CN108504673B - 一种转化质粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转化质粒的方法,涉及分子生物学领域及基因工程领域。本发明公开的转化质粒的方法,其包括:将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合。通过将宿主细胞的ygiZ基因敲除,提高转化率,该方法具有转化效率高,对大质粒转化效率高的特点,相对于野生型宿主细胞,ygiZ基因敲除的宿主细胞对质粒pUC19的转化效率增加了2.05倍,对质粒pET‑32a的转化效率增加了2.60倍,对质粒p1304的转化效率增加了1.67倍。该方法极大地提高了质粒转化效率,对分子生物学领域及基因工程领域具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域及基因工程领域,具体涉及一种转化质粒的方法。
背景技术
CaCl2法制备大肠埃希菌(Escherichia.coli)感受态细胞是分子生物学实验中最基本、最常用的操作技术之一,广泛的运用于重组质粒的转化、基因克隆以及基因文库构建等研究。虽然在理论上CaCl2法制备的感受态细胞最理想的转化效率可达5×106~2×107cfu/μg DNA,然而,在实际操作中转化率常低于105,有时甚至低达103,无法满足相关实验研究需要。
发明内容
针对上述已有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种转化质粒的方法。采用该方法进行质粒的转化,具有较高的转化率,可有效解决在实际操作中质粒转化效率低的问题。
为解决上述问题,本发明是这样实现的:
一种转化质粒的方法,其包括:质粒转化步骤;上述质粒转化步骤包括:将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合。
ygiZ基因位于大肠杆菌基因组的第3171879位-3172211位,由332个碱基构成,且该基因仅存在大肠杆菌中。其编码蛋白ygiZ的Id为NP_417499.1,其一级结构由110个氨基酸组成;二级结构由61.82%α-螺旋、20.00%延伸链、5.45%β-转角和12.73%无规则卷曲组成,具有较强的疏水性,为内膜蛋白。
本发明的研究首次发现,相较于野生型宿主细胞,将宿主细胞的ygiZ基因敲除,可以提高其外源质粒的转化效率。基于该成果,在转化质粒的过程中,将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合,进行转化,可以提高目标外源质粒的转化效率,满足相关实验研究需要,对分子生物学领域及基因工程领域具有十分重要的意义。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在质粒转化步骤之前,上述方法包括:ygiZ基因敲除步骤;上述ygiZ基因敲除步骤包括:将打靶片段与感受态的野生型宿主细胞混合;上述打靶片段的两端含有与ygiZ基因同源的同源臂序列。
需要说明的是,上述的基因敲除方法采用的同源重组的方式敲除ygiZ基因,但在其他的一些实施例中,也可采用其他的基因敲除方式例如敲除ygiZ基因,无论通过何种方式敲除ygiZ基因例如完全敲除、部分敲除、甚至是通过RNAi干扰载体抑制ygiZ基因表达使其失活等方式,只要是在质粒的转化过程中使宿主细胞的ygiZ基因不发挥其功能的方式均属于本发明的保护范围。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述打靶片段还含有筛选标记基因。
为了使被敲除ygiZ基因的宿主细胞易于后续实验中被筛选出,在打靶片段中引入筛选标记基因是有利的。通过筛选标记基因可以方便操作者筛选出阳性重组子。筛选标记基因的类型可以根据具体需求选择,例如包括但不限于抗生素抗性基因、荧光筛选标记基因等。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述筛选标记基因为抗生素抗性基因。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因(npt II)、四环素抗性基因(tetR)、氯霉素抗性基因(cat)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)和潮霉素抗性基因(hpt)。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述打靶片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
以SEQ ID NO.1所示的打靶片段转入野生型宿主细胞,可以有效地将ygiZ基因敲除,具有较高的成功率,且引入了卡那霉素抗性基因,阳性重组子可在含卡那霉素的平板上生存,进而被筛选出。打靶片段的碱基序列如下:
gaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatcccctcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtg gagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgc aggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggct atcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctg ctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctg atgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcg agcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagcc gaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgc cgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatca ggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttac ggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatat
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在ygiZ基因敲除步骤之前,上述方法还包括:打靶片段扩增步骤;上述打靶片段扩增步骤包括:以含有卡那霉素抗性基因的质粒为模板,以SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物进行PCR扩增。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,在ygiZ基因敲除步骤之后,上述方法还包括:阳性重组子筛选步骤和筛选标记基因去除步骤;
上述阳性重组子筛选步骤包括:用检测筛选标记基因的引物鉴定出阳性重组子;
上述鉴定出的阳性重组子还含有筛选标记基因,需要通过后续步骤删除。
上述筛选标记基因去除步骤包括:将可编码重组蛋白FLP的质粒导入上述阳性重组子以删除筛选标记基因。该步骤可将上述的阳性重组子中的筛选标记基因删除,得到不含筛选标记基因且ygiZ基因被敲除的可用作宿主细胞的突变体。避免筛选标记基因对突变体作为宿主细胞时带来的干扰等影响。
重组蛋白FLP能够特异性的识别FRT位点,并将两个FRT位点之间的序列切除。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述感受态宿主细胞为采用CaCl2法制备的感受态大肠杆菌。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,ygiZ基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.6为大肠杆菌中的ygiZ基因序列,当然,在其他的一些实施例中,采用不同的菌株,ygiZ基因序列存在一定的差异性,但只要是敲除的是与SEQ ID NO.6同源的ygiZ基因,也应当属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果包括:
本发明提供的转化质粒的方法,其包括:将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合,通过将宿主细胞的ygiZ基因敲除,提高转化率,该方法具有转化效率高,对大质粒转化效率高的特点,例如:相对于野生型E.coli DH5α,ygiZ基因敲除的E.coliDH5α::ΔygiZ对质粒pUC19的转化效率增加了2.05倍,对质粒pET-32a的转化效率增加了2.60倍,对质粒p1304的转化效率增加了1.67倍,本发明提供的转化质粒的方法对分子生物学试验和基因工程试验具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的PCR扩增的外源卡那抗性打靶片段的电泳图;
图2为本发明实施例1中的卡那抗性打靶片段替换ygiZ基因的阳性重组子菌落PCR鉴定电泳图;其中,M为Marker,W为E.coli DH5α对照组,W1-W5为E.coli DH5α::Kan::△ygiZ阳性重组子;
图3为本发明实施例2中的已重组的卡那片段丢失后的突变体菌落PCR鉴定电泳图;其中,M为Marker,W1为E.coli DH5α对照组,W2为E.coli DH5α::△ygiZ,W3为E.coliDH5α::Kan::△ygiZ;
图4为本发明实施例3中的质粒pUC19转化突变菌株E.coli DH5α::△ygiZ的平板计数图;其中,A为E.coli DH5α质粒转化pUC19平板;B为E.coli DH5α::△ygiZ转化质粒pUC19平板;
图5为本发明实施例3中的质粒pET-32a转化E.coli DH5α::△ygiZ的平板计数图;其中,C为E.coli DH5α转化质粒pET-32a平板;D为E.coli DH5α::△ygiZ转化质粒pET-32a平板;
图6为本发明实施例3中的质粒p1304转化E.coli DH5α::△ygiZ的平板计数图;其中,E为E.coli DH5α转化质粒p1304平板;F为E.coli DH5α::△ygiZ转化质粒p1304平板;
图7为突变株转化对不同大小的质粒效率统计结果图;其中,不同大小的质粒分别为pUC19、pET-32a和p1304。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1、PCR扩增外源含卡那抗性基因的线性打靶片段,用于敲除ygiZ基因:
(1)以含卡那抗性基因的质粒pKD4为模板,用引物K-ygiZ-F和K-ygiZ-R,通过PCR扩增卡那抗性基因线性打靶片段“同源臂+FRT+Kan序列+FRT+同源臂”,扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
扩增体系如表1所示。
表1外源卡那抗性基因线性打靶片段PCR体系
试剂名称 | 体积 |
5×prime STAR buffer(Mg<sup>2+</sup>+plus) | 10μL |
dNTP mixture(2.5mM each) | 4μL |
K-ygiZ-F | 1μL |
K-ygiZ-R | 1μL |
Template | 1μL |
Primer STAR HS DNA polymerase(2.5units/μL) | 0.5μL |
Sterilized distilled water | Up to 50μL |
(2)PCR扩增条件:预变性:95℃、5min;变性:98℃、10s;退火:56℃、30s;延伸:72℃、2min10s;30个循环;72℃、5min。
(3)外源卡那抗性基因打靶片段扩增引物
K-yjiZ-F:
GTTGATAATTATAAATGGATTTTTATGAGCGTACTGATATgtgtaggctggagctgcttc(SEQ IDNO.2);
K-yjiZ-R:
AGCCGTTAAAACGACTCTCATAGATTTTACTAATAGCAAAatgggaattagccatggtcc(SEQ IDNO.3);
扩增得到的打靶片段碱基序列如下(SEQ ID NO.1):
GTTGATAATTATAAATGGATTTTTATGAGCGTACTGATATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAGATCCCCTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAGCTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATTTTGCTATTAGTAAAATCTATGAGAGTCGTTTTAACGGCT
(4)扩增结果
增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果如图1所示,理论长度为1576bp;图1结果显示在1600bp左右位置有条带;符合理论值。
(5)测序
对打靶片段PCR产物进行测序鉴定,结果与理论序列一致。
2、E.coli DH5α/pKD46电转化感受态细胞的制备
利用CaCl2转化法将质粒pKD46转入E.coli DH5α中,筛选得到含有质粒pKD46的阳性转化子E.coli DH5α/pKD46。挑取E.coli DH5α/pKD46单菌落接种于2mL LB液体培养基中,于30℃震荡过夜培养;按1:100转接菌液于含100mM氨苄青霉素的50mL LB液体培养基中培养,待生长至菌体浓度为OD600≈0.2时,加入100mM L-阿拉伯糖,待继续生长至具体浓度为OD600≈0.5后转移菌液至预冷的离心管中冰浴15min,于4℃、5000r/min离心10min,弃去上清。用预冷的10%甘油洗涤一次,4℃,5000r/min离心10min,弃去上清;以100倍的浓缩比例,加入500μL灭菌的10%甘油,重悬菌体,制成感受态细胞,每管分装100μL,存放于-80℃冰箱待用
3、外源卡那抗性基因打靶片段替换E.coli DH5α野生型基因组中基因ygiZ
将200ng PCR扩增的打靶片段加入100μL制备好的E.coli DH5α/pKD46电转化感受态细胞,轻轻混匀,转入预冷的0.1cm电击杯中电击,电击(电击电压1.8kv,电击时间4.5ms。)后迅速加入1mL SOC液体培养基,150r/min,37℃复苏2h。移取200μL复苏后的菌液涂布于含有Kan(50μg/mL)抗性的LB固体平板上,将平板倒置,37℃培养箱中培养16~24h。4、阳性重组子的筛选及鉴定
用已灭菌的牙签随机挑取在卡那霉素平板上长出的单菌落5个,点植到一新的卡那霉素平板上37℃培养12~16h。用鉴定引物对随机挑取的5个单菌落进行PCR扩增。
引物设计
根据NCBI/Gene Bank提供的E.coli MG1655参考基因组序列,用primer5.0引物设计软件设计鉴定引物I-ygiZ-F和I-ygiZ-R;PCR体系如表2所示:
I-ygiZ-F:CAATACTGATAGCCATTCCTCATA(SEQ ID NO.4);
I-ygiZ-R:GATAATTTCATCGTGAGGGATAAC(SEQ ID NO.5)。
表2鉴定PCR体系
体积 | |
10×PCR buffer | 5μL |
dNTP mixture | 3μL |
I-ygiZ-F | 2μL |
I-ygiZ-R | 2μL |
Template | 菌落 |
DNA polymerase | 1μL |
Sterilized distilled water | Up to 50μL |
PCR反应条件:预变性:95℃、5min;变性:95℃、1min;退火:56℃、30s;延伸:72℃、45s;30个循环;72℃、5min。
产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示,W1-W5均为阳性菌株,鉴定为阳性的菌株命名为E.coli DH5α::Kan::△ygiZ,用斜面保藏法或甘油保藏法保藏,备用。
实施例2
(1)重组菌株E.coli DH5α::Kan::△ygiZ卡那抗性片段的丢失(也可理解为:去除或敲除)
将可编码重组蛋白FLP的温敏质粒pCP20用电转化的方法导入鉴定正确的E.coliDH5α::Kan::△ygiZ重组菌株中,30℃、150r/min复苏培养1h,取200μL涂布在含有35μg/mL氯霉素的LB平板培养基上,30℃培养8h后,提高到42℃过夜培养,热诱导FLP重组酶表达,质粒也会丢失。
(2)突变菌株E.coli DH5α::△ygiZ的筛选及鉴定
用无菌牙签随机5个挑取在氯霉素平板上长出的单菌落,每个单菌落均分别接种在氯霉素平板,氨苄青霉素平板及无抗生素平板上,37℃培养12~16h,只能在无抗生素平板上生长的菌落初步鉴定为质粒已丢失的E.coli DH5α::△ygiZ阳性突变株;如能在氨苄青霉素和氯霉素任一平板生长的菌株则继续置于42℃培养,直至只能在无抗生素平板生长。对只能在无抗生素平板上生长的菌落用鉴定引物I-ygiZ-F和I-ygiZ-R进行PCR鉴定。
鉴定所用引物:
I-ygiZ-F:CAATACTGATAGCCATTCCTCATA(SEQ ID NO.4);
I-ygiZ-R:GATAATTTCATCGTGAGGGATAAC(SEQ ID NO.5);
表3鉴定PCR体系
体积 | |
10×PCR buffer | 5μL |
dNTP mixture | 3μL |
I-ygiZ-F | 2μL |
I-ygiZ-R | 2μL |
Template | 菌落 |
DNA polymerase | 1μL |
Sterilized distilled water | Up to 50μL |
PCR反应条件:预变性:95℃、5min;变性:95℃、1min;退火:56℃、30s;延伸:72℃、45s;30个循环;72℃、5min。
产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示,w1为野生型菌株鉴定引物PCR条带;w2为基因ygiZ成功缺失后的阳性突变株E.coli DH5α::△ygiZ鉴定条带;w3为基因ygiZ被打靶片段同源替换后的菌株E.coli DH5α::kan::△ygiZ鉴定条带。对于鉴定为阳性突变的菌株命名为E.coli DH5α::△ygiZ,用甘油保藏法和斜面保藏法进行保藏。结果表明ygiZ基因被成功删除。
实施例3
突变体菌株E.coli DH5α::△ygiZ转化效率的测定
用100mM CaCl2分别制备野生型E.coli DH5α和突变体菌株E.coli DH5α::△ygiZ感受态细胞,将质粒pUC19、pET-32a、p1304稀释至5ng/μL。取2μL分别加入100μL的两种感受态中,轻轻混匀,冰浴30min。于42℃下热击90s,冰浴2min后加入900μL LB培养液于37℃,180r/min复宿50min。取100μL分别于LB平板上涂布,37℃过夜培养并计数。
转化效率=(平板菌落数×稀释倍数)/质粒质量数(ng)
结果如图4-图7所示,结果表明野生型E.coli DH5α、突变型E.coli DH5α::ΔygiZ的感受态细胞对质粒pUC19的转化效率分别为2.58×106CFU/μg和5.28×106CFU/μg;
对质粒pET-32a的转化效率分别为1.76×106CFU/μg和4.58×106CFU/μg;
对质粒p1304的转化效率分别为1.36×106CFU/μg和2.27×106CFU/μg;
相对于野生型E.coli DH5α,突变型E.coli DH5α::ΔygiZ对质粒pUC19的转化效率增加了2.05倍。对质粒pET-32a的转化效率增加了2.60倍。对质粒p1304的转化效率增加了1.67倍。综合以上结果,表明基因ygiZ的缺失能够使100mM CaCl2诱导下E.coli DH5α形成的感受态细胞对质粒的转化效率显著增大。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州理工大学
<120> 一种转化质粒的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1576
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttgataatt ataaatggat ttttatgagc gtactgatat gtgtaggctg gagctgcttc 60
gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctca 120
cgctgccgca agcactcagg gcgcaagggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180
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actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780
tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840
acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900
cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960
ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 1020
gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 1080
ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 1140
acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 1200
ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1260
tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 1320
atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 1380
ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccagct 1440
tcaaaagcgc tctgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcgga ataggaacta 1500
aggaggatat tcatatggac catggctaat tcccattttg ctattagtaa aatctatgag 1560
agtcgtttta acggct 1576
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttgataatt ataaatggat ttttatgagc gtactgatat gtgtaggctg gagctgcttc 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agccgttaaa acgactctca tagattttac taatagcaaa atgggaatta gccatggtcc 60
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caatactgat agccattcct cata 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gataatttca tcgtgaggga taac 24
<210> 6
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgttaaagc agaaaattaa aacaatattt gaagcattgc tatatataat gcttacttat 60
tggttaatag attctttttt tgctttcaat aagtatgact ggatgcttga gtcgggagga 120
aatatttgca gtataccttc cgtttcaggc gaagatcgta tattgcaagc aatgattgca 180
gcattttttc ttcttacgcc acttattatt cttatcttaa gaaaactctt tatgcgggaa 240
atgttcgagt tttgggtata tgtattctcg ctcggtattt gtctggtttg tggttggtgg 300
cttttttggg gacggtttat attttgctat tag 333
Claims (9)
1.一种转化质粒的方法,其特征在于,其包括:质粒转化步骤;所述质粒转化步骤包括:将目标外源质粒与ygiZ基因敲除的感受态宿主细胞混合;所述感受态宿主细胞为采用CaCl2法制备的感受态大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在质粒转化步骤之前,所述方法包括:ygiZ基因敲除步骤;所述ygiZ基因敲除步骤包括:将打靶片段与感受态的野生型宿主细胞混合;所述打靶片段的两端含有与ygiZ基因同源的同源臂序列。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述打靶片段还含有筛选标记基因。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述筛选标记基因为抗生素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因(npt II)、四环素抗性基因(tetR)、氯霉素抗性基因(cat)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)和潮霉素抗性基因(hpt)。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法,其特征在于,所述打靶片段的碱基序列如SEQID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,在ygiZ基因敲除步骤之前,所述方法还包括:打靶片段扩增步骤;所述打靶片段扩增步骤包括:以含有卡那霉素抗性基因的质粒为模板,以SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物进行PCR扩增。
8.根据权利要求3-5任一项所述的方法,其特征在于,在ygiZ基因敲除步骤之后,所述方法还包括:阳性重组子筛选步骤和筛选标记基因去除步骤;
所述阳性重组子筛选步骤包括:用检测筛选标记基因的引物鉴定出阳性重组子;
所述筛选标记基因去除步骤包括:将可编码重组蛋白FLP的质粒导入所述阳性重组子以删除筛选标记基因。
9.根据权利要求2-5任一项所述的方法,其特征在于,ygiZ基因的碱基序列如SEQ IDNO.6所示。
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