JP7133671B2 - インビトロウイルスゲノム工学のための組成物及びその方法 - Google Patents
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Description
本出願は、USC§119(e)に基づき、2014年12月16日に出願された米国仮特許出願第62/092,707号、2015年1月12日に出願された米国仮特許出願第62/102,362号及び2015年10月16日に出願された米国仮特許出願第62/242,811号の優先権を主張するものであり、各出願の全内容を参考として本明細書に援用する。
本出願は、米国特許法施行規則1.52(e)(iii)(5)に従って、2015年12月15日に作成されたキロバイトファイルサイズ(139kb)の配列表テキストファイル「SGI1840_3WO_Sequence_Listing_ST25.txt」として本出願とともに提出された核酸配列に関する参照を含み、当該ファイルの全体を参考として本明細書に援用する。
本開示は、全般的に、ゲノムの迅速な操作、より具体的には、ウイルスゲノムをインビトロで操作することに関する。
ウイルスは、多くの化学的用途、特に、予防法、治療法及び診療法の開発に使用されている。これらの目的のために、ウイルスは、遺伝子操作を受けることが多い。インビボ工学は、扱いやすい宿主生物を必要とし、多くの場合、改変されたウイルス及びウイルスベクターを作製するのに数週間から数ヶ月かかることがある(Levin and Bull,Nat Rev Microbio1.2004 Feb;2(2):166-73(非特許文献1)、参考として本明細書に援用する)。更に、細胞中で多数のウイルスゲノムを操作することに本質的に付随する毒性への懸念がある。大きなウイルスゲノムに対するインビトロ遺伝子工学の方法を開発する努力は、固有の制限酵素標的配列の利用可能性と、ゲノム消化及びそれに続く組換えアセンブリにて得られる効率の低さにより、これまでのところ制限されている。更に、ウイルスゲノム末端の不正確な予想により、遺伝子工学の多くの努力が妨げられている。例えば、一般に入手可能なPB1様ウイルスゲノムは、末端配列がゲノムの中央部に誤って配置されており、これは、現在のシーケンシング及びインシリコゲノムアセンブリ方法を使用する際によく生じるエラーである(Ceyssens et al.,Environ Mibrobiol.2009 Nov;11(11):2874-83(非特許文献2))。
[本発明1001]
宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して2つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルス。
[本発明1002]
産生された前記ウイルス粒子が、少なくとも3つの改善されたウイルス特性を有する、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1003]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1004]
前記操作されたウイルス核酸が、操作されたウイルスゲノムである、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1005]
前記操作されたウイルスゲノムが、操作されたバクテリオファージゲノムである、本発明1004の操作されたウイルス。
[本発明1006]
前記改善されたウイルス特性のうちの少なくとも1つが宿主域である、本発明1005の操作されたウイルス。
[本発明1007]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも1つの改変の結果である、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1008]
少なくとも1つの改善されたウイルス特性が、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも2つの改変の結果である、本発明1007の操作されたウイルス。
[本発明1009]
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも1つの改変が、1回の工学的ステップの結果である、本発明1007の操作されたウイルス。
[本発明1010]
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも1つの改変が、反復的な工学的ステップの結果である、本発明1007の操作されたウイルス。
[本発明1011]
前記改変の少なくとも1つが、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号5、配列番号48または配列番号49に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある、本発明1007の操作されたウイルス。
[本発明1012]
前記操作されたウイルスゲノムが、LUZ19ゲノムに対して少なくとも85%の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、本発明1004の操作されたウイルス。
[本発明1013]
異種gp18遺伝子の全てまたは一部を更に含む、本発明1012の操作されたウイルス。
[本発明1014]
前記異種gp18遺伝子が、配列番号38に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1013の操作されたウイルス。
[本発明1015]
操作されたgp34遺伝子の全てまたは一部を更に含む、本発明1012の操作されたウイルス。
[本発明1016]
前記操作されたgp34遺伝子が、配列番号5のアミノ酸位置55に対応する位置に変異を含むアミノ酸をコードする、本発明1015の操作されたウイルス。
[本発明1017]
配列番号34、配列番号35、配列番号36及び配列番号48からなる群から選択される配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする1つ以上の核酸配列中における改変を更に含む、本発明1012の操作されたウイルス。
[本発明1018]
前記操作されたウイルスゲノムが、配列番号34に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号35に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号36に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号48に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む、本発明1017の操作されたウイルス。
[本発明1019]
前記改変が、配列番号34のアミノ酸位置17に対応する位置でのCからYへの置換、配列番号48のアミノ酸位置36に対応する位置でのDからYへの置換、配列番号35のアミノ酸位置82に対応する位置でのDからGへの置換、配列番号35のアミノ酸位置83に対応する位置でのIからSへの置換及び配列番号36のアミノ酸位置253に対応する位置でのNからDへの置換を含む、本発明1018の操作されたウイルス。
[本発明1020]
配列番号49に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む、本発明1012の操作されたウイルス。
[本発明1021]
前記改変が、配列番号49に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号49に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子による置換である、本発明1020の操作されたウイルス。
[本発明1022]
前記異種核酸分子が、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46及び配列番号47からなる群から選択される配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む、本発明1021の操作されたウイルス。
[本発明1023]
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号21に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1024]
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号22に含まれる核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、本発明1001の操作されたウイルス。
[本発明1025]
(a)第1のウイルスゲノムを準備することと、
(b)前記第1のウイルスゲノムの少なくとも1つの断片を少なくとも1つの修復核酸分子と結合して、前記第1のウイルスゲノムと比較して少なくとも1つの改変を含む第2のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することとを含み、
前記第2のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、2つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる、
所望のウイルス特性を2つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法。
[本発明1026]
(c)ステップ(a)~(b)を1回以上の反復で繰り返すこと
を更に含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1028]
ステップ(b)の操作されたウイルスゲノムを作製することが、
(1)エンドヌクレアーゼを使用した前記第1のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、
(2)前記消化された第1のウイルスゲノムの少なくとも1つの断片を少なくとも1つの修復核酸分子とアセンブルすることと
を含む、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記第1のウイルスゲノムがウイルス粒子から単離される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第1のウイルスゲノムまたは前記少なくとも1つの修復核酸分子が、デノボ合成される、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記デノボ合成が、化学的に合成された核酸分子、PCR増幅された核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記第1のウイルスゲノムまたは前記少なくとも1つの修復核酸分子が、インビトロ消化の前に増幅される、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記第1のウイルスゲノムが、少なくとも3kb、少なくとも10kb、少なくとも18kb、少なくとも25kbまたは少なくとも30kbである、本発明1026の方法。
[本発明1034]
前記アセンブリがインビトロまたはインビボで実施される、本発明1028の方法。
[本発明1035]
前記アセンブリが、
(a)3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された5’→3’エキソヌクレアーゼと、
(b)3’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型DNAポリメラーゼ、または前記DNAポリメラーゼ及び3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第2のDNAポリメラーゼの混合物と、
(c)単離されたリガーゼと、
(d)dNTPの混合物と
を含む混合物を使用して、
前記操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、前記消化されたウイルス核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記エンドヌクレアーゼがRNA誘導型ヌクレアーゼである、本発明1028の方法。
[本発明1037]
少なくとも1つのガイドRNAを更に含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、Cas9またはCas9由来酵素であり、前記少なくとも1つのガイドRNAが、(1)キメラgRNA、または(2)crRNA及びtracrRNAを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記エンドヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、本発明1028の方法。
[本発明1040]
前記インビトロ消化がスペルミジンを更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1041]
前記操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1042]
前記操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1043]
本発明1026~1046のいずれかの方法によって作製された、操作されたウイルス。
[本発明1044]
本発明1001~1025のいずれかの操作されたウイルスである、本発明1047の操作されたウイルス。
[本発明1045]
(a)精製された組換えRNA誘導型ヌクレアーゼと、
(b)3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された5’→3’エキソヌクレアーゼと、
(c)3’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型DNAポリメラーゼ、または前記DNAポリメラーゼ及び3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第2のDNAポリメラーゼの混合物と、
(d)単離されたリガーゼと
を含む、ウイルス核酸分子を操作するためのキット。
[本発明1046]
(1)クラウディング剤、
(2)dNTPの混合物、及び
(3)好適な緩衝液
のうちの1つ以上を更に含む、本発明1045のキット。
[本発明1047]
個別化されたガイドRNAを更に含む、本発明1045のキット。
[本発明1048]
アセンブリ反応において挿入されるDNA断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む、本発明1045のキット。
[本発明1049]
形質転換のためのコンピテント宿主細胞を更に含む、本発明1045のキット。
[本発明1050]
単離されたウイルスゲノム核酸を更に含む、本発明1045のキット。
[本発明1051]
(a)核酸を準備することと、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼを使用した前記核酸の領域のインビトロ消化と、
(c)前記消化された核酸へのDNA断片の挿入による組換え核酸のアセンブリと
を含み、前記アセンブリは、
(i)3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された5’→3’エキソヌクレアーゼと、
(ii)3’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型DNAポリメラーゼ、または前記DNAポリメラーゼ及び3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第2のDNAポリメラーゼの混合物と、
(iii)単離されたリガーゼと、
(iv)dNTPの混合物と
を含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、前記消化された核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、核酸配列を操作する方法。
[本発明1052]
前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、Cas9またはCas9由来酵素である、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、本発明1051の方法。
[本発明1054]
(d)前記組換え核酸による宿主細胞の形質転換を更に含む、本発明1051の方法。
[本発明1055]
前記核酸が、宿主細胞から単離されたプラスミドである、本発明1051の方法。
[本発明1056]
前記プラスミドが少なくとも6kbである、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記プラスミドが少なくとも10kbである、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記プラスミドが少なくとも15kbである、本発明1055の方法。
[本発明1059]
前記プラスミドが少なくとも20kbである、本発明1055の方法。
CRISPR(クラスター化された規則的な間隔のある短い回文の繰り返し配列)は、塩基配列の短い反復を含有するDNA座位である。各反復の後には、可動性遺伝因子への過去の曝露に由来する「スペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRは、配列決定された細菌ゲノムの約40%及び配列決定された古細菌の90%にみられる。CRISPRは、多くの場合、CRISPR機能に関係するタンパク質をコードするCRISPR関連(cas)遺伝子を伴う。CRISPR-Casシステムは、原核生物の免疫システムであり、プラスミド及びファージなどの外来遺伝因子に対する耐性を付与し、獲得免疫の形成をもたらす。CRISPRスペーサーは、短いcrRNAをコードし、この配列により、標的配列にCasエンドヌクレアーゼを特異的に誘導し、真核生物におけるRNAiと類似の方法でこれらの外因性遺伝因子を切断する。
遺伝子工学の際のDNAのアセンブリについては、当該技術分野において知られている様々な方法がある。Gibson,D.G.,et al.,“Complete chemical synthesis,assembly,and cloning of a Mycoplasma genitalium genome”Science(2008)319:1215-1220(参考として援用する)及びPCT国際公開第2009/103027号(参考として援用する)に記載されているように、M.genitaliumゲノムの各部分をアセンブルするために、サーマルサイクラーによる2ステップ法が使用された。別のアプローチについては、Li,M.Z.,et al.,Nature Meth.(2007)4:251-256(参考として援用する)により記載されている。PCT国際公開第2006/021944号(参考として援用する)には、T7 5’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖DNA結合タンパク質を利用する1ステップアセンブリ法が開示されている。ハイスループットスクリーニングに使用される化合物のアセンブリのためのコンビナトリアル手法は、今では定着している。加えて、コード配列をランダムに断片化し、再度アニーリングを行う遺伝子シャッフリング手法も長年にわたり実施されている。例えば、キメラ遺伝子断片のライブラリーを作製するためのプロトコルは、Meyer,M.,et al,“Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library of Chimeras”Current Protocols in Protein Science(2006)26.2.1-26.2.17;McKee,A.E.,et al.,JBEI abstractに記載されている。種々の構成成分を完全なまたは最小のゲノムにアセンブルするための手法は、確立されている。例えば、2007年11月15日に公開された米国特許出願公開第2000/0264688号(参考として援用する)は、ゲノムの各部分を含むカセットを作製及びアセンブルすることによって、合成ゲノムを構築するための方法について記載している。核酸をアセンブルする順次的な階層的方法については、2007年1月4日に公開された米国特許出願公開第2007/004041号(参考として援用する)に記載されている。
ウイルスは、一般の顕微鏡では見えないほど微小で、代謝的に不活性な感染因子であり、生きている宿主細胞の内部でのみ複製する。ウイルスは、動物、植物、真菌、藻、細菌及び古細菌を含む全ての種類の生命体に感染し得る。感染細胞の内部以外にある間、または細胞に感染する過程中、ウイルスは、独立した粒子の形態で存在する。これらのウイルス粒子(ビリオン)は、カプシドと呼ばれるタンパク質コートに囲まれた、DNAまたはRNAゲノムのいずれかから構成される。いくつかのビリオンはまた、カプシドタンパク質コートの内側または外側のいずれかに更なる脂質エンベロープを有する。
ウイルス変異研究とは、本明細書で使用される場合、急速な進化、適応及び/またはランダムもしくは特異的変異導入の研究を指し、これらの用語は区別なく使用され得る。進化及び/または適応研究は、特定の特徴または特定の条件下におけるウイルスの選択を含む。これらの方法は、ウイルス複製に固有の天然に高い変異率により多くのウイルス多様性をもたらすため、ウイルスに特に有用である。例えば、菌株は、高温の条件下で進化し、これらの条件下での生存及び増殖を促進する分子変化を観察することができる。非限定的な例として、ウイルスまたはバクテリオファージ実験の進化または適応を使用することで、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、または標的化された宿主ゲノム消化もしくは編集に関して変化を有するバリアントを選択することができる。ウイルスの進化または適応実験の非限定的な例には、同時感染、共進化または同時形質転換の実験が挙げられる。同時感染とは、2つ以上のウイルスが同じ宿主に同時に感染することを指し、これにより、多くの場合、2つ以上のウイルス間で遺伝子の交換がなされる。共進化とは、2つ以上のウイルスまたはバクテリオファージ間での組換えが許容性または非許容性の宿主内で生じる研究を指し、これにより、異なるウイルス特性、例えば、より広い宿主域を有する新しいウイルスまたはバクテリオファージのアセンブリが生じる。同時形質転換とは、2つの裸のゲノムにより、許容性または非許容性の菌株中で一緒に形質転換を起こす場合を指す。これらの進化または適応実験のいずれも、許容性(感受性)または非許容性(耐性)宿主で実施することができる。この種の実験は、多くの場合、1つ以上の他の選択されたウイルスの非存在下または存在下で、選択された宿主中でウイルスを複数回継代することを含む。ウイルスは、多数のバリアントをもたらす変異を獲得する。継代を通して、ある特定のバリアントが継代及び選択条件に基づいて濃縮される。
溶菌酵素
「溶菌酵素」は、好適な条件下で、適切な時間の間に、1つ以上の細菌を殺傷する任意の細菌細胞壁溶菌酵素を含む。溶菌酵素の例には、限定するものではないが、種々の細胞壁アミダーゼが挙げられる。溶菌酵素は、バクテリオファージ溶菌酵素(バクテリオファージから抽出または単離された溶菌酵素を指す)または類似のタンパク質構造を有し、溶菌酵素機能を保持する合成溶菌酵素であってよい。
オートインデューサーは、クオラムセンシングに関与する細菌によって産生及び使用される小さな化学的シグナル伝達分子である。クオラムセンシングにより、細菌は、オートインデューサーの存在を介して互いを感知し、多種多様な集団レベルでの行動を調節することができる。このような行動には、共生、病原性、運動性、抗生物質産生及びバイオフィルム形成が含まれる。オートインデューサーは、種に応じて多数の異なる化学的形態を取るが、それらが有する作用は多くの場合類似しており、これにより、遺伝子操作されたバクテリオファージは、類似のオートインデューサーを利用する多種多様な細菌に影響を与えることができる。一般に、グラム陰性細菌は、オートインデューサーとしてAHLを使用し、グラム陽性細菌は、プロセシングされたオリゴペプチドをコミュニケーションのために使用するが、オートインデューサー2(AI-2)は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に共通である。
本開示は、いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージを操作することによって、バクテリオファージ宿主域を調整することを企図する。いくつかの実施形態において、ウイルス宿主域を調整することは、異種、天然、非天然の尾繊維及びこれらの任意の組み合わせを有するようにウイルスを操作することを伴う。バクテリオファージの宿主細胞特異性は、ウイルス粒子の尾繊維(複数可)の影響を受け得る。宿主バクテリオファージの尾繊維または尾繊維の一部を変更する(例えば、交換する及び/または変異させる)と、宿主域が変わり得る(例えば、拡大し得る)。
本開示は、非限定的な例として、宿主細胞によって任意に分泌される抗菌性ペプチドを発現するように操作されたバクテリオファージを企図する。例えば、操作されたバクテリオファージは、抗菌物質、例えば、限定するものではないが、宿主細菌のバクテリオファージに対する耐性の発生及び/または伝播を阻害し、2種以上の異なる細菌種を含む細菌感染などの細菌感染におけるより迅速でより効果的な細菌の殺傷を可能にする天然ペプチドを含む、抗菌性ペプチド(AMP)または抗菌性ポリペプチドを発現することができる。
細菌バイオフィルム形成は、局所感染をもたらし得るだけでなく、菌血症(血液中の細菌の存在)及び細菌性敗血症(血流を通した細菌またはその産生物の広がりによって引き起こされる多臓器不全)などの治療が困難で、時には致命的である全身感染をもたらし得る。バイオフィルムマトリックスを構成する細胞外物質は、抗体及び食細胞などの通常の免疫防御機構ならびに抗菌酵素及び抗生物質を含む抗菌物質からバイオフィルムに内在する細菌を保護し隔離するバリアとして機能することができる。バイオフィルムはまた、バイオフィルムに内在する細菌の成長及び増殖を促進する。
ウイルス粒子を遺伝子操作する方法は、広く適用できる標的指向可能なインビトロ工学的方法がないために、労力を要し、長い時間がかかる。現在のインビボ法は、改変されたウイルス及びウイルスベクターを作製するのに数週間から数ヶ月かかることがある(Levin and Bull,Nat Rev Microbiol.,2004 Feb;2(2):166-73、参考として本明細書に援用する)。更に、細胞中でウイルスゲノムを操作することに本質的に付随する毒性がある。本開示以前には、ウイルスの正確なインビトロ遺伝子工学に関する広く適用できる方法を開発する努力は、ほとんど失敗に終わっている。ウイルスゲノムを完全にインビトロで迅速に操作するための広く適用できるプロセスが本明細書にて記載される。
1)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号50もしくは配列番号25に含まれる配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有する核酸配列、または
2)配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号5、配列番号48もしくは配列番号49に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または
3)以上の任意の組み合わせ内にある、実施形態1~5のいずれかの操作されたウイルスである。
1)異種gp18遺伝子の全てまたは一部(任意に、当該異種gp18遺伝子は、配列番号26に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する)、
2)異種gp18遺伝子の全てまたは一部(任意に、当該異種gp18遺伝子は、配列番号38に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする)、
3)操作されたgp34遺伝子の全てまたは一部(任意に、当該異種gp34遺伝子は、配列番号5のアミノ酸位置55に対応する位置に変異を含むアミノ酸配列をコードするか、または任意に、異種gp34遺伝子は、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有する)、
4)配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号50からなる群から選択される配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する1つ以上の配列中における改変、ならびに
任意に、配列番号1に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号2に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する配列、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する配列、及び配列番号50に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する配列のそれぞれにおける改変
(任意に、当該改変は、配列番号1の核酸位置50に対応する位置でのGからAへの置換、配列番号50の核酸位置160に対応する位置でのGからTへの置換、配列番号2の核酸位置245に対応する位置でのAからGへの置換、配列番号2の核酸位置247~248に対応する位置でのATからTCへの置換、及び配列番号3の核酸位置757に対応する位置でのAからGへの置換を含む)、
5)配列番号34、配列番号35、配列番号36及び配列番号48からなる群から選択される配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする1つ以上の核酸配列中における改変、ならびに
任意に、配列番号34に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号35に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、配列番号36に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号48に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変
(任意に、当該改変は、配列番号34のアミノ酸位置17に対応する位置でのCからYへの置換、配列番号48のアミノ酸位置36に対応する位置でのDからYへの置換、配列番号35のアミノ酸位置82に対応する位置でのDからGへの置換、配列番号35のアミノ酸位置83に対応する位置でのIからSへの置換及び配列番号36のアミノ酸位置253に対応する位置でのNからDへの置換を含む)、
6)配列番号25に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する配列中における改変
(任意に、当該改変は、配列番号25に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有する配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号25に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有する配列中に含まれる配列の異種核酸分子での置換であり、
かつ任意に、当該異種核酸分子は、配列番号6、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19及び配列番号20からなる群から選択される配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有する異種核酸配列を含む)、
7)配列番号49に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変
(任意に、当該改変は、配列番号49に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号49に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性もしくは完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子での置換であり、
かつ任意に、当該異種核酸分子は、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46及び配列番号47からなる群から選択される配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の同一性または完全な同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む)、
8)以上の任意の組み合わせ。
1)少なくとも3kb、少なくとも10kb、少なくとも18kb、少なくとも25kbもしくは少なくとも30kb;
2)少なくとも18kb;
3)少なくとも2kb~少なくとも4Mb;
4)少なくとも18kb~少なくとも4Mb;または
5)少なくとも5kb、少なくとも10kb、少なくとも15kb、少なくとも18kb、少なくとも20kb、少なくとも25kb、少なくとも30kb、少なくとも35kb、少なくとも40kb、少なくとも45kb、少なくとも50kb、少なくとも55kb、少なくとも60kb、少なくとも65kb、少なくとも70kb、少なくとも75kb、少なくとも80kb、少なくとも85kb、少なくとも90kb、少なくとも100kb、少なくとも125kb、少なくとも150kb、少なくとも175kb、少なくとも200kb、少なくとも250kb、少なくとも300kb、少なくとも400kb、少なくとも500kb、少なくとも600kb、少なくとも700kb、少なくとも800kb、少なくとも900kb、少なくとも1Mb、少なくとも1.5Mb、少なくとも2Mb、少なくとも2.5Mb、少なくとも3Mbもしくは少なくとも3.5Mbである、実施形態10~13のいずれかの方法である。
インビトロウイルスゲノム工学
43kbのdsDNA LUZ19ウイルスゲノム(アクセッション番号NC_010326.1)を、例えば、Norgen BiotekファージDNA単離キットまたは当業者に知られている任意の他の方法を使用して、ウイルス粒子から単離した(図2A)。RNA誘導型ヌクレアーゼCas9とインビトロ転写されたgRNAとを使用して、2つの別々の位置で部位特異的消化を実施した。未消化の43kbのゲノムDNAは、最も大きいDNAラダーバンド(10kb)よりもずっと少なくしか移動しない。線状ゲノムの消化により、約39kb、約4.3kb及び約200bpの3つのサイズの断片が得られる。標的指向gRNAを過剰に使用し、200bp断片を遮断する(図2B)。LUZ19消化部位の直上流及び下流領域と100bpの相同性がある5’末端を有するプライマーを使用して、ΦKF77由来gp7の断片をPCR増幅した(図2C)。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したLUZ19ゲノムにPCR増幅したΦKF77 gp7断片(配列番号8)をシームレスに組み込み、天然gp7領域(配列番号23)を置き換えた(図2D)。Cas9切断はインビトロでのギブソンアセンブリに必要な相同性を欠く平滑末端の二本鎖分解をもたらすので、バックグラウンドはほとんど観察されない。インビトロ編集したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た(図2E)。回収したウイルスへのΦKF77遺伝子断片の組み込みは、操作領域の内側及び外側のプライマーを用いたPCRを使用して検証した。未編集のLUZ19 gDNAをネガティブ対照として使用したところ、全ての実験ウイルスは新しいΦKF77遺伝子断片を含有した(最後の7レーン)。
宿主域が拡大した操作されたウイルス
大規模臨床ライブラリー(282個のP.aeruginosa単離物)を、ファージLUZ19及びLKD16に対する感受性について、二重寒天プラークアッセイを使用してスクリーニングした。66株が2つのウイルスのうちの少なくとも1つに感染することができ、18株及び6株はそれぞれLUZ19及びLKD16に一意的に感染した。したがって、宿主域の拡大に関与するLKD16遺伝因子を試験するための土台としてLUZ19を選択した。2つのウイルスの間の比較ゲノム解析は、LKD16の遺伝子産物18(gp18)がLUZ19 gp18ホモログとは異なる配列を有することを示したことから、gp18が宿主域決定に関与し得ることが示された。LUZ19ウイルス粒子からウイルスゲノムを上記のとおりに単離した。RNA依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたgRNAとを使用して部位特異的消化を実施し、LUZ19 gp18遺伝子を切り出した。組込みのためのLUZ19相同末端部を有するLKD16由来gp18をPCR増幅した。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したLUZ19ゲノムにPCR増幅したLKD16 gp18(配列番号7)をシームレスに組み込み、天然gp18配列(配列番号50)を置き換えた。インビトロ操作したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た。LKD16 gp18遺伝子を有する操作されたLUZ19ウイルスは、LUZ19ファージに通常感染する全ての株に加え、先にはLKD16にしか感染しなかった3株にも感染することができ、宿主域の拡大を示した(図3B及び6B)。これは、gp18がLKD16の宿主域差に関与する遺伝因子であり、この遺伝子を有する操作されたLUZ19ウイルスがより多くの宿主株でより良好に複製できることを示している。
ウイルス属の宿主域を有する操作されたウイルス
LUZ19及び/またはLUZ19誘導体を進化または同時感染実験のための出発物質として使用して、ΦKMVウイルス属の宿主域を1つの代表的なウイルスに集約するための標的を特定した。同時形質転換または同時感染実験は、許容性(PAO1K)または非許容性(耐性)の宿主(PA7410またはPA7649)のいずれかで実施した(図4A)。同時感染及び同時形質転換はいずれも、それぞれLKD16またはΦKMVの存在下で実施した。宿主域は、指定の細菌株での二重寒天プラークアッセイを使用して試験した。目的株における宿主域の拡大についてスクリーニングした後、進化したファージを、許容性株と選択的株(LUZ19にのみ感染する株-PA7632)によって交互に3~5回継代した。進化したファージをPAO1K中で増幅し、gDNAを精製し、配列決定した。LUZ19と、先にはLKD16またはΦKMVにのみ感受性であった株にも感染できる進化したLUZ19との間の比較ゲノム解析を使用して、宿主域の拡大に関与する点変異を特定した(図4B)。
改善されたウイルスの複製は初期バイオフィルム破壊を改善する。
別の例において、ウイルス進化及び比較ゲノム解析では、尾部管状タンパク質B(Gp34)中にL55Δ変異を有するLUZ19進化ファージは、放出数の増加に起因して、より大きな比率で複製することが示された(図5B)。Gp34 L55Δ変異が改善されたウイルス特性を有することを検証するために、LUZ19ウイルスゲノムをウイルス粒子から単離した。RNA依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたgRNAとを使用して部位特異的消化を実施し、gp34遺伝子(配列番号4)を除去した。アミノ酸位置55にロイシンコドンの欠失を有するgp34 L55Δ遺伝子(Gp34 L55Δ、配列番号4の位置163~165)をLUZ19進化ファージからPCR増幅した。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したLUZ19ゲノムにPCR増幅したgp34 L55Δ遺伝子をシームレスに組み込んだ。インビトロ変換したゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子を得た。Gp34 L55Δを有する操作されたLUZ19ウイルスは、細菌を拡散させ、溶解することができた。gp34 L55Δ変異(ファージ*)を有するLUZ19ファージが野生型LUZ19よりも大きい除去領域を有することを明らかにするために、二重寒天プラークアッセイを使用した。2日間にわたって画像を撮り、除去領域を測定した(図5B)。溶解幅の拡大領域は、Gp34 L55Δ変異を有するウイルスが良好に細菌を拡散させ、溶解することができたことを示すものである。クリスタルバイオレットバイオフィルムアッセイは、クリスタルバイオレットの取り込みを尺度としてバイオフィルムの蓄積を測定する(図5C)。gp34 L55Δ変異を有するウイルスで処理したサンプルは、野生型gp34遺伝子を有するウイルスと比較して、バイオフィルムが大幅に減少した。図は、gp34変異(アスタリスク)の位置を野生型LUZ19ゲノムと比較して示す(図5D)。当該技術分野において知られている標準的アッセイを使用して、野生型及びgp34 L55Δ変異体の両方のウイルスの吸着、潜伏期間及び放出数を測定した。これらのデータにより、gp34 L55Δ変異を有するウイルスの放出数が大幅に増加したことが示された(図5E)。
初期バイオフィルム破壊及び宿主域拡大を有する反復操作ウイルス
実施例IIで作製した宿主域の拡大したLUZ19LKD16gp18組換えウイルスゲノムをウイルス粒子から単離した。RNA依存型ヌクレアーゼとインビトロ転写されたgRNAとを使用して部位特異的消化を実施し、gp34(配列番号4)を除去した。次いで、実施例IVで特性評価された溶菌活性が増加するgp34 ΔLeu55変異(配列番号4の位置163~165)をPCR増幅し、消化したLUZ19LKD16gp18ウイルスゲノムにギブソンアセンブリを使用してアセンブルした。反復的にインビトロ操作されたゲノムで宿主細胞を直接形質転換し、機能性ウイルス粒子、すなわち、LKD16 gp18遺伝子とgp34 ΔLeu55変異との両方を有する操作されたLUZ19ウイルス(LUZ19* LKD16gp18)を得た。
バイオフィルム分散ペイロード及び完全なウイルス属を対象とする拡大された宿主域を有する反復操作ウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、gp49(配列番号25)をエキソポリサッカライド(EPS)デポリメラーゼまたはフェノール可溶性モルホリン(PSM)のいずれかに置き換えてLUZ19にクローニングし、成熟バイオフィルムを分散させる能力を決定した(図7)。細胞外マトリックスデポリメラーゼまたは界面活性剤ポリペプチドを発現するLUZ19及びWHR LUZ19を操作するために、RNA依存型ヌクレアーゼ(この場合Cas9)及びインビトロ転写されたgRNAを使用した消化によりLUZ19またはWHRLUZ19のgp49(配列番号25)を除去した後、ギブソンアセンブリを使用して、主要カプシドプロモーターPgp32(配列番号21)及びターミネーターTgp32(配列番号22)を両端に配した目的の遺伝子(GOI)に置き換えた(図7A及び7C)。野生型LUZ19の場合、GOIは、EPSデポリメラーゼ(Pp15gp44-Pseudomonas puditaΦ15に由来する尾部スパイクgp44(配列番号14);NTUgp34-Klebsiella pneumoniaeファージNTUに由来する尾部スパイクgp34(配列番号13);LKA1gp49-P.aeruginosaファージLKA1に由来する尾部スパイクgp49(配列番号12))、Staphylococcus epidermidis(PSMa、配列番号18)及びStaphylococcus aureus(PSMa3(配列番号16)及びPSMb2(配列番号17))に由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤、ならびにAggregatibacter actinomycetemcomitans(配列番号15)に由来するDspBサーファクチン(図7B)であった。WHR LUZ19の場合、GOIは、EPSデポリメラーゼPp15gp44(配列番号14)及びサーファクチンSePSMa(配列番号18)であった(図7D)。操作したファージを適切な宿主細胞で増幅し、単離し、配列決定により検証した。
抗生物質感受性化ペイロードを発現する操作されたウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、ssRNAウイルスPRR1及びMS2に由来するリシンを発現するようにLUZ19を操作した。PRR1(配列番号20)またはMS2(配列番号19)ssRNAファージのいずれかに由来するリシンを主要カプシドプロモーターPgp32(配列番号21)及びターミネーターTgp32(配列番号22)を両端に配したLUZ19 gp49座位(配列番号25)に操作し、ファージに対する細菌耐性の発生を阻害する能力を判定した(図8A)。これらのリシンは、細胞壁合成に重要な酵素に結合及び不活性化することによって細胞壁の新しい形成を阻害し、他の抗菌物質、特に細胞壁を標的とするカルベニシリンなどの抗生物質に対する細菌の感受性を高めると一般的に言われる。
種特異的抗菌性タンパク質ペイロードを発現する操作されたウイルス
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、P.aeruginosa由来抗菌性タンパク質PyoS5を発現するようにLUZ19を操作した。バクテリオシンPyoS5は、P.aeruginosaの1つの株によって産生される種特異的抗菌性タンパク質であり、競合するP.aeruginosa株の成長を妨げる。P.aeruginosa株のPA01 gDNAを鋳型に使用してpyoS5(配列番号6)をPCR増幅した後、主要カプシドプロモーターPgp32(配列番号21)及びターミネーターTgp32(配列番号22)を両端に配したLUZ19 gp49座位(配列番号25)にクローニングした(図9A)。PyoS5は、広く分布しているピオケリン受容体FptAに結合した後、構造変化を起こし、P.aeruginosa膜中に孔を形成する。
抗菌性産物を作製するためにバクテリオファージを反復的に操作するためのシステム
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用すれば、宿主株の広範な遺伝子操作を行うことなく、バクテリオファージゲノムを迅速に操作することができる。当業者によく知られているウイルス変異研究及び選択技術と、完全ゲノム配列決定、比較ゲノム解析及び本開示のインビトロ工学的方法とを組み合わせると、改善された新しい抗菌物質の開発のための改善された新しいシステムが創出される。このシステムは、1つのウイルス土台の1、2または2以上の別個の特性を反復的に改善して、ウイルス系抗菌物質を作製することに基づく。別個のウイルス特性を改善するLUZ19ゲノムの順次的な精製及び編集が開示されているが(図6、7及び10)、この技術は、他の多数のP.aeruginosaバクテリオファージまたは任意の他の細菌株もしくは細菌種に感染する他のバクテリオファージに拡大することができる。更に、この技術を使用して同じ細菌種に感染する多数の個々のバクテリオファージの特性を改善し、細菌感染、汚染を防止もしくは処理する優れたバクテリオファージカクテルを作製する、またはミクロビオームを変えることができる。
方法
MEGAshortscript T7キット(Thermo Fisher)などの市販のインビトロ転写キットを使用して、ガイドRNA(gRNA)を合成し、精製した。ガイドRNAは、当該技術分野にてよく知られている方法を使用して設計した(図15)。
完全な反応混合物:
*完全な反応混合物は、一度に多数の部位を切断する(同時消化)ための単一ステップで使用することができるが、ウイルスgDNAの切断効率が低くなる場合がある。同時消化反応物を氷上でアセンブルした後、Cas9の添加及び37℃で30分間インキュベーションを行う。改変した2ステップ(またはそれ以上)反応も実施可能であり、この場合、より完全な消化が可能である(以下で概略する)。
**10×Cas9緩衝液は、200mM HEPES(pH7.4)、1.5M KCl、5mM DTT及び1mM EDTA(pH8)を含有する。
ステップ1の反応物をアセンブルし、RTで5分間インキュベートする。
ステップ1 反応混合物:
E.coliファージM13の操作
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、大腸菌(Escherichia coli)に感染するウイルスを操作し、蛍光レポーターパプリカ(配列番号5)を発現するようにした。図11Aは、パプリカ蛍光タンパク質遺伝子をE.coli M13ファージゲノムに組み込むためのインビトロ工学的アプローチの概略図を示している。この工学的プロセスは、改善されたウイルス特性を構成するものとして、蛍光レポーターを発現する溶原性ファージを生じるように設計した。これは、類似のウイルスが診断剤として使用されているからである。ウイルス粒子からM13ウイルスゲノム(アクセッション番号X02513)を単離した。この実験設計は2つのgRNAの使用を伴うため、個別のインビトロCas9消化反応において、個々のgRNAの機能をまず確認した(図11B)。各gRNAが機能的であることが判明したら、RNA依存型ヌクレアーゼ及び両方のインビトロ転写されたgRNAを使用して部位特異的消化を実施した(図11C)。蛍光レポーター遺伝子であるパプリカ(配列番号29)は、RNA依存型ヌクレアーゼ消化、例えば、Cas9を使用してM13ゲノムから分離したLacZa遺伝子の両端に位置する配列に相同な5’及び3’配列を付加したプライマーを使用して、PCR増幅した(図11D)。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したM13ゲノムにPCR増幅したパプリカ遺伝子をシームレスに組み込み、LacZa遺伝子(配列番号28)に置き換えた。操作したゲノムでE.coli宿主細胞を直接形質転換し、パプリカ遺伝子をコードする機能性ウイルス粒子を得た。E.coliにおけるプラーク形成の能力によって、操作したファージを評価した(図11E)。プラークからウイルスDNAを単離し、PCR増幅して、挿入したパプリカ遺伝子の存在を確認した(図11F)。組換えパプリカタンパク質の存在及び機能を蛍光イメージングによって確認した(図11G)。
E.coliファージλの操作
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、Escherichia coliに感染する第2のウイルスを編集した。図12Aは、単離されたλファージゲノム(アクセッション番号NC_001416.1)からcll遺伝子(配列番号30)を欠失させるためのインビトロ工学的アプローチの概略図を示している。この工学的プロセスは、改善されたウイルス特性を構成するものとして、構成的に溶菌性ウイルスを生じるように設計した。ウイルス粒子からλウイルスゲノムを単離した。この実験設計は2つのgRNAの使用を伴うため、個別のインビトロCas9消化反応において、個々のgRNAの機能をまず確認した(図12B)。各gRNAが機能的であることが判明したら、RNA依存型ヌクレアーゼ及び両方のインビトロ転写されたgRNAを使用して部位特異的消化を実施した(図12C)。単離したλウイルスゲノム中のCas9に標的化された切断部位の両端に位置する配列に相同な5’及び3’配列を含む二本鎖DNA修復鋳型(配列番号9)を作製するために、合成した2つの一本鎖DNA分子をインビトロでアニーリングした。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したλゲノムにPCR増幅した修復鋳型をシームレスに組み込んだ。次いで、EpiCentreのMaxplaxラムダパッケージング抽出キットを製造業者の方法に従って使用して、操作したゲノムをインビトロでパッケージングした(図12D)。インビトロパッケージング後、製造業者推奨のE.coli宿主細胞を使用した二重寒天プラークアッセイから、操作したλゲノムを回収した。E.coliにおけるプラーク形成能力に基づいて、操作したファージが機能的であるかを判定した。形成されたプラークからウイルスDNAを単離し、PCR増幅して、cll遺伝子がないことを確認した(図12E)。
ヒトCMVのエラー修正
本明細書で開示されるインビトロ工学的方法を使用して、ヒトウイルスの一部を編集した。図13Aは、エラー修正に利用されるインビトロ工学的アプローチの概略図を示す。約230kbのHCMVウイルスゲノムのうちの18kbのサブセクションをE.coli複製プラスミド中に入れた。HCMVゲノム(配列番号10)のこのサブセクションは、ウイルスゲノムの開始点を含み、RL13変異アレル(配列番号33)を有する。HCMV断片とE.coliプラスミドを合わせると、ほぼ28kbの大きさであった。これは現在のほとんどのエラー修正技術の仕様を上回る大きさである。エラー修正のために、E.coliから28kbのプラスミドを単離し、RNA依存型ヌクレアーゼ及びインビトロ転写された2つのgRNAを使用して部位特異的消化を実施した(図13B)。Cas9による消化により、変異部位の直上流及び下流のRL13遺伝子領域を切断した。RL13遺伝子(配列番号32)の修正済み領域を合成し、それぞれのRNA特異的Cas9消化部位に隣接する領域に相同な追加の5’及び3’フランキング配列を含めてPCR増幅した(図13C)。ギブソンアセンブリ法を使用して、消化したプラスミドに合成した修復鋳型をシームレスに組み込んだ。次いで、プラスミド中に含まれる修正したRL13を含有するHCMV断片(配列番号11)によりE.coli細胞を形質転換し、抗生物質含有培地で回収した。E.coliコロニーをPCRによってスクリーニングし、修正したRL13遺伝子の存在を確認した。修正したRL13遺伝子は、エラー含有RL13遺伝子と比較して付加配列を含有しているため、エラー含有RL13遺伝子との区別が可能であった(図13D)。次いで、下流用途での後の使用のために、標準的技術を使用して、エラー修正したゲノム断片をE.coli中で増幅した。
末端が重複しているウイルス末端の迅速な特定
本明細書で開示されるインビトロ消化法はまた、末端重複ウイルスゲノムの正確な末端を特定するのにも採用できる。図14は、LBL3及び14-1ファージゲノムの末端を決定するために使用したインビトロ消化アプローチの概略図を示している。LBL3及び14-1(アクセッション番号NC_011703.1)ファージゲノムDNAをウイルス粒子から精製した(図14A)。MiSeqまたはPacBioプラットフォームを使用して次世代シーケンシングを実施し、続いて、元の配列を再構築するために高品質DNAリードをより長いアセンブリに自動マージした(図14B)。通常、自動アセンブリソフトウェアは、ウイルスまたはバクテリオファージゲノムを環状コンティグに誤ってアセンブルし、末端反復ゲノムのDTRをウイルス配列の内側領域に配置する。ダブルカバレッジシーケンシング領域の特定と、密接に関連する末端反復ゲノムにマッチするBLASTの検索結果とに基づいて、物理的ゲノム末端のインシリコ予測を実施する(図14C)。これらの予測末端をCas9エンドヌクレアーゼ切断によって確認した。Cas9不活性化の後、ゲノム物理的末端に該当するDNA断片を精製し、配列決定した(図14D)。これらのシーケンシング結果は、真の物理的末端配列に基づく正確なゲノムアセンブリをもたらした(図14E)。
インビボアセンブリを用いる工学的方法
本開示は、RNA誘導型ヌクレアーゼを使用して、精製されたウイルス核酸を部位特異的に消化し、消化されたウイルス核酸へのDNAまたはRNA断片の挿入によって、操作された核酸をアセンブルするインビトロ法を提供する。本明細書に開示の精製された酵素を活用することによって、組換え核酸を完全にインビトロでアセンブルすることができるが、感受性の宿主株内の天然または操作された組換え経路を活用することによって、このプロセスを達成することもできる。組換えウイルスゲノムをインビボでアセンブルするには、一部の宿主細胞では、末端相同領域を有する挿入用修復断片とともに、精製されインビトロ消化されたウイルスゲノムで形質転換するだけで十分である。挿入用修復断片は、当該技術分野において知られている標準的技術によって合成または増幅してもよいし、選択された宿主細胞内で安定的に複製されるプラスミド中にあってもよい。この方法は、宿主細胞が相同及び非相同の両方のDNA修復経路を持つこと、十分な量のインサート及び消化されたゲノムを宿主細胞に一緒に送達するという課題、ならびにほとんどの宿主の相同組換え経路が低効率であることから、インビトロアセンブリよりも低効率になる可能性がある。宿主による組換えのない消化されたゲノム単独では機能性ウイルス粒子及び後続のプラークを形成しないので、形質転換及び平板培養後に得られたプラークを所定のインサートについてPCRによってスクリーニングし、操作された所望のウイルス核酸の正しいアセンブリを確認することができる。
本明細書に開示の操作されたウイルス
表1は、本明細書で開示されるインビトロ工学的方法によって作製された、操作されたウイルスについてまとめたものである。表2は、本明細書で開示される操作されたウイルスについて、対応する実施例及び図と合わせてまとめたものである。表3は、本明細書で開示される野生型ウイルスと、その完全ゲノム配列のアクセッション番号の一覧である。表4は、本明細書で開示される野生型核酸配列の一部と、その対応するアミノ酸配列の一覧である。
配列番号1
DNA
属/種-Phikmv様ウイルス属(Phikmvlikevirus) LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp13
配列番号2
DNA
属/種- Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型 LUZ19 gp38
配列番号3
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp40
配列番号4
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp34
配列番号5
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 Gp34タンパク質
配列番号6
DNA
属/種-Pseudomonas aeruginosa
記述表題- PyoS5配列
配列番号7
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LKD16
記述表題-LKD16 gp18付加配列
配列番号8
DNA
属/種-Phikmvlikevirus phi-KF77
記述表題-ΦKF77 gp7付加配列
配列番号9
DNA
属/種-ラムダ様ラムダ
記述表題-E. coliファージλ cII
配列番号10
DNA
属/種-サイトメガロウイルスHCMV
記述表題-HCMV断片編集前
配列番号 11
DNA
属/種-サイトメガロウイルスHCMV
記述表題-HCMV断片編集後
配列番号 12
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LKA1
記述表題-LKA1 gp49配列
配列番号 13
DNA
属/種-Phikmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1
記述表題-NTUH-K2044-K1-1 gp34
配列番号 14
DNA
属/種-T7様Pp15
記述表題-Pp15 gp44付加配列
配列番号 15
DNA
属/種-Aggregatibacter actinomycetemcomitans
記述表題-dspB付加配列
配列番号 16
DNA
属/種-Staphylococcus aureus
記述表題-SaPSMa3付加配列
配列番号 17
DNA
属/種-Staphylococcus aureus
記述表題-SaPAMb2付加配列
配列番号 18
DNA
属/種-Staphylococcus epidermidis
記述表題-SePSMa付加配列
配列番号 19
DNA
属/種-レビウイルスMS2
記述表題-MS2 L付加配列
配列番号20
DNA
属/種-レビウイルスPRR1
記述表題-PRR1 L付加配列
配列番号21
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 gp32プロモーター(P32)
配列番号22
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 gp32ターミネーター(T32)
配列番号23
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp7領域
配列番号24
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp18領域
配列番号25
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 gp49及びgp48-gp49遺伝子間領域
配列番号26
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LKD16
記述表題-野生型LKD16 gp18遺伝子
配列番号27
DNA
合成(人工/未知)
記述表題-NLS-FLAG-CAS9-Hisをコードする遺伝子
配列番号28
DNA
属/種-イノウイルスM13MP18
記述表題-野生型M13MP18置換配列
配列番号29
DNA
未知/人工-DNA2.0から市販
記述表題-パプリカ配列
配列番号30
DNA
属/種-ラムダ様ラムダ
記述表題-野生型E. coliファージλ cII配列
配列番号31
タンパク質
合成(人工/未知)
記述表題-配列番号27から翻訳されたNLS-FLAG-CAS9-His
配列番号32
DNA
属/種-サイトメガロウイルスHCMV
記述表題-HCMV RL13断片編集後
配列番号33
DNA
属/種-サイトメガロウイルスHCMV
記述表題-HCMV RL13断片編集前
配列番号34
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 Gp13タンパク質配列
配列番号35
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 Gp38タンパク質配列
配列番号36
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-野生型LUZ19 Gp40タンパク質配列
配列番号37
タンパク質
属/種-Pseudomonas aeruginosa
記述表題-PyoS5タンパク質配列
配列番号38
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LKD16
記述表題-LKD16 Gp18タンパク質配列
配列番号39
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LKA1
記述表題-LKA1 Gp49タンパク質配列
配列番号40
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1
記述表題-NTUH-K2044-K1-1 Gp34タンパク質配列
配列番号41
タンパク質
属/種-T7様Pp15
記述表題-Pp15 Gp44タンパク質配列
配列番号42
タンパク質
属/種-Aggregatibacter actinomycetemcomitans
記述表題-DspBタンパク質配列
配列番号43
タンパク質
属/種-Staphylococcus aureus
記述表題-SaPSMa3タンパク質配列
配列番号44
タンパク質
属/種-Staphylococcus aureus
記述表題-SaPAMb2タンパク質配列
配列番号45
タンパク質
属/種-Staphylococcus epidermidis
記述表題-SePSMaタンパク質配列
配列番号46
タンパク質
属/種-レビウイルスMS2
記述表題-MS2 Lタンパク質配列
配列番号47
タンパク質
属/種-レビウイルスPRR1
記述表題-PRR1 Lタンパク質配列
配列番号48
タンパク質属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 Gp18タンパク質配列
配列番号49
タンパク質
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 Gp49タンパク質配列
配列番号50
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 gp18遺伝子配列
配列番号51
DNA
属/種-Phikmvlikevirus LUZ19
記述表題-LUZ19 Gp49タンパク質配列
Claims (24)
- 2つ以上のペイロードを発現するように操作された組換えファージであって、少なくとも1つのペイロードがエキソポリサッカライド(EPS)デポリメラーゼであり、かつ、該2つ以上のペイロードが、フェノール可溶性モジュリンをさらに含む、組換えファージ。
- 前記ペイロードの少なくとも1つがDNase、または1つもしくは複数のフェノール可溶性モジュリンである、請求項1記載の組換えファージ。
- 改善された宿主域を示す、請求項1または2記載の組換えファージ。
- 前記2つ以上のペイロードが、DNaseを含む、請求項1~3のいずれか一項記載の組換えファージ。
- 前記フェノール可溶性モジュリンが、PSMa、PSMa3、およびPSMb2からなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項記載の組換えファージ。
- 前記フェノール可溶性モジュリンが、PSMaである、請求項5記載の組換えファージ。
- 前記フェノール可溶性モジュリンが、PSMb2である、請求項5記載の組換えファージ。
- 前記フェノール可溶性モジュリンが、PSMa3である、請求項5記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)もしくは大腸菌(E.coli)、または、アシネトバクター(Acinetobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロバクター(Enterobacter)、エンテロコッカス(Enterococcus)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、ミコバクテリウム(Mycobacterium)、ナイセリア(Neisseria)、Pseudomonas、サルモネラ(Salmonella)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、もしくはストレプトコッカス(Streptococcus)属内の病原菌種、または、アシディアヌス(Acidianus)、アエロピルム(Aeropyrum)、ハロアーキュラ(Haloarcula)、ハロフェラックス(Haloferax)、ハロラブラム(Halorulbum)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、ピロバキュラム(Pyrobaculum)、ピロコッカス(Pyrococcus)、スチギオロブス(Stygiolobus)、スルホロブス(Sulfolobus)、もしくはサーモプロテウス(Thermoproteus)属内の古細菌種に感染する、請求項1~8のいずれか一項記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)または大腸菌(E.coli)に感染する、請求項9項記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、ΦKMV属ファージである、請求項10記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、LUZ19ゲノムに対して少なくとも85%の同一性を有するウイルスゲノムを含む、請求項11記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、LUZ19ウイルスゲノムを含む、請求項12記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、
i)gp13 C17Y、gp18 D36Y、gp38 D82GおよびI83S、ならびにgp40 N253Dからなる群から選択される1つまたは複数の変異を含み、LUZ19と比べて改善された宿主域を示す、および/または
ii)ウイルスLKD16からのgp18で置換された野生型LUZ19 gp18を含む、および/または
iii)gp34の位置55におけるロイシンの欠失(gp34L55Δ 変異)を含み、野生型LUZ19と比べて増加した活性を示す、
請求項13記載の組換えファージ。 - 前記ファージが、gp13 C17Y、gp18 D36Y、gp38 D82GおよびI83S、ならびにgp40 N253Dからなる群から選択される1つまたは複数の変異を含み、LUZ19と比べて改善された宿主域を示す、請求項14記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp13 C17Y変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp18 D36Y変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp38 D82G変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp38 I83S変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp38 I83S変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp40 N253D変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp13 C17Y変異、gp18 D36Y変異、gp38 D82GおよびI83S変異、ならびにgp40 N253D変異を含む、請求項15記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、ウイルスLKD16からのgp18で置換された野生型LUZ19 gp18を含む、請求項14記載の組換えファージ。
- 前記ファージが、gp34の位置55におけるロイシンの欠失(gp34L55Δ 変異)を含み、野生型LUZ19と比べて増加した活性を示す、請求項14記載の組換えファージ。
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US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
US11053481B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains |
HUE049405T2 (hu) | 2014-06-23 | 2020-09-28 | Regeneron Pharma | Nukleáz-közvetített DNS-összeállítás |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
JP6842417B2 (ja) | 2014-12-16 | 2021-03-17 | シー3ジェイ セラピューティクス インコーポレイテッド | インビトロウイルスゲノム工学のための組成物及びその方法 |
US20160362667A1 (en) * | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Caribou Biosciences, Inc. | CRISPR-Cas Compositions and Methods |
US10513732B2 (en) * | 2015-07-13 | 2019-12-24 | New York University | Sequencing methods and kits |
IL310721A (en) | 2015-10-23 | 2024-04-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
US10136820B2 (en) * | 2015-12-21 | 2018-11-27 | Gholam A. Peyman | Method to visualize very early stage neoplasm or other lesions |
US11433260B2 (en) | 2015-12-21 | 2022-09-06 | Gholam A. Peyman | Cancer treatment methods using thermotherapy and/or enhanced immunotherapy |
WO2017172644A2 (en) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Bacteria identification and antibiotic susceptibility profiling device |
CA3032699A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US11203761B2 (en) | 2016-08-26 | 2021-12-21 | Codex Dna, Inc. | Genetically engineered Vibrio sp. and uses thereof |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
US20210277384A1 (en) * | 2016-10-14 | 2021-09-09 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for evading bacterial defense mechanisms |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
WO2018148412A1 (en) * | 2017-02-09 | 2018-08-16 | The Charles Stark Draper Laboratory Inc. | Recombinant k1-5 bacteriophages and uses thereof |
US20190070232A1 (en) | 2017-03-06 | 2019-03-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of cloning prophages and producing lytic phage particles |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
CN110914426A (zh) | 2017-03-23 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器 |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
US11535843B2 (en) | 2017-06-01 | 2022-12-27 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Phage engineering: protection by circularized intermediate |
CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
US10174295B1 (en) * | 2017-08-01 | 2019-01-08 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Composition of matter: engineering of Escherichia coli phage K1E |
WO2019032576A2 (en) * | 2017-08-08 | 2019-02-14 | The Charles Stark Draper Laboratory Inc. | HANDLING OF BACTERIOPHAGES BY SEMI-SYNTHESIS |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
AU2018352592A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-06-04 | Beam Therapeutics, Inc. | Uses of adenosine base editors |
EP3798304A4 (en) * | 2018-05-22 | 2022-03-23 | Jichi Medical University | ANTIBACTERIAL PHAGE, TREATMENT COMPOSITION, DISINFECTANT, FOOD, BACTERIA IDENTIFICATION KIT, METHOD FOR PRODUCING A TREATMENT COMPOSITION, METHOD FOR ELIMINATING BACTERIA, METHOD FOR IDENTIFYING BACTERIA AND METHOD FOR TREATING ANIMALS |
US11541105B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-01-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance |
WO2020092748A1 (en) * | 2018-11-01 | 2020-05-07 | The Trustees Of Princeton University | System for protein inactivation and recombinant phages for targeted bacterial killing, infection, biodetection, and as a means of protein extraction |
CA3120615A1 (en) * | 2018-11-27 | 2020-06-04 | Eligo Bioscience | Chimeric receptor binding proteins for use in bacterial delivery vehicles |
CA3120160A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Eligo Bioscience | Branched receptor binding multi-subunit protein complexes for use in bacterial delivery vehicles |
AU2020242032A1 (en) | 2019-03-19 | 2021-10-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
IL286917B (en) | 2019-04-04 | 2022-09-01 | Regeneron Pharma | Methods for scar-free insertion of targeted modifications into targeted vectors |
CA3177481A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | David R. Liu | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
CN114540389B (zh) * | 2020-11-26 | 2024-05-14 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种制备基因工程病毒的方法及其应用 |
CN112778399A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-05-11 | 南开大学 | 一类源自毒性淀粉样纤维纳米抗菌肽的制备及性质表征方法 |
WO2022251644A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Lyell Immunopharma, Inc. | Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof |
KR20240027676A (ko) | 2021-06-02 | 2024-03-04 | 라이엘 이뮤노파마, 인크. | Nr4a3-결핍 면역 세포 및 이의 용도 |
CN113755451B (zh) * | 2021-09-03 | 2023-06-06 | 广西大学 | 一株大肠杆菌噬菌体gn6及其应用 |
EP4248987A1 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-27 | Nomad Bioscience GmbH | Chimeric bacteriocins and method for the control of pseudomonas |
WO2023225665A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Lyell Immunopharma, Inc. | Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof |
WO2024064952A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun |
WO2024064958A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
WO2024077174A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006137847A2 (en) | 2004-09-13 | 2006-12-28 | Trustees Of Boston University | Engineered enzymatically active bacteriophages and methods of uses thereof |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5877279A (en) | 1994-10-13 | 1999-03-02 | Nanoframes, Llc | Materials for the production of nanometer structures and use thereof |
WO1999023107A1 (en) | 1997-10-31 | 1999-05-14 | Maxygen, Incorporated | Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling |
GB9803351D0 (en) * | 1998-02-17 | 1998-04-15 | Oxford Biomedica Ltd | Anti-viral vectors |
GB9809414D0 (en) * | 1998-05-02 | 1998-07-01 | Scottish Crop Research Inst | Method |
US7019122B1 (en) | 1998-10-30 | 2006-03-28 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Unusual retrotransposon from the yeast Candida albicans |
ATE305793T1 (de) * | 2000-07-25 | 2005-10-15 | Us Gov Health & Human Serv | Bakteriophage mit breitem wirtspektrum |
WO2006021944A1 (en) | 2004-08-12 | 2006-03-02 | Leanway Automatic Areanas Ltd. | Enhanced database structure configuration |
US7892809B2 (en) | 2004-12-15 | 2011-02-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Chimeric vectors |
WO2007005053A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Codon Devices, Inc. | Hierarchical assembly methods for genome engineering |
WO2007074479A1 (en) | 2005-12-29 | 2007-07-05 | Abl Biotechnologies Ltd | Novel strain of schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and extracellular polysaccharides and process thereof |
CA2661808A1 (en) | 2006-08-29 | 2008-03-06 | Danisco Us, Inc., Genencor Division | Compositions and methods for improved protein production |
US8404468B2 (en) | 2007-05-23 | 2013-03-26 | Cognis Ip Management Gmbh | Efficient astaxanthin production strains derived from Haematococcus pluvialis |
GB0715416D0 (en) * | 2007-08-07 | 2007-09-19 | Phico Therapeutics Ltd | Modified bacteriophage |
WO2009108406A2 (en) | 2008-01-10 | 2009-09-03 | Trustees Of Boston University | Engineered bacteriophages as adjuvants for antimicrobial agents and compositions and methods of use thereof |
SG10201800778QA (en) | 2008-02-15 | 2018-02-27 | Synthetic Genomics Inc | Methods for in vitro joining and combinatorial assembly of nucleic acid molecules |
US8207363B2 (en) | 2009-03-19 | 2012-06-26 | Martek Biosciences Corporation | Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof |
CN101928670B (zh) | 2009-09-24 | 2012-02-22 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
PL3789031T3 (pl) | 2010-09-17 | 2024-01-15 | Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa | Antybakteryjny fag, peptydy fagowe i sposoby ich zastosowania |
WO2013116771A1 (en) * | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Synthetic Genomics, Inc. | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules |
DE202013012242U1 (de) | 2012-05-25 | 2016-02-02 | Emmanuelle Charpentier | Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
WO2015035168A1 (en) * | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Massachusetts Institute Of Technolgy | Tuning bacteriophage host range |
EP3204427A4 (en) * | 2014-10-09 | 2018-06-06 | Lipotek Pty Ltd | Chimeric proteins |
JP6842417B2 (ja) | 2014-12-16 | 2021-03-17 | シー3ジェイ セラピューティクス インコーポレイテッド | インビトロウイルスゲノム工学のための組成物及びその方法 |
-
2015
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2018
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2021
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-
2022
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006137847A2 (en) | 2004-09-13 | 2006-12-28 | Trustees Of Boston University | Engineered enzymatically active bacteriophages and methods of uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Current Pharmaceutical Biotechnology,2008年,vol.9,p.261-266 |
Polish Journal of Microbiology,2014年,vol.63, no. 2,p.137-145, entered STN: 14 Aug 2014 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113215115A (zh) | 2021-08-06 |
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