CN107058393B - 一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用，该方法以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；并扩增卡那霉素抗性基因片段；将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；将获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株。本发明操作过程相较于自杀质粒介导的基因重组技术和λ‑RED重组技术，无需电转质粒或打靶DNA，操作简单。

Description

一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用

技术领域

本发明属于细菌遗传改造技术领域，具体地说，涉及一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用。

背景技术

自然转化(Natural transformation)技术构建基因缺失株，是于2010成功应用于霍乱弧菌的基因编辑，并随后不断的予以完善。该方法的理论基础是基于细菌的自然转化(Natural transformation)原理，弧菌营养饥饿条件下通过几丁质诱导可成为自然感受态摄取外源DNA，当外源DNA与自身靶基因同源时可与细菌靶基因发生同源重组交换。但该技术还未在拟态弧菌上应用成功。基因缺失的方法还包括：自杀质粒介导的基因重组技术和λ-RED重组技术。自杀质粒介导的基因重组技术如下：1、通过含有抗性基因和靶基因同源的自杀质粒；2、通过结合转移或电转化的方式将构建的质粒转化进入打靶菌株，自杀质粒的同源部分会与细菌靶基因发生同源重组交换；3、通过抗生素平板对阳性缺失株进行筛选。该技术实验过程繁琐，重组效率低下。

λ-RED重组技术如下：1、电转化将PKD46质粒转化进入目的菌株，加入L-阿拉伯糖培养(PKD46质粒可通过L-阿拉伯糖诱导表达Exo、Beta和Gam蛋白，Gam蛋白可抑制核酸酶降解打靶DNA，Exo和Beta蛋白介导打靶DNA发生同源重组)；2、电击转化打靶DNA；3、通过抗生素平板对阳性缺失株进行筛选；λ-RED重组技术基于大肠杆菌λ噬菌体开发的基因敲除技术，较为广泛的应用于大肠杆菌或与大肠杆菌亲缘性相近的物种；拟态弧菌由于与大肠杆菌亲缘性较远将导致敲除效率低下；且操作繁琐。

现已能通过λ-RED重组技术构建拟态弧菌的基因缺失，但是其缺点如下：第一、λ-RED重组技术基于大肠杆菌λ噬菌体开发的基因敲除技术，较为广泛的应用于大肠杆菌或与大肠杆菌亲缘性相近的物种；拟态弧菌由于与大肠杆菌亲缘性较远将导致敲除效率低下；第二、需通过两次电转将PKD46质粒和打靶DNA转化至目的菌株，操作过程繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法，包括以下步骤：

1)以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；以PKD4质粒为模板，使用Kan引物对扩增卡那霉素抗性基因片段；

2)将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；

3)将步骤2)获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株。

进一步地，步骤1)中的PCR扩增的反应体系均为：

Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM特异性的引物对上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5U/μl DNAPolymerase0.5μl，ddH₂O 32.5ul。

进一步地，步骤1)中的PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35个循环72℃延伸10min。

进一步地，所述目的基因为TLH基因，其对应的目的基因上臂和目的基因下臂引物对分别是TLH-UP和TLH-DOWN引物对，所述TLH-UP引物对包括TLH-UP-F和TLH-UP-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述TLH-DOWN引物对包括TLH-DOWN-F和TLH-DOWN-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Kan引物对包括Kan-F和Kan-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步地，步骤2)中的融合具体为：

第一步PCR反应体系：

Buffer 5μl，dNTP Mixture2μl，模板各1μl，模板包括卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段胶回收产物，2.5U/μl DNA Polymerase 0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20个循环，72℃延伸10min；

第二步PCR反应体系

Buffer 10μl，dNTP Mixture4μl，10μM目的基因上臂序列上游引物和目的基因下臂序列下游引物各1μl，模板1μl，模板为第一步反应PCR产物，2.5U/μl DNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39个循环72℃延伸10min。

进一步地，步骤3)中的自然转化具体为：

3.1)将保存于-80℃的拟态弧菌SCCF01株复苏于LB培养基或者接种于TCBS琼脂培养基，含30℃培养24h，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600约为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液重悬，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mMMgSO₄和5mM CaCl₂；

3.2)向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；

3.3)轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液重悬和DNA总量大于500ng的重组片段PCR产物，30℃孵育24h，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mM MgSO₄和5mMCaCl₂；

3.4)将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

本发明还提供一种上述的基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法在构建拟态弧菌缺失株中应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明操作过程相较于自杀质粒介导的基因重组技术和λ-RED重组技术，无需电转质粒或打靶DNA，操作简单。

2)本发明重组效率高，减少通过抗生素平板对阳性缺失株进行筛选的工作量。

3)该技术方案敲除基因仅需要3天就可完成，缩短研究周期。

4)本发明可用于研究拟态弧菌基因功能以及开发拟态弧菌基因缺失疫苗。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明融合PCR反应；

图2是本发明自然转化流程示意图；

图3是本发明实施例2中卡那霉素基因检测和TLH基因检测；其中，A表示卡那霉素基因检测，1代表阳性对照，2代表△TLH-SCCF01，3代表wt-SCCF01，4代表阴性对照，M为mark标记；B表示TLH基因检测；1代表△TLH-SCCF01，2代表wt-SCCF01，3代表阴性对照；

图4是本发明实施例3中TonB1基因检测和ExbB1-ExbD1基因检测；其中，A为TonB1基因检测，1代表△TonB1，2代表wt-SCCF01，3代表阴性对照，M为mark标记；B为ExbB1-ExbD1基因检测，1代表△ExbB1-ExbD1，2代表wt-SCCF01，3代表阴性对照，M为mark标记；C为TonB1基因检测(1～3泳道)和ExbB1-ExbD1基因检测(4～6泳道)：1代表△ExbB1-ExbD1-TonB1，2代表wt-SCCF01，3代表阴性对照；4代表△ExbB1-ExbD1-TonB1，5代表wt-SCCF01，6代表阴性对照，M为mark标记；

图5是本发明卡那霉素基因检测；其中，1代表△TonB1，2代表△ExbB1-ExbD1，3代表△ExbB1-ExbD1-TonB1，4代表wt-SCCF01，5代表阴性对照，M为mark标记。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1

步骤1、打靶片段的构建：使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取拟态弧菌SCCF01株基因组(保藏于四川农业大学动物医学院基础兽医系，编号：CVM2013034)，以SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列，PKD4质粒为模板，使用Kan引物对扩增卡那霉素抗性基因片段，进行重叠PCR扩增；

三个DNA片段PCR扩增的反应体系均为：

Buffer10μl，dNTPMixture 4μl，上下游引物(10μM)各1μl，模板1μl，DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH₂O32.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35个循环72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小；大小验证正确后使用胶回收试剂盒进行胶回收。

步骤2、将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上游和下游同源臂进行融合；

融合三个片段分两步进行，第一步PCR反应体系：

Buffer 5μl，dNTP Mixture 2μl，模板(上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段胶回收产物)各1μl，DNAPolymerase(2.5U/μl)0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20个循环，72℃延伸10min。第二步PCR反应体系

Buffer 10μl，dNTP Mixture4μl，引物(TLH-UP-F和TLH-DOWN-R 10μM)各1μl，模板(第一步反应PCR产物)1μl，DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39个循环72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。大小验证正确后使用胶回收试剂盒进行胶回收，胶回收产物使用Nanodrop2000测定DNA浓度，得到含有卡那霉素抗性基因片段、TLH上游和下游同源臂片段的融合PCR产物。

步骤3、自然转化

步骤3.1、将保存于-80℃的拟态弧菌SCCF01株复苏于LB培养基或者接种于TCBS琼脂培养基，含30℃培养24h，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600约为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液(添加32mM MgSO₄和5mM CaCl₂)重悬；

步骤3.2、向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；

步骤3.3、轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液(添加32mMMgSO₄和5mM CaCl₂)重悬和DNA总量大于500ng的打靶片段(重新换液是为了防止孵育过程中细菌产生核酸酶降解打靶片段)，30℃孵育24h；

步骤3.4、将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

步骤4、缺失株特异性PCR鉴定：挑取传代后具有卡那霉素抗性的菌落，于10ml LB液体培养基，180r/min振荡培养过夜后提取基因组为模板，分别使用2对引物进行PCR反应鉴定缺失株，该2对引物分别为目的基因上下游引物和Kan上下游引物。采用目的基因上下游引物鉴定SCCF01株的目的基因是否完全通过同源重组缺失，判定结果wt-SCCF01株为阳性，△目的基因-SCCF01为阴性；Kan-F、R引物(Kan上下游引物)鉴定卡那霉素抗性基因是否重组整合进入SCCF01基因组，判定结果：wt-SCCF01株为阴性，△目的基因-SCCF01为阳性。

PCR反应体系：12.5μl Mix-reaction buffer，上下游引物各1μl(10μmol/L)，模板1μl，8.5μl ddH₂O。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min共30个循环；72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。

其中，1、用于融合PCR使用的DNA聚合酶应选择高保真酶，原因：普通PCR使用的酶为Taq酶，该酶易产生错配碱基，同时会在末端添加A碱基，将影响三段PCR融合。

2、几丁质是拟态弧菌形成自然感受态的关键试剂，因此几丁质应选择正确，购买的几丁质应成片状不溶于水。

3、配置M9培养液应避免营养成分，原因：拟态弧菌形成自然感受态重要必要条件是在饥饿状态。

4、用于制备自然转化感受态细菌的OD600的取值范围：0.3～0.5，该时期细菌生长处于对数生长期，新陈代谢活跃，更易于形成自然感受态；

5、用于孵育的无葡萄糖M9培养液中MgSO₄和CaCl₂的浓度分别为32mM和5mM，在该浓度条件下自然转化率最高。

实施例2以TLH为目的基因的遗传重组方法

1、打靶片段的构建

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取拟态弧菌SCCF01株基因组(保藏于四川农业大学动物医学院基础兽医系，编号：CVM2013034)，以SCCF01株基因组为模板，使用TLH-UP-F、R和TLH-DOWN-F、R(表1)两对引物分别扩增TLH上游和下游同源臂(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)；以PKD4质粒为模板，使用Kan-F、R引物(表1)扩增卡那霉素抗性基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。三个DNA片段PCR扩增的反应体系均为：

Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，上下游引物(10μM)各1μl，模板1μl，DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH₂O 32.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35个循环72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。大小验证正确后使用胶回收试剂盒进行胶回收。

表1引物列表

注：引物序列小写字母表示与PKD4质粒同源。

融合三个片段分两步进行，如图1所示，第一步PCR反应体系：

Buffer 5μl，dNTP Mixture 2μl，模板(上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段胶回收产物)各1μl，DNA Polymerase(2.5U/μl)0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20个循环，72℃延伸10min。第二步PCR反应体系

Buffer 10μl，dNTPMixture 4μl，引物(TLH-UP-F和TLH-DOWN-R 10μM)各1μl，模板(第一步反应PCR产物)1μl，DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39个循环72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。大小验证正确后使用胶回收试剂盒进行胶回收，胶回收产物使用Nanodrop2000测定DNA浓度，得到打靶片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2、自然转化

如图2所示，(1)将保存于-80℃的拟态弧菌SCCF01株复苏于LB培养基，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600约为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液(添加32mM MgSO₄和5mM CaCl₂)重悬；(2)向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；(3)轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液(添加32mMMgSO₄和5mM CaCl₂)重悬和DNA总量大于500ng的打靶片段(重组片段PCR产物)，重新换液是为了防止孵育过程中细菌产生核酸酶降解打靶片段，30℃孵育24h；(4)将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

3、缺失株特异性PCR鉴定

挑取传代后具有卡那霉素抗性的菌落，于10ml LB液体培养基，180r/min振荡培养过夜后提取基因组为模板，分别使用2对引物进行PCR反应鉴定缺失株。TLH-F、R鉴定SCCF01株的TLH基因是否完全通过同源重组缺失，判定结果wt-SCCF01株为阳性，△TLH-SCCF01为阴性；Kan-F、R引物鉴定卡那霉素抗性基因是否重组整合进入SCCF01基因组，判定结果：wt-SCCF01株为阴性，△TLH-SCCF为阳性。

PCR反应体系：12.5μl Mix-reaction buffer，上下游引物各1μl(10μmol/L)，模板1μl，8.5μl ddH₂O。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min共30个循环；72℃延伸10min，1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。

缺失株特异性PCR鉴定显示(图3)，从图中可以看到，构建的缺失株不能扩增出TLH基因，而野生菌株则能；构建的缺失株能扩增出卡那霉素基因条带，而野生菌株则不能；证明卡那霉素基因成功将TLH基因替换，突变体构建成功。

实施例3拟态弧菌遗传重组方法可靠性的验证

为了进一步确认遗传重组方法的可靠性，本研究进一步构建TonB1单基因、ExbB1-ExbD1双基因缺失和ExbB1-ExbD1-TonB1三个基因缺失的缺失株(扩增引物见表2)；按照实施例1的方法，首先用特异性的引物扩增目的基因上臂序列和下臂序列，同时扩增出对应卡那霉素抗性基因，再以上述三个片段作为模板，进行重叠PCR扩增。所获得PCR产物经过切胶回收纯化后按照步骤3)方法进行自然转化。自然转化方法：

a)将受体菌接种于TCBS琼脂培养基，含30℃培养24h，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600约为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液重悬(添加32mM MgSO₄和5mM CaCl₂)；

b)向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；

c)轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液重悬(添加32mM MgSO₄和5mM CaCl₂)和DNA总量大于500ng的重组片段PCR产物，30℃孵育24h；

d)将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

通过卡那霉素抗性平板筛选的菌株，利用PCR对缺失的目标基因和卡那霉素基因进行检测(图4和图5)，从图中可以看到，相应缺失株均不能扩增出缺失的目标基因，而野生菌株则能；且相应缺失株均能扩增出卡那霉素基因条带，而野生菌株则不能；证明卡那霉素基因成功将缺失的目标基因替换，突变体构建成功。

表2构建打靶DNA引物列表

表3PCR检测表

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用

<130> 2017

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2114

<212> DNA

<213> TLH-UP

<400> 1

atcggtgctc cccgtctctt tcggtgacgc tttgtaaatt acatccattt ttggcacaaa 60

actggcgtaa ctcagcgggc tgatgcggtt cacatcaaca ggatacgttt ccacccacaa 120

tgcatccgtt gaacggttga gcagagattc agccgttgcg tactgctggc ggttccagat 180

aaagctaacg ttttgcgcat ttttcgcact ccgttcgatg cggtaatctt gcgtgttgta 240

ggtcagccaa cggctttgtg tgtagctggc ttttgcttcc aacttagctt tcgggccgtt 300

tttatctgct tcgacacccc ccgttacgcc aagctcaaag ccagagactt ctttacgctc 360

aaagttcgcg ttgacgttag tgaccgggaa agtctttaga atctgcgctt tatcattcga 420

agcgttgaag ctgaaacgat aatcctgcgc tatcgcatct gttgaccatt cacggaaata 480

agcatccaaa gtaacgtacc cagccttaac ttggcggttt ccgagttggt cattgagatg 540

aatacccgcg ccagtgctgt cgtcatctaa gctgatacgc acaattttgg catccggcgt 600

tgccgaaccc acaatgccat actgcaatga acgctctaag ttcacacggt aaatcaatga 660

gatattggca tctttacaaa atggacgact gcctttgtca tttttccata gccaagaatt 720

ggcgaaagta cactcttcat cgctgattga acgattgacg ttgatgtaaa aagcaacgtg 780

cggcaacgtg ttcgtttcat tgttgttagt gacattattg gcagacactg agcgacgtga 840

ccgactcaac acacgctcag aacgtggggc ttccagcagt gttggatcca catcctccgc 900

acgatcaaac ggtgtaaaca gcagctcacc tttatgctca gtgattacga tgaatgtatt 960

agcaaaccca acaccatagg tttttctaaa tttcacctgc atttcggtta ggcgatcagg 1020

gtcagagatc tgactgaaat cgaccaagat acgcaactgc tggttaatca cctgctcacg 1080

cagctcagct aaactgggta attggctttc ttctgattgc caatctgcag cgttgtaata 1140

ttttattgcg tggttatccg cgacttggct aataatttca acagcttcac caacgggatc 1200

actgatattc gcgaacacag tatgactaga tattgcgctg aatatcgtta ggattgcgat 1260

tgcacaacga ttgagttttg gcatataaac ctcactgatt cagttatttt tagtgttatt 1320

agaagagaga ttttcaaaca aagtgaatta actcgaacca ctgaaagaac agactagtgg 1380

gaatttcatt catcactacg cacataatta agcgttatgc tttaagagga taaatttaac 1440

caacaccact gcaggttcaa atcatcgagc aaacccagtt tgaatgcttc tcgtgggtta 1500

ccgtcgtcat ccttgatgtt gtgtggcttg gggcagaact acggcttaac acataccctt 1560

ttgacagaat attcaacttc ttttatttga aagaatacgt ttatattctc tgccaccaca 1620

cttattggaa tatccctaaa catgccaaaa gtaaatagtt gtaacggaaa atagtaacag 1680

gagatcacaa attcacgctt gaaaacttat tatttggcga gaattaatcc ttcacacaac 1740

tattaattcc caatttattt tttggatatt tacattattc attcgcacta atttaatttg 1800

aactaaatta gattgaatta aatagataaa aatagaaatt cattaagtga ttaactttca 1860

atcattaaat atcacttaag tccattcata tgaaaaataa agatcaatta tgaacagaat 1920

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<210> 2

<211> 2086

<212> DNA

<213> TLH-DOWN

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tcctcaacac cacgtatttg cacaagaatt tttgctttat cgccattctg ttcatagcct 120

taaagaaaag ggaaagatgg cacatttgag atgacaaaat cgaatcactc tcctgctttc 180

accggctcag aattgctgaa tctctactat cagcgtcggg tgtcgctctt tattgccttt 240

atttccagtt tgaccttttt ccctctggca atcaaaaacc tgctgattgg acaaattctg 300

cttggcggtt taatcattgt gtttcaatgc tcattactgt ttgaaatagc cgccatctac 360

taccagaaga aaacgccgtg gggatttcgg ctaccactct ctttggtggt gatcattgtc 420

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gcgatcagcg ccagtgccgc cattatgtat gtggttgtcg acgctctgcg taaattgcac 660

gcagagctgt tttatctctc cactcgtgat gctttaacag gcacactcaa ccgccatcag 720

ctcgatagtt ttttacgcaa gagcatccgg cgcagccagt ttgcgaatga gttttcggtg 780

attgcagtga tcgacattga taatttcaaa accatcaatg atatgtacgg ccatgacacg 840

ggagataagg taataactca agtggtcgag atcattaata caaacagtcg ggagttagat 900

ttgctctttc gattaggagg agatgagttt ctattactct ttgaaaatac ctcattaacg 960

gaagccacta tggtgatgag ccacataggc tgtcgggtac aaaaaacaca ctatcctaaa 1020

catgcggaag tgaccgtcag tgtggggtta gcggaggtac tcaaaaacga cgatccggag 1080

gtatggttta aacgtgccga cctttctctg tatcactcca aaaaaatggg taaaaaccgg 1140

gtatgttcag acgaaaaaca tgtgattgag ctaaacactc aacagtgtga ttctctcttg 1200

aattcgcatg gtcatcgttg attgatcatg acgatttgcg caagttgagg gagtaagatt 1260

ccgataccga acaagacgcc ttgccatttc acctgtttta aagcgagcaa aacaggtgcc 1320

ataaaaaaca gcacaaccaa cacgggcagt aaattgacgc cccctaaact cccaagcaac 1380

agggaaaaca gaataagtcc cgccaggatc caataattca gccttagctt gaaaccaagc 1440

aagccaacaa aaagcagcgg agcgataagt gacagcatat taagtaacat cttctttgtt 1500

tgtgatattg attctcattt aatacatcat agtccgctct gggtttaggt tcaagtcaca 1560

aaccacccaa aataatcatt agaaaaaata atccaatcta tagattttta tcgtgaacaa 1620

tacatcagga atctgttgat agataaggct atcggcaata acatctcgcg ccgagagaga 1680

tgctcttctc aattttttca ttagctgatt ttaataagat attgttttta tctggagata 1740

acgatgtctg cctcgctttc tgtagcaaaa ttgacctttt ttatcgctat cttggctgcg 1800

gtcggccaag cgacacaaac catgtacgtg ccttctatcg gttacatggc gcaagaattt 1860

ttggtttcac ctgcggcttt gcaagcggtc atggcttgct atctgatccc ttatggtttg 1920

tcgcaatttg tctacggcac gctgtctgat cgcatcggcc gcaaaccaat catcattgcc 1980

ggattagtca tctacattgt tggctctctg attgcgttgt ttgctcacca atactcatgg 2040

tttcttatcg gtagctttgt acaaggctta ggcattggct gtggcg 2086

<210> 3

<211> 1529

<212> DNA

<213> Kan

<400> 3

aaacaagact ctctctacta gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 60

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctca cgctgccgca agcactcagg 120

gcgcaagggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg 180

accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag 240

aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac 300

agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa 360

agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagatctga 420

tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 480

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 540

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 600

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 660

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 720

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 780

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 840

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 900

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 960

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 1020

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 1080

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 1140

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 1200

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 1260

gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc 1320

ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag 1380

cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccagct tcaaaagcgc tctgaagttc 1440

ctatactttc tagagaatag gaacttcgga ataggaacta aggaggatat tcatatggac 1500

catggctaat aagtacgtga tgtaagctt 1529

<210> 4

<211> 5648

<212> DNA

<213> 打靶片段

<400> 4

atcggtgctc cccgtctctt tcggtgacgc tttgtaaatt acatccattt ttggcacaaa 60

actggcgtaa ctcagcgggc tgatgcggtt cacatcaaca ggatacgttt ccacccacaa 120

tgcatccgtt gaacggttga gcagagattc agccgttgcg tactgctggc ggttccagat 180

aaagctaacg ttttgcgcat ttttcgcact ccgttcgatg cggtaatctt gcgtgttgta 240

ggtcagccaa cggctttgtg tgtagctggc ttttgcttcc aacttagctt tcgggccgtt 300

tttatctgct tcgacacccc ccgttacgcc aagctcaaag ccagagactt ctttacgctc 360

aaagttcgcg ttgacgttag tgaccgggaa agtctttaga atctgcgctt tatcattcga 420

agcgttgaag ctgaaacgat aatcctgcgc tatcgcatct gttgaccatt cacggaaata 480

agcatccaaa gtaacgtacc cagccttaac ttggcggttt ccgagttggt cattgagatg 540

aatacccgcg ccagtgctgt cgtcatctaa gctgatacgc acaattttgg catccggcgt 600

tgccgaaccc acaatgccat actgcaatga acgctctaag ttcacacggt aaatcaatga 660

gatattggca tctttacaaa atggacgact gcctttgtca tttttccata gccaagaatt 720

ggcgaaagta cactcttcat cgctgattga acgattgacg ttgatgtaaa aagcaacgtg 780

cggcaacgtg ttcgtttcat tgttgttagt gacattattg gcagacactg agcgacgtga 840

ccgactcaac acacgctcag aacgtggggc ttccagcagt gttggatcca catcctccgc 900

acgatcaaac ggtgtaaaca gcagctcacc tttatgctca gtgattacga tgaatgtatt 960

agcaaaccca acaccatagg tttttctaaa tttcacctgc atttcggtta ggcgatcagg 1020

gtcagagatc tgactgaaat cgaccaagat acgcaactgc tggttaatca cctgctcacg 1080

cagctcagct aaactgggta attggctttc ttctgattgc caatctgcag cgttgtaata 1140

ttttattgcg tggttatccg cgacttggct aataatttca acagcttcac caacgggatc 1200

actgatattc gcgaacacag tatgactaga tattgcgctg aatatcgtta ggattgcgat 1260

tgcacaacga ttgagttttg gcatataaac ctcactgatt cagttatttt tagtgttatt 1320

agaagagaga ttttcaaaca aagtgaatta actcgaacca ctgaaagaac agactagtgg 1380

gaatttcatt catcactacg cacataatta agcgttatgc tttaagagga taaatttaac 1440

caacaccact gcaggttcaa atcatcgagc aaacccagtt tgaatgcttc tcgtgggtta 1500

ccgtcgtcat ccttgatgtt gtgtggcttg gggcagaact acggcttaac acataccctt 1560

ttgacagaat attcaacttc ttttatttga aagaatacgt ttatattctc tgccaccaca 1620

cttattggaa tatccctaaa catgccaaaa gtaaatagtt gtaacggaaa atagtaacag 1680

gagatcacaa attcacgctt gaaaacttat tatttggcga gaattaatcc ttcacacaac 1740

tattaattcc caatttattt tttggatatt tacattattc attcgcacta atttaatttg 1800

aactaaatta gattgaatta aatagataaa aatagaaatt cattaagtga ttaactttca 1860

atcattaaat atcacttaag tccattcata tgaaaaataa agatcaatta tgaacagaat 1920

aataggagag tttatacaca aggttgatct tacttccaac ctgagtaatg acagagcact 1980

tctcattgac gagacaaatg tctcattcac aatacaaaag agatctgacc agatctgcag 2040

tgtgtatttt caaccaataa gaagaaaacg atgaaacaag actctctcta ctagtgtagg 2100

ctggagctgc ttcgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcgga ataggaactt 2160

caagatcccc tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag ggctgctaaa ggaagcggaa 2220

cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca gctactgggc 2280

tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag gtagcttgca gtgggcttac 2340

atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg 2400

ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc 2460

aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg 2520

catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt 2580

cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc 2640

agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact 2700

gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt 2760

gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca 2820

ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat 2880

gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg 2940

catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga 3000

agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga 3060

cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa 3120

tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga 3180

catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt 3240

cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct 3300

tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac 3360

ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc 3420

gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc 3480

gcccacccca gcttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc 3540

ggaataggaa ctaaggagga tattcatatg gaccatggct aataagtacg tgatgtaagc 3600

ttgaggatag gatgagctcc tatcctcaac accacgtatt tgcacaagaa tttttgcttt 3660

atcgccattc tgttcatagc cttaaagaaa agggaaagat ggcacatttg agatgacaaa 3720

atcgaatcac tctcctgctt tcaccggctc agaattgctg aatctctact atcagcgtcg 3780

ggtgtcgctc tttattgcct ttatttccag tttgaccttt ttccctctgg caatcaaaaa 3840

cctgctgatt ggacaaattc tgcttggcgg tttaatcatt gtgtttcaat gctcattact 3900

gtttgaaata gccgccatct actaccagaa gaaaacgccg tggggatttc ggctaccact 3960

ctctttggtg gtgatcattg tcgtgctggc catccatatt tttggcactc ttgccagtta 4020

ctggctcttc cctgtcatca tcgccattgc gttcttgctt ccgccgaaag ataatttatt 4080

cactatcttc attatcattc ccgcaagcat atgggcgctc atcccacatc aaacctctga 4140

ggtgactttg cgttttagtc tagcgatcag cgccagtgcc gccattatgt atgtggttgt 4200

cgacgctctg cgtaaattgc acgcagagct gttttatctc tccactcgtg atgctttaac 4260

aggcacactc aaccgccatc agctcgatag ttttttacgc aagagcatcc ggcgcagcca 4320

gtttgcgaat gagttttcgg tgattgcagt gatcgacatt gataatttca aaaccatcaa 4380

tgatatgtac ggccatgaca cgggagataa ggtaataact caagtggtcg agatcattaa 4440

tacaaacagt cgggagttag atttgctctt tcgattagga ggagatgagt ttctattact 4500

ctttgaaaat acctcattaa cggaagccac tatggtgatg agccacatag gctgtcgggt 4560

acaaaaaaca cactatccta aacatgcgga agtgaccgtc agtgtggggt tagcggaggt 4620

actcaaaaac gacgatccgg aggtatggtt taaacgtgcc gacctttctc tgtatcactc 4680

caaaaaaatg ggtaaaaacc gggtatgttc agacgaaaaa catgtgattg agctaaacac 4740

tcaacagtgt gattctctct tgaattcgca tggtcatcgt tgattgatca tgacgatttg 4800

cgcaagttga gggagtaaga ttccgatacc gaacaagacg ccttgccatt tcacctgttt 4860

taaagcgagc aaaacaggtg ccataaaaaa cagcacaacc aacacgggca gtaaattgac 4920

gccccctaaa ctcccaagca acagggaaaa cagaataagt cccgccagga tccaataatt 4980

cagccttagc ttgaaaccaa gcaagccaac aaaaagcagc ggagcgataa gtgacagcat 5040

attaagtaac atcttctttg tttgtgatat tgattctcat ttaatacatc atagtccgct 5100

ctgggtttag gttcaagtca caaaccaccc aaaataatca ttagaaaaaa taatccaatc 5160

tatagatttt tatcgtgaac aatacatcag gaatctgttg atagataagg ctatcggcaa 5220

taacatctcg cgccgagaga gatgctcttc tcaatttttt cattagctga ttttaataag 5280

atattgtttt tatctggaga taacgatgtc tgcctcgctt tctgtagcaa aattgacctt 5340

ttttatcgct atcttggctg cggtcggcca agcgacacaa accatgtacg tgccttctat 5400

cggttacatg gcgcaagaat ttttggtttc acctgcggct ttgcaagcgg tcatggcttg 5460

ctatctgatc ccttatggtt tgtcgcaatt tgtctacggc acgctgtctg atcgcatcgg 5520

ccgcaaacca atcatcattg ccggattagt catctacatt gttggctctc tgattgcgtt 5580

gtttgctcac caatactcat ggtttcttat cggtagcttt gtacaaggct taggcattgg 5640

ctgtggcg 5648

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcggtgctc cccgtctctt 20

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagcagctc cagcctacac tagtagagag agtcttgttt 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttcatatgga ccatggctaa taagtacgtg atgtaagctt 40

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgccacagcc aatgcctaag 20

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaacaagact ctctctacta gtgtaggctg gagctgcttc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagcttacat cacgtactta ttagccatgg tccatatgaa 40

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaggcacaac ctgtgactcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgaaaccgtg ttgctctggg 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actgggctat ctggacaagg ga 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcatagaagg cggcggtgga a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

attggcgagc tgctctgaac 20

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaagcagctc cagcctacac tggaaccgtt acaacaactc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagttgttgt aacggttcca gtgtaggctg gagctgcttc 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttattgcggg agggctttct ttagccatgg tccatatgaa 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcatatgga ccatggctaa agaaagccct cccgcaataa 40

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgtgttgttg ctgcatcgct 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcccccaact caacgacttc 20

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gaagcagctc cagcctacac taatggaaac aagatgaaat 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atttcatctt gtttccatta gtgtaggctg gagctgcttc 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgtttcaaat tggaaggcta ttagccatgg tccatatgaa 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttcatatgga ccatggctaa tagccttcca atttgaaacg 40

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gccattgcgg cgggtaatag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atcacgacgg atgaagccca 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gggatgtgaa ctcggtgtgc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

actgctttgc acggtttcga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttccagtaa gcgcccggta 20

Claims (2)

1.一种基于自然转化的拟态弧菌遗传重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；以PKD4质粒为模板，使用Kan引物对扩增卡那霉素抗性基因片段；

2)将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；

3)将步骤2)获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株；

步骤1)中的PCR扩增的反应体系均为：5×Prime

Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM特异性的引物对上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 32.5ul；

步骤1)中的PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35个循环72℃延伸10min；

所述目的基因为TLH基因，其对应的目的基因上臂和目的基因下臂引物对分别是TLH-UP和TLH-DOWN引物对，所述TLH-UP引物对包括TLH-UP-F和TLH-UP-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述TLH-DOWN引物对包括TLH-DOWN-F和TLH-DOWN-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Kan引物对包括Kan-F和Kan-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

步骤2)中的融合具体为：

第一步PCR反应体系：5×Prime

Buffer 5μl，dNTP Mixture 2μl，模板各1μl，模板包括卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段胶回收产物，2.5U/μlDNA Polymerase 0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20个循环，72℃延伸10min；

第二步PCR反应体系5×Prime

Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM目的基因上臂序列上游引物和目的基因下臂序列下游引物各1μl，模板1μl，模板为第一步反应PCR产物，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39个循环72℃延伸10min；

步骤3)中的自然转化具体为：

3.1)将保存于-80℃的拟态弧菌SCCF01株复苏于LB培养基或者接种于TCBS琼脂培养基，含30℃培养24h，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液重悬，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mM MgSO₄和5mM CaCl₂；

3.2)向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；

3.3)轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液重悬和DNA总量大于500ng的重组片段PCR产物，30℃孵育24h，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mM MgSO₄和5mMCaCl₂；

3.4)将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

2.权利要求1所述的基于自然转化的拟态弧菌遗传重组方法在构建拟态弧菌缺失株中应用。

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