CN109810933A - 一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。本发明构建的apuA基因敲除突变株ΔapuA，可用于研究ApuA作为毒力因子影响SS2致病性的分子机制，为进一步研究SS2的致病机理奠定了基础，也可用于研制2型猪链球菌减毒活疫苗或基因工程多价疫苗。

Description

一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人兽共患病原菌，分为33 种血清型，其中猪链球菌2型(SS2)被认为是分布最广、致病性最强的一种血清型，可导致感染猪和人的急性出血性败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等，发病率和死亡率高，不仅给养猪业造成巨大的经济损失，也对公共卫生、食品安全和人类的生命安全构成威胁。

我国于1998年和2005年在江苏和四川暴发两次大规模的猪及人感染SS2 疫情，累计报告人感染SS2病例达229例，死亡52例，引起我国卫生部门对猪链球菌病的高度重视。近年来，猪链球菌病的发病率和死亡率逐年上升，各地 SS分离株的耐药情况亦呈逐年加重的趋势，严重威胁人类公共卫生和生猪养殖产业。但是，目前关于SS2感染宿主并致病的分子机制仍不清楚。

结合近年来SS的研究进展，目前已鉴定的毒力相关因子大体可分为以下三类：(1)胞膜锚定蛋白/分泌蛋白，如荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(Sly)等；(2)酶类，如谷氨酸脱氢酶(Gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等；(3)转录因子/调控因子，如糖代谢转录调控因子(CcpA)、丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶(STK)等。

目前，很多发掘出的毒力因子都处于推测和假定的状态，缺乏进一步实验证明这些潜在毒力因子与SS2毒力的确切关系及其致病机制。

在SS2毒力因子的研究过程中，国内外许多学者通过构建某一基因的敲除突变株，并与野生株比较毒力变化，来揭示该基因在SS2致病中的作用，也为新型疫苗的研发奠定了理论基础。疫苗是一种安全有效的病原菌防控手段，特别是减毒活疫苗和亚单位疫苗。减毒活疫苗以全菌体为基础，用量小、免疫原性好，而且免疫期长、使用方便，亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、便于产业化、技术成熟等优点，成为SS2新型疫苗研发的两个重要方向。

SS2的ApuA是一个双功能淀粉酶，由SS2的apuA基因编码，含有6285 个碱基对(bp)，有保守的α-淀粉酶和普鲁兰酶的底物结合、催化结构域，并具有保守的LPNTG基序，这是革兰氏阳性菌表面蛋白质的典型特征。在已有详细研究的同源淀粉酶中，ApuA与肺炎链球菌的SpuA、A群链球菌的PulA和无乳链球菌的SAP，分别具有58％、58％和55％的氨基酸序列同源性。SpuA已被证实是肺炎链球菌主要的毒力因子，与二型肺泡细胞糖原有高度亲和性。PulA可介导A群链球菌黏附5种人口咽腔肿瘤细胞系(牙龈、喉、舌、扁桃体和鼻)。 SAP介导B群链球菌对人宫颈上皮细胞的黏附，其亚单位疫苗可有效的预防病原菌在宿主体内的定植。2010年，Ferrando等在SS2菌株Strain 10中，将壮观霉素抗性基因盒插入apuA基因的3114bp处，使apuA基因的普鲁兰酶编码序列无法表达，但保留apuA基因的启动子及其α-淀粉酶编码序列。Ferrando发现， ApuA可以促进猪链球菌对猪气管上皮细胞的黏附，是假定的毒力因子。但是，目前尚无直接证据证实ApuA是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用也尚不清楚。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中很多发掘出的毒力因子都处于推测和假定的状态，缺乏进一步实验证明这些潜在毒力因子与SS2毒力的确切关系及其致病机制，不利于全面解析SS2感染宿主并致病的分子机制，也制约了新型减毒活疫苗或亚单位疫苗的研发进程。

(2)ApuA作为亚单位疫苗候选蛋白，apuA基因的缺失突变株也是减毒活疫苗候选菌株，需要进一步的实验数据作为理论依据。但是，目前尚无直接证据证实ApuA是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用尚不清楚。

(3)文献报道中的apuA基因只有部分片段被失活，保留了apuA基因的α- 淀粉酶编码序列的功能，其实验结果无法反应全长apuA基因的功能。

解决上述技术问题的难度：

apuA的基因编码序列长度为6285bp，利用现有同源重组的方法，很难得到apuA基因全长编码序列的缺失突变株。

解决上述技术问题的意义：

本发明提供一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的制备方法及其应用，可从细菌基因组上使apuA基因无法转录和表达，并对apuA基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进行了分析，明确了apuA基因与SS2致病性的关系。本发明进一步探索研究SS2菌株的毒力因子及其在SS2与宿主相互作用中发挥的作用，有利于阐明SS2的致病机理、建立快速准确的诊断鉴定方法或开发新型保护性抗原，对进一步提高SS2预防和治疗水平具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用。

本发明是这样实现的，一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株 (Streptococcussuis apuA)，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA， 2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA(Streptococcus suisΔapuA)，已于2019 年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO： M2019041。本发明的菌株具有如下特征：该菌属于球菌科、链球菌属，具有荚膜的革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，呈卵圆形，无鞭毛，不运动，不形成芽孢，常以链形式存在。细菌的增殖需要血清或者血液，在添加5％胎牛血清的TSA 培养基上生长24h，可见透明、湿润的圆形菌落，在添加5％鲜血的TSA培养基上生长24h，可见α-溶血环。

本发明的另一目的在于提供一种所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法包括：由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒代替后所得； apuA基因全长6285bp，选择apuA基因启动子(93bp)与apuA基因5’端(2593 bp)共计2686bp的片段进行缺失获得；

进一步，SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。

进一步，所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法具体包括：

(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp 序列和apuA基因5’端下游1000bp序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm⁺；

(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm⁺-下游的顺序定向连接到温敏型自杀性穿梭载体pSET4S中，得到重组自杀性穿梭质粒 pSET4S-ΔapuA；

(3)经测序鉴定正确后，将自杀性质粒pSET4S-ΔapuA转入SC19菌株中，筛选具有红霉素抗性的克隆，利用荧光定量PCR获得2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

进一步，步骤(3)的具体为：

1)制备2型猪链球菌SC19菌株的感受态细胞，加入pSET4S-ΔapuA质粒，混匀后进行电击，复苏后将菌液涂布在含壮观霉素(spc)的大豆胰蛋白琼脂培养基TSA平板上，28℃温箱中恒温培养48h，得到含有穿梭质粒的猪链球菌单克隆；

2)将具有壮观霉素抗性的单克隆接种于含有红霉素的大豆胰蛋白肉汤TSB 液体培养基中，37℃恒温传代培养；过程会发生同源重组，温敏型穿梭质粒pSET4S会丢失；将传代培养的菌液稀释后涂布于含红霉素的TSA平板，置于 37℃培养12h后，通过抗性筛选疑似apuA基因敲除突变株；

3)经RT-PCR鉴定后证实apuA基因被红霉素抗性基因盒序列erm⁺所取代，获得了2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

本发明的另一目的在于提供一种所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株在分析ApuA影响SS2致病性的分子机制的应用。(如研究ApuA作为黏附素介导2 型猪链球菌黏附宿主上皮细胞、作为毒力因子影响2型猪链球菌的致病性、协助2型猪链球菌逃避免疫系统监视等)。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的2型猪链球菌减毒活疫苗。

本发明的另一目的在于提供利用所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的多价基因工程疫苗。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明运用同源重组的原理，构建中间为红霉素抗性基因，两侧为apuA基因片段上下游同源序列的基因敲除载体，将重组载体电转化入SS2强致病株 SC19感受态细胞，通过体内同源重组的方法，经抗性筛选和转录水平鉴定，成功获得apuA基因缺失突变株，命名为ΔapuA。apuA基因的启动子和5’端序列被红霉素抗性基因盒取代，apuA基因无法转录和表达，因此apuA基因缺失突变株ΔapuA的实验结果可信，可用于ApuA的功能研究。

本发明构建的apuA基因敲除突变株ΔapuA，可用于研究ApuA作为毒力因子影响SS2致病性的分子机制，为进一步研究SS2的致病机理奠定了基础。

本发明对apuA基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进行了分析，明确了apuA基因与SS2致病性的关系。该突变菌株为多价亚单位疫苗的保护性抗原的筛选提供了理论依据，可应用于开发或制备SS2减毒活疫苗及多价基因工程疫苗。

附图说明

图1是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的apuA基因5’端的RT-PCR鉴定图。

图2是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的lacl_tr基因的 RT-PCR检测结果图。

图3是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的sgaT基因的 RT-PCR检测结果图。

图4是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的形态观察图。

图5是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的抗吞噬能力比较图。

图6是本发明实施例提供的野生株SC19与突变株ΔapuA的黏附能力比较图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

ApuA是亚单位疫苗候选蛋白，apuA基因的缺失突变株是减毒活疫苗候选菌株，但是需要进一步的实验数据作为理论依据。目前尚无直接证据证实ApuA 是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用也尚不清楚。另外，apuA的基因编码序列长度过长，利用现有同源重组的方法，很难得到apuA 基因全长编码序列的缺失突变株。

为解决上述问题，下面结合技术方案对本发明作详细描述。

本发明实施例提供的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒(erythromycin resistancecassette，以下简称erm⁺)代替后所得。因apuA基因全长6285bp，通过同源重组的方法全部敲除存在很大的困难，故选择该基因启动子(93bp)与apuA基因5’端(2593bp)共计2686bp的片段进行缺失。SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，全基因组测序已经完成，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。

所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA(Streptococcus suis ΔapuA)，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。

本发明实施例提供的构建所述的SS2apuA基因敲除突变株的方法，包含以下步骤：

(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp 和apuA基因5’端下游1000bp；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm⁺；

(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm⁺-下游的顺序定向连接到温敏型自杀性穿梭载体pSET4S中，得到重组自杀性穿梭质粒pSET4S-ΔapuA。

(3)经测序鉴定正确后，将自杀性质粒pSET4S-ΔapuA转入SC19菌株中，筛选具有红霉素抗性的克隆，利用荧光定量PCR(RT-PCR)证实获得2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

上述步骤(3)的具体操作为：

(1)制备2型猪链球菌SC19菌株的感受态细胞，加入pSET4S-ΔapuA质粒，混匀后进行电击，复苏后将菌液涂布在含壮观霉素(spc)的大豆胰蛋白琼脂培养基(TSA)平板上，28℃温箱中恒温培养48h，得到含有穿梭质粒的猪链球菌单克隆。

(2)将具有壮观霉素抗性的单克隆接种于含有红霉素的大豆胰蛋白肉汤 (TSB)液体培养基中，37℃恒温传代培养。此过程会发生同源重组，温敏型穿梭质粒pSET4S会丢失。将传代培养的菌液稀释后涂布于含红霉素的TSA平板，置于37℃培养12h后，通过抗性筛选疑似apuA基因敲除突变株。

(3)经RT-PCR鉴定后证实apuA基因被红霉素抗性基因盒序列erm⁺所取代，获得了2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

本发明的菌株具有如下特征：该菌属于球菌科、链球菌属，具有荚膜的革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，呈卵圆形，无鞭毛，不运动，不形成芽孢，常以链形式存在。细菌的增殖需要血清或者血液，在添加5％胎牛血清的TSA培养基上生长24h，可见透明、湿润的圆形菌落，在添加5％鲜血的TSA培养基上生长24h，可见α-溶血环。

所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，可用于研究ApuA影响 SS2致病性的分子机制，也可用于制备2型猪链球菌减毒活疫苗及多价基因工程疫苗。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：基因敲除载体的构建

(1)设计引物

根据GenBank中登录的SC19菌株全基因组序列，设计扩增apuA基因启动子上游同源臂序列的一对引物Aup-F/Aup-R，设计扩增apuA基因5’端下游同源臂序列的一对引物ANdown-F/ANdown-R。根据GenBank登录的pAT18序列信息，设计扩增红霉素抗性基因盒序列erm⁺的一对引物Erm-F/Erm-R。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1引物设计

(2)目的基因片段的PCR扩增

用细菌基因组提取试剂盒(Trans)提取SC19的全基因组，方法参照说明书。分别以SC19基因组DNA和pAT18质粒(本实验保存)为模板，用Primerstar HS DNA Polymerase(Takara)PCR扩增(1)中所述的3段目的基因。PCR扩增体系为50μL，如下表所示：

PCR的反应条件均为：第一阶段98℃预变性2分钟；第二阶段98℃变性10 秒，56℃退火15秒，72℃延伸1分20秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测后，用Gel Extraction Kit(Trans)回收扩增产物，方法参照说明书。

(3)重组自杀性载体质粒的构建

连接顺序依次为上游同源臂-erm⁺-下游同源臂：

A.纯化后的1000bp apuA基因启动子上游同源臂，用SphI和SalI限制性内切酶(Takara)进行双酶切，pSET4S质粒也同样进行双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，纯化回收目的片段后连接。连接反应体系为10μL，如下所示：目的基因2μL，载体1μL，T4DNA Ligase(Takara)1μL，10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，ddH2O 5μL,16℃连接4小时。连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞(Trans)中，涂布含有100μg/mL spc的LB平板上。37℃培养12 小时后，挑取单克隆培养，用质粒小提试剂盒(Trans)提取重组质粒，进行PCR 鉴定，检测引物为pSET4S的通用检测引物pSET4S-F/pSET4S-R，如表1所示。 1％琼脂糖进行电泳观察，具有1200bp左右条带的为阳性克隆。

B.纯化后的1197bp红霉素抗性基因盒序列erm⁺，用SalI限制性内切酶进行单酶切，A中得到的阳性重组pSET4S质粒也进行SalI单酶切，通过琼脂糖凝胶电泳后纯化回收目的片段。连接反应及后续试验同A所示。经过PCR鉴定后，具有2400bp左右条带的为阳性克隆。

C.纯化后的1000bp apuA基因5’端下游同源臂，用SmaI和EcoRI限制性内切酶(Takara)进行双酶切，B中得到的重组pSET4S质粒也同样进行双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，纯化回收目的片段后连接。连接反应及后续试验同A所示。经过PCR鉴定后，具有3400bp左右条带的为阳性克隆。

将重组质粒插入的序列进行测序，以验证构建的正确性，筛选得到的重组自杀性穿梭质粒pSET4S-ΔapuA。

(4)pSET4S-ΔapuA转入2型猪链球菌野生型菌株SC19中

取2μL质粒pSET4S-ΔapuA，与100μL新鲜制备的SC19电转化感受态细胞混匀，转移到已消毒晾干并预冷的电转杯中，冰上放置5min后准备电转。电转参数设为电压2.5KV，电容25μF，脉冲电阻200Ω。电转后迅速加入1mL 28℃预热的TSB液体培养基，把混合物转移到1.5mL离心管中，28℃180rpm/min 复苏2小时。取复苏后的菌液涂布于含有100μg/mL spc的TSA平板上，28℃恒温培养48小时，得到具有spc⁺erm⁺双抗性的单克隆。

(5)基因敲除突变株ΔapuA的筛选

挑取具有双抗性的猪链球菌单克隆，转接于含100μg/mL spc的TSB培养基中28℃过夜培养。按1:100的比例，转接于含有90μg/mL erm的TSB培养基中， 37℃培养传代，此过程会发生同源重组，温敏型穿梭质粒pSET4S会丢失。将培养的菌液按一定的比例稀释后涂布含有90μg/mL erm的TSA平板，37℃培养12 小时，得到单菌落。

挑取erm平板上的单菌落，分别对应转点到含有erm的TSA平板和含有spc 的TSA平板上，37℃过夜培养。对应观察两个抗性平板，erm平板上生长而spc 上不生长的即为疑似的apuA基因敲除突变菌株(ΔapuA，spc^-erm⁺)。

(6)基因敲除突变株ΔapuA的鉴定

提取疑似突变菌株的全基因组DNA，以apuAN-F/apuAN-R(见表1)为引物进行PCR扩增。野生型SC19菌株的基因组扩增结果作为阳性对照，若对疑似突变株的PCR扩增结果为阴性，则初步从基因组水平确定apuA基因敲除成功。

用SV Total RNA提取试剂盒(Promega)提取SC19与ΔapuA的总RNA，用ReverseTranscription System(Promega)逆转录成cDNA。用cDNA作为模板， PCR检测apuA(引物apuAN-F/apuAN-R)、上游基因lacl_tr(引物 lacl_tr-F/lacl_tr-R，见表1)、下游基因sgaT(引物sgaT-F/sgaT-R，见表1)的转录情况。从图1、图2、图3分析琼脂糖凝胶电泳结果可知，野生株SC19菌株的apuA、lacl_tr与sgaT均可正常转录，ΔapuA的apuA未检测到转录，而上下游基因可正常转录，证明apuA基因敲除突变株ΔapuA构建成功，并且不影响上下游基因的正常转录。

实施例2：生长特性试验

在相同培养条件下，分别挑取SC19与ΔapuA单菌落接种于5mL不含erm 和含erm的TSB液体培养基中，37℃培养过夜。次日分别以1:100的比例转接至5mL新鲜TSB中，于37℃180rpm/min振荡培养，每隔1小时取样测定OD₆₀₀，并测定一次细菌菌落数(CFU)。以培养时间为横坐标，分别以OD₆₀₀和CFU为纵坐标，绘制野生株与突变株的生长曲线，并计算对数期(2～5小时)的斜率。结果表明，ΔapuA的OD₆₀₀和CFU曲线均落后于SC19，ΔapuA在对数期的的生长要慢于野生株。

实施例3：革兰氏染色试验

根据北京Solarbio科技有限公司的革兰氏染色液试剂盒的说明书操作，分别对野生株SC19和突变株ΔapuA进行革兰氏染色，在1000倍光学显微镜下观察，并随机选取视野用Image pro plus 6.0软件计算链长，发现突变株ΔapuA的链明显变长(见图4)。

实施例4：吞噬试验

将RAW 264.7细胞接种于6孔细胞培养板中，待长成细胞单层后，用PBS 洗涤3次，加入无抗性的DMEM培养液(HyClone)，并向其中加入培养至对数生长期的SC-19与ΔapuA，使MOI达到10:1(细菌:细胞)，于37℃作用30min。吸出培养液，用PBS洗涤3次，加入DMEM培养液(含100μg/mL氨苄青霉素) 用以杀灭结合于细胞表面的细菌。孵育2h，用PBS洗涤细胞3次后，用无菌双蒸水裂解细胞。对细胞裂解液进行梯度稀释，将其涂布在含有10％灭活牛血清的TSA培养基上，37℃培养过夜，确定其中含有的细菌数目，计算各菌株被RAW 细胞的吞噬率。由统计结果可以看出，基因敲除突变株ΔapuA的抗吞噬能力较野生株显著下降(见图5)。

实施例5：黏附试验

将HEp-2细胞接种于6孔细胞培养板中，待长成细胞单层后，用PBS洗涤 3次，加入无抗性的DMEM培养液，并向其中加入培养至对数生长期的SC-19 与ΔapuA，使MOI值达到100:1，于37℃作用2小时。吸出培养液，用PBS洗涤3次。用无菌双蒸水裂解细胞，将细胞裂解液梯度稀释后涂布在含有10％灭活牛血清的TSA培养基上，37℃培养过夜，以计算侵入细胞内的和粘附于细胞表面的总细菌数目。实验结果显示，ΔapuA对HEp-2细胞的黏附能力较SC19 显著下降(见图6)，提示apuA基因与细菌黏附宿主上皮细胞的能力相关。

实施例6：小鼠致病性试验

已有文献测得2型猪链球菌SC19菌株对小鼠的半数致死量为1.5×10⁹CFU，全数致死量为3.0×10⁹CFU(Li et al,2011)。为了检测突变株ΔapuA的致病性，将培养至对数生长期的SC19与ΔapuA离心收集菌体，用无菌生理盐水重悬，调至浓度均为3.0×10⁹CFU/0.5-mL(全数致死剂量)。SPF级4～5周龄雌性昆明小鼠30只，随机分为3组，分别腹腔注射SC19、ΔapuA和生理盐水0.5mL。小鼠接种后持续观察一周，及时记录小鼠临床症状和死亡情况。结果发现，用致死剂量的SC19接种小鼠后，小鼠24小时内死亡8只，48小时内全部死亡，而相同剂量下的ΔapuA接种小鼠后，小鼠7天内死亡3只，存活7只，且观察期结束时，存活小鼠均恢复表征健康状态。阴性对照组10只状态均良好。病理组织切片结果显示，ΔapuA感染小鼠的脑、肺组织病理损伤情况，显著轻于野生株接种的小鼠。动物实验结果表明，apuA基因与2型猪链球菌的毒力密切相关，可将其应用于2型猪链球菌减毒疫苗或多价亚单位疫苗的研制。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgcatgct cgcgtgtcat caaccatcc 29

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgtcgaca cgttttctta aatgttaacg gta 33

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccccgggt tgtcacagat gcctatacag ga 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggaattct ggtaaggtcc aagacaaggt c 31

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtcgacct tagaagcaaa cttaagagt 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacgtcgaca tcgatacaaa ttccccgtag 30

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaacgaa cagggatgct aga 23

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctacatcttt accagatact tcaagc 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgacgacat tagccgatgt gg 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctactgaggt gtagtctccc tttcaa 26

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggatttcc ttcaaacccc a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctattctgct tgtgcctcgc c 21

Claims (8)

1.一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。

2.一种如权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法包括：由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒代替后所得；apuA基因全长6285bp，选择apuA基因的启动子93bp与apuA基因的5’端2593bp共计2686bp的片段进行缺失获得。

3.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。

4.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法具体包括：

(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp和apuA基因5’端下游1000bp序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm⁺；

(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm⁺-下游的顺序定向连接到温敏型自杀性穿梭载体pSET4S中，得到重组自杀性穿梭质粒pSET4S-ΔapuA；

(3)经测序鉴定正确后，将自杀性质粒pSET4S-ΔapuA转入SC19菌株中，筛选具有红霉素抗性的单克隆，利用荧光定量PCR获得2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

5.如权利要求4所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体为：

1)制备2型猪链球菌SC19菌株的感受态细胞，加入pSET4S-ΔapuA质粒，混匀后进行电击，复苏后将菌液涂布在含壮观霉素spc的大豆胰蛋白琼脂培养基TSA平板上，28℃温箱中恒温培养48h，得到含有穿梭质粒的猪链球菌单克隆；

2)将具有壮观霉素抗性的单克隆接种于含有红霉素的大豆胰蛋白肉汤TSB液体培养基中，37℃恒温传代培养；过程会发生同源重组，温敏型穿梭质粒pSET4S会丢失；将传代培养的菌液稀释后涂布于含红霉素的TSA平板，置于37℃培养12h后，通过抗性筛选疑似apuA基因敲除突变株；

3)经RT-PCR鉴定后证实apuA基因被红霉素抗性基因盒序列erm⁺所取代，获得了2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

6.一种如权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株在分析ApuA影响SS2致病性的分子机制的应用。

7.一种利用权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的2型猪链球菌减毒活疫苗。

8.一种利用权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的多价基因工程疫苗。