CN107002046B - 非复制型转导粒子和基于转导粒子的报道系统 - Google Patents

Abstract

提供了用于将报道核酸分子包装至用作报道分子的非复制型转导粒子中的方法和系统。所述非复制型转导粒子可以从病毒构建并且使用病毒转导和复制系统。所述报道核酸分子包括报道基因，诸如报道分子或可选择标记物，其用于检测靶基因或细胞。提供了使用非复制型转导粒子作为报道分子用于检测细胞和靶核酸分子的方法和系统。

Description

非复制型转导粒子和基于转导粒子的报道系统

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2014年8月25日提交的美国临时专利申请号62/041,539和于2015年8月7日提交的美国临时专利申请号62/202,653的权益，所述申请的公开内容通过引用并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本，于2015年8月24日生成，命名为29681PCT_CRF_SequenceListing.txt并且大小为37,642字节。

发明背景

发明领域

本发明涉及用于包装非复制型转导报道分子并将其递送至细胞中以检测细胞中靶基因的方法和组合物。

相关领域描述

转导粒子指的是能够递送非病毒核酸至细胞中的病毒。基于病毒的报道系统已经被用于检测细胞的存在并且依赖于病毒的溶原期以允许报道分子从细胞表达。这些基于病毒的报道系统使用能够复制的转导粒子，其表达报道分子并导致靶细胞发出可检测的信号。

但是，病毒的裂解周期已经显示对基于病毒的报道分子测定是有害的。Carrière,C., 等人, Conditionally replicating luciferase reporter phages:Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997.35(12): p.3232-3239。Carrière等人开发了结核分支杆菌（M. Tuberculosis）/卡介苗（bacillusCalmette-Guérin (BCG)）萤光素酶报道噬菌体，其裂解周期在30℃受到抑制，但是在37℃有活性。使用该系统，Carrière等人已经展示了使用具有受抑制的裂解周期的噬菌体报道分子检测BCG。

但是，存在与抑制但不消除基于噬菌体的报道分子测定中的噬菌体的复制功能的相关的缺点。首先，控制噬菌体的复制功能施加了限制的测定条件。例如，当使用噬菌体在30℃的非允许温度下感染细胞时，由Carrière等人使用的报道噬菌体phAE40的裂解循环受到抑制。该温度要求对报道分子测定施加了限制条件，因为靶细菌的最优温度为37℃。这些限制条件妨碍了最优的测定表现。

此外，病毒的复制功能难以控制。病毒的复制应当在使用转导粒子作为报道系统期间受到抑制。例如，由Carrière等人报道的报道噬菌体 phAE40的裂解活性被减小但是没有被消除，其导致测定中萤光素酶信号的下降。Carrière等人强调了对于产生的报道分子信号的下降的可能原因，诸如完整噬菌体表达的基因和测定的温度限制，其均源于没有消除噬菌体报道物的裂解周期的事实。

报道分子测定法依赖于可以期望偶尔展示出裂解活性的噬菌体的天然溶原周期。另外，依赖于噬菌体溶原周期的测定可容易受来自已经用相似噬菌体溶原化的靶细胞的重复感染免疫，以及靶向进入的病毒核酸的天然存在的宿主限制系统的影响，因此限制了这些报道噬菌体的宿主范围。

在其它实例中，转导粒子产生系统被设计为包装外源核酸分子，但是转导粒子通常含有外源核酸分子和天然子代病毒核酸分子的组合。天然病毒可以展示出裂解活性，这是对测定表现的阻碍，并且病毒的裂解活性必须被消除以纯化转导粒子。但是，该纯化通常是不可能的。在标题为Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteria的U.S.2009/0155768 A中，Scholl等人描述了这样的转导粒子系统的开发。所述系统的产品是报道分子转导粒子和天然噬菌体的组合（参考文献中的图8）。虽然作者指出可以通过超离心将转导粒子和天然噬菌体分离，但是该分离只有在其中转导粒子和天然病毒展现出可以允许通过超离心分离的不同密度的系统中才可能进行。尽管该特征通过参考文献中描述的基于噬菌体T7的包装系统展示，但这不是通常适用于其它病毒系统的特征。病毒包装机制通常展示出会导致天然病毒和转导粒子展示出不能通过超离心分离的不可区分的密度的满头包装(headful packaging)。病毒包装系统也依赖于最低量的包装作为适当病毒结构装配的要求，其导致具有不可区分的密度的天然病毒和转导粒子。

因此，存在对非复制型转导粒子的需求，其不遭受病毒裂解功能的有害效果和受限于重复感染免疫和靶向病毒核酸分子和病毒功能的宿主限制机制的可能性，其都可以通过增加检测限和导致假阴性结果而限制报道分子测定的表现。

甚至当转导粒子已进行工程改造时，用于使用转导粒子检测和报道细胞中靶核酸分子存在的方法仍具有限制。一些方法需要细胞的破坏和麻烦的技术以分离和检测裂解物中的转录物。检测方法包括使用经标记的探针，诸如抗体、适配体或核酸探针。针对靶基因的经标记的探针可以导致对不期望的靶标的非特异性结合或生成具有高信噪比的信号。

因此，对于用于细胞中内源核酸分子的检测和报道的特异的、有效的和精确的方法存在需求。因此，对于用于生成允许报道分子在细胞中包装和表达，同时消除能够复制的子代病毒的非复制型转导粒子的方法和系统存在需求。还需要用于在使用表达的报道分子的细胞中检测分子的有效和精确的方法。

发明概述

本文公开了一种细菌细胞包装系统，其用于将报道核酸分子包装至用于导入细菌细胞的非复制型转导粒子（NRTP）中，所述包装系统包含宿主细胞，其包含（1）含有包含破坏的第一基因的噬菌体基因组，其中在不存在所述破坏的情况下，第一基因编码与包装相关的酶活性的第一必需组分，并且所述第一基因包含第一包装起始位点序列，其中所述与包装相关的酶活性识别第一包装起始位点，其中所述破坏阻止由必需的与包装相关的酶活性识别第一包装起始位点序列，并且其中所述破坏降低了必需的与包装相关的酶活性的水平，和（2）报道核酸分子，其包含报道基因、编码必需的与包装相关的酶活性的第一组分的第二基因和编码必需的与包装相关的酶活性的第二组分的第三基因，其中所述第二基因包含未破坏的第一包装起始位点序列，其中所述第一包装起始位点序列经配置以促进将所述报道核酸分子的复制子包装至NRTP中。

在一个实施方案中，所述噬菌体包含多个破坏的基因，其中在破坏不存在的情况下，各基因编码与包装相关的酶活性的必需组分。在一个实施方案中，所述噬菌体上的多个破坏的基因各自通过由报道核酸分子编码的具功能的未破坏的基因补充。在另一个实施方案中，所述破坏是通过缺失、插入、突变或置换。

在另一个实施方案中，所述报道核酸分子包含小末端酶基因和大末端酶基因。在进一步的实施方案中，所述末端酶基因包含肠杆菌科噬菌体P1的pacA基因和pacB基因。在一些实施方案中，所述第二组噬菌体基因的至少一个包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，所述末端酶基因包含来自金黄色葡萄球菌（S. aureus）噬菌体

11或

80α的terS基因和terL基因。在另一个实施方案中，所述末端酶基因包含来自粪肠球菌(E. faecalis)噬菌体

Efl1的terA基因和terB基因。

在一些实施方案中，所述与包装相关的酶活性是末端酶活性。在一个实施方案中，第二基因和第三基因各自是末端酶基因。在一个实施方案中，第二基因是pcaA基因且其中第三基因是pacB基因。在一个实施方案中，报道核酸分子包含SEQ ID NO:1的序列。在一个实施方案中，第二基因是terA基因且第三基因是terB基因。在一个实施方案中，所述报道核酸分子包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，第二基因是terS基因且其中第三基因是terL基因。在另一个实施方案中，报道核酸分子包含SEQ ID NO:4的序列。

在一些实施方案中，第二基因和第三基因可操作地连接至条件型启动子。在一个实施方案中，条件型启动子包含SEQ ID NO: 9的序列。在一个实施方案中，条件型启动子是噬菌体基因组的末端酶基因的天然启动子。在一些实施方案中，第二基因或第三基因的表达在不存在噬菌体裂解周期激活的情况下受到抑制，并且其中第二基因或第三基因的表达在噬菌体的裂解周期的激活后被活化。在某些实施方案中，第二基因和第三基因是噬菌体基因组的天然末端酶基因，并且其中条件型启动子是末端酶基因的天然启动子。

在一些实施方案中，噬菌体基因组包含报道基因。在一些实施方案中，噬菌体基因组进一步包含抗生素抗性基因。在一个实施方案中，报道基因编码可检测标记物或可选择标记物。在一个实施方案中，报道基因选自：介导发光反应的酶（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、介导比色反应的酶（lacZ、HRP）、荧光蛋白（GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白）、亲和肽（His-标签、3X-FLAG）和可选择标记物（ampC、tet(M)、CAT、erm）。在一个实施方案中，所述报道基因破坏末端酶基因。在某些实施方案中，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。在一些实施方案中，报道基因可操作地连接至组成型启动子。在进一步的实施方案中，组成型启动子是Pblast。

在一个实施方案中，所述破坏包括使用编码可选择标记物的基因插入或置换第一包装起始位点序列。在某些实施方案中，编码可选择标记物的基因可操作地连接至组成型启动子。在一个实施方案中，所述破坏包括使用编码可检测标记物的基因插入或置换第一包装起始位点序列。在一个实施方案中，编码可检测标记物的基因选自：luxA、luxB和luxAB。在某些实施方案中，编码可检测标记物的基因可操作地连接至组成型启动子，例如Pblast。在某些实施方案中，所述第一基因包含pacA基因座，且其中所述破坏包括将luxAB基因和kan基因插入pacA基因座。在一些实施方案中，噬菌体基因组包含SEQ ID NO: 12。

在一些实施方案中，所述报道核酸分子包含复制起点。在一个实施方案中，报道核酸分子的复制包括适合包装至非复制型转导粒子中的多联体。在某些实施方案中，所述未破坏的第一包装起始位点序列包括多联体接合点。在一些实施方案中，所述复制子是肠杆菌科噬菌体P1裂解复制子。

在一个实施方案中，所述复制子包含C1阻遏物控制的P53启动子、P53 启动子反义链、repL基因和kilA基因的框架内缺失。在一个实施方案中，所述复制子包含SEQ ID NO:2的序列。在一个实施方案中，所述复制子是pBHR1复制子或pBHR1复制子的衍生物。在一个实施方案中，所述复制子包含SEQ ID NO:3的序列。在一个实施方案中，所述报道核酸分子包含SEQ ID NO:4的序列。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子衍生自金黄色葡萄球菌pT181质粒复制起点。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子包含SEQ ID NO:5的序列。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子衍生自肠球菌（Enterococcus）repB质粒复制起点。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子包含SEQ ID NO:7的序列。在一个实施方案中，所述核酸分子的复制子衍生自肠球菌pDL278质粒复制起点。在一个实施方案中，所述报道核酸分子的复制子包含SEQ ID NO:8的序列。在一个实施方案中，未破坏的第一包装起始位点序列包含pac-位点。在一个实施方案中，未破坏的第一包装起始位点序列包含cos-位点。

在一个实施方案中，所述噬菌体基因组包含肠杆菌科噬菌体P1。在一个实施方案中，所述噬菌体基因组包含金黄色葡萄球菌噬菌体

80α或噬菌体

11。在一个实施方案中，所述噬菌体基因组包含粪肠球菌噬菌体

EF11。

在一个实施方案中，所述细菌细胞包含大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，所述细菌细胞包含金黄色葡萄球菌细胞。在一个实施方案中，所述细菌细胞包含粪肠球菌细胞。在一个实施方案中，所述细菌细胞包含革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，所述细菌细胞包含革兰氏阳性细胞。

在一个实施方案中，所述报道基因编码可检测标记物或可选择标记物。在一些实施方案中，报道基因选自：介导发光反应的酶（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、介导比色反应的酶（lacZ、HRP）、荧光蛋白（GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白）、亲和肽（His-标签、3X-FLAG）和可选择标记物（ampC、tet(M)、CAT、erm）。

在一个实施方案中，所述报道核酸分子包含适配体。在一个实施方案中，所述报道核酸分子包含与所述报道核酸分子中的第二序列互补的核酸转录物序列。

在一个实施方案中，所述核酸转录物序列与细胞转录物互补。在进一步的实施方案中，所述核酸转录物序列包含顺式阻遏序列。在一个实施方案中，所述报道核酸分子可操作地连接至启动子。

在进一步的实施方案中，选择启动子用于有助于细菌细胞中的从报道核酸分子表达的报道分子的反应性。在一些实施方案中，所述报道核酸分子的复制子包含与所述报道核酸分子的复制物中的第二序列互补的核酸转录物序列。

本文还提供了用于将报道核酸分子包装至非复制型转导粒子中的方法，其包括（1）为本文公开的细菌细胞包装系统提供条件，所述条件诱导噬菌体基因组的裂解期以产生包装有报道核酸分子的非复制型转导粒子；和（2）收集包含报道核酸分子的非复制型转导粒子。在一些实施方案中,所述非复制型转导粒子不含有复制的噬菌体基因组。在一些实施方案中，所述非复制型转导粒子包含由于与报道核酸分子重组而存在的噬菌体基因组的部分，并且其中所述噬菌体基因组的部分包含报道基因。

本文还提供了包含通过本文公开的方法生产的包含报道核酸分子的复制子的非复制型转导粒子的组合物。

本文还提供了用于将核酸分子包装至非复制型转导粒子中的细菌细胞包装系统，所述细菌细胞包含（1）包含第一包装起始位点序列的噬菌体基因组，其中所述第一包装起始位点序列被编码报道分子的基因破坏，和（2）包含促进将报道核酸分子的复制子包装至非复制型转导粒子中的第二包装起始位点序列的报道核酸分子，其中所述报道核酸分子形成配置为包装至非复制型转导粒子中的复制子。

本文还提供了用于将报道核酸分子包装至用于导入细胞的非复制型转导粒子（NRTP）中的细菌细胞包装系统，所述包装系统包括宿主细胞，其包含（1）包含第一对末端酶基因的噬菌体基因组，其中所述第一对末端酶基因的至少一个是被破坏的，致使破坏的末端酶基因无功能，和（2）包含报道基因和补充第一对末端酶基因的第二对末端酶基因的报道核酸分子，其中第二对末端酶基因的每一个均是有功能的，并且其中所述第二对末端酶基因促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中。

本文还提供了用于将报道核酸分子包装至用于导入细胞的非复制型转导粒子（NRTP）中的细菌细胞包装系统，所述包装系统包括宿主细胞，其包含（1）包含第一对末端酶基因的噬菌体基因组，其中所述第一对末端酶基因的仅一个是被破坏的，致使破坏的末端酶基因无功能，和（2）包含报道基因和补充第一末端酶基因的第二末端酶基因的报道核酸分子，其中第二末端酶基因是有功能的，并且其中所述第二末端酶基因促进将报道核酸分子的复制子包装至NRTP中。

在一些非复制型转导粒子包装系统中，可以包装与质粒DNA重组的病毒DNA。在此类系统中，通过包装系统产生的裂解物可以含有两种转导粒子，（1）携带质粒DNA的转导粒子和（2）携带病毒DNA的转导粒子。在此类系统中，当使用所述裂解物作为检测靶细胞的报道系统时，后一种转导粒子不促成信号产生。因此，本文公开了改善的基于非复制型转导粒子的报道系统，其中已经将报道基因并入病毒基因组，使得两种转导粒子均能够产生信号。

附图的几个视图的简述

本发明的这些和其它特征、方面和优点将关于以下说明和所附附图变得更好理解，其中：

图1说明了根据一个实施方案在噬菌体P1中pacA基因破坏的实例，其通过在pacA基因中经由等位基因交换插入卡那霉素抗性基因。

图2说明了根据一个实施方案的携带在天然pacA基因启动子的控制下pacA和pacB基因的互补报道质粒的示意图。

图3说明了根据一个实施方案的包装系统的设计和功能的一个实例，所述包装系统包括使用具有破坏的pacA的噬菌体P1溶原化的大肠杆菌细胞，所述细胞还携带含有pacA和pacB的质粒。

图4说明了根据一个实施方案的包装系统的设计和功能的一个实例，所述包装系统包括使用具有破坏的pacA的噬菌体P1溶原化的大肠杆菌细胞，其中所述破坏是经由卡那霉素抗性基因和细菌萤光素酶luxAB基因的插入完成的，所述细胞还携带含有pacA和pacB的质粒。

图5描述了根据本发明的一个实施方案的用于使用NRTP用于检测活细胞中对靶基因启动子的诱导物的系统。

图6描述了根据本发明的一个实施方案的包括报道核酸分子（例如质粒）的报道系统，所述报道核酸分子被构建用于检测VanR（屎肠球菌（或粪肠球菌）中的万古霉素抗性（vanA）基因的启动子的诱导物）。报道质粒携带可操作地连接至vanA基因启动子的报道基因。

图7描述了根据本发明的一个实施方案的包括报道核酸分子的报道系统，所述报道核酸分子被构建用于检测TcdD（艰难梭菌(C. difficile)的毒素A和B基因（分别为tcdA和tcdB）的启动子的诱导物）。报道核酸分子包括可操作地连接至tcdA基因启动子的报道基因。

图8描述了根据本发明的一个实施方案的包括报道核酸分子的报道系统，所述报道核酸分子被构建用于检测SarS（金黄色葡萄球菌中蛋白质A基因(spa)的启动子的诱导物）。报道核酸分子包括可操作地连接至spa基因启动子(P_spa)的细菌萤光素酶基因luxA和luxB。

图9显示了在靶标转录物和报道分子转录物的顺式阻遏序列之间的碱基配对的图表。

图10显示了通过测量来自转导细胞的菌落的光产生（RLU）获得的数据的表格。使用质粒DNA转导对壮观霉素有抗性（SpecR）的细胞，而通过P1 DNA转导对卡那霉素有抗性（KanR）的细胞。从使用从含有P1、无luxAB整合至其基因组的细胞（1505）产生的裂解物获得的数据导致通常不产生光的KanR转导子，而从使用从含有P1和luxAB整合至其基因组的细胞（1525）产生的裂解物获得的数据导致产生光的KanR转导子。

发明详述

I.定义

在下文定义了在权利要求和说明书中使用的术语，除非另有说明。

如本文所用，“报道核酸分子”指的是包含DNA或RNA分子的核苷酸序列。报道核酸分子可以是天然存在的或是人工或合成分子。在一些实施方案中，报道核酸分子对宿主细胞是外源的，并且可以作为外源核酸分子诸如质粒或载体的一部分导入宿主细胞中。在某些实施方案中，报道核酸分子可以与细胞中的靶基因互补。在其它实施方案中，报道核酸分子包含编码报道分子（例如报道酶、蛋白质）的报道基因。在一些实施方案中，报道核酸分子被称为“报道构建体”或“核酸报道构建体”。

“报道分子”或“报道子”指的是给予生物体可检测或可选择表型的分子（例如核酸或蛋白质）。可检测表型可以是例如比色的、荧光的或发光的。报道分子可以从编码介导发光反应的酶（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）的报道基因、编码介导比色反应的酶（lacZ、HRP）的基因、编码荧光蛋白（GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白）的基因、编码亲和肽（His-标签、3X-FLAG）的核酸分子和编码可选择标记物（ampC、tet(M)、CAT、erm）的基因表达。可以使用报道分子作为成功摄取核酸分子或外源序列（质粒）进入细胞的标记物。报道分子还可以用于指示靶基因、靶核酸分子、靶细胞内分子或细胞的存在，如本文所述。可选地，报道分子可以是核酸，诸如适配体或核糖酶。

在本发明的一些方面中，报道核酸分子可操作地连接至启动子。在本发明的其它方面中，可以选择或设计启动子以有助于基于特定细胞（例如，特定物种）中而不是在其它细胞中的启动子活性的报道系统的反应性和交叉反应性。在某些方面中，所述报道核酸分子包含复制起点。在其它方面中，当基于特定细胞（例如，特定物种）中而不是在其它细胞中复制起点的活性，靶细胞中的报道核酸分子的复制有助于报道分子信号产生或是其所需时，复制起点的选择可以相似地有助于报道系统的反应性和交叉反应性。在一些实施方案中，报道核酸分子形成能够在病毒复制期间作为多联体DNA包装至子代病毒中的复制子。

如本文所用，“靶转录物”指的是由靶细胞天然形成的DNA序列或mRNA分子的核苷酸序列的部分，包括在靶基因转录期间形成的mRNA和作为初级转录产物的RNA加工的产物的mRNA。靶转录物还可以被称为细胞转录物或天然存在的转录物。

如本文所用，术语“转录物”指的是从DNA或RNA模板序列或基因转录的一段核苷酸序列（DNA或RNA）。转录物可以是转录自RNA模板的cDNA序列或转录自DNA模板的mRNA序列。转录物可以是编码蛋白质的或非编码蛋白质的。转录物还可以从经工程改造的核酸构建体转录。

衍生自报道核酸分子的转录物可以被称为“报道分子转录物”。报道分子转录物可以包括报道分子序列和顺式阻遏序列。报道分子转录物可以具有形成互补性区域的序列，使得转录物包括形成双链体的两个区域（例如分子间双链体区域）。一个区域可以称为“顺式阻遏序列”并且具有与靶转录物和/或报道分子序列的部分或全部的互补性。转录物的第二部分被称为“报道分子序列”并且可以具有与顺式阻遏序列的互补性。互补性可以是完全互补性或实质互补性。顺式阻遏序列与报道分子序列的存在和/或结合可以在报道分子转录物中形成构象，其可以阻断报道分子的进一步表达。报道分子转录物可以形成二级结构，诸如发卡结构，使得报道分子转录物中各自互补的区域可以与彼此杂交。

当指的是核酸分子或外源序列（例如质粒、载体、构建体）时，“导入细胞”意为促进摄取或吸收至细胞中，如本领域技术人员理解的。吸收或摄取核酸构建体或转录物可以通过无辅助扩散或活性细胞过程发生，或通过包括经由使用噬菌体、病毒和转导粒子的助剂或装置发生。该术语的含义不限于体外细胞；核酸分子也可以被“导入至细胞”，其中所述细胞是活生物体的部分。在这种情况下，导入细胞将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，本发明的核酸分子、构建体或载体可以被注射至组织位点或全身施用。体外导入细胞包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂质体转染。进一步的方法在本文中描述或是本领域已知的。

“转导粒子”指的是能够递送非病毒核酸分子至细胞中的病毒。病毒可以是噬菌体、腺病毒等。

“非复制型转导粒子”指的是能够将非病毒核酸分子递送至细胞，但是不能将其自身复制的病毒基因组包装至转导粒子中的病毒。病毒可以是噬菌体、腺病毒等。

“质粒”是与细胞中染色体DNA物理分离、并且可以独立于细胞中染色体DNA复制的小DNA分子。最通常发现作为细菌中的小环形、双链DNA分子，质粒有时也存在于古细菌和真核生物体中。质粒被视作复制子，能够在合适的宿主中自主复制。

“载体”是用作媒介物以人工携带外来遗传物质进入另一细胞而使外来遗传物质在其中可以复制和/或表达的核酸分子。

“病毒”是仅在其它生物体的活细胞内复制的小型传染性病原体。病毒粒子（称作病毒颗粒）包括两个或三个部分：i)由DNA或RNA分子制成的携带遗传信息的遗传物质；ii）保护这些基因的蛋白质衣壳；和在一些情况中，iii）包围蛋白质衣壳的脂质包膜。

如本文所用，术语“补充（complement）”指的是在存在已破坏的相同序列的情况下的未破坏的序列，或指的是未破坏的序列与已破坏的序列的关系。在一个实施方案中，补充包含在细胞的多核苷酸中编码的基因，其具有功能并能够表达，并且表达具有与噬菌体上的破坏的基因在破坏前相同功能的蛋白质。在一些实施方案中，补充基因与破坏之前的破坏的噬菌体基因（即，天然噬菌体基因）具有大于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些实施方案中，补充基因与破坏之前的破坏的噬菌体基因（即，天然噬菌体基因）相同。在一些实施方案中，补充基因包含从噬菌体缺失的多核苷酸序列。在一些实施方案中，补充基因指的是在质粒上编码噬菌体的包装机制的基因，其中相同的基因已经在噬菌体中破坏。因此，需要所述质粒在具有突变的包装机制基因的噬菌体的存在下，提供将多核苷酸包装至转导粒子中所需的必需包装机制。

如本文所用，术语“与包装相关的酶活性”指的是对于与包装起始位点序列相互作用以将多核苷酸包装至转导粒子中至关重要的一种或多种多肽。在一些实施方案中，这样的相互作用需要一对末端酶基因，其中各末端酶编码与包装相关的酶活性。在一些实施方案中，所述酶活性由金黄色葡萄球菌噬菌体

11或

80α的terS和/或terL基因、粪肠球菌噬菌体

Ef11的terA和terB基因、或肠杆菌科噬菌体P1的pacA和pacB基因编码。在这些实施方案中，末端酶基因对中的每一个表达一种与包装相关的酶活性，并且两者的功能版本是包装具有包装起始位点的多核苷酸所必需的。在一些实施方案中，与包装相关的酶活性相关的多个基因的基因之一的破坏消除了所述与包装相关的酶活性。在一些实施方案中，末端酶基因对中的两者在噬菌体中受到破坏，由此，破坏噬菌体上整组与包装相关的酶活性编码基因。

“MRSA”指的是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌。

“MSSA”指的是甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌。

术语“改善”指的是疾病状态的治疗中的任何治疗性有益结果，例如，疾病状态，包括其预防、严重性或进程减轻、缓解或治愈。

术语“原位”指的是过程发生在与活生物体分离生长（例如，在组织培养中生长）的活细胞中。

术语“体内”指的是过程发生在活生物体中。

如本文使用的术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长动物、犬类、猫类、鼠类、牛类、马类和猪类。

“G”、“C”、“A”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在本文中可互换地使用并且指的是其中核苷碱基是胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，例如脱氧核糖胸腺嘧啶。但是，将理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”也可以指的是经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或指的是替代置换部分。技术人员充分意识到鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以由其它部分置换，而基本上不改变包含携带这样的置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性能。例如，不受限制地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸置换。包含此类置换部分的序列是本发明的实施方案。

如本文所用，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补”指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下杂交并形成双链体结构的能力，这将被技术人员所理解。互补序列也被描述为彼此结合并通过结合亲和力表征。

例如，当两序列在严格杂交条件下杂交（例如，退火）时，第一核苷酸序列可以被描述为与第二核苷酸序列互补。杂交条件包括用于退火和/或洗涤步骤的温度、离子强度、pH和有机溶剂浓度。术语严格杂交条件指的是在其中第一核苷酸序列将优先与其靶序列（例如，第二核苷酸序列）杂交，并且以较低程度与其它序列杂交或根本不与其它序列杂交的条件。严格杂交条件是序列依赖性的，并且在不同环境参数下不同。通常，严格杂交条件选为比在限定的离子强度和pH下核苷酸序列的热熔解点（Tm）低约5℃。Tm为（在限定的离子强度和pH下）在其中50%的第一核苷酸序列与完美匹配的靶序列杂交的温度。对核酸杂交的广泛指导见于例如Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays,” Elsevier, N.Y. (“Tijssen”)。可以应用其它条件，诸如可能在生物体内遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用确定用于两序列互补性测试的最合适的条件集合。

这包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长上的碱基配对。本文中此类序列可以被称为彼此“完全互补”。但是，当本文中第一序列被称为相对于第二序列“基本互补”时，所述两序列可以完全互补，或它们可以在杂交时形成一个或多个，但通常不多于4个、3个或2个错配碱基对，同时保持在与它们最终应用最相关的条件下杂交的能力。但是，当两寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端时，这样的突出端不应当被视为关于互补性测定的错配。例如，包含一条21个核苷酸长的寡核苷酸和另一条23个核苷酸长的寡核苷酸（其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个寡核酸的序列）的dsRNA对于本文所述的目的仍可以被称为“完全互补”。

如本文所用，“互补”序列还可以包括由非Watson-Crick碱基对和/或由非天然的和经修饰的核苷酸形成的碱基对或完全由非Watson-Crick碱基对和/或由非天然的和经修饰的核苷酸形成的碱基对形成，条件是满足上文中关于它们的杂交能力的要求。此类非Watson-Crick碱基对包括，但不限于G:UWobble或Hoogstein碱基配对。

本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以关于dsRNA的两条链之间或dsRNA的反义链和靶序列之间、单链RNA序列或单链DNA序列的互补链之间的碱基匹配使用，如将从它们的使用背景了解的。

如本文所用，“双链体结构”包括两条反向平行并且基本互补的核酸序列。核酸构建体中的互补序列，在两个转录物之间、转录物中的两个区域之间或转录物和靶序列之间可以形成“双链体结构”。通常，每条链的核苷酸的大多数为核糖核苷酸，但是如本文详述的，各链或两条链还可以包括至少一个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。形成双链体结构的两条链可以是一个更大的RNA分子的不同部分，或它们可以是分开的RNA分子。当两条链是一个更大的分子的部分，并且因此通过一条链的3’-端和形成双链体结构的相对另一条链的5’-端之间的核苷酸的不间断链连接时，连接的RNA链被称为“发夹环”。当两条链通过一条链的3’-端和形成双链体结构的相对另一条链的5’-端之间的核苷酸的不间断链以外的方式共价连接时，所述连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同的核苷酸数量。碱基对的最大数量是双链体最短的链的核苷酸数量减去存在于双链体中的任何突出端。通常，双链体结构为15至30，或25至30，或18至25，或19至24，或19至21，或19、20或21个碱基对长。在一个实施方案中，双链体是19个碱基对长。在另一个实施方案中，双链体是21个碱基对长。当组合使用两个不同的siRNA时，双链体长度可以相同或可以不同。

如本文所用，术语“互补区域”指的是反义链中与序列，例如靶序列基本互补的区域，如本文所定义的。当互补区域不是与靶序列完全互补时，错配在末端区域是最耐受的，并且如果存在，通常在一个或多个末端区域在例如5’和/或3’端的6、5、4、3或2个核苷酸内。

在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“百分比同一性”指的是当针对最大对应进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，如使用下文描述的序列比较算法（例如BLASTP和BLASTN或技术人员可以获得的其它算法）之一或通过目视检查所测量。取决于应用，百分比“同一性”可以存在于所比较的序列区域，例如功能结构域，或者，可选地，存在于待比较的两序列的全长。

为了序列比较，通常一条序列用作与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，设计子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。随后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

可以进行用于比较的序列优化比对，例如，通过Smith & Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482 (1981)的局部同源算法、通过Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)的相似性检索方法、通过这些算法的计算机化执行（Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA）或通过目视检查（通常参见Ausubel 等人，下文）。

适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其在Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中描述。用于执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以公开获得。

术语“足够量”意为足以产生期望效果的量，例如足以从细胞产生可检测信号的量。

术语“治疗有效量”是对缓解疾病症状有效的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被视为治疗。

必须注意的是，如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/种”和“所述”包括复数对象，除非上下文中另有明确规定。

II. 病毒的溶原和裂解周期

病毒在宿主细胞中经历溶原和裂解周期。如果采用了溶原周期，噬菌体染色体可以整合至细菌染色体中，或其可以在宿主中自身确立为稳定质粒，所述噬菌体染色体在宿主中可以长时间保持休眠。如果诱导溶原体，噬菌体基因组从细菌染色体切除并且开始溶原周期，其在将细胞裂解并释放噬菌体粒子时达到顶峰。裂解周期导致产生新噬菌体粒子，其可以通过宿主的裂解释放。

某些温和噬菌体可以展现出裂解活性，并且其倾向随各种宿主细菌而变化。为了说明这种现象，经由噬菌斑测定检验十种MRSA临床分离物上的两种温和金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解活性（表1）。噬菌体φ11在10种临床MRSA分离物中的10种上展现出裂解活性，并且φ80α在10种临床MRSA分离物中的6种上展现出裂解活性。因此，可以预期依赖于噬菌体的天然溶原周期的报道分子测定偶尔展示出裂解活性。

表1：金黄色葡萄球菌温和噬菌体11和80α在10个临床MRSA分离物上的裂解活 性（由字母“x”指示）

MRSA 分离物	11	80α
			1	X
2	X
			3	X	X
4	X	X
			5	X	X
6	X
			7	X	X
8	X
			9	X	X
10	X	X

另外，由于基于宿主和原噬菌体衍生的噬菌体抗性机制导致的噬菌体宿主范围的限制，基于病毒的报道分子测定，诸如基于噬菌体的报道物（reporter），可以遭受有限的反应性（即，分析包容性）。这些抗性机制靶向天然噬菌体核酸，其可以导致噬菌体DNA和功能的降解或以其他方式的抑制。此类抗性机制包括切割噬菌体DNA的限制系统，和抑制噬菌体衍生的转录物的CRISPR系统。

裂解活性和噬菌体抗性两者均可以抑制基于报道噬菌体的测定。裂解活性可以通过破坏或以其他方式抑制细胞产生可检测的信号的能力来抑制信号，并且因此通过减少可检测信号的量或阻止生成可检测信号来影响检测限。噬菌体抗性机制可以限制噬菌体的宿主范围并且限制基于噬菌体的报道物的包容性，相似地通过减少可检测信号的量或阻止生成可检测信号来影响检测限。通过将噬菌体DNA并入报道噬菌体而导致的裂解活性和噬菌体抗性均可以导致并入这些噬菌体报道物的测定中的假阴性结果。

III. 用于产生非复制型转导粒子（NRTP）的方法

用于产生非复制型转导粒子的基于破坏/补充的方法。

本文公开的是基于病毒基因组组分的破坏的非复制型转导粒子包装系统，所述病毒的基因组组分被病毒包装机制识别为病毒生产期间由其起始基因组包装的元件。在一个实施方案中，该破坏破坏了噬菌体的包装起始位点，并且还破坏了末端酶功能。受破坏的元件的实例包括pac-型噬菌体的pac-位点序列和cos-型噬菌体的cos-位点序列。在一个实施方案中，当噬菌体中的包装起始位点序列被破坏时，噬菌体不能产生功能性末端酶。在一个实例中，pac-位点在pacA基因序列中编码，且末端酶功能需要有功能的PacA和PacB两者。在实施方案中，通过在质粒DNA上补充所述受破坏的末端酶和包括可识别的包装起始位点，将质粒DNA包装至噬菌体衣壳中。噬菌体可以是任何噬菌体，诸如肠杆菌科噬菌体P1或

EF11，或金黄色葡萄球菌噬菌体

80α或噬菌体

11。

包装起始位点通常在对于病毒生产必需的基因的编码区域中发现。在一些实施方案中，噬菌体基因组的区域通过破坏包装起始位点的插入、置换、缺失或突变进行破坏。达到这一目的的破坏的实例包括，但不限于，将含有包装起始位点序列的噬菌体基因组序列置换为另一序列诸如抗生素抗性基因的序列的等位基因交换事件，或小和大末端酶的完全缺失。在使用末端酶基因pacA和pacB的实例中，pacA可以以产生极性效应的方式被破坏，所述极性效应还破坏pacB表达和/或由pacA和pacB介导的总体末端酶功能。其它实例可以包括末端酶基因，其还包括来自金黄色葡萄球菌噬菌体

11或

80α的terS和terL基因，或来自粪肠球菌噬菌体

Ef11的terS和terL基因。在一个实施方案中，末端酶基因包括SEQ IDNo:10，其中含有pac-位点的基因序列的部分已经被卡那霉素抗性基因置换的P1 pacA基因。图1说明了通过将卡那霉素抗性基因经由等位基因交换插入pacA基因中的噬菌体P1中的pacA基因的破坏的实例。

在一个实例中，细胞基因组是使用病毒基因组溶原化的，其中包装起始位点已经被破坏。在一些实施方案中，细胞可以是大肠杆菌细胞、金黄色葡萄球菌细胞或粪肠球菌细胞。细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性的。将补充质粒（或报道核酸分子）导入细胞，并且所述质粒DNA至少包括噬菌体中已经被破坏的基因，以及包装起始位点序列，和任选地另外的噬菌体基因和报道基因，其可以编码可检测和/或可选择标记物。可以使用国际申请号PCT US 2014/026536中发现的方法构建质粒，所述申请通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，包装起始位点序列包括pac-位点或cos-位点。在一个实施方案中，包装起始位点序列包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的序列。质粒的一个或多个基因可以可操作地连接至启动子，诸如诱导型启动子（当通过诱导噬菌体起始包装时，所述启动子可以被诱导）。在一些实施方案中，启动子可以是小末端酶基因或大末端酶基因的天然启动子。在一个实施方案中，天然启动子可以通过噬菌体控制，并且因此有效地充当在包装期间诱导的条件型启动子。在一个实施方案中，启动子包括SEQ ID NO: 9的序列。

图2说明了携带pacA和pacB基因的质粒的示意图。图3说明了由使用具有被破坏的pacA基因的噬菌体P1溶原化的大肠杆菌细胞构成的包装系统的设计和功能的实例。细胞也携带含有pacA和pacB基因的质粒。在一个实施方案中，质粒中的pacA和pacB基因衍生自肠杆菌科噬菌体P1。当突变病毒经历裂解周期时，从噬菌体基因组或（如果被破坏）补充质粒产生病毒包装蛋白，由于其包装起始位点，将质粒DNA的复制子包装至包装单元中，并且产生携带复制质粒DNA的非复制型转导粒子。

在一个实施方案中，所述复制子是肠杆菌科噬菌体P1裂解复制子。复制子还可以是pBHRl复制子或pBHRl复制子的衍生物，其衍生自金黄色葡萄球菌pT181质粒复制起点、衍生自肠球菌repB质粒复制起点或衍生自肠球菌pDL278质粒复制起点。在另一个实施方案中，所述复制子包含C1阻遏物控制的P53启动子、P53 启动子反义链、repL基因和kilA基因的框架内缺失。复制子的一个实例具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQID NO: 7或SEQ ID NO: 8的序列。

在一些实施方案中，优选设计破坏/补充，使得突变病毒DNA和补充外源DNA之间没有同源性。这是因为突变病毒DNA和补充外源DNA之间缺乏同源性避免了两种DNA分子之间同源重组的可能性，其可以导致将包装序列再次导入病毒基因组中。为了实现缺乏同源性，一个策略是缺失含有来自病毒基因组的包装起始位点的整个一个基因（或多个基因）并且随后使用外源DNA分子补充此基因，所述外源DNA分子优选仅含有从病毒缺失的确切的DNA序列。在该策略中，设计补充DNA分子以表达从病毒缺失的基因。使用噬菌体

80α（pac型噬菌体）提供这样的系统的另一实例。噬菌体基因组在宿主细菌细胞中是溶原化的，并且噬菌体基因组包括其中pac-型噬菌体

80α的pac-位点已经缺失的小末端酶基因。将包括具有天然pac-位点的互补小末端酶基因转化至细胞中。当诱导溶原化原噬菌体的裂解周期时，噬菌体包装系统将质粒DNA包装至子代噬菌体结构组分中，而不是包装天然噬菌体DNA。包装系统因此产生携带质粒DNA的非复制型转导粒子。

在另一个实施方案中，噬菌体基因组的区域通过破坏包装起始位点的插入而破坏。在一个实施方案中，所述破坏包括将报道基因引入噬菌体基因组。在一个实施方案中，所述破坏包括将抗性标记物和报道基因引入噬菌体基因组。在一个实施方案中，所述破坏是通过将噬菌体基因组上的基因使用报道基因置换或破坏的等位基因交换事件实现的。在一个实施方案中，所述破坏是通过将噬菌体基因组上的基因使用抗性标记物和报道基因置换或破坏的等位基因交换事件实现的。在一些实施方案中，抗性标记物和/或报道基因是在组成型启动子的控制下。

图4说明了由包含具有破坏的pacA基因（其中kan和luxAB基因已经插入pac-位点序列）的噬菌体P1的大肠杆菌细胞构成的包装系统的设计和功能的实例。如图3中，细胞也携带含有pacA和pacB基因的质粒。因此，如果在噬菌体和质粒之间发生重组，插入P1衣壳以形成NRTP的复制的质粒将仍然包含报道基因。

在一个实施方案中，所述报道基因编码可检测标记物或可选择标记物。在进一步的实施方案中，所述报道基因选自：介导发光反应的酶（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、介导比色反应的酶（lacZ、HRP）、荧光蛋白（GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白）、亲和肽（His-标签、3X-FLAG）和可选择标记物（ampC、tet(M)、CAT、erm）。在一个实施方案中，报道基因是luxA。在一些实施方案中，抗性标记物包含抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗性标记物是卡那霉素抗性基因（kan）。在一些实施方案中，组成型启动子包含Pblast。在一些实施方案中，噬菌体基因组破坏是通过置换或破坏在噬菌体基因组上含有包装起始位点序列的序列的等位基因交换事件实现的。

在一些实施方案中，噬菌体基因组破坏是通过使用在组成型启动子（Pblast）控制下的卡那霉素抗性基因（kan）和细菌萤光素酶基因（luxAB）置换或破坏在噬菌体基因组上含有包装起始位点序列的序列的等位基因交换事件实现的。在一个实施方案中，等位基因交换以类似于图1中描述的方式实现，其中转换了报道分子或报道分子和抗性标记物。

在一个实施方案中，噬菌体基因组上的一对末端酶基因，例如pacA和pacB、terA和terB或terS和terL，以导致极性效应的方式被破坏，其还破坏末端酶基因中的一个的表达和/或由末端酶基因介导的总体末端酶功能。在一个实施方案中，包含插入pacA基因座的kan和luxAB的构建体在SEQ ID NO: 12中提供。在一个实施方案中，使用包含噬菌体基因组的末端酶基因（例如pacA和pacB、terA和terB或terS和terL）的质粒补充破坏的噬菌体。在一个实施方案中，将质粒导入至使用具有破坏的末端酶基因的噬菌体溶原化的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，噬菌体是肠杆菌科噬菌体P1。在一个实施方案中，质粒中的末端酶基因衍生自肠杆菌科噬菌体P1，即pacA和pacB基因。当突变病毒经历裂解周期时，从噬菌体基因组或（如果被破坏）补充质粒产生的病毒包装蛋白，由于其含有包装起始位点，将质粒DNA的复制子包装至包装单元中，并且产生携带复制的质粒DNA的非复制型转导粒子。

在这些缺失/补充系统中，可以产生两种类型的转导粒子，其包括（1）携带质粒DNA的非复制型转导粒子和（2）携带P1 DNA的非复制型转导粒子，其中后者可以由于质粒DNA和P1 DNA之间的重组而产生。在一个P1突变体不含有插入P1基因组的luxAB的实施方案中，当这些转导粒子递送DNA至靶细胞时，所述携带P1 DNA的非复制型转导粒子无助于信号产生。但是，在一个P1突变体的确含有插入P1基因组的luxAB的实施方案中，当这些转导粒子递送DNA至靶细胞时，所述携带P1 DNA的非复制型转导粒子的确有助于信号产生。

如此，将luxAB基因插入P1基因组的实施方案产生了改善的非复制型转导粒子报道系统。

IV.报道分子

在一些实施方案中，本发明的NRTP和构建体包含了包括报道基因的报道核酸分子。在一些实施方案中，本发明的噬菌体包含报道基因。报道基因可以编码报道分子，并且报道分子可以是可检测或可选择标记物。在某些实施方案中，报道基因编码报道分子，当在细胞中表达时，所述报道分子产生可检测信号。

在某些实施方案中，报道分子可以是荧光报道分子，诸如但不限于绿色荧光蛋白（GFP）、增强型GFP、黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白（RFP）或mCherry，以及近红外荧光蛋白。

在其它实施方案中，报道分子可以是介导发光反应的酶（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc等）。报道分子可以包括细菌萤光素酶、真核细胞萤光素酶、适合用于比色检测的酶（lacZ、HRP）、适合用于免疫检测的蛋白，诸如亲和肽（His标签、3X-FLAG）、用作适配体或展示出酶活性的核酸（核糖酶）或可选择标记物，诸如抗生素抗性基因（ampC、tet(M)、CAT、erm）。本领域已知的其它报道分子可以用于产生信号以检测靶标核酸或细胞。

在其它方面，报道分子包含核酸分子。在一些方面，报道分子是具有特异性结合活性，或展示出酶活性（例如适配体酶、DNA酶、核糖酶）的适配体。

报道分子和报道分子测定在本文V部分中进一步描述。

NRTP和报道分子测定

诱导物报道分子测定

在一些实施方案中，本发明包括使用NRTP作为报道分子与靶向活细胞内的基因启动子的内源或天然诱导物一起使用的方法。本发明的NRTP可以使用部分III和下文实施例1-2中描述的方法进行工程改造。

在一些实施方案中，所述方法包括使用NRTP作为报道分子，其中NRTP包含报道基因，其可操作地连接至控制靶细胞中靶基因表达的诱导型启动子。当包括所述报道基因的NRTP导入靶细胞时，经由报道核酸分子中的靶基因启动子的诱导，报道基因的表达是可能的。

图5描述了具有两种基因的靶细胞500基因组基因座，所述基因为编码诱导物502的基因和靶基因503。还描述了包括报道基因505的报道核酸分子504，所述报道基因505可操作地连接至靶细胞的靶基因的启动子506。可以将报道核酸分子504经由NRTP导入细胞中。在天然细胞中，当诱导物基因502表达并产生诱导物蛋白507时，诱导物蛋白507能够诱导可操作地连接至靶基因的靶基因启动子506，因此导致靶基因的表达和靶基因产物508的产生。

当靶生物体中存在报道核酸分子504时，诱导物507也能够诱导报道核酸分子504中存在的靶基因启动子506，因此导致报道基因505的表达，其导致能够生成可检测信号的报道分子509的产生。

因此，来自报道分子509的可检测信号的产生指示细胞的存在，其基于靶细胞中诱导物蛋白507的存在。

VanR报道系统

在一个实施方案中，报道系统包括NRTP，其包含报道核酸分子（例如质粒）。可以构建报道核酸分子用于检测VanR，屎肠球菌（Enterococcus faecium）（或粪肠球菌）中万古霉素抗性（vanA）基因的启动子的诱导物。报道质粒携带了可操作地连接至vanA基因启动子的报道基因。

图6概括了VanR报道系统的设计和功能。图6描述了可以在屎肠球菌中存在的转座子Tn1546 601的区域。Tn1546 转座子可以包括vanR诱导物基因602和vanA靶基因603。图中还描述了报道核酸分子604，其可以被包装至NRTP中并且导入细胞中。报道核酸分子604包括报道基因605，其可操作地连接至启动子P_H 606，所述启动子P_H 606控制包括vanA基因的vanHAX操纵子的表达。在天然细胞中，当vanR基因602表达并且产生VanR蛋白607时，VanR能够诱导Tn1546转座子中的P_H 606，因此导致vanA基因的表达并且因此产生VanA蛋白608。当报道核酸分子603（载体）存在于靶生物体中时，VanR还能够诱导报道核酸分子603中的P_H606，因此导致报道分子609的表达。因此，报道分子的产生指示靶细胞中VanR的存在。

适合用于开发VRE测定的启动子的实例包括：vanA基因启动子和vanB基因启动子。Arthur, M.,等人, The VanS sensor negatively controls VanR-mediatedtranscriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tnl546 andrelated elements in the absence of induction. J. Bacterial., 1997. 179(1): p.97-106。

TcdD报道系统

在该系统的另一个实施方案中,将报道核酸分子使用NRTP导入细胞。可以构建报道核酸分子用于检测TcdD，艰难梭菌的毒素A和B基因（分别为tcdA和tcdB）的启动子的诱导物。报道核酸分子包括可操作地连接至tcdA基因启动子的报道基因。

图7概括了根据本发明的一个实施方案的TcdD报道系统的设计和功能。图7描述了可以在艰难梭菌中存在的转座子PaLoc 701的区域。PaLoc 转座子可以含有tcdD基因702和tcdA靶基因703。图中还描述了使用NRTP导入细胞的报道核酸分子704(例如载体)。报道核酸分子704包括可操作地连接至tcdA基因启动子(PtcctA)706的报道基因705。

在天然细胞中，当tcdD基因表达并且产生TcdD蛋白707时，TcdD能够诱导PaLoc转座子701中的P_tcdA 706，因此导致tcdA基因703的表达并且因此产生毒素A蛋白708。

当报道核酸分子704存在于靶生物体中时，TcdD还能够诱导报道分子载体中的P_tcdA 706，因此导致报道分子709的表达。因此，报道分子709的产生指示靶细胞中TcdD的存在。

适合用于开发艰难梭菌测定的启动子的实例包括：tcdA基因启动子和tcdB基因启动子。Karlsson, S., 等人, Expression of Clostridium dif.ficile Toxins A and Band Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun.,2003. 71(4): p. 1784-1793。

靶细胞和诱导物：靶细胞可以包括真核和原核细胞靶标和相关的诱导物。

载体递送系统：含有重组DNA的载体的递送可以通过非生物学或生物学系统执行。包括但不限于脂质体、病毒样粒子、衍生自噬菌体或病毒的转导粒子，和缀合。

基于噬菌体的SarS报道系统

在本发明的另一个实施方案中，报道核酸分子被构建用于检测SarS（金黄色葡萄球菌中蛋白质A基因(spa)的启动子的诱导物）。报道核酸分子可以在NRTP中导入细胞，并且包括可操作地连接至spa基因启动子(P_spa)的细菌萤光素酶基因luxA和luxB。报道核酸分子经由例如NRTP递送至金黄色葡萄球菌。如果细胞中存在SarS，其将诱导luxAB基因的表达，因此产生能够生成发光信号的萤光素酶。

图8概括了根据本发明的一个实施方案的SarS报道系统的设计和功能。图8描述了金黄色葡萄球菌基因组801的区域，其含有sarS基因802和spa基因803。图中还描述了通过NRTP递送至细胞的报道核酸分子（例如载体）804，并且其包括可操作地连接至控制spa基因803表达的启动子P_spa 806的luxAB 报道基因805。

在天然细胞中，当sarS基因802表达产生SarS蛋白807时，所述蛋白能够诱导金黄色葡萄球菌基因组转座子中的P_spa 806，因此导致spa基因803的表达和产生蛋白质A 808。

当靶生物体中存在报道核酸分子804时，SarS 807也能够诱导报道核酸分子804中的P_spa 806，因此导致luxAB的表达，其导致能够生成发光信号的萤光素酶809的产生。因此，萤光素酶的产生指示靶细胞中SarS的存在。

用于与下文描述的NRTP使用的其它报道系统描述于国际PCT公开号：WO 2014/160418中，其通过引用以其整体并入本文。

通过报道序列的顺式阻遏和通过靶转录物的结合的构象变化的机制。

本发明使用的一般机制是分子间核酸分子相互作用，其可以导致两种随后机制：（1）核酸分子的二级结构的构象变化，和（2）切割事件。本文描述了用于设计报道分子转录物的方法，所述报道分子转录物可以在顺式阻遏构象和去阻遏构象之间进行构象变化，使得通过将靶转录物结合至报道分子转录物来诱导构象变化。

如上文所述，报道分子转录物可以包含报道分子序列并且经设计使得报道基因序列的翻译由报道基因的核糖体结合位点（RBS）的顺式阻遏所阻断。

在一些实施方案中，可以使用以下工具用于设计本发明的报道分子转录物。

1）使用二级结构程序，诸如在由纽约州立大学，奥尔巴尼分校，文理学院RNA研究所（The RNA Institute College of Arts and Sciences, University at Albany,State University of New York）维护的服务器上可以获得的Mfold（用于核酸折叠和杂交预测Mfold 网页的服务器，Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003) ）(http://mfold.rna.albany.edu/

q=mfold/RNA-Folding-Form)计算RNA二级结构。

2）使用软件程序诸如RNA-RNA InterACTion预测，使用在由日本庆应大学，生物科学与信息学系，奈良科学技术研究所(NAIST)，信息科学研究部（http://rna.naist. jp/ractip/)维护的服务器上可以获得的Integer Programming (RactIP)计算分子内RNA相互作用。

3）使用用于RNA的可视化支程序 (VARNA) (http://varna.lri.fr/)（其为专用于绘制RNA二级结构的Java轻量级支程序）将RNA二级结构可视化。

靶转录物的二级结构可以基于由MFold计算的最低能量构象生成，并且使用VARNA可视化。

可以在靶转录物中鉴定ssRNA区域或靶标区域，其可以是对结合报道分子转录物是理想的。在一些情况中，靶转录物的二级结构包括共有序列或环序列，其可以结合报道分子序列的一部分。例如，在甲氧西林-抗性的金黄色葡萄球菌的mecA转录物中，存在包括可以用于结合报道分子转录物的顺式阻遏序列的共有YUNR序列“UUGG”)的末端环。靶转录物的二级结构的分析可以揭示可以适合用于结合顺式阻遏序列的这些一个或多个ssRNA区域。可以随后设计报道分子转录物的顺式阻遏序列以结合这些一个或多个ssRNA区域。

在一些实施方案中，顺式阻遏序列可以被设计为结合报道分子转录物中的报道分子序列的RBS，并且在报道分子转录物中形成茎-环结构，使得顺式阻遏序列阻断RNA聚合酶与报道分子序列的RBS的结合。在顺式阻遏序列结合靶转录物的ssRNA区域后，可以暴露报道分子序列的RBS并且可以起始报道分子序列的翻译。

在一些实施方案中，报道分子转录物的顺式阻遏序列可以被设计位于报道分子序列的5’端并且被设计以在报道分子序列中生成茎-环结构，使得报道分子序列的RBS序列被阻断。可以基于报道分子转录物的最低能量构象（如通过MFold计算并使用VARNA可视化）设计顺式阻遏茎-环结构以阻断RBS序列。预测的靶转录物和报道分子转录物的顺式阻遏序列之间的分子内相互作用可以通过RactIP计算并使用VARNA可视化。可以绘制图表以将靶转录物和报道分子转录物的顺式阻遏序列之间的碱基配对可视化，如图9中所示。

相互作用可以包括在靶序列和顺式阻遏序列中的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或更多个核苷酸之间的碱基配对。两个序列之间的互补结合可以是完全互补、基本互补或部分互补。碱基配对可以跨靶标和顺式阻遏序列中的相邻核苷酸序列或区域，例如如图9所示。

转录物

如上文所述，转录物指的是从DNA或RNA模板序列或基因转录的一段核苷酸序列（DNA或RNA）。转录物可以是转录自RNA模板的cDNA序列或转录自DNA模板的mRNA序列。转录物可以从经工程改造的核酸构建体转录。转录物可以具有其自身内的互补区域，使得转录物包括可以形成分子内双链体的两个区域。一个区域可以被称为“顺式阻遏序列”，其结合并阻断报道分子序列的翻译。转录物的第二区域被称为“报道分子序列”，其编码报道分子，诸如可检测或可选择标记物。

本发明的转录物可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长的转录物序列。在其它实施方案中，所述转录物长度可以是至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多个核苷酸。顺式阻遏序列和报道分子序列可以是相同长度或不同长度。

在一些实施方案中，顺式阻遏序列与报道分子序列分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24,25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60或更多个间隔区核苷酸。

载体

在另一个方面中，本发明的转录物（包括反义和正义序列）从插入DNA或RNA载体的转录单元表达（参见例如Couture, A,等人, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A.,等人,国际PCT公开号WO 00/22113, Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114,和Conrad,美国专利号6,054,299）。这些序列可以作为线性构建体、环形质粒或病毒载体（包括基于噬菌体的载体）导入，其可以并入宿主基因组和作为并入宿主基因组的转基因进行遗传。还可以构建转录物以允许其作为染色体外质粒进行遗传（Gassmann, 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1995) 92:1292）。

转录物序列可以通过位于表达质粒上的启动子进行转录。在一个实施方案中，顺式阻遏序列和报道分子序列表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列，使得转录物具有茎和环结构。

可以使用重组表达载体以表达本发明的转录物。重组表达载体通常为DNA质粒或病毒载体。表达转录物的病毒载体可以基于，但不限于腺相关病毒（对于综述，参见Muzyczka,等人, Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)）；腺病毒（参见例如Berkner, 等人, BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld 等人(1991, Science252:431-434), 和Rosenfeld 等人 (1992), Cell 68:143-155)）；或α病毒以及本领域已知的其它病毒进行构建。已经使用逆转录病毒在体外和/或体内将各种基因导入多种不同细胞类型，包括上皮细胞，（参见，例如Eglitis, 等人, Science (1985) 230:1395-1398;Danos和Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson 等人,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano 等人, 1990, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber 等人, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88:8039-8043; Ferry 等人, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381;Chowdhury 等人, 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. 等人, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay 等人, 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai 等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu 等人,1993, J. Immunol. 150:4104-4115; 美国专利号4,868,116;美国专利号4,980,286; PCT申请WO 89/07136; PCT 申请WO 89/02468; PCT 申请WO 89/05345; 和PCT申请WO 92/07573）。能够转导并表达插入细胞基因组的基因的重组逆转录病毒载体可以通过将重组逆转录病毒基因组转染至合适的包装细胞系诸如PA317和Psi-CRIP（Cornette等人, 1991,Human Gene Therapy 2:5-10; Cone等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）进行生产。重组腺病毒载体可用于感染易感宿主(例如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu等人, 1992, J. Infectious Disease, 166:769)，并且其还具有不需要有丝分裂活性细胞用于感染的优点。

可以使用任何能够接受待表达的转录物的编码序列的病毒载体，例如，衍生自腺病毒（AV）；腺相关病毒（AAV）；逆转录病毒（例如慢病毒（LV）、弹状病毒、鼠白血病病毒）；疱疹病毒等的载体。合适地，可以通过使用来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原对载体进行假型包装或通过置换不同的病毒衣壳蛋白来修饰病毒载体的趋性。

例如，本发明特征中的慢病毒载体可以使用来自水疱性口炎病毒 (VSV)、狂犬病、埃博拉、莫科拉等的表面蛋白进行假型包装。可以通过将载体工程改造以表达不同衣壳蛋白血清型来制备本发明特征的AAV载体以靶向不同细胞。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域的技术中；参见例如Rabinowitz J E 等人 (2002), J Virol 76:791-801，其整体公开内容通过引用并入本文。

适合用于本发明中的重组病毒载体的选择、将用于表达转录物的核酸序列插入所述载体的方法和将病毒载体递送至目标细胞的方法在本领域的技术中。参见，例如Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques6: 608-614; Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998),Nature 392: 25-30; 和 Rubinson DA 等人, Nat. Genet. 33: 401-406, 其整体公开内容通过引用并入本文。

病毒载体可以衍生自AV和AVV。用于表达本发明特征的转录物的合适的AV载体，用于构建重组AV载体的方法和用于递送所述载体至靶细胞的方法，描述于Xia H 等人(2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010中。用于表达本发明特征的转录物的合适的AAV载体，用于构建重组AV载体的方法和用于递送所述载体至靶细胞的方法，描述于Samulski R等人(1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher KJ 等人. (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski R等人(1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 美国专利号5,252,479;美国专利号5,139,941;国际专利申请号WO 94/13788;和国际专利申请号WO 93/24641中，其整体公开内容通过引用并入本文。

驱动本发明特征的DNA质粒或病毒载体中的转录物表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I（例如，核糖体RNA启动子）、RNA聚合酶II（例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或U1 snRNA启动子）或通常地RNA聚合酶III启动子（例如U6 snRNA或7SK RNA启动子）或原核启动子，例如T7启动子，条件是表达质粒还编码从T7启动子转录所需的T7 RNA聚合酶。启动子还可以涉及将转基因表达引导至胰腺（参见，例如用于胰腺的胰岛素调节序列（Bucchini等人, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515））。

另外，转录物的表达可以例如通过，使用可诱导调节序列和表达系统（诸如对某些生理调节剂例如循环葡萄糖水平或激素敏感的调节序列）精确调节（Docherty 等人,1994, FASEB J. 8:20-24）。适合用于控制细胞或哺乳动物中的转基因表达的此类诱导型表达系统包括，通过蜕化素、雌性激素、黄体酮、四环素、二聚化的化学诱导剂和异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于dsRNA转基因的预期用途选择合适的调节/启动子序列。

通常，能够表达转录物分子的重组载体如下文所述递送，并保留在靶细胞中。可选地，可以使用提供转录物分子的瞬时表达的病毒载体。此类载体可以根据需要重复施用。一旦表达，转录物结合至靶RNA并且调节其功能或表达。转录物表达载体的递送可以是全身的，诸如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者外植的靶细胞随后再导入至患者中，或通过允许导入期望的靶细胞的任何其它手段。

通常将转录物表达DNA质粒作为与阳离子脂质载体（例如Oligofectamine）或基于非阳离子脂质的载体（例如Transit-TKO™）的复合物转染至靶细胞中。本发明还考虑了用于dsRNA介导的敲低的多种脂质转染，其在一周或更久的时间段中靶向单一PROC基因或多个PROC基因的不同区域。可以使用各种已知方法监测载体至宿主细胞的成功导入。例如，可以使用报道分子诸如荧光标记物诸如绿色荧光蛋白（GFP）信号传导瞬时转染。细胞的离体稳定转染可以使用标记物来确定，所述标记物为转染细胞提供对特定环境因子（例如，抗生素和药物）的抗性，诸如潮霉素B抗性。

含有重组DNA的载体的递送可以通过非生物学或生物学系统执行。包括但不限于脂质体、病毒样粒子、衍生自噬菌体或病毒的转导粒子，和缀合。

转录物测定的报道分子

在一些实施方案中，核酸构建体包含报道分子序列（例如报道基因序列）。报道基因编码报道分子，当在细胞中表达时，所述报道分子产生信号。在一些实施方案中，报道分子可以是可检测或可选择标记物。在某些实施方案中，报道分子可以是荧光报道分子，诸如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或红色荧光蛋白（RFP）。在其它实施方案中，报道分子可以是化学发光蛋白。

报道分子可以是细菌萤光素酶、真核萤光素酶、荧光蛋白、适合用于比色检测的酶、适合用于免疫检测的蛋白质、适合用于免疫检测的肽或作为适配体或展示出酶活性的核酸。

还可以使用可选择标记物作为报道分子。可选择标记物可以是例如抗生素抗性基因。

实施例

下文为用于实施本发明的具体实施方案的实施例。所述实施例是仅为说明性目的提供的，并且不意在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于使用数目（例如，量、温度等）的精确，但是当然应当允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术中蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此类技术将在文献中充分解释。参见，例如，T.E.Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman andCompany, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 目前版本); Sambrook, 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989);Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版 (Easton, Pennsylvania: MackPublishing Company, 1990); Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry 第3版(Plenum Press) 卷 A 和 B(1992)。

实施例1：基于等位基因交换的破坏/补充包装系统

以下是用于生产非复制型转导粒子的基于等位基因交换的基于破坏/补充的包装系统的设计和构建的实施例。

用于开发包装系统的材料列于以下：

细菌菌株：

• N1706，大肠杆菌K-12 P1 cl-100 Tn9溶原体

载体：

• Y14439 (pBHR1骨架)

对于载体骨架和盒序列，可以使用以下GenBank登录号（注意，由登录号参考的序列是到本申请的优先权日为止的数据库中所列的那些）或SEQ ID NO；

• X06758 (细菌萤光素酶基因luxAB)

•SEQ ID NO: 1 (天然P1 pacA和pacB基因，包括天然pacA基因启动子)

•SEQ ID NO:2 (P1裂解复制子，其含有C1阻遏物控制的P53启动子, P53启动子反义链，repL基因和kilA基因的框架内缺失)

• SEQ ID NO: 11 (Pblast启动子，其驱动luxAB表达)。

构建N1706(pacA::Kan): pacA突变的菌株，亦称菌株1505：pacA突变序列的示例性序列在SEQ ID NO: 10中示出。突变可以通过构建等位基因交换底物实现，所述等位基因交换底物由被pacA基因序列（其自身侧接了期望被置换的pacA基因的序列）侧接的卡那霉素抗性基因构成。可以经由基因合成产生等位基因交换底物，并且随后置换N1706中的天然序列并且经由等位基因交换插入Kan基因。确定了所述破坏还破坏了突变P1噬菌体包装DNA的能力。突变噬菌体的导入导致子代噬菌体的消除，如通过经由通过诱导天然噬菌体相比突变噬菌体产生的细菌裂解物的噬菌斑测定比较P1噬菌体滴度确定的。此外，当表达pacA基因的补充质粒被导入P1突变溶原体并且所述突变噬菌体被转化子诱导时，没有在裂解物中回收到转导粒子，这表明尽管补充了pacA基因和pac-位点，噬菌体不能包装补充质粒。

构建补充质粒：补充质粒含有展示广谱革兰氏阴性活性的pBHR1复制起点；壮观霉素的可选择标记物；天然噬菌体P1 pacA和pacB基因，其可操作地连接至天然pacA基因启动子序列；来自Aliivibrio fischeri的luxA和luxB基因，其可操作地连接至组成型blasticillin启动子（Pblast）和P1裂解复制子，其含有C1阻遏物控制的P53启动子，P53启动子反义链，repL基因和kilA基因的框架内缺失。

可以以本领域技术人员已知的各种方式构建质粒，所述方式包括经由PCR从它们的天然来源或经由基因合成获得盒，并经由传统的基于限制酶的克隆或替代技术诸如吉布森组装进行载体的组装。

基于补充的包装系统：包装系统包括使用补充质粒补充的pacA突变株1505。如本领域技术人员已知的，构建该系统的方式可以通过使用补充质粒转化1505来实现。可以通过在10 ug/mL壮观霉素存在下生长转化子来将补充质粒维持在转化的1505的培养物中。

携带质粒DNA的转导粒子的产生：可以经由在42℃热诱导从1505转化子产生携带补充质粒的非复制型转导粒子。在42℃温育导致P1裂解周期的诱导，其中所述原噬菌体产生噬菌体结构元件，并且包装通过子代噬菌体粒子中的裂解复制子形成的补充质粒多联体DNA。不同于当pacA和pacB基因两者在噬菌体基因组中被破坏时，使用仅表达pacA基因的补充质粒进行补充不会导致转导粒子的产生，表达pacA和pacB基因两者的补充质粒导致含有非复制型转导粒子的细胞裂解物，所述非复制型转导粒子各自由携带补充质粒的线性多联体的噬菌体P1组成，并且因此证实该补充质粒成功补充了包装的破坏。

实施例2：改善的基于等位基因交换的破坏/补充包装系统

在使用包含末端酶基因pacA和pacB的肠杆菌科噬菌体P1的实施例中，pacA以同样破坏pacB表达和/或由pacA和pacB介导的总体末端酶功能的导致极性效应的方式被破坏。将kan和luxAB插入pacA基因座的最终构建体包括在SEQ ID NO:12中。

随后使用在图2中描述的质粒补充pacAB被破坏的噬菌体基因组。图4说明了由使用具有破坏的pacA基因的噬菌体P1溶原化的大肠杆菌细胞构成的包装系统的设计和功能。细胞也可以包含含有pacA和pacB基因的质粒。在该实施例中，质粒中的pacA和pacB基因衍生自肠杆菌科噬菌体P1。当突变病毒在裂解周期中时，病毒包装蛋白产生自补充质粒，由于其包装起始位点，其将质粒DNA的复制子包装至包装单元中，并且产生携带复制质粒DNA的非复制型转导粒子。

在这些缺失补充系统中，产生两种类型的转导粒子，其包括（1）携带质粒DNA的非复制型转导粒子和（2）携带P1 DNA的非复制型转导粒子，其中后者可以由于质粒DNA和P1DNA之间的重组而产生。当P1突变体不含有插入pacA基因的luxAB时，当这些转导粒子递送DNA至靶细胞时，所述携带P1 DNA的非复制型转导粒子无助于信号产生。但是，当P1突变体含有插入pacA基因的luxAB时，当这些转导粒子递送DNA至靶细胞时，所述携带P1 DNA的非复制型转导粒子的确有助于信号产生。

因此，当我们将luxAB基因插入P1基因组并与本文所述的系统NRTP生成系统整合时，我们已提供了改善的非复制型转导粒子报道系统。

以下提供了用于生产该实施例中描述的非复制型转导粒子的基于等位基因交换的破坏/补充包装系统的设计和构建的进一步详述。

用于开发包装系统的材料列于以下：

细菌菌株：

• Nl706,大肠杆菌K-12 P1 cl-100 Tn9溶原体

载体：

• Y14439 (pBHRl骨架)。

对于载体骨架和盒序列，可以使用以下GenBank登录号（注意，由登录号参考的序列是到本申请的优先权日为止的数据库中所列的那些）或SEQ ID NO。

• X06758 (细菌萤光素酶基因luxAB)

•SEQ ID NO: 1 (天然P1 pacA和pacB基因，其包括天然pacA基因启动子)

•SEQ ID NO:2 (P1裂解复制子，其含有C1阻遏物控制的P53启动子, P53启动子反义链，repL基因和kilA基因的框架内缺失)

• SEQ ID NO: 11 (Pblast启动子，其驱动luxAB表达)。

构建N1706(pacA::Kan luxAB): pacA突变的菌株，亦称菌株1525: 如以下执行：

突变pacA序列的示例性序列在SEQ ID NO: 12中示出。如SEQ ID NO:12中提供的pacA突变序列提供构建等位基因交换底物生成，所述等位基因交换底物由在Pblast启动子控制下且侧接pacA基因序列（其自身侧接pacA基因的序列）的卡那霉素抗性基因（Kan）和luxAB基因构成。经由基因合成产生等位基因交换底物。随后，经由等位基因交换，经由Kan和luxAB基因的插入置换N1706中的天然pacA序列。确定了所述破坏还破坏了突变P1噬菌体包装DNA的能力。突变噬菌体的诱导导致子代噬菌体的消除，如通过经由通过诱导天然噬菌体相比突变噬菌体产生的细菌裂解物的噬菌斑测定比较P1噬菌体滴度确定的。

构建补充质粒：补充质粒含有展示广谱革兰氏阴性活性的pBHR1复制起点；壮观霉素的可选择标记物；天然噬菌体P1 pacA和pacB基因，其可操作地连接至天然pacA基因启动子序列；来自Aliivibrio fischeri的luxA和luxB基因，其可操作地连接至组成型blasticillin启动子（Pblast），P1裂解复制子，其含有C1阻遏物控制的P53启动子，P53启动子反义链，repL基因和kilA基因的框架内缺失。

可以以本领域技术人员已知的各种方式构建质粒，所述方式包括经由PCR从它们的天然来源或经由基因合成获得盒，并经由传统的基于限制酶的克隆或替代技术诸如吉布森组装进行载体的组装。

基于补充的包装系统：包装系统包括使用补充质粒补充的pacA突变株1525。如本领域技术人员已知的，构建该系统的方式可以通过使用补充质粒转化菌株1525来实现。可以通过在10 ug/mL壮观霉素存在下生长转化子来将补充质粒维持在转化的1525的培养物中。

携带质粒DNA的转导粒子的产生：可以经由在42℃热诱导从1525转化子产生携带补充质粒的非复制型转导粒子。在42℃温育导致P1裂解周期的诱导，其中所述原噬菌体产生噬菌体结构元件，并且包装通过子代噬菌体粒子中的裂解复制子形成的补充质粒多联体DNA。表达pacA和pacB基因两者的补充质粒导致含有非复制型转导粒子的细胞裂解物，所述非复制型转导粒子各自由携带补充质粒的线性多联体的噬菌体P1粒子组成，并且因此证明该补充质粒成功补充了包装的破坏。

除了携带质粒DNA的转导粒子，系统产生了携带P1 DNA的转导粒子。携带P1 DNA的转导粒子可以经由质粒DNA和P1 DNA之间的重组出现。携带P1 DNA的转导粒子的存在通过将靶细胞暴露于来自该系统的裂解物并且筛选在并入卡那霉素的选择培养基上繁殖的转导细胞的存在进行评估，而携带质粒DNA的转导序列以相似方式基于壮观霉素抗性进行评估。图10显示了通过测量来自转导细胞的菌落的光产生（RLU）获得的数据的表格。使用质粒DNA转导对壮观霉素基因抗性（SpecR）的细胞，而通过P1 DNA转导对卡那霉素具有抗性（KanR）的细胞。来自1505的数据从不具有插入P1基因组的luxAB的包装系获得，而来自1525的数据从具有插入P1基因组的luxAB的包装系获得。如可以从数据观察到的，所有SpecR转导物产生光，而所有KanR转导物中只有来自1525的那些产生光。

因此，1525代表了改善的基于非复制型转导粒子的报道系统，其中携带质粒DNA和病毒DNA两者的转导粒子能够产生光。

非正式序列表

>SEQ ID NO: 1 pacA和pacB (粗体：启动子, 加下划线的：pacA, 无格式的：pacB)

>SEQ ID NO:2 P1裂解复制子，其含有C1阻遏物控制的P53启动子、P53启动子反义链、repL基因和kilA基因的框架内缺失

> SEQ ID NO:3 pBHRl rep (粗体：ORF)

>SEQ ID NO:4

80αterS和terL 基因(粗体：terS ORF, 加下划线：terL ORF)

>SEQ ID NO:5 pT181

> SEQ ID NO:6 Ef11 terA和terB (粗体：terA ORF，加下划线：terB ORF)

> SEQ ID NO:7 repB

> SEQ ID NO:8 pDL278

>SEQ ID NO:9 乳酸链球菌素启动子

>SEQ ID NO:10 pac-位点和pacA基因经kanR破坏(无格式的：pacA基因序列，加下划线的：包括在等位基因交换底物中的pacA基因序列, 粗体：Kan基因启动子, 斜体：Kan基因)

> SEQ ID NO：11 Pblast启动子

>SEQ ID NO：12 具有插入的kan基因和luxAB基因的P1 pacA基因座(小写字母为天然序列，大写字母为插入序列)

序列表

<110> GENEWEAVE BIOSCIENCES, INC.

<120> 非复制型转导粒子和基于转导粒子的报道系统

<130> 28421-29681/PCT

<140>

<141>

<150> 62/202,653

<151> 2015-08-07

<150> 62/041,539

<151> 2014-08-25

<160> 12

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 2733

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 未知的描述: 肠杆菌科噬菌体P1序列

<400> 1

atgtgacttt cgttaccctc gcgtcaaaaa gagtttttac gaaaggaagc ataagtgacc 60

tgggacgatc acaagaagaa ttttgctcgc ctggcgcgag atggtggtta caccatcgca 120

cagtatgccg ccgagtttaa tcttaaccct aataccgcac gtcgttatct ccgtgccttc 180

aaagaagaca ccaggactac ggacagccgc aagccaaata agccagtcag gaagccacta 240

aaaagcatga tcattgatca ctctaatgat caacatgcag gtgatcacat tgcggctgaa 300

atagcggaaa aacaaagagt taatgccgtt gtcagtgccg cagtcgagaa tgcgaagcgc 360

caaaataagc gcataaatga tcgttcagat gatcatgacg tgatcacccg cgcccaccgg 420

accttacgtg atcgcctgga acgcgacacc ctggatgatg atggtgaacg ctttgaattc 480

gaagttggcg attacctgat agataacgtt gaagcgcgga aggccgcgcg cgctatgttg 540

cgtcggtccg gggccgatgt tctggaaacc actcttctgg aaaagtctct ttctcatctc 600

cttatgctgg agaacgccag ggatacgtgt attcgcctgg tgcaggaaat gcgcgatcag 660

caaaaagacg atgatgaagg tactccgcct gaataccgta tcgcgagcat gctaaacagc 720

tgttccgcgc agataagcag cctgatcaac accatttaca gcatccggaa taactatcga 780

aaagaaagcc gggaggcgga aaagcacgct ttatctatgg ggcaagctgg cattgttaag 840

ctggcatacg aacgaaagcg tgaaaataac tggtcagtgc tggaagcggc tgaattcatc 900

gaggcgcatg gaggaaaagt gccgcccctg atgctggagc aaatcaaagc cgatctgcgt 960

gctcctaaga ccaataccga tgatgaggaa aaccaaacag catctggcgc tccatcactt 1020

gaagatctgg ataaaatcgc gcgagaacgg gccgccagcc gccgcgctga tgccgcattg 1080

tggattgagc atcgtagaga agaaattgcc gatatcgtcg atacaggtgg ttatggtgat 1140

gtcgatgcgg aaggcatatc aaacgaagca tggcttgaac aggatctgga cgaagacgag 1200

gaggaagacg aagaagttac ccgcaaactg tacggggatg atgattaaat ggccagaagt 1260

tgcgtaacgg acccacgttg gcgcgagctt gtggcgctat atcgttatga ctggattgcg 1320

gccgctgatg tgttgtttgg gaagacacca acctggcagc aggatgagat cattgagtcc 1380

acgcagcagg acggcagttg gacaagtgtg acctccggcc atggtactgg taaatcggat 1440

atgacgagta tcattgcaat actcttcatc atgtttttcc ccggcgctcg cgtcattctg 1500

gtcgctaaca aaagacagca agtccttgat ggtattttca aatacataaa gagcaattgg 1560

gctactgctg ttagcagatt cccgtggttg tcgaagtatt tcattcttac agaaacgtct 1620

ttttttgagg tgactggcaa gggtgtttgg acaatattga taaagtcctg tcgtcccgga 1680

aatgaggagg cgttggctgg tgaacacgcc gatcatctct tgtatatcat cgacgaagcg 1740

tcgggtgtga gtgataaagc attcagtgtg ataacaggtg cgctgaccgg taaggataac 1800

cgtattctgc ttctttccca gcctacgcga ccttcaggct atttctacga ttcacaccac 1860

agactagcta ttcgcccggg aaatcctgat ggattgttta ctgcgataat actgaatagt 1920

gaagaatctc cgcttgtaga tgcaaaattt atacgagcaa aacttgcgga gtatggcggt 1980

cgtgataacc ccatgtacat gatcaaagta cgtggtgaat ttcccaaatc tcaagatggc 2040

tttcttcttg gtcgtgatga ggttgagcgg gcgacgcggc gaaaggtcaa gattgccaaa 2100

ggatggggct gggttgcatg tgttgacgtt gctggtggca caggacgaga taagtccgtt 2160

attaatatca tgatggtgtc cggccagcga aataaacgcc gtgtaatcaa ctatcgtatg 2220

ctggaataca cagacgttac agaaacgcag ttagccgcca agattttcgc agaatgtaac 2280

ccagaacggt tcccgaacat aaccatagct attgatggcg atggcttggg gaaatcgacg 2340

gctgatctaa tgtacgaacg ctatggcatt accgtccagc gtatccgctg gggtaaaaag 2400

atgcacagcc gtgaagataa aagcctttat ttcgatatgc gcgctttcgc gaatattcag 2460

gcggcagaag ctgtaaaatc agggcgtatg aggcttgata agggggctgc gactatagag 2520

gaagcatcaa agataccggt agggataaat tccgcaggtc aatggaaggt gatgtcaaag 2580

gaagatatga agaaaaaact caacctgcac tcaccggacc attgggatac atattgtttc 2640

gctatgttgg cgaactatgt tccccaagat gaagtgctta gcgtcgaaga cgaagcgcag 2700

gttgatgaag ctctggcatg gcttaatgaa taa 2733

<210> 2

<211> 1727

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 2

cactataggg cgaattggcg gaaggccgtc aaggccgcat ttgggcccgg cgcgccggat 60

ccgctagctc tagactggca ggtttctgag cagatcgtcc aacccgatct ggatcgggtc 120

agaaaaattt gctctaataa atttcgtttt ctaagtgcaa agaatcacca tttcgagctg 180

gtgattgaag gttgatgcaa atttggagaa aaaatgcaac aaacattcaa tgcggatatg 240

aatatatcaa accttcatca aaatgtcgat ccttcaacca ctctgcccgt tatttgtggt 300

gttgaaatta cgaccgaccg cgctggccgt tacaacctta atgctctaca cagagcgagc 360

ggactcggtg cccataaagc gccagctcaa tggctaagaa cgctgtcagc taaacagctc 420

atcgaagagc ttgaaaaaga aactatgcag aattgcatag tttcgttcac aagcaatgga 480

agcaggattt ctttcacgac tcgtataacc ggcaaaggtc agcagtggct gatgaagcga 540

ttgcttgatg ctggtgtgct ggtacctgtc gcggcaacgc gctaacagac gtagtaagaa 600

ccaccagcat tgtaatgctg gctaaagtca ctttcctgag ctgtataacg atgagcgatt 660

ttactttttc tggctatgaa ttggcctgct ttgtaacaca ctccggtcta tcccgtagcg 720

ccgggcatat cctgtcgcaa tgtgcaaatc tcgcggcaac aaccagtgaa tacttcattc 780

acaagcctca ccgcctgatc gcggcagaaa ctggttatag ccaatcaacc gtcgttcgtg 840

cattccgtga agctgtaaac aaaggaattc tgtctgtaga gattgttatc ggcgatcacc 900

gtgaacgtcg cgctaacctg taccggttta caccatcctt tttggccttc gcacaacaag 960

ccaaaaatgc gctgatagaa agcaaattaa agatctcttc agcggcaacc aaggttaaag 1020

ctgttctcgc taagacattg gctttattta attttttatc cacaccccca tgtcaaaatg 1080

ataccccctc cccctgtcag gatgacgtgg caataaagaa taagaagtca caagttaaaa 1140

aaacaaaaag atcagtttcc ggcggtgccg gaacaaccag cctcaaaaaa ttgacttcat 1200

ggatcgctaa ggcaaaagca aaggctgaca atctgcggtt atccaaaaaa cgcactcaaa 1260

aacatgagtt caagcagaaa gtagaggcgg ctgcgcggaa atatgcttac ctgaagaaca 1320

agcgttcgcc tgatattggc gggatatcaa acttcgataa cctaccgcat tgcatgacgg 1380

taaacgaagc tcttaatgcg gttttagcca aaaataaaga taacgaacaa tggggtatac 1440

cggcaggatt cagagggtaa tgaattgctc taattataac catgcatact ttcaacacct 1500

ctagtttgcc atgaggcaaa ctcataggtg tcctggtaag aggacactgt tgccaaaact 1560

ggacgcccca ttattgcaat taataaacaa ctaacggaca attctaccta acaataagtg 1620

gcttaaaaaa acccgccccg gcgggttttt ttatctagag ctagcggatc cggcgcgccg 1680

ggcccttctg ggcctcatgg gccttccgct cactgcccgc tttccag 1727

<210> 3

<211> 773

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 3

ttgactgcca cttttacgca acgcataatt gttgtcgcgc tgccgaaaag ttgcagctga 60

ttgcgcatgg tgccgcaacc gtgcggcacc cctaccgcat ggagataagc atggccacgc 120

agtccagaga aatcggcatt caagccaaga acaagcccgg tcactgggtg caaacggaac 180

gcaaagcgca tgaggcgtgg gccgggctta ttgcgaggaa acccacggcg gcaatgctgc 240

tgcatcacct cgtggcgcag atgggccacc agaacgccgt ggtggtcagc cagaagacac 300

tttccaagct catcggacgt tctttgcgga cggtccaata cgcagtcaag gacttggtgg 360

ccgagcgctg gatctccgtc gtgaagctca acggccccgg caccgtgtcg gcctacgtgg 420

tcaatgaccg cgtggcgtgg ggccagcccc gcgaccagtt gcgcctgtcg gtgttcagtg 480

ccgccgtggt ggttgatcac gacgaccagg acgaatcgct gttggggcat ggcgacctgc 540

gccgcatccc gaccctgtat ccgggcgagc agcaactacc gaccggcccc ggcgaggagc 600

cgcccagcca gcccggcatt ccgggcatgg aaccagacct gccagccttg accgaaacgg 660

aggaatggga acggcgcggg cagcagcgcc tgccgatgcc cgatgagccg tgttttctgg 720

acgatggcga gccgttggag ccgccgacac gggtcacgct gccgcgccgg tag 773

<210> 4

<211> 1785

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述: 肠杆菌科噬菌体P1序列

<400> 4

ttttaaaaag cgtatagcgc gagagttggt ggtaaatgaa atgaacgaaa aacaaaagag 60

attcgcagat gaatatataa tgaatggatg taatggtaaa aaagcagcaa tttcagcagg 120

ttatagtaag aaaacagcag agtctttagc aagtcgattg ttaagaaatg ttaatgtttc 180

ggaatatatt aaagaacgat tagaacagat acaagaagag cgtttaatga gcattacaga 240

agctttagcg ttatctgctt ctattgctag aggagaacct caagaggctt acagtaagaa 300

atatgaccat ttaaacgatg aagtggaaaa agaggttact tacacaatca caccaacttt 360

tgaagagcgt cagagatcta ttgaccacat actaaaagtt catggtgcgt atatcgacaa 420

aaaagaaatt actcagaaga atattgagat taatattggt gagtacgatg acgaaagtta 480

aattaaactt taacaaacca tctaatgttt tcaacagaaa catattcgaa atactaacca 540

attacgataa cttcactgaa gtacattacg gtggaggttc gagtggtaag tctcacggcg 600

ttatacaaaa agttgtactt aaagcattgc aagactggaa atatcctagg cgtatactat 660

ggcttagaaa agtccaatca acaattaaag atagtttatt cgaagatgtc aaagattgtt 720

tgataaactt cggtatttgg gacatgtgcc tttggaataa gactgataac aaagttgaat 780

tgccaaacgg cgcagttttt ttgtttaaag gattagataa cccagagaaa ataaagtcga 840

taaaaggcat atcagacata gtcatggaag aagcgtctga attcacacta aatgattaca 900

cgcaattaac gttgcgtttg agggagcgta aacacgtgaa taagcaaata tttttgatgt 960

ttaacccagt atctaaactg aattgggttt ataagtattt ctttgaacat ggtgaaccaa 1020

tggaaaatgt catgattaga caatctagtt atcgagataa taagtttctt gatgaaatga 1080

cacgacaaaa cttagagttg ttagcaaatc gtaatccagc atattacaaa atttatgcgt 1140

taggtgaatt ttctacacta gacaaattgg ttttccctaa gtatgaaaaa cgtttaataa 1200

ataaagatga gttaagacat ttaccttctt attttggatt ggactttggc tacgttaatg 1260

atcctagtgc ttttatacat tctaaaatag atgtaaagaa aaagaagtta tacatcattg 1320

aagagtatgt taaacaaggt atgctgaatg atgaaatagc taatgtcata aagcaacttg 1380

gttatgctaa agaagaaatt acagcagata gtgcagaaca aaaaagtata gctgaattaa 1440

ggaatctagg gcttaaaagg attttaccaa ccaaaaaagg gaagggctcg gttgtacaag 1500

ggttacaatt cttaatgcaa tttgaaatca ttgttgatga acgttgtttc aagactattg 1560

aagagtttga caactacaca tggcaaaagg acaaagatac aggtgaatat accaatgaac 1620

cagtagatac atacaatcat tgtatcgatt cgttgcgtta ttcagtggaa cgattctaca 1680

gaccggttag aaaacgcaca aatgtcagtt cgaaagttga cacaataaaa tctctaggat 1740

tataggaggg aacaaatgtt aaaagtaaac gaatttgaaa cagat 1785

<210> 5

<211> 4681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (301)..(301)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (4056)..(4056)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 5

tttgcggaaa gagttagtaa gttaacagaa gacgagccaa acctaaatgg tttagcagga 60

aacttagata aaaaaatgaa tccagaatta tattcagaac aggaacagca acaagagcaa 120

caaaagaatc aaaaacgaga tagaggtatg cacttataga acatgcattt atgccgagaa 180

aacttattgg ttggaatggg ctatgtgtta gctaacttgt tagcgagttg gttggacttg 240

aattgggatt aatcccaaga aagtaccggc tcaacaaccc ataaagccct gtaggttccg 300

nccaataagg aaattggaat aaagcaataa aaggagttga agaaatgaaa ttcagagaag 360

cctttgagaa ttttataaca agtaagtatg tacttggtgt tttagtagtc ttaactgttt 420

accagataat acaaatgctt aaataaaaaa agacttgatc tgattagacc aaatcttttg 480

atagtgttat attaataaca aaataaaaag gagtcgctca cgccctacca aagtttgtga 540

acgacatcat tcaaagaaaa aaacactgag ttgtttttat aatcttgtat atttagatat 600

taaacgatat ttaaatatac atcaagatat atatttgggt gagcgattac ttaaacgaaa 660

ttgagattaa ggagtcgatt ttttatgtat aaaaacaatc atgcaaatca ttcaaatcat 720

ttggaaaatc acgatttaga caatttttct aaaaccggct actctaatag ccggttggac 780

gcacatactg tgtgcatatc tgatccaaaa ttaagttttg atgcaatgac gatcgttgga 840

aatctcaacc gagacaacgc tcaggccctt tctaaattta tgagtgtaga gccccaaata 900

agactttggg atattcttca aacaaagttt aaagctaaag cacttcaaga aaaagtttat 960

attgaatatg acaaagtgaa agcagatagt tgggatagac gtaatatgcg tattgaattt 1020

aatccaaaca aacttacacg agatgaaatg atttggttaa aacaaaatat aataagctac 1080

atggaagatg acggttttac aagattagat ttagcctttg attttgaaga tgatttgagt 1140

gactactatg caatgtctga taaagcagtt aagaaaacta ttttttatgg tcgtaatggt 1200

aagccagaaa caaaatattt tggcgtgaga gatagtaata gatttattag aatttataat 1260

aaaaagcaag aacgtaaaga taatgcagat gctgaagtta tgtctgaaca tttatggcgt 1320

gtagaaatcg aacttaaaag agatatggtg gattactgga atgattgctt tagtgattta 1380

catatcttgc aaccagattg gaaaactatc caacgcactg cggatagagc aatagttttt 1440

atgttattga gtgatgaaga agaatgggga aagcttcaca gaaattctag aacaaaatat 1500

aagaatttga taaaagaaat ttcgccagtc gatttaacgg acttaatgaa atcgacttta 1560

aaagcgaacg aaaaacaatt gcaaaaacaa atcgattttt ggcaacatga atttaaattt 1620

tggaaatagt gtacatatta atattactga acaaaaatga tatatttaaa ctattctaat 1680

ttaggaggat ttttttatga agtgtctatt taaaaatttg gggaatttat atgaggtgaa 1740

agaataattt acccctataa actttagcca cctcaagtaa agaggtaaaa ttgtttagtt 1800

tatataaaaa atttaaaggt ttgttttata gcgttttatt ttggctttgt attctttcat 1860

tttttagtgt attaaatgaa atggttttaa atgtttcttt acctgatatt gcaaatcatt 1920

ttaatactac tcctggaatt acaaactggg taaacactgc atatatgtta actttttcga 1980

taggaacagc agtatatgga aaattatctg attatataaa tataaaaaaa ttgttaatta 2040

ttggtattag tttgagctgt cttggttcat tgattgcttt tattgggccc acctaggcaa 2100

atatgctctt acgtgctatt atttaagtga ctatttaaaa ggagttaata aatatgcggc 2160

aaggtattct taaataaact gtcaatttga tagcgggaac aaataattag atgtcctttt 2220

ttaggagggc ttagtttttt gtacccagtt taagaatacc tttatcatgt gattctaaag 2280

tatccagaga atatctgtat gctttgtata cctatggtta tgcataaaaa tcccagtgat 2340

aaaagtattt atcactggga tttttatgcc cttttgggtt tttgaatgga ggaaaatcac 2400

atgaaaatta ttaatattgg agttttagct catgttgatg caggaaaaac taccttaaca 2460

gaaagcttat tatataacag tggagcgatt acagaattag gaagcgtgga caaaggtaca 2520

acgaggacgg ataatacgct tttagaacgt cagagaggaa ttacaattca gacaggaata 2580

acctcttttc agtgggaaaa tacgaaggtg aacatcatag acacgccagg acatatggat 2640

ttcttagcag aagtatatcg ttcattatca gttttagatg gggcaattct actgatttct 2700

gcaaaagatg gcgtacaagc acaaactcgt atattatttc atgcacttag gaaaatgggg 2760

attcccacaa tcttttttat caataagatt gaccaaaatg gaattgattt atcaacggtt 2820

tatcaggata ttaaagagaa actttctgcc gaaattgtaa tcaaacagaa ggtagaactg 2880

tatcctaata tgtgtgtgac gaactttacc gaatctgaac aatgggatac ggtaatagag 2940

ggaaacgata accttttaga gaaatatatg tccggtaaat cattagaagc attggaactc 3000

gaacaagagg aaagcataag atttcagaat tgttctctgt tccctcttta tcatggaagt 3060

gcaaaaagta atatagggat tgataacctt atagaagtta ttactaataa attttattca 3120

tcaacacatc gaggtccgtc tgaactttgc ggaaatgttt tcaaaattga atatacaaaa 3180

aaaagacaac gtcttgcata tatacgcctt tatagtggag tactacattt acgagattcg 3240

gttagagtat cagaaaaaga aaaaataaaa gttacagaaa tgtatacttc aataaatggt 3300

gaattatgta agattgatag agcttattct ggagaaattg ttattttgca aaatgagttt 3360

ttgaagttaa atagtgttct tggagataca aaactattgc cacagagaaa aaagattgaa 3420

aatccgcacc ctctactaca aacaactgtt gaaccgagta aacctgaaca gagagaaatg 3480

ttgcttgatg cccttttgga aatctcagat agtgatccgc ttctacgata ttacgtggat 3540

tctacgacac atgaaattat actttctttc ttagggaaag tacaaatgga agtgattagt 3600

gcactgttgc aagaaaagta tcatgtggag atagaactaa aagagcctac agtcatttat 3660

atggagagac cgttaaaaaa tgcagaatat accattcaca tcgaagtgcc gccaaatcct 3720

ttctgggctt ccattggttt atctgtatca ccgcttccgt tgggaagtgg aatgcagtat 3780

gagagctcgg tttctcttgg atacttaaat caatcatttc aaaatgcagt tatggaaggg 3840

gtacgctatg gttgcgaaca aggattatat ggttggaatg tgacggattg taaaatctgt 3900

tttaagtacg gtttatacta tagccctgtt agtactccag cagattttcg gatgcttact 3960

cctattgtac tggagcaagc ctttagaaaa gctggaacag aattgttaga gccatatctt 4020

agttttaaag tttatgcacc acaggaatat ctttcncggg catataacga tgctcccaaa 4080

tattgtgcaa atatcgtaaa tactcaactg aaaaataatg aggtcattat tattggagaa 4140

attcctgctc gatgtattca agattatcgc aatgatttaa ctttttttac aaatgggctt 4200

agtgtttgtt tagcagagct aaaaggatat caggttacca ctggcgaacc tgtttgccag 4260

acccgtcgtc taaatagtcg gatagataaa gtaagatata tgttcaataa aataacttag 4320

tgcgttttat gttgttatat aaatatggtt tcttattaaa taagatgaaa tattctttaa 4380

tatagatttg aattaaagtg gaaaggagga gattgttatt ataaactaca agtggatatt 4440

gtgtcctatt tgtggaaata aaacaagact acgaatacga gtggatacta tacttaaaaa 4500

tttcccttta tacagcccca aatgtaagaa cgaaacttta attaatgttc aaaaaatgaa 4560

tataataaca atcaaagagc cagacgccaa gacgcagagc cgataatttg agaaatgaaa 4620

ctctcatctt atcggctctt tttgtttatc tgaattttac tgactagcct tcaatatttc 4680

c 4681

<210> 6

<211> 2321

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述: 肠杆菌科噬菌体P1序列

<400> 6

ctcaattcaa caagtattgt gaggtggtgt tatatgtcag atggataaaa aggaacaagc 60

aaagaaatat tatgaaaaag gttggaaata caaggatatt tccgaaaagc tttctgtacc 120

tctcaacaca ttgaagtcat ggagaaaacg tgataaatgg gaaagagggg gtgcaaccaa 180

agaggtgcaa cctacaaata ggggtgcacc taaaggtaat caaaatgcta taggcaataa 240

aggtaatagt cgagcctcgc caccaaaaag aaataagaat gctgttaaaa ctggcgaata 300

cgaaacaata tttgccgata tgttatctga cgaagaaaag gacatctatt ctactatgaa 360

tgatgatcct ttttttattt tggatgaaga aataagaatc ctgaaaattc gccaatatag 420

aatgcttaaa cgcataaaag atgcagaggc tggcttaaat gatgaagaag ttgaacgttt 480

gcagcagctt cgcaaagtta aagagccatc ggtaattgat gggaaaatgg ttactgttaa 540

gagagaagtt ttaaaagatg tacaagtcac tcgtaaaaca tttagaaagt tagatgacat 600

cctggctatt gaagatgcgt tgactcgcgt tagcaatcaa ttaataaagg cgattaagca 660

acaaaaagaa ttattgtcga cagataaaaa atctctttta atggaggctc aaattgagaa 720

gataaagctt gagacagaca aattaagtgg cggatcatct aacgatgaag ctgactcttg 780

gaaacaagca gttataaatg cagcaaataa gcgggcggtg gaagaaaatg aataagagtt 840

tattccgttt gccgatattg gtgcagcaat tgattactac tacgataaac cagttgcttt 900

ttgtcaggat attttgcatc ttgatccaga tgaatggcag gataaggtct tggatgattt 960

ggctaaattc ccaaaagtct cagttagatc agggcagggt gttggaaaaa cggcgttgga 1020

ggctggtgct attctttggt ttctaacatg ccggccatat gcaaaagtaa tagcaactgc 1080

tccgacgatg aaacaattat acgatgttct atgggcagaa gtggctaagt ggctgaataa 1140

cagcttgatt aaagacttac ttaaatggac caagacgaaa atttatatgg ttggcgattc 1200

agaacgatgg tttgctacag ctcgaacagc aactaaacca gaaaatatgc aaggatttca 1260

cgaagaccat atgttaatag tggttgatga agcatcaggt gttgctgatc ccattatgga 1320

agcaatatta ggtactcttt caggatttga caataaatta ctaatgtgtg ggaaccccaa 1380

caatattgaa ggggtttttt atgattcgca taatacagat agagacaagt atagaacgca 1440

caaagtttct agttacgata gcaaacgtac taacaaagaa aatattcaaa tgctcatcga 1500

taagtatggt gagaatagcg atgtagctcg tgttcgtatt tatggtgaat ttcccaaagg 1560

cgcacttgat tcatttatca gccttgaaat tgttgagttt gccaaagata ttaatatttc 1620

tgattcagaa ttaaaacatg ttagagaagg acacataggt gtcgatgtgg ctcgttttgg 1680

tgatgattca acgatagtat ttcctagaat cggagctaaa gcattgccat ttgaaaaata 1740

tagtaagcaa gataccatgc agaccactgg tcgagtttta aaagcggcga aaaggatgat 1800

ggatgactat cctacaataa aaaaagtgtt catcaaagta gatgatacag gtgttggtgg 1860

aggtgttact gatagactta aagaagtaat tagcgatgaa aaacttccct atgaagtaat 1920

tccggtaaat aatggagaat cttctacaga cgattattat gcaaataaag gaacacaaat 1980

atggggagat gttaaagaac tgttagaaca aaacatttcc aattcgatta atggtcaagg 2040

gccgacgata gaacttcctg ataatgcaaa tctaatcaaa gaattgagca cacgtaaatt 2100

taaaatgact agcaatggaa aaatccgttt agaaagtaaa gaagatatga aaaagcgtaa 2160

tgttggcagt ccagatattg ctgatgcgtt aacgttagcg ttttacgagc catttagacc 2220

agaacctata aacgttaaaa aagctattaa tacgttcaaa aaattaggat taagtaggtg 2280

atagagtgaa taataaatta ttgaacggtt ctagatttga t 2321

<210> 7

<211> 2391

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 7

gatcttttgc ccattttatt tttataaaat gggcaggtgg cgtttgtgta aagcaaatcg 60

acacaatcca aaggggataa aaggggaaag tgaaacttcc cccttttcaa gccacattgt 120

aatacaagaa cgaagtgttt tgtattacaa tgtgatagct tgcagtattt atggttttat 180

atggtctatt ttgttgtgag gattgtaacc gaatagggcg caatgcttat tacaaaatca 240

atgacaaagg gcgattgagg aatgagcgct gaggcatttt atctttgagt aagttattga 300

tggatcagaa aaatgtatca caaattgaaa caaagactca ctcatttaag agaagctact 360

atcatgaaat tttgttgttg tgataagcaa cttctaatac acgattttta gccattacat 420

cactcgtttt tagagtgatg tgtaagtgcg cattgcactc tttttttacg aaacaagccg 480

accagcgttt gaaacttttt agtttttcat cattctattt taaaacgttc taaaactcga 540

tttaagcgac tttaattcga aactgtctat ttgttcaaag ggagcattaa gaatgcttaa 600

acgagctttt aagggggttt aaattgattt tgaattgaat agcttgttgt aagttgtaaa 660

aaaaacaagt taaacaaagt atcagttttc catttaaggg ttgttagggc ttgccctgac 720

cgtctgtaag acgcttgatt gcatgatatg agtatttagc tagtcaaaca gttaaaacag 780

cttatatgag caattagagg gaatccaata aattcctaaa agcggttttg atcttttctt 840

ttagcgagtg aacgctgcaa gtaaaatgtg agcgttcact cgctcactcc tttttttgat 900

gactttgacc tttggtttta aatttttgaa aaaaataaaa aataggcgaa gcctattata 960

tatttatctt atatatttta atcttttatt cttttgcgtc aaaaaaaaat caatattttc 1020

aaggctttat agaattatat accaacaaaa aactgtgtat ataccaacaa aaaactgtgc 1080

atacaccaac aaaaaactgt gcatatacca acttctttgt ttgtttcgtt ggtatataat 1140

gatataataa aagcatgaag aatctctcta cgaaaagtgt ttcttcatgc ttatctaaac 1200

tcactcacaa aggagcagtt ttctatgtct agtatatcaa aaaatgaacc taatcaaaag 1260

caggtgcaaa ccttgaacga attgtcaaaa cgaaaagtag tggaacataa ttctttaatt 1320

accagtattg cgaaaatgga taaaacgcca ctgaaaatgt ttgaattagc cgtgtcttgt 1380

attaataccg aagaaccacc caaagatcat acggtttatc tctcaaaaga agaattgttt 1440

gcctttttta aggtatctga taatgacaaa catagtcgtt ttaaacaagc agtagagaat 1500

atgcaaaaac aagccttttt tcaaattaaa gaagaagtag gtaaaggatt taaatttagg 1560

agtattgttc ccattccata tgtcgagtgg acagattatc atgatgacgt aaaaattgaa 1620

tttcatcgtg aaatcatgcc ctacttaatt aatctaaaac aaaatttcac gcaacatgct 1680

ttgtctgata ttgcagagct gaatagcaaa tactctatta tcttgtaccg ttggttatcc 1740

atgaattata accaatacga gcattatagt tataagggcg gacggagaga agaacaagtg 1800

gaagcctacc gcaatcctac catttcaatg cgagaattac gagaaatgac ggatacagtt 1860

gatgaatacc cccgctttga tagattagaa catagagttt taaaagaacc aatagaagaa 1920

attaacgaaa acacctcttt taacgtgacg tatgacaaga taaaaaaagg acgaagcatt 1980

gattctattg tctttcatat cacgaaaaaa cgtcgagcag atgataacag ctacaagtta 2040

gaagataaag attatcaatc cgacaaagag gaaaaatcaa gaaatgaagc tgacttatta 2100

aaacaggcaa tggaaagcaa gtacacacga ttattgattg aaaactttct cttatcccct 2160

cttgaaatga cggacacggc acttatggca ggtttgcaaa agaacgtcta tccgttgtat 2220

gacgagttaa aggaattaag aggattgaat ggggtcaaag accacttgtc ttatatatct 2280

agcaaaaaag aagcctattc taaacgcaat gtagcgaagt atctgaaaaa agcaatcgag 2340

caatatctac ctacggttaa aaggcaggac ttaaaccatg agtgagaact t 2391

<210> 8

<211> 2596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 8

tggcgattct gagacctctg agaggctctc agagctatct aaagctgagg gatatataaa 60

taccttagaa aattattcga agagcttaga agcgaaaata gagcgtttag agcgcgaggg 120

gctgaaatta gaaaaactaa aaacacaaat agctgaccta aaaatcatgt ctgagaaaga 180

actagcggct attaccccta aaaaaggcgt gttcggtaaa gaatatgtgg aattgactaa 240

agagcagttt gaagaattta aagggctgat ataccgaagc agaaaccttg ttcatcaaaa 300

agagctagag aatgagcaat taaggcggat agtgcctctg agacgctcta aacggtttga 360

agcgagttgg aacgagctaa agaaaaaagt aagggagaga gcatagagcg tcttaggaac 420

gaaaatagag cgcttagaag tgaaaactca gttttgagac agcaaaatga caaaatgcta 480

ggaaaactga aagagtttat gccagataaa gccttaaaaa attttatatc agagttaaga 540

gctattcagc caatcgtaag ggtagttaaa cgagtgattg aaaaagggct aggcctttga 600

gcgatttatg ccgtgaaagc taattgacaa taagcaaggg caaagtacgc taggacgtga 660

cgagccgaaa ggctttagcg tttcgagccg acacggacaa aggacgtccg cccttggtta 720

cttgttgtca attagaccat ggaataaagt aagcggacat ggtataatag ctaggtcgca 780

acgttctttc gctaagttac gaacttagat tggaggtgag cgctgtgaag actttcctag 840

aacttgtttt gatacctttt gtggttggcg ttgctgcaga ggtaagtgct gattggttga 900

ttcggtatgt tcgaaacaaa cgcgacaaaa attaacctga gttctttttg aggacaaaaa 960

agaaagacag tagttccagc tactgttttt tttgcgttgt gctattcgtt tcctagaact 1020

tctagcgtta aaattattat accacgtttg gatttagaaa gtcaaaattt gaggttttag 1080

gggtgaattt ttcgtgaaac gaaaaagagg gctgaaaagc ccttaaaaac ccaattgcgt 1140

agcaagggtt ttttcttatc ttgatacata tagaaataat gagttttttt attttcttgt 1200

tttaaagcac ctcaaaccct tgatattgct gggtttttag gtaacaaaaa agcccttgca 1260

atttaataaa ataaagttta taatttaagt gtccaattta aaataataaa cttaggagaa 1320

ttgcaggaac ttttttatat actcaaaaaa atttttttgc aagaaaatta taacatgaca 1380

ggtactgaaa atcaagtctt taaggactat tctaagaatg gcaaagatag aaagtggcga 1440

gaacgcaagt taaaaaatat tgagcttgct ggtcgtttag agcgtttagg atatcgttcg 1500

tttgaacggg tctatcaatg tgccgaagtg ttgaagttta tcgaacaaca agacggcacg 1560

aaaaaactct atcagtctta tttttgcaaa aataagctct gcccaatttg taactggaga 1620

cggtcaatga agtatgctta tcaagctgaa ttagtggtaa atgaagcaat gaaacgctat 1680

ccaaaaggtc gctttctctt tttgaccttg acgattaaga acattagtgg tgaaaaatta 1740

aataaatcaa tttcagaaat agggcgagct tttaatcgtc ttatgaaata caagaaagtc 1800

gataaaaatg ttattggcta tttgcgagcc actgaggtaa cttattcaac tgagcatgag 1860

aattatcacc ctcatttgca tgtattgtta tttgtgaaat ctagctattt tactggaaat 1920

aatacaaatt acattagcca agaagaatgg acgaaactat gggctaaggc gatgaaattg 1980

gattatacac ctgtagttga tattcgaacc gtcaaagctc ataaacgtaa aaacttgaag 2040

tcagctatta tcgaaacagc taaatatcct gttaagcctt ttgatgtaga tacagaagat 2100

gtgacattat tctctgaaat ggtcaaagaa cggataacag aagatttaac gaatggtttg 2160

caccgaaaaa ggcagattgg ttttggaaag ttgttcaaga aaatcaaggc ggagttagct 2220

cttgatgatg tcgaagaagg gaatcttgtt cagaccggag cagaagaatc tgcagaaagt 2280

actggtcgtg aaattgttgc cttttggaat tgggatagaa agaattattt tgtgaggtag 2340

ctgatgagta aaacagtatc agaattagct caagaattgg gagttagtag gcagtatctt 2400

aatcggattt tatcgcaaaa taatctcggt cgaaaaaaag ggaataaaaa agtagtttcc 2460

gatatggacg agaaagttat gcaagggttt attgttttct aaaatctgat taccaattag 2520

aatgaatatt tcccaaatat taaataataa aacaaaaaaa ttgaaaaaag tgtttccacc 2580

attttttcaa tttttt 2596

<210> 9

<211> 155

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 未知的描述: 乳酸链球菌素启动子序列

<400> 9

aaacagtctt aattctatct tgagaaagta ttggtaataa tattattgtc gataacgcga 60

gcataataaa cggctctgat taaattctga agtttgttag atacaatgat ttcgttcgaa 120

ggaactacaa aataaattat aaggaggcac tcaaa 155

<210> 10

<211> 1307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 10

acgatcacaa gaagaatttt gctcgcctgg cgcgagatgg tggttacacc atcgcacagt 60

atgccgccga gtttaatctt aaccctaata ccgcacgtcg ttatctccgt gccttcaaag 120

aagacaccag gactacggac agccgcaagc caaataagcc agtcaggaag ccggaattgc 180

cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct 240

cgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga tcaagagaca ggatgaggat 300

cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 360

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 420

ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 480

atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 540

cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 600

cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 660

atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 720

aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 780

tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca 840

tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 900

tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 960

atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 1020

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 1080

gccttcttga cgagttcttc tgagcccacc ggaccttacg tgatcgcctg gaacgcgaca 1140

ccctggatga tgatggtgaa cgctttgaat tcgaagttgg cgattacctg atagataacg 1200

ttgaagcgcg gaaggccgcg cgcgctatgt tgcgtcggtc cggggccgat gttctggaaa 1260

ccactcttct ggaaaagtct ctttctcatc tccttatgct ggagaac 1307

<210> 11

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 11

cgtcaggtgg cacttttcgg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat tttctaaata 60

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 120

aaaggaagag t 131

<210> 12

<211> 6145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多肽

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2860)..(2860)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 12

atgtgacttt cgttaccctc gcgtcaaaaa gagtttttac gaaaggaagc ataagtgacc 60

tgggacgatc acaagaagaa ttttgctcgc ctggcgcgag atggtggtta caccatcgca 120

cagtatgccg ccgagtttaa tcttaaccct aataccgcac gtcgttatct ccgtgccttc 180

aaagaagaca ccaggactac ggacagccgc aagccaaata agccagtcag gaagaagaga 240

aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca 300

gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa 360

gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat 420

caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 480

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 540

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 600

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 660

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 720

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat cccaccttgc tcctgccgag 780

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 840

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 900

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 960

gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1020

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1080

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1140

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1200

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattgaaaa aggaagagta 1260

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 1320

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 1380

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 1440

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 1500

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 1560

ttgagtactc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1620

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1680

aataatattg aaaaaggaag agtatgaagt ttggaaatat ttgtttttcg tatcaaccac 1740

caggtgaaac tcataagcaa gtaatggatc gctttgttcg gcttggtatc gcctcagaag 1800

aggtagggtt tgatacatat tggaccttag aacatcattt tacagagttt ggtcttacgg 1860

gaaatttatt tgttgctgcg gctaacctgt taggaagaac taaaacatta aatgttggca 1920

ctatgggggt tgttattccg acagcacacc cagttcgaca gttagaagac gttttattat 1980

tagatcaaat gtcgaaaggt cgttttaatt ttggaaccgt tcgagggcta taccataaag 2040

attttcgagt atttggtgtt gatatggaag agtctcgagc aattactcaa aatttctacc 2100

agatgataat ggaaagctta cagacaggaa ccattagctc tgatagtgat tacattcaat 2160

ttcctaaggt tgatgtatat cccaaagtgt actcaaaaaa tgtaccaacc tgtatgactg 2220

ctgagtccgc aagtacgaca gaatggctag caatacaagg gctaccaatg gttcttagtt 2280

ggattattgg tactaatgaa aaaaaagcac agatggaact ctataatgaa attgcgacag 2340

aatatggtca tgatatatct aaaatagatc attgtatgac ttatatttgt tctgttgatg 2400

atgatgcaca aaaggcgcaa gatgtttgtc gggagtttct gaaaaattgg tatgactcat 2460

atgtaaatgc gaccaatatc tttaatgata gcaatcaaac tcgtggttat gattatcata 2520

aaggtcaatg gcgtgatttt gttttacaag gacatacaaa caccaatcga cgtgttgatt 2580

atagcaatgg tattaaccct gtaggcactc ctgagcagtg tattgaaatc attcaacgtg 2640

atattgatgc aacgggtatt acaaacatta catgcggatt tgaagctaat ggaactgaag 2700

atgaaataat tgcttccatg cgacgcttta tgacacaagt cgctcctttc ttaaaagaac 2760

ctaaataaat tacttatttg atactagaga taataaggaa caagttatga aatttggatt 2820

attttttcta aactttcaga aagatggaat aacatctgan gaaacgttgg ataatatggt 2880

aaagactgtc acgttaattg attcaactaa atatcatttt aatactgcct ttgttaatga 2940

acatcacttt tcaaaaaatg gtattgttgg agcacctatt accgcagctg gttttttatt 3000

agggttaaca aataaattac atattggttc attaaatcaa gtaattacca cccatcaccc 3060

tgtacgtgta gcagaagaag ccagtttatt agatcaaatg tcagagggac gcttcattct 3120

tggttttagt gactgcgaaa gtgatttcga aatggaattt tttagacgtc atatctcatc 3180

aaggcaacaa caatttgaag catgctatga aataattaat gacgcattaa ctacaggtta 3240

ttgtcatccc caaaacgact tttatgattt tccaaaggtt tcaattaatc cacactgtta 3300

cagtgagaat ggacctaagc aatatgtatc cgctacatca aaagaagtcg tcatgtgggc 3360

agcgaaaaag gcactgcctt taacatttaa gtgggaggat aatttagaaa ccaaagaacg 3420

ctatgcaatt ctatataata aaacagcaca acaatatggt attgatattt cggatgttga 3480

tcatcaatta actgtaattg cgaacttaaa tgctgataga agtacggctc aagaagaagt 3540

gagagaatac ttaaaagact atatcactga aacttaccct caaatggaca gagatgaaaa 3600

aattaactgc attattgaag agaatgcagt tgggtctcat gatgactatt atgaatcgac 3660

aaaattagca gtggaaaaaa cagggtctaa aaatatttta ttatcctttg aatcaatgtc 3720

cgatattaaa gatgtaaaag atattattga tatgttgaac caaaaaatcg aaatgaattt 3780

accataaagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atgggcccac cggaccttac 3840

gtgatcgcct ggaacgcgac accctggatg atgatggtga acgctttgaa ttcgaagttg 3900

gcgattacct gatagataac gttgaagcgc ggaaggccgc gcgcgctatg ttgcgtcggt 3960

ccggggccga tgttctggaa accactcttc tggaaaagtc tctttctcat ctccttatgc 4020

tggagaacgc cagggatacg tgtattcgcc tggtgcagga aatgcgcgat cagcaaaaag 4080

acgatgatga aggtactccg cctgaatacc gtatcgcgag catgctaaac agctgttccg 4140

cgcagataag cagcctgatc aacaccattt acagcatccg gaataactat cgaaaagaaa 4200

gccgggaggc ggaaaagcac gctttatcta tggggcaagc tggcattgtt aagctggcat 4260

acgaacgaaa gcgtgaaaat aactggtcag tgctggaagc ggctgaattc atcgaggcgc 4320

atggaggaaa agtgccgccc ctgatgctgg agcaaatcaa agccgatctg cgtgctccta 4380

agaccaatac cgatgatgag gaaaaccaaa cagcatctgg cgctccatca cttgaagatc 4440

tggataaaat cgcgcgagaa cgggccgcca gccgccgcgc tgatgccgca ttgtggattg 4500

agcatcgtag agaagaaatt gccgatatcg tcgatacagg tggttatggt gatgtcgatg 4560

cggaaggcat atcaaacgaa gcatggcttg aacaggatct ggacgaagac gaggaggaag 4620

acgaagaagt tacccgcaaa ctgtacgggg atgatgatta atggccagaa gttgcgtaac 4680

ggacccacgt tggcgcgagc ttgtggcgct atatcgttat gactggattg cggccgctga 4740

tgtgttgttt gggaagacac caacctggca gcaggatgag atcattgagt ccacgcagca 4800

ggacggcagt tggacaagtg tgacctccgg ccatggtact ggtaaatcgg atatgacgag 4860

tatcattgca atactcttca tcatgttttt ccccggcgct cgcgtcattc tggtcgctaa 4920

caaaagacag caagtccttg atggtatttt caaatacata aagagcaatt gggctactgc 4980

tgttagcaga ttcccgtggt tgtcgaagta tttcattctt acagaaacgt ctttttttga 5040

ggtgactggc aagggtgttt ggacaatatt gataaagtcc tgtcgtcccg gaaatgagga 5100

ggcgttggct ggtgaacacg ccgatcatct cttgtatatc atcgacgaag cgtcgggtgt 5160

gagtgataaa gcattcagtg tgataacagg tgcgctgacc ggtaaggata accgtattct 5220

gcttctttcc cagcctacgc gaccttcagg ctatttctac gattcacacc acagactagc 5280

tattcgcccg ggaaatcctg atggattgtt tactgcgata atactgaata gtgaagaatc 5340

tccgcttgta gatgcaaaat ttatacgagc aaaacttgcg gagtatggcg gtcgtgataa 5400

ccccatgtac atgatcaaag tacgtggtga atttcccaaa tctcaagatg gctttcttct 5460

tggtcgtgat gaggttgagc gggcgacgcg gcgaaaggtc aagattgcca aaggatgggg 5520

ctgggttgca tgtgttgacg ttgctggtgg cacaggacga gataagtccg ttattaatat 5580

catgatggtg tccggccagc gaaataaacg ccgtgtaatc aactatcgta tgctggaata 5640

cacagacgtt acagaaacgc agttagccgc caagattttc gcagaatgta acccagaacg 5700

gttcccgaac ataaccatag ctattgatgg cgatggcttg gggaaatcga cggctgatct 5760

aatgtacgaa cgctatggca ttaccgtcca gcgtatccgc tggggtaaaa agatgcacag 5820

ccgtgaagat aaaagccttt atttcgatat gcgcgctttc gcgaatattc aggcggcaga 5880

agctgtaaaa tcagggcgta tgaggcttga taagggggct gcgactatag aggaagcatc 5940

aaagataccg gtagggataa attccgcagg tcaatggaag gtgatgtcaa aggaagatat 6000

gaagaaaaaa ctcaacctgc actcaccgga ccattgggat acatattgtt tcgctatgtt 6060

ggcgaactat gttccccaag atgaagtgct tagcgtcgaa gacgaagcgc aggttgatga 6120

agctctggca tggcttaatg aataa 6145

Claims (14)

1.细菌细胞包装系统，其用于将报道核酸分子包装至用于导入细菌细胞的非复制型转导粒子（NRTP）中，所述包装系统包括宿主细胞，其包括：

噬菌体基因组，其含有包含破坏的包装起始位点序列的第一末端酶基因，其中在不存在所述破坏的情况下，所述第一末端酶基因编码第一末端酶活性，其中所述第一末端酶活性识别包装起始位点序列，其中所述破坏阻止由第一末端酶活性识别包装起始位点序列，并且其中所述破坏进一步使得第一末端酶活性无功能；和

含有报道核酸分子的质粒，所述报道核酸分子包含报道基因、含有未破坏的包装起始位点序列并编码有功能的第一末端酶活性的第二末端酶基因、和编码第二末端酶活性的第三末端酶基因，其中所述未破坏的包装起始位点序列经配置以促进将所述含有报道核酸分子的质粒的复制子包装至NRTP。

2.权利要求1的细菌细胞包装系统，其中所述噬菌体基因组包含多个破坏的末端酶基因，其中在破坏不存在的情况下，所述多个破坏的末端酶基因各自编码末端酶活性，并且其中所述噬菌体基因组上的多个破坏的基因各自通过由报道核酸分子编码的具功能的未破坏的基因补充。

3.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述第一末端酶基因的破坏是经由破坏包装起始位点的缺失、插入、置换或突变。

4.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述第二末端酶基因和第三末端酶基因可操作地连接至条件启动子。

5.权利要求4的细菌细胞包装系统，其中所述条件启动子是噬菌体基因组的末端酶基因的天然启动子。

6.权利要求4的细菌细胞包装系统，其中所述第二末端酶基因或第三末端酶基因的表达在不存在噬菌体裂解周期激活的情况下受到抑制，并且其中所述第二末端酶基因或第三末端酶基因的表达在噬菌体的裂解周期的激活后被活化。

7.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述噬菌体基因组包含编码可检测标记物或可选择标记物的报道基因并且其中所述报道基因可操作地连接至组成型启动子。

8.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述破坏包括使用编码可选择标记物的基因插入或置换第一包装起始位点序列，并且其中所述编码可选择标记物的基因可操作地连接至组成型启动子。

9.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述破坏的包装起始位点序列包括使用编码可检测标记物的基因插入或置换包装起始位点序列。

10.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述含有报道核酸分子的质粒包含复制起点。

11.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中含有报道核酸分子的质粒的复制子包括适合包装至非复制型转导粒子中的多联体。

12.权利要求1至2中任一项的细菌细胞包装系统，其中所述未破坏的包装起始位点序列包含多联体接合点。

13.用于将报道核酸分子包装至非复制型转导粒子中的方法，所述方法包括：

-为权利要求1至12中任一项的细菌细胞包装系统提供条件，所述条件诱导噬菌体基因组的裂解期以产生包装了含有报道核酸分子的质粒的复制子的非复制型转导粒子；和

-收集包含含有报道核酸分子的质粒的复制子的非复制型转导粒子。

14.一种组合物，其包含由权利要求13的方法产生的包含含有报道核酸分子的质粒的复制子的非复制型转导粒子。

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