JP2009254350A - 宿主dnaの改変方法および選択マーカーカセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】与体DNAと宿主DNAとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主DNAの対象領域を改変させる方法であって、前記供与体DNAが、宿主DNA中の、前記対象領域の外側の5’側領域、前記対象領域の外側の3’側領域及び前記対象領域の内側の第1相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記3’側領域の相同領域及び前記第1相同組み換え領域の相同領域の間に第1選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第2選択マーカー遺伝子を有し、前記供与体DNAと前記宿主DNAとの間において、前記5’側領域及び前記第1相同組み換え領域で相同組み換えを行う第1工程と、上記相同組み換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の前記3’側領域と供与体DNA由来の前記3’側領域との間で相同組み換えを行う第2工程とを含み、上記第1工程では、前記供与体DNAを組み込んだ宿主を前記第1選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、前記第2工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の対象領域が改変された宿主を選択することを特徴とする、宿主DNAの対象領域の改変方法および当該方法に用いる選択マーカーカセット。
【選択図】なし
Description
また、1つの宿主に対して複数の遺伝子改変を行う際には、使用できる選択マーカー遺伝子の種類が限られてしまう。そこで、形質転換体から選択マーカー遺伝子を除去する方法の開発が望まれている。
例えば、特許文献1には、リプレッサーと該リプレッサーにより抑制されるプロモーターとを利用して、宿主ゲノムの特定領域を欠失させる方法が開示されている。特許文献1に開示された方法は、一旦、供与体DNAと称するDNA断片を相同組み換えによって宿主ゲノムに組み込み、その後、供与体DNAの一部領域と宿主ゲノムの一部領域との間で相同組み換え行うことによって、供与体DNAとともに宿主ゲノムの特定領域を欠失させる方法である。この方法において、供与体DNAにはリプレッサー遺伝子が含まれており、且つ、宿主ゲノムには、当該リプレッサー存在下で発現が抑制されるプロモーターと該プロモーターの制御下に薬剤耐性遺伝子とが含まれている。この方法において、供与体DNAには選択マーカー遺伝子が含まれているため、これを指標として供与体DNAが組み込まれた宿主DNAを選抜することができる。また同時に、供与体DNAが宿主ゲノムに組み込まれると、薬剤耐性遺伝子の発現抑制によって薬剤感受性株となる。そして、供与体DNAが宿主ゲノムから欠失すると、薬剤耐性遺伝子の発現が回復することとなり薬剤抵抗性株となる。
そのため、従来のファージ等を用いる方法に比べてより簡便な操作で、かつ一つの細胞に比較的長いDNA断片を複数挿入できる方法の開発が望まれていた。とくに最近は、メタゲノム解析による環境中のDNA解析が盛んに行われており、従来の方法ではクローニングが困難なDNA断片を、クローニングすることができる新しいツールおよび方法が望まれてきている。
前記特許文献1に記載された方法でも、予め宿主ゲノムに選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを導入する工程が必須となり、作業効率の点から必ずしも優れた方法であるとは言えなかった。さらに、この予め導入した発現カセットは、宿主ゲノムの特定領域を欠失させた後も宿主ゲノム中に残存することになる。
また、従来のプラスミドを用いた方法では、サイズの大きなDNA断片又は致死性の遺伝子を宿主DNAの所望の領域に導入することは困難であった。ファージやコスミドを用いた方法では、一つの細胞の複数の遺伝子座に複数の遺伝子を挿入することは不可能であった。
具体的には、宿主DNAの所望の領域を欠失させ、かつ欠失後の宿主DNA中に選択マーカー遺伝子等が残存しない宿主DNAの改変方法、また、宿主DNAの任意の領域を所望のDNA配列(特に、サイズの大きなDNA断片、宿主への導入が困難なDNA、複数の遺伝子群など)で置換し、かつ置換後の宿主DNA中には所望のDNA配列のみが挿入され、選択マーカー遺伝子等が残存しない宿主DNAの改変方法を提供することを課題としている。
本発明に係る宿主DNAの対象領域の改変方法(以下、本発明の改変方法ともいう。)は、供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主DNAの対象領域を改変させる方法であって、前記供与体DNAが、宿主DNA中の、前記対象領域の外側の5’側領域、前記対象領域の外側の3’側領域及び前記対象領域の内側の第1相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記3’側領域の相同領域及び前記第1相同組み換え領域の相同領域の間に第1選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第2選択マーカー遺伝子を有し、前記供与体DNAと前記宿主DNAとの間において、前記5’側領域及び前記第1相同組み換え領域で相同組み換えを行う第1工程と、上記相同組み換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の前記3’側領域と供与体DNA由来の前記3’側領域との間で相同組み換えを行う第2工程とを含んでいる。
また、本発明に係る宿主DNAの対象領域の改変、欠失、置換方法において、前記第2選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、例えば宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードする遺伝子を利用することができる。この場合、前記第2工程を経て供与体DNA由来の選択マーカー遺伝子を欠失し、且つ目的のDNA改変が行われた宿主は生育することができる。一方、供与体DNA由来の選択マーカー遺伝子が宿主ゲノムに残存した宿主は、発現誘導条件下で致死となる。そのため、供与体DNA由来の選択マーカー遺伝子の残存の有無をポジティブセレクションによって判定することができる。ここで、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定されないが、例えばchpA遺伝子を挙げることができる。
ここで、前記第2選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることが好ましい。特に、前記第2選択マーカー遺伝子としてはchpA遺伝子を適用することができる。また、前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることが好ましい。さらに、前記第1選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子を利用することができる。また、本発明に係る選択マーカーカセットは枯草菌ゲノム内に組み込んだ状態であってもよい。
さらに、本発明は、本発明の前記方法を用いて対象領域が改変(欠失、置換)された宿主の作成方法に関する。
本発明の方法では、改変後の宿主DNA中に、改変工程(欠失工程あるいは置換工程)で利用した第1選択マーカー遺伝子及び第2選択マーカー遺伝子が共に残存しない。そのため、本発明の方法によれば、選択マーカー遺伝子の利用範囲を何ら制限することなく、所望の形質転換体を作成することができる。特に、本発明の方法は、宿主DNA中の複数の領域を改変させた変異株を作成する場合において、選択マーカー遺伝子を制限無く使用することができるため、選択マーカー遺伝子を宿主に残存させる遺伝子改変方法に比較し操作を大幅に簡易化することができる。さらに上記選択マーカー遺伝子に加えて、本発明の方法では、改変工程において利用したその他の領域(第一相同組み換え領域、プロモーター配列等)も改変後の宿主DNA中に残存することはない。そのため本発明の方法は、同一の宿主に対して複数回の改変を繰り返し行う場合も、操作を容易に行うことができる。
本発明の方法を用いることで、選択マーカー遺伝子が宿主に残存することによって生じる環境への悪影響を防ぐことができる。例えば、宿主が病原性を有する場合、薬剤耐性遺伝子が残存した菌株、すなわち薬剤耐性菌によって環境が汚染される危険性が存在する。また、薬剤耐性遺伝子が残存した菌株は、通常組み替え生物として扱われるため、拡散防止措置が厳格に要求されることとなる。そのため、該菌株の製造・使用・保存時において、取り扱いに制限が課されたり、拡散を防止するための作業が必要とされるため、作業工程が煩雑化する。本発明の改変方法を用いれば、このような選択マーカー遺伝子の残存に起因する環境面での問題を解決することができる。
また、本発明の方法では、改変対象領域が宿主DNA中の特定の位置に限定されず、任意の領域を改変対象領域とすることができる。
さらに、本発明の方法では、改変対象領域を広範な領域にわたり設定することが可能である。すなわち、宿主DNA中の広範囲にわたる領域を欠失させたり、置換することができる。
本発明において、「宿主DNAの対象領域を改変する」とは、宿主DNA中の対象領域のDNA配列を変化させることをいい、具体的には、宿主DNA中から対象領域のDNA配列を欠失させること、宿主DNA中の対象領域のDNA配列を所望のDNA配列で置換して宿主DNA中に所望のDNA配列を挿入することを言う。
本発明に係る宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法の実施態様を図1に示す。図1の実施態様によれば、宿主DNA中の欠失対象領域を欠失させることができる。
本発明に係る宿主DNAの置換対象領域の置換方法の実施態様を図2に示す。図2の実施態様によれば、宿主DNA中の置換対象領域を所望のDNA配列で置換することで当該領域に所望のDNA配列を挿入することができる。
本発明において、「宿主DNAの対象領域」とは、宿主DNA中に存在する任意の領域であって、DNA配列の改変を行う領域を言う。具体的には、本発明の欠失方法の場合は、欠失対象領域、すなわち宿主DNAから欠失することが望まれる領域をいい、本発明の置換方法の場合には、置換対象領域、すなわち所望のDNA配列によって置換されることが望まれる宿主DNA上の領域を言う。例えば、対象領域としては、宿主DNAの不要な領域、例えば宿主の物質生産に不要な領域(胞子形成関連遺伝子など)、または宿主の生育、物質生産を阻害する領域(ファージ領域など)、また、宿主内で多数重複している遺伝子や遺伝子グループ(2成分制御系遺伝子など)などが挙げられる。
本発明において、対象領域(欠失対象領域、置換対象領域)は、本発明の改変、欠失、置換方法適用前に既に宿主DNAに存在する領域であればいずれの領域であってよく、例えば、本来的に存在する領域でもよいし、本発明の方法適用前に人為的に導入された領域でもよい。人為的に導入された領域としては、例えば、選択マーカー遺伝子やレポーター遺伝子を含む領域などが挙げられる。
本発明の改変、欠失、置換方法では、対象領域のサイズは、特に限定されないが、1bp以上が好ましく、0.2kb以上がより好ましく、0.5kb以上が最も好ましい。対象領域のサイズは、200kb以下が好ましく、160kb以下がより好ましく、120kb以下が更に好ましく、80kb以下が特に好ましく、40kb以下が最も好ましい。対象領域のサイズを200kb以下とした場合には、対象領域内に生育に必至な遺伝子(以下、「生育必須遺伝子」という)を含まない蓋然性が高いからである。ここで生育必須遺伝子とは、外部から培地へ添加する等の方法によっても補うことのできない機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味し、宿主ゲノムから削除されると致死となる遺伝子である。換言すると、宿主ゲノムから削除されると宿主が生存できない、すなわち致死となることが知られる遺伝子であっても、培地に補完物質(例えば代謝関連物質等)を添加することによって宿主の生育を維持できるのであれば、対象領域に含まれていても良い。なお、枯草菌において、生育必須遺伝子を含まない最大の領域は、dltA遺伝子〜yycH遺伝子間の約200kbであることが知られている(例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,4679(2003)参照)。
図1および図2において、それぞれ5’外側領域をAで示し、3’外側領域をBで示す。
第1相同組み換え領域Cの位置は、上述した5’外側領域の近傍に位置していれば特に限定されないが、5’外側領域から3’方向に0kb〜200kb離間している領域であることが好ましく、0kb〜140kb離間している領域であることが特に好ましい。
宿主DNAの5’外側領域と3’外側領域との間に十分な長さの第1相同組み換え領域が無い場合、または5’外側領域と3’外側領域との間にDNA配列が全く無い場合は、一般的な遺伝子挿入方法を用いて、あらかじめ既知のDNA配列(例えば、薬剤耐性遺伝子配列等)を宿主DNAに挿入して第1相同組み換え領域とすることができる。例えば、図3に示すように、宿主DNA由来の領域A、領域B、及び薬剤耐性遺伝子配列をSOE(splicing by overlap extension)-PCR法(例えば、Horton,RM.,et al.:Gene,77,pp.61-68(1989)参照)によって構築し、これを用いて宿主DNAの領域Aおよび領域Bで二重交差の相同組換えを起こさせることにより、宿主DNAに薬剤耐性遺伝子を導入することができる。
上述のように、第1相同組み換え領域として薬剤耐性遺伝子等のDNA配列があらかじめ導入された宿主DNAを用いて、本発明の置換方法を行うことで、宿主DNA本来の配列を保持したまま、目的のDNA配列のみを宿主DNAに挿入することが可能となる(図4参照)。この場合、第1相同組み換え領域としてあらかじめ挿入されたDNA配列は、後述の第2相同組み換え工程において宿主DNAより削除され、改変後の宿主DNAに残存することはない(図4(iv)参照)。本発明の置換方法の一実施態様として、このような宿主DNA配列を保持したまま、所望のDNA配列を対象領域に挿入する場合も、本発明の方法に包含される。
供与体DNAは、宿主DNA中の上記5’外側領域及び3’外側領域により挟み込まれる対象領域(欠失対象領域、置換対象領域)を改変、欠失、置換するために用いられる。本発明の改変、欠失、置換方法に用いる供与体DNAは、宿主DNAの5’外側領域A、3’外側領域B及び第1相同組み換え領域Cとそれぞれ相同性を有する領域(相同領域)をこの順で有しており、さらに3’外側領域Bの相同領域及び第1相同組み換え領域Cの相同領域の間に選択マーカーカセットを有している(図1(i)及び図2(i):供与体DNA参照)。以下、供与体DNAのこれらの相同領域を単に、「供与体DNAの5’外側領域」、「供与体DNAの3’外側領域」、「供与体DNAの第1相同組み換え領域」とも称する。また、図1及び図2において、供与体DNAの5’外側領域をA、供与体DNAの3’外側領域をB、供与体DNAの第1相同組み換え領域をCで示す。
ここで選択マーカーカセットとは、第1選択マーカー遺伝子M1、発現誘導型プロモーターと、発現誘導型プロモーターの制御下に発現する第2選択マーカー遺伝子M2を有する核酸断片である。
選択マーカーカセットのサイズは、特に限定されないが、3kb〜10kbであることが好ましく、3kb〜5kbあることがより好ましい。
本発明においては、選択マーカー遺伝子M1として、薬剤耐性遺伝子を用いることが好ましく、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子が特に好ましく用いられる。
なかでも、本発明において用いることができる致死遺伝子として、chpA遺伝子(リボヌクレアーゼをコードする遺伝子)及びccdB遺伝子(DNAジャイレースの阻害剤をコードする遺伝子)等の細胞増殖阻害タンパク質をコードする遺伝子を利用することがより好ましい。chpA遺伝子等の致死遺伝子が発現する細胞は増殖できず死滅する。したがって、chpA遺伝子等の致死遺伝子を第2選択マーカー遺伝子M2として用いた場合、後述する第2相同組み換え工程で第2選択マーカー遺伝子M2を脱落した細胞は増殖し生育することができるため、コロニー形成の有無を指標として所望の形質転換体を選択することができる。
本発明に用いられる発現誘導型プロモーターとしては、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導する機能を持ったプロモーターが好ましい。
本発明の置換方法に用いられる供与体DNAは、上述した供与体DNAの構成に加えて、さらに供与体DNAの5’外側領域と供与体DNAの3’外側領域との間に所望のDNA配列を有する(図2(i):供与体DNA参照)。
本発明において、「所望のDNA配列(以下、「目的DNA配列」とも言う。)」としては、宿主DNAの対象領域に挿入することができれば、いかなるDNA配列であってもよい。例えば、タンパク質やプロモーター等の調節因子をコードする遺伝子等が挙げられる。また、所望のDNA配列は、これらの遺伝子等を複数含んでいても良い。例えば、目的DNA配列として、プロモーター配列及びタンパク質をコードする遺伝子配列を有していてもよいし、複数の調節因子と複数の遺伝子配列を有していてもよい。
本発明の置換方法において、挿入される目的DNA配列のサイズは、供与体DNAが細胞内に導入できれば特に制限されないが、1bp以上10kb以下であることが好ましく、1bp〜5kbであることがより好ましい。
また、目的DNA配列及び供与対DNAは、必ずしもPCR産物である必要はない。例えば、制限酵素により消化された目的DNA配列をDNAリガーゼによって供与体DNAの5’外側領域と供与体DNAの3’外側領域との間に結合し、得られたDNA断片(5’外側領域−目的DNA配列−3’外側領域)をPCR法によって増幅し、増幅産物と選択マーカーカセットとをDNAリガーゼにより結合することで供与体DNAを調整することもできる。
そのため、本発明の置換方法を用いれば、例えば、一つの生合成系を作っている蛋白質をコードする遺伝子群や蛋白質複合体を形成して働く蛋白質群をコードする遺伝子群を同一細胞内に挿入することができる。その結果、挿入したこれらの遺伝子群を同時に細胞内で発現させることで、細胞内で遺伝子群の機能解析を行うことも可能になる。また、近年、メタゲノム解析において、環境中のDNAをプラスミドにクローニングし、シークエンスを行うことが進められている。環境中に存在するDNAの中には、プラスミドではクローニングできないDNA断片も多く、このようなDNA断片のクローニング及びDNA断片に含まれる遺伝子の機能解析にも、本発明の置換方法は有用である。
宿主が枯草菌である場合には、コンピテントセル形質転換法(例えば、J.Bacterial.93,1925(1967)参照)やLP形質転換方法(例えば、T.Akamatsu及びJ.Sekiguchi,Archives of Microbiology,1987,146,p.353-357;T.Akamatsu及びH.Taguchi,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65,4,p.823-829参照)を用いることができる。
動物細胞を宿主とする場合、動物細胞へのDNAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞へのDNAの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。植物を宿主とする場合は、植物細胞へのDNAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びPEG法等が挙げられる。
ここで、相同組み換えが生じる条件下とは、宿主が本来的に有している組換え反応に関与する酵素等の機能を失っていない状態を意味する。
供与体DNAと宿主DNAとの間の組換え方法としては、例えば、一般的なコンピテントセル形質転換方法(例えば、J.Bacterial.,Vol.93,p.1925(1967)参照)、プロトプラスト形質転換法(例えば、Mol.Gen.Genet.168,111(1979)参照)、エレクトロポレーション法(例えば、FEMS Microbiol.Lett.55,135(1990)参照)又はLP形質転換方法(例えば、T.Akamatsu及びJ.Sekiguchi,Archives of Microbiology,1987,146,p.353-357;T.Akamatsu及びH.Taguchi,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65,4,p.823-829参照)が挙げられる。例えば、宿主が枯草菌である場合、コンピテントセル形質転換方法(例えば、J.Bacterial.,Vol.93,p.1925(1967)参照)に従って以下の様に形質転換を行うことができる。
以上の工程により、宿主細胞内に供与体DNAが導入され、供与体DNAと宿主DNAとの間で第1相同組み換えが起こる(図1(i)〜(ii)及び図2(i)〜(ii)「第1相同組み換え」参照)。
なお、本発明において「ポジティブセレクション」とは、目的の形質転換体のみが特定の培地において増殖能を有することを指標として、目的の形質転換体を選択する方法を言う。
一方、本発明において「ネガティブセレクション」とは、目的の形質転換体のみが特定の培地にて増殖能を失ったことを指標として目的の形質転換体を選択する方法または特定のタンパク質の生産能を失ったことを指標として目的の形質転換体を選択する方法を言う。ここで、「特定の培地において増殖能を失う」とは、例えば、目的の形質転換体が特定のタンパク質の生産能を欠失した結果、特定の培地で増殖または生存できなくなることを意味する。
さらに、選択圧に起因するspacプロモーター変異による擬陽性のクローン取得をなくすために、第1選択マーカー遺伝子の欠落による表現型の変化を同時に確認することが好ましい。たとえば、第1選択マーカー遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子の場合、100μg/mlのスペクチノマイシンを添加した寒天平板培地上で生育できないクローンを選択し、スペクチノマイシン感受性を確認することが好ましい。このように第1選択マーカー遺伝子の欠落による表現型の変化を指標として併用することで、非常に高い精度(ほぼ100%の確率)で目的とする個体を得ることができる。
施例に限定されるものではない。
本実施例では、枯草菌168株ゲノム上の1,879,258bpから1,899,742bpまでのpro5領域(20485bp)を欠失対象領域として、当該領域を欠失させる実験を行った。本実施例で使用したプライマー配列を表1にまとめた。またそのフローを図5及び図6に示した。
先ず、枯草菌168株aprE遺伝子領域にスペクチノマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子、lacI遺伝子、Pspac-chpA遺伝子を含むDNA断片を挿入した枯草菌168(aprE::spec, lacI, Pspac-chpA)株、及び168(aprE::Km, lacI, Pspac-chpA)株を以下のように作製した。
次に、上記で作製したDNA断片を制限酵素ApaI及びBamHIで消化し、制限酵素処理断片を得た。同様に、ベクターpAPNC213(スペクチノマイシン耐性遺伝子含有)またはpAPNCK(カナマイシン耐性遺伝子含有)を制限酵素ApaI及びBamHIで消化し、制限酵素処理断片を得た。こうして得られた制限酵素処理断片を、DNAライゲースを用いて結合した。
得られた環状DNAを用いて枯草菌168株を形質転換した。100μg/mlのスペクチノマイシンもしくは5μg/mlカナマイシンを含むLB寒天平板培地で培養して、目的の形質転換体を選択し、168(aprE::spec, lacI, Pspac-chpA)及び168(aprE::Km, lacI, Pspac-chpA)株を構築した。
1.第一相同組み換え
上述のように取得された供与体DNAを用いて、枯草菌168株を形質転換した。形質転換の条件は、コンピテントセル形質転換方法(例えば、J.Bacterial.93,192(1967)参照)に従い、PCR産物(供与体DNA)を20μg以上用いて行った。枯草菌形質転換は、1μgのPCR断片を400μlのコンピテントセルに加え、更に1.5時間培養し第1相同組み換え(図6(i)〜(ii)参照)を行った。
次に、スペクチノマイシン耐性またはカナマイシン耐性遺伝子を指標として選択された形質転換体を、LB液体培地で一晩培養した。培養液を希釈後、1mM IPTGを添加したLB寒天プレートに塗布した。その結果、48個のコロニーが得られた。IPTG含有LB寒天プレート上で生存し、コロニー形成が確認されたこれらの形質転換枯草菌は、第2相同組み換えによって、宿主DNAの欠失対象領域及び供与体DNAがともに改変後の宿主DNAから欠失したものである(図6(iii)〜(iv)参照)。
また、本実施例では、形質転換過程において使用した選択マーカー遺伝子であるスペクチノマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子が、最終的に得られた形質転換体に残存していない。したがって、得られた形質転換体は、再度、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして利用した形質転換実験等に使用可能である。
本実施例では、枯草菌168株ゲノム上の1,690,526bpから1,695,233bpまでのflgB-fliH領域(4708bp)を目的DNA配列として、当該DNA配列を宿主DNAの対象領域に挿入する実験を行った。本実施例で使用したプライマー配列を表2にまとめた。またそのフローを図7に示した。
実施例1で得られた枯草菌168(aprE::spec, lacI, Pspac-chpA)株の染色体DNAを鋳型として、APNC-Fプライマー(配列番号7)とchpA-Rプライマー(配列番号6)を用いてPCRによりDNA断片を増幅した(図5参照)。増幅したDNA断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌168株の染色体DNAを鋳型として、flgB-fliH領域、挿入領域の5’外側領域(断片A)、挿入領域の3’外側領域(断片B)及び第1相同組み換え領域(断片C)を、それぞれflgB-F(配列番号16)とfliH-R(配列番号17)、aprEclone-fF(配列番号18)とaprEclone-fR(配列番号19)、aprEclone-bF(配列番号20)とaprEclone-bR(配列番号21)、及びaprEclone-mF(配列番号22)とaprEclone-mR(配列番号23)のプライマーセットを用いてPCRにより増幅した(図7(i)参照)。
1.第一相同組み換え
形質転換および第1相同組み換えにより得られた形質転換体の選択は上述の実施例1と同様に行った。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体を、LB液体培地で一晩培養した。培養液を希釈後、1mM IPTGを添加したLB寒天プレートに塗布した。その結果、100個以上のコロニーが得られた。IPTG含有LB寒天プレート上で生存し、コロニー形成が確認されたこれらの形質転換枯草菌は、第2相同組み換えによって、宿主DNAの対象領域にflgB-fliH領域(目的DNA配列)が挿入され、同時に選択マーカー遺伝子カセットが改変後の宿主DNAから欠失したものである(図7(iii)〜(iv)参照)。
また、本実施例では、形質転換工程において使用した選択マーカー遺伝子であるスペクチノマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子が、最終的に得られた形質転換体に残存していない。したがって、得られた形質転換体は、再度、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして利用した形質転換実験等に使用可能である。
Claims (24)
- 供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主DNAの対象領域を改変させる方法であって、
前記供与体DNAが、宿主DNA中の、前記対象領域の外側の5’側領域、前記対象領域の外側の3’側領域及び前記対象領域の内側の第1相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記3’側領域の相同領域及び前記第1相同組み換え領域の相同領域の間に第1選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第2選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体DNAと前記宿主DNAとの間において、前記5’側領域及び前記第1相同組み換え領域で相同組み換えを行う第1工程と、
上記相同組み換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の前記3’側領域と供与体DNA由来の前記3’側領域との間で相同組み換えを行う第2工程とを含み、
上記第1工程では、前記供与体DNAを組み込んだ宿主を前記第1選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第2工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の対象領域が改変された宿主を選択することを特徴とする、宿主DNAの対象領域の改変方法。 - 供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主DNAの欠失対象領域を欠失させる方法であって、
前記供与体DNAが、宿主DNA中の、前記欠失対象領域の外側の5’側領域、前記欠失対象領域の外側の3’側領域及び前記欠失対象領域の内側の第1相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記3’側領域の相同領域及び前記第1相同組み換え領域の相同領域の間に第1選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第2選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体DNAと前記宿主DNAとの間において、前記5’側領域及び前記第1相同組み換え領域で相同組み換えを行う第1工程と、
上記相同組み換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の前記3’側領域と供与体DNA由来の前記3’側領域との間で相同組み換えを行う第2工程とを含み、
上記第1工程では、前記供与体DNAを組み込んだ宿主を前記第1選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第2工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の欠失対象領域が欠失した宿主を選択することを特徴とする、宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。 - 前記第2工程において、第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の欠失対象領域が欠失した宿主をポジティブセレクションによって選択することを特徴とする請求項2記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 前記第2選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項2または3記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 前記第2選択マーカー遺伝子はchpA遺伝子であることを特徴とする請求項2〜4のいずれか一項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項2〜5のいずれか一項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 前記第1選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項2〜6のいずれか一項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項2〜7のいずれか一項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主DNAの置換対象領域を所望のDNA配列で置換する方法であって、
前記供与体DNAが、宿主DNA中の、前記置換対象領域の外側の5’側領域、前記置換対象領域の外側の3’側領域及び前記置換対象領域の内側の第1相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、前記5’側領域の相同領域と前記3’側領域の相同領域との間に所望のDNA配列を有し、更に前記3’側領域の相同領域及び前記第1相同組み換え領域の相同領域の間に第1選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第2選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体DNAと前記宿主DNAとの間において、前記5’側領域及び前記第1相同組み換え領域で相同組み換えを行う第1工程と、
上記相同組み換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の前記3’側領域と供与体DNA由来の前記3’側領域との間で相同組み換えを行う第2工程とを含み、
上記第1工程では、前記供与体DNAを組み込んだ宿主を前記第1選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第2工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の置換対象領域が所望のDNA配列で置換された宿主を選択することを特徴とする、宿主DNAの置換対象領域の置換方法。 - 前記第2工程において、第2の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主DNA中の置換対象領域が置換された宿主をポジティブセレクションによって選択することを特徴とする請求項9記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 前記第2選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項9または10記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 前記第2選択マーカー遺伝子はchpA遺伝子であることを特徴とする請求項9〜11のいずれか一項記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項9〜12のいずれか一項記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 前記第1選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項9〜13のいずれか一項記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項9〜14のいずれか一項記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法。
- 前記第1選択マーカー遺伝子、前記発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な前記第2選択マーカー遺伝子を有し、前記供与体DNAの3’側領域の相同領域と第1相同組み換え領域の相同領域との間に位置することを特徴とする、請求項1記載の宿主DNAの対象領域の改変方法に用いられる選択マーカーカセット。
- 前記第2選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項16記載の選択マーカーカセット。
- 前記第2選択マーカー遺伝子はchpA遺伝子であることを特徴とする請求項16または17記載の選択マーカーカセット。
- 前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
- 前記第1選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項16〜19のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
- 枯草菌ゲノム内に組み込まれていることを特徴とする請求項16〜20のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
- 請求項1記載の宿主DNAの対象領域の改変方法を用いて、宿主DNAの対象領域を改変させる工程を含む、対象領域が改変された宿主の作成方法。
- 請求項2〜8のいずれか一項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法を用いて、宿主DNAから欠失対象領域を欠失させる工程を含む、欠失対象領域の欠失した宿主の作成方法。
- 請求項9〜15のいずれか一項記載の宿主DNAの置換対象領域の置換方法を用いて、宿主DNAの置換対象領域を置換させる工程を含む、置換対象領域が置換された宿主の作成方法。
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