggatcc tgacgacgct gattacctcc tccatcgcca ttcgcgcgca gcgcatcgtc 60

gtcggtgtga gcgagcgcaa gccggaactt gcagcacgct tttacgagcg cggcccgaaa 120

cgcagtcatg ccatcatggc gcaatccctt caggcgatga tcgacgcggg tgtgctcgag 180

cagcacgatg taacaagaac agcctatcaa ctttctgatc tttttttcgc cgggctctat 240

cgtccccggc tcttcggtgc gcttgcggag gcaccttccg agcaggcgat tcgggacaat 300

gtggagtccg cagtagactt tttctttaga gcctatggca aaaagtagag aatgtgttcc 360

aaagtgaaac acatttagga ttttttcgat cacgaaatag tgaaaatcgt taggatcggg 420

gtttttccaa cctcgtcata ttttgacctg ttattgtgtg caaagggttg caattaagta 480

attgccggtt gccaacgact atattttttt taagtcacta ataagcgatt gaaggcctct 540

gaggggaggc gattctctcg caagcagtta tagagatacc agagcgaagc ccgcatggtt 600

tcatcaccaa ggatatttcc attttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg 660

cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa 720

ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca 780

tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 840

gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 900

cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactcc 960

aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 1020

tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 1080

atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 1140

ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 1200

tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 1260

agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgg atgcccgacg 1320

gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 1380

gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 1440

tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 1500

tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 1560

acgagttctt ctgatcaaca tggtcgcgcg gaaaccttcc gcgcgacgcc gtagcaggcg 1620

aaaagaaaag ctcagacgcg tttcaggcgc gtttgcgcag gggcaccggg catcctcaaa 1680

agctttcgcc agccgcactg tgttggcgga aggatcgcca tccgcatcct cgaaggcgat 1740

atggttcaat tccacgcctg ccgtcctgtc cgtcagggta atgcgaaaat aggcatagac 1800

gccctgatgg cgaaattcca tgtcgagggt gatggaaggc ggtgactgcc agtcgcaatg 1860

aaattcaccg ccgtgaccga ggcccagtgt gccgggatag aaatagagct cggcagcaga 1920

gcttacaaga tcggcaatat tggcaaagag ctcacagcgt atgaaggcaa tataatctgc 1980

gggatcaacc agccggagat cagaaacgac atcccggata ttttccgcga tgatggtttc 2040

tctctctttt gaaaactgca agctcttcat tgcatcaccg tgctttcaga ggccataaat 2100

attatcttat agtatttgaa tgccataggg tctgttccag aagtc 2145

Claims

1.A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)设计引物：分别依据布鲁氏菌A19全基因组序列中靶基因VjbR的上、下游区域的核苷酸序列，各设计一对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度分别为671bp和511bp的同源性核苷酸片段；依据pK19mobsacB质粒的kana抗性基因，设计一对引物，扩增得到974bp的kana抗性基因片段，扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端分别添加一个限制性内切酶识别位点及其保护性碱基；

2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得:以布鲁氏菌A19的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对VjbR基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；依pK19mobsacB质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；将扩增获得的VjbR的上、下游同源性核苷酸片段和kana抗性基因片段采用PCR扩增的方法定向连接，构成VjbR基因被kana抗性基因替换的同源性核苷酸片段；

4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因VjbR的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。

2.根据权利要求1所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)还包括依据kana抗性基因序列，在kana抗性基因的两侧设计一对特异性的引物，所述靶基因VjbR的扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端分别添加kana抗性基因的上下游引物的反向互补序列，所述kana抗性基因的一对引物的5’-末端分别添加了布鲁氏菌VjbR基因上游片段中下游引物和VjbR基因下游片段中上游引物的反向互补序列。

3.根据权利要求2所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：以含有kana抗性基因的质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana抗性基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到kana抗性基因片段，所述定向连接为将VjbR的上游同源性核苷酸片段、kana抗性基因片段、VjbR的下游同源性核苷酸片段，采用PCR扩增的方法定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段。

4.根据权利要求2所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，VjbR基因上下游设计的两对特异的PCR引物分别为VjbRKan-N-F/VjbRKan-N-R与VjbRKan-C-F/VjbRKan-C-R，其序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述kana抗性基因的两侧设计的一对特异性的引物为VjbRKan-F/VjbRKan-R，其序列分别如SEQID NO.5-6所示。

5.根据权利要求1所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)还包括在VjbR基因上游片段的外侧设计进行重组鉴定的上游引物VjbRKan-I，其序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求3所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述含有kana抗性基因的质粒为pK19mobsacB质粒，所述克隆载体为PUC18。

7.用于构建A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的引物组，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO.1-7所示的引物。

8.根据权利要求1-6任一项所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株的构建方法构建得到的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株。

9.根据权利要求8所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株在制备布鲁氏菌病疫苗制品中的应用。

10.根据权利要求8所述的A19布鲁氏菌VjbR基因缺失突变株在制备用于野毒感染动物的检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括VjbR抗体检测试剂。