ES2778727T3 - Partículas de transducción no replicativas y sistemas indicadores basados en partículas de transducción - Google Patents

Partículas de transducción no replicativas y sistemas indicadores basados en partículas de transducción Download PDF

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Abstract

Un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa (NRTP) para su introducción en una célula bacteriana, comprendiendo el sistema de empaquetamiento una célula huésped, que comprende: - un genoma de bacteriófago que comprende un primer gen que comprende una alteración, en el que, en ausencia de la alteración, el primer gen codifica un primer componente esencial de una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento y comprende una primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento reconoce el primer sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la alteración evita el reconocimiento de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento por la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y en el que la alteración reduce el nivel de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial; y - una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende un gen indicador, un replicón lítico P1, un segundo gen que codifica el primer componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y un tercer gen que codifica un segundo componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, en la que el segundo gen comprende la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada, en la que la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento se configura para facilitar el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la NRTP.

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas de transducción no replicativas y sistemas indicadores basados en partículas de transducción
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
La invención se refiere a procedimientos y composiciones para empaquetar y liberar moléculas indicadoras de transducción no replicativas en células para detectar genes diana en las células.
Descripción de la técnica relacionada
Una partícula de transducción se refiere a un virus que puede liberar un ácido nucleico no vírico en una célula. Los sistemas indicadores basados en virus se han usado para detectar la presencia de células y se basan en la fase lisógena del virus para permitir la expresión de una molécula indicadora de la célula. Estos sistemas indicadores basados en virus usan partículas de transducción con capacidad de replicación que expresan moléculas indicadoras y provocan que una célula diana emita una señal detectable.
Sin embargo, se ha demostrado que el ciclo lítico del virus es perjudicial para los ensayos indicadores basados en virus. Carriére, C. et al., Conditionally replicating luciferase repórter phages: Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35(12): p. 3232-3239. Carriére et al. desarrollaron fagos indicadores de luciferasa de M. tuberculosis / bacilo de Calmette-Guérin (BCG) que tienen sus ciclos líticos suprimidos a 30 °C, pero activos a 37 °C. Usando este sistema, Carriére et al. han demostrado la detección de BCG usando indicadores de fagos con un ciclo lítico suprimido.
Sin embargo, existen desventajas asociadas con la supresión, pero no con la eliminación, de las funciones de replicación del bacteriófago en los ensayos indicadores basados en bacteriófago. En primer lugar, controlar las funciones de replicación del bacteriófago impone condiciones limitantes de ensayo. Por ejemplo, el ciclo lítico del fago indicador phAE40 usado por Carriére et al. se reprimía cuando el fago se usaba para infectar células a la temperatura no permisiva de 30 °C. Este requisito de temperatura impuso condiciones limitantes en el ensayo indicador en que la temperatura óptima para las bacterias diana era 37 °C. Estas condiciones limitantes dificultan el rendimiento óptimo del ensayo.
Además, las funciones de replicación del virus son difíciles de controlar. La replicación del virus se debe suprimir durante el uso de las partículas de transducción como sistema indicador. Por ejemplo, la actividad lítica del fago indicador phAE40 del que informó Carriére et al. se redujo, pero no se eliminó, dando como resultado una caída en la señal de luciferasa en el ensayo. Carriére et al. destacaron las posibles causas de la caída resultante en la señal del indicador, tal como los genes intactos expresados en el fago y las limitaciones de temperatura del ensayo, todo derivado del hecho de que no se eliminó el ciclo lítico del indicador del fago.
Se puede esperar que los ensayos indicadores que dependen del ciclo lisógeno natural de los fagos presenten actividad lítica esporádicamente. Además, los ensayos que se basan en el ciclo lisógeno del fago pueden ser propensos a inmunidad por sobreinfección de las células diana ya lisogenizadas con un fago similar, así como a los sistemas de restricción del huésped naturales que se dirigen al ácido nucleico del virus entrante, limitando por tanto la gama de huéspedes de estos fagos indicadores.
En otros ejemplos, los sistemas de producción de partículas de transducción se diseñan para empaquetar moléculas de ácido nucleico exógenas, pero la partícula de transducción a menudo contiene una combinación de moléculas de ácido nucleico exógenas y moléculas de ácido nucleico vírico de la descendencia natural. El virus natural puede presentar actividad lítica que es un obstáculo para el rendimiento del ensayo, y la actividad lítica del virus se debe eliminar para purificar las partículas de transducción. Sin embargo, en general esta purificación no es posible. En el documento US 2009/0155768 A, titulado Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteria, Scholl et al. describen el desarrollo de dicho sistema de partículas de transducción. El producto del sistema es una combinación de partículas de transducción indicadoras y bacteriófagos naturales (figura 8 en la referencia). Aunque los autores indican que la partícula de transducción y el bacteriófago natural se pueden separar por ultracentrifugación, esta separación solo es posible en un sistema donde la partícula de transducción y el virus natural presenten densidades diferentes que permitan la separación por ultracentrifugación. Aunque esta característica la presente el sistema de empaquetamiento basado en bacteriófago T7 descrito en la referencia, esta no es una característica que sea aplicable en general a otros sistemas víricos. Es común que la maquinaria de empaquetamiento vírica presente empaquetamiento completo, que daría como resultado virus natural y partículas de transducción que presentan densidades indistinguibles que no se pueden separar por ultracentrifugación. Los sistemas de empaquetamiento víricos también dependen de una cantidad mínima de empaquetamiento como requisito para un ensamblaje estructural del virus apropiado que dé como resultado virus natural y partículas de transducción con densidades indistinguibles.
Por tanto, existe una necesidad de partículas de transducción no replicativas que no experimenten los efectos perjudiciales de las funciones líticas del virus y la posibilidad de estar limitadas por la inmunidad por sobreinfección y los mecanismos de restricción del huésped que se dirigen a las moléculas de ácido nucleico vírico y las funciones víricas, pudiendo limitar todo ello el rendimiento del ensayo indicador al incrementar los límites de detección y dar como resultado resultados falsos negativos.
Incluso cuando se han genomanipulado partículas de transducción, los procedimientos para usar las partículas de transducción para detectar e informar de la presencia de moléculas de ácido nucleico diana en las células tienen limitaciones. Algunos procedimientos requieren la alteración de la célula y técnicas engorrosas para aislar y detectar transcritos en el lisado. Los procedimientos de detección incluyen el uso de sondas marcadas, tales como anticuerpos, aptámeros o sondas de ácido nucleico. Las sondas marcadas dirigidas a un gen diana pueden dar como resultado una unión no específica a dianas no pretendidas o generar señales que tienen una alta proporción señal/ruido. Por lo tanto, existe una necesidad de procedimientos específicos, eficaces y exactos para detectar e informar de moléculas de ácido nucleico endógenas en las células.
En consecuencia, se necesitan procedimientos y sistemas para generar partículas de transducción no replicativas que permitan el empaquetamiento y la expresión de moléculas indicadoras en las células, mientras se elimina el virus de la descendencia con capacidad de replicación. También se necesitan procedimientos eficaces y exactos para detectar moléculas en las células usando las moléculas indicadoras expresadas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se divulga un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa (NRTP) para su introducción en una célula bacteriana, comprendiendo el sistema de empaquetamiento una célula huésped, que comprende (1) un genoma de bacteriófago que comprende un primer gen que comprende una alteración, en el que en ausencia de la alteración, el primer gen codifica un primer componente esencial de una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento y comprende una primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento reconoce el primer sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la alteración evita el reconocimiento de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento por la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y en el que la alteración reduce el nivel de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y (2) una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende un gen indicador, un replicón lítico P1, un segundo gen que codifica el primer componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial y un tercer gen que codifica un segundo componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, en la que el segundo gen comprende la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada, en la que la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento se configura para facilitar el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la NRTP.
En un modo de realización, el bacteriófago comprende una pluralidad de genes alterados, en los que, en ausencia de las alteraciones, cada uno codifica un componente esencial de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento. En un modo de realización, cada uno de la pluralidad de genes alterados del bacteriófago se complementa con un gen funcional, no alterado, codificado por la molécula de ácido nucleico indicadora. En otro modo de realización, la alteración es por medio de deleción, inserción, mutación o remplazo.
En otro modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un gen de terminasa pequeño y un gen de terminasa grande. En otro modo de realización, los genes de terminasa comprenden un gen pacA y un gen pacB del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. En algunos modos de realización, al menos uno de dicho segundo conjunto de genes de bacteriófago comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. En un modo de realización, los genes de terminasa comprenden un gen terS y un gen terL de un bacteriófago $11 o $80a de S. aureus. En otro modo de realización, los genes de terminasa comprenden un gen terA y un gen terB de un bacteriófago $Ef11 de E. faecalis.
En algunos modos de realización, la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento es una actividad terminasa. En un modo de realización, el segundo gen y el tercer gen son genes de terminasa. En un modo de realización, el segundo gen es un gen pacA y en el que el tercer gen es un gen pacB. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En un modo de realización, el segundo gen es un gen terA y el tercer gen es un gen terB. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En un modo de realización, el segundo gen es un gen terS y en el que el tercer gen es un gen terL. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.
En algunos modos de realización, el segundo gen y el tercer gen están enlazados de forma funcional a un promotor condicional. En un modo de realización, el promotor condicional comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9. En un modo de realización, el promotor condicional es un promotor natural de un gen de terminasa del genoma de bacteriófago. En algunos modos de realización, la expresión del segundo gen o el tercer gen se inhibe en ausencia de activación del ciclo lítico del bacteriófago, y en los que la expresión del segundo gen o el tercer gen se activa tras la activación del ciclo lítico del bacteriófago. En determinados modos de realización, el segundo gen y el tercer gen son genes de terminasa naturales del genoma de bacteriófago, y en los que el promotor condicional es un promotor natural de los genes de terminasa.
En algunos modos de realización, el genoma de bacteriófago comprende un gen indicador. En algunos modos de realización, el genoma de bacteriófago comprende además un gen de resistencia a antibióticos. En un modo de realización, el gen indicador codifica un marcador detectable o un marcador seleccionable. En un modo de realización, el gen indicador se selecciona del grupo que consiste en: enzimas que median reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), enzimas que median reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), péptidos de afinidad (His-tag, 3X-FLAG) y marcadores seleccionables (ampC, tet(M), CAT, erm). En un modo de realización, el gen indicador altera un gen de terminasa. En determinados modos de realización, el gen de resistencia a antibióticos es un gen de resistencia a kanamicina. En algunos modos de realización, el gen indicador está enlazado de forma funcional a un promotor constitutivo. En un modo de realización adicional, el promotor constitutivo es Pblast.
En un modo de realización, la alteración comprende una inserción en o remplazo de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento con un gen que codifica un marcador seleccionable. En determinados modos de realización, el gen que codifica el marcador seleccionable está enlazado de forma funcional a un promotor constitutivo. En un modo de realización, la alteración comprende una inserción en o remplazo de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento con un gen que codifica un marcador detectable. En un modo de realización, el gen que codifica el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en: luxA, luxB y luxAB. En algunos modos de realización, el gen que codifica el marcador detectable está enlazado de forma funcional a un promotor constitutivo, por ejemplo, Pblast. En determinados modos de realización, el primer gen comprende un locus del gen pacA, y en el que la alteración comprende un gen luxAB y un gen kan insertado en el locus del gen pacA. En algunos modos de realización, el genoma de bacteriófago comprende SEQ ID NO: 12.
En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un origen de replicación. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un concatámero susceptible de empaquetarse en la partícula de transducción no replicativa. En determinados modos de realización, la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada comprende un punto de unión concatamérico. En algunos modos de realización, el replicón es un replicón lítico del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae.
En un modo de realización, el replicón comprende un promotor P53 controlado por represor C1, una molécula de antisentido del promotor P53, un gen repL y una deleción sin cambio de pauta de lectura de un gen kilA. En otro modo de realización, el replicón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En un modo de realización, el replicón es un replicón pBHR1 o un derivado del replicón pBHR1. En otro modo de realización, el replicón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora se deriva de un origen de replicación del plásmido pT181 de S. aureus. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora se deriva de un origen de replicación del plásmido repB de Enterococcus. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora se deriva de un origen de replicación del plásmido pDL278 de Enterococcus. En un modo de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8. En un modo de realización, la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada comprende un sitio pac. En un modo de realización, la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada comprende un sitio cos.
En un modo de realización, el genoma de bacteriófago comprende un bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. En un modo de realización, el genoma de bacteriófago comprende un bacteriófago $80a o un bacteriófago $11 de S. aureus. En un modo de realización, el genoma de bacteriófago comprende un bacteriófago $EF11 de E. faecalis.
En un modo de realización, la célula bacteriana comprende una célula de E. coli. En un modo de realización, la célula bacteriana comprende una célula de S. aureus. En un modo de realización, la célula bacteriana comprende una célula de E. faecalis. En un modo de realización, la célula bacteriana comprende una célula gramnegativa. En un modo de realización, la célula bacteriana comprende una célula grampositiva.
En un modo de realización, el gen indicador codifica un marcador detectable o un marcador seleccionable. En algunos modos de realización, el gen indicador se selecciona del grupo que consiste en: enzimas que median reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), enzimas que median reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), péptidos de afinidad (His-tag, 3X-FLAG) y marcadores seleccionables (ampC, tet(M), CAT, erm).
En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un aptámero. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende una secuencia de transcrito de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia en la molécula de ácido nucleico indicadora.
En un modo de realización, la secuencia de transcrito de ácido nucleico es complementaria a un transcrito celular. En otro modo de realización, la secuencia de transcrito de ácido nucleico comprende una secuencia de represión en cis. En un modo de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora está enlazada de forma funcional a un promotor. En otro modo de realización, el promotor se selecciona para que contribuya a la reactividad de una molécula indicadora expresada a partir de la molécula de ácido nucleico indicadora en la célula bacteriana. En algunos modos de realización, el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende una secuencia de transcrito de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia en la réplica de la molécula de ácido nucleico indicadora.
También se proporciona en el presente documento un procedimiento para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa, que comprende (1) proporcionar condiciones al sistema de empaquetamiento de células bacterianas como se divulga en el presente documento que induzcan una fase lítica del genoma de bacteriófago para producir partículas de transducción no replicativas empaquetadas con la molécula de ácido nucleico indicadora; y (2) recoger la partícula de transducción no replicativa que comprende la molécula de ácido nucleico indicadora. En algunos modos de realización, la partícula de transducción no replicativa no contiene un genoma de bacteriófago replicado. En algunos modos de realización, la partícula de transducción no replicativa comprende una parte del genoma de bacteriófago debido a recombinación con la molécula de ácido nucleico indicadora, y en la que la parte del genoma de bacteriófago comprende el gen indicador.
También se proporciona en el presente documento una composición que comprende la partícula de transducción no replicativa que comprende un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora producida por el procedimiento divulgado en el presente documento.
También se divulga en el presente documento un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico en una partícula de transducción no replicativa, comprendiendo la célula bacteriana (1) un genoma de bacteriófago que comprende una primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento es alterada por un gen que codifica un indicador, y (2) una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende una segunda secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento que facilita el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la partícula de transducción no replicativa, en la que la molécula de ácido nucleico indicadora forma un replicón configurado para empaquetarse en la partícula de transducción no replicativa.
También se divulga en el presente documento un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa (NRTP) para su introducción en una célula, comprendiendo el sistema de empaquetamiento una célula huésped, que comprende (1) un genoma de bacteriófago que comprende un primer par de genes de terminasa, en el que al menos uno del primer par de genes de terminasa se altera, haciendo que el gen de terminasa alterado no sea funcional, y (2) una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende un gen indicador y un segundo par de genes de terminasa que complementa el primer par de genes de terminasa, en la que cada uno del segundo par de genes de terminasa es funcional, y en la que el segundo par de genes de terminasa facilita el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la NRTP.
También se divulga en el presente documento un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa (NRTP) para su introducción en una célula, comprendiendo el sistema de empaquetamiento una célula huésped, que comprende (1) un genoma de bacteriófago que comprende un primer par de genes de terminasa, en el que solo uno del primer par de genes de terminasa se altera, haciendo que el gen de terminasa alterado no sea funcional, y (2) una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende un gen indicador y un segundo gen de terminasa que complementa el primer gen de terminasa, en la que el segundo gen de terminasa es funcional, y en la que el segundo gen de terminasa facilita el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la NRTP.
También se divulga que, en algunos sistemas de empaquetamiento de partículas de transducción no replicativas, se puede empaquetar ADN vírico recombinado con ADN plasmídico. En dichos sistemas, un lisado producido por el sistema de empaquetamiento puede contener dos especies de partículas de transducción, (1) partículas de transducción que portan ADN plasmídico y (2) partículas de transducción que portan ADN vírico. En dichos sistemas, la última especie de partículas de transducción no contribuye a la producción de señales cuando se usa el lisado como un sistema indicador para la detección de células diana. Por tanto, en el presente documento se divulga un sistema indicador mejorado basado en partículas de transducción no replicativas, en el que se ha incorporado un gen indicador al genoma vírico de modo que ambas especies de partículas de transducción puedan producir señales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
Estos y otros rasgos característicos, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y los dibujos adjuntos, donde:
La figura 1 ilustra un ejemplo de alteración del gen pacA en el bacteriófago P1 mediante la inserción de un gen de resistencia a kanamicina dentro del gen pacA por medio de intercambio alélico, de acuerdo con un modo de realización.
La figura 2 ilustra un esquema de un plásmido indicador complementario que porta genes pacA y pacB bajo el control del promotor del gen pacA natural, de acuerdo con un modo de realización.
La figura 3 ilustra un ejemplo del diseño y la función de un sistema de empaquetamiento que comprende una célula de E. coli lisogenizada con el bacteriófago P1 que tiene un gen pacA alterado, portando la célula también un plásmido que contiene pacA y pacB, de acuerdo con un modo de realización.
La figura 4 ilustra un ejemplo del diseño y la función de un sistema de empaquetamiento que comprende una célula de E. coli lisogenizada con el bacteriófago P1 que tiene un gen pacA alterado, donde la alteración se logra por medio de la inserción de un gen de resistencia a kanamicina y los genes de luciferasa bacteriana luxAB, portando la célula también un plásmido que contiene pacA y pacB, de acuerdo con un modo de realización.
La figura 5 representa un sistema para el uso de NRTP para la detección de inductores que se dirigen a promotores de genes dentro de células viables, de acuerdo con un modo de realización de la invención.
La figura 6 representa un sistema indicador que incluye una molécula de ácido nucleico indicadora (por ejemplo, plásmido) que se construye para detectar VanR, el inductor del promotor del gen de resistencia a vancomicina (vanA) en Enterococcus faecium (o E. faecalis), de acuerdo con un modo de realización de la invención. El plásmido indicador porta un gen indicador que está enlazado de forma funcional al promotor del gen vanA.
La figura 7 representa un sistema indicador que incluye una molécula de ácido nucleico indicadora construida para detectar TcdD, el inductor de los promotores de los genes de las toxinas A y B (tcdA y tcdB, respectivamente) de C. difficile, de acuerdo con un modo de realización de la invención. La molécula de ácido nucleico indicadora incluye un gen indicador que está enlazado de forma funcional al promotor del gen tcdA.
La figura 8 representa un sistema indicador que incluye una molécula de ácido nucleico indicadora construida para detectar SarS, el inductor del promotor del gen de la proteína A (spa) en S. aureus, de acuerdo con un modo de realización de la invención. La molécula de ácido nucleico indicadora incluye los genes de luciferasa bacteriana luxA y luxB enlazados de forma funcional al promotor del gen spa (Pspa).
La figura 9 muestra un diagrama de emparejamiento de bases entre el transcrito diana y la secuencia de represión en cis del transcrito indicador.
La figura 10 muestra una tabla de datos obtenidos al medir la producción de luz (ULR) de colonias de células transducidas. Las células que eran resistentes a espectinomicina (SpecR) se transdujeron con ADN plasmídico, mientras que las células que eran resistentes a kanamicina (KanR) se transdujeron con ADN de P1. Los datos obtenidos tras emplear un lisado producido a partir de una célula que contiene P1 sin luxAB integrado en su genoma (1505) dieron como resultado transductantes KanR que en general no produjeron luz, mientras que los datos obtenidos tras emplear un lisado producido a partir de una célula que contiene P1 con luxAB integrado en su genoma (1525) dieron como resultado transductantes KanR que produjeron luz.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. Definiciones
Los términos usados en las reivindicaciones y la memoria descriptiva se definen como se establece a continuación, a menos que se especifique de otro modo.
Como se usa en el presente documento, "molécula de ácido nucleico indicadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende una molécula de ADN o ARN. La molécula de ácido nucleico indicadora puede ser una molécula natural o una molécula artificial o sintética. En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora es exógena a una célula huésped y se puede introducir en una célula huésped como parte de una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un plásmido o vector. En determinados modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora puede ser complementaria de un gen diana en una célula. En otros modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un gen indicador que codifica una molécula indicadora (por ejemplo, enzima indicadora, proteína). En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora se denomina "construcción indicadora" o "construcción indicadora de ácido nucleico".
Una "molécula indicadora" o "indicador" se refiere a una molécula (por ejemplo, ácido nucleico o proteína) que confiere a un organismo un fenotipo detectable o seleccionable. El fenotipo detectable puede ser colorimétrico, fluorescente o luminiscente, por ejemplo. Las moléculas indicadoras se pueden expresar a partir de genes indicadores que codifican enzimas que median reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), genes que codifican enzimas que median reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), genes que codifican proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos de afinidad (His-tag, 3X-FLAG) y genes que codifican marcadores seleccionables (ampC, tet(M), CAT, erm). La molécula indicadora se puede usar como un marcador para la captación exitosa de una molécula de ácido nucleico o secuencia exógena (plásmido) en una célula. La molécula indicadora también se puede usar para indicar la presencia de un gen diana, una molécula de ácido nucleico diana, una molécula intracelular diana o una célula, como se describe en el presente documento. De forma alternativa, la molécula indicadora puede ser un ácido nucleico, tal como un aptámero o una ribozima.
En algunos aspectos de la invención, la molécula de ácido nucleico indicadora está enlazada de forma funcional a un promotor. En otros aspectos de la invención, el promotor se puede elegir o diseñar para que contribuya a la reactividad y reactividad cruzada del sistema indicador en base a la actividad del promotor en células específicas (por ejemplo, especies específicas) y no en otras. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un origen de replicación. En otros aspectos, la elección del origen de replicación puede contribuir de forma similar a la reactividad y reactividad cruzada del sistema indicador, cuando la replicación de la molécula de ácido nucleico indicadora dentro de la célula diana contribuye a o es necesaria para la producción de señales indicadoras en base a la actividad del origen de replicación en células específicas (por ejemplo, especies específicas) y no en otras. En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora forma un replicón que se puede empaquetar como ADN concatamérico en un virus de la descendencia durante la replicación del virus.
Como se usa en el presente documento, un "transcrito diana" se refiere a una parte de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN o una molécula ARNm que se forma naturalmente por una célula diana, incluyendo la formada durante la transcripción de un gen diana y un ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción principal. El transcrito diana también se puede denominar transcrito celular o transcrito natural.
Como se usa en el presente documento, el término "transcrito" se refiere a una longitud de secuencia de nucleótidos (ADN o ARN) transcrita a partir de una secuencia molde o gen de ADN o ARN. El transcrito puede ser una secuencia de ADNc transcrito a partir de un molde de ARN o una secuencia de ARNm transcrito a partir de un molde de ADN. El transcrito puede ser codificante o no codificante de proteínas. El transcrito también se puede transcribir a partir de una construcción de ácido nucleico genomanipulado.
Un transcrito derivado de una molécula de ácido nucleico indicadora se puede denominar "transcrito indicador". El transcrito indicador puede incluir una secuencia indicadora y una secuencia de represión en cis. El transcrito indicador puede tener secuencias que forman regiones de complementariedad, de modo que el transcrito incluye dos regiones que forman una estructura bicatenaria (por ejemplo, una región bicatenaria intermolecular). Una región se puede denominar "secuencia de represión en cis" y tiene complementariedad con una parte o la totalidad de un transcrito diana y/o una secuencia indicadora. Una segunda región del transcrito se denomina "secuencia indicadora" y puede tener complementariedad con la secuencia de represión en cis. La complementariedad puede ser complementariedad completa o complementariedad sustancial. La presencia y/o unión de la secuencia de represión en cis con la secuencia indicadora puede formar una conformación en el transcrito indicador, que puede bloquear la expresión adicional de la molécula indicadora. El transcrito indicador puede formar estructuras secundarias, tales como una estructura en horquilla, de modo que las regiones dentro del transcrito indicador que sean complementarias entre sí puedan hibridar entre sí.
"Introducir en una célula", cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico o una secuencia exógena (por ejemplo, un plásmido, un vector, una construcción), significa facilitar la captación o absorción en la célula, como se entiende por los expertos en la técnica. La absorción o captación de construcciones o transcritos de ácido nucleico se puede producir a través de procesos celulares activos o difusivos sin ayuda, o mediante agentes o dispositivos auxiliares que incluyen por medio del uso de bacteriófagos, virus y partículas de transducción. El significado de este término no se limita a las células in vitro; una molécula de ácido nucleico también se puede "introducir en una célula", en la que la célula forma parte de un organismo vivo. En dicho caso, la introducción en la célula incluirá la liberación en el organismo. Por ejemplo, para la liberación in vivo, las moléculas, construcciones o vectores de ácido nucleico de la invención se pueden inyectar en un sitio de tejido o administrar sistémicamente. La introducción in vitro en una célula incluye procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación y lipofección. Otros enfoques se describen en el presente documento o se conocen en la técnica.
Una "partícula de transducción" se refiere a un virus que puede liberar una molécula de ácido nucleico no vírico en una célula. El virus puede ser un bacteriófago, un adenovirus, etc.
Una "partícula de transducción no replicativa" se refiere a un virus que puede liberar una molécula de ácido nucleico no vírico en una célula, pero no puede empaquetar su propio genoma vírico replicado en la partícula de transducción. El virus puede ser un bacteriófago, un adenovirus, etc.
Un "plásmido" es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada de, y se puede replicar independientemente de, el ADN cromosómico dentro de una célula. Los plásmidos, que se encuentran más comúnmente como pequeñas moléculas circulares de ADN bicatenario en bacterias, a veces están presentes en arqueas y organismos eucariotas. Los plásmidos se consideran replicones, que se pueden replicar de forma autónoma dentro de un huésped adecuado.
Un "vector" es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para transportar artificialmente material genético exógeno a otra célula, donde se puede replicar y/o expresar.
Un "virus" es un pequeño agente infeccioso que se replica solo en el interior de las células vivas de otros organismos. Las partículas víricas (conocidas como viriones) incluyen dos o tres partes: i) el material genético hecho de moléculas de ADN o ARN que transportan información genética; ii) una cubierta proteínica que protege estos genes; y, en algunos casos, iii) una envoltura de lípidos que rodea la cubierta proteínica.
Como se usa en el presente documento, el término "complemento" se refiere a una secuencia no alterada que está en presencia de una secuencia idéntica que se ha alterado, o a la relación de la secuencia no alterada con la secuencia alterada. En un modo de realización, el complemento comprende un gen codificado en un polinucleótido en una célula que es funcional y con capacidad de expresión, y expresa una proteína con la misma función que un gen alterado en un bacteriófago antes de la alteración. En algunos modos de realización, el gen del complemento tiene más de un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el gen de bacteriófago alterado antes de la alteración, es decir, el gen de bacteriófago natural. En algunos modos de realización, el gen del complemento es idéntico al gen de bacteriófago alterado antes de la alteración, es decir, el gen de bacteriófago natural. En algunos modos de realización, el gen del complemento comprende una secuencia polinucleotídica que se ha eliminado del bacteriófago. En algunos modos de realización, el gen del complemento se refiere a un gen que codifica la maquinaria de empaquetamiento de un bacteriófago en un plásmido, donde el mismo gen se ha alterado en un bacteriófago. Por tanto, se requiere que el plásmido esté en presencia de un bacteriófago con un gen de la maquinaria de empaquetamiento mutado para proporcionar la maquinaria de empaquetamiento necesaria para empaquetar un polinucleótido en una partícula de transducción. Como se usa en el presente documento, el término "actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento" se refiere a uno o más polipéptidos cruciales para la interacción con una secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento para empaquetar un polinucleótido en una partícula de transducción. En algunos modos de realización se requiere un par de genes de terminasa para dicha interacción, en los que cada terminasa codifica una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento. En algunos modos de realización, la actividad enzimática está codificada por un gen terS y/o terL de un bacteriófago $11 o $80a de S. aureus, un gen terA y terB de un bacteriófago $Ef11 de E. faecalis o un gen pacA y pacB del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. En estos modos de realización, cada uno del par de genes de terminasa expresa una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento, y se requiere una versión funcional de ambos para empaquetar un polinucleótido con el sitio de inicio del empaquetamiento. En algunos modos de realización, la alteración de uno de los genes de una pluralidad de genes asociados con una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento elimina la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento. En algunos modos de realización, los dos de un par de genes de terminasa están alterados en el bacteriófago, lo que altera, por tanto, el conjunto completo de genes que codifican la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento en el bacteriófago.
"MRSA" se refiere a Staphylococcus aureus resistente a meticilina.
"MSSA" se refiere a Staphylococcus aureus sensible a meticilina.
El término "mejorar" se refiere a cualquier resultado terapéuticamente beneficioso en el tratamiento de un estado de enfermedad, por ejemplo, un estado de enfermedad, que incluye profilaxis, disminución de la gravedad o progresión, remisión o cura de la misma.
El término "in situ" se refiere a procesos que se producen en una célula viva que crece separada de un organismo vivo, por ejemplo, que crece en cultivo hístico.
El término "in vivo" se refiere a procesos que se producen en un organismo vivo.
El término "mamífero", como se usa en el presente documento, incluye tanto humanos como no humanos e incluye, pero no se limita a, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos.
En general, "G", "C", "A" y "U" representan cada uno un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. "T" y "dT" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxirribonucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente a continuación, o a un resto de remplazo sustituto. El experto en la técnica sabe muy bien que la guanina, la citosina, la adenina y el uracilo se pueden remplazar por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de emparejamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva dicho resto de remplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base se puede emparejar con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina se pueden remplazar en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden dichos restos de remplazo son modos de realización de la invención.
Como se usa en el presente documento, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos de hibridar y formar una estructura bicatenaria en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto en la técnica. Las secuencias complementarias también se describen como unidas entre sí y caracterizadas por afinidades de unión.
Por ejemplo, una primera secuencia de nucleótidos se puede describir como complementaria de una segunda secuencia de nucleótidos cuando las dos secuencias hibridan (por ejemplo, se reasocian) en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación incluyen temperatura, fuerza iónica, pH y concentración de disolvente orgánico para las etapas de reasociación y/o lavado. El término "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones en las que una primera secuencia de nucleótidos hibridará preferentemente con su secuencia diana, por ejemplo, una segunda secuencia de nucleótidos y, en menor medida, o en absoluto, a otras secuencias. Las condiciones de hibridación rigurosas dependen de la secuencia y son diferentes con diferentes parámetros ambientales. En general, las condiciones de hibridación rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia de nucleótidos a una fuerza iónica y pH definidos. La Tf es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que un 50 % de las primeras secuencias de nucleótidos hibridan con una secuencia diana perfectamente emparejada. Una guía extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, cap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. ("Tijssen"). Se pueden aplicar otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente pertinentes que se pueden encontrar dentro de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Esto incluye el emparejamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Dichas secuencias se pueden denominar "completamente complementarias" entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero en general no más de 4, 3 o 2 pares de bases con emparejamiento erróneo tras la hibridación, mientras que conservan la capacidad de hibridar en las condiciones más pertinentes para su aplicación final. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para formar, tras la hibridación, uno o más salientes monocatenarios, dichos salientes no se considerarán emparejamientos erróneos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria a la del oligonucleótido más corto, aún se puede denominar "completamente complementario" para los propósitos descritos en el presente documento.
Las secuencias "complementarias", como se usan en el presente documento, también pueden incluir, o estar formadas en su totalidad por, pares de bases distintos de Watson y Crick y/o pares de bases formados por nucleótidos no naturales y modificados, con la condición de que los requisitos anteriores con respecto a su capacidad de hibridación se cumplan. Dichos pares de bases distintos de Watson y Crick incluyen, pero sin limitarse a, el emparejamiento de bases oscilantes o de Hoogstein G:U.
Los términos "complementario", "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" en el presente documento se pueden usar con respecto al emparejamiento de bases entre dos hebras de un ARNbc, o entre la hebra de antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, entre hebras complementarias de una secuencia de ARN monocatenario o una secuencia de ADN monocatenario, como se entenderá a partir del contexto de su uso.
Como se usa en el presente documento, una "estructura bicatenaria" comprende dos secuencias de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias. Las secuencias complementarias en una construcción de ácido nucleico, entre dos transcritos, entre dos regiones dentro de un transcrito o entre un transcrito y una secuencia diana pueden formar una "estructura bicatenaria". En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en el presente documento, cada una o ambas de las hebras también pueden incluir al menos un nucleótido que no es ribonucleótido, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Las dos hebras que forman la estructura bicatenaria pueden ser partes diferentes de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras forman parte de una molécula más grande y, por lo tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura bicatenaria, la cadena de ARN de conexión se denomina "bucle de horquilla". Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura bicatenaria, la estructura de conexión se denomina "conector". Las hebras de ARN pueden tener el mismo número o un número diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta de la estructura bicatenaria menos cualquier saliente que esté presente en la estructura bicatenaria. En general, la estructura bicatenaria tiene entre 15 y 30 o entre 25 y 30, o entre 18 y 25, o entre 19 y 24, o entre 19 y 21, o 19, 20 o 21 pares de bases de longitud. En un modo de realización, la estructura bicatenaria tiene 19 pares de bases de longitud. En otro modo de realización, la estructura bicatenaria tiene 21 pares de bases de longitud. Cuando se usan dos ARNip diferentes en combinación, las longitudes de la estructura bicatenaria pueden ser idénticas o pueden diferir.
Como se usa en el presente documento, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la hebra de antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los emparejamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, en general están en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de los 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
El término "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para los expertos) o por inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de "identidad" puede existir en una región de la secuencia que se está comparando, por ejemplo, en un dominio funcional o, de forma alternativa, existir en toda la longitud de las dos secuencias que se van a comparar. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.
Se puede llevar a cabo la alineación óptima de secuencias para su comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al., más abajo).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa informático para realizar los análisis por BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
El término "cantidad suficiente" significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para producir una señal detectable de una célula.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que es eficaz para mejorar un síntoma de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una "cantidad profilácticamente efectiva", ya que la profilaxis se puede considerar un tratamiento.
Se debe tener en cuenta que, como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un(o)", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.
II. Ciclo lisóaeno y lítico de virus
Los virus experimentan ciclos lisógenos y líticos en una célula huésped. Si se adopta el ciclo lisógeno, el cromosoma del fago se puede integrar en el cromosoma bacteriano, o puede establecerse por sí mismo como un plásmido estable en el huésped, donde puede permanecer inactivo durante largos periodos de tiempo. Si se induce el lisógeno, el genoma del fago se escinde del cromosoma bacteriano e inicia el ciclo lítico, que culmina en la lisis de la célula y la liberación de partículas de fago. El ciclo lítico da lugar a la producción de nuevas partículas de fago que se liberan por lisis del huésped.
Determinados fagos moderados pueden presentar actividad lítica, y la propensión a esto puede variar con diversas bacterias huésped. Para ilustrar este fenómeno, se examinó la actividad lítica de dos fagos de S. aureus moderados en diez aislados clínicos de MRSA por medio de un ensayo en placa (tabla 1). El fago $11 presentó actividad lítica en 10 de los 10 aislados clínicos de MRSA y $80a presentó actividad lítica en seis de los 10 aislados clínicos de MRSA. Por tanto, se puede esperar que los ensayos indicadores que dependen del ciclo lisógeno natural de los fagos presenten actividad lítica esporádicamente.
Tabla 1: Actividad lítica (indicada por la letra "x") de los fagos moderados é11 y Ó80a de S. aureus en diez aislados clínicos de MRSA
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Además, los ensayos indicadores basados en virus, tales como los indicadores basados en fagos, pueden experimentar reactividad limitada (es decir, inclusión analítica) debido a los límites en la gama de huéspedes de los fagos provocados por mecanismos de resistencia a los fagos basados en el huésped y derivados del profago. Estos mecanismos de resistencia están dirigidos al ácido nucleico del fago natural que pueden dar como resultado la degradación o la inhibición de otro modo del ADN y las funciones del fago. Dichos mecanismos de resistencia incluyen sistemas de restricción que escinden el ADN del fago y sistemas de CRISPR que inhiben los transcritos derivados del fago.
Tanto la actividad lítica como la resistencia a los fagos pueden inhibir los ensayos basados en fagos indicadores. La actividad lítica puede inhibir la señal al destruir o inhibir de otro modo la capacidad de la célula de generar una señal detectable y, por tanto, afectar a los límites de detección al reducir la cantidad de señal detectable o evitar la generación de una señal detectable. Los mecanismos de resistencia a fagos pueden limitar la gama de huéspedes del fago y limitar la inclusión del indicador basado en fago, afectando de forma similar a los límites de detección al reducir la cantidad de señal detectable o evitar la generación de una señal detectable. Tanto la actividad lítica como la resistencia a fagos provocadas por la incorporación del ADN del fago en un fago indicador pueden dar lugar a resultados falsos negativos en ensayos que incorporan estos indicadores de fagos.
III. Procedimientos para producir partículas de transducción no replicativas (NRTP)
Procedimientos basados en alteraciónlcomplementación para producir partículas de transducción no replicativas.
En el presente documento se divulgan sistemas de empaquetamiento de partículas de transducción no replicativas basados en la alteración de un componente del genoma de un virus que la maquinaria de empaquetamiento vírica reconoce como el elemento desde el que se inicia el empaquetamiento genómico durante la producción vírica. En un modo de realización, esta alteración altera un sitio de inicio del empaquetamiento de un bacteriófago, y también altera una función terminasa. Los ejemplos de los elementos alterados incluyen la secuencia del sitio pac de bacteriófagos de tipo pac y la secuencia del sitio cos de bacteriófagos de tipo cos. En un modo de realización, cuando la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento dentro del fago se altera, el fago no puede producir terminasas funcionales. En un ejemplo, el sitio pac se codifica dentro de una secuencia del gen pacA, y las funciones terminasa requieren una PacA y una PacB funcionales. En el modo de realización, el ADN plasmídico se empaqueta en una cápside de fago complementando dichas terminasas alteradas e incluyendo un sitio de inicio del empaquetamiento reconocible en el ADN plasmídico. El bacteriófago puede ser cualquier bacteriófago, tal como un bacteriófago P1 o $EF11 de Enterobacteriaceae, o un bacteriófago $80a o un bacteriófago $11 de S. aureus.
Los sitios de inicio del empaquetamiento a menudo se encuentran dentro de regiones codificantes de genes que son esenciales para la producción de virus. En algunos modos de realización, una región del genoma del bacteriófago se altera por una inserción, remplazo, deleción o mutación que altera el sitio de inicio del empaquetamiento. Los ejemplos de alteraciones que logran esto incluyen, pero no se limitan a, un acontecimiento de intercambio alélico que remplaza una secuencia en el genoma del bacteriófago que contiene la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento por otra secuencia, tal como la de un gen de resistencia a antibióticos, o la deleción completa de los genes de terminasa pequeños y grandes. En un ejemplo que emplea los genes de terminasa pacA y pacB, pacA se puede alterar de manera que cause efectos polares que también alteren la expresión de pacB y/o la función terminasa global mediada por PacA y PacB. Otros ejemplos pueden incluir genes de terminasa, también pueden incluir genes terS y terL del bacteriófago $11 o $80a de S. aureus, o los genes terS y terL del bacteriófago $Ef11 de E. faecalis. En un modo de realización, un gen de terminasa incluye SEQ ID NO: 10, un gen pacA de P1 en el que una parte de la secuencia del gen que contiene el sitio pac se ha remplazado por un gen de resistencia a kanamicina. La figura 1 ilustra un ejemplo de la alteración del gen pacA en el bacteriófago P1 mediante la inserción de un gen de resistencia a kanamicina dentro del gen pacA por medio de intercambio alélico.
En un ejemplo, el genoma de una célula se lisogeniza con un genoma vírico donde se ha alterado el sitio de inicio del empaquetamiento. En algunos modos de realización, la célula puede ser una célula de E. coli, una célula de S. aureus o una célula de E. faecalis. La célula puede ser gramnegativa o grampositiva. Se introduce un plásmido complementario (o molécula de ácido nucleico indicadora) en la célula, y el ADN plasmídico incluye al menos el gen que se ha alterado en el bacteriófago, así como la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento y, opcionalmente, genes adicionales del bacteriófago y un gen indicador, que puede codificar un marcador detectable y/o seleccionable. El plásmido se puede construir usando procedimientos encontrados en la solicitud internacional n.° WO2014/160418. En algunos modos de realización, la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento incluye un sitio pac o un sitio cos. En un modo de realización, la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento incluye la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Uno o más genes del plásmido se pueden enlazar de forma funcional a un promotor, tal como un promotor inducible (que se puede inducir cuando se inicia el empaquetamiento induciendo el bacteriófago). En algunos modos de realización, el promotor puede ser un promotor natural de un gen de terminasa pequeño o un gen de terminasa grande. En un modo de realización, el promotor natural puede estar controlado por el bacteriófago y, por tanto, actúa eficazmente como un promotor condicional inducido durante el empaquetamiento. En un modo de realización, el promotor comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9.
La figura 2 ilustra un esquema de un plásmido que porta los genes pacA y pacB. La figura 3 ilustra un ejemplo del diseño y la función de un sistema de empaquetamiento compuesto por una célula de E. coli lisogenizada con el bacteriófago P1 que tiene un gen pacA alterado. La célula también porta un plásmido que contiene los genes pacA y pacB. En un modo de realización, los genes pacA y pacB en el plásmido derivan del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. Cuando el virus mutado experimenta un ciclo lítico, las proteínas de empaquetamiento víricas producidas a partir del genoma del bacteriófago o (si está alterado) del plásmido complementario, empaquetan un replicón del ADN plasmídico en la unidad de empaquetamiento debido a su sitio de inicio del empaquetamiento, y se producen partículas de transducción no replicativa que portan el ADN plasmídico replicado.
En un modo de realización, el replicón es un replicón lítico del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. El replicón también puede ser un replicón pBHR1 o un derivado del replicón pBHR1, derivado de un origen de replicación del plásmido pT181 de S. aureus, derivado de un origen de replicación del plásmido repB de Enterococcus o derivado de un origen de replicación del plásmido pDL278 de Enterococcus. En otro modo de realización, el replicón incluye un promotor P53 controlado por represor C1, una molécula de antisentido del promotor P53, un gen repL y una deleción sin cambio de pauta de lectura de un gen kilA. Un ejemplo de un replicón tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
En algunos modos de realización, es preferente que la interrupción/complementación se diseñe de modo que no exista homología entre el ADN vírico mutado y el ADN exógeno complementario. Esto se debe a que la falta de homología entre el ADN vírico mutado y el ADN exógeno complementario evita la posibilidad de recombinación homóloga entre las dos moléculas de a Dn , que puede dar como resultado la reintroducción de una secuencia de empaquetamiento en el genoma del virus. Para lograr una falta de homología, una estrategia es eliminar todo el gen (o genes) que contiene(n) la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento del genoma del virus y, a continuación, complementar este gen con una molécula de ADN exógeno que preferentemente no contiene más que exactamente la secuencia de ADN que se eliminó del virus. En esta estrategia, la molécula de ADN complementaria se diseña para expresar el gen que se eliminó del virus. Se proporciona otro ejemplo de dicho sistema usando el bacteriófago $80a, un fago de tipo pac. El genoma del fago se lisogeniza en una célula bacteriana huésped, y el genoma del fago incluye un gen de terminasa pequeño donde se ha eliminado el sitio pac de un profago $80a de tipo pac. Un plásmido que incluye un gen de terminasa pequeño complementario con un sitio pac natural se transforma en la célula. Cuando se induce el ciclo lítico del profago lisogenizado, el sistema de empaquetamiento del bacteriófago empaqueta el ADN plasmídico en componentes estructurales de bacteriófago de la descendencia, en lugar de empaquetar el ADN del bacteriófago natural. El sistema de empaquetamiento produce, por tanto, partículas de transducción no replicativas que portan ADN plasmídico.
En otro modo de realización, una región del genoma del bacteriófago se altera mediante una inserción que altera el sitio de inicio del empaquetamiento. En un modo de realización, la alteración comprende un gen indicador incorporado en el genoma del bacteriófago. En un modo de realización, la alteración comprende un marcador de resistencia y un gen indicador incorporado en el genoma del bacteriófago. En un modo de realización, la alteración se logra mediante un acontecimiento de intercambio alélico que remplaza o altera una secuencia en el genoma del bacteriófago con un gen indicador. En un modo de realización, la alteración se logra mediante un acontecimiento de intercambio alélico que remplaza o altera una secuencia en el genoma del bacteriófago con un marcador de resistencia y un gen indicador. En algunos modos de realización, el marcador de resistencia y/o el gen indicador están bajo el control de un promotor constitutivo.
La figura 4 ilustra un ejemplo del diseño y la función de un sistema de empaquetamiento compuesto por una célula de E. coli que comprende el bacteriófago P1 que tiene un gen pacA alterado en el que los genes kan y luxAB se han insertado en la secuencia del sitio pac. Como en la figura 3, la célula también porta un plásmido que contiene los genes pacA y pacB. Por lo tanto, si se produce recombinación entre el bacteriófago y el plásmido, el plásmido replicado insertado en la cápside de P1 para formar la NRTP todavía comprenderá un gen indicador.
En un modo de realización, el gen indicador codifica un marcador detectable o un marcador seleccionable. En otro modo de realización, dicho gen indicador se selecciona del grupo que consiste en enzimas que median reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), enzimas que median reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), péptidos de afinidad (His-tag, 3X-FLAG) y marcadores seleccionables (ampC, tet(M), CAT, erm). En un modo de realización, el gen indicador es luxA. En algunos modos de realización, el marcador de resistencia comprende un gen de resistencia a antibióticos. En algunos modos de realización, el marcador de resistencia es un gen de resistencia a kanamicina (kan). En algunos modos de realización, el promotor constitutivo comprende Pblast. En algunos modos de realización, la alteración del genoma de bacteriófago se logra mediante un acontecimiento de intercambio alélico que remplaza o altera una secuencia en el genoma del bacteriófago que contiene la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento.
En algunos modos de realización, la alteración del genoma de bacteriófago se logra mediante un acontecimiento de intercambio alélico que remplaza o altera una secuencia en el genoma del bacteriófago que contiene la secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento con un gen de resistencia a kanamicina (kan) y los genes de luciferasa bacteriana (luxAB) bajo el control de un promotor constitutivo (Pblast). En un modo de realización, el intercambio alélico se logra de manera análoga a la representada en la figura 1, en la que se transfieren un indicador o un indicador y un marcador de resistencia.
En un modo de realización, un par de genes de terminasa en un genoma bacteriófago, por ejemplo, pacA y pacB, terA y terB, o terS y terL, se alteran de manera que cause efectos polares que también alteren la expresión de uno de los genes de terminasa y/o la función terminasa general mediada por los genes de terminasa. En un modo de realización se proporciona una construcción que comprende kan y luxAB insertados en los locus del gen pacA en SEQ ID NO: 12. En un modo de realización, el bacteriófago alterado se complementa con un plásmido que comprende genes de terminasa, por ejemplo, pacA y pacB, terA y terB o terS y terL, del genoma del bacteriófago. En un modo de realización, el plásmido se introduce en una célula lisogenizada con el bacteriófago que tiene los genes de terminasa alterados. En un modo de realización, la célula es una célula de E. coli. En un modo de realización, el bacteriófago es el bacteriófago P1 de Enterobacteríaceae. En un modo de realización, los genes de terminasa en el plásmido se derivan del bacteriófago P1 de Enterobacteríaceae, es decir, los genes pacA y pacB. Cuando el virus mutado experimenta un ciclo lítico, las proteínas de empaquetamiento víricas producidas a partir del genoma del bacteriófago o (si está alterado) del plásmido complementario, empaquetan un replicón del ADN plasmídico en la unidad de empaquetamiento debido a que contiene un sitio de inicio del empaquetamiento, y se producen partículas de transducción no replicativa que portan el ADN plasmídico replicado.
En estos sistemas de deleción/complementación se pueden producir dos especies de partículas de transducción que incluyen (1) partículas de transducción no replicativas que portan ADN plasmídico y (2) partículas de transducción no replicativas que portan ADN de P1, donde las últimas se pueden producir debido a la recombinación entre el ADN plasmídico y el ADN de P1. En un modo de realización donde el mutante de P1 no contiene luxAB insertado en el genoma de P1, las partículas de transducción no replicativas que portan ADN de P1 no contribuyen a la producción de señales cuando estas partículas de transducción liberan a Dn en las células diana. Sin embargo, en un modo de realización donde el mutante de P1 contiene luxAB insertado en el genoma de P1, las partículas de transducción no replicativas que portan ADN de P1 contribuyen a la producción de señales cuando estas partículas de transducción liberan ADN en las células diana.
Por tanto, un modo de realización donde los genes luxAB se insertan en el genoma de P1 da como resultado un sistema indicador de partículas de transducción no replicativas mejorado.
IV. Indicadores
En algunos modos de realización, las NRTP y las construcciones de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico indicadora que incluye un gen indicador. En algunos modos de realización, el bacteriófago de la invención incluye un gen indicador. El gen indicador puede codificar una molécula indicadora, y la molécula indicadora puede ser un marcador detectable o seleccionable. En determinados modos de realización, el gen indicador codifica una molécula indicadora que produce una señal detectable cuando se expresa en una célula.
En determinados modos de realización, la molécula indicadora puede ser una molécula indicadora fluorescente, tal como, pero sin limitarse a, una proteína fluorescente verde (GFP), una GFP potenciada, una proteína fluorescente amarilla (YFP), una proteína fluorescente azul verdosa (CFP), una proteína fluorescente azul (BFP), una proteína fluorescente roja (RFP) o mCherry, así como proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano.
En otros modos de realización, la molécula indicadora puede ser una enzima que media reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc, etc.). Las moléculas indicadoras pueden incluir una luciferasa bacteriana, una luciferasa eucariota, una enzima adecuada para detección colorimétrica (lacZ, HRP), una proteína adecuada para inmunodetección, tal como péptidos de afinidad (His-tag, 3X-FLAG), un ácido nucleico que funciona como un aptámero o que presenta actividad enzimática (ribozima), o un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibióticos (ampC, tet(M), CAT, erm). Se pueden usar otras moléculas indicadoras conocidas en la técnica para producir señales para detectar ácidos nucleicos o células diana.
En otros aspectos, la molécula indicadora comprende una molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, la molécula indicadora es un aptámero con actividad de unión específica o que presenta actividad enzimática (por ejemplo, aptazima, ADNzima, ribozima).
Los indicadores y ensayos indicadores se describen más detalladamente en la sección V del presente documento.
Ensayos de NRTP e indicadores
Ensayo indicador de inductor
En algunos modos de realización, la invención comprende procedimientos para el uso de NRTP como moléculas indicadoras para su uso con inductores endógenos o naturales que se dirigen a promotores de genes dentro de células viables. Las NRTP de la invención se pueden genomanipular usando los procedimientos descritos en la sección III y a continuación en los ejemplos 1-2.
En algunos modos de realización, el procedimiento comprende emplear una NRTP como indicador, en el que la NRTP comprende un gen indicador que está enlazado de forma funcional a un promotor inducible que controla la expresión de un gen diana dentro de una célula diana. Cuando la NRTP que incluye el gen indicador se introduce en la célula diana, la expresión del gen indicador es posible por medio de la inducción del promotor del gen diana en la molécula de ácido nucleico indicadora.
La figura 5 representa un locus genómico de una célula diana 500 con dos genes, un gen que codifica un inductor 502 y un gen diana 503. También representa una molécula de ácido nucleico indicadora 504 que incluye un gen indicador 505 que está enlazado de forma funcional al promotor 506 del gen diana de la célula diana. La molécula de ácido nucleico indicadora 504 se puede introducir en la célula por medio de una NRTP. En la célula natural, cuando el gen inductor 502 se expresa y produce la proteína inductora 507, la proteína inductora 507 puede inducir el promotor 506 del gen diana que está enlazado de forma funcional al gen diana, provocando, por tanto, la expresión del gen diana y la producción del producto génico diana 508.
Cuando la molécula de ácido nucleico indicadora 504 está presente dentro del organismo diana, el inductor 507 también puede inducir el promotor 506 del gen diana presente dentro de la molécula de ácido nucleico indicadora 504, provocando, por tanto, la expresión del gen indicador 505 que da como resultado la producción de una molécula indicadora 509 que puede generar una señal detectable.
Por tanto, la producción de una señal detectable a partir de la molécula indicadora 509 es indicativa de la presencia de la célula, basada en la presencia de la proteína inductora 507 dentro de una célula diana.
Sistema indicador de VanR
En un modo de realización, el sistema indicador incluye NRTP que comprende una molécula de ácido nucleico indicadora (por ejemplo, plásmido). La molécula de ácido nucleico indicadora se puede construir para detectar VanR, el inductor del promotor del gen de resistencia a vancomicina (vanA) en Enterococcus faecium (o E. faecalis). El plásmido indicador porta un gen indicador que está enlazado de forma funcional al promotor del gen vanA.
La figura 6 describe el diseño y la función de un sistema indicador de VanR. La figura 6 representa una región del transposón Tn1546601 que puede estar presente en E. faecium. El transposón Tn1546 puede incluir el gen inductor vanR 602 y el gen diana vanA 603. También se representa en la figura una molécula de ácido nucleico indicadora 604 que se puede empaquetar en una NRTP e introducir en la célula. La molécula de ácido nucleico indicadora 604 incluye un gen indicador 605 que está enlazado de forma funcional a un promotor Ph 606 que controla la expresión del operón vanHAX que incluye el gen vanA. En la célula natural, cuando el gen vanR 602 se expresa y produce la proteína VanR 607, VanR puede inducir Ph 606 en el transposón Tn1546, provocando, por tanto, la expresión del gen vanA y produciendo, por tanto, la proteína VanA 608. Cuando la molécula de ácido nucleico indicadora 603 (vector) está presente dentro del organismo diana, VanR también puede inducir Ph 606 dentro de la molécula de ácido nucleico indicadora 603, provocando, por tanto, la expresión de una molécula indicadora 609. Por tanto, la producción de una molécula indicadora es indicativa de la presencia de VanR dentro de una célula diana.
Los ejemplos de promotores que son adecuados para el desarrollo de un ensayo VRE incluyen: el promotor del gen vanA y un promotor del gen vanB. Arthur, M., et al., The VanS sensor negatively Controls VanR-mediated transcriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tn1546 and related elements in the absence of induction. J. Bacteriol., 1997. 179(1): p. 97-106.
Sistema indicador de TcdD
En otro modo de realización de este sistema se introduce una molécula de ácido nucleico indicadora en una célula usando una NRTP. La molécula de ácido nucleico indicadora se puede construir para detectar TcdD, el inductor de los promotores de los genes de las toxinas A y B (tcdA y tcdB, respectivamente) de C. difficile. La molécula de ácido nucleico indicadora incluye un gen indicador que está enlazado de forma funcional al promotor del gen tcdA.
La figura 7 describe el diseño y la función de un sistema indicador de TcdD, de acuerdo con un modo de realización de la invención. La figura 7 representa una región del transposón PaLoc 701 que puede estar presente en C. difficile. El transposón PaLoc puede contener el gen tcdD 702 y el gen diana tcdA 703. También se representa en la figura una molécula de ácido nucleico indicadora 704 (por ejemplo, vector) que se introduce en la célula usando una NRTP. La molécula de ácido nucleico indicadora 704 incluye el gen indicador 705 que está enlazado de forma funcional al promotor del gen tcdA (PtcdA) 706.
En la célula natural, cuando el gen tcdD se expresa y produce la proteína TcdD 707, TcdD puede inducir PtcdA 706 en el transposón PaLoc 701, provocando, por tanto, la expresión del gen tcdA 703 y produciendo, por tanto, la proteína toxina A 708.
Cuando la molécula de ácido nucleico indicadora 704 está presente dentro del organismo diana, TcdD también puede inducir PtcdA 706 dentro del vector indicador, provocando, por tanto, la expresión de una molécula indicadora 709. Por tanto, la producción de una molécula indicadora 709 es indicativa de la presencia de TcdD dentro de una célula diana.
Los ejemplos de promotores adecuados para el desarrollo de un ensayo con C. difficile incluyen: el promotor del gen tcdA y el promotor del gen tcdB. Karlsson, S., et al., Expression of Clostridium difficile Toxins A and B and Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun., 2003. 71(4): p. 1784-1793.
Células diana e inductores: Las células diana pueden incluir dianas de células eucariotas y procariotas e inductores asociados.
Sistemas de liberación de vector: La liberación del vector que contiene el ADN recombinante se puede realizar mediante sistemas abiológicos o biológicos. Incluyendo, pero sin limitarse a liposomas, partículas similivíricas, partículas de transducción derivadas de fagos o virus, y conjugación.
Sistema indicador de SarS basado en bacteriófago
En otro modo de realización de la invención se construye una molécula de ácido nucleico indicadora para detectar SarS, el inductor del promotor del gen de la proteína A (spa) en S. aureus. La molécula de ácido nucleico indicadora se puede introducir en la célula en una NRTP e incluye los genes de luciferasa bacteriana luxA y luxB enlazados de forma funcional al promotor del gen spa (Pspa). La molécula de ácido nucleico indicadora se libera en S. aureus por medio de una NRTp , por ejemplo. Si SarS está presente en la célula, inducirá la expresión de los genes luxAB, produciendo, por tanto, la enzima luciferasa que puede generar una señal luminiscente.
La figura 8 describe el diseño y la función de un sistema indicador de SarS, de acuerdo con un modo de realización de la invención. La figura 8 representa una región del genoma de S. aureus 801 que contiene el gen sarS 802 y el gen spa 803. También se representa en la figura una molécula de ácido nucleico indicadora (por ejemplo, vector) 804 liberada por NRTP en la célula y que incluye los genes indicadores luxAB 805 que están enlazados de forma funcional al promotor Pspa 806 que controla la expresión del gen spa 803.
En la célula natural, cuando el gen sarS 802 se expresa, produciendo la proteína SarS 807, la proteína puede inducir Pspa 806 en el transposón del genoma de S. aureus, provocando, por tanto, la expresión del gen spa 803 y produciendo la proteína A 808.
Cuando la molécula de ácido nucleico indicadora 804 está presente dentro del organismo diana, SarS 807 también puede inducir Pspa 806 dentro de la molécula de ácido nucleico indicadora 804, provocando, por tanto, la expresión de luxAB que da como resultado la producción de la enzima luciferasa 809 que puede generar una señal luminiscente. Por tanto, la producción de luciferasa es indicativa de la presencia de SarS dentro de una célula diana. Otros sistemas indicadores para su uso con las NRTP descritas en el presente documento se describen en la publicación internacional PCT número: WO 2014/160418.
Mecanismo de cambio conformacional por represión en cis de la secuencia indicadora y por unión de un transcrito diana
Los mecanismos generales empleados en la invención son interacciones intermoleculares de moléculas de ácido nucleico que pueden dar como resultado dos mecanismos posteriores: (1) un cambio conformacional en la estructura secundaria de las moléculas de ácido nucleico y (2) un acontecimiento de escisión. En el presente documento se describen procedimientos para diseñar transcritos indicadores que pueden experimentar un cambio conformacional entre una conformación reprimida en cis y una conformación desreprimida, de modo que el cambio conformacional se induce por la unión de un transcrito diana al transcrito indicador.
Como se describe anteriormente, un transcrito indicador puede comprender una secuencia indicadora y diseñarse de modo que la traducción de la secuencia del gen indicador esté bloqueada por la represión en cis del sitio de unión al ribosoma (RBS) del gen indicador.
En algunos modos de realización, las siguientes herramientas se pueden usar para diseñar los transcritos indicadores de la invención.
1) La estructura secundaria de ARN se calcula usando un programa de estructura secundaria, tal como Mfold disponible en un servidor mantenido por The RNA Institute College of Arts and Sciences, University at Albany, State University of New York (servidor web Mfold para el plegamiento de ácidos nucleicos y la predicción de hibridación. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)) (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
2) Las interacciones intermoleculares de ARN se calculan usando un programa informático tal como la predicción de interacción de ARN-ARN usando programación en enteros (RNA-RNA InterACTion prediction using Integer Programming, RactIP) disponible en un servidor mantenido por la Graduate School of Information Science, Nara Institute of Science and Technology (NAIST), Departamento de Biociencias e Informática, Universidad Keio de Japón (http://rna.naist.jp/ractip/).
3) La estructura secundaria de ARN se visualiza usando la miniaplicación de visualización para ARN (Visualization Applet for RNA, VARNA) (http://varna.lri.fr/), que es una miniaplicación ligera de Java especializada en dibujar la estructura secundaria de ARN.
Se puede generar una estructura secundaria del transcrito diana basada en la conformación de mínima energía calculada por MFold y visualizada con VARNA.
Las regiones de ARNmc o regiones diana se pueden identificar dentro del transcrito diana que puede ser ideal para la unión a un transcrito indicador. En algunos casos, la estructura secundaria del transcrito diana incluye una secuencia consenso o secuencia de bucle que se puede unir a una parte de la secuencia indicadora. Por ejemplo, en el transcrito de mecA de S. aureus resistente a meticilina existe un bucle terminal que incluye una secuencia consenso YUNR ("UUGG") que se puede usar para la unión a una secuencia de represión en cis de un transcrito indicador. El análisis de la estructura secundaria del transcrito diana puede revelar estas una o más regiones de ARNmc que pueden ser adecuadas para la unión a una secuencia de represión en cis. La secuencia de represión en cis del transcrito indicador se puede diseñar, a continuación, para que se una a estas una o más regiones de ARNmc.
En algunos modos de realización, la secuencia de represión en cis se puede diseñar para que se una al RBS de la secuencia indicadora en el transcrito indicador y formar una estructura en tallo-bucle dentro del transcrito indicador, de modo que la secuencia de represión en cis bloquee la unión de una ARN-polimerasa al RBS de la secuencia indicadora. Tras la unión de la secuencia de represión en cis a la región de ARNmc del transcrito diana, el RBS de la secuencia indicadora se puede exponer y se puede iniciar la traducción de la secuencia indicadora.
En algunos modos de realización, la secuencia de represión en cis del transcrito indicador se puede diseñar para colocarla en el extremo 5' de la secuencia indicadora y diseñarla para que genere una estructura en tallo-bucle en la secuencia indicadora, de modo que la secuencia de RBS de la secuencia indicadora se bloquee. La estructura en tallo-bucle de represión en cis se puede diseñar para que bloquee la secuencia de RBS en base a la conformación de mínima energía del transcrito indicador, calculada por MFold y visualizada con VARNA. Las interacciones intermoleculares predichas entre el transcrito diana y la secuencia de represión en cis del transcrito indicador se pueden calcular mediante RactIP y visualizar mediante VARNA. Se puede dibujar un diagrama para visualizar el emparejamiento de bases entre el transcrito diana y la secuencia de represión en cis del transcrito indicador, como se muestra en la figura 9.
La interacción puede incluir el emparejamiento de bases entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más nucleótidos en la secuencia diana y la secuencia de represión en cis. La unión complementaria entre las dos secuencias puede ser completamente complementaria, sustancialmente complementaria o parcialmente complementaria. El emparejamiento de bases puede ser a través de secuencias o regiones de nucleótidos contiguos dentro de las secuencias diana y de represión en cis, por ejemplo, como se muestra en la figura 9.
Transcritos
Como se describe anteriormente, un "transcrito" es una longitud de secuencia de nucleótidos (ADN o ARN) transcrita a partir de una secuencia molde o gen de ADN o ARN. El transcrito puede ser una secuencia de ADNc transcrito a partir de un molde de ARN o una secuencia de ARNm transcrito a partir de un molde de ADN. El transcrito se puede transcribir a partir de una construcción de ácido nucleico genomanipulado. El transcrito puede tener regiones de complementariedad dentro de sí mismo, de modo que el transcrito incluya dos regiones que pueden formar una estructura bicatenaria intramolecular. Una región se puede denominar "secuencia de represión en cis" que se une a y bloquea la traducción de una secuencia indicadora. Una segunda región del transcrito se denomina "secuencia indicadora" que codifica una molécula indicadora, tal como un marcador detectable o seleccionable.
Los transcritos de la invención pueden ser una secuencia de transcrito que puede ser de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. En otros modos de realización, el transcrito puede tener al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de represión en cis y la secuencia indicadora pueden ser de la misma longitud o de diferentes longitudes.
En algunos modos de realización, la secuencia de represión en cis está separada de la secuencia indicadora por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más nucleótidos espaciadores.
Vectores
En otro aspecto, los transcritos (incluyendo las secuencias de antisentido y de sentido) de la invención se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., publicación internacional PCT n.° WO 00/22113, Conrad, publicación internacional PCT n.° WO 00/22114 y Conrad, patente de EE. UU. n.° 6.054.299). Estas secuencias se pueden introducir como una construcción lineal, un plásmido circular o un vector vírico, incluyendo vectores basados en bacteriófagos, que se pueden incorporar y heredar como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transcrito también se puede construir para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
Las secuencias de transcrito puede transcribirlas un promotor localizado en el plásmido de expresión. En un modo de realización, las secuencias de represión en cis y las secuencias indicadoras se expresan como una repetición invertida unida por una secuencia polinucleotídica conectora de modo que el transcrito tenga una estructura en tallo y bucle.
Los vectores de expresión recombinantes se pueden usar para expresar los transcritos de la invención. Los vectores de expresión recombinantes son, en general, plásmidos de a Dn o vectores víricos. Los vectores víricos que expresan los transcritos se pueden construir basados en, pero sin limitarse a, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434) y Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus, así como otros conocidos en la técnica. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo las células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; patente de EE. UU. n.° 4.868.116; patente de EE. UU. n.° 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovíricos recombinantes que pueden transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula se pueden producir transfectando el genoma retrovírico recombinante en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 81:6349). Los vectores adenovíricos recombinantes se pueden usar para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769) y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección.
Se puede usar cualquier vector vírico que pueda aceptar las secuencias codificantes para el transcrito o los transcritos que se va(n) a expresar, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores víricos se puede modificar seudotipando los vectores con proteínas de la envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas víricas de la cápside, según corresponda.
Por ejemplo, los vectores lentivíricos presentados en la invención se pueden seudotipar con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), de la rabia, del Ébola, de Mokola y similares. Los vectores de AAV presentados en la invención se pueden preparar para que se dirijan a diferentes células genomanipulando los vectores para que expresen diferentes serotipos de proteínas de la cápside. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresen diferentes serotipos de proteínas de la cápside están dentro de las habilidades de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.
La selección de vectores víricos recombinantes adecuados para su uso en la invención, los procedimientos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar los transcritos en el vector y los procedimientos para liberar el vector vírico en las células de interés están dentro de las habilidades de la técnica. Véase, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; y Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406.
Los vectores víricos se pueden derivar de AV y AAV. Un vector de AV adecuado para expresar los transcritos presentados en la invención, un procedimiento para construir el vector de AV recombinante y un procedimiento para liberar el vector en células diana se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Vectores AAV adecuados para expresar los transcritos presentados en la invención, los procedimientos para construir el vector de AV recombinante y los procedimientos para liberar los vectores en las células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente de EE. UU. n.° 5.252.479; patente de EE. UU. n.° 5.139.941; solicitud de patente internacional n.° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional n.° WO 93/24641.
El promotor que dirige la expresión del transcrito en un plásmido de ADN o un vector vírico presentado en la invención puede ser una ARN-polimerasa I eucariótica (por ejemplo, promotor de ARN ribosómico), ARN-polimerasa II (por ejemplo, promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor de ARNnp de U1) o, en general, el promotor de ARN-polimerasa III (por ejemplo, el promotor de ARNnp de U6 o de ARN de 7SK) o un promotor procariótico, por ejemplo, el promotor de T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique la ARN-polimerasa T7 requerida para la transcripción a partir de un promotor de T7. El promotor también puede dirigir la expresión transgénica al páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).
Además, la expresión del transcrito se puede regular con precisión, por ejemplo, usando una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que es sensible a determinados reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa u hormonas en la circulación (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Dichos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión transgénica en células o en mamíferos incluyen la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la técnica podría elegir la secuencia reguladora/promotora apropiada en base al uso previsto del transgén de ARNbc.
En general, los vectores recombinantes que pueden expresar moléculas de transcrito se liberan como se describe a continuación, y persisten en las células diana. De forma alternativa, se pueden usar vectores víricos que proporcionen expresión transitoria de las moléculas de transcrito. Dichos vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresado, el transcrito se une al ARN diana y modula su función o expresión. La liberación de vectores que expresan el transcrito puede ser sistémica, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células diana explantadas del paciente seguida de reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmidos de ADN de expresión de transcrito se transfectan típicamente en células diana como un complejo con vehículos lipídicos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamine) o vehículos basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). La invención también contempla múltiples transfecciones lipídicas para atenuaciones mediadas por ARNbc dirigidas a diferentes regiones de un solo gen PROC o múltiples genes PROC durante un periodo de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en células huésped se puede verificar usando diversos procedimientos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP). La transfección estable de células ex vivo se puede garantizar usando marcadores que proporcionen a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a higromicina B.
La liberación del vector que contiene el ADN recombinante se puede realizar mediante sistemas abiológicos o biológicos. Incluyendo, pero sin limitarse a liposomas, partículas similivíricas, partículas de transducción derivadas de fagos o virus, y conjugación.
Indicadores para ensayo de transcrito
En algunos modos de realización, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia indicadora (por ejemplo, una secuencia de gen indicador). El gen indicador codifica una molécula indicadora que produce una señal cuando se expresa en una célula. En algunos modos de realización, la molécula indicadora puede ser un marcador detectable o seleccionable. En determinados modos de realización, la molécula indicadora puede ser una molécula indicadora fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde (GFP), una proteína fluorescente amarilla (YFP), una proteína fluorescente azul verdosa (CFP), una proteína fluorescente azul (BFP) o una proteína fluorescente roja (RFP). En otros modos de realización, la molécula indicadora puede ser una proteína quimioluminiscente.
Las moléculas indicadoras pueden ser una luciferasa bacteriana, una luciferasa eucariota, una proteína fluorescente, una enzima adecuada para detección colorimétrica, una proteína adecuada para inmunodetección, un péptido adecuado para inmunodetección o un ácido nucleico que funciona como un aptámero o que presenta actividad enzimática.
Los marcadores seleccionables también se pueden usar como indicador. El marcador seleccionable puede ser un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo.
EJEMPLOS
A continuación hay ejemplos de modos de realización específicos para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solo con propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se debe permitir, por supuesto, algún error experimental y desviación. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, procedimientos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a edición (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3.a Ed. (Plenum Press) Volúmenes A y B (1992).
Ejemplo 1: Sistema de empaquetamiento de alteración/complementación basado en intercambio alélico Lo siguiente es un ejemplo del diseño y la construcción de un sistema de empaquetamiento basado en alteración/complementación basado en intercambio alélico para producir partículas de transducción no replicativas. Los materiales utilizados para desarrollar el sistema de empaquetamiento se enumeran a continuación:
Cepas bacterianas:
• N1706, un lisógeno Tn9 c1-100 de P1 de la cepa K-12 de E. coli
Vectores:
• Y14439 (cadena principal de pBHR1)
Los siguientes números de acceso de GenBank (N.B., las secuencias denominadas por el número de acceso son las que figuran en la base de datos en la fecha de prioridad de esta solicitud) o las SEQ ID NO. se pueden usar para las secuencias de la cadena principal del vector y las secuencias de casete:
• X06758 (genes de luciferasa bacteriana luxAB)
• SEQ ID NO: 1 (genes pacA y pacB de P1 naturales que incluyen el promotor del gen pacA natural)
• SEQ ID NO: 2 (replicón lítico P1 que contiene el promotor P53 controlado por represor C1, la molécula de antisentido del promotor P53, los genes repL y una deleción en el mismo marco del gen kilA)
• SEQ ID NO: 11 (promotor Pblast que dirige la expresión de luxAB)
Construcción de N1706(pacA::Kan): cepa mutada de pacA, también conocida como cepa 1505: Una secuencia ejemplar de una secuencia mutada de pacA se muestra en SEQ ID NO: 10. La mutación se puede lograr construyendo un sustrato de intercambio alélico compuesto por el gen de resistencia a kanamicina flanqueado por secuencias del gen pacA que flanquean ellas mismas la secuencia del gen pacA que se desea remplazar. El sustrato de intercambio alélico se puede producir por medio de síntesis génica y, a continuación, remplazando la secuencia natural en N1706 e insertando el gen Kan por medio de un intercambio alélico. Se determinó que la alteración también alteraba la capacidad del fago P1 mutado de empaquetar el ADN. La inducción del fago mutado dio como resultado la eliminación del fago de la descendencia, como se determina al comparar los valores de fago P1 por medio de un ensayo en placa a partir de lisados celulares producidos al inducir el fago natural frente al fago mutado. Además, cuando se introducía el plásmido complementario que expresa el gen pacA en el lisógeno mutante de P1 y se inducía el fago mutante a partir del transformante, no se recuperaban partículas de transducción en el lisado, lo que indica que el fago no podía empaquetar el plásmido complementario a pesar de que complementaba el gen pacA y el sitio pac.
Construcción del plásmido complementario: El plásmido complementario contiene el origen de replicación pBHR1 que presenta una amplia actividad gramnegativa, un marcador seleccionable para espectinomicina, los genes pacA y pacB del bacteriófago P1 naturales enlazados de forma funcional a la secuencia promotora del gen pacA natural, los genes luxA y luxB de Aliivibrio fischeri enlazados de forma funcional al promotor constitutivo de blasticilina (Pblast) y el replicón lítico P1 que contiene el promotor P53 controlado por represor C1, la molécula de antisentido del promotor p53, los genes repL y una deleción sin cambio de pauta de lectura del gen kilA.
El plásmido se puede construir de una variedad de maneras que son conocidas por un experto en la técnica, incluyendo la obtención de casetes por medio de PCR de sus fuentes naturales o por medio de síntesis génica y ensamblaje del vector por medio de clonación tradicional basada en enzimas de restricción o técnicas alternativas tales como el ensamblaje de Gibson.
Sistema de empaquetamiento basado en complementación: El sistema de empaquetamiento incluye la cepa mutante de pacA 1505 complementada con el plásmido complementario. Como conoce un experto en la técnica, la manera de construir este sistema se puede lograr mediante transformación de 1505 con el plásmido complementario. El plásmido complementario se puede mantener en cultivos de 1505 transformada cultivando el transformante en presencia de 10 ug/ml de espectinomicina.
Producción de partículas de transducción que portan ADN plasmídico: Las partículas de transducción no replicativas que portan el plásmido complementario se pueden producir a partir de transformantes 1505 por medio de inducción térmica a 42 °C. La incubación a 42 °C da como resultado la inducción del ciclo lítico de P1 en el que el profago produce elementos estructurales del fago y empaqueta el ADN concatamérico del plásmido complementario formado por el replicón lítico en las partículas de fago de la descendencia. A diferencia de la complementación usando un plásmido complementario que solo expresaba el gen pacA que no daba como resultado la producción de partículas de transducción cuando los dos genes pacA y pacB se alteraban en el genoma del bacteriófago, el plásmido complementario que expresaba los dos genes pacA y pacB dio como resultado un lisado celular que contenía partículas de transducción no replicativas, consistiendo cada una de ellas en partículas de bacteriófago P1 que portan un concatámero lineal del plásmido complementario y, por tanto, demostrando que este plásmido complementario complementa con éxito la alteración del empaquetamiento.
Ejemplo 2: Sistema de empaquetamiento de alteración/complementación basado en intercambio alélico mejorado
En un ejemplo que emplea un bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae que comprende los genes de terminasa pacA y pacB, pacA se alteró de manera que provocara efectos polares que también alteran la expresión de pacB y/o la función terminasa global mediada por PacA y PacB. La construcción final en la que se insertan kan y luxAB en los locus del gen pacA se incluye en SEQ ID NO: 12.
El genoma del bacteriófago con pacAB alterado se complementó a continuación con el plásmido representado en la figura 2. La figura 4 ilustra el diseño y la función de un sistema de empaquetamiento compuesto por una célula de E. coli lisogenizada con el bacteriófago P1 que tiene un gen pacA alterado. La célula también contenía un plásmido que contiene los genes pacA y pacB. En este ejemplo, los genes pacA y pacB en el plásmido se derivaron del bacteriófago P1 de Enterobacteriaceae. Cuando el virus mutado estaba en el ciclo lítico, las proteínas de empaquetamiento víricas se producían a partir del plásmido complementario, que empaquetaba un replicón del ADN plasmídico en la unidad de empaquetamiento debido a su sitio de inicio del empaquetamiento, y se producían partículas de transducción no replicativas que portaban el ADN plasmídico replicado.
En estos sistemas de deleción/complementación se produjeron dos especies de partículas de transducción que incluyen (1) partículas de transducción no replicativas que portan ADN plasmídico y (2) partículas de transducción no replicativas que portan ADN de P1, donde las últimas se pueden producir debido a la recombinación entre ADN plasmídico y el ADN de P1. Cuando el mutante de P1 no contenía luxAB insertado en el gen pacA, las partículas de transducción no replicativas que portaban ADN de P1 no contribuían a la producción de señales cuando estas partículas de transducción liberaban ADN en las células diana. Sin embargo, cuando el mutante de P1 contenía luxAB insertado en el gen pacA, las partículas de transducción no replicativas que portaban ADN de P1 contribuían a la producción de señales cuando estas partículas de transducción liberaban ADN en las células diana (véase la figura 10).
Por lo tanto, cuando se insertan los genes luxAB en el genoma de P1 y se integran con el sistema generador de NRTP descrito en el presente documento, se ha proporcionado un sistema indicador de partículas de transducción no replicativas mejorado.
Lo siguiente proporciona detalles adicionales del diseño y construcción del sistema de empaquetamiento basado en alteración/complementación basado en intercambio alélico para producir partículas de transducción no replicativas descrito en este ejemplo.
Los materiales utilizados para desarrollar el sistema de empaquetamiento se enumeran a continuación:
Cepas bacterianas:
• N1706, un lisógeno Tn9 c1-100 de P1 de la cepa K-12 de E. coli
Vectores:
• Y14439 (cadena principal de pBHR1)
Los siguientes números de acceso de GenBank (N.B., las secuencias denominadas por el número de acceso son las que figuran en la base de datos en la fecha de prioridad de esta solicitud) o las SEQ ID NO. se pueden usar para las secuencias de la cadena principal del vector y las secuencias de casete:
• X06758 (genes de luciferasa bacteriana luxAB)
• SEQ ID NO: 1 (genes pacA y pacB de P1 naturales que incluyen el promotor del gen pacA natural)
• SEQ ID NO: 2 (replicón lítico P1 que contiene el promotor P53 controlado por represor C1, la molécula de antisentido del promotor P53, los genes repL y una deleción en el mismo marco del gen kilA)
• SEQ ID NO: 11 (promotor Pblast que dirige la expresión de luxAB)
Construcción de N1706(pacA::Kan luxAB): cepa mutada de pacA, también conocida como cepa 1525: se realizó como sigue:
Una secuencia ejemplar de una secuencia de pacA mutada se muestra en SEQ ID NO: 12. Se generó una secuencia mutada de pacA como se proporciona en SEQ ID NO: 12 construyendo un sustrato de intercambio alélico compuesto del gen de resistencia a kanamicina (Kan) y los genes luxAB bajo el control del promotor Pblast y flanqueado por secuencias génicas de pacA que flanquean ellas mismas la secuencia del gen pacA. El sustrato de intercambio alélico se produjo por medio de síntesis génica. A continuación, la secuencia de pacA natural en N1706 se remplazó por medio de inserción de los genes Kan y luxAB por medio de un intercambio alélico. Se determinó que la alteración también alteraba la capacidad del fago P1 mutado de empaquetar el ADN. La inducción del fago mutado dio como resultado la eliminación del fago de la descendencia, como se determina al comparar los valores de fago P1 por medio de un ensayo en placa a partir de lisados celulares producidos al inducir el fago natural frente al fago mutado.
Construcción del plásmido complementario: El plásmido complementario contenía el origen de replicación pBHR1 que presenta una amplia actividad gramnegativa, un marcador seleccionable para espectinomicina, los genes pacA y pacB del bacteriófago P1 naturales enlazados de forma funcional a la secuencia promotora del gen pacA natural, los genes luxA y luxB de Aliivibrio fischeri enlazados de forma funcional al promotor constitutivo de blasticilina (Pblast), el replicón lítico P1 que contiene el promotor P53 controlado por represor C1, la molécula de antisentido del promotor P53, los genes repL y una deleción sin cambio de pauta de lectura del gen kilA.
El plásmido se puede construir de una variedad de maneras que son conocidas por un experto en la técnica, incluyendo la obtención de casetes por medio de PCR de sus fuentes naturales o por medio de síntesis génica y ensamblaje del vector por medio de clonación tradicional basada en enzimas de restricción o técnicas alternativas tales como el ensamblaje de Gibson.
Sistema de empaquetamiento basado en complementación: El sistema de empaquetamiento incluye la cepa mutante de pacA 1525 complementada con el plásmido complementario. Como conoce un experto en la técnica, la manera de construir este sistema se puede lograr mediante transformación de la cepa 1525 con el plásmido complementario. El plásmido complementario se puede mantener en cultivos de 1525 transformada cultivando el transformante en presencia de 10 ug/ml de espectinomicina.
Producción de partículas de transducción que portan ADN plasmídico: Las partículas de transducción no replicativas que portan el plásmido complementario se pueden producir a partir de transformantes 1525 por medio de inducción térmica a 42 °C. La incubación a 42 °C da como resultado la inducción del ciclo lítico de P1 en el que el profago produce elementos estructurales del fago y empaqueta el ADN concatamérico del plásmido complementario formado por el replicón lítico en las partículas de fago de la descendencia. El plásmido complementario que expresa los dos genes pacA y pacB dio como resultado un lisado celular que contenía partículas de transducción no replicativas, consistiendo cada una de ellas en partículas de bacteriófago P1 que portan un concatámero lineal del plásmido complementario y demostrando, por tanto, que este plásmido complementario complementa con éxito la alteración del empaquetamiento.
Además de las partículas de transducción que portan ADN plasmídico, el sistema produjo partículas de transducción que portan ADN de P1. Las partículas de transducción que portan ADN de P1 pueden surgir por medio de recombinación entre el ADN plasmídico y el ADN de P1. La presencia de partículas de transducción que portan ADN de P1 se evaluó exponiendo las células diana al lisado de este sistema y cribando por la presencia de células transducidas que se propagan en medios selectivos que incorporan kanamicina, mientras que las partículas de transducción que portan ADN plasmídico se evaluaron de manera similar en base a la resistencia a espectinomicina. La figura 10 muestra una tabla de datos obtenidos al medir la producción de luz (ULR) de colonias de células transducidas. Las células que eran resistentes a espectinomicina (SpecR) se transdujeron con ADN plasmídico, mientras que las células que eran resistentes a kanamicina (KanR) se transdujeron con ADN de P1. Los datos de 1505 se obtuvieron de líneas de empaquetamiento que no tienen luxAB insertado en el genoma de P1, mientras que los de 1525 se obtuvieron de líneas de empaquetamiento que tienen luxAB insertado en el genoma de P1. Como se puede observar a partir de los datos, todos los transductantes de SpecR produjeron luz, mientras que todos los transductantes de KanR produjeron luz solo para los transducidos a partir de 1525.
Por tanto, 1525 representa un sistema indicador basado en partículas de transducción no replicativas mejorado donde las partículas de transducción que portan tanto ADN plasmídico como ADN vírico pueden producir luz.
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Listado de secuencias extraoficial
> SEQ ID NO: 1 pacA y pacB (negrita: promotor, subrayado: pacA, sin formato: pacB)
ATGTGACTTTCGTTACCCTCGCGTCAAAAAGAGTTTTTACGAAAGGAA
(ÍCATAAGTGACICTGGGACICiATCIACAAGAAGAATTTK KT(X iCCTtX KGCGAGAT GGTGGTTACACCATCGCACAGTATGCCGCCGA GTTTAATCTTAACCCTAATACCG CVUXTCGTTATCTCXXiTGCXTTCAAAGAAGACACCAüüACTACüüACAGCCGCA AGCC AAAT AAGCC AGTCAGG AAGCC ACTAAA AAGC AT G AT C ATT G AT C ACTCT A ATGATCAACATGCAGGTGATCACATTGCGGCTGAAATAGCGGAAAAACAAAGAG TTAATGCCGTTGTCAGTGCCGCAGTCGAGAATGCGAAGCGCCAAAATAAGCGCA TAAATGATCGTTCAGATGATCATGACGTGATCACCCGCGCCCACXXitiACCTTACG TGATCGCCTGGAACG( GACACCCTGGATGATGATGGTGAACGCTTTGAATTXXiAA GTTGGCGATTACCTGATAGATAACXiTTGAAGt GCXiüAAGGCCGCGCGCGCTATG TTGCXiTCGüTCCGGGGCCGATGTTCTGGAAACCACTCTTCTGGAAAAGTCTCTTT CTCATCTCCTTATGCTGGAGAACGCCAGGGATACGTGTATTCGCCTGGTGCAGGA AATGCGCGATCAGCAAAAAGACGATGATGAAGGTACTCCGCCTGAATACCGTAT CGCGAGCATGCTAAACAGCTGTTCCGCGCAGATAAGCAGCCTGATCAACACCAT TTACAGCATCCGGAATAACTATCGAAAAGAAAGCCGGGAGGCGGAAAAGCACG CTTTATCTATÜGGÜCAAGCTGGCATTÜTTAAGCTGÜCATACGAACGAAAGCGTGA AAATAACTGGTCAGTGCTGGAAGCGGCTGAATTCATCGAGGCGCATGGAGGAAA AG I GCCGCCCCJ GA J G C I GGAGCAAAl CAAAGCCGA J CJ GCG J GC J CC J AAGACC AATACCG ATG AT G AGG AAAACCAAAC AGC ATCTGGCGCTCC ATC ACTT G AAG AT CI GGAI AAAA rCGCGCGAGAAGGGGCGGCGAGCCGCCGCGG I GA I GCCGCA I I G TGGATTGAGCATCGTAG AG AAG AAATT G CCG AT ATCGTC G AT ACAGGT GGTT AT GG I GA IG I GGA I GCGGAAGGCA I A I CAAAGGAAGCA I GGCI I GAACAGGATG I G GACGAAGACGAGGAGGAAGACGAAGAAGTTACCCGCAAACTGTACGGGGATGA TGATTAA A'I ’GGCC AGAAGTTGCGTAACGGACCCACGTTGGCGCGAGCTTGTGGC GCJ A'J ATCGTIATGACTGGATJ GCGGCCQCTGATGTGTTGTITGGGAAÜACAGCA ACCTGGCAGCAGGATGAGA l’CA r i ’GAG'l CCACGCAGCAGGACGGCAGTTGGACA AGTGTGACCTCCGGCCATGGT ACT GGTAAATCGGATATGACGAGTATC ATTGC AA TACTCTTCATCATGTm TCCCCGGCGCT CGCGTCATTCT GGT CGCTAACAAAAG A C AGC AAGTCCTTGATGGT ATTTTCAAATACATAAAGAGCAATTGGGCrACrGCTG TTAGC AGATTCCCGTGGTTGTCG AAGTATTTCATTCTTACA GAAACG1CTTTTTIT GAGGT G A CT G G C AA G GG T GTTT G GACAATATTGATAAAGTCC TGTCGTCCC GG A AATGAGGAGGCGTTGGCTGGTGAACACGCCGATCATCTCTTGTATATCATCGACG AAGCGTCGGGTGTG AGTGATAAAGCATTC AGTGTGATAAC AGGTGCGCTG ACCG GTAAGGATAACCGTATTCTGCTTCTTTCCCAGCCTACGCGACCTTCAGGCTATTTC TACGATTCACACCACAGACTAGCTATTCGCCCGGGAAATCCTGATGGATTGTTTA CTGCG AT A AT ACTG A ATAGTG A AGAATCTCCGCTTGTAG ATGC A A A ATTT AT ACG A GC AAAACTT GCGG AGTATG GCGGTCGT ’G ATAACCCCATGTAC ATG ATC AAA GT ACGTGGTGAATTTCCCAAATCTCAAGATGGCTTTCTTCTTGGTCGTGATGAGGTT G AGCGGGCGACGCGGCGAAAGGTC AAG ATT GCCAAAGG ATGGGGCTGGGTTGC
a t g t g t t g a c g t t g c t g g t g g c a c a g g a c g a g a t a a g t c c g t t a t t a a t a t c a t g ATGGTGTCC G GCC A GCGAAATAAA C GC C GTGTAATC AACTATCGTATGCTGG AAT ACACAGACGTTACAGAAACGCAGTTAGCCGCCAAGATTTTCGCAGAATGTAACC C AG A ACGGTTCCCGA ACATA ACC ATAGCTATTG ATGGCG ATGGCTTGGGG A A AT CGACGGCTGATCTAATGTACGAACGCTATGGCATT ACCGTCCAGCGTATCCGCTG GGGT A A A A AG ATGC ACAGCCGTG A AG AT A A A AGCCTTTATTTCG AT ATGCGCGC TTTCGCGAATATTCAGGCGGCAGAAGCTGTAAAATCAGGGCGTATGAGGCTTGA TAAGGGGGCTGCGACTATAGAGGAAGCATCAAAGATACCGGTAGGGATAAATTC CGCAGGTCAATGGAAGGTGATGTCAAAGGAAGATATGAAGAAAAAACTCAACCT GCACTC ACCGGACCATTGGGATACAT ATTGTTT CGCT ATGTT GGCGAACT ATGTT CCCCAAGATGAAGTGCTTAGCGTCGAAGACGAAGCGCAGGTTGATGAAGCTCTG GCATGGCTT AATGAATAA
> SEQ ID NO: 2 replicón lítico P1 que contiene el promotor P53 controlado por represor C1, la molécula de antisentido del promotor P53, los genes repL y una deleción sin cambio de pauta de lectura del gen kilA
CACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATTTGGGCCCGG CGCGCC’GGA ICCGCIAGC ICIAGACTGGCAGGTI TCTGAGCAGATCGTCCAACCC G ATCTGGATCGGGTC AGAAAAATTTGCTCT AAT,A A ATTT CGTTTT CT A AGT G C A A AGAAT C ACCATTTCGAGCTGGTGATTG AAGGTTGATGC AAATTT GG AG AAAAAA TGCAACAAAC ATTC AAT G CGGATAT G AATATATCAAACCTTCAT CAAAATGTCGA TCCTTCAACCACTCTGCCCGTTATTTGTGGTGTTGAAATTACGACCGACCGCGCTG GCCGTTACAACCTTAATGCTCTACACAGAGCGAGCGGACTCGGTGCCCATAAAG CGCC AGCTC AATGGCTAAGAACGCTGr l’C AGCT A A A CAGCTCATCGAAGAGCTTG AAAAAGAAAC l’ATGCAGAA I J GCA'J AGT I rCG'J I CACAAGCAATGGAAGCAGGA TTTCTTTCACGAC1-CGTATAACCGGCAAAGGTCAGCAGTGGCTGATGAAGCGATT GCTTGATGCTGGTGTGCTGGT ACCTGTCGCGGCAACGCGCTAACAGACGTAGTAA GAACCACCAGCATTGTAATGCTGGCTAAAGTCACTTTCCTGAGCTGTATAACGAT GAGCGATTTTACTTTTTCTGGCTAT GAATTGGCCT GCTTTGTAACACACTCCGGT C TATC CO GTA G CGC C:GGGC AT A l CCTGTCGCAATGTGCA A ATCTCGCG GCAAC A A C CAG'J’GAATACTTCAI J CACAAGCCI CACCGCCTGA'J CGCGGCAGAAAC'l’GG I l’AT AGCC AAT C AACCGTCGTTCGT GC ATTCCGT GAAGCTGT AAACAAAGGAATTCTGT CTGTAGAGATTGTTATCGGCGATCACCGTGAACGTCGCGCTAACCTGTACCGGTT TACACCATCCTTTTTGGCCTTCGCACAACAAGCCAAAAATGCGCTGATAGAAAGC AAATTAAAGATCTCTTCAGCGGCAACCAAGGTTAAAGCTGTTCTCGCTAAGACAT TGGCTTTATTTA ATTTTTT A TCC AC ACCCCCATGTCAAAATG ATACCCCCTCCCCC TGTCAGGATGACGTGGCAATAAAGAATAAGAAGTCACAAGTTAAAAAAACAAA AAGATCAGTTTCCGGCGGTGCCGGAACAACCAGCCTCAAAAAATTGACTTCATG G ATCGCTAAGGC AAAAGCAAAGGCTGAC AATCTGCGGTTATCC AAAAAACG C AC TCAAAAAC AT G AGTT CAAGCAGAAAGTAG AGGCGGCT GCGCGGAAATATGCTT A CCTGAAGAACAAGCGTrCGCCTGATATTGGCGGGATATCAAACTTCGATAACCTA CCGCATTGCATGACGGTAAACGAAGCTCTTAATGCGGTTTTAGCCAAAAATAAA G ATAACGAAC AAT GGGGTATACCGGC AGGATTC AGAGGGTAAT GAATT GCT CTA ATTATAACCATGCATACTTTCAACACCTCTAGTTTGCCATGAGGCAAACTCATAG GTGTCCTGGTAAGAGGACACTGTTGCCAAAACTGGACGCCCCATTATTGCAATTA ATAAACAACTAACGGACAATTCTACCTAACAATAAGTGGCTTAAAAAAACCCGC CCCGGCGGGTTI T I T I ATCTAGAGCTAGCGGATCCGGCGCGCCGGGCCCTTCTGG GCCTC ATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTT CCAG
> SEQ ID NO: 3 replicón pBHR1 (negrita: ORF)
TTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGT TGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCCTACCGCATGGAGA T A A GC ATG G C CACGCAGT C C AG AC A A AT C G C C AT TCAAGC C AACAACAAGC CCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGG CTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCG CAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAG CTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTG GCCCACCCCTCCATCTCCCTCCTCAAGCTCAACCGCCCCCCCACCGTCTCC GCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTG CGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGAC GAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCG GGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCC CGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGA ATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTT TCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCG CCGGTAG
> SEQ ID NO: 4 genes terS y terL de $80a (negrita: ORF de terS, subrayado: ORF de terL)
TTTTAAAAAGCGT ATAGCGCG AGAGTT GGT GGTAAAT G AAATGAAC GAA AAACAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGTAAAA AAGCAGCAATTTCAGCAGGTTATAGTAAGAAAACAGCAGAGTCTTTAGCAAG TCG A TTG TT AAGAAATGTT AATGTTTCGGAAT AT ATT AAAGAACGATT AGAA C AG AT AC AAG AAG A G CG TTT AAT G AGC ATT AC AG AAGC TTT AGC GTT ATC TG CTTCTATTGCTAGAGGAGAACCTCAAGAGGCTTACAGTAAGAAATATGACCA TTTAAACGATGAAGTGGAAAAAGAGGTTACTTACACAATCACACCAACTTTT GAAGAGCGTCAGAGATCTATTGACCACATACTAAAAGTTCATG G TG CG TA TA TCGACAAAAAAGAAATTACTCAGAAGAATATTGAGATTAATATTGGTGAGTA CGATGACGAAAGTT AAATT AA ACTTT AACAAACCATCT AATGTTTT CA ACAGAA ACATATTCGAAATACTAACCAATTACGATAACTTCACTGAAGTACATTACGGTGG AGGTTCGAGTGGTAAGTCTCACGGCGTTATACAAAAAGTTGTACTTAAAGCATTG C AAG ACT GGAAAT ATCCT AGGCGT ATACT AT GGCTT AGAAAAGTC CAAT C AAC A ATTAAAGATAGTTTATTCGAAGATGTCAAAGATTGTTTGATAAACTTCGGTATTT GGGACATGTGCCTTTGGAATAAGACTGATAACAAAGTTGAATTGCCAAACGGCG CAGTTTTTTTGTTTAAAGGATTAGATAACCCAGAGAAAATAAAGTCGATAAAAG GCATATCAGACATAGTCATGGAAGAAGCGTCTGAATTCACACTAAATGATTACA CGCAATTAACGTTGCGTTTGAGGGAGCGTAAACACGTGAATAAGCAAATATTTTT GATGTTTAACCCAGTATCTAAACTGAATTGGGTTTATAAGTATTTCTTTGAACATG GT GAACC AATGG AAAATGTC AT GATTAGAC AAT CT AGTT AT CG AGAT AAT AAGTT TCTTGAT G AAAT G AC ACGAC AAAACTT AGAGTT GTT AGC AAAT CGT AAT CCAGC A TATTACAAAATTTATGCGTTAGGTGAATTTTCTACACTAGACAAATTGGTTTTCCC TAAGTATGAAAAACGTTTAATAAATAAAGATGAGTTAAGACATTTACCTTCTTAT TTTGGATTGGACTTTGGCT ACGTT AATGATCCT AGTGCTTTT ATACATTCT AAAAT AGATGTAAAGAAAAAGAAGTTATACATCATTGAAGAGTATGTTAAACAAGGTAT GCT G AAT G AT GAAAT AGCT AAT GTC ATA AAGC A ACTT GGTT AT GCT AAAG AAGA AATT AC AGC AGAT AGT GC AG A AC AAAAA AGT AT AGCT G AATT A AGG AAT CT AGG GCTTAAAAGGATTTTACCAACCAAAAAAGGGAAGGGCTCGGTTGTACAAGGGTT ACAATTCTT AAT GC AATTT GAAAT C ATTGTTGATGAACGTTGTTT C AAG ACT ATT G AAGAGTTTGACAACTACACATGGCAAAAGGACAAAGATACAGGTGAATATACCA ATGAACCAGTAGATACATACAATCATTGTATCGATTCGTTGCGTTATTCAGTGGA ACGATTCTACAGACCGGTTAGAAAACGCACAAATGTCAGTTCGAAAGTTGACAC AATAAAATCTCTAGGATTATAGGAGGGAACAAATGTTAAAAGTAAACGAATTTG AAACAGAT
> SEQ ID NO: 5 pT181
TTT GCGGAAAGA G TTAG TAAGTTAACA GAAG A C G AGC CAAACCT AAAT GG TTTAGC AGGAAAC rTAGATAAAAAAATGAATCCAGAATTA IA 1 J CAGAACAGGA ACAGt AACAAG AGC AACAAAAGAA J 'CAAAAACGAGATAGAGGTATGCACTTA' I AGAAC AT GCATTT ATGCCGAGAAAACTT ATTOGTTGGAATGGGCT ATGTGTTAGC T A ACTTGTTAGCG AGTTG G TTGG ACTTG AATTGGG ATTAATCCC AAG AAAGT ACC
g g c t c a a c a a c c c a t a a a g c c c t g t a g g t t c c g n c c a a t a a g g a a a t t g g a a t a A A GC A AT A A A AGG AGTTG A A GA A ATG A A A IT C AG A G A AGCCTTTGAG A ATTTT A T AAC AAG T A AG T ATGTA CTTG GTGTTTT AGTA GT CTTAACTGTTTA CC A G A T A AT ACAAATGCTTAAATAAAAAAAGACTTG AT CTGATTAG ACCAAATCTTTTGATAGT GTTATATTAATAACAAAATAAAAAGGAGTCGCTCACGCCCTACCAAAGTTTGTGA ACG ACATCATTC A AAGAAAAAAAC ACTG AGTTGTTTTT ATAA T CTTG T ATA TTTA GATATTAAACGATATTTAAATATACATCAAGATATATATTTGGGTGAGCGATTAC TTAAAC G AA ATTGA G ATTAAGGA GTC GATTTTTTAT GT ATAAAAACAAT CAT GC A AATCATTCA A ATC ATTTGG A A A ATC ACG ATTTAG ACA ATTTTTCT AAAACCGGCT ACTCTAATAGCCGGTTGGACGCACATACTGTGTGCATATCTGATCCAAAATTAAG TTTTG AT GCAATGACGATCGTTGGAAATCT CAACOGAGAC AACGCTCAGGCCCTT TCTAAATTTATGAC ¡TGTAG At iCCCí A A A ] A ACiAí TTTGGGATATTC [Tí AA Ai ’ A A AGTTTAAAGCTAAAGCACTTCAAGAAAAAGTTTATATTGAATAIGACAAAGTGA A A G CAGA IAGT I G G G ATAG ACGT A AT ATC CGTATTGAATTTAATCCAAA CAA A C TTACACGAGATGAAATGATTTGGTTAAAACAAAATATAATAAGCTACATGGAAG AT GACGG TTT TA CAAG ATT A G A TTT AGCCTTTGATTTTGAA GATGATTTGAGTGA CT ACT A I’G C A ATGTCTG AT AAAGC AGTTAAG A A A A CIA TI i i l l ATGGTCGTAAI GGT AAGCC AGAAACAAAATATTTTGGCGT G AGAGATAGTAAT AG ATTTATT AGA ATTTATAATAAAAAGCAAGAACGTAAAG AT AATGCAG AIG C rGAAGTT AT GTCT GAACATTTATGGC GTGTAGAAATCGAACTTAAAAGAGATATGGTGGATTACTGG AATG ATTGCTTT AGTG ATTT AC AT ATCTTGCAACCAGATT GG AAAACTATCC AAC GCACTGCGGATAGAGCAATAGTTTTTA l G'J "I AT T’GAGT g a t g a a g a a g a a t g g g GAAAGCTTCACAGAAATTCTAGAACAAAATATAAGAATTTGATAAAAGAAATTT C G CC A G TC G A TTT A A CGG AC TTA AT G AAATCG AC TTT A A A AGC G A ACG A A A AAC AATTGCAAAAACAAATC GATTTTTGGC AAC ATGAA TTTA AATTTTGGAAAT AGTG T ACAT ATT AAT ATT ACTG AAC AAAAATGATATATTTAAACTATTCTAATTT AGGA GGATTTTTTTATGAAGTGTCTATTTAAAAATTTGGGGAATTTATATGAGGTGAAA G AAT AATTT ACCCCT ATAAACTTTAGCCACCTCA AGTAAAGAGGT AAAATTGTTT AGTTT ATATAAAAA ATTTAAAGGTTTGTTTTATAGCGTTTTATnTGGCTTTGT AT T CTTTCATTTTTTAGTGT ATTAAATG AAATGGTTTTAA ATGTTT CTTT ACCTGAT AT TGCAAATCATTTTAAT ACT ACTCCTGGAATTACAAACTGGGTAAACACTGCATAT ATGTT AACTTTTTCGATAGGAACAGC AGT ATATGGAAAATTATCTGATT ATATAA
a t a t a a a a a a a t t g t t a a t t a t t g g t a t t a g t t t g a g c t g t c t t g g t t c a t t g a t t GCTTTT AT TGGGCCCAC CT A G G C A A ATATGCTCTT ACGTGCT ATT ATTT A AGTG AC L ATTTAAAAGGAGTTAA l AAA l A IGCGGCAAGGTATTCTTAAATAAAC J GTCAA'L TT GAT AGCGGGA ACAA ATAATT AGAT GT CC1T1TT1AGGAGGGCTTAG1TT1TTGT ACCCAGTTT AAGAATACCTTTATCAT GTGATT CT AAAGTATCCAGAGAATATCTG
I’A ICjC LITGTATACCTATGGTTATGCATAAAAATCCCAGTGATAAAAGTATTTAT CACTGGGATTTTTATGCCCTTTTGGGTTTTTGAATGGAGGAAAATCACATGAAAA TTATTAATATTGGAG rTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAAACTACCT IAACAGA AAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTGGACAAAGG TAC A ACGAGG ACGG ATA ATACGCTTTTAGA ACGTCAGAGAGG A ATT ACAATTCA GAC AGG AATA ACCTCTTTT C AGT GGG AAAAT ACGAAGGTG AACAT CAT AG AC AC GCCAGGACATA I GGA ITIC J I AGCAGAAG l A I A I CG I I CA I [ A I CAG ] I I [ AGA I GGGGCAATTCTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATAT TATTTCATGCACTTAGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTATCAATAAGATT GACC AAAATGGAATTGATTT ATCAACGGTTT ATCAGGAT ATT A A AGAGAAACTTT CT GCCGAAATT GTAATC AAACAGAAGGT AG AACT GT ATCCT AATATGT GTGT GAC GAACTTTACCGAATCTGAACAATGGGATACGGTAATAGAGGGAAACGATAACCT TTTAGAGAAATATATGTCCGGTAAATCATTAGAAGCATTGGAACTCGAACAAGA GGAAAGCATAAGATTTCAGAATTGTTCTCTGTTCCCTCTTTATCATGGAAGTGCA AAAAGT AAT AT AG GG ATT G AT AAC CTT AT AG A AGTT ATT ACT AAT A AATTTT ATT CATCAACACATCGAGGTCCGTCTGAACTTTGCGGAAATGTTTTCAAAATTGAATA TACAAAAAAAAGACAACGTCTTGCATATATACGCCTTTATAGTGGAGTACTACAT TTACGAGATTCGGTTAGAGTATCAGAAAAAGAAAAAATAAAAGTTACAGAAATG T AT ACTT C AAT AAAT G GT G AATT AT G T AAG ATT G AT AG AGC TT AT TCTG G AG AAA TTGTTATTTTGCAAAATGAGTTTTTGAAGTTAAATAGTGTTCTTGGAGATACAAA ACT ATTGCCACAGAGA AA AAAGATTGAA AATCCGC ACCCTCT ACT ACA A ACAAC TGTTGAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGCTTGATGCCCTTTTGGAA ATCTCAGATAGTGATCCGCTTCTACGATATTACGTGGATTCTACGACACATGAAA TT ATACTTT CTTT CTT AGGGAAAGT AC AAATGG AAGTG ATT AGT GC ACT GTT GCA AG AAAAGT ATC AT GTGG AG AT AG AACT A AAAG AGC CT AC AGT C ATTTAT AT GG A G AG ACCGTT AAAAA AT GC AG AAT AT ACC ATT C AC ATCG AAGT GCCGCC AAATCC TTTCTGGGCTTCCATTGGTTTATCTGTATCACCGCTTCCGTTGGGAAGTGGAATGC AGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACTTAAATCAATCATTTCAAAATGCAGT TATGGAAGGGGTACGCTATGGTTGCGAACAAGGATTATATGGTTGGAATGTGAC GGATTGT AAAATCT GTTTT AAGT ACGGTTTATACT ATAGCCCT GTT AGT ACTCC AG CAGATTTTCGGATGCTTACTCCTATTGTACTGGAGCAAGCCTTTAGAAAAGCTGG AAC AGAATT GTT AGAGCCAT ATCTT AGTTTT AAAGTTT ATGC ACCAC AGGAATAT CTTTCNCGGGCATATAACGATGCTCCCAAATATTGTGCAAATATCGTAAATACTC AACT G AAAAAT AAT G AGGT C ATTATT ATT GG AG AAATT C CTGCTCG AT GT ATTC A AG ATT AT C GC AATG ATTTAACTTTTTTT AC AA ATGGGCTT AGT GTTT GTTT AGC AG AGCTAAAAGGATATCAGGTTACCACTGGCGAACCTGTTTGCCAGACCCGTCGTCT AAATAGTCGGATAGATAAAGTAAGATATATGTTCAATAAAATAACTTAGTGCGTT TTATGTTGTTATATAAATATGGTTTCTTATTAAATAAGATGAAATATTCTTTAATA T AGATTTG AATT AAAGTGGAAAGGAGG AGATTGTT ATT AT AAACT ACAAGTGG A TATTGTGTCCTATTTGTGGAAATAAAACAAGACTACGAATACGAGTGGATACTAT ACTT AAAAATTTCCCTTTATACAGCCCCAAATGTAAGAACGAAACTTT AATT AAT GTTCAAAAAATGAATATAATAACAATCAAAGAGCCAGACGCCAAGACGCAGAGC CG ATAATTT G AG AAAT GAAACTCT C AT CTT AT CGGCTCTTTTT GTTT ATCTGAATT TT ACTGACT AGCCTTC A ATATTTCC
> SEQ ID NO: 6 terA y terB de Ef11 (negrita: ORF de terA, subrayado: ORF de terB)
CTC AATT C AACAAGTATT GT G AGGT GGT GTT AT AT GT C AGATGG AT AAAA
AGG AAC AAGC AAAG AAAT ATTATG AA AAAGGTTGG AAAT AC AAG G AT ATT T C CGAAAAGCTTTCTGTACCTCTCAACACATTGAAGTCATGGAGAAAACGTGAT AAATGGGAAAGAGGGGGTGCAACCAAAGAGGTGCAACCTACAAATAGGGGT GCACCT AAAGGT AATCAAAATGCTATAGGCAATAAAGGTAATAGTCGAGCCT CGCCACCAAAAAGAAATAAGAATGCTGTTAAAACTGGCGAATACGAAACAAT ATTTGCCGATATGTTATCTGACGAAGAAAAGGACATCTATTCTACTATGAAT GATGATCCTTTTTTTATTTTGGATGAAGAAATAAGAATCCTGAAAATTCGCC AATATAGAATGCTTAAACGCATAAAAGATGCAGAGGCTGGCTTAAATGATGA AGAAGTTGAACGTTTGCAGCAGCTTCGCAAAGTTAAAGAGCCATCGGTAATT GATGGGAAAATGGTTACTGTTAAGAGAGAAGTTTTAAAAGATGTACAAGTCA CTCGTAAAACATTTAGAAAGTTAGATGACATCCTGGCTATTGAAGATGCGTT GACTCGCGTTAGCAATCAATTAATAAAGGCGATTAAGCAACAAAAAGAATTA TTGTCGACAGATAAAAAATCTCTTTTAATGGAGGCTCAAATTGAGAAGATAA AGCTTGAGACAGACAAATTAAGTGGCGGATCATCTAACGATGAAGCTGACT CTT GGA AAC AAGC AGTT AT AAAT GC AGC AAAT AAGCGGGC GGT GGA AGA AA ATGAATAAGAGTTTATTCCGTTTGCCGATATTGGTGCAGCAATTGATTACTACTA CGATAAACCAGTTGCTTTTTGTCAGGATATTTTGCATCTTGATCCAGATGAATGG CAGGATAAGGTCTTGGATGATTTGGCTAAATTCCCAAAAGTCTCAGTTAGATCAG GGCAGGGTGTTGGAAAAACGGCGTTGGAGGCTGGTGCTATTCTTTGGTTTCTAAC ATGCCGGCCAT ATGC A AAAGT AAT AGC AACTGCT CCGACGATGAA ACA ATT ATA CGAT GTT CT ATGGGC AGAAGT GGCT A AGTGGCTGA AT A AC AGCTTGATT A A AGA CTTACTTAAATGGACCAAGACGAAAATTTATATGGTTGGCGATTCAGAACGATGG TTT GCT AC AGCTC G AAC AGC AACT AAACCAG AAAAT AT GC AAGG ATTTC ACG AA GACCATATGTTAATAGTGGTTGATGAAGCATCAGGTGTTGCTGATCCCATTATGG AAGCAATATTAGGTACTCTTTCAGGATTTGACAATAAATTACTAATGTGTGGGAA CCCCAACAATATTGAAGGGGTTTTTTATGATTCGCATAATACAGATAGAGACAAG TATAGAACGCACAAAGTTTCTAGTTACGATAGCAAACGTACTAACAAAGAAAAT ATTCAAATGCTCATCGATAAGTATGGTGAGAATAGCGATGTAGCTCGTGTTCGTA TTTATGGTGAATTTCCCAAAGGCGCACTTGATTCATTTATCAGCCTTGAAATTGTT G AGTTT GCC AAAGATATTAATATTT CT G ATT CAGAATTAAAAC AT GTTAG AGAAG GACAC AT AGGT GTCG ATGT GGCTCGTTTT GGT GAT GATTC AACG AT AGT ATTT CC TAGAATCGGAGCTAAAGCATTGCCATTTGAAAAATATAGTAAGCAAGATACCAT GCAGACCACTGGTCGAGTTTTAAAAGCGGCGAAAAGGATGATGGATGACTATCC TACAAT A AAAAA AGT GTTCATCAAAGT AGATGATACAGGTGTTGGTGGAGGT GT T ACT GAT AG ACTT AAAG AAGT AATT AGC GAT G AAAAACTT CCC T AT G AAGT AATT CCGGTAAATAATGGAGAATCTTCTACAGACGATTATTATGCAAATAAAGGAACA CA A AT ATGGGGAGAT GTT A A AGA ACT GTT AGA AC A A A ACATTT CC A ATT CGATT AAT GGTC AAGGGCCGACGAT AG AACTTCCTGAT AATGC AAAT CT AATC AAAG AA TTGAGCACACGTAAATTTAAAATGACTAGCAATGGAAAAATCCGTTTAGAAAGT A AAGAAGAT ATGA A AAAGCGT AATGTTGGC AGTCCAGAT ATTGCTGATGCGTT A ACGTTAGCGTTTTACGAGCCATTTAGACCAGAACCTATAAACGTTAAAAAAGCTA TTAATACGTTCAAAAAATTAGGATTAAGTAGGTGATAGAGTGAATAATAAATTAT T GA ACGGTTCTAGATTTGAT
> SEQ ID NO: 7 repB
Figure imgf000032_0001
> SEQ ID NO: 8 pDL278
TGGCGATTCTGAGACCTCTGAGAGGCTCTCAGAGCTATCTAAAGCTGAGG GAT AT ATAAATACCTT AGA AAATT ATTCGAAGAGCTT AGA AGCGAA AATAGAGC GTTTAGAGCGCGAGGGGCTGAAATTAGAAAAACTAAAAACACAAATAGCTGACC T AAAA ATCAT GTCTGAGAA AGAACT AGCGGCT ATT ACCCCT AAAAA AGGCGTGT TCGGTAAAGAATATGTGGAATTGACTAAAGAGCAGTTTGAAGAATTTAAAGGGC TGATATACCGAAGCAGAAACCTTGTTCATCAAAAAGAGCTAGAGAATGAGCAAT TAAGGCGGATAGTGCCTCTGAGACGCTCTAAACGGTTTGAAGCGAGTTGGAACG AGCTAAAGAAAAAAGTAAGGGAGAGAGCATAGAGCGTCTTAGGAACGAAAATA GAGCGCTTAGAAGTGAAAACTCAGTTTTGAGACAGCAAAATGACAAAATGCTAG G AAAACT G AAAG AGTTT AT GCC AG AT AAAGC CTTAAAA AATTTTAT AT C AG AGTT AAGAGCTATTCAGCCAATCGTAAGGGTAGTTAAACGAGTGATTGAAAAAGGGCT AGGCCTTTGAGCGATTTATGCCGTGAAAGCTAATTGACAATAAGCAAGGGCAAA GTACGCTAGGACGTGACGAGCCGAAAGGCTTTAGCGTTTCGAGCCGACACGGAC AAAGGACGTCCGCCCTTGGTTACTTGTTGTCAATTAGACCATGGAATAAAGTAAG CGGACATGGTATAATAGCTAGGTCGCAACGTTCTTTCGCTAAGTTACGAACTTAG ATTGGAGGTGAGCGCTGTGAAGACTTTCCTAGAACTTGTTTTGATACCTTTTGTG GTTGGCGTTGCTGCAGAGGTAAGTGCTGATTGGTTGATTCGGTATGTTCGAAACA AACGCGACAAAAATTAACCTGAGTTCTTTTTGAGGACAAAAAAGAAAGACAGTA GTTCCAGCTACTGTTTTTTTTGCGTTGTGCT ATTCGTTTCCT AGAACTT CT AGCGTT AAAATT ATT AT ACC ACGTTT GG ATTT AGAAAGT C AAAATTTGAGGTTTT AGGGGT GAATTTTTCGTGAAACGAAAAAGAGGGCTGAAAAGCCCTTAAAAACCCAATTGC GTAGCAAGGGTTTTTTCTTATCTTGATACATATAGAAATAATGAGTTTTTTTATTT T CTT GTTTT AA AGCACCTC AAACCCTTGATATTGCT GGGTTTTTAGGT AACAAA A AAGCCCTTGCAATTTAATAAAATAAAGTTTATAATTTAAGTGTCCAATTTAAAAT AAT AAACTTAGGAG AATTGCAGG AACTTTTTTATATACT CAAAAAAATTTTTTT G CAAG AAAATT AT AAC AT GAC AGGTACTGAAAAT C AAGTCTTT AAGG ACT ATT CTA AG AAT GG C AAAG AT AG AAAGTGGCG AG AACG C AAGTT AAAAAAT ATT G AG CTT G CTGGTCGTTTAGAGCGTTT AGGAT ATCGTTCGTTTGAACGGGT CT ATCA ATGTGC CGAAGTGTTGAAGTTTATCGAACAACAAGACGGCACGAAAAAACTCTATCAGTC TTATTTTTGCAAAAATAAGCTCTGCCCAATTTGTAACTGGAGACGGTCAatgaagtatg cttatcaagctgaattagtggtaaatgaagcaatgaaacgctatccaaaaggtcgctttctctttttgaccttgacgattaagaacattagtg gtgaaaaattaaataaatcaatttcagaaatagggcgagcttttaatcgtcttatgaaatacaagaaagtcgataaaaatgttattggctatt tgcgagccactgaggtaacttattcaactgagcatgagaattatcaccctcatttgcatgtattgttatttgtgaaatctagctattttactgga
Figure imgf000033_0001
agttgttcaagaaaatcaaggcggagttagctcttgatgatgtcgaagaagggaatcttgttcagaccggagcagaagaatctgcaga aagtactggtcgtgaaattgttgccttttggaattgggatagaaagaattattttgtgaggtagCTGATGAGTAAAACAGT AT C AG AATT AGCT C AAG AATT GGG AGTT AGT AGGC AGT AT CTT AAT CGG ATTTT A TCGCAAAATAATCTCGGTCGAAAAAAAGGGAATAAAAAAGTAGTTTCCGATATG GACGAGAAAGTTATGCAAGGGTTTATTGTTTTCTAAAATCTGATTACCAATTAGA AT G AAT ATTTCC C AAAT ATT AAAT AAT AAAACAAA AAAATT G AAAA AAGTGTTT CCACCATTTTTTCAATTTTTT
> SEQ ID NO: 9 promotor de nisina
AAACAGTCTT AATT CT AT CTTGAGA AAGT ATTGGTA AT AAT ATT ATTGTCG AT AACGCGAGC AT AAT AAACGGCTCTGATT AAATT CT GAAGTTTGTT AGAT ACAA TGATTTCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCAAA
> SEQ ID NO: 10 alteración del sitio pac y del gen pacA con kanR (sin formato: secuencia del gen pacA, subrayado: secuencia del gen pacA incluida en el sustrato de intercambio alélico, negrita: promotor del gen kan, cursiva: gen kan)
ACGATCACAAGAAGAATTTTGCTCGCCTGGCGCGAGATGGTGGTTACACC ATCGCACAGTATGCCGCCGAGTTTAATCTTAACCCTAATACCGCACGTCGTTATC TCCGTGCCTTCAAAGAAGACACCAGGACTACGGACAGCCGCAAGCCAAATAAGC CAGTCAGGAAGCCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGA AGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGC GCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC47G^r TGAA CAA GA TGGA TTGCACGCA G G1 "TCTCCGGCCG CAI GGG TGGA GAGGCTA TTCGG CTA TGA CTGGGCA CAA CA GA CAA TCGGCTGCTCTGA TGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCA GCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAA CTGCAA GACGA GGCA GCGCGGCTA TCGTGGCTGGCCA CGA CGGGCGTTCCTTGCGC A GCTGTGCTCGA CGTTGTCA CTGAA GCGGGAAGGGACTGGCTGCTA TTGGGCGAAGT GCCGGGGCA GGA TCTCCTGTCA TCTCA CCTTGCTCCTGCCGA GAAA GTA TCCA TCA TG GCTGA TGCAA TGCGGCGGCTGCA TA CGCTTGA TCCGGCTA CCTGCCCA TTCGA CCA C CAA GCGAAACA TCGCA TCGA GCGA GCACGTA CTCGGA TGGA A GCCGGTCTTGTCGA T CA GGA TGA TCTGGACGAA GA GCA TCA GGGGCTCGCGCCA GCCGAA CTGTTCGCCAGG CTCAA GGCGA GCA TGCCCGA CGGCGA GGA TCTCGTCGTGA CCCA TGGCGA TGCCTGC TTGCCGAA TA TCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTTTCTGGA TTCA TCGA CTGTGGCCGGC TGGGTGTGGCGGA CCGCTA TCA GGA CA TA GCGTTGGCTA CCCGTGA TA TTGCTGAA GA GCTTGGCGGCGAA TGGGCTGA CCGCTTCCTCGTGCTTTA CGGTA TCGCCGCTCCCGA TTCGCA GCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTTGA CGA GTTCTTCTGAGCCCACCGGACC TTACGTGATCGCCTGGAACGCGACACCCTGGATGATGATGGTGAACGCTTTGAAT TCGAAGTTGGCGATTACCTGATAGATAACGTTGAAGCGCGGAAGGCCGCGCGCG CTATGTTGCGTCGGTCCGGGGCCGATGTTCTGGAAACCACTCTTCTGGAAAAGTC TCTTTCTCATCTCCTTATGCTGGAGAAC
> SEQ ID NO: 11 promotor Pblast
CGTCAGGTGGCACTTTTCGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATT TTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGC TTCAATAATATTGAAAAGGAAGAGT
> SEQ ID NO: 12 locus del gen pacA de P1 con el gen kan y los genes luxAB insertados (en minúscula es la secuencia natural, en mayúscula es la secuencia de inserción)
atgtgactttcgttaccctcgcgtcaaaaagagtttttacgaaaggaagcataagtg acctgggacgatcacaagaagaattttgctcgcctggcgcgagatggtggttacaccatcgc acagtatgccgccgagtttaatcttaaccctaataccgcacgtcgttatctccgtgccttca aagaagacaccaggactacggacagccgcaagccaaataagccagtcaggaagAAGAGAAAG CAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAG CGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACT GGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACA GGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTG GGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCG TGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCC CTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTG CGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGC CGGGGCAGGATCTCCTGTCATCCCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGAT GCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACA TCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACG AAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGAC GGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGG CCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAG CGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTG CTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTT CTTCTGAATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTT TTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATG CTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATC CTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATG TGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATT CTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACC CCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTG ATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAAGTTTGGAAATATTTGTTTTTCGT ATCAACCACCAGGTGAAACTCATAAGCAAGTAATGGATCGCTTTGTTCGGCTTGGTATCGCC TCAGAAGAGGTAGGGTTTGATACATATTGGACCTTAGAACATCATTTTACAGAGTTTGGTCT TACGGGAAATTTATTTGTTGCTGCGGCTAACCTGTTAGGAAGAACTAAAACATTAAATGTTG GCACTATGGGGGTTGTTATTCCGACAGCACACCCAGTTCGACAGTTAGAAGACGTTTTATTA TTAGATCAAATGTCGAAAGGTCGTTTTAATTTTGGAACCGTTCGAGGGCTATACCATAAAGA TTTTCGAGTATTTGGTGTTGATATGGAAGAGTCTCGAGCAATTACTCAAAATTTCTACCAGA TGATAATGGAAAGCTTACAGACAGGAACCATTAGCTCTGATAGTGATTACATTCAATTTCCT AAGGTTGATGTATATCCCAAAGTGTACTCAAAAAATGTACCAACCTGTATGACTGCTGAGTC CGCAAGTACGACAGAATGGCTAGCAATACAAGGGCTACCAATGGTTCTTAGTTGGATTATTG GTACTAATGAAAAAAAAGCACAGATGGAACTCTATAATGAAATTGCGACAGAATATGGTCAT GATATATCTAAAATAGATCATTGTATGACTTATATTTGTTCTGTTGATGATGATGCACAAAA GGCGCAAGATGTTTGTCGGGAGTTTCTGAAAAATTGGTATGACTCATATGTAAATGCGACCA ATATCTTTAATGATAGCAATCAAACTCGTGGTTATGATTATCATAAAGGTCAATGGCGTGAT TTTGTTTTACAAGGACATACAAACACCAATCGACGTGTTGATTATAGCAATGGTATTAACCC TGTAGGCACTCCTGAGCAGTGTATTGAAATCATTCAACGTGATATTGATGCAACGGGTATTA CAAACATTACATGCGGATTTGAAGCTAATGGAACTGAAGATGAAATAATTGCTTCCATGCGA CGCTTTATGACACAAGTCGCTCCTTTCTTAAAAGAACCTAAATAAATTACTTATTTGATACT AGAGATAATAAGGAACAAGTTATGAAATTTGGATTATTTTTTCTAAACTTTCAGAAAGATGG AATAACATCTGANGAAACGTTGGATAATATGGTAAAGACTGTCACGTTAATTGATTCAACTA AATATCATTTTAATACTGCCTTTGTTAATGAACATCACTTTTCAAAAAATGGTATTGTTGGA GCACCTATTACCGCAGCTGGTTTTTTATTAGGGTTAACAAATAAATTACATATTGGTTCATT AAATCAAGTAATTACCACCCATCACCCTGTACGTGTAGCAGAAGAAGCCAGTTTATTAGATC AAATGTCAGAGGGACGCTTCATTCTTGGTTTTAGTGACTGCGAAAGTGATTTCGAAATGGAA TTTTTTAGACGTCATATCTCATCAAGGCAACAACAATTTGAAGCATGCTATGAAATAATTAA TGACGCATTAACTACAGGTTATTGTCATCCCCAAAACGACTTTTATGATTTTCCAAAGGTTT CAATTAATCCACACTGTTACAGTGAGAATGGACCTAAGCAATATGTATCCGCTACATCAAAA GAAGTCGTCATGTGGGCAGCGAAAAAGGCACTGCCTTTAACATTTAAGTGGGAGGATAATTT AGAAACCAAAGAACGCTATGCAATTCTATATAATAAAACAGCACAACAATATGGTATTGATA TTTCGGATGTTGATCATCAATTAACTGTAATTGCGAACTTAAATGCTGATAGAAGTACGGCT CAAGAAGAAGTGAGAGAATACTTAAAAGACTATATCACTGAAACTTACCCTCAAATGGACAG AGATGAAAAAATTAACTGCATTATTGAAGAGAATGCAGTTGGGTCTCATGATGACTATTATG AATCGACAAAATTAGCAGTGGAAAAAACAGGGTCTAAAAATATTTTATTATCCTTTGAATCA ATGTCCGATATTAAAGATGTAAAAGATATTATTGATATGTTGAACCAAAAAATCGAAATGAA TTTACCATAAAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGgcccaccggacctta cgtgatcgcctggaacgcgacaccctggatgatgatggtgaacgctttgaattcgaagttgg cgattacctgatagataacgttgaagcgcggaaggccgcgcgcgctatgttgcgtcggtccg gggccgatgttctggaaaccactcttctggaaaagtctctttctcatctccttatgctggag aacgccagggatacgtgtattcgcctggtgcaggaaatgcgcgatcagcaaaaagacgatga tgaaggtactccgcctgaataccgtatcgcgagcatgctaaacagctgttccgcgcagataa gcagcctgatcaacaccatttacagcatccggaataactatcgaaaagaaagccgggaggcg gaaaagcacgctttatctatggggcaagctggcattgttaagctggcatacgaacgaaagcg tgaaaataactggtcagtgctggaagcggctgaattcatcgaggcgcatggaggaaaagtgc cgcccctgatgctggagcaaatcaaagccgatctgcgtgctcctaagaccaataccgatgat gaggaaaaccaaacagcatctggcgctccatcacttgaagatctggataaaatcgcgcgaga acgggccgccagccgccgcgctgatgccgcattgtggattgagcatcgtagagaagaaattg ccgatatcgtcgatacaggtggttatggtgatgtcgatgcggaaggcatatcaaacgaagca tggcttgaacaggatctggacgaagacgaggaggaagacgaagaagttacccgcaaactgta cggggatgatgattaatggccagaagttgcgtaacggacccacgttggcgcgagcttgtggc gctatatcgttatgactggattgcggccgctgatgtgttgtttgggaagacaccaacctggc agcaggatgagatcattgagtccacgcagcaggacggcagttggacaagtgtgacctccggc catggtactggtaaatcggatatgacgagtatcattgcaatactcttcatcatgtttttccc cggcgctcgcgtcattctggtcgctaacaaaagacagcaagtccttgatggtattttcaaat acataaagagcaattgggctactgctgttagcagattcccgtggttgtcgaagtatttcatt cttacagaaacgtctttttttgaggtgactggcaagggtgtttggacaatattgataaagtc ctgtcgtcccggaaatgaggaggcgttggctggtgaacacgccgatcatctcttgtatatca tcgacgaagcgtcgggtgtgagtgataaagcattcagtgtgataacaggtgcgctgaccggt aaggataaccgtattctgcttctttcccagcctacgcgaccttcaggctatttctacgattc acaccacagactagctattcgcccgggaaatcctgatggattgtttactgcgataatactga atagtgaagaatctccgcttgtagatgcaaaatttatacgagcaaaacttgcggagtatggc ggtcgtgataaccccatgtacatgatcaaagtacgtggtgaatttcccaaatctcaagatgg ctttcttcttggtcgtgatgaggttgagcgggcgacgcggcgaaaggtcaagattgccaaag gatggggctgggttgcatgtgttgacgttgctggtggcacaggacgagataagtccgttatt aatatcatgatggtgtccggccagcgaaataaacgccgtgtaatcaactatcgtatgctgga atacacagacgttacagaaacgcagttagccgccaagattttcgcagaatgtaacccagaac ggttcccgaacataaccatagctattgatggcgatggcttggggaaatcgacggctgatcta atgtacgaacgctatggcattaccgtccagcgtatccgctggggtaaaaagatgcacagccg tgaagataaaagcctttatttcgatatgcgcgctttcgcgaatattcaggcggcagaagctg taaaatcagggcgtatgaggcttgataagggggctgcgactatagaggaagcatcaaagata ccggtagggataaattccgcaggtcaatggaaggtgatgtcaaaggaagatatgaagaaaaa actcaacctgcactcaccggaccattgggatacatattgtttcgctatgttggcgaactatg ttccccaagatgaagtgcttagcgtcgaagacgaagcgcaggttgatgaagctctggcatgg cttaatgaataa

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de empaquetamiento de células bacterianas para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa (NRTP) para su introducción en una célula bacteriana, comprendiendo el sistema de empaquetamiento una célula huésped, que comprende:
- un genoma de bacteriófago que comprende un primer gen que comprende una alteración, en el que, en ausencia de la alteración, el primer gen codifica un primer componente esencial de una actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento y comprende una primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento reconoce el primer sitio de inicio del empaquetamiento, en el que la alteración evita el reconocimiento de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento por la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y en el que la alteración reduce el nivel de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial; y
- una molécula de ácido nucleico indicadora que comprende un gen indicador, un replicón lítico P1, un segundo gen que codifica el primer componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, y un tercer gen que codifica un segundo componente de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento esencial, en la que el segundo gen comprende la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada, en la que la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento se configura para facilitar el empaquetamiento de un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora en la NRTP.
2. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de la reivindicación 1, en el que el bacteriófago comprende una pluralidad de genes alterados, en el que, en ausencia de las alteraciones, cada uno codifica un componente esencial de la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento y en el que cada uno de la pluralidad de genes alterados en el bacteriófago se complementa con un gen funcional, no alterado, codificado por la molécula de ácido nucleico indicadora.
3. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la alteración es por medio de deleción, inserción, mutación o remplazo.
4. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad enzimática relacionada con el empaquetamiento es una actividad terminasa.
5. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el segundo gen y el tercer gen son genes de terminasa y en el que el segundo gen y el tercer gen están enlazados de forma funcional a un promotor condicional.
6. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de la reivindicación 5, en el que el promotor condicional es un promotor natural de un gen de terminasa del genoma del bacteriófago.
7. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que la expresión del segundo gen o el tercer gen se inhibe en ausencia de activación del ciclo lítico del bacteriófago, y en el que la expresión del segundo gen o el tercer gen se activa tras la activación del ciclo lítico del bacteriófago.
8. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el genoma del bacteriófago comprende un gen indicador que codifica un marcador detectable o un marcador seleccionable y en el que el gen indicador está enlazado de forma funcional a un promotor constitutivo.
9. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la alteración comprende una inserción en o remplazo de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento con un gen que codifica un marcador seleccionable y en el que el gen que codifica el marcador seleccionable está enlazado de forma funcional a un promotor constitutivo.
10. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la alteración comprende una inserción en o remplazo de la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento con un gen que codifica un marcador detectable.
11. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un origen de replicación.
12. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un concatámero susceptible de empaquetamiento en la partícula de transducción no replicativa.
13. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la primera secuencia del sitio de inicio del empaquetamiento no alterada comprende un punto de unión concatamérico.
14. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la molécula de ácido nucleico indicadora comprende una secuencia de transcrito de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia en la molécula de ácido nucleico indicadora.
15. El sistema de empaquetamiento de células bacterianas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora comprende una secuencia de transcrito de ácido nucleico que es complementaria a una segunda secuencia en la réplica de la molécula de ácido nucleico indicadora.
16. Un procedimiento para empaquetar una molécula de ácido nucleico indicadora en una partícula de transducción no replicativa, que comprende:
- proporcionar condiciones al sistema de empaquetamiento de células bacterianas de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que induzcan una fase lítica del genoma del bacteriófago para producir partículas de transducción no replicativas empaquetadas con la molécula de ácido nucleico indicadora; y
- recoger la partícula de transducción no replicativa que comprende la molécula de ácido nucleico indicadora.
17. Una composición que comprende la partícula de transducción no replicativa que comprende un replicón de la molécula de ácido nucleico indicadora producida a partir del procedimiento de la reivindicación 16.
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