CN113615643B

CN113615643B - 一种可诱导b细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用

Info

Publication number: CN113615643B
Application number: CN202111189601.8A
Authority: CN
Inventors: 孙瑞林; 王津津; 池骏
Original assignee: Shanghai Dishi Biotechnology Co Ltd; Shanghai Model Organisms Center Inc; Guangdong Nanmo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Dishi Biotechnology Co Ltd; Shanghai Model Organisms Center Inc; Guangdong Nanmo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-10-13
Also published as: CN113615643A

Abstract

本发明提供一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及其在B细胞缺陷药物中的应用。该方法将白喉毒素受体和绿色荧光蛋白定点插入到Cd19分子基因表达框，构建了一个Cd19‑IRES‑DTR‑EGFP（简称：Cd19‑DTR）基因修饰小鼠模型，该模型可以实现小鼠内源Cd19基因驱动白喉毒素受体和绿色荧光蛋白表达。利用该模型，可以通过在特定时间点或时间段内给予小鼠白喉毒素将B细胞杀死，造成B细胞缺陷，对B细胞在特定生理、病理过程中的作用进行研究。

Description

一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

B细胞，又称B淋巴细胞，来一种源于骨髓的多能干细胞。B细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体（免疫球蛋白），产生抗体介导的体液免疫应答；同时，活化的B细胞还是一类抗原递呈细胞其表面BCR结合可溶性抗原，通过内吞和加工后，以抗原肽：MHC-Ⅱ类分子复合物形式提呈给CD4⁺T细胞。除此之外，激活的B细胞还可以产生大量的细胞因子，参与免疫调节、炎症反应及造血。近年来，在肿瘤免疫治疗的研究中发现，B细胞是肿瘤微环境中重要的免疫细胞，B细胞对抗肿瘤免疫产生起到关键的促进作用，B细胞浸润和免疫治疗的效果呈正相关。

在体内特异性的剔除某一类细胞，是研究细胞在体内功能的一种有效方法。为了更好的研究B细胞在免疫系统中的重要作用，研究人员开发了多种B细胞缺陷小鼠模型，如Jh小鼠模型，该模型通过敲除小鼠抗体重链基因的J位点，导致不能产生重链的可变区重组，进而导致B 细胞发育在前 B 细胞阶段停止，缺少成熟B细胞。这类B 细胞缺陷小鼠模型广泛应用于免疫基础机制研究以及作为免疫源性测试物品研究的宿主小鼠。该类抗体重链基因缺陷小鼠模型从出生就缺少成熟B细胞，基于成熟B细胞的重要作用，其缺失也导致小鼠其他免疫功能的异常，不利于正常免疫机制的研究。因此，迫切需求有一种可诱导性的B细胞缺陷小鼠模型，其可以在诱导剂的作用下，在特定时间内造成B细胞缺陷，在其他时间段内，维持正常状态。

白喉毒素（DT）介导的细胞毒性非常高效，细胞质中白喉毒素活性单个分子就足以杀死真核细胞，其作用机制严格依赖于其受体-肝素结合 EGF 样生长因子前体（proHB-EGF，也称为 DTR）介导的内吞作用。DTR 结合DT并促进 DT 内吞作用,入细胞质后，DT催化延伸因子 2 的失活，导致蛋白质合成终止并导致细胞凋亡。人类和灵长类动物细胞天然对DT 敏感，但鼠细胞对白喉毒素的杀伤不敏感。将灵长类动物的DTR转入小鼠细胞可使小鼠对DT产生敏感。因此，可以借助细胞类型特异的启动子驱动灵长类DTR在小鼠特定细胞类型表达，进而通过给予小鼠白喉毒素，实现对特定细胞类型的可诱导杀伤。

哺乳类动物B细胞的分化发育过程主要可分为前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞五个阶段。Cd19分子在B细胞发育过程中，除浆细胞阶段外，在B细胞发育的其他阶段均广泛表达。因此，Cd19驱动DTR在小鼠B细胞中的表达，通过给药白喉毒素，有望实现可诱导的小鼠B细胞缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建可诱导性B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及其应用。该方法利用Cd19分子为小鼠B细胞的标记分子这一特性，通过将白喉毒素受体和绿色荧光蛋白定点插入到Cd19分子基因表达框，构建了一个Cd19-IRES-DTR-EGFP（简称：Cd19-DTR）基因修饰小鼠模型，该模型可以实现小鼠内源Cd19基因驱动白喉毒素受体和绿色荧光蛋白表达。利用该模型，发明人可以通过EGFP荧光表达标记小鼠B细胞；可以通过在特定时间点或时间段内给予小鼠白喉毒素将B细胞杀死，造成B细胞缺陷，对B细胞在特定生理、病理过程中的作用进行研究。本领域技术人员也可以替换其他标记物来标记小鼠B细胞，比如tdTomato等。

具体的，包括如下内容；

一种诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

1）gRNA靶位点筛选：在插入位点附近设计并合成识别靶位点的gRNA；

2）同源重组载体构建：同源重组载体结构从左到右依次为：重组左臂、核糖体接入位点IRES、白喉毒素受体DTR、荧光蛋白、重组右臂；

3）构建小鼠模型：将步骤2）获得的同源重组载体、Cas9 mRNA 和gRNA混合，导入小鼠，传代获得重组阳性小鼠。

所述荧光蛋白为EGFP，也可以选择本领域中常用的报告基因所替代，只要能够起到发光检测作用即可。所述小鼠，在适宜的时机，其可以理解为本领域中常规的替换的动物模型，如大鼠、豚鼠、狗、猫等，直至能够实现相同目的的哺乳动物模型，均在保护范围内。

其中，重组左臂、核糖体接入位点IRES、白喉毒素受体DTR与绿色荧光蛋白EGFP的融合蛋白表达框、重组右臂序列可依次为SEQ ID NO:11-14，上述序列仅为举例，任何能够实现重组功能的载体同源臂、报告基因序列均可使用。

为了避免破坏小鼠内源Cd19的表达进而造成正常情况下的B细胞功能缺陷，可将重组载体插入Cd19基因终止密码子之后。

本申请还涉及按如上方法获得的B细胞缺陷小鼠模型，所述小鼠模型包括重组左臂、核糖体接入位点IRES、白喉毒素受体DTR、荧光蛋白、重组右臂；通过在在特定时间段给予小鼠白喉毒素可造成B细胞缺陷，一定时间后，B细胞功能可恢复。

本申请还涉及一种白喉毒素调控B细胞缺陷的非疾病诊断治疗的方法，包括如下步骤：

1）按照上述方法构建B细胞缺陷的小鼠模型；

2）在特定时间段给予小鼠模型白喉毒素调控B细胞缺陷，白喉毒素剂量可为0.015mg/kg，可维持约2周时间内的B细胞缺失。

进一步的，所述方法并非用于疾病的诊断和/或治疗作用。

有益效果

本发明提供了一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用，利用筛选到的高活性gRNA靶位点，基于CRISPR/Cas9系统介导的同源重组构建Cd19-DTR小鼠模型；发明人对该模型B细胞EGFP荧光表达，白喉毒素对B细胞的可诱导性杀伤进而造成的B细胞缺陷进行了验证，该模型可以应用于特定生理、病理条件下的B细胞功能研究等领域。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有方法和实验中的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图做简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1:小鼠Cd19基因结构和Cd19-DTR基因修饰后的Cd19基因结构。

图2：gRNA活性T7核酸内切酶I酶切检测电泳图。数字为对应的gRNA，Con为对照，M为DNA marker。

图3: Cd19-DTR小鼠模型构建策略示意图及鉴定结果；图3中的A图为Cd19-DTR小鼠构建策略示意图；P1,P2,P3,P4为重组PCR鉴定引物位置示意；图3中的B图为F0代小鼠同源重组鉴定电泳图；数字为小鼠编号，wt为野生型对照；M,为1kb DNA marker。

图4：F1代小鼠同源重组鉴定电泳图；数字为小鼠编号，wt为野生型对照；M为1kbDNA marker；图4中的A图为F1代5-16号小鼠左臂同源重组鉴定结果；图4中的B图为F1代左臂同源重组阳性小鼠右臂同源重组鉴定结果。

图5：Cd19-DTR小鼠B细胞EGFP荧光表达检测。

图6：Cd19-DTR小鼠B细胞可诱导剔除效果检测；图6中的A图为实验时间轴；图6中的B图为流式细胞术检测小鼠外周血B细胞含量结果。

具体实施方式

实施例一

Cd19-DTR小鼠模型构建

为了避免破坏小鼠内源Cd19的表达进而造成正常情况下的B细胞功能缺陷，发明人Cd19-DTR小鼠模型的构建设计策略为将IRES-DTR-EGFP元件插入到小鼠Cd19基因终止密码子后。野生型Cd19基因结构和Cd19-DTR基因修饰后基因结构如图1所示。

1）gRNA靶位点筛选

gRNA靶序列决定了其靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。Cas9切割目的基因的效率越高，发生同源重组的效率就越高。因此，高效特异的靶序列选择和设计是成功构建Cd19-DTR小鼠模型的前提。

根据重组方案，在插入位点附近设计并合成识别靶位点1-10（SEQ ID NO:1-10）的gRNA(gRNA1-gRNA10)。使用T7核酸内切酶I检测试剂盒检测，从酶切后凝胶电泳结果可见不同的gRNA活性不同，检测结果参见图2所示。从中优先选择靶向位点3（SEQ ID NO:3）的gRNA3（SEQ ID NO: 19，即

gCUAGUCACUUGGGAGUCACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu）为后续小鼠受精卵注射实验的gRNA。

2）同源重组载体构建

根据获得的gRNA位点及插入位点信息，构建同源重组载体，载体结构如策略图3所示，从左到右结构依次为：重组左臂、核糖体接入位点（IRES）、白喉毒素受体（DTR）与绿色荧光（EGFP）融合蛋白编码区、重组右臂，序列依次为SEQ ID NO:11-14。重组左臂和重组右臂，通过以小鼠基因组为模板，PCR扩增获得，其余片段通过全基因合成获得。构建过程中，先通过PCR获得重组左臂、基因敲入片段（IRES-DTR-EGFP）和重组右臂,利用In-Fusion的方法将3个DNA片段连入PBR322载体，获得最终的PBR322-Cd19-DTR重组载体。载体经酶切及测序验证正确后，进行后续的小鼠制备。

3）Cd19-DTR基因敲入小鼠构建：取C57BL/6小鼠的受精卵，按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将PBR322-Cd19-DTR重组载体、Cas9 mRNA和gRNA混合后,进行受精卵显微注射，注射后的受精卵经培养箱短暂培养后，移植至受体母鼠的输卵管，获得基因修饰小鼠F0代小鼠。F0代小鼠出生后，剪尾抽提基因组，分别利用针对同源重组左臂的鉴定引物对(引物P1和P2)和右臂的鉴定引物对(引物P3和P4)，对是否发生正确同源重组进行鉴定，引物位置示意如图3A中的P1-P4所示，序列信息如下：

引物名称	序列信息（5’→3’）
		P1	ACACCTCGCCTATGCTTCTCCTTA （SEQ ID NO: 15）
P2	TTGTGGCCATATTATCATCGTGTT （SEQ ID NO: 16）
		P3	TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG （SEQ ID NO: 17）
P4	GCCCAGGCCAGTGTCAGCAGT （SEQ ID NO: 18）

引物对P1/P2,P3/P4的PCR反应体系相同，具体如下：

PCR反应组成	体积 (µl)
		ddH<sub>2</sub>O	31
PCR Buffer	10
		2.5 mM dNTP	4
引物1(20pmol/µl)	1
		引物2(20pmol/µl)	1
DNA Polymerase	2
		genomic DNA	1
总计	50

引物对P1/P2,P3/P4的PCR反应程序相同，具体如下：

步骤	温度（℃）	时间	备注
				1	98	2 min
2	98	15 sec
				3	60	15 sec
4	68	3 min	重复步骤2-4共34个循环
				5	68	5 min
6	12	10 min

共计出生11只F0代小鼠，对4-11号小鼠左臂同源重组鉴定结果如图3中的B图所示，正确同源重组的F0代小鼠，可以扩增出3.8kb大小的条带，阴性小鼠无PCR产物可以扩增出，结果显示4号和11号小鼠左臂发生正确的同源重组；4号和11号小鼠右臂同源重组鉴定的结果如图3中的C图所示，右臂正确重组可以PCR扩增出4kb大小条带，阴性小鼠无PCR产物可以扩增出，结果显示4号和11号小鼠右臂也发生了正确的同源重组。

4号和11号F0代小鼠成年后与野生型C57BL/6小鼠交配，获得F1代小鼠。F1代小鼠出生后，剪尾抽提基因组，用和鉴定F0代小鼠相同的条件，分别针对同源重组左臂(引物P1和P2)和右臂(引物P3和P4)进行PCR鉴定，确认获得的 F1代小鼠是否是正确同源重组的Cd19-DTR基因敲入小鼠，鉴定结果如图4所示。图4中的A图为F1代5-16号小鼠左臂同源重组鉴定结果；图4中的B图为F1代左臂同源重组阳性小鼠右臂同源重组鉴定结果。结果显示：7，8，10，12，13，15，16号F1代小鼠为传代获得的重组阳性小鼠。

实施例二

Cd19-DTR基因敲入小鼠B细胞EGFP荧光表达检测

Cd19-DTR小鼠构建过程中，根据设计策略DTR和EGFP以融合蛋白的形式，共同表达。因此，小鼠B细胞表达DTR的同时，应可同时检测到EGFP荧光的表达。发明人通过流式细胞术对外周血B细胞EGFP荧光表达情况进行了检测。流式细胞术检测结果如图5所示，Cd19-DTR小鼠外周血中Cd19阳性细胞几乎均可以检测到EGFP荧光，荧光比例为：98.25%{1.16/(1.16+65.24)}；野生型C57BL/6小鼠外周血中Cd19阳性细胞几乎均检测不到EGFP荧光。

实施例三

Cd19-DTR基因敲入小鼠白喉毒素诱导的B细胞缺陷效果检测

为了验证B细胞表达DTR后是否可以为白喉毒素所剔除，发明人分别在实验第1，3，5天通过腹腔注射给予野生型小鼠和Cd19-DTR小鼠白喉毒素，剂量为0.015mg/kg；给予白喉毒素同时，分别在实验第1，3，7，14，21天对外周血中B细胞含量进行检测，相关时间点如图6中的A所示。流式细胞检测结果如图6中的B所示:Cd19-DTR小鼠腹腔给予1次白喉毒素，第三天Cd19⁺细胞的含量即从正常的40-50%下降到1.26%；3次给药结束后，到实验第七天Cd19⁺细胞比例仅为0.39%，到实验第十四天Cd19⁺细胞比例恢复到5.29%，到实验第21天Cd19⁺细胞比例恢复到16.22%。从该结果看，给予Cd19-DTR基因敲入小鼠白喉毒素可以诱导性的杀死B细胞，造成B细胞缺陷，3次连续给药可以维持大约2周时间内的B细胞缺失，其后随着时间推移B细胞更新，B细胞含量不断增加，直至回复到正常水平。

综上所述，发明人提供了一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法，利用筛选到的高活性gRNA靶位点，基于CRISPR/Cas9系统介导的同源重组构建Cd19-DTR小鼠模型；发明人对该模型B细胞EGFP荧光表达，白喉毒素对B细胞的可诱导性杀伤进而造成的B细胞缺陷进行了验证，该模型可以应用于特定生理、病理条件下的B细胞功能研究等领域。

序列表

<110> 广东南模生物科技有限公司

上海南方模式生物科技股份有限公司

上海砥石生物科技有限公司

<120> 一种可诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用

<141> 2021-06-14

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatttacact ttccttttcc tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttcataag agtctgcatc tgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagtcactt gggagtcacg tgg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccttcccat gctggttcta gg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgacgaccta gaaccagcat ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcagactct tatgaaaaca tgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agagggccac atggggactt ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacctagaac cagcatggga agg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tccagctcac ctagtcactt ggg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacgtgactc ccaagtgact agg 23

<210> 11

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttgtgctcc gtggctcaat ccttgtgctc ctgggaacaa ctggttcttc cttagtggac 60

gggagaagag ccccctggag agattaaggc ttgaggtctg tgtcctgctc tgggctctca 120

gccgtatgcc ccttgagggg ttggggagta agctgcattg tggggtcctt gtctcaaagc 180

actttcctct tagcagtgtg gctctggctg ttgagaactg gtggatggat agtcccagtg 240

gtgactttag tatatgtcat cttctgtatg gtttctctgg tggcttttct ctattgtcaa 300

agaggtaagt catgcccctg agcttccccg aattctaccc catctttctt aggacaagcc 360

catactggcc aatctaatgc accccacagc ctcatccctc ctttactgtc tctcatactt 420

cctggggtcc ctggtatttg tacaaccatc ccctctattg acccaagtga cctcccccgt 480

gtcccccaaa ttcacctcct gcctgccaac ccctctcctg atccatctct ttaaatccca 540

ccagccttta tcctgagaag gaaaaggaag cgaatgactg accccgccag gaggtaaagt 600

agcaaatgcc cgcccttccg ctataagctt tacactgtcc tctgtcacgt ggggtgggcc 660

ttggtgccat ctctcttggt tgaaatactg cccaagtctg gaagccacct tcaaaatcac 720

ctcccttggc atggtcccaa actctttggg taggcatccc tacacactta actcccagaa 780

tagactgcag ctgggcatcc ctacatggtt gagccttaag gtacaccaac cctttctccc 840

tccagattct tcaaagtgac gcctccctcg ggaaacggga cccagaacca gtacgggaat 900

gtgctctccc ttcctacatc tacctctggc cagggtgagg gaccactgcc ttgaaaggct 960

ttcaagtcgc acccttctct ccggcactag ccagctatgc cttgtcctca tttctccaat 1020

cttctcagag cagaaccttc cccagagcag agcccaggac caaatctcaa cagatcagcc 1080

aagtctagcc actggacctt ggccagagcc agccttgtcc tagaacttga ggccaaggct 1140

cagattttga tcccttcccc atggctcaag gccggttatg caggcacaca gaggctttct 1200

gaagcattgt ctcctttccc tctgatgggc atcttaaatc tctcttttca ccagcccatg 1260

ctcagcgttg ggctgctggc ctagggagtg tccctgggtc ctatggaaat ccacgcattc 1320

aagtccagga tactggagct cagagccatg aaacaggtca gatttaaggg ttgttcctca 1380

ccttgagagt gtcggagcag cctgtggtgg gattagtgga ctgtgggtgg aggaagagag 1440

ataccgctca gctctccaca ctggtcccaa attcaggact ggaagaagaa ggggaggcct 1500

atgaagagcc agacagcgag gagggctctg aattctatga gaacgactcc aaccttgggc 1560

aggaccaggt ttcccagggt gagtccccat tctccctggt cctgacactt caacagtagg 1620

ctgatggctg acaacctttg ctaaagatgc cctcattctc taacagatgg gagtggctat 1680

gagaaccccg aggatgagcc catgggtcca gaggaagaag actccttctc caatggtaat 1740

gtggtgtcct tgtagggttg gtggctagga aaacgtgctt ggtgctgcag ggctcctact 1800

gcctgagcaa ctcctgcgct ctctcttcca cagctgagtc ttatgaaaat gcagatgagg 1860

agctggccca accagttggc aggatgatgg gtgtgtattt gagtgagcga gggctgtcac 1920

tcttggaaga agctggagac caggaaaaaa agtgatatct ttgtctcttt tcttgttcca 1980

gacttcctga gcccccatgg gtctgcgtgg gaccccagcc gggaagcatc ctcgcttggt 2040

gagagtgctt agggcatcct tctagggtca atttcagatg atataaactc agctctgatc 2100

tccaagtcca agcctaacag tggtcttaga ccttattccc aactccacct ctatcccgtt 2160

tccccgtgtt tctgccattt ctaaccttga agaccaatct tgacccaaaa tgaacctgac 2220

ataactgttc atgtctagaa ttccaacttg tgggaaagtt aaggcagaaa gatggtcatg 2280

ggcttaaggc tagtctgggg tactttgtga attccaggct agcctaggct gaagctttgt 2340

aacaaaaaat gtaacgaaac acactcagcc aaccgactga agcattgacc tcaatacctt 2400

ctctcttaga gtttggcctt cacctcaccc cagtttaaag tggacttcaa ccttgacccc 2460

aactgtctgt atcatttcct gtgagcttga ctttgactcc tcccaattct gttcttgacc 2520

cttcctttgg ccttggccat cttagaacca agtaggatct tgatgctgac aaatcagtcc 2580

tagtttgaca ttaggaactt cgacttcttg cctagctcct ctcccgtggg taggcaggac 2640

ttcccttccc ccaagcccca gcagaatttc tgggtctcta atcttccatc ccatgcctaa 2700

acagggtccc agtcctatga agatatgaga gggatcctct atgcagctcc tcagctccac 2760

tcaattcagt ccggtcccag tcatgaagaa ggtgggtgtt tctgcactgt ttctcgttgt 2820

cctctggaca cccccctccc cctccctccc ccactctacc ccagcatcct tttcatccaa 2880

tttacacttt ccttttcctg gtcttatcca gatgcagact cttatgaaaa catggataag 2940

tctgacgacc tagaaccagc atgggaagga gagggccaca tggggacttg gggaaccacg 3000

<210> 12

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg 120

cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca 180

aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa 240

gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt 300

gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt 360

gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca 420

acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc 480

ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc 540

acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tggccacaac c 591

<210> 13

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaagctgc tgccgtcggt ggtgctgaag ctccttctgg ctgcagttct ttcggcactg 60

gtgactggcg agagcctgga gcagcttcgg agagggctag ctgctggaac cagcaacccg 120

gacccttcca ctggatctac ggaccagctg ctacgcctag gaggcggccg ggaccggaaa 180

gtccgtgact tgcaagaggc agatctggac cttttgagag tcactttatc ctccaagcca 240

caagcactgg ccacaccaag caaggaggag cacgggaaaa gaaagaagaa aggcaaggga 300

ctagggaaga agagggaccc atgtcttcgg aaatacaagg acttctgcat ccacggagaa 360

tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct gccacccagg ttaccatgga 420

gagaggtgtc atgggctgag cctcccagtg gaaaatcgct tatataccta tgaccataca 480

actatcctgg ctgtggtggc cgtggtgctg tcctctgtct gtctgctggt catcgtgggg 540

cttctcatgt ttaggtacca taggagaggt ggttatgatg tggaaaacga agagaaagtg 600

aagttgggca tgactaattc ccacccggat ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc 660

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 720

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 780

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 840

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 900

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 960

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1020

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1080

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1140

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1200

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1260

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1320

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaa 1365

<210> 14

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcccaagtg actaggtgag ctggacgctg cccctgggag aggggaggaa gagagggata 60

aatgaggatg gtaatgcagc cctggctgct ggggagagaa aggggaaggg ttttctgggt 120

ccagtggata gggcctagac gtcatctcat actttgcttg tttgtttgtt tttttatgta 180

gcctggactt cgttaggtcc caagaaccac atctgattct gaaatctgga gatcccagat 240

ggtgtcagtc agtgaaatga ccttgatcag gatgtgtgca tgctgacaca cacacactca 300

tatgcatgtt caagcaaagc ttccttttga ccctttgctt tccccaaata aacccaatta 360

gccactcaaa ttctctgaag ccggcccttg tgtgggatag gaagggaaga tggggttgaa 420

tccagccctg agtcacccag aggaaggaga actgaggtct gagtacatcc tggctctagc 480

cttcccatgg cctggcattt agccacctaa catccagtga tgcaaatatg tccagccgct 540

acattccatg gtgtcccaca agggagagac agtgatggga ctagcagact gtttggttgt 600

aacccatccc tgctcaccct gcacaaactg ggaaacactg tctgcctctc ttttaatcct 660

gcctgctcca ggctaacagg ccagtaccct caccttcgag tttctggcaa cactacctga 720

gtgcctgctc agggggttca gcttctgacc atatgtagac accaccccag ctctgagttt 780

acacatcatc accccttgcc taagacctga aacccccctt taccttcgcc caggtgtgcc 840

atttccctgc tccctcctgc atccttggga cctgtgaacc tactcaagtg ctgctctcaa 900

taaatctgcc tttatacttt ctaattcggc ttgaattggc ttgtttcttt ggatgctgag 960

aacctgggag gaattgagcc taaagcccct tgtgctgggc ccctggcctt ctgggaactg 1020

ctcccttccc ctcttctcat tcgttttcca agccccacat gccacttccc tgaattcttg 1080

taggatgatt tttctcaaat tctttcctgg tcgtgcccat ctccccgatg cctttactgg 1140

actgtgatat ccttagccgc tttgggacca cagaaaggac tccataatcc ctggatccca 1200

taatctctcc tgactcccat cttcgtcttc ctctggttgc ctcacaggtc accacctgag 1260

actgtgctgt cctcacccta ccagatcttg tcaaccccca agtatgggat atttccaccc 1320

cggtggttgc tacttacccc gagacggtcc tggtccacct caaggacccc tcatccttcc 1380

atcctagctt cccatttctg aaacccatcg ctgcagtctc aagcccatca ctagctgcct 1440

cctgtctcag gaacttctaa tgcagcactc ccattctccc agtgaataag cctaacacct 1500

agtacagaat ctttacctcg ttactgaagt agtaatccca acccacccat ggttaccaac 1560

tctacaccct tgtcttagct agggttttac tgacaccatg accaaggcaa ctcttataag 1620

gacaacattt aattgggcct ggcttacaag gttcagcagc tgggacacac tagtcttagg 1680

ctctgcatag atccccaaga acaagtatga atggcctggc atggctttgt tcatactcaa 1740

cagatccact ttcatctctt tctctttctg ggtctctttt ttttcccctc tgttgcccct 1800

gtcacacagt gacattgtgg gctaggctga ctgtccctct gtgggatgac aagatgtcct 1860

ctccaccctg ggatccctct ttaagtggac agaaaggttc tgtcacccta ttatttgctt 1920

tacctatgat aagagagaca gaacttgtca tacccgacgg gtcaaagaaa atgggggttg 1980

ccatggggct attgtaaaaa aaaaaagtct cctaagatgg tgcagacaaa aattctgtgg 2040

ctaacatgga aagaatgggc cacaaaactg gtttgttctt tcccagtaca acacaacaca 2100

acacaacaca acacaacaca acacaacaca atacactcca gatccttgtg acgactggtg 2160

ggctcaggga gtgagagaca aggtctagca aagggatata tctctgtatc catggaaaca 2220

aatagaaatc tagtgagcct acatccagac cctgccctct gtcctcgaga gcctggcaaa 2280

ccccaccaag accacagagc agcaggagaa ctccctcaaa tcacaccttg gagactcctc 2340

aatctcaggt taaaaactaa gaaaaaagaa cctttctcct gactggacct catccaggag 2400

gaagcaacgc tacttagcct cactaaattc tccaagctta gcaactgttc tgtttgtttg 2460

tttgtttgtt tgttttgttg tttttttctg tgctgctttg ggccaccccc tttgaccata 2520

gtgttcttac ctagtctgat aatgatgcca gggactgacc cccaacaatg aacaactatt 2580

atacagcatg cgcccctctt tcaggactct cttggatacc tattcccttt ctgctacctg 2640

actccctttg tcatactact gacataactt tgatgtcttc ctggtcaccc cccagtgggg 2700

ttcttcaatg actatatcaa aaatcgtgtc ccctggtgat ccctcctctc tctgtacctg 2760

gtgatgctgc atggcagggc tgaaatggcc gtgctctcct ctcctattga cccctcccag 2820

catcaggtac tctttactca gacacgcccc gtggtcccaa tggtggcact gacagggatt 2880

gctacgatgg cttcaacaag agcaactggc ttaaatgtag gcactatggg acactcagtg 2940

ttgggatcaa agggtgtgtg accatctcca aaggtccatc aacaactcag cagcgtcact 3000

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acacctcgcc tatgcttctc ctta 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgtggccat attatcatcg tgtt 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcatggccga caagcagaag aacg 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcccaggcca gtgtcagcag t 21

<210> 19

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcuagucacu ugggagucac gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu u 101

Claims

1.一种诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）gRNA靶位点筛选：筛选靶位点，合成识别靶位点的gRNA，所述gRNA识别的靶位点序列如SEQ ID NO:3所示；

2）同源重组载体构建：同源重组载体结构从左到右依次为：重组左臂、核糖体接入位点IRES、白喉毒素受体DTR、绿色荧光蛋白、重组右臂；白喉毒素受体DTR与绿色荧光蛋白组成融合蛋白表达框；

3）构建小鼠模型：将步骤2）获得的同源重组载体和Cas9 mRNA 、gRNA混合，导入小鼠，传代获得重组阳性小鼠；所述同源重组载体插入Cd19基因终止密码子之后；

其中，步骤2）中重组左臂、核糖体接入位点IRES、白喉毒素受体DTR与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达框、重组右臂序列依次为SEQ ID NO:11-14。

2.根据权利要求1所述的诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括鉴定步骤：抽提步骤3）获得的重组阳性小鼠基因组，分别利用针对重组左臂的鉴定引物对P1和P2，以及针对重组右臂的鉴定引物对P3和P4，对是否发生正确同源重组进行鉴定，P1-P4分别如SEQ ID NO:15-18所示。

3.根据权利要求1-2中任一项所述诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法制备的B细胞缺陷小鼠模型在诱导B细胞缺陷中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，给予小鼠白喉毒素造成B细胞缺陷后，B细胞功能能够恢复。

5.一种白喉毒素调控B细胞缺陷的非疾病诊断治疗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）按照权利要求1-2中任一项所述一种诱导B细胞缺陷小鼠模型的构建方法构建B细胞缺陷的小鼠模型；

2）给予小鼠模型白喉毒素造成B细胞缺陷后，B细胞功能能够恢复。

6.根据权利要求5所述的一种白喉毒素调控B细胞缺陷的非疾病诊断治疗的方法，其特征在于，所述白喉毒素剂量为0.015mg/kg，分3次连续给药，维持2周时间内的B细胞缺缺陷。