EA038595B1 - Композиции и способы для конструирования вирусного генома in vitro - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу конструирования нуклеиновых кислот в условиях in vitro. Изобретение дополнительно относится к in vitro конструированию вирусных геномов и к улучшению вирусных свойств с помощью геномной инженерии in vitro вирусных геномов. В частности, изобретение относится к расщеплению вирусного генома в условиях in vitro с использованием РНК-направляемой Cas9, сборки рекомбинантного генома путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленный вирусный геном и трансформации клетки-хозяина рекомбинантным геномом. Данный способ также относится к конструированию in vitro для исправления ошибок в нуклеиновых кислотах.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с USC 119 (е) по предварительной заявке на патент США № 62/092707, поданной 16 декабря 2014 г., предварительной заявке на патент США № 62/102362, поданной 12 января 2015 г., и предварительной патентной заявке США № 62/242811, поданной 16 октября 2015 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит ссылки на последовательности нуклеиновой кислоты, которые одновременно представлены в виде текстового файла с перечнем последовательностей SGI1840_3WO_Sequence_Listing_ST25.txt, с размером файла (139 кБ) в килобайтах, созданного 15 декабря 2015 г., который включен в качестве ссылки в полном объеме в соответствии со Сводом федеральных нормативных актов США, раздела 37, пункта 1.52(е) (iii) (5).

Область техники

Изобретение в основном относится к быстрому конструированию геномов и, более конкретно, к конструированию вирусных геномов in vitro.

Уровень техники

Вирусы используют во многих научных целях, особенно при разработке профилактических, терапевтических и диагностических средств. Для этих целей вирусы часто подвергают генной инженерии. Инженерия in vitro требует легко поддающегося обработке организма-хозяина и часто может занять от нескольких недель до нескольких месяцев для создания модифицированных вирусов и вирусных векторов (Levin and Bull, Nat. Rev. Microbiol., 2004 Feb; 2(2): 166-73, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, существуют проблемы токсичности, связанные с манипулированием многими вирусными геномами в клетках. Усилия по разработке методов генной инженерии in vitro крупных вирусных геномов до сих пор были ограничены наличием уникальных последовательностей целевых рестрикционных ферментов и низкой эффективностью, полученной для расщепления генома и последующей рекомбинантной сборки. Кроме того, многие усилия в области генной инженерии пресекаются неправильно предсказанными вирусными геномными точками окончания репликации. Например, общедоступные PB1-подобные вирусные геномы неправильно размещают концевые последовательности в середине генома, что является часто встречающейся ошибкой при использовании современных методов секвенирования и сборки генома in silico (Ceyssens et al., Environ Mibrobiol. 2009 Nov; 11(11): 2874-83).

Остается потребность в быстрой генной инженерии вирусных геномов, особенно для вирусов, инфицирующих генетически неприемлемых хозяев. Изобретение использует Cas9-опосредованное расщепление in vitro и сборку сайтспецифических модифицированных целых вирусных геномов. Настоящий способ значительно увеличивает точность, простоту и скорость, с которой вирусные геномы могут быть генетически модифицированы. Кроме того, настоящий способ преодолевает общепризнанную сложность манипулирования часто токсичными вирулентными вирусными геномами внутри нативных и гетерологичных клеток-хозяев. Использование раскрытого способа конструирования in vitro также позволяет идентифицировать подходящие вирусные геномные концы, что облегчает последующее конструирование при помощи настоящего раскрытия.

Коррекция ошибок in vitro представляет собой бесценный метод получения желаемых последовательностей после клонирования или методов сборки. Стандартные методы коррекции ошибок, основаные на ПЦР, которая имеет две неотъемлемые проблемы: 1) ПЦР может вводить дополнительные нежелательные мутации в нуклеиновую кислоту; и 2) ПЦР в этом контексте имеет ограничение по размеру приблизительно 5 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов), прежде чем она становится все более подверженной ошибкам (руководство по набору Quick Change site-directed mutagenesis kit, New England Biolabs, США). Поэтому стандартные методы исправления ошибок на основе ПЦР не могут быть надежно выполнены на плазмидах размером более 5 т.п.н., либо из-за дополнительных создаемых ПЦР мутаций, либо из-за невозможности амплификиции всей матрицы.

Сущность изобретения

Среди различных аспектов настоящего раскрытия представлены композиции и способы для конструирования последовательностей нуклеиновых кислот in vitro с использованием РНК-направляемой нуклеазы. В одном аспекте раскрытие относится к улучшению специфических вирусных свойств при помощи генетической инженерии in vitro последовательностей вирусных нуклеиновых кислот и к улучшенным вирусным композициям или частицам. В другом аспекте раскрытие относится к расщеплению in vitro последовательностей вирусных нуклеиновых кислот с использованием эндонуклеазы, направляемой РНК, например Cas9, с последующей сборкой последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента(ов) ДНК или РНК в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к сконструированному вирусу, содержащему сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту, способную при введении в клетку-хозяина продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы с двумя или более улучшенными вирусными свойствами по сравнению с вирусными частицами, полученными путем введения несконструированной вирусной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина.

- 1 038595

В некоторых аспектах полученные вирусные частицы имеют по меньшей мере три улучшенных вирусных свойства.

В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунологического надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота представляет собой сконструированный вирусный геном.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном представляет собой сконструированный геном бактериофага. В некоторых аспектах по меньшей мере одно из улучшенных вирусных свойств представляет собой специфичность к хозяевам.

В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство представляет собой результат по меньшей мере одной модификации в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте.

В некоторых аспектах по меньшей мере одно улучшенное вирусное свойство представляет собой результат по меньшей мере двух модификаций в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна модификация в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте представляет собой результат одного этапа конструирования.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна модификация в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте представляет собой результат неоднократно повторяемых этапов конструирования.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна из модификаций находится в последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 25.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна из модификаций находится в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит весь или часть гетерологичного гена gp18. В некоторых аспектах гетерологичный ген gp18 имеет по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 26. В некоторых аспектах гетерологичный ген gp18 кодирует аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 38.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит весь или часть сконструированного гена gp34. В некоторых аспектах сконструированный ген gp34 кодирует аминокислотную последовательность, содержащую мутацию в положении, соответствующем положению 55 аминокислоты в SEQ ID NO: 5.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в одной или более последовательностях, имеющих по меньшей мере 85% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 50. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в каждой последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности SEQ ID NO: 1, последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности SEQ ID NO: 2, последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 3 и последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 50. В некоторых аспектах модификации включают замену G на А в положении, соответствующем положению 50 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, замену G на Т в положении, соответствующем положению 160 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO: 50, замену А на G в положении, соответствующем положению 245 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO: 2, замену AT на ТС в положениях, соответствующих положениям 247-248 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO: 2 и замену А на G в положении, соответствующем положению 757 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO: 3.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно включает модификацию в одной или более последовательностях нуклеиновой кислоты, кодирующих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности, с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 48. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном включает модификацию в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей каждую из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 34,

- 2 038595 аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 35, аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 36, и аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 48. В некоторых аспектах модификации включают замену С на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 17 в SEQ ID NO: 34, замену D на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO: 48, замену D на G в положении, соответствующем аминокислотной положению 82 в SEQ ID NO: 35, замену I на S в положении, соответствующем аминокислотному положению 83 в SEQ ID NO: 35 и замену N на D в положении, соответствующем аминокислотному положению 253 в SEQ ID NO: 36.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в пределах последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 25. В некоторых аспектах модификация представляет собой введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 25, или замену последовательности, содержащейся в последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 25 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 85% идентичности с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в пределах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 49. В некоторых аспектах модификация представляет собой введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 49, или замену последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 49 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности, с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с промотором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в SEQ ID NO: 21, или ее часть.

В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с терминатором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, или ее часть.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие представляет способ создания сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более необходимыми вирусными свойствами, включающими: (a) предоставление первого вирусного генома; и (b) создание сконструированного вирусного генома путем объединения по меньшей мере одного фрагмента первого вирусного генома по меньшей мере с одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты для создания второго вирусного генома, содержащего по меньшей мере одну модификацию по сравнению с первым вирусным геномом; при этом второй вирусный геном, будучи введенным в клетку-хозяина, способен продуцировать вирусные частицы с двумя или более улучшенными вирусными свойствами.

В некоторых аспектах способ дополнительно содержит (с) повторение этапов (а)-(b) в одном или более повторениях.

В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунологического надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах улучшенное свойство или улучшенные свойства и улучшенное вирусное свойство или улучшенные вирусные свойства используются взаимозаменяемо.

В некоторых аспектах создание сконструированного вирусного генома на стадии (b) включает: (1) расщепление in vitro области первого вирусного генома с использованием эндонуклеазы; и (2) сборка по

- 3 038595 меньшей мере одного фрагмента расщепленного первого вирусного генома с по меньшей мере одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах первый вирусный геном выделяют из вирусных частиц.

В некоторых аспектах первый вирусный геном или по меньшей мере одна восстанавливающая молекула нуклеиновой кислоты синтезируется в условиях de novo.

В некоторых аспектах синтез de novo включает объединение химически синтезированных молекул нуклеиновой кислоты, ПЦР-амлифицированных последовательностей нуклеиновой кислоты, расщепленных фрагментов выделенных молекул нуклеиновой кислоты или любых их комбинаций.

В некоторых аспектах первый вирусный геном или по меньшей мере одну восстанавливающую молекулу нуклеиновой кислоты амплифицируют перед расщеплением in vitro.

В некоторых аспектах первый вирусный геном по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 18 т.п.н., по меньшей мере 25 т.п.н. или по меньшей мере 30 т.п.н.

В некоторых аспектах сборку выполняют in vitro или in vivo.

В некоторых аспектах сборку выполняют in vitro со смесью, содержащей: (а) выделенную 5'-3'экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (b) выделенную невязкую замещающую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (с) выделенную лигазу; и (d) смесь дНТФ в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей сконструированный вирусный геном.

В некоторых аспектах эндонуклеаза представляет собой РНК-направляемую нуклеазу.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает по меньшей мере одну гидовую РНК.

В некоторых аспектах нуклеаза, управляемая РНК, представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9, и в котором по меньшей мере одна гидовая РНК включает 1) химерную гРНК или 2) сгРНК и tracrPHK.

В некоторых аспектах эндонуклеазу инактивируют нагреваением или удаляют перед сборкой.

В некоторых аспектах система расщепления in vitro дополнительно содержит спермидин.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает трансформирование сконструированного вирусного генома в клетку-хозяина.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает использование упаковочного набора in vitro для упаковки сконструированного вирусного генома в вирусные частицы.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие представляет собой сконструированный вирус, полученный любым из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых аспектах сконструированный вирус представляет собой любой из сконструированных вирусов, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие представляет набор для конструирования молекул вирусной нуклеиновой кислоты, содержащий: (а) очищенную рекомбинантную РНКнаправляемую нуклеазу; (b) выделенную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (с) выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; и (d) выделенную термостабильную лигазу.

В некоторых аспектах набор дополнительно содержит один или более из: (1) краудинг-агента; (2) смеси дНТФ; и (3) подходящего буфера.

В некоторых аспектах набор дополнительно содержит специально разработанные гидовые РНК.

В некоторых аспектах набор дополнительно содержит специально разработанные синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, предназначенные для использования в качестве вставленного фрагмента ДНК в реакции сборки.

В некоторых аспектах набор дополнительно содержит компетентные клетки-хозяева для трансформации.

В некоторых аспектах набор дополнительно содержит выделенные вирусные геномные нуклеиновые кислоты.

В некоторых вариантах реализации изобретение представляет собой систему сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты in vitro, содержащую выделенную вирусную нуклеиновую кислоту, рекомбинантную РНК-направляемую нуклеазу, по меньшей мере одну гидовую РНК и фрагмент нуклеиновой кислоты, который должен быть вставлен в сайт расщепления выделенной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах система такова, что рекомбинантная РНК-направляемая нуклеаза и по меньшей мере одна гидовая РНК образуют комплекс, способный расщеплять выделенную вирусную нуклеиновую кислоту.

В некоторых аспектах система дополнительно содержит спермидин.

В некоторых аспектах система дополнительно содержит выделенную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не

- 4 038595 обладает З'-экзонуклеазной активностью; выделенную лигазу; и смесь дНТФ, причем система находится в условиях, которые являются эффективными для вставки фрагмента нуклеиновой кислоты в выделенную вирусную нуклеиновую кислоту в месте расщепления нуклеазой, управляемой РНК, с образованием рекомбинантной вирусной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах система, описанная в настоящем документе, такова, что рекомбинантная вирусная нуклеиновая кислота способна продуцировать вирусные частицы, не встречающиеся в природе, по меньшей мере с двумя улучшенными вирусными свойствами по сравнению с вирусными частицами, полученными из несконструированной вирусной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах улучшенное вирусное свойство или свойства выбраны из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунологического надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах в системе, описанной в настоящем документе, нуклеаза, управляемая РНК, представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых аспектах РНК-направляемую нуклеазу инактивируют или удаляют перед сборкой.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие представляет способ конструирования последовательности нуклеиновой кислоты, включающий: (а) обеспечение нуклеиновой кислоты; (b) расщепление in vitro области нуклеиновой кислоты с использованием нуклеазы, управляемой РНК; и (с) сборку рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК в расщепленную нуклеиновую кислоту, причем сборку проводят in vitro в одном сосуде со смесью компонентов, включающих: (i) выделенную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (ii) выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНКполимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (iii) выделенную лигазу; и (iv) смесь дНТФ в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах нуклеаза, управляемая РНК, представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах нуклеазу, управляемую РНК, инактивируют воздействием тепла или удаляют до сборки.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает: (d) трансформацию рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие относится к способу получения нуклеиновой кислоты, причем нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, выделенную из клетки-хозяина. В некоторых аспектах плазмида составляет по меньшей мере 5 т.п.н. В некоторых аспектах плазмида составляет по меньшей мере 6 т.п.н. В некоторых аспектах плазмида составляет по меньшей мере 10 т.п.н. В некоторых аспектах плазмида составляет по меньшей мере 15 т.п.н. В некоторых аспектах плазмида составляет по меньшей мере 20 т.п.н.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1А-1Е показана схема процесса in vitro для прямого конструирования вирусных геномов. А) Геномы выделяют из очищенных вирусных частиц с использованием способов, известных специалистам в данной области техники. Серыми линиями показан пример дцДНК вирусного генома. Светло-серыми линиями на концах генома обозначены прямые концевые повторы, обычно встречающиеся во многих вирусных геномах. Б) Вирусные геномы затем расщепляют на одном или нескольких участках местоположения, в частности, используя нуклеазу, управляемую РНК, такую как Cas9, в сочетании с очищенными нацеливающими РНК, такими как химерные гРНК, сгРНК и tracrPHK или только сгРНК. На иллюстрации изображена РНК-направляемая нуклеаза, нацеленная на определенные вирусные геномные локализации, в соответствии с указанной РНК. В) РНК-направляемую нуклеазу инактивируют с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но без ограничений, воздействие тепла и/или удаление с использованием классической экстракции фенол-хлороформом. Г) Вставку ДНК или РНК выполняют с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но без ограничений, синтез in vitro, амплификацию (ПЦР) или фермент-опосредуемое освобождение от плазмид, вирусов или бактериальной геномной ДНК (гДНК). На диаграмме изображены вновь созданные вставки (темно-серые линии) с областями гомологии, соответствующими вирусным последовательностям, фланкирующим сайт(ы) расщепления РНК-направляемой нуклеазой (серые концевые области). Д) Расщепленные вирусные геномы и очищенную вставку собирают in vitro с использованием методов, известных в данной области техники, включая, но без ограничений, метод сборки Gibson Assembly, SLIC (метод безлигазного клонирования, в присутствии белка RecA) и/или сборку Golden Gate. На иллюстрации показан собранный рекомбинантный геном, который теперь содержит новую последовательность вставки (темносерые линии) в нужной локализации. Е) Рекомбинантные вирусные геномы трансформируют непосредственно в клетки-хозяева с использованием методов, известных в данной области техники, включая, но без ограничений, электропорацию или химическую трансформацию. На фигуре показано восстановление функциональных вирусных частиц после трансформации инфекционного вирусного генома в восприим- 5 038595 чивые клетки-хозяева;

на фиг. 2А-2Е - конструирование in vitro вирусного генома. А) Очистка ~ 43 т.п.н. дцДНК вирусного генома LUZ19 непосредственно от вирусных частиц. Б) Сайтспецифическое расщепление очищенного вирусного генома в двух независимых локализациях для удаления фрагмента гена gp7 с использованием РНК-зависимой нуклеазы Cas9 и in vitro транскрибируемых гРНК. В) ПЦР использовали для амплификации гена gp7 из вируса ФИР??. Г) Метод сборки in vitro Gibson Assembly использовали для последовательной специфической интеграции ПЦР-амплифицированного фрагмента гена gp7 ΦKF77 в расщепленный геном LUZ19. Д) Инфекционные геномы, собранные in vitro, трансформировали непосредственно в клетки-хозяева для восстановления функциональных вирусных частиц, что подтверждается образованием бактерий. Е) Внутренние и внешние праймеры использовали в ПЦР для проверки того, что вирусы содержат новый фрагмент ДНК в правильном геномном сайте. Все тестируемые вирусные клоны были ПЦР-положительными для новой вставки фрагмента gp7 ΦKF77 (правые 7 полос);

на фиг. 3А-3Б - создание вируса с улучшенными вирусными свойствами после in vitro вирусного геномного конструирования. А) На диаграмме показаны геномы естественного вируса LUZ19 и сконструированного производного, несущего ген gp18 вируса LKD16 вместо естественной последовательности gp18 LUZ19. Черными стрелками обозначены открытые рамки считывания LUZ19, а серой стрелкой указан недавно встроенный ген gp18 LKD16. Б) Слева на диаграмме Венна показаны общие и отдельные бактерии-хозяева, инфицированные вирусами LUZ19 и LKD16. Были протестированы разнообразные коллекции из 282 клинических изолятов P.aeruginosa. Справа на диаграмме Венна показано, что сконструированный вирус LUZ19, содержащий ген gp18 LKD16, имеет расширенный круг хозяев, включая 3 из 6 штаммов, ранее зараженных только LKD16;

на фиг. 4А-4В - схемы, демонстрирующие процесс, используемый для идентификации и выбора генетических элементов и точечных мутаций, необходимых для расширения круга хозяев и разработки способности вирусов с широким кругом хозяев заражать полный круг хозяев рода вирусов А) Схематическое представление процесса, используемого для идентификации мутаций, ответственных за специфичность к кругу хозяев. Б) На схематическом представлении изображены модификации генома, необходимые для создания вируса LUZ19 с широким кругом хозяев (ШКХ-LUZ19); звездочки (*) определяют локализацию каждой точечной мутации, связанной с кругом хозяев. Метки gp13 C17Y, gp18 D36Y, gp38 D82G и 183S, и gp40 N253D описывают генные продукты и аминокислотную точечную мутацию, связанную с расширением круга хозяев LUZ19. РА7245, РА7255, РА7410, РА7427, РА7503 и РА7686 представляют собой клинические изоляты Р.aeruginosa, восприимчивые только к LKD16 и ШКХ-LUZ19; PA7649 представляют собой клинические изоляты P.aeruginosa, чувствительные только к ΦKMV и ШКХ-LUZ19. Клинические изоляты, инфицированные после добавления данной мутации, изображены выше данной мутации. В) Слева на диаграмме Венна показаны общие и отдельные бактерии-хозяева, инфицированные вирусами LUZ19, LKD16 и ΦΚΜν. Справа на диаграмме Венна показано, что сконструированный вирус ШКХ-LUZ19, содержащий описанные выше точечные мутации, способен заразить все 67 штаммов, восприимчивых к роду вирусов ΦΚΜν;

на фиг. 5А-5Д показано, что мутация белка Gp34 LUZ19 улучшает литическую активность. А) Белок Gp34 LUZ19 является членом комплекса трубок вируса (см. вставленное изображение). Б) Анализ бляшкообразования в мягком агаре для двух связанных фагов, экспрессирующих или Gp34 LUZ19 дикого типа или Gp34 с разницей в лейцине 55 (L55A) (фаг *). Снимки были сделаны в течение двух суток и было показано, что фаг, экспрессирующий мутацию L55 Gp34, имеет зоны повышенного лизиса. В) Анализ биопленки с окрашиванием кристаллическим фиолетовым, экстраполирующий биомассу биопленки в виде измерения включения кристаллического фиолетового. Фаг LUZ19*, экспрессирующий Gp34 L55Δ, был способен лучше разрушать биопленку P.aeruginosa, предварительно сформированную в течение 8 ч по сравнению с LUZ19 дикого типа. Гентамицин в десятикратном размере минимальной ингибирующей концентрации (МИК) использовали для полного удаления биопленки. Г) На иллюстрации показано расположение мутации gp34 по сравнению с геномом LUZ19 дикого типа. Д) На таблице продемонстрирована разница в величине поглощения и величине выхода фага между LUZ19 и LUZ19, экспрессирующим Gp34 L55Δ;

на фиг. 6А-6Е представлены схемы, демонстрирующие итеративное конструирование вируса с улучшением до двух независимых свойств. А) Схематическое представление LUZ19_LKD16gp18 вирусной гДНК, в которой ген gp18 LUZ19 дикого типа заменен гомологом LKD16. Черным цветом обозначена последовательность генома LUZ19 дикого типа; серым цветом- gp18 от LKD16. Б) Восприимчивость лабораторных и МЛР клинических штаммов к очищенному исходному (LKD16 и LUZ19) и сконструированному вирусу LUZ19*_LKD16gp18, демонстрирующему объединение круга хозяев. В) Схематическое представление вирусной гДНК LUZ19*_LKD16gp18, в которой и лейцин, закодированный в позиции 55 Gp34, был удален, а gp18 LUZ19 заменен на gp18 вируса LKD16. Черным цветом обозначена геномная последовательность LUZ19 дикого типа; серым цветом - gp18 от LKD16; серая звезда обозначает gp34^_eu55. Г) Восприимчивость лабораторных и МЛР клинических штаммов к очищенному исходному (LKD16, LUZ19 и LUZ19_LKDi_6gpi8, содержащим gp18 из вируса LKD16) и сконструированному вирусу (LUZ19,

- 6 038595 несущему делецию лейцина, закодированную в позиции 55 GP34 и LUZ19*_LKD16gp18), демонстрирующему объединение круга хозяев у вирусов LUZ19_LKD16gp18 и LUZ19*_LKD16gp18. Д) Оценка литической активности фага дикого типа и сконструированного фага против бактерий, прикрепленных к монослоям кератиноцитов. Количество бактерий РАО1К и РА7245, прикрепленных к клеткам, отмечали как процент от общего количества бактерий, инкубированных с монослоями кератиноцитов. Данные демонстрируют улучшенную литическую активность вирусов LUZ19* и LUZ19*_LKD16gp18. Е) Улучшенное раннее разрушение 8часовой биопленки РАО1К и РА7245 при помощи сконструированного фага по сравнению с исходными вирусами. Гентамицин использовали в десятикратном размере минимальной ингибирующей концентрации для полного удаления биопленки. Приведенные данные представляют собой три независимых эксперимента, выполненных в трех повторениях. Столбцы представляют собой среднее ± СОС; * Р <0,01; ** Р <0,001; *** р <0,0001;

на фиг. 7А-7Е показаны схемы, демонстрирующие второй пример итеративного конструирования вируса с улучшением до двух независимых свойств. А) Схематическое представление LUZ19, сконструированного для экспрессии различных генетически закодированных полезных нагрузок из улучшенного локуса gp49. Ген gp49 заменяли кассетой, содержащей ген интереса (ГИ), фланкированный основным промотором и терминатором капсида (gp32) (P_gp32 и T_gp32). Использовали биопленку, диспергирующую ГИ: ЭПС-деполимеразы (Рр15gp44 - хвостовой шип gp44 из сф15 Pseudomonas pudita; NTUgp34 - хвостовой шип gp34 из фага Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044-K1-1 (NTU); LKAlgp49 - хвостовой шип gp49 из фага Р.aeruginosa LKA1), поверхностно-активные фенол-растворимые модулины из Staphylococcus epidermidis (PSMa) и Staphylococcus aureus (PSMa3 и PSMb2) и DspB-сурфактин (дисперсин Всурфактин) из Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Б) Анализ дисперсии биопленки, демонстрирующий активность сконструированного фага LUZ19 против 24 ч биопленки PAOIK P.aeruginosa, обработанной 100 фагами в течение 3 ч. Гентамицин использовали в десятикратном размере минимальной ингибирующей концентрации (МИК). В) Схематическое представление ранее сконструированного фага ШКХ-LUZ19, дополнительно сконструированного для экспрессии ГИ из сконструированного локуса gp49. Г) Анализ дисперсии биопленки, демонстрирующий сконструированный ШКХ-LUZ19, дополнительно модифицировали для экспрессии ферментов и сурфактинов с активностью против 24 ч биопленки P.aeruginosa PAOIK, обработанной 100 фагами в течение 3 ч. Сконструированная полезная нагрузка: ЭПС-деполимераза Рр15gp44 и SePSMa. Гентамицин использовали в десятикратном размере МИК. Д) Восприимчивость лабораторных и клинических штаммов к очищенным исходным (LKD16 и LUZ19) и производным LUZ19, демонстрирующим объединение и сохранение круга хозяев при дальнейшей разработке для экспрессии фрагментов, диспергирующих биопленку. Е) На диаграмме Венна показано сохранение круга хозяев ШКХ-LUZ19 после добавления биопленки, диспергирующей полезную нагрузку Рр5gp44 и SePSMa;

на фиг. 8А-8В представлены схемы, демонстрирующие создание вируса, способного помешать клеткам-хозяевам получить резистентность к вирусу в сочетании с субингибирующей концентрацией антибиотика. А) Схематическое изображение LUZ19 дикого типа, сконструированного для экспрессии лизинов из фага или MS2 или PRR1. Б) и В) Анализ зависимости время - летальное действие, демонстрирующие сенсибилизацию P.aeruginosa PAOIK к субингибирующим концентрациям карбенициллина (Cb - 1/5 х МИК) при помощи LUZ19, экспрессирующих лизины из оцРНК бактериофага. Эти данные демонстрируют, что сконструированный бактериофаг, экспрессирующий ненативные лизины в сочетании с субингибирующими концентрациями антибиотиков, может препятствовать быстрому приобретению резистентности бактерий к единственному вирусу;

на фиг. 9А-9Г - схемы, демонстрирующие создание 2-го вируса, способного помешать клеткамхозяевам получить вирусную резистентность. А) Схематическое изображение LUZ19 дикого типа, сконструированного для экспрессии белка бактериоцина PyoS5 из сконструированного локуса gp49. Б) Анализы зависимости время - летальное действие, демонстрирующие, что рост штамма РА7416 XRSPA был первоначально ингибирован диким типом LUZ19, однако бактерии быстро избегали вируса, что приводило к повторному росту бактерий. Приблизительно 1 х 10⁷ КОЕ добавляли на лунку. Высокую МИ (множественность инфицирования)=10 БОЕ/КОЕ и низкую МИ=0,01 БОЕ/КОЕ указанного вируса или носителя добавляли на 0 ч. В) Тесты на поражение, демонстрирующие, что LUZ19, кодирующий PyoS5, способен ингибировать рост и повторный рост штамма РА7416 XDRPA по сравнению с вирусом дикого типа. Приблизительно 1х10⁷ КОЕ добавляли на лунку. В течение 0 ч добавляли высокую МИ=10 БОЕ/КОЕ и низкую MOI =.01 БОЕ/КОЕ указанного вируса или носителя. Г) Сравнение роста РА7416 через 24 ч в присутствии или LUZ19 дикого типа или LUZ19+pyoS5. На графике отображены данные для эксперимента с низким МИ;

на фиг. 10 - схематический чертеж системы, включающей редактирование целевого вирусного генома с фенотипическим скринингом бактериофагов для создания генетически сконструированного бактериофага с улучшением двух или более свойств. Система опирается на неоднократное повторение этапов скрининга и секвенирования мутантных или естественных вирусов с желаемыми фенотипическими признаками и интегрированием данных признаков в одно или более вирусных шасси на одном или бо- 7 038595 лее этапах конструирования. Данный процесс обеспечивает прямой и рациональный способ быстрой идентификации генетических элементов, лежащих в основе специфического фенотипического признака бактериофага, интегрирования множественных независимых мутаций или аллелей в один геном бактериофага и создания искусственного вируса, сочетающего два или более улучшенных признака;

на фиг. 11А-11Ж показано конструирование in vitro генома фага Е.coli M13. А) Схематическое изображение умеренного фага М13mp18 и М13_{пяприкя} Е. coli. Б) Электрофорез в геле расщепленной кольцевой геномной ДНК М13 in vitro с использованием гРНК 1 и 2 в независимых реакциях с РНКнаправляемой эндонуклеазой Cas9. На диаграмме ниже на геле показана кольцевая и линейная природа нерасщепленных и дважды расщепленных геномов М13 соответственно. Эти данные показывают, что обе гРНК точно и полностью расщепляют дцДНК М13 в заданных локализациях. В) Гель-электрофорез расщепленной кольцевой геномной ДНК М13 in vitro с использованием как гРНК, так и РНКнаправляемой эндонуклеазы Cas9, в той же реакции (двойное расщепление). На диаграмме ниже на геле показана кольцевая и линейная природа нерасщепленных и дважды расщепленных геномов М13 соответственно. Г) Гель-электрофорез, визуализирующий ПЦР полученной вставки, содержащей флуоресцентный репортер паприка. Д) Трансформация расщепленной и собранной in vitro сконструированной гДНК М13_{паприка} в клетки E.coli для восстановления функциональных вирусных частиц. Вирусные бляшки неотчетливы и скрыты, потому что М13 является умеренным бактериофагом, который не лизирует клетки-хозяева, что приводит к плохому образованию бляшек. В качестве положительного контроля использовали нерасщепленную гДНК М13. ГДНК М13, расщепленная Cas9, но собранная в отсутствие вставки (без вставки) демонстрирует как полноту расщепления, так и низкий уровень фона. Е) Проверка при помощи ПЦР бляшек сконструированного М13_{паприка}. Прямые и обратные праймеры были разработаны вне областей гомологии вставки. Несконструированная гДНК М13 продуцировала 0,9 т.п.н. продукт и использовалась в качестве отрицательного контроля для реакций ПЦР. Ж) Флуоресцентные (нижние) и яркие (верхние) изображения исходной и сконструированной М13_{паприка} во время образования бляшек;

на фиг. 12А-12Д - конструирование in vitro второго генома фага Е.coli. А) Схематическое представление фага Е.coli X AcII. Линейный фаговый геном имеет размер 48,5 т.п.н. Б) Гель-электрофорез расщепленной геномной ДНК λ in vitro с использованием гРНК 1 и 2 в независимых реакциях с РНКнаправляемой эндонуклеазой. На диаграмме ниже на геле показаны линейные нерасщепленные и ожидаемые продукты расщепления. Эти данные показывают, что обе гРНК точно и полностью расщепляют дцДНК λ в заданных локализациях. В) Гель-электрофорез дважды расщепленной геномной ДНК λ in vitro с использованием как гРНК, так и РНК-направляемой эндонуклеазы в той же реакции. На диаграмме ниже на геле показаны линейные нерасщепленные и ожидаемые продукты двойного расщепления. Г) На схеме показано использование фагового упаковочного буфера фага λ для упаковки генома дикого типа и рекомбинантного фага in vitro. Cas9 с дважды расщепленным и собранным геномом фага были упакованы in vitro в соответствии с протоколом изготовителя и покрыты Е.coli для восстановления недавно сконструированного фага λ ΔοΠ. Д) ПЦР-проверка гена AcII λ. Прямой праймер был расположен снаружи от области конструирования. Делеции положительных клонов имеют ожидаемый размер 300 п.о;

на фиг. 13А-13Г - конструирование in vitro последовательностей из цитомегаловируса человека (ЦМВ). А) Схематическое изображение вирусного генома ЦМВ длиной 235 т.п.н. Сверху геном в форме сигары представляет собой полноразмерный геном, а черный раздел обозначает область манипуляции. Небольшая белая секция означает 235 п.о. вставку, добавляемую с использованием метода инженерии in vitro, описанного в настоящем документе. Б) Гель-электрофорез с дважды расщепленной плазмидой in vitro, содержащей 17,8 т.п.н. области генома ЦМВ, с использованием двух гРНК и РНК-направляемой эндонуклеазы Cas9. На диаграмме ниже на геле показаны кольцевые нерасщепленные и линейные дважды расщепленные продукты. Эти данные показывают, что обе гРНК точно и полностью расщепляют последовательность дцДНК ЦМВ в заданной локализации. В) Гель-электрофорез, визуализирующий ПЦР созданной вставки, содержащей новую последовательность вставки RL13. Г) ПЦР-проверка сконструированной последовательности ЦМВ. Прямой праймер был расположен снаружи от области конструирования. Вставки положительных клонов имеют ожидаемый размер 500 п.о;

на фиг. 14А-14Е - быстрая идентификация концов фага. А) Выделение геномной ДНК из очищенных вирусных частиц. Б) Секвенирование нового поколения гДНК (MiSeq или PacBio) и автоматическое слияние высококачественных считываний ДНК в более длинные сборки для реконструирования исходной последовательности. В светло-сером цвете - ПТП - прямые терминальные повторы. Программное обеспечение автоматическоей сборки неправильно размещает ПТП терминально повторяющихся геномов во внутренней области вирусной последовательности. Геномные физические концы подтверждены целевым расщеплением Cas9 предсказанной последовательности. В) Прогнозирование in silico физических концов генома на основе идентификации областей секвенирования двойного охвата и поиска BLAST, который соответствует близкородственному терминально повторяющемуся геному. Физические концы подтверждаются при помощи расщепления эндонуклеазой Cas9 предсказанных физических концов. Г) После инактивации Cas9 фрагменты ДНК, соответствующие геномным физическим концам, очищают и секвенируют. Д) Точная сборка генома на основе последовательности физических концов. Е)

- 8 038595

Пример картирования геномных физических концов фагов LBL3 и 14-1 (терминально повторяющихся геномов) с использованием Cas9-напраβленного расщепления в определенном положении, предсказанного при помощи реанжировки генома in silico. Светлосерыми стрелками указано на очищенные и секвенированные фрагменты ДНК;

на фиг. 15А-15В - схематическое изображение конструирования и стратегия синтеза химерной огРНК. А) На иллюстрации показано расположение мотивов NGG РАМ (темно-серые подчеркнутые последовательности) и целевых сайтов огРНК (светлосерые последовательности), фланкирующих представляющий интерес ген (ГИ). Черные последовательности обозначают оставшиеся вирусные геномные последовательности. Б) Конструирование олигонуклеотидов, используемых в качестве матриц для транскрипции огРНК in vitro. Последовательности, составляющие промотор Т7, последовательность направляющей огРНК и консервативную область химерной огРНК, обозначены соответственно подчеркнутым темно-серым, светло-серым и черным текстом. В) Схема in vitro транскрибируемой химерной огРНК. Светло-серыми и черными последовательностями указаны нацеливающие и консервативные химерные области, составляющие каждую функциональную огРНК соответственно. Все Ns обозначают вариабельные последовательности, используемые для изменения целевой специфичности каждой огРНК.

Подробное описание иллюстративных вариантов реализации изобретения

Изобретение обеспечивает композиции и способы для конструирования in vitro и дополнительно относится к улучшению вирусных свойств. Изобретение дополнительно обеспечивает способ конструирования нуклеиновых кислот in vitro.

До того как будут описаны настоящие композиции и способы, следует понимать, что это раскрытие не ограничивается конкретными композициями, способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие композиции, способы и условия могут варьироваться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего раскрытия будет ограничен только в прилагаемой формуле изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее раскрытие. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы в практике или тестировании раскрытия, ниже описаны предпочтительные способы и материалы. Определения, изложенные ниже, предназначены для понимания раскрытия, но ни в коем случае не должны считаться заменяющими понимание терминов, которыми обладают специалисты в данной области техники.

Как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылки на способ включают один или более способов и/или этапы, описанные в настоящем документе, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения настоящего раскрытия и т.д.

Используемые в настоящем документе термины около или приблизительно при обращении к любому численному значению обозначают значение плюс или минус 10% от указанного значения. Например, около 50°С (или приблизительно 50°С) охватывает диапазон температур от 45 до 55°С включительно. Аналогично, около 100 ммоль/л (или приблизительно 100 ммоль/л) охватывает диапазон концентраций от 90 до 110 ммоль/л включительно. В качестве альтернативы около или приблизительно может означать в пределах 5% от заявленного значения, или в некоторых случаях в пределах 2,5% от заявленного значения, или около может означать округление до ближайшей значащей цифры. Все диапазоны, предусмотренные в заявке, включают значения верхнего и нижнего концов диапазона.

Термины клетки, культуры клеток, клеточная линия, клетки рекомбинантного хозяина, клетки-реципиенты и клетки-хозяева, используемые в настоящем документе, включают первичные клетки-субъекты и любое их потомство независимо от количества пассажей. Следует понимать, что не все потомства точно идентичны исходной клетке (из-за преднамеренных или непреднамеренных мутаций или различий в окружающей среде); однако такое измененное потомство включено в эти термины, при условии, что потомство сохраняет те же функциональные свойства, что и у изначально трансформированной клетки.

Термин сборка или сборка, используемый в настоящем документе, относится к соединению молекул ДНК или РНК.

Термин восстанавливающая молекула нуклеиновой кислоты, используемый в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может быть собрана с одним или более фрагментами ДНК или расщеплена, или отщеплена ДНК-плазмидой или молекулой нуклеиновой кислоты ДНК, с тем чтобы создать молекулу непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты или закрытой плазмидной ДНК.

Термины синтез de novo, сборка de novo, химический синтез и синтез ДНК относятся к способам создания последовательностей нуклеиновых кислот без необходимости использования ранее существовавшей матрицы предшественника.

- 9 038595

В тех способах изобретения, которые выполняют in vitro, все белковые компоненты выделяют и/или практически очищают. Реакции сборки in vitro не проводят в живой клетке или с необработанным клеточным экстрактом; реакции проводят в бесклеточной среде.

Функциональная молекула РНК представляет собой молекулу РНК, которая может взаимодействовать с одним или более белками, или молекулами нуклеиновой кислоты для осуществления или участия в структурной, каталитической или регуляторной функции, которая влияет на экспрессию или активность гена, или продукта гена, отличного от гена, который продуцирует функциональную РНК. Функциональной РНК может быть, например, транспортной РНК (тРНК), рибосомальной РНК (рРНК), антисмысловой РНК (асРНК), микроРНК (микро РНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), малой интерферирующей РНК (миРНК), гидовой РНК (гРНК), crisp РНК (сгРНК), или трансактивирующей РНК (tracrPHK) системы CRISPR, малые ядрышковые РНК (мякРНК), РНК, взаимодействующие с PIWI, (пиРНК) или рибозимом.

Термин ген широко используется для обозначения любого сегмента молекулы нуклеиновой кислоты (обычно ДНК, но необязательно РНК), кодирующего полипептид или экспрессируемую РНК. Таким образом, гены содержат последовательности, кодирующие экспрессируемую РНК (которая может содержать полипептидные кодирующие последовательности или, например, функциональные РНК, такие как рибосомные РНК, тРНК, антисмысловые РНК, микроРНК, короткие шпилечные РНК, гРНК, сгРНК, tracrPHK, рибозимы и т.д.). Гены могут дополнительно содержать регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии или влияющие на их экспрессию, а также последовательности, связанные с белковой или РНК-кодирующей последовательностью в ее естественном состоянии, таком как, например, интронные последовательности, 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности и т.д. В некоторых примерах ген может относиться только к кодирующей белок части молекулы ДНК или РНК, которая может содержать или не содержать интроны. Ген предпочтительно составляет более 50 нуклеотидов в длину, более предпочтительно более 100 нуклеотидов и может быть, например, от 50 нуклеотидов до 500000 нуклеотидов в длину, например от 100 нуклеотидов до 100000 нуклеотидов в длину или от около 200 нуклеотидов до около 50 000 нуклеотидов в длину, или от около 200 нуклеотидов до около 20 000 нуклеотидов в длину. Гены могут быть получены из различных источников, включая клонирование из источника, представляющего интерес, или путем синтеза из известной или предсказанной информации о последовательности.

Термин нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты относится к сегменту ДНК или РНК (например, мРНК), а также включает нуклеиновые кислоты, имеющие сконструированные остовы (например, пептидные нуклеиновые кислоты, закрытые нуклеиновые кислоты) или сконструированные или неестественные нуклеотидные основания. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными; одноцепочечная нуклеиновая кислота, которая содержит ген или его часть, может быть кодирующей (смысловой) цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью.

Термины кодирующая последовательность или кодирующая область, используемые в настоящем документе, относятся к областям последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут быть транскрибированы для получения функциональной РНК или транскрипта РНК, которые могут быть переведены в полипептид, когда они находятся под контролем соответствующих последовательностей контроля экспрессии и в присутствии соответствующих клеточных механизмов или ферментов. Термин некодирующая последовательность или некодирующая область относится к областям последовательности нуклеиновой кислоты, которые не транскрибируются и не транслируются в аминокислоты (например, интроны, нетранслируемые области и т.д.) или не транскрибируются или не образуют по меньшей мере часть зрелой функциональной последовательности РНК.

Используемый в настоящем документе термин белок или полипептид предназначен для охвата отдельного полипептида, а также множественных полипептидов и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известные как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к определенной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид может использоваться вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов.

Молекула нуклеиновой кислоты может быть получена из указанного источника, что включает выделение (полностью или частично) сегмента нуклеиновой кислоты из указанного источника. Молекула нуклеиновой кислоты также может быть получена из указанного источника путем, например, прямого клонирования, ПЦР-амплификации или искусственного синтеза из указанного полинуклеотидного источника или на основе последовательности, связанной с указанным полинуклеотидным источником. Гены или молекулы нуклеиновой кислоты, полученные из конкретного источника или вида, также включают гены или молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие модификации последовательности относительно исходных молекул нуклеиновой кислоты. Например, ген или молекула нуклеиновой кислоты, полученные из источника (например, конкретный упоминаемый ген), могут включать одну или более мутаций относительно исходного гена или молекулы нуклеиновой кислоты, которые непреднамеренно

- 10 038595 или намеренно введены, и если одна или более мутаций, включая замены, делеции или вставки, преднамеренно введены, изменения последовательности могут быть введены случайной или целевой мутацией клеток или нуклеиновых кислот, путем амплификации или другими методами молекулярной биологии или путем химического синтеза или любой их комбинации. Ген или молекула нуклеиновой кислоты, которая получена из упомянутого гена или молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует функциональную РНК или полипептид, может кодировать функциональную РНК или полипептид, имеющий по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности с эталонной или исходной функциональной РНК или полипептидом или с его функциональным фрагментом. Например, ген или молекула нуклеиновой кислоты, которая получена из упомянутого гена или молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует функциональную РНК или полипептид, может кодировать функциональную РНК или полипептид, имеющий по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с эталонной или исходной функциональной РНК или полипептидом или с его функциональным фрагментом.

Используемую в настоящем документе выделенную нуклеиновую кислоту или белок удаляют из его естественной среды или окружения, в котором нуклеиновая кислота или белок существуют в природе. Например, выделенный белок или молекулу нуклеиновой кислоты удаляют из клетки или организма, с которым они связаны в своей естественной или природной среде. Выделенная нуклеиновая кислота или белок может быть в некоторых случаях частично или практически очищена, но для выделения не требуется определенный уровень очистки. Так, например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, которая была вырезана из хромосомы, генома или эписомы, которая была встроена в природе.

Очищенная молекула нуклеиновой кислоты или нуклеотидная последовательность, или белковая или полипептидная последовательность, по существу, свободна от клеточного материала и клеточных компонентов. Например, очищенная молекула нуклеиновой кислоты или белка может быть свободна от химических веществ, если не считать буфер или растворитель. Существенно свободный не означает, что другие компоненты за пределами новых молекул нуклеиновой кислоты не поддаются определению.

Термины естественного происхождения и дикого типа относятся к форме, встречаемой в природе. Например, молекула нуклеиновой кислоты естественного происхождения или дикого типа, нуклеотидная последовательность или белок могут присутствовать и могут быть выделены из природного источника и ненамеренно модифицироваться при помощи человеческих манипуляций.

Термин экспрессия, используемый в настоящем документе, включает экспрессию гена, по меньшей мере, на уровне продуцирования РНК, а продукт экспрессии включает полученный продукт, например полипептид или функциональную РНК (например, рибосомальную РНК, тРНК, антисмысловую РНК, микроРНК, кшРНК, рибозим и т.д.) экспрессируемого гена. Термин повышенная экспрессия включает изменение в экспрессии генов посредством повышения продукции мРНК и/или увеличения экспрессии полипептида. Повышенное продуцирование, когда речь идет о количестве белка или количестве активного белка в результате экспрессии генов, скорости текучести белка, состояниях активации белка и т.п., включает увеличение количества полипептидной экспрессии на уровне ферментативной активности полипептида или их комбинации по сравнению с естественным продуцированием или ферментативной активностью полипептида.

Молекула экзогенной нуклеиновой кислоты или экзогенный ген относится к молекуле нуклеиновой кислоты или гену, который был введен (трансформирован) в клетку или вирус. Трансформированным организмом можно назвать рекомбинантную клетку или вирус, в который можно ввести дополнительный экзогенный ген(ы). Потомство клетки или вируса, трансформированного молекулой нуклеиновой кислоты, также упоминается как трансформированное или рекомбинантное, если оно унаследовало молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты. Экзогенный ген может быть от другого вида (и, следовательно, гетерологичного) или от одного и того же вида (и, следовательно, гомологичного) по отношению к трансформируемому организму. Эндогенная молекула нуклеиновой кислоты, ген или белок представляет собой нативную молекулу нуклеиновой кислоты, ген или белок, когда она встречается в организме или естественным образом продуцируется организмом.

Кроме того, термин экзогенный, используемый в настоящем документе, в контексте гена или белка, относится к генам или белкам, которые не получают из видов организма-хозяина.

Термин трансген, используемый в настоящем документе, относится к экзогенному гену, т.е. к гену, введенному в микроорганизм или предшественник путем вмешательства человека.

Используемый в настоящем документе термин ортолог гена или белка относится к его функциональному эквиваленту у другого вида.

Номера доступа генов и белков, обычно представленные в настоящем документе в скобках после имени гена или вида, являются уникальными идентификаторами для записи последовательности, общедоступной на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov), поддерживаемого Национальным институтом здравоохранения Соединенных Штатов. Идентификационный номер последовательности GenInfo Identifier (GI) специфичен для нуклеотидной

- 11 038595 или аминокислотной последовательности. Если последовательность изменяется каким-либо образом, назначается новый номер GI. Инструмент История изменений последовательности доступен для отслеживания различных номеров GI, номеров версий и дат обновления для последовательностей, которые отображаются в определенной записи GenBank. Поиск и получение последовательностей нуклеиновых кислот или генов, или последовательностей белка на основе номеров доступа и номеров GI хорошо известны в данной области техники, например, в клеточной биологии, биохимии, молекулярной биологии и молекулярной генетике.

Используемые в настоящем документе термины процент идентичности или гомология в отношении нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей определяются как процент нуклеотидных или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны с известными полипептидами после выравнивания последовательностей для максимального процента идентичности и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента гомологии. N-концевая или С-концевая вставка, или делеция не должны истолковываться как влияющие на гомологию, а внутренние делеции и/или вставки в последовательность полипептида менее чем около 30, менее чем около 20 или менее чем около 10 аминокислотных остатков не должны быть истолкованы как влияющие на гомологию. Гомологию или идентичность на уровне нуклеотидов или аминокислотных последовательностей можно определить с помощью анализа BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) с использованием алгоритма, используемого программами blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, и Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 22642268), которые предназначены для поиска сходства последовательностей. Подход, используемый программой BLAST, заключается в том, чтобы сначала рассмотреть аналогичные сегменты с гэпами и без них между запрашиваемой последовательностью и последовательностью базы данных, затем оценить статистическую значимость всех идентифицируемых совпадений и, наконец, суммировать только те соответствия, которые удовлетворяют предварительно выбранному порогу значимости. Для обсуждения основных проблем поиска сходства баз данных последовательностей см. Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119-129. Параметры поиска для гистограмм, описаний, выравниваний, ожиданий (т.е. порог статистической значимости для сопоставления отчетов по последовательностям базы данных), обрезание, матрица и фильтр (низкая сложность) могут быть в настройках по умолчанию. Матрица выравнивания весов по умолчанию, используемая blastp, blastx, tblastn и tblastx, представляет собой матрицу BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), рекомендованную для запрашиваемых последовательностей длиной более 85 (нуклеотидных оснований или аминокислот).

Для blastn, предназначенного для сравнения нуклеотидных последовательностей, матрица подсчета определяется отношениями М (т.е. оценкой вознаграждения для пары сопоставимых остатков) к N (т.е. оценкой штрафа за несоответствующие остатки), где значения по умолчанию для М и N могут быть +5 и -4 соответственно. Четыре параметра blastn можно настроить следующим образом: Q=10 (штраф за создание гэпа); R=10 (штраф за продолжение гэпа); wink=1 (генерирует попадания слов в каждом просматриваемом в данный момент положении вдоль запроса); и gapw=16 (задает ширину окна, в которой создаются выравнивания гэпов). Эквивалентные параметры параметра Blastp для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть: Q=9; R=2; wink=1; и gapw=32. Сравнение Bestfit между последовательностями, доступными в пакете GCG версии 10.0, может использовать параметры ДНК GAP=50 (штраф за создание гэпа) и LEN=3 (штраф за расширение гэпа), а эквивалентные настройки в сравнении с белками могут быть GAP=8 и LEN=2.

Таким образом, когда речь идет о последовательностях полипептида или нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают идентичности последовательностей по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%), по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 85%), например, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%), по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или около 100% идентичности последовательности с полноразмерным полипептидом или последовательностью нуклеиновой кислоты или их фрагментами, содержащими непрерывную последовательность по меньшей мере в 100, по меньшей мере в 125, по меньшей мере в 150 или более аминокислотных остатков всего белка; варианты таких последовательностей, например, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток был вставлен в N-и/или С-конец и/или в пределах раскрытой последовательности(ей), которые содержат(ит) вставку и замену. Рассмотренные варианты могут дополнительно или поочередно включать те, которые содержат предопределенные мутации, например, путем гомологичной рекомбинации или сайт-направленного или ПЦР-мутагенеза и соответствующих полипептидов или нуклеиновых кислот других видов, включая, но без ограничений, описанные в настоящем документе аллели или другие природные варианты семейства полипептидов или нуклеиновых кислот, которые содержат вставку и замену; и/или производные, в которых полипептид ковалентно модифицирован путем замены, химическим, ферментативным или другим подходящим способом с остатком, отличным от природной аминокислоты, которая содержит вставку и замену (например, детекти

- 12 038595 руемый фрагмент, такой как фермент).

Термин нативный, используемый в настоящем документе, для обозначения последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, поскольку они естественно происходят в организме хозяина, в организме или вирусе. Термин ненативный, используемый в настоящем документе, для обозначения последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, которые не встречаются естественным образом у хозяина, в организме или вирусе. Последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, которая была удалена из клетки или вируса, подвергнута лабораторной манипуляции и введена или повторно введена в клетку-хозяин или вирус, считается ненативной. Синтетические или частично синтетические гены, вводимые в клетку-хозяин или вирус, являются ненативными. Ненативные гены дополнительно включают гены, эндогенные к вирусу, функционально связанному с одной или более гетерологичными регуляторными последовательностями, которые были рекомбинированы в геном хозяина.

Рекомбинантная или сконструированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая была изменена путем манипулирования, осуществленным человеком. В качестве неограничивающих примеров рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты включает любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая: 1) была частично или полностью синтезирована или модифицирована in vitro, например с использованием химических или ферментативных методик (например, с использованием синтеза химической нуклеиновой кислоты или с использованием ферментов для репликации, полимеризации, расщепления (экзонуклеолитического или эндонуклеолитического) лигирования, обратной транскрипции, транскрипции, модификации оснований (включая, например, метилирование), интеграции или рекомбинации (включая гомологичную и сайт-специфическую рекомбинацию) молекул нуклеиновых кислот); 2) включает соединенные нуклеотидные последовательности, которые не соединены в природе; 3) была сконструирована с использованием методик молекулярного клонирования, так что она не имеет одного или более нуклеотидов по отношению к естественной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты; и/или 4) была подвергнута манипулированию с использованием методик молекулярного клонирования, так что она имеет одно или более изменений последовательности или перегруппировок по отношению к естественной последовательности нуклеиновой кислоты. В качестве неограничивающих примеров кДНК представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, как и любая молекула нуклеиновой кислоты, которая была получена полимеразной реакцией(иями) in vitro полимеразы или к которой присоединены линкеры или которые были интегрированы в вектор, такой как вектор клонирования или вектор экспрессии.

Используемый в настоящем документе термин рекомбинантный белок относится к белку, полученному при помощи генной инженерии.

При применении к организмам или вирусам термин рекомбинантный, сконструированный или генетически сконструированный относится к организмам или вирусам, на которых воздействовали путем вставки гетерологичной или экзогенной (например, ненативной) рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты в организм или вирус и включает, без ограничений, нокауты генов, целевые мутации и замену гена, замену, делецию или вставку промотора или перенос молекулы нуклеиновой кислоты, например трансгена, синтетического гена, промотора или другой последовательности в организм или вирус. Рекомбинантные или генетически сконструированные организмы или вирусы также могут быть организмами или вирусами, в которые были введены конструкции для нокдауна гена. Такие конструкции включают, но без ограничений, одну или более гидовых РНК, РНКи, микроРНК, кшРНК, миРНК, антисмысловых и рибозимных конструкций. Также включены организмы или вирусы, чьи геномы были изменены действием нуклеаз Cas, мегануклеаз или цинковопальцевых нуклеаз. Молекула экзогенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в рекомбинантный/генетически сконструированный вирус или геном организма, или в других случаях не интегрирована в рекомбинантный/генетически сконструированный вирус или геном организма. Используемый в настоящем документе термин рекомбинантный вирус или рекомбинантная клетка-хозяин включает потомство или производные рекомбинантного вируса согласно настоящему раскрытию. Поскольку определенные изменения могут произойти в последующих поколениях из-за мутации или воздействия, или влияния окружающей среды, такое потомство или производные могут фактически не совпадать с родительской клеткой, но все еще включены в объем термина, как он используется в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин этап конструирования относится к выполнению любого способа инженерии, раскрытого в настоящем документе или известного в данной области техники. Например, и этап конструирования может представлять собой один раунд интересующего инженерного способа, такого как, например, один раунд описанного в настоящем изобретении способа конструирования in vitro, один ПЦР-опосредованный мутагенез или одна реакция лигирования, объединяющая две части ДНК вместе. Аналогичным образом, неоднократное повторение этапов конструирования означает выполнение способа конструирования два или более последовательных раз.

Термин гетерологичный при использовании в отношении полинуклеотида, гена, нуклеиновой кислоты, полипептида или фермента относится к полинуклеотиду, гену, нуклеиновой кислоте, полипептиду или ферменту, который не является производным от вида хозяина. Например, гетерологичный ген или

- 13 038595 гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, как используется в настоящем документе, относится к последовательности гена или нуклеиновой кислоты от разных видов, чем к видам организмахозяина или вируса, в который он введен. Когда речь идет о регуляторной последовательности гена или к вспомогательной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой для регуляции экспрессии генной последовательности (например, 5'-нетранслируемая область, 3'-нетранслируемая область, последовательность добавления поли-А, последовательность интрона, сайт сплайсинга, сайт связывания рибосом, внутренняя входная последовательность рибосом, область гомологии генома, сайт рекомбинации и т.д.) или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей домен белка или последовательность локализации белка или белка, гетерологичная означает, что регуляторная или вспомогательная последовательность или последовательность, кодирующая белковый домен или последовательность локализации, из другого источника, чем ген, с которым регуляторная или вспомогательная последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белковый домен или последовательность локализации, сопоставляются в геноме, хромосоме или эписоме. Таким образом, промотор, функционально связанный с геном, к которому он не функционально связан в своем естественном состоянии (например, в геноме генетически несконструированного организма или вируса), в настоящем документе упоминается как гетерологичный промотор, даже хотя промотор может быть получен из одного и того же вида (или, в некоторых случаях, одного и того же организма или вируса) в качестве гена, с которым он связан. Аналогично, когда речь идет о последовательности локализации белка или белкового домена сконструированного белка, гетерологичный означает, что последовательность локализации или белковый домен получают из белка, отличного от белка, в который он включен при помощи методов генной инженерии.

Регуляторная последовательность, регуляторный элемент или последовательность регуляторных элементов относится к нуклеотидной последовательности, расположенной выше (5'), в пределах или ниже (3') кодирующей последовательности. Транскрипция кодирующей последовательности и/или трансляция молекулы РНК в результате транскрипции кодирующей последовательности обычно зависит от наличия или отсутствия регуляторной последовательности. Данные последовательности регуляторных элементов могут содержать промоторы, цис-элементы, энхансеры, терминаторы или интроны. Регуляторные элементы могут быть выделены или идентифицированы из нетраслируемых областей (НТО) из конкретной полинуклеотидной последовательности. Любой из описанных в настоящем документе регуляторных элементов может присутствовать в химерном или гибридном регуляторном экспрессирующем элементе. Любой из описанных в настоящем документе регуляторных элементов может присутствовать в рекомбинантной конструкции согласно настоящему изобретению.

Термины промотор, область промотора или последовательность промотора относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, способной связывать РНК-полимеразу с инициацией транскрипции гена в направлении от 5' к 3' (в прямом направлении). Ген находится под контролем или регулируется промотором, в том случае, когда связывание РНК-полимеразы с промотором является непосредственной причиной транскрипции указанного гена. Промотор или промоторная область обычно обеспечивает сайт распознавания для РНК-полимеразы и другие факторы, необходимые для правильной инициации транскрипции. Промотор может быть выделен из 5'-нетранслируемой области (5' НТО) геномной копии гена. Альтернативно, промотор может быть синтетически получен или сконструирован путем изменения известных элементов ДНК. Также рассмотрены химерные промоторы, которые объединяют последовательности одного промотора с последовательностями другого промотора. Промоторы могут быть определены по их профилю экспрессии гена, основанной, например, на метаболических, экологических или связанных с развитием условиях. Промотор может быть использован как регуляторный элемент для модуляции экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы, например, кодирующей последовательности. Промоторы могут содержать, помимо последовательностей, распознаваемых РНК-полимеразой и, предпочтительно, другие факторы транскрипции, элементы регуляторной последовательности, такие как цис-элементы или энхансерные домены, которые влияют на транскрипцию функционально связанных генов. Вирусный промотор является нативным или ненативным промотором, который инициирует транскрипцию одного или более генов, расположенных в вирусном геноме.

Используемый в настоящем документе термин конститутивный промотор относится к промотору, который активен в большинстве условий окружающей среды и развития. Конститутивный промотор активен независимо от окружающей среды, такой как освещение и композиция культуральной питательной среды. В некоторых примерах конститутивный промотор активен в присутствии и в отсутствие питательного вещества. Например, конститутивный промотор может быть промотором, который является активным (опосредует транскрипцию гена, с которым он функционально связан), в условиях истощения азота, а также в условиях, когда азот не ограничен (условия насыщения азотом). Напротив, индуцируемый промотор является промотором, который активен в ответ на конкретные условия окружающей среды, такие как наличие или отсутствие питательного вещества или регулятора, наличие света и т.д.

Используемый в настоящем документе термин функционально связанный обозначает конфигурацию, в которой контрольная последовательность помещается в соответствующее положение относитель

- 14 038595 но кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, так что контрольная последовательность направляет или регулирует экспрессию кодирующей последовательности полипептида и/или функциональной РНК). Таким образом, промотор находится в функциональной связи с последовательностью нуклеиновой кислоты, если он может опосредовать транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты. При введении в клетку-хозяина кассета экспрессии может приводить к транскрипции и/или трансляции закодированной РНК или полипептида в соответствующих условиях. Антисмысловые или смысловые конструкты, которые не транслируются или не могут быть транслированы, не исключены данным определением. В случае как экспрессии трансгенов, так и подавления эндогенных генов (например, антисмысловыми или РНКи) любой специалист определит, что вставленная полинуклеотидная последовательность не обязательно должна быть идентичной, но может быть только по существу идентичной последовательности гена, из которого она была получена. Как поясняется в настоящем документе, эти по существу идентичные варианты конкретно покрыты ссылкой на конкретную последовательность нуклеиновой кислоты.

Термин селективный маркер или селективный маркерный ген, используемый в настоящем документе, включает любой ген, который придает фенотип клетке, в которой он экспрессируется, для облегчения отбора клеток, которые трансфецированы или трансформированы конструкцией нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Данный термин также может быть использован для обозначения генных продуктов, которые осуществляют указанные фенотипы. Неограничивающие примеры выбираемых маркеров включают: 1) гены, придающие устойчивость к антибиотикам, таким как амикацин (aphA6), ампициллин (ampR), бластицидин (bis, bsr, bsd), блеомицин или флеомицин (ZEOCIN™) (ble), хлорамфеникол (cat), эметин (RBS14p или cry 1-1), эритромицин (ermE), G418 (GENETICIN™) (neo), гентамицин (аас3 или аасС4), гигромицин В (aphIV, hph, hpt), канамицин (nptll), метотрексат (DHFR mtxR), пенициллин и другие β-лактамы (β-лактамазы), стрептомицин или спектиномицин (aadA, spec/strep) и тетрациклин (tetA, tetM, tetQ); 2) гены, придающие толерантность к гербицидам, таким как аминотриазол, амитрол, анримид, арилоксифеноксипропионаты, атразины, бипиридиуты, бромоксинил, циклогександиеноксима далапон, дикамба, дикфоп, дихлорфенилдиметилмочевина (ДКМ), дифунон, дикетонитрилы, диурон, флуридон, глюфозинат, глифосат, галогенированные гидробензонитрилы, галоксифоп, 4-гидроксипиридины, имидазолиноны, изоксасфлутол, изоксазолы, изоксазолидиноны, мирамид В, п-нитродифениловые эфиры, норфлуразон, оксадиазолы, м-феноксибензамиды, N-фениламиды, пиноксадин, ингибиторы протопорфириогеноксидазы, пиридазиноны, пиразолинаты, сульфонилмочевины, 1,2,4-триазолпиримидин, трикетоны или мочевина; ацетил-KoA-карбоксилаза (АККаза); синтаза ацетогидроксикислоты (ahas); ацетолактатсинтаза (a/s, csrl-1, csrl-2, imr1, imr2), аминогликозид-фосфотрансфераза (apt), антранилатсинтаза, бромоксинилнитрилаза (bxn), цитохром Р450-НАДФ-цитохром Р450-оксидоредуктаза, далапон-дегалогеназа (dehal), дигидроптероат-синтаза (sul), 5-енолпирувалшикимат-3-фосфатсинтаза класса I (EPSPS), класс II EPSPS (aroA), не I/II классов EPSPS, глутатионредуктаза, глифосат-ацетилтрансфераза (gat), глифосат-оксидоредуктаза (gox) гидроксифенилпируватдегидрогеназа, гидроксифенилпируватдиоксигеназа (hppd), изопренилпирофосфат-изомераза, ликопенциклаза, фосфинотрицин-ацетилтрансфераза (pat, bar), фитоэндезатураза (crtl), пренилтрансфераза, протопорфириноксидаза, полипептид psbA фотосистемы II (psbA) и эстераза SMM (SulE) супероксиддисмутаза (sod); 3) гены, которые могут быть использованы в ауксотрофных штаммах или для придания других метаболических эффектов, таких как arq7, his3, hisD, hisG, lysA, manA, metE, nit1, trpB, ura3, xylA, ген дигидрофолатредуктазы, манноза-6фосфат-изомеразы, ген нитратредуктазы или ген орнитиндекарбоксилазы; фактор негативного отбора, такой как тимидинкиназа; или факторы устойчивости к токсину, такие как ген устойчивости к дезоксиглюкозе.

Репортерный ген представляет собой ген, кодирующий белок, который обнаруживается или обладает активностью, которая продуцирует детектируемый продукт. Репортерный ген может кодировать визуальный маркер или фермент, который продуцирует детектируемый сигнал, такой как cat, lacZ, uidA, xylE, ген щелочной фосфатазы, ген α-амилазы, ген α-галактозидазы, ген β-глюкуронидазы, ген βлактамазы, гена пероксидазы хрена, ген люциферина/люциферазы, ген R-локуса, гена тирозиназы или ген, кодирующий флуоресцентный белок, включая, но без ограничений, синий, голубой, зеленый, красный, паприка или желтый флуоресцентный белок, фотоотверждаемый, фотографируемый или оптический флуоресцентный белок с подсветкой или любым из его вариантов, включая, без ограничений, оптимизированный по кодону, с быстрым сворачиванием, мономерный, с повышенной стабильностью и варианты с усиленной флуоресценцией.

Термин РНК-направляемая нуклеаза или РНК-направляемая эндонуклеаза, используемый в настоящем документе, относится к ферменту, расщепляющему нуклеиновую кислоту, который нацелен на целевой сайт расщепления при помощи одной или более гидовых РНК. Неограничивающие примеры РНК-направляемых нуклеаз включают Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 и С2с3.

Термин терминатор или терминаторная последовательность или терминатор транскрипции, используемый в настоящем документе, относится к регуляторной части генетической последовательности, которая вызывает прекращение транскрипции РНК-полимеразой.

- 15 038595

Термины введение в клетку-хозяин и трансформация, используемые в настоящем документе, относятся к введению одной или более экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот или полинуклеотидов в клетку-хозяин или организм с использованием одного или более физических, химических или биологических методов. Физические и химические методы трансформации (т.е. трансфекция) включают в качестве неограничивающего примера электропорацию, бомбардировку частицами, химически-индуцированную компетентность и доставку липосом. Биологические методы трансформации (т.е. трансдукция) включают передачу ДНК с использованием вирусов или микроорганизмов (например, Agrobacterium).

Используемый в настоящем документе термин конструирование генома относится к определению желаемой последовательности нуклеиновой кислоты конечного генома, представляющего интерес. Конструирование может быть основано на базовых знаниях, литературных источниках, экспериментальных данных или любой их комбинации.

Используемый в настоящем документе термин рекомбинантный или сконструированный, когда речь идет о молекуле нуклеиновой кислоты, белке, вирусной частице или их комбинации, означает не имеющую природное происхождение молекулу нуклеиновой кислоты, белок, вирусную частицу или их комбинацию, полученную посредством манипуляции, осуществляемой человеком. В качестве неограничивающих примеров рекомбинантная или сконструированная молекула нуклеиновой кислоты включает любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая: 1) была частично или полностью синтезирована или модифицирована in vitro, например, с использованием химических или ферментативных методик (например, с использованием синтеза химической нуклеиновой кислоты или с использованием ферментов для репликации, полимеризации, расщепления (экзонуклеолитического или эндонуклеолитического) лигирования, обратной транскрипции, транскрипции, модификации оснований (включая, например, метилирование), интеграции или рекомбинации (включая гомологичную и сайт-специфическую рекомбинацию) молекул нуклеиновых кислот); 2) включает соединенные нуклеотидные последовательности, которые не соединены в природе, 3) была сконструирована с использованием методик молекулярного клонирования, так что она не имеет одного или более нуклеотидов по отношению к естественной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты; и/или 4) была подвергнута воздействию с использованием методик молекулярного клонирования, так что она имеет одно или более изменений последовательности или перегруппировок по отношению к естественной последовательности нуклеиновой кислоты. В качестве неограничивающих примеров кДНК представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, как и любая молекула нуклеиновой кислоты, которая была получена при помощи полимеразной реакции(ий) in vitro или к которой присоединены линкеры или которые были интегрированы в вектор, такой как вектор клонирования или вектор экспрессии. Рекомбинантная или сконструированная РНК или белок представляет собой рекомбинантную или сконструированную РНК или белок, которая транскрибируется или транслируется соответственно из рекомбинантной или сконструированной молекулы нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная или сконструированная вирусная частица или вирус получают из сконструированной вирусной последовательности или вирусного генома.

Термин вирусный геном относится к полному генетическому комплементу, содержащемуся в одной или более молекулах ДНК или РНК в вирусной частице, включая гены и некодирующие последовательности. Термин сконструированный вирусный геном относится к не встречающему в природе вирусному геному, который является результатом манипуляции, осуществляемой человеком, и способен продуцировать вирусные частицы, не встречающиеся в природе, после введения в совместимую клеткухозяина.

Термин вирусная нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, полученную из вирусного генома. Вирусная нуклеиновая кислота может содержать целый вирусный геном или часть вирусного генома. Вирусные нуклеиновые кислоты могут кодировать аминокислотные последовательности, содержащие вирусные белки. В некоторых случаях нативные, зрелые белки или полипептидные последовательности, кодируемые данной открытой рамкой считывания, не могут быть определены или охарактеризованы. Аминокислотные последовательности, представленные в настоящем документе, которые кодируются последовательностями вирусной нуклеиновой кислоты, которые могут содержать сайт, подходящий для мутации (такой как изменение, делеция или замена) или вставку гетерологичных последовательностей, могут быть раскрыты в настоящем документе как кодирующие аминокислотные последовательности, которые могут содержать весь или часть вирусного полипептида или белка.

Термины вирусная частица и вирион относятся к независимой форме, в которой существует вирус, когда он не находится внутри инфицированной клетки или в процессе заражения клетки. Данные вирусные частицы (вирионы) состоят или из генома ДНК, или из РНК, окруженного белковой оболочкой, называемой капсидой. Некоторые вирионы также имеют дополнительную липидную оболочку, как внутри, так и снаружи оболочки капсидного белка. Термины вирусная частица, вирион и вирус могут использоваться взаимозаменяемо.

Используемый в настоящем документе термин вирусное свойство относится к любому аспекту репликации вируса или жизненного цикла или к аспекту, который возникает в результате репликации

- 16 038595 вируса или жизненного цикла. Используемый в настоящем документе термин вирусное свойство часто относится к свойствам, которые могут быть изменены или сконструированы посредством вмешательства человека для достижения желаемого результата. Неограничивающие примеры вирусных свойств включают специфичность к кругу хозяев, вирусный литический цикл, адсорбцию, прикрепление, инъекцию, репликацию и сборку, лизис, величину выхода фага, ускользание от иммунологического надзора, иммунную стимуляцию, иммунную дезактивацию, дисперсию биопленки, устойчивость к бактериальному фагу, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина. В некоторых аспектах улучшенное свойство или улучшенные свойства и улучшенное вирусное свойство или улучшенные вирусные свойства используются взаимозаменяемо.

Термины бактериофаг и фаг могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к вирусу, который заражает бактерии.

Системы CRISPR.

CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) представляют собой локусы ДНК, содержащие короткие повторы последовательностей оснований. За каждым повтором следуют короткие сегменты спейсерной ДНК от предыдущих воздействий на мобильные генетические элементы. CRISPR обнаруживают в около 40% секвенированных геномов бактерий и 90% секвенированных архей. CRISPR часто ассоциируются с CRISPR-ассоциированными (cas) генами, которые кодируют белки, связанные с функцией CRISPR. Система CRISPR-Cas представляет собой прокариотическую иммунную систему, которая обеспечивает устойчивость к чужеродным генетическим элементам, таким как плазмиды и фаги, и обеспечивает форму приобретенного иммунитета. CRISPR-спейсеры кодируют малые стРНК последовательность которых специфически ориентирует эндонуклеазы Cas на целевые последовательности и разрезает эти экзогенные генетические элементы способом, аналогичным РНКи в эукариотических организмах.

Системы типа II CRISPR-Cas использовали для редактирования генов и регуляции генов у многих видов. Эти системы особенно полезны, потому что они требуют только одну эндонуклеазу Cas (Cas9) и нацеливающую сгРНК. В природных системах эндонуклеаза Cas9 требует две независимо транскрибируемые РНК для активности, однако эти две РНК также могут быть ковалентно связаны с образованием одной химерной гРНК. Обеспечивают белком Cas9 и соответствующими гРНК клетку, геном организма можно разрезать в любом необходимом месте. Системы CRISPR-Cas представляют собой РНКнаправляемую систему защиты, которая защищает от вирусов, плазмид и других мобильных генетических элементов. Данный защитный путь имеет три этапа. Во-первых, копия встраивающейся нуклеиновой кислоты интегрируется в массив CRISPR. Затем массив CRISPR транскрибируется в большой транскрипт CRISPR и затем процессируется в зрелые сгРНК. Затем сгРНК вводят в эффекторные комплексы, причем сгРНК направляет комплекс к встраивающейся нуклеиновой кислоте, а белки Cas деградируют данную нуклеиновую кислоту. Как указано выше, для нативной системы CRISPR-Cas II типа требуется как транс-активирующая сгРНК (tracrPHK), так и пре-crPHK для активации Cas9. TracrPHK является комплементарной к и комплементарной парами оснований с пре-crPHK, образующей дуплекс РНК. Он расщепляется РНКазой III, РНК-специфической рибонуклеазой, с образованием гибрида crPHK/tracrPHK. Этот гибрид выступает в качестве направляющего для эндонуклеазы Cas9, которая расщепляет встраивающуюся нуклеиновую кислоту, образующую двухцепочечный разрыв в встраивающейся ДНК для защиты клетки-хозяина. Cas9-опосредовαнное расщепление строго зависит от наличия мотива, смежного с протоспейсером, (РАМ) в целевой нуклеиновой кислоте. Возможность программировать Cas9 для расщепления определенных сайтах, определяемых гидовыми РНК, привела к принятию его в качестве универсальной платформы для конструирования генома и генной регуляции. Данный способ конструирования генома описан в публикации заявки на патент США № 2014/0068797, опубликованной 6 марта 2014 года, 2014/0170753, опубликованной 19 июня 2014 года и 2014/0273037 и 2014/0273226, обе из которых опубликованы 18 сентября 2014 года, все из которых включены в качестве ссылки.

Были описаны другие программируемые системы CRISPR-Cas, которые могут быть использованы для геномной инженерии, включая системы Cpf1, C2c1, С2с2 и С2сЗ. Система Cpf1 представляет собой систему CRISPR V типа и опосредует расщепление ДНК с липкими концами с помощью одной РНК, ориентированной на нацеливание (Zetsche et al., Cell (2015) 163, 1-13) (включен посредством ссылки). C2c1 и С2сЗ являются одновременно системами CRISPR V типа, тогда как С2с2 предлагается быть системой CRISPR VI типа (Shmakov et al., Molecular Cell (2015) 60, 1-13) (включен в качестве ссылки).

Сборка ДНК.

Существуют различные методы, известные в данной области техники для сборки ДНК во время генной инженерии. Двухстадийный метод на основе термоциклов использовали для сборки частей гена М.genitαlium, как описано в Gibson D.G. et al., Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome. Science (2008) 319: 1215-1220 (включена в качестве ссылки) и публикации РСТ WO 2009/103027 (включены в качестве посредством ссылки). Другой подход описан Li M.Z. et al., Nature Meth. (2007) 4: 251-256 (включен посредством ссылки). Одностадийный способ сборки с исполь

- 17 038595 зованием 5' экзонуклеазы Т7 и одноцепочечного ДНК-связывающего белка раскрыт в публикации РСТ WO 2006/021944 (включена посредством ссылки). В настоящее время хорошо известны комбинаторные методики сборки химических соединений для использования при высокопроизводительном скрининге. Кроме того, в течение ряда лет практикуют методики перетасовки генов, в которых кодирующие последовательности случайным образом фрагментируют и повторно отжигают. Например, протоколы для создания библиотек фрагментов химерных генов описаны в Meyer M. и др. Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library of Chimeras Current Protocols in Protein Science (2006) 26.2.126.2.17; McKee A.E. et al., JBEI abstract. Методики сборки различных компонентов в полные или минимальные геномы были установлены. Например, публикация патента США 2000/0264688 (включена посредством ссылки), опубликованная 15 ноября 2007 г., описывает способы конструирования синтетического генома путем создания и сборки кассет, содержащих части генома. Поэтапный иерархический способ сборки нуклеиновых кислот описан в публикации патента США № 2007/004041 (включен посредством ссылки), опубликованной 4 января 2007 года.

Кроме того, метод одного сосуда для сборки ДНК описан в публикации заявки на патент США № 2010/0035768 и 2012/0053087, опубликованы 11 февраля 2010 года и 1 марта 2012 года соответственно, обе из которых включены посредством ссылки. Данный метод был назван методом сборки Gibson Assembly и позволяет успешно собрать несколько фрагментов ДНК, независимо от длины фрагмента или конечной совместимости. Реакция сборки Gibson Assembly проводится в одном сосуде в изотермических условиях с использованием трех ферментативных активностей: 5'-экзонуклеаза образует длинные липкие концы, полимераза заполняет промежутки отожженных одноцепочечных областей, а ДНК-лигаза лигирует разрывы отжигом и заполнением промежутков. Данный метод был широко принят и является основной рабочей лошадкой проектов в области синтетической биологии во всем мире. Применяя эту методологию, митохондриальный геном мыши размером 16,3 т.п.н. был собран из 600 перекрывающихся 60 мономеров. В комбинации со сборкой in vivo у дрожжей, метод сборки Gibson Assembly использовали для синтеза 1,1 млн пар оснований генома Mycoplasma mycoides. Синтезированный геном трансплантировали в клетку-реципиент М.capricolum, создавая новые самовоспроизводящиеся клетки М.mycoides. 5'экзонуклеазная активность возвращает обратно 5'-концевые последовательности и раскрывает комплементарную последовательность для отжига. Затем полимерная активность заполняет промежутки в отожженных областях. ДНК-лигаза затем заполняет одноцепочечные разрывы и ковалентно связывает фрагменты ДНК вместе. Перекрывающаяся последовательность смежных фрагментов намного длиннее, чем те, которые используются в сборке Golden Gate, и, следовательно, приводит к увеличению процента правильных сборок.

Вирусы.

Вирус представляет собой ультрамикроскопический и метаболически инертный инфекционный агент, который реплицируется только внутри клеток живых хозяев. Вирусы могут заражать все типы жизненных форм, включая животных, растения, грибы, водоросли, бактерии и археи. Хотя они не находятся внутри инфицированной клетки или в процессе заражения клетки, вирусы существуют в виде независимых частиц. Данные вирусные частицы (вирионы) состоят или из генома ДНК, или из РНК, окруженного белковой оболочкой, называемой капсидой. Некоторые вирионы также имеют дополнительную липидную оболочку, как внутри, так и снаружи оболочки капсидного белка.

Существует два цикла вирусной репликации, однако терминология варьирует между прокариотическими и эукариотическими вирусными полями. Скрытые или лизогенные вирусы объединяют вирусный генетический материал в геном клетки-хозяина или образуют эписомальный репликон. Когда клеткахозяин реплицируется, вирусный генетический материал также копируется и продолжает разделяться с геномом хозяина до начала вирусного продуцирования. Начало вирусного продуцирования и гибель клеток являются маркерами литического или вирулентного цикла. Во время литического цикла вирусный геном реплицируется отдельно от гена хозяина и захватывает механизмы репликации и трансляции клеток, чтобы создавать больше вирусов. После накопления достаточного количества вирусов специализированные вирусные белки растворяют клеточную стенку и/или мембрану хозяина. Клетка-хозяин лопается из-за высокого внутреннего осмотического давления, этот процесс называется лизисом. Это высвобождает потомство вирусов в среду, где они могут заражать другие клетки и повторять процесс. Вирулентные вирусы - это те, которые не входят в латентное или лизогенное состояние, но вместо этого реплицируются только путем захвата механизма клеток-хозяев (в отличие от умеренных вирусов, которые входят в латентное состояние).

Исследования вирусной мутации.

Вирусные мутационные исследования, используемые в настоящем документе, относятся к исследованиям быстрой эволюции, адаптации и/или случайному или направленному мутагенезу, и данные термины могут использоваться взаимозаменяемо.

Исследования в области эволюции и/или адаптации включают выбор вирусов по определенным признакам или при определенных условиях. Данные методы особенно полезны для вирусов из-за естественной высокой скорости мутаций, присущей вирусной репликации, что приводит к большому количеству вирусного разнообразия. Например, штаммы можно выращивать в условиях высокой температуры,

- 18 038595 чтобы наблюдать молекулярные изменения, которые способствуют выживанию и размножению в этих условиях. В качестве неограничивающих примеров можно выделить эволюцию или адаптацию эксперимента вируса или бактериофага для выбора вариантов с изменением круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммуннологического надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагу, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляцию факторов вирулентности, или направленного расщепления или редактирования гена хозяина. Неограничивающие примеры экспериментов по эволюции вируса или адаптации включают эксперименты по коинфекции, коэволюции или контрансформации. Коинфекция относится более чем к одному вирусу, заражающему один и тот же хозяин одновременно, что часто приводит к обмену генами между двумя или более вирусами. Коэволюция относится к исследованию, в котором рекомбинация между двумя или более вирусами или бактериофагами происходит в пермиссивном или непермиссивном хозяине, что приводит к сборке нового вируса или бактериофага с различными вирусными свойствами, такими как, например, более широким кругом хозяев. Котрансформация относится к тому, когда два оголенных генома трансформируются вместе в пермиссивном или непермиссивном штамме. Любое из этих исследований эволюции или адаптации может быть выполнено в пермиссивном (восприимчивом) или непермиссивном (резистентном) хозяине. Данные типы экспериментов часто включают передачу вируса несколько раз выбранному хозяину в отсутствии или присутствии одного, или более других выбранных вирусов. Вирусы будут получать мутации, которые приводят к множественным вариантам. На протяжении всего пассирования некоторые варианты будут обогащаться в зависимости от условий пассирования и отбора.

Мутагенез может быть выполнен любым способом, например инсерционным мутагенезом, химическим мутагенезом, γ-облучением или ультрафиолетовым облучением, или ПЦР-опосредуемым мутагенезом. Способы получения мутантов или варианты геномных последовательностей хорошо известны. Например, γ-облучение, УФ-облучение и обработка любым из большого числа возможных химических мутагенов (например, 5-бромдезоксиуридин, этилметан сульфонат (EMS), метилметансульфонат (MMS), диэтилсульфат (DES), нитрозогуанидин (NTG), соединения ICR и т.д.) или лечение соединениями, такими как эндеиновые антибиотики, которые вызывают разломы хромосом (например, блеомицин, адриамицин, неокарзиностатин) представляют собой методы, которые применяют для мутагенеза водорослей, грибов и хитридиомицетов (см., например, патент США 8232090, заявка на патент США 20120088831, заявка на патент США 20100285557, заявка на патент США 20120258498). В данной области техники известно большое количество химических мутагенов, включая, но без ограничений, интеркалирующие агенты, алкилирующие агенты, дезаминирующие агенты, аналоги оснований. Интеркалирующие агенты включают в качестве неограничивающих примеров производные акридина или производные фенантридина, такие как бромид этидия (также известный как 2,7-диамино-10-этил-6-фенилфенантридбромид или 3,8-диамино-5-этил-6-фенилфенантридинийбромид). Неограничивающие примеры алкилирующих агентов включают производные нитрозогуанидина (например, N-метил-N'-нитронитрозогуанидин), этилметансульфонат (EMS), этилэтансульфонат, диэтилсульфат (DES), метилметансульфонат (MMS), азотистую кислоту или HNO2, и азотистый иприт или соединения ICR. Неограничивающие примеры аналогов оснований, которые могут быть использованы в качестве мутагенов, включают соединение 5-бромурацил (также известный как дезоксинуклеозид 5-бромдезоксиуридин), 5-бромдезоксиуридин и 2аминопурин. Методы мутагенеза на основе ПЦР хорошо известны в данной области техники и часто включают условия реакции и/или ДНК-полимеразу, которая увеличивает частоту ошибок в течение ПЦРамплификации.

Мутагенез может дополнительно или альтернативно включать введение экзогенных молекул нуклеиновой кислоты непосредственно в вирусный геном или в клетку-хозяина для последующей рекомбинации в представляющий интерес вирусный геном. Например, экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, введенная в клетку-хозяин, может интегрироваться в вирусный генетический локус путем случайной или целевой интеграции, влияя на экспрессию генов, в которые вставляются чужеродные ДНК-вставки или гены, которые являются проксимальными по отношению к чужеродной ДНК, вставленной в геном (например, патент США 7019122; патент США 8216844). Как правило, введенная молекула нуклеиновой кислоты содержит селектируемый маркерный ген для отбора трансформантов, которые интегрировали конструкт молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты. Молекула экзогенной нуклеиновой кислоты в некоторых вариантах реализации изобретения может включать транспонируемый элемент или его компонент, такой как, например, инвертированные повторы, которые могут быть распознаны транспозазой и/или геном, кодирующим транспозазу, или молекула экзогенной нуклеиновой кислоты может быть основана, по меньшей мере, частично на вирусе, таком как интегрирующий вирус.

Для случайного инсерционного мутагенеза конструкция предпочтительно содержит селектируемый маркер, который может быть использован для выбора трансформантов, имеющих интегрированный конструкт, и необязательно также может служить маркером сегрегации и молекулярной меткой для выделения и идентификации гена, прерванного интегрированным селектируемым маркерным геном. Селективные маркеры не ограничиваются генами устойчивости к антибиотикам, но также включают любой ген,

- 19 038595 который может обеспечить преимущество роста вирусу (оба гена установленной и гипотетической функции). Альтернативно, специфический генетический локус может быть нацелен. Конструкция для разрушения гена может включать, например, селектируемый маркерный ген, фланкированный последовательностями из интересующего генетического локуса, например по меньшей мере часть гена, который кодирует регулятор, и, необязательно, дополнительные геномные последовательности, окружающие ген. Такие фланкирующие последовательности могут содержать, например, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов или по меньшей мере 1 тысяча пар нуклеотидов геномной последовательности.

Сбор вирусных вариантов может быть создан любым из вышеперечисленных способов, другими способами, хорошо известными в данной области техники или любой их комбинацией. Затем набор вариантов можно скринировать для обеспечения необходимого фенотипа. Выделенные вирусы с желаемым фенотипом(ами) могут быть подвергнуты дополнительным этапам исследований мутаций. Выделенные вирусы, демонстрирующие желаемые свойства или фенотипы, могут быть дополнительно или альтернативно секвенированы для идентификации генетической мутации, ответственной за желаемое свойство или фенотип. Эти идентифицированные генетические поражения могут быть подтверждены повторением мутации в чистом эталонном фоне и тестированием желаемого свойства или фенотипа.

Вирусные полезные нагрузки.

Литические ферменты.

Литический фермент включает любой литический фермент бактериальной клеточной стенки, который убивает одну или более бактерий в подходящих условиях и в течение соответствующего периода времени. Примеры литических ферментов включают, без ограничений, различные амидазы клеточной стенки. Литическим ферментом может быть литический фермент бактериофага, который относится к литическому ферменту, экстрагированному или выделенному из бактериофага или синтезированного литического фермента с аналогичной структурой белка, которая поддерживает литическую функциональность фермента.

Литический фермент способен специфически расщеплять связи, которые присутствуют в пептидогликане бактериальных клеток, чтобы разрушить клеточную стенку бактерий. В настоящее время также постулируется, что пептидогликан бактериальной клеточной стенки очень консервативен среди большинства бактерий, и расщепление только нескольких связей может нарушить клеточную стенку бактерий. Примерами литических ферментов, которые расщепляют эти связи, представляют собой мурамидазы, глюкозаминидазы, эндопептидазы или N-ацетил-мурамоил-L-аланиновые амидазы. Fischetti et al. (1974) сообщили, что фермент лизин Cl стрептококкового бактериофага представляет собой амидазу. Garcia et al. (1987, 1990) сообщили, что лизин Cpl из S.pneumoniae из фага Ср-1 представляет собой лизоцим. Caldentey and Bamford (1992) сообщили, что литический фермент из фага φ6 Pseudomonas представляет собой эндопептидазу, разделяющей пептидный мост, образованный меламинопимилиновой кислотой и D-аланином. Т1 и Т6 литические ферменты фага Е.coli представляют собой амидазы, как и литический фермент из фага Listeria (ply) (Loessner et al., 1996). Существуют также другие литические ферменты, известные в данной области техники, которые способны расщеплять клеточную стенку бактерий.

Литический фермент, генетически кодируемый бактериофагом, содержит полипептид, способный убивать бактерию-хозяина, например, путем, по меньшей мере, разрушения клеточной стенки или ингибирования активности клеточной стенки против бактерий-хозяев. Полипептид может иметь последовательность, которая охватывает нативные литические ферменты и их варианты. Полипептид может быть выделен из множества источников, например из бактериофага (фага), или получен путем рекомбинантных или синтетических методов. Полипептид может, например, содержать холинсвязывающую часть на карбоксильной концевой стороне и может быть охарактеризован ферментативной активностью, способной расщеплять пептидогликан клеточной стенки (такой как активность амидазы действовать на амидные связи в пептидогликане) на аминоконцевой стороне. Были описаны литические ферменты, которые включают множественные активности ферментов, например два ферментативных домена, такие как лизин PlyGBS. Кроме того, описаны другие литические ферменты, содержащие только каталитический домен и домен, не связывающий клеточную стенку.

Полипептиды для подавления кворума.

Автоиндукторы представляют собой небольшие химические сигнальные молекулы, продуцируемые и используемые бактериями, участвующими в определении кворума. Чувство кворума позволяет бактериям ощущать друг друга посредством наличия аутоиндукторов и регулировать самые разнообразные поведения на уровне группы. Такое поведение включает симбиоз, вирулентность, подвижность, продуцирование антибиотиков и образование биопленки. Автоиндукторы входят в различные химические формы в зависимости от вида, но во многих случаях эффект, который у них есть, во многом аналогичен, что позволяет генетически сконструированным бактериофагам воздействовать на самые разнообразные бактерии, использующие подобные автоиндукторы. В целом, грамотрицательные бактерии используют AHL в качестве аутоиндукторов, а грамположительные бактерии используют процессированные олигопептиды для коммуникации, в то время как автоиндуктор 2 (AI-2) является универсальным для грамотрицательных и грамположительных бактерий.

- 20 038595

AHL, продуцируемые различными видами грамотрицательных бактерий, различаются по длине и составу ацильной боковой цепи, которая часто содержит от 4 до 20 атомов углерода. AHL способны диффундировать в и из клеток как с помощью пассивного транспорта, так и с помощью активных механизмов транспорта. Рецепторы для определения AHL включают ряд регуляторов транскрипции, таких как LuxR, которые функционируют как ДНК-связывающие факторы транскрипции, которые могут активировать разнообразную экспрессию генов, регулирующую поведение популяции бактерий.

Автоиндукторы могут быть ингибированы полипептидами, подавляющими кворум. Полипептиды для подавления кворума могут модифицировать или деградировать автоиндукторы, чтобы сделать их менее активными или неактивными. Определенные полипептиды для подавления кворума представляют собой ферменты, которые инактивируют автоиндуктор (например, путем модификации или деградации), такой как описанный в настоящем документе белок лактоназы AiiA, который расщепляет лактонные кольца из ацильных фрагментов AHL с широкой субстратной специфичностью для инактивации AHL из различных бактерий (Wang et al. (2004) J. Biol. Chem. 279 (14): 136.45-51).

Предлагаемый в настоящем документе способ конструирования in vitro может быть использован для получения синтетического бактериофага, сконструированного для кодирования, например, полипептида, подавляющего кворум, полученного из Pseudomonas aeruginosa. Полипептиды, подавляющие кворум, могут быть экспрессированы в виде свободных белков, которые высвобождаются в область, окружающую фаг и/или бактерии, например при фаговой инфекции и лизиса бактерий-хозяев. Не исключено также, что полипептиды, подавляющие кворум, также могут быть экспрессированы и активно секретированы из клетки бактериального хозяина с использованием способов, известных в данной области техники. Аналогичным образом, полипептиды, подавляющие кворум, могут быть трансляционно слиты с белком бактериофага, например капсидным, хвостовым или шейным белком.

Хвостовые волокна.

Раскрытие изобретения предусматривает в некоторых вариантах реализации изменение круга хозяев бактериофага при помощи сконструированного рекомбинантного бактериофага. В некоторых вариантах реализации изобретения изменение круга хозяев вируса включает конструирование вируса с гетерологичными, нативными, ненативными хвостовыми волокнами и любой их комбинацией. Специфичность клеток-хозяев бактериофага может зависеть от хвостовых волокон(а) вирусной частицы. Путем изменения (например, замены и/или мутации) хвостовых волокон или частей хвостовых волокон бактериофагахозяина круг хозяев может быть изменен (например, расширен).

Хвостовые волоконные белки обычно содержат детерминанты антигенности и детерминанты круга хозяев. Гетерологичное хвостовое волокно может быть закодировано набором геномных фрагментов, выделенных или синтезированных на основе генома одного типа бактериофага. Набор фрагментов гена хвостового волокна может содержать подмножества геномных фрагментов, выделенных или полученных на основе геномов нескольких бактериофагов. Например, консервативные области хвостового волокна могут быть закодированы геномными фрагментами, выделенными из генома шасси бактериофага, в то время как области детерминант круга хозяев могут быть закодированы геномными фрагментами, выделенными из генома другого типа бактериофага.

Антимикробные пептиды.

Раскрытие изобретения рассматривает в качестве неограничивающего примера бактериофаг, сконструированный для экспрессии антимикробного пептида, который необязательно секретируется клеткойхозяином. Например, сконструированные бактериофаги могут экспрессировать антимикробный агент, такой как антимикробный пептид (AMP) или антимикробный полипептид, включая, но без ограничений, естественные пептиды для предотвращения развития и/или распространения устойчивости бактерий-хозяев к бактериофагу и для обеспечения более быстрого и эффективного уничтожения бактерий при бактериальных инфекциях, таких как бактериальные инфекции, включающие более одного вида бактерий.

Бактериофаги обеспечивают аттрактивный противомикробный агент для устранения бактериальных инфекций из-за их усиления и механизма хозяина-хищника, например, путем распространения в бактериях-хозяевах, а затем уничтожения бактерий в форме лизиса, что приводит к высвобождению размноженных бактериофагов, которые впоследствии заражают и убивают окружающие бактерии тем же механизмом. Практическое использование бактериофага в устранении бактериальных инфекций обусловлено значительными ограничениями, такими как (i) очень узкий круг бактерий-хозяев как внутри, так и между видами, и (ii) очень быстрое развитие устойчивости к бактериофагу популяцией бактерии-хозяина. Таким образом, как это часто бывает во многих областях науки, теоретический результат трудно достичь в реальных жизненных ситуациях. Поэтому, в то время как бактериофаги кажутся полезными в качестве антимикробных агентов в теории, на практике они сдерживают антимикробные свойства, и их использование для устранения бактериальных инфекций очень трудно достичь из-за быстрого развития устойчивости хозяина к бактериофагу. Следовательно, бактериофаги были неэффективны при длительной элиминации бактерий-хозяев.

Соответственно, настоящее изобретение относится к сконструированному бактериофагу, кодирующему антимикробный агент, причем бактериофаг модифицирован или сконструирован для экспрессии антимикробного пептида (AMP), который необязательно секретируется клеткой-хозяином, по меньшей

- 21 038595 мере одну или любую комбинацию различных антимикробных агентов сконструированного бактериофага могут использовать отдельно или в любой комбинации для устранения или уничтожения бактериальной инфекции. В некоторых вариантах реализации изобретения сконструированный бактериофаг, кодирующий антимикробный агент, может быть использован с дополнительными агентами, такими как другой антимикробный агент сконструированного бактериофага, очищенный антимикробный пептид(ы) или низкомолекулярный антибиотик. Сконструированные бактериофаги, кодирующие антимикробные пептиды (или сконструированные бактериофаги, кодирующие AMP), могут кодировать любой антимикробный агент, известный специалисту в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации аспектов изобретения сконструированный бактериофаг, кодирующий антимикробный агент, может экспрессировать и секретировать антимикробный агент, который представляет собой нуклеиновую кислоту, например антимикробный агент, который действует посредством сайлесинга генов общеизвестных бактериальных генов, известных обычным специалистам в данной области техники. Антимикробный агент на основе нуклеиновой кислоты включает, например, но без ограничений, молекулы, индуцирующие РНК-интерференцию (РНКи), например, но без ограничений, миРНК, дцРНК, мвРНК, кшРНК, микроРНК и их сконструированные версии, где ген молекулы РНК-интерференции подавляет экспрессию гена, экспрессированного и важного для жизнеспособности (т.е. выживания) бактерий. Антимикробный агент на основе нуклеиновой кислоты может представлять собой антисмысловую олигонуклеиновую кислоту или аналог нуклеиновой кислоты, например, но без ограничений, ДНК, РНК, пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК (пк-ПНК), или закрытую нуклеиновую кислоту (ЗНК) и тому подобное. Альтернативно, антимикробным агентом на основе нуклеиновой кислоты может быть ДНК или РНК и аналоги нуклеиновых кислот, например ПНК, пкПНК и ЗНК. Нуклеиновая кислота может быть одно- или двухцепочечной и может быть выбрана из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, ПНК и т.д. Такие ингибиторы нуклеиновой кислоты включают, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который является транскрипционным репрессором, или антисмысловую молекулу, или рибозим, или небольшую ингибирующую последовательность нуклеиновой кислоты, такую как РНКи, кшРНКи, миРНК, микроРНКи (микроРНК), антисмысловой олигонуклеотид и т.д.

Антимикробные пептиды могут дополнительно или альтернативно быть антибактериальными ферментами. Иллюстративные антибактериальные активности могут включать, но без ограничений, литический фермент, ацилазу, аминопептидазу, амилазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрингликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, эстеразу, альфагалактозидазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, α-глюкозидазу, β-глюкозидазу, галопероксидазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, оксидазу, пектинолитический фермент, пептидоглутаминазу, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглутаминазу, ксиланазу, РНКазу, ДНКазу, лизостафин или порообразующие пептиды.

Антимикробные пептиды или антимикробные полипептиды могут непосредственно разрушать бактериальную мембрану путем связывания с отрицательно заряженной микробной мембраной и разрушения мембраны путем образования водных каналов, заставляя липидный бислой сворачиваться назад на себя или покрывая мембрану с образованием мицелл. В дополнение к их прямым бактерицидным эффектам любые антимикробные пептиды и полипептиды могут также активировать TLR-сигналинг и дополнительные иммунные ответы, служить в качестве хемоаттрактантов лейкоцитов, увеличивать бактерицидную опсонизацию путем вторжения фагоцитов, очищать жизненно важные питательные вещества, необходимые бактериям для роста и ингибировать бактериальные протеазы, или любую комбинацию его.

Биосурфактанты.

Образование бактериальной биопленки может приводить к локальным инфекциям, а также к тяжелому лечению, а иногда и к смертельным, системным инфекциям, таким как бактериемия (наличие бактерий в крови) и бактериальный сепсис (множественная органная недостаточность, вызванная распространением бактерий или их продуктов через кровоток). Внеклеточные вещества, которые составляют матрицу биопленки, могут действовать как барьер, который защищает и изолирует бактерии, находящиеся в биопленке от нормальных иммунологических защитных механизмов, таких как антитела и фагоциты, а также от антимикробных агентов, включая антибактериальные ферменты и антибиотики. Биопленка также способствует росту и распространению бактерий, обитающих в биопленке.

Изобретение относится к способам получения и композициям сконструированных вирусов, экспрессирующих дополнительный агент, используемый для облегчения удаления или ослабления биопленки, нанесенной на поверхность. Например, композиции могут включать биосурфактант. Типичные биосурфактанты включают, но без ограничений, гликолипиды, липопептиды, депсипептиды, фосфолипиды, замещенные жирные кислоты, липополисахариды, сурлактин, сурфактин, висконсин и рамнолипиды.

Вирусная инженерия.

Методы генетического конструирования вирусных частиц являются трудоемкими и длительными из-за отсутствия широко применимых и целевых методов конструирования in vitro. Современные методы in vivo могут занять недели или месяцы для создания модифицированных вирусов и вирусных векторов (Levin and Bull, Nat. Rev. Microbiol., 2004, февраль, 2 (2): 166-73, включены в настоящий документ по- 22 038595 средством ссылки). Кроме того, существует токсичность, связанная с манипуляцией вирусными геномами в клетках. До этого раскрытия усилия по разработке широко применимых методов для точной генной инженерии вирусов in vitro были в значительной степени безуспешными. В настоящем документе описан широко применимый процесс для быстрого создания вирусных геномов полностью in vitro.

Представленные в настоящем документе системы и методы генетического конструирования in vitro имеют несколько преимуществ по сравнению с существующими методами генной инженерии вирусов: 1) позволяют легко манипулировать токсичными генами/продуктами полностью in vitro; 2) быстрые, т.е. могут быть выполнены в течение дня по сравнению с неделями или месяцами для методов in vivo; 3) позволяют удерживать геномную модификацию большей части вирусного генома; 4) не требует рекомбинации сигнальных путей хозяина; 5) более прямой и менее подвержен ошибкам, чем предыдущие методы; и 6) применим к нескольким вирусам без изменений в протоколе.

Изобретение представляет собой способы расщепления, опосредуемой РНК-направляемой нуклеазой, и сборку in vitro сайт-специфических сконструированных целых геномов. Изобретение значительно увеличивает точность, простоту и скорость, с которой вирусные геномы могут быть генетически модифицированы. Кроме того, данный способ преодолевает сложившуюся сложность манипулирования часто ядовитыми вирусными геномами вируса внутри клеток-хозяев. Также данный подход, выполняемый полностью в условиях in vitro, устраняет потребность в генетически приемлемом штамме хозяина для конструирования, что препятствует манипулированию многими важными и интересными вирусами архей, прокариот и эукариот. Данный подход не усиливает манипуляции вирусными геномами и поэтому позволяет сохранять большинство модификаций вирусного генома, таких как метилирование. Хорошо известно, что модификации генома могут иметь глубокое влияние на пригодность вирусов, и поэтому сохранение данных модификаций генома дает четкое преимущество перед другими инженерными методами. Кроме того, этот метод отличается от других методов, относящихся к конструированию генома РНК-направляемой нуклеазой in vivo, поскольку он не сосредоточен на использовании РНКнаправляемой нуклеазы, такой как Cas9 и гРНК для редактирования эукариотического генома, но вместо этого относится к преодолению известных проблем вирусной инженерии целиком в условиях in vitro.

В некоторых аспектах, описанные в настоящем документе новые способы могут включать модификацию вирусной нуклеиновой кислоты или вирусного генома, например, используя РНК-направляемую нуклеазу и сборку, описанную в настоящем документе, и введение сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты или сконструированного вирусного генома непосредственно в хозяин, который будет продуцировать сконструированные вирусные частицы или сконструированные вирусы, которые содержат сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту или сконструированный вирусный геном. Например, в некоторых аспектах способы включают конструирование вирусной нуклеиновой кислоты или вирусного генома без введения сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты или сконструированного вирусного генома в клонирующем хозяине для амплификации сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты или сконструированного вирусного генома, например, посредством репликации в векторе. Например, в некоторых способах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота или сконструированный вирусный геном не вводятся в дрожжи, Е.coli или другие известные клонирующие хозяева, такие как, но без ограничений, Bacillus или Vibrio, до введения сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты или сконструированного вирусного генома в клетку-хозяина, которая будет продуцировать сконструированные вирусные частицы или сконструированные вирусы.

Новые способы, предложенные в настоящем документе, позволяют проводить целенаправленную модификацию двух, трех, четырех, пяти или более сайтов в вирусном геноме. Способы могут быть выполнены целиком в условиях in vitro, что позволяет производить вирусные геномы, измененные в нескольких сайтах, что не достигается с использованием обычных методов конструирования.

Приведенные в настоящем документе сконструированные вирусы, содержащие сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту и/или сконструированные вирусные геномы, которые имеют две, три, четыре, пять или более модификаций в отношении несконструированной вирусной нуклеиновой кислоты или несконструированного вирусного генома. Две или более модификаций могут быть вставкой, делецией, заменой или любой их комбинацией. Две или более модификаций могут приводить к одному, двум или более улучшенным вирусным свойствам, таким как любое раскрытое в настоящем документе. Сконструированные вирусы можно получать полностью посредством методов конструирования в условиях in vitro, раскрытых в настоящем документе. Способы конструирования in vitro, описанные в настоящем документе, приводят к целенаправленным модификациям, в отличие от классического или случайного мутагенеза. В отличие от модификаций, получаемых классическим или случайным мутагенезом, целевые модификации могут быть удобно скринированы для использования в стандартных молекулярногенетических лабораторных методах, таких как ПЦР и/или секвенирование до любых анализов фенотипа.

Также в настоящем документе раскрыта система получения синтетических вирусов с улучшенными вирусными свойствами (например, см., фиг. 10). Система включает идентификацию последовательностей нуклеиновых кислот, ответственных за обеспечение требуемого свойства, и затем включение этих изменений последовательности в выбранный вирусный геном для получения вирусных частиц с улучшенными вирусными свойствами. Последовательности нуклеиновой кислоты, способные придавать желаемое

- 23 038595 вирусное свойство, могут быть идентифицированы с помощью фундаментальных научных знаний, поиска литературы, эмпирического тестирования, исследований мутаций или любой их комбинации. Исследования мутаций могут включать эволюционные исследования, исследования адаптации, исследования мутагенеза и/или другие экспериментальные подходы, хорошо известные в данной области техники. Исследования мутагенеза могут включать ультрафиолетовый (УФ), химический и/или инсерционный мутагенез. Инсерционный мутагенез может включать транспозон и/или селективный маркер инсерционного мутагенеза. Эксперименты по мутации, используемые для идентификации интересующих последовательностей нуклеиновых кислот, могут быть выполнены с использованием вируса или вирусного генома вируса, который станет отправной точкой для конструирования in vitro. Дополнительно или альтернативно вместо выбранного вируса или вирусного генома, связанный или гетерологичный вирус, или вирусный геном может быть использован в исследовании мутаций с целью идентификации последовательностей рекомбинантных нуклеиновых кислот для включения в первоначально выбранный вирус или вирусный геном для придания дополнительных свойств выбранного вируса.

Желаемые свойства могут включать одно или более из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунологического надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагу, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина, других необходимых свойств, которые могут быть хорошо известны специалисту в данной области техники или в любой их комбинации. Идентифицированные последовательности нуклеиновых кислот, обладающие необходимым свойством, могут быть включены в выбранный вирусный геном, используя описанный в настоящем документе метод конструирования in vitro для включения одного или более изменений в один вирусный геном в течение одного или более циклов повторного конструирования и тестирования до тех пор, пока не будет подвержден желаемый набор одного или более улучшенных вирусных свойств. Конечный вирусный геном, представляющий интерес, может представлять собой комбинацию естественных и синтезированных молекул нуклеиновых кислот или может быть полностью синтезирован de novo с использованием способов, описанных в настоящем документе, и/или известных в данной области техники. Получение вирусов или вирусных частиц с улучшенными вирусными свойствами может включать введение сконструированного вирусного генома, представляющего интерес, в совместимую клетку, причем геном активируется, тем самым создавая вирусные частицы или вирусы. Для получения молекулы нуклеиновой кислоты, идентифицированной для придания желаемого свойства для включения в выбранный вирусный геном, последовательность, представляющая интерес, может быть выделена или амплифицирована из вирусного генома, из которого она была идентифицирована путем расщепления, ПЦР-амплификации, синтеза, других методов известных в данной области техники, или в любой их комбинации. Синтезированную последовательность нуклеиновой кислоты можно химически синтезировать или собрать из химически синтезированных перекрывающихся олигонуклеотидов. Дополнительно или альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, которая должна быть включена в выбранный вирусный геном для того, чтобы придать желаемый фенотип, может быть комбинацией последовательностей естественных и синтезированных нуклеиновых кислот. В зависимости от конструкции молекулы нуклеиновой кислоты, которая должна быть включена в выбранный вирусный геном, полученный сконструированный вирусный геном может содержать последовательности нуклеиновых кислот, замененные альтернативными последовательностями или любой их комбинацией для придания необходимого вирусного свойства. Способы конструирования молекул нуклеиновой кислоты для того, чтобы изменить последовательность таким образом, что последовательности выделяют, удаляют, заменяют или любую их комбинацию хорошо известную специалистам в данной области техники. Сконструированные вирусные геномы, получаемые при помощи системы и методами, описанными в настоящем документе, могут быть использованы для получения вирусов или вирусных частиц с улучшенными вирусными свойствами. Получение вирусов или вирусных частиц с улучшенными вирусными свойствами может включать введение сконструированного вирусного генома в совместимую клетку, причем геном активируется, тем самым создавая вирусные частицы или вирусы. Введение сконструированного генома в клетку может быть осуществлено путем электропорации, трансформации, конъюгации, контакта клетки с предварительно упакованными вирусными геномами и т.д. или другими способами, хорошо известными в данной области техники.

Изобретение дополнительно относится к открытию способа для конструирования нуклеиновой кислоты in vitro с использованием РНК-направляемой эндонуклеазы. Настоящее раскрытие дополнительно относится к улучшению вирусных свойств при помощи генной инженерии in vitro вирусных нуклеиновых кислот. В частности, раскрытие относится к расщеплению in vitro последовательностей вирусов с использованием эндонуклеаз, таких как РНК-направляемая эндонуклеаза, например, Cas9, с последующей сборкой рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента(ов) ДНК или РНК в расщепленный вирусный геном.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro вирусной нуклеиновой кислоты, включающий выделение вирусной нуклеиновой кислоты; расщепление in vitro области вирусной нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и сборку

- 24 038595 рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах расщепление in vitro представляет собой ферментативное расщепление, основанное на РНК. В некоторых примерах ферментативное расщепление выполняют при помощи РНК-направляемой нуклеазы. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9, фермент, полученный из Cas9, фермент, связанный с Cas9, или любую очищенную программируемую РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых примерах расщепление дополнительно включает нацеливающие РНК. В некоторых примерах система расщепления дополнительно содержит спермидин. В некоторых примерах нацеливающие РНК представляют собой гРНК, сгРНК и/или tracrPHK. В некоторых примерах после расщепления РНК-направляемую нуклеазу инактивируют стандартными методами, такими как воздействие тепла и/или удалением стандартными методами, такими как, например, фенольно-хлороформной экстракцией. В некоторых примерах нагревание в процессе активации достигают путем воздействия на раствор, содержащий белок, нагревая, например, по меньшей мере на 80°С.

Любая программируемая РНК-направляемая нуклеаза может быть использована в способах и композициях настоящего изобретения, например Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известна как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, C2c1, C2c2, С2сЗ или их гомологи, или их сконструированные варианты. Любую программируемую систему CRISPR можно использовать в способах и композициях в настоящем документе, включая тип I, тип II, тип III, тип IV, тип V, тип VI или любую их комбинацию. РНК-направляемая нуклеаза может быть белком Cas9, таким как белок Cas9 из Staphylococcus pyogenes, S.thermophilus, S.pneumonia, S.aureus или Neisseria meningitidis, в виде неограничивающих примеров. Также рассматриваются белки Cas9, представленные в виде SEQ ID NO: 1-256 и 795-1346 в публикации заявки на патент США № US 2014/0068797, включенной в настоящий документ посредством ссылки, и химерных белков Cas9, которые могут объединять домены из более чем одного белка Cas9, а также варианты и мутанты идентифицированных белков Cas9. В дополнение к Cas9, специалист в данной области техники легко узнает, что любой известный функциональный эквивалент будет достаточным альтернативным примером.

Вирусные частицы могут быть архей-, прокариот- или эукариот- специфическими вирусами. Например, вирус может быть таким, который может заразить Pseudomonas aeruginosa, Е.coli или Homo sapiens. В некоторых примерах вирус может быть таким, который заражает виды возбудителей, такие как те, что относятся к роду Acinetobacter, Clostridium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Mycobacterium, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus или Streptococcus. В некоторых примерах вирус может инфицировать виды архей, такие как те, что относятся к роду Acidianus, Aeropyrum, Haloarcula, Haloferax, Halorulbum, Methanobacterium, Pyrobaculum, Pyrococcus, Stygiolobus, Sulfolobus или Thermoproteus. В некоторых примерах вирус может инфицировать эукариотические хозяева, такие как люди, млекопитающие, животные, растения, водоросли или грибы. Вирусная нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. В некоторых примерах вирусная нуклеиновая кислота состоит из цельного вирусного генома, части вирусного генома, или одного или более вирусных генов. В некоторых примерах часть вирусного генома субклонируется в плазмиду до конструирования.

Вирусная нуклеиновая кислота может быть одиночной или двойной (или более) расщепленной РНК-направляемой нуклеазой, такой как Cas9, в сочетании с нацеливающей(ими) РНК in vitro для удаления одного или более нуклеотидов, одного гена, множества генов или любого размера геномной области или открытой ДНК для вставки новой последовательности. В дополнение к Cas9 специалисту в данной области техники понятно, что любая программируемая РНК-направляемая нуклеаза или другой механизм расщепления ДНК, пригодный для ДНК, будет достаточным и будет функционально эквивалентным. Множественные расщепления могут быть выполнены одновременно; однако было обнаружено, что последовательное расщепление РНК-направляемой Cas9 может повысить эффективность. Кроме того, спермидин может быть добавлен в реакционную смесь для увеличения диссоциации Cas9 от ДНК, что позволяет увеличить доступность Cas9 для ферментативной активности. Вирусная последовательность, удаленная расщеплением Cas9, не рекомбинируется обратно в геном, потому что Cas9 представляет собой тупой режущий фермент и фрагменты не содержат гомологии с сайтом встраивания. Кроме того, дезактивация теплом Cas9 обеспечивает непосредственный переход от расщепления к реакциям сборки, упрощая протокол.

Используемый в настоящем документе термин нацеливающие РНК или направляющие РНК относится к CRISPR РНК (сгРНК), транс-активирующим сгРНК (сгРНК), модифицированным химерным гидовым РНК (гРНК), включающим как сгРНК, так и tracrPHK, или одиночные гРНК, совместимые с выбранной системой CRISPR. CRISPR РНК (сгРНК) транскрибируют из локуса CRISPR, включают в эффекторные комплексы и направляют комплекс к последовательностям встраивающейся нуклеиновой кислоты, что приводит к расщеплению нуклеиновой кислоты, опосредованному РНК-направляемой нуклеазой. ТгасгРНК являются комплементарными с и комплементарной парами оснований с pre-сгРНК, образующими дуплекс РНК, необходимый для Cas9-опосредованного расщепления. Гибридные гРНК

- 25 038595 представляют собой химерные РНК, которые связывают нацеливающую сгРНК с tracrPHK, что позволяет использовать одну РНК для Cas9-опосредованного расщепления. Cas9-опосредованное расщепление могут проводить как с транскрибированой in vitro смесью crPHK-tracrPHK или с химерной гРНК.

Вставка ДНК или РНК может быть получена любыми способами, известными в данной области техники, а именно путем синтеза in vitro, химического синтеза, синтеза de novo, сборки de novo, амплификации (ПЦР), фермент-опосредуемого освобождения от плазмид, вирусов или бактерий, или любой их комбинации. В одном аспекте вставка ДНК или РНК создается сборкой олигонуклеотидов или ПЦР с праймерами, содержащими перекрывающиеся последовательности с сайтом встраивания. Вставка ДНК или РНК может быть комбинацией естественных и синтезированных нуклеиновых кислот, или полученных полностью естественным или синтетическим путем.

Сборка вставки ДНК или РНК и расщепленной вирусной нуклеиновой кислоты может быть проведена любым известным в данной области техники способом, таким как реакции клонирования in vitro или любым из ранее обсуждавшихся способов. В одном аспекте сборка вставки ДНК или РНК в расщепленный вирусный геном выполняют с использованием метода сборки Gibson Assembly. В одном аспекте сборку вставки ДНК или РНК в расщепленный вирусный геном выполняют in vivo с использованием механизмов рекомбинации клеток-хозяев. Сборка вставки ДНК или РНК может приводить к вставке, делеции, замене или любой их комбинации последовательности нуклеиновой кислоты. Процесс конструирования последовательности ДНК или РНК такой, что сборка в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту приводит к вставке, делеции, замене или любой их комбинации нуклеиновых кислот, представляющих интерес, хорошо известны в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro вирусной последовательности, включающий выделение вирусной нуклеиновой кислоты; расщепления in vitro области вирусной нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и сборку рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах сборку проводят in vitro в одном сосуде со смесью компонентов, включающих: (а) выделенную не термостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'экзонуклеазной активностью; (b) краудинг-агент; (с) выделенную термостабильную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесью указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную термостабильную лигазу; (е) смесь дНТФ; и (f) подходящий буфер в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах экзонуклеаза представляет собой экзонуклеазу Т5, и приведение в контакт происходит в изотермических условиях, и/или краудинг-агент представляет собой ПЭГ, и/или невытесняющая ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу Phusion™ или ДНК-полимеразу VENT® и/или лигазу представляет собой Taq-лигазу. В некоторых примерах сборку in vitro выполняют при помощи одноступенчатой или изотермической сборки методом Gibson Assembly. В некоторых примерах сборку in vitro выполняют при помощи двухступенчатой сборки методом Gibson Assembly. В некоторых примерах расщепленная нуклеиновая кислота и фрагмент ДНК или РНК могут быть собраны in vitro лигированием тупых концов с использованием фермента лигазы.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает метод in vitro для конструирования вирусной последовательности, включающий этап сборки. В некоторых примерах сборку выполняют in vivo в совместимой клетке-хозяине с использованием механизма рекомбинации клеток-хозяев. Хотя рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть собрана целиком в условиях in vitro с использованием очищенных ферментов, как описано в настоящем документе, этот процесс также может быть осуществлен с использованием естественных или сконструированных рекомбинантных сигнальных путей в чувствительном штамме хозяина. В некоторых случаях совместимыми клетками-хозяевами могут быть S.cerevisiae, Е.coli, P.aeruginosa, В.subtilis, V.natrigens или другие организмы, доступные в данной области техники. Трансформация очищенных и обработанных in vitro вирусных геномов вместе с фрагментом вставки восстановления, содержащим концевые области гомологии, достаточна для того, чтобы некоторые клетки-хозяева собирали рекомбинантный вирусный геном in vivo. Фрагменты вставки восстановления могут быть синтезированы или амплифицированы стандартными методами, известными в данной области техники, или могут находиться внутри плазмид, стабильно реплицирующихся в выбранной клетке-хозяине. Данный способ, вероятно, будет иметь более низкую эффективность по сравнению со сборкой in vitro из-за клеток-хозяев, имеющих как гомологичные, так и не гомологичные пути восстановления ДНК, задача совместной доставки достаточного количества вставки и расщепленного генома в клетку-хозяина и более низкой эффективности большинства гомологичных сигнальных путей рекомбинации хозяина. Поскольку только расщепленнные геномы не образуют функциональных вирусных частиц и в последующем бляшек без опосредованной хозяином рекомбинации, бляшки, полученные после трансформации и выращивания, могут быть скринированы с помощью ПЦР для данной вставки, чтобы подтвердить корректную сборку желаемой сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает метод in vitro для конструирования вирусной последовательности, содержащей РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых примерах РНК- 26 038595 направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 II типа. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах РНКнаправляемая нуклеаза представляет собой выделенный рекомбинантный фермент Cas9 или Cas9. В некоторых примерах существует по меньшей мере одна нацеливающая РНК. В некоторых примерах существует две нацеливающие РНК. В некоторых примерах нацеливающая РНК представляет собой химерную гидовую РНК (гРНК) или набор сгРНК и tracrPHK. В некоторых примерах в реакции расщепления in vitro использует две гРНК. В некоторых примерах в реакции расщепления in vitro использует два набора сгРНК и tracrPHK, чтобы, например, одновременно нацеливать на две последовательности.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro вирусной последовательности, включающий стадию расщепления in vitro. В некоторых примерах после расщепления РНК-направляемую нуклеазу инактивируют при помощи стандартных методов, таких как воздействие теплом, например, по меньшей мере на 80°. В некоторых примерах после расщепления РНКнаправляемую нуклеазу удаляют фенольно-хлороформной экстракцией. В некоторых примерах, после расщепления, РНК-направляемую нуклеазу удаляют другими способами экстракции, хорошо известными в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ in vitro для конструирования вирусной последовательности, которая приводит к созданию сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту затем трансформируют в клетку-хозяин. В некоторых примерах клетка-хозяин представляет собой Е.coli, P.aeruginosa, S.cerevisiae, V.natriegens, В.subtilis или другой организм, хорошо известный в данной области техники. В некоторых примерах трансформацию выполняют путем теплового шока, электропорации, биолистики, бомбардировки частиц, конъюгации, трансдукции, липофекции или другого известного метода, хорошо известного в данной области техники. В некоторых примерах сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту трансформируют в клетку-хозяина и затем снова выделяют после репликации. В некоторых примерах выделенную сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту используют в качестве исходной вирусной нуклеиновой кислоты для другого цикла конструирования in vitro, который в настоящем документе называется итеративное конструирование in vitro. В некоторых примерах представлен один цикл итеративного конструирования in vitro. В других примерах представлен по меньшей мере один цикл итеративного конструирования in vitro. В других примерах существует два или более циклов итеративного инженерии in vitro.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ in vitro конструирования вирусной последовательности, который приводит к созданию сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту упаковывают в вирусные частицы с использованием набора для упаковки in vitro, который может быть коммерчески доступен. В некоторых примерах комплект для упаковки in vitro представляет собой набор Maxplax lambda packaging extract.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ in vitro для конструирования вирусной последовательности, который приводит к образованию рекомбинантной сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте. В некоторых примерах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота улучшает или изменяет свойство вируса по сравнению с контрольным и/или несконструированным вирусом. В некоторых примерах улучшенное или измененное вирусное свойство представляет собой свойство, такое как круг хозяев, вирусный литический цикл, адсорбция, прикрепление, инъекция, репликация и сборка, лизис, величина выхода фага, ускользание от иммунологического надзора, иммунная стимуляция, иммунная дезактивация, дисперсия биопленки, устойчивость к бактериальному фагу, антибиотическая сенсибилизация бактерий, модуляция факторов вирулентности, направленное расщепление или редактирование геном хозяина или любая их комбинация. В некоторых примерах улучшение свойства может быть увеличением, уменьшением или изменением свойства. Например, улучшенное вирусное свойство может быть расширенным или уменьшенным кругом хозяев, измененным вирусным литическим циклом, увеличенной или уменьшенной адсорбцией в клетке-хозяине, увеличенным или уменьшенным прикреплением к клетке-хозяина, увеличенным или уменьшенным инъекцией, увеличенной или уменьшенной или измененной репликацией и сборкой, повышенным или сниженным лизисом, увеличенной или уменьшенной величиной выхода фага, увеличенным или уменьшенным или измененным ускользанием от иммунного надзора, увеличенной или уменьшенной или измененной иммунной стимуляцией, увеличенной или уменьшенной или измененной иммунной дезактивацией, увеличенной или уменьшенной или измененной дисперсией биопленки, увеличенной или уменьшенной или измененной устойчивости бактерий к фагу, повышенной или уменьшенной или измененной антибиотической сенсибилизацией бактерий, увеличенной или уменьшенной или измененной модуляцией факторов вирулентности, увеличением или уменьшением или изменением направленного расщеплениея или редактирования генома или любой их комбинации.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, увеличенный круг хозяев. Круг хозяев представляет собой количество типов клеток, штаммов или видов хозя

- 27 038595 ев, которые вирус может заразить. Увеличение круга хозяев представляет собой расширение абсолютного числа различных типов клеток, штаммов или видов, которые вирус способен инфицировать по сравнению с контрольным и/или несконструированным вирусом. В некоторых примерах увеличенный круг хозяев представляет собой увеличение количества бактериальных штаммов или вариантов внутри бактериальных видов, которые вирус способен инфицировать. Увеличение в круге хозяев может быть увеличением по меньшей мере одного или более штаммов, типов клеток или видов. Круг хозяев могут анализировать, например, стандартным анализом бляшкообразования, который хорошо известен в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ для конструрования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, вирусный литический цикл. Вирусный литический цикл представляет собой один из двух циклов вирусной репликации, другой является лизогенным циклом. Литический цикл приводит к разрушению инфицированной клетки и инфицированной клеточной мембраны. Литический цикл состоит из шести этапов, каждый из которых может быть индивидуально сконструирован. Шесть этапов вирусного литического цикла представляют собой адсорбцию, прикрепление, инъекцию, репликацию и сборку, лизис и величину выхода фага.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, адсорбция. Адсорбция представляет собой действие вируса, контактирующего с клеткой-хозяином. Вирусная адсорбция характеризуется как сродство вируса к данной клетке-хозяину и может быть проанализировано с помощью стандартных анализов адсорбции, например, описанных Хайманом и Абедоном (Methods in Molecular Biology, 2009). Кроме того, или, альтернативно, вирусная адсорбция может быть определена другими стандартными анализами аффинности, широко используемыми в биохимии для анализа взаимодействий рецептор-лиганд.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, прикрепление. Вирусное прикрепление - это когда вирус сильно прикрепляется к клетке-хозяина. Вирусное прикрепление является необратимым взаимодействием между вирусом и рецептором клетки-хозяина.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, инъекция. Введение относится к инъекции вирусного генома, и когда вирус вставляет свой генетический материал в клетку-хозяина. В качестве примера можно привести инъекцию вирусного генома путем измерения оттока ионов калия (Cady et al., J. Bacteriol., 2012, 194 (21): 5728-38; Leavitt et al., PLoS ONE, 2013 8 (8): E70936, которые включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте).

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, репликация и сборка. Вирусная репликация и сборка относятся к созданию новых вирусов в клетке-хозяине. После инъекции вирусного генома механизм клеток-хозяев захватывается и вирусные гены транскрибируются, вирусные белки транслируются, а вирусные частицы представляют собой сборку, содержащую реплицированные вирусные геномы. Вирусная репликация и сборка в конечном итоге приводят к лизису клеток-хозяев, поэтому репликацию и сборку можно анализировать, контролируя скорость роста вируса стандартным анализом бляшкообразования или анализом бляшкообразования в двойном агаровом слое. Скорости вирусной репликации могут дополнительно или альтернативно определяться путем измерения величины выхода фага в стандартном анализе бляшкообразования, кривой одиночного цикла размножения или других стандартных анализах на репликативную способность вируса, которые хорошо известны в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, лизис. Лизис относится к лизису клеток-хозяев. После репликации и сборки новых вирусных частиц образуется фермент, который разрушает стенку клетки-хозяина и/или клеточную мембрану изнутри и позволяет вводить жидкость, что в конечном итоге приводит к лизису клеток-хозяев. Способность увеличивать или ингибировать вирулентную репликацию вируса может увеличивать или уменьшать время, необходимое для того, чтобы данный вирус убивал клетку-хозяина путем лизиса. Вирусную вирулентность можно исследовать, анализируя время между заражением и лизисами клеток-хозяев, контролируя скорость роста вируса стандартным анализом бляшкообразования или анализом бляшкообразования в двойном агаровом слое. Кроме того, или альтернативно, усиленный бактериальный лизис сконструированного вируса по сравнению с контрольным и/или несконструированным вирусом может быть определен при помощи колониеобразующих единиц (КОЕ) после анализа, количества или диаметра бляшкообразующих единиц (БОЕ) или после анализа бляшкообразования, из анализа биопленки или других стандартных анализов, которые хорошо известны в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, величина

- 28 038595 выхода фага. Величина выхода фага относится к числу вирусов, продуцируемых зараженной клеткой.

Величина выхода фага может быть проанализирована стандартными анализами величины выхода фага, такими как те, которые описаны Эллисом и Делбрейком (J. Gen. Physiol. 1939 Jan 20; 22(3): 365-384, включенный в настоящий документ посредством ссылки) и Delbriick (Delbriick J. Gen. Physiol, 1940, 23;

643, включенный в настоящий документ посредством ссылки)

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, ускользание от иммунного надзора. Ускользание от иммунного надзора представляет собой способность вируса избегать клиренса врожденной или адаптивной иммунной системы. Ускользание от иммунного надзора может быть проанализировано путем изучения уровня или скорости нейтрализации продуцирования антител. Кроме того, или, альтернативно, ускользание от иммунного надзора можно измерить, анализируя период полужизни или времени пребывания данного вируса внутри животного.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает собой способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, иммунная стимуляция. Иммунная стимуляция представляет собой способность вируса индуцировать иммунный ответ, который обычно не ассоциируется с вирусом дикого типа или несконструированным вирусом. Это может быть проанализировано путем анализа иммунных факторов, продуцируемых в присутствии вируса, с использованием стандартных наборов ИФА, проточной цитометрии, гистологии или других стандартных иммунологических анализов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, иммунная дезактивация. Иммунная дезактивация представляет собой способность вируса уменьшать иммунный ответ, обычно связанный с вирусом дикого типа или несконструированным вирусом. Это может быть проанализировано путем анализа иммунных факторов, продуцируемых в присутствии вируса, с использованием стандартных наборов ИФА, проточной цитометрии, гистологии или других стандартных иммунологических анализов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, дисперсия биопленки. Дисперсия биопленки представляет собой способность деградировать, ослаблять или увеличивать проницаемость биопленки. Мероприятия, которые могут приводить к дисперсии биопленки, включают, но без ограничений, деградацию экзополисахарида (ЭПС), модуляцию молекул бактериального чувства кворума, и деградацию внеклеточной ДНК или РНК в биопленке или месте бактериальной инфекции. Деградация экзополисахарида представляет собой способность вируса продуцировать белок или фермент, способный разрушать или диссоциировать высокомолекулярные соединения, секретируемые микроорганизмами в их среду для формирования структурной целостности биопленок. ЭПСдеградирующая активность может включать, но без ограничений, поверхностно-активные вещества, гликозидазы и протеазы. Их активность может быть измерена с использованием стандартных биохимических анализов, известных специалистам в данной области техники. Модуляция молекул бактериального чувства кворума также может приводить к дисперсии биопленки. Известно, что молекулы бактериального чувства кворума являются высококонсервативными регуляторами вирулентности у ряда патогенных бактерий человека. Были идентифицированы белки с ферментативной активностью, способные разрушать молекулы бактериального чувства кворума, и их активность измеряли при помощи различных анализов микробных репортеров, биохимических репортерных анализов или путем анализа продуктов расщепления с использованием TLC (Rajesh and Rai, Microbiological Research, July-August 2014, Volume 169, Issues 7-8, Pages 561-569, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Деградация внеклеточной ДНК или РНК в биопленке или месте бактериальной инфекции также может привести к дисперсии биопленки. Активность вирусной закодированной ДНКазы или РНКазы может быть измерена с помощью имеющихся в продаже наборов, известных специалистам в данной области техники, таких как те, что доступны от Jena Bioscience или Thermofisher в качестве неограничивающих примеров. Предотвращение, проникновение, разрушение или дисперсия биопленки также может быть оценена путем количественной оценки биопленки, присутствующей после обработки, и сравнения ее с контрольным условием. Измерения биопленки хорошо известны в данной области техники и включают в качестве неограничивающего примера окрашивание биопленки красителем, таким как кристаллический фиолетовый, и количественное определение поглощения на спектрофотометре.

В некоторых примерах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшенному вирусному свойству, такому как, например, устойчивость бактериального фага. Фаг или бактериофаг представляют собой термины, которые можно использовать взаимозаменяемо и которые относятся к вирусам, которые заражают бактерии. Бактериальная устойчивость к фагу относится к появлению бактериофаг-устойчивых бактерий из популяции, обработанной или подверженной воздействию конкретного вируса. Это происходит либо посредством случайных мутаций внутри бактерий, либо из-за того, что некоторые бактерии внутри популяции не способны заразиться вирусом. Когда данные резистентные бактерии распространяются, новая популяция устойчива к

- 29 038595 вирусу или бактериофагу, изначально подвергаемому воздействию. Неограничивающим примером оценки устойчивости бактерий является отслеживание скорости роста бактерий после вирусной обработки, поскольку количество резистентных бактерий непосредственно влияет на скорость повторного роста популяции. Бактериофаг может быть модифицирован таким образом, чтобы бактерии не могли получить вирусную резистентность по меньшей мере тремя способами, включая 1) ингибирование известных систем устойчивости к вирусам, 2) кодирование вторичного токсина и/или 3) увеличение вирулентности за счет увеличения литической способности. Бактериофаг может избегать или ингибировать известные системы устойчивости к вирусам посредством экспрессии известных или синтетических ингибирующих белков, как один пример. Активность данных ингибирующих белков можно контролировать с помощью классического метода титрования на двухслойной бляшке и/или анализа эффективности культивирования. Системы устойчивости к вирусам могут включать, но без ограничений, системы CRISPR-Cas и рестрикции-модификации. Предотвращение устойчивости к вирусам также может быть достигнуто путем экспрессии вторичных токсинов, таких как бактерицидные полезные нагрузки. Активность данных вторичных токсинов не зависит от естественной литической активности данного вируса и может быть измерена анализом кривой роста/гибели. Кроме того, или альтернативно, генетически закодированный токсический белок может быть очищен и охарактеризован с использованием установленных биохимических и/или фенотипических анализов, обычно используемых для характеристики белковых токсинов и которые хорошо известны специалисту в данной области техники.

В некоторых примерах настоящее раскрытие обеспечивает способ модификации вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, антибиотическая сенсибилизация бактерий. Антибиотическая сенсибилизация бактерий относится к способности вируса экспрессировать генетически закодированную полезную нагрузку, чтобы сделать инфицированные или соседние клетки более чувствительными к антимикробному агенту. Полезная нагрузка может быть генетически закодирована на вирусе или бактериофаге, а затем экспрессирована внутри клеткихозяина. Экспрессированная полезная нагрузка может быть необязательно секретирована клеткойхозяином или высвобождена при лизисе клеток-хозяев. Активность антибиотической сенсибилизации бактерий можно наблюдать при помощи тестирования синергии, используя, например, хорошо известный метод микроразведений с использованием серийных разведений.

В некоторых примерах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, модуляция факторов вирулентности. Модуляция факторов вирулентности относится к вирусным генетически закодированным белкам или соединениям, способным модулировать экспрессию или активность известных факторов вирулентности. Неограничивающими примерами модуляторов факторов вирулентности являются факторы транскрипции, антитела и белки иммунитета. Экспрессию или активность факторов вирулентности и модуляторов фактора вирулентности можно наблюдать, например, на животных моделях, биохимических тестах или репортерных анализах.

В некоторых примерах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования вирусной нуклеиновой кислоты, который приводит к улучшению вирусного свойства, такого как, например, направленное расщепление или редактирование генома хозяина. Расщепление или редактирование целевого генома хозяина относится к способности вируса генетически кодировать специфичную для последовательности нуклеазу, способную целенаправленно расщеплять геном в данном генетическом локусе, и, необязательно, редактировать, например, путем вставки восстанавливающей молекулы ДНК. Активность целевого расщепления можно наблюдать путем секвенирования, определения количества жизнеспособных микроорганизмов, подтверждения интеграции новой последовательности и/или других стандартных методов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro вирусной последовательности, включающий этап расщепления in vitro. В некоторых примерах расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту выделяют и секвенируют вместо использования в реакции сборки in vitro или in vivo. В некоторых примерах результаты секвенирования из фрагмента вирусной нуклеиновой кислоты используют для определения концов вирусных геномов. В некоторых примерах скорректированные последовательности вирусного генома используют для планирования и разработки дальнейших подходов и этапов конструирования in vitro.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу конструирования in vitro вирусной последовательности, включающей выделение вирусной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах вирусная нуклеиновая кислота представляет собой полный вирусный геном. В некоторых примерах полный вирусный геном выделяют из вирусной частицы. В некоторых примерах вирусная нуклеиновая кислота представляет собой часть вирусного генома. В некоторых примерах вирусная нуклеиновая кислота представляет собой часть вирусного генома, содержащегося в плазмиде. В некоторых примерах плазмиду, содержащую часть вирусного генома, выделяют из клетки-хозяина. В некоторых примерах часть вирусного генома клонировали в плазмиду, трансформировали в клетку-хозяина и изолировали перед конструированием in vitro. В некоторых примерах вирусную нуклеиновую кислоту синтезируют de novo. Синтез de novo может включать синтез олигонуклеотидов и сбор их in vitro или in vivo с использо- 30 038595 ванием стандартных методов, известных в данной области техники. В некоторых примерах вирусную нуклеиновую кислоту амплифицируют перед расщеплением, таким как, например, с ПЦРамплификацией.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает набор для конструирования вирусной последовательности, включающий: (а) выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (b) краудинг-агент; (с) выделенную термостабильную непересекающаяся ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную термостабильную лигазу; (е) смесь дНТФ; (f) подходящий буфер; и (g) очищенную рекомбинантную РНКнаправляемую нуклеазу. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах набор дополнительно содержит специально разработанные нацеливающие РНК. В некоторых примерах нацеливающие РНК представляют собой химерные гРНК или сгРНК и tracrPHK. В некоторых примерах набор дополнительно содержит специально разработанные синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, предназначенные для использования в качестве вставленного фрагмента ДНК в реакции сборки. В некоторых примерах набор дополнительно содержит компетентные клетки-хозяева. В некоторых примерах набор дополнительно содержит выделенные вирусные нуклеиновые кислоты.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает систему для конструирования in vitro вирусной нуклеиновой кислоты, содержащей выделенную вирусную нуклеиновую кислоту, рекомбинантную РНК-направляемую нуклеазу, по меньшей мере одну нацеливающую РНК и фрагмент ДНК или РНК, которые будут собраны в выделенную вирусную нуклеиновую кислоту в сайте расщепления. В некоторых примерах выделенная вирусная нуклеиновая кислота представляет собой полный геном, выделенный из вирусных частиц. В некоторых примерах выделенная вирусная нуклеиновая кислота представляет собой часть вирусного генома, который субклонируется в плазмиду и выделяется из клеткихозяина. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах нацеливающая РНК представляет собой сгРНК и tracrPHK. В некоторых примерах нацеливающая РНК представляет собой химерную гидовую РНК (гРНК). В некоторых примерах существует две нацеливающие РНК или гРНК. В некоторых примерах имеется два набора сгРНК и tracrPHK.

В некоторых аспектах изобретение обеспечивает систему сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты in vitro, содержащую выделенную вирусную нуклеиновую кислоту, рекомбинантную РНКнаправляемую нуклеазу, по меньшей мере одну нацеливающую РНК и фрагмент нуклеиновой кислоты, который должен быть вставлен в сайт расщепления выделенной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах система такова, что рекомбинантная РНК-направляемая нуклеаза и по меньшей мере одна нацеливающая РНК образуют комплекс, способный расщеплять выделенную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах система дополнительно содержит спермидин. В некоторых примерах система дополнительно содержит выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; краудинг-агент; выделенную термостабильную невытесняющую ДНКполимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесью указанной ДНК-полимеразы со второй ДНКполимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; выделенную термостабильную лигазу; смесь дНТФ; и подходящий буфер, в котором система находится в условиях, эффективных для вставки фрагмента нуклеиновой кислоты в выделенную вирусную нуклеиновую кислоту в месте расщепления РНК-направлямой нуклеазы с образованием рекомбинантной вирусной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах система, описанная в настоящем документе, такова, что рекомбинантная вирусная нуклеиновая кислота способна продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы по меньшей мере с одним улучшенным вирусным свойством по сравнению с эталонной и/или несконструированной вирусной нуклеиновой кислотой. В некоторых примерах улучшенное вирусное свойство выбирают из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотикочувстительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах в системе, описанной в настоящем документе, РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах РНК-направляемую нуклеазу инактивируют или удаляют после расщепления.

Способ, описанный в настоящем документе, может быть использован в нескольких других вирусных геномах и вирусных векторных конструкциях, используемых для модификации геномов РНК путем прямого редактирования генома РНК или ДНК-матрицы, который затем будет транскрибироваться in vitro в вирусную РНК, используемую для конструирования и непосредственного изменения вирусов как прокариотов, так и эукариотов, и используется для непосредственной модификации вирусных геномов, используемых для отображения фагов, фаговой терапии, вирусной диагностики или разработки/производства вакцин.

- 31 038595

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает рекомбинантную вирусную нуклеиновую кислоту, вырабатываемую любым из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых примерах рекомбинантная вирусная нуклеиновая кислота способна продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы по меньшей мере с одним улучшенным вирусным свойством по сравнению с несконструированной вирусной нуклеиновой кислотой. В некоторых примерах улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотикочувстительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает сконструированную вирусную композицию, содержащую рекомбинантную нуклеиновую кислоту, способную продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы по меньшей мере с одним улучшенным вирусным свойством по сравнению с несконструированной вирусной нуклеиновой кислотой. В некоторых примерах улучшенное вирусное свойство выбирают из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотикочувстительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина. В некоторых примерах сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением получают любым из этапов, описанных в настоящем документе, способов.

Данный способ может быть использован для изменения нуклеотида, гена или цельной геномной области. Например, как описано в приведенных ниже примерах, данный способ, как было показано, заменяет ген gp18 LKD16 на LUZ19, что приводит к улучшению чувствительности к кругу вирусных хозяев. Кроме того, данный способ может быть использован для вставки единственной мутации в комплекс трубок вируса для улучшения репликации вируса. Данный способ также может быть использован для конструирования антимикробных пептидов; пиоцинов; ЭПС-деполимераз; белков, ингибирующих CRISPR/Cas; хвостовых волокон из бактериофага; репортерных генов (т.е. Lux, GFP); генов для подавления кворума; нуклеаз; нуклеаз TALEN; белков системы CRISPR типа I, типа II, типа III, типа IV, типа V и типа VI (т.е. Cas9); CRISPR РНК, факторов транскрипции и иммуномодулирующих факторов человека в бактериофаге для улучшения активности бактериофага в бактериофаговой терапии или связанных с ним применениях. Данные элементы могут быть функционально связаны с нативными или гетерологичными регуляторными элементами, такими как нативный промотор, гетерологичный промотор, индуцируемый промотор или любой их комбинацией.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к сконструированному вирусу, содержащему сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту, способную при введении в клетку-хозяина продуцировать вирусные частицы, не встречающиеся в природе, с двумя или более улучшенными вирусными свойствами по сравнению с несконструированной вирусной нуклеиновой кислотой. В некоторых аспектах полученные вирусные частицы имеют по меньшей мере три улучшенных вирусных свойства. В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотиокочувстительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к сконструированному вирусу, содержащему сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота представляет собой сконструированный вирусный геном. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном представляет собой сконструированный геном бактериофага. В некоторых аспектах у сконструированного бактериофага по меньшей мере одним из улучшенных вирусных свойств является круг хозяев.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает сконструированный вирус с двумя или более улучшенными вирусными свойствами, который содержит сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство является результатом по меньшей мере одной модификации в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте. В некоторых аспектах по меньшей мере одно улучшенное вирусное свойство является результатом по меньшей мере двух модификаций в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте. В некоторых аспектах модификации, содержащиеся в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте, являются результатом одного этапа конструирования. В некоторых аспектах модификации, содержащиеся в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте, являются результатом неоднократно повторяемых этапов конструирования.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает сконструированный вирус с

- 32 038595 двумя или более улучшенными вирусными свойствами, который содержит сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна из модификаций находится в последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 100% или полную идентичность с последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 25.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна из модификаций находится в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит все или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит весь или часть гетерологичного гена gp18. В некоторых аспектах гетерологичный ген gp18 имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 26. В некоторых аспектах гетерологичный ген gp18 кодирует аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полной идентичностью с SEQ ID NO: 38.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит весь или часть сконструированного гена gp34. В некоторых аспектах сконструированный ген gp34 кодирует аминокислотную последовательность, содержащую мутацию в положении, соответствующем положению 55 аминокислоты SEQ ID NO: 5. В некоторых аспектах гетерологичный ген gp34 имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 4.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в одной или более последовательностях, имеющих по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 50.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в каждой последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 1, последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 2, последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 3 и последовательности, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 50. В некоторых аспектах модификации включают замену G на А в положении, соответствующем положению 50 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, замену G на Т в положении, соответствующем положению 160 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 50, замену А на G в положении, соответствующем положению 245 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, замену AT на ТС в положениях, соответствующим положениям нуклеиновой кислоты 247-248 SEQ ID NO: 2 и замену А на G в положении, соответствующем положению 757 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3.

- 33 038595

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в одной или более последовательностях нуклеиновой кислоты, кодирующих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 48.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит модификацию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей каждую из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 34, аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 35, аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 36, и аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 48. В некоторых аспектах модификации включают замену С на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 17 SEQ ID NO: 34, замену D на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 SEQ ID NO: 48, замену D на G в положении, соответствующем аминокислотной позиции 82 SEQ ID NO: 35, замену I на S в положении, соответствующем аминокислотному положению 83 SEQ ID NO: 35 и замену N на D в положении, соответствующем аминокислотному положению 253 SEQ ID NO: 36.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25. В некоторых аспектах модификация представляет собой введение молекулы гетерологичной нуклеиновой кислоты в последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25 или замену последовательности, содержащейся в последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.

В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном содержит весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19. В некоторых аспектах сконструированный вирусный геном дополнительно содержит модификацию в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49. В некоторых аспектах модификация представляет собой введение гетероличной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по

- 34 038595 меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49 или замену последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с промотором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в SEQ ID NO: 21 или ее часть.

В некоторых аспектах сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с терминатором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в SEQ ID NO: 22, или ее часть.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более необходимыми вирусными свойствами, включающий: (а) обеспечение первого вирусного генома; и (b) конструирование второго вирусного генома путем объединения по меньшей мере одного фрагмента первого вирусного генома с по меньшей мере одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты, так что полученный второй вирусный геном содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению с первым вирусным геномом и при этом при введении в клетку-хозяина второй вирусный геном способен продуцировать вирусные частицы с двумя или более улучшенными вирусными свойствами. В некоторых аспектах способ, описанный в настоящем документе, дополнительно включает (с) повторение этапов (а)-(b) в одном или более циклах. В некоторых аспектах каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотиокочувствительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более необходимыми вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах конструирование второго вирусного генома на стадии (b) дополнительно включает: (1) расщепление in vitro области первого вирусного генома с использованием эндонуклеазы; и (2) сборку по меньшей мере одного фрагмента расщепленного первого вирусного генома по меньшей мере с одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах первый вирусный геном выделяется из вирусных частиц. В некоторых аспектах первый вирусный геном или по меньшей мере одну восстанавливающую молекулу нуклеиновой кислоты синтезируют de novo. В некоторых аспектах синтез de novo включает объединение химически синтезированных молекул нуклеиновой кислоты, последовательностей нуклеиновой кислоты с амплифицированной ПЦР, расщепленных фрагментов выделенных молекул нуклеиновой кислоты или любой их комбинации. В некоторых аспектах первый вирусный геном или по меньшей мере одну восстанавливающую молекулу нуклеиновой кислоты амплифицируют перед расщеплением in vitro.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах первый вирусный геном составляет по меньшей мере 18 т.п.н. В некоторых аспектах первый вирусный геном составляет от по меньшей мере 2 т.п.н. до по меньшей мере 4 млн п.н. В некоторых аспектах первый вирусный геном составляет от по меньшей мере 18 т.п.н. до по меньшей мере 4 млн п.н. В некоторых аспектах первый вирусный геном составляет по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 15 т.п.н., по меньшей мере 18 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 25 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 35 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 45 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 55 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 65 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 75 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 85 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по по меньшей мере 125 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 175 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 500 т.п.н., по меньшей мере 600 т.п.н., по меньшей мере 700 т.п.н., по меньшей мере 800 т.п.н., по меньшей мере 900 т.п.н., по меньшей мере 1 млн

- 35 038595

п.н., по меньшей мере 1,5 млн п.н., по меньшей мере 2 млн п.н., по меньшей мере 2,5 млн п.н., по меньшей мере 3 млн п.н. или по меньшей мере 3,5 млн п.н.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах сборку выполняют in vitro или in vivo. В некоторых аспектах сборку выполняют in vitro при помощи смеси, содержащей: (а) выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (b) краудинг-агент; (с) выделенную термостабильную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную термостабильную лигазу; (е) смесь дНТФ; и (f) подходящий буфер в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей сконструированный вирусный геном.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах сборку выполняют in vitro или in vivo. В некоторых аспектах сборку выполняют in vivo в клетке-хозяина.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах эндонуклеаза представляет собой РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых аспектах способ дополнительно включает одну или две направляющие РНК. В некоторых аспектах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых аспектах направляющие РНК включают: 1) химерную гРНК или; 2) сгРНК и tracrPHK.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах эндонуклеазу инактивируют нагреванием или удаляют. В некоторых аспектах система расщепления in vitro дополнительно содержит спермидин.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ получения сконструированного вируса, представляющего интерес, обладающего двумя или более желательными вирусными свойствами, описанными в настоящем документе. В некоторых аспектах способ дополнительно включает трансформацию сконструированного вирусного генома в клетку-хозяина. В некоторых аспектах способ дополнительно включает использование упаковочного набора in vitro для упаковки сконструированного вирусного генома в вирусные частицы.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает сконструированный вирус, полученный любым из способов, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает композиции любого из сконструированных вирусов, описанных в настоящем документе, получаемых любым из способов конструирования, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает набор для конструирования молекул вирусной нуклеиновой кислоты, включающий очищенную рекомбинантную РНК-направляемую нуклеазу; выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; краудинг-агент; выделенную термостабильную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'экзонуклеазной активностью или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; выделенную термостабильную лигазу; смесь дНТФ; и подходящий буфер. В некоторых аспектах набор дополнительно содержит специально разработанные гидовые РНК. В некоторых аспектах набор дополнительно содержит специально разработанные синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, предназначенные для использования в качестве вставленного фрагмента ДНК в реакции сборки. В некоторых аспектах набор дополнительно содержит компетентные клетки-хозяева для трансформации. В некоторых аспектах набор дополнительно содержит выделенные вирусные геномные нуклеиновые кислоты.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает систему сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты in vitro, содержащую выделенную вирусную нуклеиновую кислоту, нуклеазу, рекомбинантную РНК-направляемую нуклеазу, по меньшей мере одну нацеливающую РНК и фрагмент нуклеиновой кислоты, который должен быть вставлен в сайт расщепления выделенной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах система такова, что рекомбинантная РНК-направляемая нуклеаза и по меньшей мере одна нацеливающая РНК образуют комплекс, способный расщеплять выделенную вирусную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах система дополнительно содержит спермидин. В некоторых примерах система дополнительно содержит выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; краудинг-агент; выделенную термостабильную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью или смесью указанной ДНК-полиме- 36 038595 разы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает З'-экзонуклеазной активностью; выделенную термостабильную лигазу; смесь дНТФ; и подходящий буфер, в котором система находится в условиях, эффективных для вставки фрагмента нуклеиновой кислоты в выделенную вирусную нуклеиновую кислоту в месте расщепления РНК-направлямой нуклеазы с образованием рекомбинантной вирусной нуклеиновой кислоты.

В некоторых аспектах система, описанная в настоящем документе, такова, что рекомбинантная вирусная нуклеиновая кислота способна продуцировать вирусные частицы, не встречающиеся в природе, по меньшей мере с одним улучшенным вирусным свойством по сравнению с несконструированной вирусной нуклеиновой кислотой. В некоторых примерах улучшенное вирусное свойство выбирают из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагам, антибиотикочувствительности бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

В некоторых аспектах в системе, описанной в данном документе, РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах РНК-направляемую нуклеазу инактивируют или удаляют после расщепления.

В некоторых аспектах способ, описанный в настоящем документе, используют в качестве способа коррекции ошибок для коррекции последовательностей в выделенных нуклеиновых кислотах. Стандартные методы коррекции ошибок основаны на ПЦР, имеют две неотъемлемые проблемы: 1) ПЦР может вводить дополнительные нежелательные мутации в нуклеиновую кислоту; и 2) ПЦР в этом контексте имеет ограничение по размеру приблизительно 5 т.п.н. Поэтому стандартные методы коррекции ошибок на основе ПЦР не могут быть надежно выполнены на плазмидах размером более 5 т.п.н., либо в результате мутаций, вызванных ПЦР, либо в случае невозможности усиления. Описанный в настоящем документе способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты обходит необходимость ПЦР-амплификации, которая устраняет ограничение по размеру и исключает возможность возникновения мутаций, вызванных ПЦР.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, включающей выделение нуклеиновой кислоты; расщепление in vitro области нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и сборку рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленную нуклеиновую кислоту. В одном аспекте расщепление in vitro представляет собой ферментативное расщепление, основанное на РНК. В другом аспекте ферментативное расщепление проводят с использованием Cas9 или фермента, полученного из Cas9. В дополнительном аспекте расщепление дополнительно включает нацеливающие РНК. В другом аспекте система расщепления дополнительно содержит спермидин. В конкретном аспекте нацеливающие РНК представляют собой гРНК, сгРНК и/или tracrPHK. В дополнительном аспекте после расщепления РНК-направляемую нуклеазу инактивируют стандартными методами, таким как воздействием тепла, например, такими как по меньшей мере 80°C. Дополнительно или альтернативно, РНКнаправляемую нуклеазу удаляют стандартными способами, такими как, например, фенольно-хлороформной экстракцией.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, включающий выделение нуклеиновой кислоты; расщепления in vitro области нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и сборку рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах сборку проводят in vitro в одном сосуде со смесью компонентов, включающих: (а) выделенную нетермостабильную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (b) краудинг-агент; (с) выделенную термостабильную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'экзонуклеазной активностью или смесью указанной ДНК-полимеразы со второй ДНК-полимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную термостабильную лигазу; (е) смесь дНТФ; и (f) подходящий буфер в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах экзонуклеаза представляет собой экзонуклеазу Т5, и приведение в контакт происходит в изотермических условиях, и/или краудинг-агент представляет собой ПЭГ, и/или невытесняющая ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу Phusion™ или ДНК-полимеразу VENT® и/или лигаза представляет собой Taq-лигазу. В некоторых примерах сборку in vitro выполняют при помощи одноступенчатой или изотермической сборки методом Gibson Assembly. В некоторых примерах сборку in vitro выполняют при помощи двухступенчатой сборки методом Gibson Assembly.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей РНК-направляемую нуклеазу. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 II типа. В некоторых примерах РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9. В некоторых примерах РНКнаправляемая нуклеаза представляет собой выделенный рекомбинантный фермент Cas9 или Cas9. В не- 37 038595 которых примерах существует по меньшей мере одна нацеливающая РНК. В некоторых примерах существуют две нацеливающие РНК. В некоторых примерах нацеливающая РНК представляет собой химерную гидовую РНК (гРНК) или набор сгРНК и tracrPHK. В некоторых примерах в реакции расщепления in vitro используют две гРНК. В некоторых примерах в реакции расщепления in vitro используют два набора сгРНК и tracrPHK.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, включающий этап расщепления in vitro. В некоторых примерах после расщепления РНК-направляемую нуклеазу инактивируют стандартными методами, такими как воздействие теплом, таким как, например, по меньшей мере 80°. В некоторых примерах после расщепления РНКнаправляемую нуклеазу удаляют фенольно-хлороформной экстракцией. В некоторых примерах после расщепления РНК-направляемую нуклеазу удаляют другими способами экстракции, хорошо известными в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, приводящей к образованию сконструированной нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах сконструированную нуклеиновую кислоту затем трансформируют в клеткухозяин. В некоторых примерах клетка-хозяин представляет собой Е.coli, Р.aeruginosa, S.cerevisiae, V.natriegens, В.subtilis или другой микроорганизм, хорошо известный в данной области техники. В некоторых примерах трансформацию выполняют путем теплового шока, электропорации, биолистики, бомбардировки частиц, конъюгации, трансдукции, липофекции или другого известного метода, хорошо известного в данной области техники.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых примерах нуклеиновая кислота представляет собой полный геном, выделенный из клетки-хозяина. В некоторых примерах клетка-хозяин представляет собой Е.coli, S.cerevisiae, В.subtilis, V.natriegens, P.aeruginosa или другой известный микроорганизм. В некоторых примерах нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду. В некоторых примерах плазмиду выделяют из клетки-хозяина. В некоторых примерах нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, клонировали в плазмиду, трансформировали в клетку-хозяин и выделяли до конструирования по способу, описанному в настоящем документе.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ конструирования in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, включающей выделение нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой геном или плазмиду. В некоторых примерах выделенный геном или плазмида составляет по меньшей мере 6 т.п.н., по меньшей мере 7 т.п.н., по меньшей мере 8 т.п.н., по меньшей мере 9 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 12 т.п.н., по меньшей мере 15 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 25 т.п.н. или по меньшей мере 28 т.п.н. В некоторых примерах выделенный геном или плазмида составляет от 6 т.п.н. до 1 млн п.н. В некоторых примерах выделенный геном или плазмида составляет: от 6 до 10 т.п.н., от 8 до 15 т.п.н., от 12 до 20 т.п.н., от 15 до 22 т.п.н., от 20 до 25 т.п.н., от 22 до 28 т.п.н., от 25 до 30 т.п.н., от 25 до 50 т.п.н. или от 40 до 100 т.п.н.

Дополнительно или, альтернативно, к любому из вышеописанных вариантов реализации раскрытие включает следующие варианты реализации изобретения.

Вариант реализации изобретения 1 представляет собой сконструированный вирус, содержащий сконструированную вирусную нуклеиновую кислоту, способную при введении в клетку-хозяина продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы с двумя или более, или, возможно, тремя или более улучшенными вирусными свойствами по сравнению с вирусными частицами, продуцируемыми при введении несконструированной вирусной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина.

Вариант реализации изобретения 2 представляет собой сконструированный вирус согласно варианту реализации изобретения 1, при этом каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагу, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления и редактирования генома хозяина.

Вариант реализации изобретения 3 представляет собой сконструированный вирус согласно варианту реализации изобретения 1 или 2, причем вирусная нуклеиновая кислота представляет собой одну или более из следующих вирусных нуклеиновых кислот: вирусный геном, фрагмент вирусного генома, генома бактериофага, фрагмент генома бактериофага, геном литического бактериофага, фрагмент генома литического бактериофага или любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 4 представляет собой сконструированный вирус любого из вариантов реализации изобретения 1-3, причем сконструированная вирусная нуклеиновая кислота представляет собой геном бактериофага и необязательно при этом по меньшей мере одно из улучшенных вирусных свойств представляет собой круг хозяев.

Вариант реализации изобретения 5 представляет собой сконструированный вирус любого из вари- 38 038595 антов реализации изобретения 1-4, причем выполняется по меньшей мере одно из следующего: 1) каждое улучшенное вирусное свойство является результатом по меньшей мере одной модификации в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте; 2) по меньшей мере одно улучшенное вирусное свойство является результатом по меньшей мере двух модификаций в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте; 3) модификации, содержащиеся в вирусной нуклеиновой кислоте, являются результатом одного этапа конструирования, 4) модификации, содержащиеся в сконструированной вирусной нуклеиновой кислоте, являются результатом итерации этапов конструирования или 5) любой их комбинации.

Вариант реализации изобретения 6 представляет собой сконструированный вирус любого из вариантов реализации изобретения 1-5, в котором по меньшей мере одна из модификаций находится внутри:

1) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 25, или

2) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49, или

3) любой их комбинации.

Вариант реализации изобретения 7 представляет собой сконструированный вирус согласно любому из вариантов реализации изобретения 1-6, причем сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит сконструированный вирусный геном, содержащий весь или часть вирусного генома, имеющего по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с геномом LUZ19.

Вариант реализации изобретения 8 представляет собой сконструированный вирус любого из вариантов реализации изобретения 1-7, причем сконструированный вирусный геном дополнительно содержит по меньшей мере одно из следующего:

1) весь или часть гетерологичного гена gp18 и, необязательно, в котором гетерологичный ген gp18 имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 26;

2) весь или часть гетерологичного гена gp18 и, необязательно, в котором гетерологичный ген gp18 кодирует аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полной идентичностью с SEQ ID NO: 38;

3) весь или часть сконструированного гена gp34 и, необязательно, в котором гетерологичный ген gp34 кодирует аминокислотную последовательность, содержащую мутацию в положении, соответствующем положению аминокислоты SEQ ID NO: 5, или необязательно, в котором гетерологичный ген gp34 имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 4;

4) модификацию в одной или более последовательностях, имеющих по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 50, и, необязательно, модификацию в каждой последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 1, последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность SEQ ID NO: 2, последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 3, и последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 50, и, необязательно, в которой модификации включают замену G на А в положении, соответствующем положению 50 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, замену G на Т в положении, соответствующем по- 39 038595 ложению 160 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 50, замену А на G в положении, соответствующем положению 245 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, замену AT на ТС в положениях, соответствующих положениям нуклеиновой кислоты 247-248 SEQ ID NO: 2 и замену А на G в положении, соответствующем положению 757 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3;

5) модификацию в одной или более последовательностях нуклеиновой кислоты, кодирующих аминокислотную последовательность, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 48, и, необязательно, модификацию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей каждую из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 34, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 35, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 36 и аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 48, и, необязательно, в которой модификации включают замену С на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 17 SEQ ID NO: 34, замену D на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 SEQ ID NO: 48, D на G в положении, соответствующем аминокислотному положению 82 SEQ ID NO: 35, замену I на S в положении, соответствующем аминокислотному положению 83 SEQ ID NO: 35, и замену N на D в положении, соответствующем аминокислотному положению 2 53 SEQ ID NO: 36;

6) модификацию в последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25, и, необязательно, в которой модификация представляет собой введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25 или замену последовательности, содержащейся в последовательности, имеющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 25 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты, и, необязательно, в которой гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20;

7) модификацию в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49 и, необязательно, в которой модификация представляет собой введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49 или заменой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с SEQ ID NO: 49 с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты, и, необязательно, в которой гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%,

- 40 038595 по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 100% или полную идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44,

SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47,

8) любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 9 представляет собой сконструированный вирус по любому из вариантов реализации изобретения 1-8, причем сконструированная вирусная нуклеиновая кислота содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с 1) промотором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в SEQ ID NO: 21, или ее часть, 2) терминатором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в SEQ ID NO: 22, или ее часть, или 3) любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 10 представляет собой способ получения сконструированного вируса, имеющего два или более желательных вирусных свойства, включающий: (а) обеспечение первого вирусного генома; и (b) создание сконструированного вирусного генома путем объединения по меньшей мере одного фрагмента первого вирусного генома с по меньшей мере одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты для получения второго вирусного генома, содержащего по меньшей мере одну модификацию по сравнению с первым вирусным геномом; при этом второй вирусный геном, будучи введенным в клетку-хозяин, способен продуцировать вирусные частицы с двумя или более улучшенными вирусными свойствами и необязательно (с) повторять этапы (а)-(b) в одной или более итерациях.

Вариант реализации изобретения 11 представляет собой вариант реализации изобретения 10, в котором каждое улучшенное вирусное свойство выбрано из группы, состоящей из круга хозяев, вирусного литического цикла, адсорбции, прикрепления, инъекции, репликации и сборки, лизиса, величины выхода фага, ускользания от иммунного надзора, иммунной стимуляции, иммунной дезактивации, дисперсии биопленки, устойчивости бактерий к фагу, антибиотической сенсибилизации бактерий, модуляции факторов вирулентности и направленного расщепления или редактирования генома хозяина.

Вариант реализации изобретения 12 представляет собой способ согласно варианту реализации изобретения 10 или 11, в котором создание сконструированного вирусного генома на стадии (b) включает: (1) расщепление in vitro области первого вирусного генома с использованием эндонуклеазы; и (2) сборку по меньшей мере одного фрагмента расщепленного первого вирусного генома по меньшей мере с одной молекулой восстанавливающей нуклеиновой кислоты.

Вариант реализации изобретения 13 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации изобретения 10-12, в котором выполняется по меньшей мере один из следующих элементов: 1) первый вирусный геном выделяют из вирусных частиц, 2) первую вирусную и/или по меньшей мере одну восстанавливающую молекулу нуклеиновой кислоты синтезируют de novo и, необязательно, в котором синтез de novo включает объединение химически синтезированных молекул нуклеиновой кислоты, ПЦР-амплифицированных последовательностей нуклеиновых кислот, расщепленных фрагментов изолированных молекул нуклеиновой кислоты или любой их комбинации, 3) первый вирусный геном и/или по меньшей мере одну восстанавливающую молекулу нуклеиновой кислоты амплифицируют перед расщеплением in vitro или 4) любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 14 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации изобретения 10-13, причем первый вирусный геном составляет по меньшей мере одно из следующего:

1) по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 18 т.п.н., по меньшей мере 25 т.п.н. или по меньшей мере 30 т.п.н.;

2) по меньшей мере 18 т.п.н.;

3) от по меньшей мере 2 т.п.н. до по меньшей мере 4 млн п.н.;

4) от по меньшей мере 18 т.п.н. до по меньшей мере 4 млн п.н.; или

5) по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мер, 10 т.п.н., по меньшей мере 15 т.п.н., по меньшей мере 18 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 25 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 35 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 45 Kb, по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 55 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 65 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 75 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 85 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 125 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 175 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 500 т.п.н., по меньшей мере 600 т.п.н., по меньшей мере 700 т.п.н., по меньшей мере 800 т.п.н., по меньшей мере 900 т.п.н., по меньшей мере 1 млн п.н., по меньшей мере 1,5 млн п.н., по меньшей мере 2 млн п.н., по меньшей мере 2,5 млн п.н., по меньшей мере 3 млн п.н. или по меньшей мере 3,5 млн п.н.

Вариант реализации 15 представляет собой способ соглано любому из вариантов реализации изобретения 10-14, в котором сборку выполняют in vitro и, необязательно, в котором сборку выполняют in vitro с помощью смеси, содержащей: (а) выделенную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'экзонуклеазной активностью, которая необязательно не термостабильна; (b) необязательно краудинг- 41 038595 агент; (с) выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с З'-экзонуклеазной активностью, которая, необязательно, является термостабильной, или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНКполимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную лигазу, которая, необязательно, является термостабильной; (е) смесь дНТФ; и (f) необязательно подходящий буфер в условиях, эффективных для вставки фрагмента в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей сконструированный вирусный геном.

Вариант реализации изобретения 16 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации изобретения 10-14, в котором сборку выполняют in vivo и, необязательно, в которой сборку in vivo выполняют в клетке-хозяине.

Вариант реализации изобретения 17 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации изобретения 10-16, в котором выполняется по меньшей мере один из следующих элементов: 1) эндонуклеаза представляет собой РНК-направляемую нуклеазу; 2) способ дополнительно включает по меньшей мере одну направляющую РНК; 3) РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9, и при этом по меньшей мере одна направляющая РНК содержит: (а) химерную гРНК; или (б) сгРНК и tracrPHK; 4) эндонуклеазу подвергают инактивации теплом или удалению перед сборкой; 5) система расщепления in vitro дополнительно содержит спермидин; 6) способ дополнительно включает трансформацию сконструированного вирусного генома в клетку-хозяина; 7) способ дополнительно включает использование упаковочного набора in vitro для упаковки сконструированного вирусного генома в вирусные частицы; или 8) любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 18 представляет собой модифированный вирус, полученный способом согласно любому из вариантов реализации изобретения 10-17, и необязательно, в котором сконструированный вирус представляет собой сконструированные вирусы согласно любому из вариантов реализации изобретения 1-9.

Вариант реализации изобретения 19 представляет собой набор для сконструированных молекул нуклеиновых кислот, которые являются необязательно молекулами вирусной нуклеиновой кислоты, которые включают: (а) очищенную рекомбинантную РНК-направляемую нуклеазу; (b) выделенную 5'-3'экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью, которая необязательно нетермостабильна; (с) выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью, которая необязательно является термостабильной, или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНКполимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (d) выделенную лигазу, которая необязательно является термостабильной; и необязательно дополнительно включает любое из следующего: 1) краудинг-агент, 2) смесь дНТФ, 3) подходящий буфер, 4) специально разработанные направляющие РНК, 5) специально разработанные синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, предназначенные для использования в качестве вставленного фрагмента ДНК в реакции сборки, 6) компетентные клеткихозяева для трансформации, 7) выделенную вирусную геномную нуклеиновую кислоту или 8) любую их комбинацию.

Вариант реализации изобретения 20 представляет собой способ модификации последовательности нуклеиновой кислоты, включающий: (а) предоставление нуклеиновой кислоты; (b) расщепление in vitro области нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и (с) сборку рекомбинантной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК в расщепленную нуклеиновую кислоту, причем сборку проводят in vitro в одном сосуде со смесью компонентов, включающих: (i) выделенную 5'-3'-экзонуклеазу, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью, которая необязательно не термостабильна; (ii) выделенную невытесняющую ДНК-полимеразу с 3'-экзонуклеазной активностью, которая необязательно является термостабильной, или смесь указанной ДНК-полимеразы со второй ДНКполимеразой, которая не обладает 3'-экзонуклеазной активностью; (iii) изолированную лигазу, которая необязательно является термостабильной; (iv) смесь дНТФ в условиях, которые являются эффективными для вставки фрагмента в расщепленную нуклеиновую кислоту с образованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты и, необязательно, в которой сборка in vitro дополнительно содержит (v) краудинг-агент или (vi) подходящий буфер.

Вариант реализации изобретения 21 представляет собой способ согласно варианту реализации изобретения 20, в котором, по меньшей мере, выполняется один из следующих элементов: 1) РНКнаправляемая нуклеаза представляе собой Cas9 или фермент, полученный из Cas9; 2) РНК-направляемая нуклеаза подвергается инактивации теплом или удалению перед сборкой; 3) способ дополнительно включает трансформацию рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина; 4) нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, выделенную из клетки-хозяина, и необязательно, при этом плазмида составляет по меньшей мере 6 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 15 т.п.н. или по меньшей мере 20 т.п.н. или 5) любую их комбинацию.

Раскрытие во всех его аспектах проиллюстрировано дополнительно в следующих примерах. Однако примеры не ограничивают объем настоящего раскрытия, который определен прилагаемой формулой изобретения. Обсуждение общих способов, приведенных в настоящем документе, предназначено только для иллюстративных целей. Другие альтернативные способы и варианты реализации настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения настоящего описания

- 42 038595 и должны быть включены в сущность и сферу действия настоящей заявки.

Примеры

Пример I.

Модификация вирусного генома in vitro.

т.п.н. дцДНК вирусного генома (номер доступа NC_010326.1) было выделено из вирусных частиц, например, с использованием набора для выделения ДНК фагов Norgen Biotek или любых других способов, известных специалистам в данной области техники (фиг. 2А). Сайт-специфическое расщепление выполняли с использованием РНК-направляемой нуклеазы Cas9 и транскрибируемых in vitro гРНК в двух независимых местах. Нерасщепленная геномная ДНК размером 43 т.п.н. мигрирует значительно меньше, чем самая большая маркерная полоса ДНК (10 т.п.н.). Расщепление линейного генома дает фрагменты трех размеров: ~ 39 т.п.н., ~ 4,3 т.п.н. и ~ 200 п.о. Нацеливающие гРНК использовали в избытке и блокировали фрагмент в 200 п.о. (фиг. 2Б). Фрагмент gp7 из ФКР77 был ПЦР-амплифицирован (фиг. 2В) с использованием праймеров, содержащих 5'-хвосты с гомологией 100 п.о. к областям, непосредственно расположенным в прямом и обратном направлении от сайтов расщепления LUZ19. Метод сборки Gibson Assembly был использован для бесшовной вставки ПЦР-амплифицированного фрагмента gp7 ФКР77 (SEQ ID NO: 8) в расщепленный геном LUZ19 для замены нативной области gp7 (SEQ ID NO: 23) (фиг. 2Г). Наблюдали небольшой фон, так как Cas9-расщепление приводит к двухцепочечному разрыву ДНК с тупыми концами, который не имеет гомологии, необходимой для сборки методом Gibson Assembly in vitro. Отредактированные in vitro геномы трансформировали непосредственно в клеткихозяева, чтобы получить функциональные вирусные частицы (фиг. 2Д). Вставку фрагмента гена ФКР77 в восстановленные вирусы проверяли с использованием ПЦР с праймерами, внутренними и внешними по отношению к области модификации. Неотредактированную геномную ДНК LUZ19 использовали как отрицательный контроль, тогда как все экспериментальные вирусы содержали новый фрагмент гена ФКР7 7 (последние 7 полос).

Эти данные представляют собой пример применения in vitro вирусной инженерии для редактирования генома литического фага P.aeruginosa. Сконструированный фаг, такой как LUZ19, не может быть получен стандартными методами из-за эффектов токсичности в гетерологичных бактериальных хозяевах, таких как E.coli, отсутствия селективных маркеров, подходящих для вирулентных вирусов, и отсутствия уникальных сайтов для стандартных ферментов рестрикции в геноме LUZ19. Поэтому эти данные демонстрируют, как описанный в настоящем документе, способ модификации in vitro позволяет осуществлять прямое и быстрое конструирование других генетически несовместимых вирусных геномов.

Для трансформаций в P.aeruginosa были получены химически компетентные клетки P.aeruginosa, как описано в Irani and Rowe (Irani V.R. & Rowe J.J. BioTechniques 1997, 22, 54-56). По существу, 3 мл стартовой культуры клеток P.Aeruginosa разбавляли в 400 мл свежей LB (среда Лурия-Бертани). Культуру выращивали при 37°C при встряхивании (220 об/мин) до ОП₆₀₀=0,6, если не указано иное. Клетки охлаждали в течение 10 мин на льду, переносили в 500 мл колбу для центрифугирования и осаждали в центрифуге с охлаждением (4°C) при 5000 g в течение 20 мин. Бактериальный осадок промывали 100 мл ледяного 150 ммоль/л MgCl₂ перед разделением на две 50 мл конические пробирки и осаждали при 5000 g в центрифуге с охлаждением (4°C). Клетки промывали еще один раз с использованием 30 мл 150 ммоль/л MgCl2 перед центрифугированием и ресуспендировали в 15 мл холодного 150 ммоль/л MgCl2. Клеточную суспензию инкубировали на льду в течение 1 ч перед центрифугированием при 4°C и ресуспендировали в 4 мл охлажденного 150 ммоль/л MgCl2. Аликвоты в 200 мкл помещали в отдельные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и выдерживали на льду в течение 2 сут. Очищенную ДНК добавляли к каждой аликвоте клеток, кратковременно встряхивали и инкубировали на льду еще 1 ч. Клетки подвергали тепловому шоку при 50°C в течение 3 мин и помещали непосредственно на лед в течение 5 мин до культивирования. Каждую трансформацию добавляли к 4 мл 50°C агара для верхнего слоя LB и помещали на предварительно нагретую чашку Петри с LB. Чашки Петри переворачивали и инкубировали при 37°C, чтобы обеспечить образование бактерий.

Пример II.

Сконструированный вирус с расширенным кругом хозяев.

Большая клиническая библиотека (282 штамма Р.aeruginosa) была подвергнута скринингу на предмет чувствительности к фагам LUZ19 и LKD16 с использованием анализа бляшкообразования в двойном агаровом слое. Шестьдесят шесть штаммов были инфицированы хотя бы одним из двух вирусов, причем 18 и 6 штаммов были инфицированы исключительно LUZ19 и LKD16 соответственно. Таким образом, LUZ19 был выбран в качестве шасси для тестирования генетических элементов LKD16, ответственных за расширение круга хозяев. Сравнительная геномика между двумя вирусами показала, что продукт гена 18 LKD16 (gp18) имел отличную последовательность от гомолога gp18 LUZ19, указывая на то, что он может отвечать за определение круга хозяев. Вирусный геном был выделен из вирусных частиц LUZ19, как описано выше. Сайтспецифическое расщепление проводили с использованием РНК-зависимой нуклеазы и транскрибируемых in vitro гРНК для экспрессии гена gp18 LUG19. Gp18 из LKD16 был амплифицирован ПЦР с гомологичными концами LUZ19 для интеграции. Метод сборки Gibson Assembly использова

- 43 038595 ли для бесшовной вставки ПЦР-амплифицированного gp18 LKD16 (SEQ ID NO: 7) в расщепленный геном LUZ19, чтобы заменить нативную последовательность gp18 (SEQ ID NO: 50). Сконструированные in vitro геномы трансформировали непосредственно в клетки-хозяева, чтобы получить функциональные вирусные частицы. Сконструированный вирус LUZ19, содержащий ген gp18 LKD16, смог заразить все штаммы, обычно инфицированные фагом LUZ19, а также 3 штамма, ранее инфицированные только LKD16, демонстрируя расширение круга хозяев (фиг. 3Б и 6Б). Это демонстрирует, что gp18 является генетическим элементом, ответственным за различающийся круг хозяев LKD16, и что сконструированный вирус LUZ19, несущий данный ген, лучше способен реплицировать в большем количестве штаммов хозяина.

Эти данные демонстрируют реализацию способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, в отношении генетически неприемлемого вирусного генома, который приводит к улучшению вирусного свойства расширенного круга хозяев. Способность рационально модифицировать бактериофаг с расширенным кругом хозяев является большой ценностью при разработке вирусов для уничтожения бактерий.

Пример III.

Сконструированный вирус с кругом хозяев рода вирусов LUZ19 и/или производное LUZ19 использовали в качестве исходного материала для экспериментов по эволюции или коинфекции для определения целей для объединения круга хозяев рода вирусов ΦKMV в один репрезентативный вирус. Эксперименты по котрансформации или коинфекции выполняли либо в пермиссивном (РАО1К), либо в непермиссивном (устойчивом) хозяине (РА7410 или РА7649) (фиг. 4А). Как коинфекцию, так и котрансформацию выполняли в присутствии LKD16 или ΦKMV соответственно. Круг хозяев тестировали с применением анализа бляшкообразования в двойном агаровом слое на указанных бактериальных штаммах. После скрининга на расширенный круг хозяев в интересующем штамме усовершенствованный фаг пассировали 3-5 раз альтернативно через пермиссивные и селективные штаммы (штамм, который инфицирован только LUZ19-PA7632). Усовершенствованный фаг амплифицировали в PAOIK, гДНК очищали и секвенировали. Сравнительную геномику между LUZ19 и усовершенствованным LUZ19, способным заражать штаммы, ранее чувствительные только к LKD16 или ΦKMV, использовали для определения точечной мутации, ответственной за расширение круга хозяев (фиг. 4Б).

Большую клиническую библиотеку (282 штамма Р.aeruginosa) подвергали скринингу на предмет восприимчивости к роду вирусов ΦKMV с использованием анализа бляшкообразования в двойном агаровом слое. Три фага (LUZ19, LKD16 и ΦKMV) отображали различающийся круг хозяев и были способны заразить 67 штаммов, при этом LUZ19 заразил большинство клинических штаммов (фиг. 4В). Шесть клинических штаммов (РА7245, РА7255, РА7427, РА7503, РА7686 и РА7410) восприимчивы только к LKD16, и один клинический штамм восприимчив только к ΦKMV (PA7649). Таким образом, LUZ19 был выбран в качестве шасси для экспериментов по эволюции/коинфекции/котрансформации для получения варианта, который способен инфицировать все клинические штаммы, чувствительные к роду ΦKMV. Сравнительной геномикой показано, что для того, чтобы LUZ19 заразил штаммы, восприимчивые только к LKD16 или ΦKMV, необходимо было указать несколько точечных мутаций: (i) gp13 C17Y (положение 50 SEQ ID NO: 1) необходимо для инфицирования РА7427; (ii) gp18 D36Y (положение 106 SEQ ID NO: 50) необходимо для инфицирования РА7245, РА7503 и РА7686; gp38 D82G и 183S (положение 245 и 247248 SEQ ID NO: 2 соответственно) позволяет инфицировать РА7410 и РА7649; (iv) gp40 N253D (положение 757 SEQ ID NO: 3) позволяет инфицировать РА7255 (фиг. 4Б). Итеративное конструирование вышеупомянутых мутаций в шасси LUZ19 с использованием способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, дало LUZ19 с широким кругом хозяев (ШКХ-LUZ19), способному заражать все клинические штаммы, восприимчивые к фактору рода ФКМВ (фиг. 4В).

Эти данные представляют собой пример использования способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, для объединения круга хозяев рода вируса в один вирусный геном путем первой идентификации генетических мутаций, ответственных за различия в круге хозяев после эволюционных экспериментов, скрининга, секвенирования, сравнительной геномики, и любой их комбинации.

Пример IV.

Улучшенная вирусная репликация улучшает раннее разрушение биопленки.

В другом примере вирусная эволюция и сравнительная геномика показали, что усовершенстованный фаг LUZ19 с мутацией L55 в пределах хвостового трубчатого белка В (Gp34) реплицируется с большей скоростью из-за увеличенного выхода фага (фиг. 5Б). Чтобы подтвердить, что мутация Gp34 L55Δ улучшила вирусные свойства, вирусный геном LUZ19 выделяли из вирусных частиц. Сайтспецифическое расщепление выполняли с использованием РНК-зависимой нуклеазы и транскрибируемых in vitro гРНК для удаления гена gp34 (SEQ ID NO: 4). Ген gp34 L55Δ, который несет делецию кодона лейцина в аминокислотном положении 55 (Gp34 L55Δ, положение 163-165 SEQ ID NO:4), ПЦРамплифицировали из усовершенствованного фага LUZ19. Метод сборки Gibson Assembly использовали для вставки ПЦР-амплифицированного гена gp34 L55Δ в расщепленный геном LUZ19. Трансформированные in vitro геномы трансформировали непосредственно в клетки-хозяева, чтобы получить функцио

- 44 038595 нальные вирусные частицы.

Сконструированный вирус LUZ19, содержащий Gp34 L55Δ, способен рассеять и лизировать бактерии. Анализ бляшкообразования в двойном агаровом слое использовали для того, чтобы показать, что у фага LUZ19, несущего мутацию gp34 L55Δ5 (фаг*), была большая область очистки (прозрачное пятно), чем LUZ19 дикого типа. Были сделаны снимки и области очистки измеряли в течение двух суток (фиг. 5Б). Расширяющийся диаметр лизиса указывает на то, что вирусы, несущие мутации Gp34 L55Δ, лучше способны рассеивать и лизировать бактерии. Анализом биопленки с окрашиванием кристаллическим фиолетовым измеряют накопление биопленки в виде измерения включения кристаллического фиолетового (фиг. 5В). Образцы, обработанные вирусами, содержащими мутации gp34 L55Δ, имели значительное уменьшение биопленки по сравнению с вирусами с геном gp34 дикого типа. На иллюстрации показано расположение мутации gp34 (звездочка) по сравнению с геномом LUZ19 дикого типа (фиг. 5Г). Стандартные анализы, известные в данной области техники, должны были измерять адсорбцию вируса, латентный период и величину выхода фага как у дикого типа, так и мутантов gp34 L55Δ. Эти данные указывают на то, что вирусы, содержащие мутацию gp34 L55Δ, имели значительно увеличенный выход фага (фиг. 5Д).

Эти данные обеспечивают пример использования способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, для создания вируса с улучшенными вирусными свойствами повышенного бактериального лизиса, выхода фага, репликации и раннего разрушения биопленки.

Пример V.

Вирус, полученный путем итеративного конструирования, с ранним разрушением биопленки и расширенным кругом хозяев.

Расширенный круг хозяев LUZ19_LKD16gp18 рекомбинантного вирусного генома, созданный в примере II, был выделен из вирусных частиц. Для удаления gp34 (SEQ ID NO: 4) с использованием РНКзависимой нуклеазы и транскрибируемых in vitro гРНК выполняли сайтспецифическое расщепление. Мутацию gp34 ΔLeu55, повышающую литическую активность, (положение 163-165 SEQ ID NO: 4), описанную в примере IV, затем ПЦР-амплифицировали и собирали в расщепленный вирусный геном LUZ19_LKD16gp18 с применением метода сборки Gibson Assembly. Геномы, полученные путем итеративного конструирования in vitro, трансформировали непосредственно в клетки-хозяева для получения функциональных вирусных частиц, т.е. сконструированный вирус LUZ19, содержащий как ген gp18 LKD16, так и мутацию gp34 ΔLeu55 (LUZ19* K ·. .-^).

Вирус LUZ19*_LKD16gp18 анализировали на улучшенные вирусные свойства, используя анализы бляшкообразования в двойном агаровом слое, биопленки и анализы на прикрепление кератиноцитов человека in vitro. На фиг. 6Г показано, что у LUZ19*_LKDi_6gpi₈ увеличен круг хозяев. LUZ19*_LKDi_6gpi₈ по сравнению с нативным LUZ19 для способности разрушать предварительно сформированные МЛР биопленки P.aeruginosa. В частности, LUZ19*_LKD16gp18 и LUZ19 дикого типа инкубировали с биопленкой P.aeruginosa, и разрушение измеряли с использованием кристаллического фиолетового. На фиг. 6Д показано, что LUZ19*LKD16gp18 обладает повышенной способностью разрушать предварительно сформированные МЛР биопленки P.aeruginosa по сравнению с LUZ19 дикого типа. Вирус LUZ19*_LKD16gp18 анализировали на эффективность фаговой терапии против бактерий, прикрепленных к кератиноцитам человека. В частности, P.aeruginosa прикрепляли к монослою клеток НаСаТ. Затем клетки инкубировали с LUZ19*_LKD16gp18 или LUZ19 дикого типа. Результаты показали, что фаг LUZ19*_LKD16gp18 лучше способен устранять множественную лекарственную устойчивость (IVIDR) Клетки P.aeruginosa прикрепляли к кератиноцитам человека (см. фиг. 6Е).

Эти данные приводят пример того, как способ конструирования in vitro, описанный в настоящем документе, использовали в системе для итеративного конструирования бактериофага с несколькими независимыми улучшенными вирусными свойствами, такими как расширенный круг хозяев и увеличенный выход фага. Важно отметить, что данные этапы конструирования не могут быть выполнены как напрямую, так и с использованием стандартных методов. Кроме того, эти данные демонстрируют, что способ конструирования in vitro, описанный в настоящем документе, использовали последовательно в итерационных циклах конструирования, что является важным свойством для применений в синтетической биологии.

Пример VI.

Вирусы, полученные путем итеративного конструирования, с биофильм-диспергирующей полезной нагрузкой, и расширенный круг хозяев, охватывающий полный вирусный род.

Любые экзополисахариды (ЭПС) деполимеразы или фенол-растворимые модулины (PSM) клонировали в LUZ19 путем замены gp49 (SEQ ID NO: 25) с использованием способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, для определения их способности диспергировать зрелую биопленку (фиг. 7). Чтобы сконструировать LUZ19 и WHR LUZ19 для экспрессии внеклеточной деполимеразы или поверхностно-активных полипептидов, gp49 (SEQ ID NO: 25) LUZ19 или WHR LUZ19 удаляли путем расщепления с использованием РНК-зависимой нуклеазы, в этом случае Cas9 и in vitro транскрибируемые гРНК и затем заменяли на ген интереса (ГИ), фланкированный основным промотором капсида P_gp32

- 45 038595 (SEQ ID NO: 21) и терминатором T_gp32 (SEQ ID NO: 22) с использованием метода сборки Gibson Assembly (фиг. 7А и 7В). В случае LUZ19 дикого типа, ГИ представляют собой ЭПС-деполимеразы (Рр15gp44 хвостовой шип gp44 из Φ15 Pseudomonas pudita (SEQ ID NO: 14); NTUgp34 - хвостовой шип gp34 из фага NTU Klebsiella pneumoniae (SEQ ID NO: 13); LKAlgp49 - хвостовой шип gp49 фага из LKA1 P.aeruginosa (SEQ ID NO: 12)), поверхностно-активные фенол-растворимые модулины из Staphylococcus epidermidis (PSMa, SEQ ID NO: 18) и Staphylococcus aureus (PSMa3 (SEQ ID NO: 16) и PSMb2 (SEQ ID NO: 17)) и DspB-сурфактин из Aggregatibacter actinomycetemcomitans (SEQ ID NO: 15) (фиг. 7Б). В случае ШКХLUZ19, ГИ представлял собой ЭПС-деполимеразу Pp15gp44 (SEQ ID NO: 14) и сурфактин SePSMa (SEQ ID NO:18) (фиг. 7Г). Сконструированный фаг амплифицировали в соответствующей клетке-хозяина, выделяли и проверяли путем секвенирования.

Способность сконструированного фага к диспергированию зрелой биопленки была протестирована на 24-часовой биопленке, выращенной в устройстве МВЕС, с использованием 100 фагов на лунку в течение 3 ч. Вкратце, ночные культуры P.aeruginosa разбавляли (1:100) в минимальной среде М63, дополненной сульфатом магния (1 мМ), глюкозой (0,2%) и казаминокислотами (0,5%), а затем добавляли в стерильные микротитрационные планшеты (150 мкл на лунку). Крышку с заглушками вставляли в планшет для микротитрования. После 24 ч инкубации при 37°C крышку с заглушками перемещали на микротитрационные планшеты (150 мкл на лунку). Крышку с заглушками вставляли в планшет для микротитрования. После 24 ч инкубации при 37°C крышку с заглушками перемещали на микротитрационный планшет, содержащий 160 мкл полной MG63, содержащей 100 фагов на лунку. После 3 ч инкубации при 37°C крышку с заглушками промывали 3 раза в воде, сушили и окрашивали 200 мкл 0,5% кристаллического фиолетового. Затем планшеты промывали водой для удаления несвязанного кристаллического фиолетового и сушили. Краситель растворяли в 200 мкл 30% уксусной кислоты и измеряли оптическую плотность при ОП=550 нм.

DspB, который является поверхностно активным против биопленок Е.coli, служил в качестве отрицательного контроля, поскольку он не имеет активности против P.aeruginosa. Две полезные нагрузки (Рр15gp44 и SePSMa) показали заметную активность против биопленки (фиг. 7Б). Примечательно, что PSM, которые являются сурфактинами с известной антибиопленочной активностью у грамположительных бактерий, никогда ранее не демонстрировали, что они диспергируют биопленку P.aeruginosa. Данные полезные нагрузки были сконструированы в ШКХ-LUZ19, чтобы определить, может ли фаг с широким кругом хозяев быть дополнительно модифицирован с целью придания ему способности диспергировать биопленку. Результаты показывают, что ШКХ-LUZ19, кодирующие Рр15gp44 или SePSMa, поддерживают их биофильм-диспергирующую активность (фиг. 7Г) и способность инфицировать все клинические штаммы, восприимчивые к роду вирусов O-KMV (фиг. 7Д, 7Е).

Эти данные представляют собой пример того, как способ конструирования in vitro, описанный в настоящем документе, может использоваться в системе для итеративного конструирования бактериофага с несколькими независимыми улучшенными вирусными свойствами, такими как неограничивающие свойства дисперсии биопленки и круг хозяев.

Пример VII.

Сконструированные вирусы, экспрессирующие антибиотическую сенсибилизирующую полезную нагрузку.

С использованием способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, LUZ19 был сконструирован для экспрессии лизинов из оцРНК-вирусов PRR1 и MS2. Лизины как из PRR1 (SEQ ID NO: 20), так и из MS2 (SEQ ID NO: 19) оцРНК-фага были встроены в локус gp49 LUZ19 (SEQ ID NO: 25), фланкированный основным капсидным промотором Pgp32 (SEQ ID NO: 21) и терминатором Tgp32 (SEQ ID NO: 22), чтобы определить их способность ингибировать появление бактерий, устойчивых к фагу (фиг. 8А). Эти лизины ингибируют образование новых клеточных стенок путем связывания и инактивации ферментов, важных для синтеза клеточной стенки, и предположительно сенсибилизируют бактерии к другим антимикробным препаратам, особенно к нацеленным на клеточные стенки антибиотикам, таким как карбенициллин.

Конструкт получали, как описано выше, с использованием способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе. Сконструированный фаг амплифицировали в соответствующей клеткехозяина, выделяли и проверяли путем секвенирования. Способность сконструированного фага ингибировать появление бактерий, устойчивых к фаговой терапии, в присутствии карбенициллина при 1/5 х МИК тестировали в стандартном анализе зависимости время - летальное действие (фиг. 8Б, 8В). Результаты показывают, что сконструированные LUZ19, экспрессирующие лизины из оцРНК фага в сочетании с карбенициллином в субингибирующих концентрациях (1/5 х МИК) предотвращают повторный рост бактерий после фаговой терапии.

Эти данные представляют собой пример использования способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, для создания вируса с улучшенными вирусными свойствами, в частности в данном случае, предотвращения развития устойчивости к фагу у бактерий.

- 46 038595

Пример VIII.

Сконструированный вирус, экспрессирующий видоспецифическую противомикробную белковую нагрузку.

Используя способ конструирования in vitro, описанный в настоящем документе, LUZ19 был сконструирован для экспрессии антимикробного белка PyoS5, продуцируемого P.aeruginosa. Бактериоцин PyoS5 является видоспецифическим антимикробным белком, продуцируемым одним штаммом P.aeruginosa, чтобы препятствовать росту конкурирующих штаммов P.aeruginosa. ГДНК штамма РА01 P.aeruginosa использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации pyoS5 (SEQ ID NO: б) до клонирования в локус gp49 LUZ19 (SEQ ID NO: 25), фланкированный основным промотором капсида P_gp32 (SEQ ID NO: 21) и терминатором T_gp32 (SEQ ID NO: 22) (фиг. 9А). PyoS5 связывается с широко диспергированным пиохелиновым рецептором FptA перед конформационными изменениями для создания пор в мембране P.aeruginosa.

LUZ19+pyoS5 был создан, как описано выше, с использованием способа конструирования in vitro, описанный в настоящем документе. Сконструированный фаг амплифицировали внутри восприимчивого хозяина РА01, выделяли и проверяли путем секвенирования. Бактериальный штамм РА7416 выбирали для анализа, потому что лабораторный штамм РА01, как известно, устойчив к PyoS5, однако в анализе in silico показано, что штамм РА7416 МЛР P.aeruginosa был восприимчивым к фагу LUZ19 и кодировал PyoS5-рецептор FptA.

Способность фага ингибировать появление бактерий РА7416, устойчивых к фаговой терапии, тестировали в стандартном анализе зависимости время - летальное действие. Результаты показывают, что в то время как LUZ19 дикого типа первоначально ингибирует рост РА7416, бактерии быстро становятся устойчивыми, а повторный рост происходит через 8-12 часов (фиг. 9Б). Однако сконструированный UJZ/9+pyoS5 ингибирует повторный рост бактерий РА7416 на более чем 24 ч после обработки фагом (фиг. 9В, 9Г).

Эти данные представляют собой пример использования способа конструирования in vitro, описанного в настоящем документе, для получения вируса с улучшенными вирусными свойствами, в частности в данном случае, предотвращения развития устойчивости к фагу у бактерий.

Пример IX.

Система итеративного конструирования бактериофага для создания антимикробного продукта.

Используя описанный в настоящем документе способ конструирования in vitro, геномы бактериофагов могут быть быстро сконструированы без обширной генетической манипуляции штаммом хозяина. Объединение вирусных мутационных исследований и методов селекции, хорошо известных специалистам в данной области техники, с полным секвенированием генома, сравнительной геномикой и раскрытом в настоящем изобретении способом конструирования in vitro создает новую и улучшенную систему для разработки новых и улучшенных антимикробных препаратов. Система основана на итеративном улучшении 1, 2 или более 2 различных свойств в одном вирусном шасси для создания антимикробного препарата на основе вирусов. Последовательная очистка и редактирование генома LUZ19 для улучшения отдельных вирусных свойств были раскрыты (фиг. 6, 7 и 10), однако данный способ можно распространить на множество других бактериофагов Р.aeruginosa или другого бактериофага, заражающего любые другие штаммы или виды бактерии. Кроме того, данный способ можно использовать для улучшения свойств нескольких отдельных бактериофагов, заражающих одни и те же виды бактерий, для создания превосходного коктейля бактериофагов, предотвращающего или лечащего бактериальные инфекции, заражения или изменения микробиомы.

Эти данные демонстрируют, как конструирование in vitro в сочетании с секвенированием генома, сравнительной геномикой и вирусными мутационными/селекционными исследованиями могут выполнять последовательно для достижения поэтапных улучшений или инженерных изменений для включения улучшенных вирусных свойств, представляющих интерес (фиг. 10).

Пример X.

Способы.

Гидовые РНК (гРНК) синтезировали и очищали с использованием коммерчески доступного набора для транскрипции in vitro, такого как набор MEGAshortscript T7 kit (Thermo Fisher). Гидовые РНК были разработаны с использованием методов, хорошо известных в данной области техники (фиг. 15).

Разбавьте in vitro транскрибируемые гРНК на рабочий материал 500 нг/мкл.

Реакции сборки без очищенной РНК-направляемой нуклеазы, такой как Cas9. Очищенный Cas9 (SEQ ID NO: 31) был получен из экспрессирующей плазмиды, содержащей последовательность генов, кодирующую His-меченый Cas9 (SEQ ID NO: 27) и очищающей ее с помощью известных способов никель-аффинной очистки. Необязательно используйте гРНК, которая сначала разрезает самую внутреннюю часть генома для итеративных расщеплений.

Полная реакционная смесь:

мкл:

10Х Cas9 буфер* * 4;

ммоль/л MgCl₂ 8;

- 47 038595

100 ммоль/л спермидин 4;

гРНК1 2;

гРНК2 2;

Фермент Cas9 (0,45 мг/мл) 8 (общее количество);

гДНК X (общая масса 2 мкг);

дистилированная Н₂О X (до общего объема 40 мкл).

* Полная реакционная смесь может быть использована на одном этапе для одновременного вырезания нескольких сайтов (совместное расщепление), однако это может привести к низкой эффективности вырезания вирусной гДНК. Реакции совместного расщепления выполняют на льду перед добавлением Cas9 и инкубацией при 37°C в течение 30 мин. Сконструированная 2-стадийная (или более) реакция также может быть выполнена, что обеспечивает более полное расщепление (описано ниже).

**10х Cas9 буфер содержит 200 ммоль/л HEPES рН 7.4, 1.5М KCl, 5 ммоль/л DTT и 1 ммоль/л EDTA рН8.

стадия реакции сборки и инкубация при комнатной температуре в течение 5 мин.

Реакционная смесь 1 стадии:

мкл:

10Х Cas9 буфер 4;

ммоль/л MgCl₂ 8;

100 ммоль/л спермидина 4;

гРНК1 2;

гДНК (общее количество 2 мкг);

дистилированная Н₂О X (до общего объема 36 мкл).

Инкубируйте на льду в течение 10 мин.

Инкубируйте при 37°C в течение 2 мин.

Добавьте 4 мкл фермента Cas9 (0,45 мг/мл). Инкубируйте при 37°C в течение 30 мин.

стадия реакции, добавление второй гРНК и дополнительного фермента Cas9.

Реакционная смесь 2 стадии:

мкл:

Реакционная стадия 1 стадии 40;

гРНК2 2;

Фермент Cas9 (0,45 мг/мл) 4;

10Х Cas9 буфер 1;

дистиллированная H2O 3 (общий объем 50 мкл).

Инкубируйте реакцию 2 стадии при 37°C в течение 30 мин. Дополнительные шаги могут быть добавлены для расщепления генома в более чем 2 местах.

Инактивируйте фермент Cas9 путем инкубации при 80°С в течение 10 мин. Необязательно проведите очистку с использованием фенольно-хлороформной экстракции (повышает эффективность сборки фрагментов в сборке методом Gibson Assembly) или других способов инактивации, дезактивации или очистки, хорошо известных в данной области техники.

Исследуйте 5 мкл образца на агарозном геле для проверки правильности разрезания.

Для сборки in vitro с использованием метода сборки Gibson Assembly соответствующую концентрацию продуктов расщепления и in vitro сконструированной вставки использовали в соответствии с протоколом метода сборки Gibson Assembly NEB.

После сборки in vitro, возможно, трансформируют в клетки-хозяева для амплификации сконструированного генома, части генома или восстановления сконструированного вируса.

Пример XI.

Конструирование фага М13 Е.coli.

Используя описанный в настоящем документе способ конструирования in vitro, был сконструирован вирус, заражающий Escherichia coli, для экспрессии флуоресцентного репортера паприка (SEQ ID NO: 5). На фиг. 11А показана схема подхода конструирования in vitro для включения гена флуоресцентного белка паприка в геном фага М13 Е.coli. Этот процесс конструирования был разработан для создания лизогенного фага, экспрессирующего флуоресцентный репортер, который будет представлять собой улучшенное вирусное свойство, поскольку аналогичные вирусы использовали в качестве диагностики. Вирусный геном М13 (номер доступа Х02513) был выделен из вирусных частиц. Поскольку экспериментальная конструкция включает использование двух гРНК, функциональность каждой отдельной гРНК была впервые подтверждена в отдельных реакциях Cas9-расщепления in vitro (фиг. 11Б). Зная, что каждая гРНК была функциональной, сайт-специфическое расщепление выполняли с использованием РНКзависимой нуклеазы и обеих in vitro транскрибируемых гРНК (фиг. 11В). Флуоресцентный репортерный ген паприка (SEQ ID NO: 29) ПЦР-амплифицировали (фиг. 11Г) с использованием праймеров, которые добавляли 5'- и 3'-последовательностям, гомологичным последовательностям, фланкирующим ген LacZa, который был выделен из генома М13 с использованием расщепления РНК-зависимой нуклеазой, например Cas9. Метод сборки Gibson Assembly использовали для бесшовной вставки ПЦР-амплифицирован

- 48 038595 ного гена паприка в расщепленный геном М13, заменяя ген LacZa (SEQ ID NO: 28). Сконструированные геномы трансформировали непосредственно в хозяина Е.coli для получения функциональных вирусных частиц, кодирующих ген паприка. Сконструированный фаг оценивали по его способности образовывать бляшки у Е.coli (фиг. 11Д). Вирусную ДНК выделяли из бляшек и ПЦР-амплифицировали для подтверждения присутствия вставленного гена паприка (фиг. 11Е). Присутствие и функции рекомбинантного белка паприка подтвердили при помощи флуоресцентной визуализации (фиг. 11Ж).

Эти данные демонстрируют успешное использование описанного в настоящем документе способа конструирования in vitro для создания репортерного гена в геноме фага Е.coli. Демонстрируя, что раскрываемый способ можно расширить на другой род вирусов, включая тот, который заражает другой род бактерий.

Пример XII.

Конструирование фага X Е.coli.

Используя описанный в настоящем документе способ конструирования in vitro, был отредактирован второй вирус, заражающий Escherichia coli. На фиг. 12А показана схема подхода конструирования in vitro для удаления гена ell (SEQ ID NO: 30) из выделенного генома фага X (доступ NC_001416.1). Данный технический процесс был разработан для создания конститутивно литического вируса, который будет представлять собой улучшенное вирусное свойство. Вирусный геном λ был выделен из вирусных частиц. Поскольку экспериментальная конструкция предполагает использование двух гРНК, функциональность каждой отдельной гРНК была впервые подтверждена в отдельных реакциях Cas9-расщепления in vitro (фиг. 12Б). Зная, что каждая гРНК была функциональной, сайт-специфическое расщепление проводили с использованием РНК-зависимой нуклеазы и обеих in vitro транскрибируемых гРНК (фиг. 12В). Две синтезированные одноцепочечные молекулы ДНК были отожжены in vitro для получения шаблона для восстановления двухцепочечной ДНК (SEQ ID NO: 9), содержащего 5'- и 3'-последовательности, гомологичные последовательностям, фланкирующим Cas9-направленные вырезанные сайты в выделенный вирусный геном λ. Метод сборки Gibson Assembly использовали для бесшовной вставки ПЦРамплифицированной восстанавливающией матрицы в расщепленный геном λ. Затем сконструированные геномы были упакованы in vitro с использованием набора Maxplax lambda packaging extraction kit из Epicentre в соответствии со способом изготовителя (фиг. 12Г). После in vitro упаковки сконструированные геномы λ были извлечены из анализа бляшкообразования с двойным агаровым слоем с использованием рекомендованных изготовителем клеток-хозяев Е.coli. Было определено, что сконструированный фаг функционирует на основе его способности образовывать бляшки у E.coli. Вирусную ДНК выделяли из образовавшихся бляшек и ПЦР-амплифицировали, чтобы подтвердить отсутствие гена ell (фиг. 12Д).

Эти данные демонстрируют успешное использование описанного в настоящем документе способа конструирования in vitro для удаления нежелательного гена из генома фага Е.coli. Эти данные также обеспечивают пример упаковки сконструированных вирусных геномов in vitro, что повышает эффективность восстановления вируса и обеспечивает альтернативу прямой трансформации в клетку-хозяина. Кроме того, эти данные обеспечивают пример использования отожженных in vitro синтезированных олигонуклеотидов в качестве вставки для конструирования. Кроме того, эти данные являются еще одним примером использования этого подхода для конструирования генома фага, чтобы получить улучшенное вирусное свойство, а именно конститутивно литический фенотип. Наконец, эти данные показывают, что второй род вируса, заражающий Е.coli, может быть сконструирован с использованием описанного в настоящем документе способа конструирования in vitro.

Пример XIII.

Коррекция ошибок ЦМВ человека.

Используя раскрытый в настоящем документе способ конструирования in vitro, была отредактирована часть человеческого вируса. На фиг. 13А показана схема подхода конструирования in vitro, используемого для исправления ошибок. 18 т.п.н. часть ~230 т.п.н. вирусного генома ЦМВ человека содержалась в пределах плазмиды, реплицирующейся в Е.coli. Настоящая часть генома ЦМВ человека (SEQ ID NO: 10) содержала начало вирусного генома и несла мутантный аллель RL13 (SEQ ID NO: 33). Вместе фрагмент ЦМВ человека и плазмида Е.coli имели размер примерно 28 т.п.н., что превышает спецификации большинства современных методов коррекции ошибок. Для исправления ошибок плазмиду 28 т.п.н. выделяли из Е.coli и проводили сайт-специфическое расщепление с использованием РНК-зависимой нуклеазы и двух in vitro транскрибируемых гРНК (фиг. 13Б). Cas9-опосредованное расщеплением вырезали область гена RL13 непосредственно в прямом и обратном направлении от сайта мутации. Исправленная область гена RL13 (SEQ ID NO: 32) была синтезирована и ПЦР-амплифицирована с дополнительными 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями, гомологичными областям, граничащим с каждым сайтом расщепления, специфичным для РНК (фиг. 13В). Метод сборки Gibson Assembly использовали для бесшовной вставки синтезированной восстанавливающей матрицы в расщепленную плазмиду. Исправленный RL13-содержащий фрагмент ЦМВ человека (SEQ ID NO: 11), содержащийся внутри плазмиды, затем трансформировали в Е.coli и восстанавливали на антибиотикосодержащих питательных средах. Колонии Е.coli подвергали скринингу с помощью ПЦР для подтверждения наличия исправленного

- 49 038595 гена RL13, который содержал дополнительную последовательность по сравнению с геном RL13, содержащим ошибки, что позволяет отличать его от гена RL13, содержащего ошибки (фиг. 13Г). Геномный фрагмент с исправленной ошибкой затем амплифицировали в Е.coli с использованием стандартных методик для последующего использования в обратных приложениях.

Эти данные демонстрируют успешное использование описанного в настоящем документе способа конструирования in vitro для конструирования генов из генома вируса человека и дополнительно обеспечивают способ использования синтезированной ДНК в качестве восстанавливающей матрицы в реакции сборки in vitro. Эти данные также демонстрируют использование этого способа конструирования in vitro для коррекции ошибок ДНК или плазмид, которые слишком велики для стандартных методов коррекции ошибок. Стандартная методика коррекции ошибок имеет ограничение по размеру около 5 т.п.н. и основана на ПЦР, которое по своей природе может создавать более нежелательные ошибки. Представленный в настоящем документе способ конструирования in vitro не зависит от ПЦР-амплификации всей или даже большой части плазмиды или вирусного генома и поэтому поддается применению при исправлении ошибок последовательностей, превышающих 5 т.п.н.

Пример XIV.

Быстрая идентификация терминально избыточных вирусных концов.

Описанный в настоящем документе способ расщепления in vitro также может быть адаптирован для идентификации точных концов терминально избыточных вирусных геномов. На фиг. 14 показана схема подхода расщепления in vitro, который использовался для определения концов фаговых геномов LBL3 и 14-1. LBL3 и 14-1 (номер доступа NC_011703.1) фаговую геномную ДНК очищали от вирусных частиц (фиг. 14А). Секвенирование нового поколения выполняли с использованием платформы MiSeq или PacBio, а затем при помощи автоматического слияния высококачественных считываний ДНК в более длинные сборки для восстановления исходной последовательности (фиг. 14Б). Как правило, программное обеспечение автоматической сборки неправильно собирает вирусные или бактериофаговые геномы в круговые контиги и размешает ПТП терминально повторяющихся геномов во внутреннюю область вирусной последовательности. Прогнозирование in silico физических концов генома выполняют на основе идентификации областей секвенирования двойного охвата и результатов поиска BLAST, которые соответствуют близкородственному терминально повторяющемуся геному (фиг. 14В). Данные прогнозируемые концы были подтверждены расщеплением эндонуклеазой Cas9. После инактивации Cas9 фрагменты ДНК, соответствующие геномным физическим концам, очищали и секвенировали (фиг. 14Г). Эти результаты секвенирования привели к точной сборке генома на основе истинных физических концевых последовательностей (фиг. 14Д).

Одной из самых больших технических проблем, связанных с секвенированием генома фага, является точное отображение геномных физических концов из-за их повторяющегося характера. Эти сегменты могут простираться от 4-14 п.о. в циклически перегруппированных геномах (например, большинство фагов Mycobacterium и Propionibacterium acnes) до нескольких сотен пар оснований в терминально повторяющихся геномах (например, ΦKMV-подобные, PBl-подобные и N4-подобные фаговые роды Р.aeruginosa) и даже до нескольких тысяч пар оснований (например, Т5 и DTR E.coli). Сопоставление повторяющихся концов (или ПТП - прямых терминальных повторов) в настоящее время выполняется комбинацией глубокого анализа последовательностей (для идентификации фрагментов ДНК с двойным покрытием), праймер-опосредованной прогулкой (секвенирование по Сэнгеру), идентификацией основных разрывов ДНК и анализом рестрикционных эндонуклеаз. Однако каждый из этих подходов часто ограничен в использовании или безрезультативный: I) плохо определенные двойные сиквенсы границы охвата двойного упорядочения в данных NGS (секвенирования следующего поколения); (II) считывание праймер-опосредованной прогулки с прохождением через конкатэмеры ПТП, дающая неубедительные результаты; (III) низкая частота мест рестрикции вблизи фаговых концов или обструкция рестрикционных участков вследствие модификаций ДНК, таких как метилирование. Использование направленного Cas9-расщепления ДНК фага в определенных положениях устраняет необходимость в ненадежных или громоздких анализах или процедурах и значительно упрощает идентификацию фаговых геномных физических концов. Такой подход имеет потенциал для точного отображения концов уже секвенированных фаговых геномов (как показано на примере картирования ПТП LBL3 и 14-1), а также для быстрой идентификации ПТП новых идентифицированных вирусов.

Использование направленного Cas9-расщепления в пределах описанного в настоящем документе способа конструирования in vitro для сопоставления физических концов терминально повторяющихся фаговых геномов представляет собой явное преимущество по сравнению с существующими подходами, поскольку оно не зависит от тонких изменений в охвате секвенирования и может выполняться независимо от образования конкатемера. Кроме того, активность Cas9 менее чувствительна к модификациям ДНК, чем многие рестрикционные ферменты.

Эти данные показывают успешное применение РНК-направляемого Cas9-расщепления in vitro, что дает возможность идентифицировать правильное положение последовательности фагового генома. Эта информация затем может быть использована для разработки нижерасположенных подходов модификации in vitro для конструирования этих фагов, что было ранее невозможным из-за отсутствия истинных

- 50 038595 границ генома.

Пример XV.

Способ конструирования со сборкой in vivo.

Настоящее раскрытие обеспечивает способ in vitro сайт-специфического расщепления очищенной вирусной нуклеиновой кислоты с использованием РНК-направляемой нуклеазы; и сборку сконструированной нуклеиновой кислоты путем вставки фрагмента ДНК или РНК в расщепленную вирусную нуклеиновую кислоту. Хотя рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть собрана целиком в условиях in vitro с использованием очищенных ферментов, как описано в настоящем документе, этот процесс также может быть осуществлен с использованием естественных или сконструированных рекомбинантных сигнальных путей в чувствительном штамме хозяина. Трансформация очищенных и обработанных in vitro вирусных геномов вместе с фрагментом вставки восстановления, содержащим концевые области гомологии, достаточна для того, чтобы некоторые клетки-хозяева собирали рекомбинантный вирусный геном in vivo. Фрагменты вставки восстановления могут быть синтезированы или амплифицированы стандартными методами, известными в данной области техники, или могут находиться внутри плазмид, стабильно реплицирующихся в выбранной клетке-хозяине. Данный способ, вероятно, будет иметь более низкую эффективность по сравнению со сборкой in vitro из-за клеток-хозяев, имеющих как гомологичные, так и не гомологичные пути восстановления ДНК, задача совместной доставки достаточного количества вставки и расщепленного генома в клетку-хозяина и более низкой эффективности большинства гомологичных сигнальных путей рекомбинации хозяина. Поскольку только расщепленнные геномы не образуют функциональных вирусных частиц и в последующем бляшек без опосредованной хозяином рекомбинации, бляшки, полученные после трансформации и выращивания, могут быть скринированы с помощью ПЦР для данной вставки, чтобы подтвердить корректную сборку желаемой сконструированной вирусной нуклеиновой кислоты.

Пример XVI.

Сконструированные вирусы, описанные в настоящем документе.

В табл. 1 представлены сконструированные вирусы, полученные в соответствии с настоящим изобретением в способе модификации in vitro. В табл. 2 представлены сконструированные вирусы, описанные в настоящем документе, вместе с соответствующим примером и фигурой. В табл. 3 перечислены вирусы дикого типа, описанные в настоящем документе, и номера доступа для их полной геномной последовательности. В табл. 4 перечислены некоторые из последовательностей нуклеиновых кислот дикого типа, описанных в настоящем документе, и соответствующие аминокислотные последовательности.

- 51 038595

Таблица 1. Сконструированные вирусы, описанные в изобретении

Сконструированный вирус	Исходный Вирус	Тип мутации	Целевая область	Номер доступа, положение нуклеотида (SEQ ID NO.)	Изменение нуклеотида и аминокислоты или добавление последовательно сти
LUZ19+ фрагмент др7 ФКЕ7 7	LUZ19	Замена	др 7 (SEQ ID NO:23)	Доступ NC_010326.1, 4288- 4491 (SEQ ID NO:23)	Фрагмент др 7 ФКЕ7 7 (SEQ ID NO:8)
LUZ19+LKD16 др18	LUZ19	Замена	gpi8 (SEQ ID NQ:50)	Доступ NC_010326.1, 11368-11688 (SEQ ID NO:24)	др18 LKD16 (SEQ ID NO:7)
IIIKX-LUZ19	LUZ19	ТМ	gp!3 (SEQ ID NO: 1)	Доступ NC_010326.1, 7325 (положение 50 SEQ ID NO:1)	G на A, C17Y
ТМ	gp!8 (SEQ ID N0:50)	Доступ NC_010326.1, 11469 (положение 106 SEQ ID N0:50)	G на T, D36Y
ТМ	gp3 8	Доступ	А на G, D82G

- 52 038595

			(SEQ ID N0:2)	NC_010326.1, 36462 (положение 245 SEQ ID NO:2)
TM	gp3 8 (SEQ ID N0:2)	Доступ NC_010326.1, 36464; 36465 (положение 247, 248 SEQ ID NO:2)	AT на TC, I83S
TM	gp4 0 (SEQ ID N0:3)	Доступ NC_010326.1, 38180 (положение 757 of SEQ ID NO:3)	А на G, N253D
LUZ19+gp34 L55A (LUZ19*)	LUZ19	Делеция	gP34 (SEQ ID N0:4)	Доступ NC_010326.1, 2 6664-2 6666 (положение 163165 SEQ ID NO:4)	CTG на -, L55
LUZ19+LKD16 gpl8+gp34 L55A	LUZ19+ LK D16 gp!8	Делеция	gp34 (SEQ ID N0:4)	Доступ NC_010326.1, 2 6664-2 6666 (положение 163165 SEQ ID NO:4)	CTG на -, L55
LUZ19+ gp49 LKA1	LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) gp49 LKA1 (SEQ ID NO:12) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+ gp34 NTU	LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) NJ\Jgp34 (SEQ ID NO:13) T32 (SEQ ID

- 53 038595

					NO:22)
LUZ19+Ppl5g p4 4	LUZ19	Вставка	др4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) Ppl5gp44 (SEQ ID NO:14) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+SaPSM a3	LUZ19	Вставка	др4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) SaPSMa3 (SEQ ID NO:16) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+SaPSM b2	LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) SaPSMb2 (SEQ ID NO:17) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+SePSM a	LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) SePSMa (SEQ ID NO:18) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+dspS	LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) dspB (SEQ ID NO:15) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+Ppl5g p4 4	ШКХ LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	Ppl5gp44 (SEQ ID NO:14)
LUZ19+SePSM a	ШКХ LUZ19	Вставка	gp4 9 (SEQ ID N0:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943	SePSMa (SEQ ID NO:18)

- 54 038595

				(SEQ ID NO:25)
LUZ19+PPR1L	LUZ19	Вставка	др4 9 (SEQ ID NQ:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) PRR1 L (SEQ ID N0:20) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+MSR L	LUZ19	Вставка	др4 9 (SEQID NO:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) MS2 L (SEQ ID NO:19) T32 (SEQ ID NO:22)
LUZ19+pyoS5	LUZ19	Вставка	др4 9 (SEQID NO:51)	Доступ NC_010326.1, 42719-42943 (SEQ ID NO:25)	P32 (SEQ ID NO:21) pyoS5 (SEQ ID NO: 6) T32 (SEQ ID NO:22)
М13МР18+пап рика	М13МР1 8	Замена	lacZ (SEQID NO:28)	Доступ X02513, 6216-6722 (SEQID NO:28)	паприка (SEQID NO:29)
Лямбда сП удаление	лямбда	Делеция	ell (SEQID NO:30)	Доступ NC_001416.1, 38390-28623 (SEQ ID N0:30)	ell удаленная (SEQID NO:9)
цмв человека+от редактирова нный RL13	Фрагме нт ЦМВ Челове ка	Замена	RL13 (SEQID NO:33)	Неотредактирова нный полноразмерный фрагмент (SEQ ID N0:10) и неотредактирова нный RL13 (SEQ ID NO:33)	Отредактированн ый RL13(SEQID NO :32) и отредактированн ый полноразмерный фрагмент (SEQ ID NO:11)

ТМ - точечная мутация, замена - замена, делеция - удаление, вставка - инсерция.

- 55 038595

Таблица 2. Сконструированные вирусы, описанные в изобретении

Сконструированный фаг	Пример	Фигура	Свойство
LUZ19+ фрагмент др 7 ФКД77	1	2	Сконструированный ОП
LUZ19+LKD16 др!8	II	3	Расширение круга хозяев
IIIKX-LUZ19	III	4	Расширение круга хозяев
LUZ19+gp34 L55A (LUZ19*)	IV	5	Улучшенная литическая активность
LUZ19+LKD16 др!8+др34 L55A	V	6	Итеративное конструирование
LUZ19+LKAlgp49	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+ др34 NTU	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+Ppl5gp44	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+SaPSMa3	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+SaPSMb2	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+SePSMa	VI	7	Дисперсия биопленки
LUZ19+dspS	VI	7	Дисперсия биопленки
IIIKX-LUZ19+Ppl5gp4 4	VI	7	Итеративное конструирование
IIIKX-LUZ19+SePSMa	VI	7	Итеративное конструирование
LUZ19+PPR1L	VII	8	Антибиотическая сенсибилизация /предовращение устойчивости к фагу
LUZ19+MS2 L	VII	8	Антибиотическая сенсибилизация
			/предовращение устойчивости к фагу
LUZ19+pyoS5	VIII	9	Предовращение устойчивости к фагу
М13МР18+паприка	XI	11	Сконструированный ОП
делеция ell λ	XII	12	Сконструированный ОП
ЦМВ человека+отредактиро ванный RL13	XIII	13	Коррекция ошибок/сконструированный ОП

ОП - опытный образец.

- 56 038595

Таблица 3. Вирусы дикого типа, описанные в изобретении

Название вируса дикого типа	Геномная последовательность
Фага LUZ19 Р. aeruginosa	Доступ NC 010326.1
Фаг Е. coll \ сП 857 SAM7	Доступ NC 001416.1
Фаг М13 Е. coli	Доступ Х02513
Фаг 14-1 Р. aeruginosa	Доступ NC 011703.1

Таблица 4. Последовательности дикого типа, описанные в изобретении

Название	Последовательность нуклеиновой кислоты	Аминокислотная последовательность
gpl3 LUZ19	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO:34
др38 LUZ19	SEQ ID NO :2	SEQ ID NO:35
др40 LUZ19	SEQ ID NO :3	SEQ ID NO:36
др34 LUZ19	SEQ ID NO :4	SEQ ID NO :5
др49 LUZ19	SEQ ID NO:51	SEQ ID NO:49
др18 LUZ19	SEQ ID N0:50	SEQ ID NO:48
др18 LKD16	SEQ ID NO :26	SEQ ID NO:38
др49 LKA1	SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO:39
PyoS5	SEQ ID NO:6	SEQ ID NO:37
др34 NTU	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO :40
др44 Рр15	SEQ ID NO: 14	SEQ ID NO:41
DspB	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO:42
SaPSMa3	SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO:43
SaPAMb2	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO:44
SePSMa	SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO:45
MS2L	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO:46
PRR1 L	SEQ ID N0:20	SEQ ID NO:47

Из вышеприведенного описания специалист в данной области техники может легко определить основные характеристики изобретения и не отходя от его сущности и объема может вносить изменения и модификации в изобретение, чтобы адаптировать его к различным условиям применения и использования, а также реализовывать изобретение в полном объеме. Предшествующие конкретные варианты реализации изобретения должны толковаться как просто иллюстративные, а не ограничивающие объем изобретения каким-либо образом. Полное раскрытие всех заявок, патентов и публикаций (включая справочные руководства), упомянутых выше и на фигурах, полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

- 57 038595

Перечень последовательностей

SEQ ID NO: 1

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- др!3 LUZ19 дикого типа

GTGCTGGCCCTCGGTGCCTTCGACCTGTCCGGCCTGATGGTAGGTTCCTGCCTCGTAGTAGGTG

GTGAGCTG

AAGGCCCTGTGCGTTGATGACCGGCACAGCAGGCAGGGTATCGGCGCTGAGCTGGTACGGGCCG

CTGAGCT

GGCTGGTGCCGAGTATCTGACCTGCTTCGAGTTCCTGGAGCCGTTCTACGCCGACTTGGGCTGG

AGCACCAC

CCACCGCGAGGCGAACTGGACAGCAGGAGAGCCGGACGTGCTGCACATGAGGGCACCCGGTCAT

GACGTAT

- 58 038595

GA

SEQ ID NO :2

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- gp38 LUZ19 дикого типа

GTGGCTCGGTTCAAGAATCCCGAGACCATCCACGTTGCAGATGGGGTCGAGGCTGTCTTCAGTC

TCGACTTC

CCGTTCCTGCGGCGTGAGGACGTATTCGTCCAGGTCGATAAGATACTCGTCACCGACTATACGT

GGGTAGAC

GACACCAACATCCAATTGGCCGTGGTGCCGAAGAAGGACCAAGAGGTCCGCATCTTCCGCGACA

CGCCCGC

CCAGGTCCCGGACACACAGTTCAGCCAGGACATCCCGTTCCTGCCTCGATACATCGACGCGAAC

AACAAGC

AGCTCCTGTACGCTGTGCAGGAAGGCATCAACACCGCGAACCTCGCTCTCGATGGCGTACTCGA

CGCGATCC

GTATCGCCGAGGAGGCTCGTCGCCTGGCGCAGGAAGCACTCGACGCCGCCAATGAGGCGCTTCG

CCGTGCC

CTGGGCTTCGCTGAGATTCGCACCGTGACCGAGGACTCGGACATCGATCCGAGCTGGCGCGGTT

ACTGGAAC

CGTTGCATCACCGCCGATAAACCTCTGACCCTGACCATGCAGATGGAAGACCCGGATGCACCGT

GGGTCGA

GTTCAGCGAGGTTCACTTCGAGCAGGCCGGTGTGCGTGACCTAAACATCGTAGCCGGTCCTGGC

GTTACOAT

CAACCGTTTGCAGAACACCACCATGCAGCTCTACGGCGAGAATGGCGTGTGTACTCTCAAGCGG

CTGGGCGC

TAACCACTGGATCGTGTTCGGGGCCATGGAGGACGAATAA

SEQ ID NO :3

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- gp40 LUZ19 дикого типа

ATGTTTAAGACCGAAGTAAAGGGACGTTACACCCTGATTCGCCGCAAGGCGGACGGCACTCCGG

TGGAGAC

TCTGGAGTTCGACAACATCATTACGAATGCGGGCCTGGATTGGATCGCCGCTATGGATACCGAC

CTCATGGG

CGAACCCGTAGCGGTCAGCACTTCTACAGCCGATCCCAACCCGAGCGCACCCGCCATCCCGGAG

GTTGTGCA

- 59 038595

ACGCACGTCCGCATCTGCCCCTGGTGGAGGTACTACGTCGGGCCTGGATGGCGAGTGGCTGTTC

TGGCGGAG

GCGTTGGAGATTCCCGCAGGGCACCCTAGCTGGTCAAGTCCTGGCCACCGTGGGCCTCATCTGC

AACTCGGA

TCGTCGCTTCGAGAGTAACACGGGTGAGCTGATCCCGAAGGATACCCCGCTGTCGTACACTCGC

ATCAAGGA

CGCCGCCGGGCAGCCTACTACTCTGGTGGTGGCCGCTGACGAGATTCTGGATGTCCAGTACGAG

TTCCGCAG

CCGGCCCGTAGGAACGGCTGAGGCCAAGTTCGTGATCTCCGGCGTGGAACGCACCTTCCGGCTG

ATCCCAAA

GCCTTTTGCGAACCGTGCTAATCTCTCCGGGGAACGCTACATCTTCTACAACACCAACCCCTAC

ATCAACGG

CAAGGACGCCTCCGGCGGCAATGTCCGAGACGGTCAGTGGCAGAAGAAATATCCCAAGTACGTG

CGCGGCT

CCTACAAGGCGCAGATCACGCTGCTGGCCCAGGTCCAGAACGGCAATATGGCTGGCGGCATCAC

CGGCACC

GAGGAACTСCAGATTTACAATGGAGGTAAGTATGTGСTCGATATCAAGСCGССTGTTGTGAAGA

ACAATACC

CAGGAGTTCACCGTGACCCTGGAGTTTACGGTGGCGAGGGCATAA

SEQ ID NO:4

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- gp34 LUZ19 дикого типа

ATGAGCTACAAGCAATCCGCGTATCCCAATCTGCTGATGGGTGTGAGCCAGCAGGTGCCCTTCG

AGCGCCTG

CCGGGCCAGCTCAGCGAGCAGATCAACATGGTATCCGATCCCGTGTCAGGACTTCGGCGGCGCA

GCGGTAT

CGAGCTGATGGCCCACCTGCTGCATACCGACCAGCCCTGGCCGAGGCCGTTCCTCTACCACACG

AACCTCGG

TGGCCGCAGCATTGCGATGCTGGTGGCGCAGCACCGTGGCGAGCTGTACCTGTTCGACGAGCGG

GACGGTC

GCCTGCTGATGGGTCAGCCCCTGGTGCATGACTACCTCAAGGCCAACGATTACAGGCAGCTACG

GGCCGCCA

CGGTGGCCGATGACCTGTTCATCGCCAACCTGAGTGTAAAGCCCGAGGCCGACCGCACCGACAT

CAAGGGC

GTAGACCCCAACAAGGCCGGCTGGCTGTACATCAAGGCAGGCCAGTATTCGAAGGCATTCTCCA

- 60 038595

TGACCATC

AAGGTCAAGGACAACGCCACCGGCACCACCTACAGCCACACGGCCACCTACGTGACGCCGGACA

ACGCCAG

CACGAACCCCAACCTCGCTGAGGCGCCATTCCAAACGAGCGTAGGCTACATCGCGTGGCAGCTC

TACGGCA

AGTTCTTCGGTGCGCCGGAGTACACTCTGCCCAACTCGACGAAGAAGTACCCGAAGGTAGACCC

GGACGCC

AACGCGGCAACCATAGCCGGTTACCTCAACCAACGGGGCGTGCAGGACGGGTACATCGCGTTCC

GTGGCGA

CGCCGATATCCACGTTGAAGTGTCCACGGACATGGGCAACAACTACGGCATAGCCTCCGGCGGT

ATGAGCCT

CAACGCCACGGCAGACCTGCCGGCCTTACTGCCGGGCGCGGGTGCTCCTGGCGTGGGTGTGCAG

TTCATGGA

CGGCGCTGTCATGGCCACCGGCTCCACCAAGGCCCCGGTATACTTCGAGTGGGATTCCGCTAAC

CGCCGCTG

GGCAGAGCGGGCCGCCTACGGCACCGATTGGGTCCTGAAGAAGATGCCACTGGCCCTGCGCTGG

GATGAGG

CTACCGACACCTACAGCTTGAACGAGCTGGAGTATGATCGACGTGGCTCCGGCGACGAGGATAC

GAACCCC

ACGTTCAACTTCGTCACCCGAGGCATCACCGGCATGACGACCTTCCAGGGTCGCCTCGTCCTCC

TGTCGCAG

GAGTACGTCTGCATGTCGGCCAGTAACAATCCACACCGCTGGTTCAAGAAGTCGGCAGCCGCGC

TGAACGA

CGATGATCCTATCGAGATCGCAGCCCAGGGGAGCCTGACTGAACCGTACGAGCACGCGGTCACC

TTCAACA

AGGACTTGATCGTCTTCGCCAAGAAGTATCAGGCCGTGGTCCCCGGTGGCGGCATTGTAACTCC

CCGGACGG

CGGTTATCAGCATCACCACGCAGTACGACCTCGATACCAGGGCGGCACCTGCCGTGACTGGCCG

CAGTGTGT

ACTTCGCTGCGGAGCGTGCCCTGGGTTTCATGGGCCTGCATGAGATGGCCCCGTCTCCGTCCAC

GGACAGCC

ACTACGTCGCCGAAGACGTTACCAGCCACATCCCGAGCTACATGCCGGGGCCTGCTGAGTACAT

CCAGGCG

GCGGCCTCCAGCGGCTACCTGGTGTTCGGCACCAGCACGGCGGACGAGATGATCTGCCACCAGT

ACCTCTGG

CAGGGCAACGAGAAAGTGCAGAACGCGTTTCATCGCTGGACGTTGCGGCATCAGATCATCGGCG

- 61 038595

ССТАСТТС

ACTGGTGACAACCTGATGGTTCTGATTCAGAAGGGCCAGGAGATCGCCCTGGGACGGATGCACC TGAACAG

CCTGCCAGCCCGTGAGGGTCTGCAATACCCTAAATACGACTACTGGCGGCGTATCGAGGCGACC GTCGATGG

TGAGCTGGAACTGACCAAGCAGCATTGGGACCTGATCAAGGATGCCTCTGCCGTGTACCAGCTA CAGCCTGT

GGCCGGCGCCTACATGGAGCGTACCCATCTCGGCGTGAAGCGCGAGACGAATACGAAGGTGTTC CTCGACG

TGCCCGAGGCCGTGGTCGGGGCGGTGTATGTGGTCGGCTGCGAGTTCTGGTCGAAGGTGGAGTT CACTCCGC

CGGTTCTCCGGGACCACAATGGCCTGCCCATGACCTCGACCCGTGCAGTGCTTCATCGGTACAA CGTAAACT

TCGGCTGGACCGGCGAGTTCCTGTGGCGCATCAGCGACACGGCTCGACCCAACCAGCCGTGGTA CGAGACG

ACGCCCCTCCGGTTGTTCAGCCGGCAACTCAATGCCGGGGAGCCTCTGGTGGATAGCGCTGTGG TGCCGCTG

CCGGCACGGGTCGATATGGCCACGTCCAAGTTCGAGCTGAGCTGTCACAGTCCGTACGACATGA ACGTTCGG

G С T G T C GAG TAGAAG T T CAAG T С CAAG СAAAC C TAGAG GAG G G T G T GA

SEQ ID NO:5

Белок

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- белок Gp34 LUZ19 дикого типа

MSYKQSAYPNLLMGVSQQVPFERLPGQLSEQINMVSDPVSGLRRRSGIELMAHLLHTDQPWPRP FLYHTNLGGR

SIAMLVAQHRGELYLFDERDGRLLMGQPLVHDYLKANDYRQLRAATVADDLFIANLSVKPEADR TDIKGVDPN

KAGWLYKAGQYSKAFSMTIKVKDNATGTTYSHTATYVTPDNASTNPNLAEAPFQTSVGYIAWQL

YGKFFGAPE

YTLPNSTKKYPKVDPDANAATIAGYLNQRGVQDGYIAFRGDADIHVEVSTDMGNNYGIASGGMS LNATADLPA

LLPGAGAPGVGVQFMDGAVMATGSTKAPVYFEWDSANRRWAERAAYGTDWVLKKMPLALRWDEA TDTYSL

NELEYDRRGSGDEDTNPTFNFVTRGITGMTTFQGRLVLLSQEYVCMSASNNPHRWFKKSAAALN DDDPIEIAAQ

- 62 038595

GSLTEPYEHAVTFNKDLIVFAKKYQAWPGGGIVTPRTAVISITTQYDLDTRAAPAVTGRSVYF

AAERALGFMGL

HEMAPSPSTDSHYVAEDVTSHIPSYMPGPAEYIQAAASSGYLWGTSTADEMICHQYLWQGNEKV

QNAFHRWTL

RHQIIGAYFTGDNLMVLIQKGQEIALGRMHLNSLPAREGLQYPKYDYWRRIEATVDGELELTKQ

HWDLKDASA

VYQLQPVAGAYMERTHLGVKRETNTKVFLDVPEAWGAVYVVGCEFWSKVEFTPPVLRDHNGLP

MTSTRAVL

HRYNVNFGWTGEFLWRISDTARPNQPWYDTTPLRLFSRQLNAGEPLVDSAWPLPARVDMATSK

FELSCHSPYD

MNVRAVE YN FKS NQ T YRRV

SEQ ID NO:6

ДНК

Род/вид- Pseudomonas aeruginosa

Описательное название- последовательность PyoS5

ATGTСCAATGAGAAGGAAGTACСTGGTTСCATGGTTATTGTCGCACAAGGTСCAGACGATCAAT

ACGCATAC

GAGGTTCCCCCTATCGATAGCGCGGCCGTTGCCGGGAATATGTTTGGCGACTTAATTCAAAGAG

AAATATAT

С TACAGAAAAACATTTATTATCCAGTCCGATCTATTTTT GAACAAGGAACAAAAGAAAAGAAGG

AGATCAA

CAAGAAAGTATСTGATCAAGTCGATGGCTTGCTAAAGCAGATСАСTCAAGGAAAAAGGGAGGCC

ACAAGGC

AAGAGCGAGTCGATGTCATGTCGGCAGTCCTGCACAAGATGGAATCTGATCTTGAAGGATACAA

AAAGACC

TTTACCAAAGGCCCATTCATTGACTACGAAAAGCAGTCAAGCCTCTCCATCTATGAGGCCTGGG

TCAAGATC

TGGGAGAAGAACTCTTGGGAAGAAAGAAAGAAGTACCCTTTTCAGCAGCTTGTTAGAGATGAAC

TGGAGCG

GGCGGTTGCCTACTACAAACAAGATTCACTCTCTGAAGCGGTAAAAGTGCTAAGACAGGAGCTC

AACAAGC

AAAAAGCGCTAAAGGAAAAAGAGGACCTCTCTCAACTGGAGCGGGACTACAGAACCCGAAAGGC

GAATCT

CGAGATGAAAGTACAATCCGAGCTTGATCAAGCGGGAAGTGCTTTGCCTCCATTGGTCAGTCCA

ACGCCAGA

GCAATGGCTTGAACGTGCCACAAGACTGGTTACGCAAGCAATTGCTGATAAAAAGCAGCTGCAG

- 63 038595

ACCACAA

ACAATAC T С T TAT CAAGAAT T С С С СAAC С С С T С TAGAAAAG CAGAAAG С CAT C TAGAAT G G T GA

GCTACTTG

TGGATGAGATAGCCAGTCTACAGGCCCGCTTAGTTAAGCTGAACGCCGAAACGACACGACGCAG

GACAGAA

GCAGAACGCAAGGCGGCCGAGGAACAAGCGTTGCAAGATGCTATTAAATTTACTGCCGACTTTT

ATAAGGA

AGTAACTGAGAAATTTGGCGCACGAACATCGGAGATGGCGCGCCAACTGGCCGAAGGCGCCAGG

GGGAAA

AATATCAGGAGTTCGGCGGAAGCAATCAAGTCGTTTGAAAAGCACAAGGATGCGTTAAATAAAA AACTTAG

CCTTAAAGATAGGCAAGCCATTGCCAAAGCCTTTGATTCTCTAGACAAGCAGATGATGGCGAAG

AGCCTTGA

GAAATTTAGCAAAGGCTTTGGAGTTGTAGGCAAAGCTATTGACGCCGCCAGCCTGTACCAAGAG

TTCAAGAT

ATCTACGGAAACCGGGGACTGGAAACCATTCTTTGTAAAAATTGAAACACTAGCTGCTGGTGCG

GCCGCCA

GTTGGCTTGTGGGTATTGCATTTGCCACGGCAACAGCCACTCCTATAGGCATTCTGGGGTTCGC

ACTGGTAAT

GGCAGTTACCGGGGCGATGATTGACGAAGACCTTCTAGAAAAAGCAAACAATCTTGTAATATCC ATTTAA

SEQ ID NO:7

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LKD16

Описательное название - добавлена последовательность gp!8

LKD16

GAGTACCAACTGAACACGAGCGCACCCTGCGCTGCCTGCTCCAAGACATCCACGGGCCGCTGAA

TCTGCTGT

TCCCAGGTATCCGGGTGAAGGTGGAGGAGGCGTGCCTCGGATACTTGGGCTACAGGGAGCGGGG

CTATTGG

GAGCTGCGCCTCCAGGTGGACTACGACCACCCGAAGCTTGGGCACCTCCGCTACAGTCAGGCCG

TGCCGGA

GTACGTGCTGATCAACGACCGCGACAGCATCATCAAGTACCTGATGGAAGCAGTCCCTCGGCAG GTAGTAG

AGGGCATGCTCAATAAGGCCCAGGAATTCGTAACCAAGAACTGGTATTCCCTATGACGAC SEQ ID NO:8

- 64 038595

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus phi-KF77

Описательное название - добавлена последовательность др7 ФКЕ7 7 TACAAGGTGGTGACGCCTAGCTCGGCAGAGGGCGCCGTTGTGCTGGCGACCAAGCAGACGCCTG CCCTCGC TCAGGCAGTCATCGTACTGCACAGCATGAACCCCGCGCAGTACGCGGTGGGCACGGCCATACTA AACACAG ACTGGCGGTGCCGCCGCCTGGGTGCCGGCGAGTACATCAAGCTCGTTCAAGGGGAGGCCGAC

SEQ ID NO:9

ДНК

Род/вид- Lambdavirus лямбда

Описательное название- ell фага λ Е. coll

ATGGTTCGTGCAAACAAACGCAACGAGGCTCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGA SEQ ID NO: 10 ДНК Род/вид - цитомегаловирус ЦМВЧ Описательное название - предварительное редактирование фрагмента ЦМВЧ ACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGATTAC CCTGTTAT CCCTACCATTCCGGGCCGTGTGCTGGGTCCCCGAGGGGCGGGGGGGTGTTTTTAGCGGGGGGGT GAAATTTG GAGTCTTGGAGCCGCGTGTGCTGTGGAGGACGGTGACGGTGGTAAGAGTGTGCTGCGGTGCGGT TGGGACG GCGGCGGCGAATAAAAGCGGCGTGCGGCGCGCACGGCGAAAAGCAGACGCGCGTCTGTGTTGTG TGTCTTT GACCGCGGCGGAACACACGCGGAAAAGCGAGTCCCAGGGGACACACGACGAGCGAGTCCCAGGG GGGGAC GACGACGGCCAGGGACGCGGAAACGACGCGGAAAAGAGGAAGTCCCCAGGGGGACGGGCGGAAA AGAGG AAGCGCCTAGGGGACCGCGGGGGCAGGAACAGACGAAGTACGCCGCAACCCGCGTCGAGGACAC ACGCAG AAGCGGCCGCCCAGGGGAGGGGGGGGGGGGGACTCGCGGGCCCCGGGGCACACTTGTTGTTCCC TCCGGCC

- 65 038595

GCCGACACGCACCCCGAAGCCGCGCACACCGCCGACACACCCCTGACACACCCGCGACACACCC

GCCACAC

G С С C GAGACAC G С С C G C GACACAC С C GAC C GACACAC CCT GACACAC С С C G С СAACACACCCAG

CCGCACC

CGCCCCGCCAACACACCCCCGACACACCCGACACACGCCCGCGACACACCCGGCACACACCCAC

CCACCCA

GCCGCGCCCCCGACACACCCCGAACGGCGCCGGTGCGGGACAGGGCTCACGGAGGTTTGCGGGC

CGTGAGC

ACGCCTCCCTTTGTACACACTACCGGTGCGTGGCGTCCCACGCTATTTGTTCGCGAGACCGGAC

TAAGGGAG

GTTTGCGGTGCGTCAGCGCGGGGCGGCGTTTGCGGCGTGTTTCGACCAGCGCTTTGTGCGCGCT

GCCTGTGC

GTGTCGTCCCATGGTCTTTGTCAGCGGCACGGCGCTGGGGACGGGGTTTCACCGCGCTGAGGGA

TCTTTCTG

CGGGTGTGAGGGACGGAGCTTTTTTCGCACGCTGGGCACCGGGCTGGGGGACGGGGGGTGTGCG

GGACGGC

GGTGGGGCCGGGGCGTTGCGGGTACGGGGATTACGCTGGGAACGGGGACTCGCGGACCCGGGCT

GAGGGA

CGGGGGTGGCGGGGGTGTTTGCGGCGAGGACGGGGGCCTTTTGCGGCGGGGACGGGGACTCACC

CTCGCCT

ATT TAAC С T С СAC С СAC T T CAACACACACATGСCGCACAATCAT GCCAGСCACAGACACAAACA

GCACCCAC

AC CAC G С C G C T T СAC С CAGAG ТАС CAACACACGT TACСС T ТАСACCACAGCAACACACAACCGC

CTATCCAA

ACCTCGGACAAACACGCCAACGAAGAACACCGCACGCAGATGGAGCTCGACGCCGCGGATTACG

CTGCTTG

CGCGCAGGCCCGCCAACACCTCTACGCTCAAACACAACCCCAACTACACGCATACCCCAACGCC

AACCCTCA

GGAAAGCGC TCAT TTT T CCACAGAAAATCAACAT CAAC T CACGCAT С ТАС T T CACAACAT T GGC

GAAGGCGC

AGCGCTCGGCTACCCCGTCCCCCGCGCGGAAATCCGCCGCGGCGGTGGCGACTGGGCCGACAGC

GCGAGCG

ACTTCGACGCCGACTGCTGGTGCATGTGGGGACGCTTCGGAACCATGGGCCGCCAACCTATCGT

GACCTTAC

TGTTGGCGCGCCAACGCGACGGCCTCGCTGACTGGAACGTCGTACGCTGCCGCGGCACAGGCTT

TCGCGCAC

- 66 038595

ACGATTCCGAGGACGGCGTCTCTGTCTGGCGTCAGCACTTGGTTTTTTTACTCGGAGGCCACGG

CCGCCGTGT

ACAGTTAGAACGTCCATCCGCGGGAGAAGCCCAAGCTCGAGGCCTATTGCCACGCATCCGGATC

ACCCCCAT

CTCCACATCTCCACGCCCAAAACCACCCCAGCCCACCATATCCACCGCATCGCACCCACATGCT

ACGACTCG

CCCACATCACACGCTCTTTCCTATCCCTTCTACACCCTCAGCCACGGTTCACAATCCCCGAAAC

TACGCCGTC

CAACTTCACGCCGAAACGACCCGCACATGGCGCTGGGCACGACGCGGTGAACGTGGCGCGTGGA

TGCCGGC

CGAGACATTTACATGTCCCAAGGATAAACGTCCCTGGTAGACGGGGTAGGGGGATCTACCAGCC

CAGGGAT

CGCGTATTTCGCCGCCACGCTGCTTCACCGATATCCAATAAACCCATCCCCTCGCCACGACGTC

TCCGCGTAT

CTTTGTAGCCTCAGGAATCCGTCCCCACGTCCATCCATCCCGAGCACTCCACACGCTATAACAG

ACCACGGA

CACGGCAAATGCATGCAAACTTCTCATTTATTGTGTCTACTACTCTGTGTTGCTACAGGGAGTG

AAGGGGGT

GAAGGCAAAGAAAAAAAAAAGGAACAAAATAATAGATTAGCAGAAGGAATAATCCGTGCGACCG

AGCTTG

TGGTTСTTTTСTTATAAGGAGGCAAATATACTAGGGAAAACTTAAGAATAGGAAGAAACCGAGG

TTTGGGA

GAAAAGCTGAGATAAAATAGCGCATTTTCCATACAGAGGTTGTTGTTTTTGTGGATCCTAAGAG

GTTTCAAG

TGCGAATСTCAAAGTTСTCACGAGAATATTGTСTTCAAGAATCGACAACTGTGGTCCAAGATTT

TTTTTTGGT

CTTTTTAGGTTCTGCGAGGGACATCACGATGGATCGTTGCGATGAAGTCACGCGTACGCCTCTG

GTGTGGCG

CGGTGTCGTGACAGGAGAGTGTGTTTTCAGTGCAGAGCTGTCTTGATTCCTATATCCGAGTATC

TGTTTTCTC

GTAAGGACGGTAATCTTCTTTGGTGTAAGTACATCTAAAAGCTGCAAACTATATTTTAAGGGCT

GTCTCTAG

GTGTACTTTGATGCTGGAGTTTTTCGCTGTGTTGATGTGAATAAATCTACTACTACTATTATAT

GCAGAAAGA

GTGATTATGCCGAGACAAGATTGCATTGGCTGAACTGTTTCAAAAACGCCTACACTCTACTTAT

CCGTAAAC

- 67 038595

CTAAGGTAATACTATGTGTAAGTTGTTTTTTTTTCTTTTTGTAGTAAAATGGTGATACGTGCAA

TTAAAACTG

TATTCCATGTTTCCATCCTTTCATTTCAACTTTAAAGGCGGCTTTGAGAGCGAAGAAGTGCGAG

TGGATGACTCCTTCGTGTCCAGGGAGTCGACTACTGCAACGCTGATTGATTAAAAGATGGTCTC

CGATGATG

ATGTTGTTATTGATCGAATCATGGTGCAGAACGGCGACGGAGAGGAGCGTGTCCGCCGCCGGGA

AGGTGGT

CTCTTTCTCTTTTCTTTTTTCAAGAAATCTTCCATGTGTTTATCGTAGTGATCGAAATCGACTG

ATCTCGGGTT

CTTTTTGTTGGTTTCTTTTCGGTTAATCATGTATTGTTTTCTTTTTTTACAGAAAGATACTTTT

TTCATGAGCAA

TTCCTCGCCCGGCGCCGGCATGCCGAGGTGGGGCCACTGCGATCAGCGGCATGCCGACGCCGAC

CCGGGGA

TCTTGGATTCACCGTTTTCTCTCTTCTCTCTCTACATACAGACCGGGTGGCAGGAGCGGTAAGG

AATCATCGT

C G T C Τ Τ T CAT T C Τ T C GAT GAT TAT G G TAATACΤAAAT CTTATCTAGGAGCATATACAT С TAAGA

TTGGAGTAC

TAGTAGTCGTTTGTGGTTTCTATTTTTTTTATATTTATCTATGACAGTTTTTCTGTTTTTCGTT

TTGATAATAAT

ATAATAAAAACTCATGGACGTGAAATCTGGCTTGGTTGTGGTGATTTCATTCTCATTATTGTTG

TTTTCTTTCC

GTCTTGCGGATGAAGATGTTGCGATGCGGTTGTTGTTGGTGTTGCTATACACCGAGAGAGATGA

TCTTTTTGT

TCTTCTGGTTCATTTCCTATGATTGTTTGGCTGCTGACCGACGCGTCAGGATGTGCAGGGCATG

CGGGGAATC

AGGACCGGACACGGGATAATTTCATCTACCTATACGGAGATCGCGGTCCTCGCCATGAGGATCG

CGACAGG

CGCGTCGAGGGGGCAGGAACACCCTTGCGGATTGACATTCTTGGTGGTGTTTCGTTGTTGTCGG

TAGTTGTTG

TTGACGATGAGGATAAATAAAAATGACCTTGTTTTTGTTCTGTTTTCTCTTGTTGGGAATCGTC

GACTTTGAA

TTCTTCGAGTTATCGGAAAGCTGAGGTACCCAAATGTCTGTAGCTTTTTTCTTTTTACCCTCTT

GTTTATCATC

TGCGATTCGTGGTAGGTAGGAGAGGGAAATGATAATCCGAGATTAAGGAAAGGAGAAGATAAAA

- 68 038595

AAAAAAATAATAAAACAGAAGCCGACCGGCCGCCGACCCGTTCCCCAGGACCAGCCTACGAGGA

ATGGATA

ACGCGGTGGCGACGGCAGCGGTGGTGGCGCTGGGGGTGGCGGCAGTGGTACTGCTGATGGTAGT

CGGGACG

GAGGAGAGGCGATGCATACATACACGCGTGCATGCTGCATGGGTGGATGGTACGGCCGGGAGAC

GCGGAA

GAGAAAC T C AC AT AAAAAG G T GAG AAAAAGAG C G G T T GAAAAAAGAAAAC GAGAT T C GAG GAGA

CAGAAG

AGAAGGACCGGGGCTTGGCGACCCTTCCACGACTGCTGTTGTCATCTCGGCTCCCCCGTCTTCT

CCCGGCCAC

GGGCGGCTAAGTCACCGCCGTTCTCCCCATCCGTCCGAGCGCCGACCGACCAGCCGGCCGATTC

GCCCGCCG

GGGCTTCTGGAGAACGCCGGGGCAGCAGCGATCTGGGGAAGCCGCTAAACCCCTGCGTTTTTAT

ATGGTAGC

TCTGCCGAGCGCGGGCTGACGCGTTGAGTAAGCGGAAAGACGTGTGTGACGAAAAGGGGTCCCA

TGGTATT

TCACGTGACGATGAGGAGATGCGGTTTGGAGCACATACGGTTTAGAAAAAGGGAGTTGTCGTGA

CAAGGGC

TGAGGGACCTCTGTCTCCATGTGTGTATAAAAAGCAAGGCACGTTCATAATGTAAAAAAGAACA

CGTTGTAA

ACAAGCTATTGCTGTATCATTCGGCTGACTATGCTTCATTCGGACTGATTTTCTTTTCCTAACG

GCGTAACTT

AAAG T GAT TAAG GTATGATATTTGTTCCC CAGAG TTATACTATAGTCATCATCC TAAAAT T CAG

ATATAAATG

AACACATGTCGTATGGGATTATTAAGAAACCGAAACTСTСCACAGTTСACCATСTTСTTCGTCA

TTCAACCG

ATGACCCACTCCGTACAACGAATCAGTCTGCTGTGTCACACTGCAAACTACTAGCGACGTATGC

AAACAACT

T GAAAC AC GGGCTGTTGTATT GAC GAC C G T T G T AC C AT T AC T AG T C AC AT T G C AT AGAGAC CAT

CCACCGTC

ATCCCATCTTTCCCACCCGATGGAAAACCGTCTTCTATCATCAACTATGGTAAGATTTCGACCC

TGCGAGGTA

T T CAG TTTCCCCATATC CATAAC CTGGATTTTATCAT TAAAC С С CAATAT TAAACAC T T T T T TA

GTACCCCCCC

ACCCACCAAAAAATGTGACTGGACCGGTTCCTAGCAGCTCTGGGAGCCATGTTCAGGTTGAACC

ACAGCTAC

- 69 038595

AGCGAAACCGAGTCCAGTGACCGGTAACCACGTCCAGCCCCTGCGTATGTACCAGTCCAAGCAC GTCCGGTC

AT T G T T C TAGACAG GAAAT С TAAG TAG G T CAAG G CAAT T T TAT T С САС C G T TAC G CAGAATAC T AACAAACA

AAC AC AC AAAT T T AAC GAAT TAG AC GTAGTTTAT TAG AT GAAAAC T G T AAGAAC AC C AAT T C AC TAAGCGAT

ACAACAT T TAG С T GAC T T С CAAG TGC CACACAT СAC CAC TGTATTCATCCATGTTTT СAC C GAA CCAACGAG

ACAGAT C GAAGAAG С CAGAAT С T С С C GAC T T TAAAT TACATAAATСCAACGTAT TAT GACCACA GCTCGACA

CACAAATAG TTGCGTTACTATT CACAG TAG CAT ТАС С TATAC С C G TAAC G T T G CACAAC СAC T G АТСACCATT

GTTACCAAAAACGGTTTTCCACTTAGTTGTCAACGGATCTTTCCCATGCGTAATGGTCAAATTA CTACCAGTC

GTCGCTTTTAGCTCATTACGAGTATTATCCGCATCCACATATATCAACGTCATAGCTAGGCACG CTATAAGTA

CCCCCCCCCCACAATGGAATGTTGCCAAACCGGTTCTTTCCCGTTATAGCCATAGCGTTCCCAG

GCAAAAGC

AAACGCCAAACCTAATGCAGTGAAAAGCGCTTGCAGCCAGAACCAGCTTATGTACCAGCCACAA TCACATC

CGGTTATTGTTTCCACAGGAAATCCTACCAGGCAAAGCCCCGCTTGTTTTGTTCCTGACCATCT

TGTTTAGCA

ATTCGTAAACTGTCAGCCTAGCGACGTCCGTTTAGATCAAAAGTCACGTATATAGCGACGCTGT

TTCCACCC

GTTTCCCCGTCCCGCCGTTTCCGAACAACCCACCCGGGTTCAGACAACCGACCACCAACAGAAA

TATACACA

CAGACCACCGGGAGTTCAGTTAAAGATTTCATCAGGTTTATTTTGGCTGCTGCTAGTCTTTTGC

TTCTTAGAA

AAAAAATACCCATATAGAGAAATAAT GATAGT T T GACAACACATAT GGCAGGGAT TTCTTCTTC

ATCAATAA

GATAT G CAAT T С С С C CAG G GAGAGAC TTT CAACAAT T GAAT T TACAAAAACAAAAT TAGAT CAG

GAGAAAG

AGAGGATACAT TAATAAATATAT TATAT С T GGT GTATATAC T GAAT GC T GC T GGT T CATAAGGT

AACGATGC

TACTTTTTTTAATTCCAAGATGGTTTTTCTTTGTTAGTCTTTTGTTGACTTGCTGGTTCCTAAA

AGTTCGCAAA

- 70 038595

AACGATTGTGTGAAGATTATGACGTTGGTTGACTAGTTCATGAGATTCTGCTGTACGTGTGATG

GTTATTCGC

TGGTTCGTTCTAAGATGAGTATCGTACTGTGTCTGCGATGGTCGTCTCTTACTGGCATTCTCTC

GGCTGCCTCT

TGTTTTCATGATTGAAAAGGAAAAAAGGACTCCGAGGGCGCGGTCATCTTTTACTTTTCGGTTT

TCTCGTTGG

CGGGTCAGAGGTAGTCAGATCATGAGACTGTCGTGGTCGATGAAACTGTGTCTGCTCAAGTGAC

GTCCATTT

CTTGTACGGAGAAAAAAGTCATCGGGATAAATAAGGCTATACAAGGCGTTGTCAAGCGTGCGGC

TCTAAAC

AAATTAAGCGATACAAAATTACAGTGATACGAATAATAAATTACССССTСССССTGTGGTСССC

CCGAGGCG

AGAGCCACCCATCGTGTACTCTCGCACCACCCACGACCACAGGGGGAGACGGGACGAAGAGACG

ACGCAG

AGCGCCATCTCCTCCTGGAGGCCGGCGGCGTTAACTGCTACAGCTGCGGCGGCGACGACAGCTG

CGATTTGT

CGGCCGACATGCCGATGGTATGGGCGGCGGCGGCGGTGGCCGCGGCAGCGGGGAGGAGAGGAGA

GAGAAG

AGGAGCGGGGCGTCCGAAGGCGAGGATGGCATGGTCTCGCCGGAGCGCCCGGCTTTTATGGAAC

ACTCGCG

TCCGGTTGGGTAT САС C GAGAG GAAGAT GAATCACAAGT T ССAAACCAT С T T GAGACСCGAGTA

ACGGTTTA

CAGGTCGCACGCCAGTCTCAGCTAAAAACAGCGGACAGTCCCACGCTGTTTCTGTTGTGGCTCT

CTCCAGTTT

CCTCATCGCCGTCTTGGTCTCCGTCATCATCGGAAGAATACCACCCGCTCTCATGCGGCAGTCG

ATCAGCCTC

GATGAACGAGACGCGGCGACGCCTTTCTACGGCCGACTGGTTGTGGTGGTGAAAGAAGAGCACC

AGCAATC

CCAGGAGGAGCAACAAGCCCTCACATGTCCAGGAGGTCGGGGAGAGGGCCTGTCGGAGATGACC

GTGAGG

CATCACGTACGGCAGCTGAGGAGAAACGGAGAAGAAAGGAAAATTACCGTCAGGGGCCGGGGTT

CTTATTA

GAGAAACAGCACGTAGGTCAGGATCCAGATGCTAATGGCAATCATGATGACGATGATCATGCAG

GCCAAGA

CGCGGCGCACCAATGCAGAATCCAATAGCCGCCGTGCCTCCGGTTGGTGGCCGGCGGCATCTAG

AGACATG

- 71 038595

ATTTGGGGGGGGGACCGGCGGCGCAAAAAGACAGGGAGATGGACAGTGCCACGGTGTTTTGTTA

TGATTAG

GACATGGGGACCGGAAGCCGAGACAGAGTACTACAGGGTGTTGAAGGGTAACGTGAGGGAGATC

ATGTCAT

GGGCGGGCTGAAGACCGTGCGGGGAGGATCGACGTGTGCGGTGCTTGTGGAACACGGTGTTTTA

ATATGTA

TCCGCGTGTAATGCACGCGGTGTGCTTTTTAGCACTCGGCTTGATAAGCTACGTGACCGTCTGC

GCTGAAAC

CATGGTCGССACCAAGTGTСTCGTGAAAACAGAAAATACССACСTAGCATGTAAGTGCAATСCG

AATAGTAG

ATCTACCAATGGCAGCAAGTGCCACGCGATGTGCAAATGCCGGGTCACAGAACCCATTACCATG

CTAGGCG

CATACTCGGCCTGGGGCGCGGGCTCGTTCGTGGCCACGCTGATAGTCCTGCTGGTGGTCTTCTT

CGTAATTTA

CGCGCGCGAGGAGGAGAAAAACAACACGGGCACCGAGGTAGATCAATGTCTGGCCTATCGGAGC

CTGACAC

GCAAAAAGCTGGAACAACACGCGGCTAAAAAGCAGAACATCTACGAACGGATTCCATACCGACC

CTCCAGA

CAGAAAGATAACTCCCCGTTGATCGAACCGACGGGCACAGACGACGAAGAGGACGAGGACGACG

ACGTTT

AACGAGGAAGACGAGAACGTGTTTTGCACCATGCAGACCTACAGCAACTCCCTCACGCTTGTCA

TAGTCACG

TCGCTGTTTTTATTCACAGCTCAGGGAAGTTTATCGAATGCCGTCGAACCAATCAAAAAACCCC

TAAAGCTC

GCCAACTACCGCGCCACTTGCGAAAACCGTACACGCACGCTGGTTACCAGGCTTAACACTAGCC

ATCACAGC

GTAGTCTGGCAACGTTATGATATCTACAGCAGATACATGCGTCGTATGCCGCCACTTTGCATCA

TTACAGAC

GCCTATAAAGAAACCACGCGTCAGGGTGGCGCAACTTTCACGTGCACGCGCCAAAATCTCACGC

TGTACAAT

CTTACGGTTAAAGATACGGGAGTCTACCTTCTACAGGATCAGTATACCGGCGATGTCGAAGCTT

TCTACCTC

ATCATCCACCCACGCAGCTTCTGCCGAGCCTTGGAAACGCGTCGATGCTTTTATCCGGGACCAG

GCAGAGTC

GGTGTGGTCACGGATTCCCAAGAGGCAGACCGAGCAATTATCTCGGATTTAAAACGCCAGTGGT

CCGGCCTC

- 72 038595

TCACTCCATTGCGCCTGGGTTTCGGGACTGATGATCTTTGTTGGCGCACTGGTCATCTGCTTTC

TGCGATCGC

AACGAATCGGAGAACAGGACGTTGAACATCTGCGGACGGACCTGGATACGGAACCTTTGTTGTT

GACGGTG

GACGGGAATTTGGAATAAAAGATGCGTAACACCTGTCGAAGATGCGATAACTTTACATACAGGC

AAACAGT

G TATACAATTATAGTATTTTGTATGTTGCATAAAGT TAGAT GCAAGAGTAC T GС TAACAGTACT GCATCCATT

AC G С TAT С CAACACTGCCTCTACСAC T T T T GTAACCAACATATAT T CAAC T СCGAATAACAACA

CATCAACG

AC G С CACACACAT С T G T СAC С T CACAAG CGT CAAC CAT T G G CAACAT СAC CAAC GTTACCTCCG

ACTTGAGT

AC T T T CACAAC CGTATATTC TAGAT T CAATACAT CAT T T G С CAATATAT CTAATACGGCTGTCA CTACAGAAT

T GAT T T CAACAAATAC CAACAC TATCTCATCTTTTAC CAAC G TAACAG СAAAC G C TAGAT CATC TTATAACAC

AACAAT СAC C G TAAC TGT CAC G T CAGAT GAAAC T T C G CACAAC G TAT С СAC TAATAAT G СAC T T

ATAAGCAC

ACCATGGCCTACAAATTGCAGCGCCACAACATACACCACGTACAACCTTACTAACTCTTCCAAC

GCTTGTCA

CACAGAGACAACAAT CATAC G T T T CAAGGAAAC CAATACAACAGGAATAGAAGGGAG TAAT G T C

ACCATAA

AGGGTAATTCTACGTGGGACTGTCTTTCAGTCGCCTGGATACGACATTACAATAGATCCACACA

CGGACATC

ATCTAGGTTATCGTAAGAACGCACATACCCAATCTTGGTATTGGCTACGCATCCTTACCTCTCA

CACTGTATG

T CAT T С T CAACAT GAAAGAC CTT СAC T G TAG CAT GAC TTATGTCGTTCGTG CAACAACACAGAA TTACATCTG

TAG GAT С T AAAT AT C AC CAAT T С C G G CAG G TAG AG C AGAC G T T G T T T T AAAGAAAAT T AC T T C A CAGGACAT

CAC GAAGAT GAAAAT TTCTACCTATTAG TAACAC СAAAAAAT CATAC T GAAG CTATTAATGCTA

CTTTCGTT

T G С С С TAGATACAACAC C GATAT C GAAAAT GAAGATAGAGAGAAAG GAAG T CAACATAC TAACA

ATACACA

TCACCACAAACGTAATCTCTATCATAGCTCGCAAAGAAGCCGCACCGTATGGACCATCGTGTTG

GTTTGTAT

- 73 038595

GGCCTGCATAGTTCTGTTTTTTGCACGACGAGCCTTTAACAAAAAGTATCATATGTTACAAGAC

ACCGTCAG

T GAAT CAGAAT TCATTGTTCGATAT СAC С CAGAACAT GAAGAT T GAG CTACGTTTCCGGG CAGA

CATCTTAT

GAAG С T GAACAATAAAC TAAAACAT T С T G TAAGAC T CAG C G T T CAAAG GAATAT TAATGCCCAT

TGAGCGA

AAACTAATATTGCAATGGACTGGCGATTTACGGTTACGTGGACCGTTACTTGTGATGGTTTCAA

TTATACAGT

CCATAAAAGATGCGATCGCAGTTACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGTAGCAACATA

ACTCTAA

AAAAATGCAATCAGACTGAGAAATGGCACAATGTAGACTGGATTCATTATGAGTACCCCACGCA

TAAAATG

TGCGAATTAGGCAACTATCACCAAACCACACCACGGCACGACATATGTTTTGACTGCAACGACA

CCTCCCTA

AAATTACTACGTAACGGTGTTAATTGGAGACACAACGTTATTCACTCTTGGCACATGCCCTGTA

AGATATAA

AGAAT С TAC GAACAC T GAAAACAC CAT T G GAAG TAG CAT CATAGAAAC CATT GAGAAAG С TAAC

ATTCCCC

TGGGAATTCATGCTGTATGGGCAGGCGTAGTGGTATCAGTGGCGCTTATAGCGTTGTACATGGG

TAGCCATC

G CAT T С С CAAAAAG С C G CAT TACAC CAAAC T T С С СAAATAT GAT С CAGAT GAAT T T T G GAC TAA

GGCTTAAC

ATGCTGATCAATAAACTTTTTTTAACCAATAACATGTCTCCGTTTTTTTTTGTTAACAACCTAT

GATATAAAG

CGTTATATTCAGTCGTTACTAAACAAAAAAACATGGGCATGCAATGCAACACTAAATTGTTATT

GCCAGTCG

C AC TAATACCGGTTG C AAT CATCCTAATTGGTACTCTAGTGCCGATACTTT T AC AT GAAC AAAA

AAAGGCGT

TTTACTGGCGACTTTTTCTGCAAAGTCAACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGA

CACAGTCT

ACCTAGACGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACT TTGTGGATG

GAAC GGATATCTACG CAAT G T TAGACAT TAG TAGACAAACACAT CGTGTTCCCCG CAAT T CAT C TGCATAAA

- 74 038595

CGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATGTAACATTAAACGATTCAGGCGCTTATACTGAACAC GTTTACGA

AT G T GAG CTTTCGTG TAACAT ТАС ТАС TAATAAC GAATAT GAAATAC T CAAT TAT T T T GATAAC TGTAACTAC

AC CATAAATAG СAC CAAG CATAT TAT CAC CGTGGTGTCTT CAC G T CAT T С TAAACAAACAAAT T CCCACGTA

TCCACTCACGCTGGTTGGGCAGTCGCCGTGGTGACGGTAATTATGATCTACGTTCTGATCCACT

TTAACGTCC

CGG CAAC TCT GAGACACAAAC TAG GAAC TAGAAACAAC G TAAAT C G CATAG C G T GAT TATAAAG

TATCGAC

GCTAATTTCTCCAAGATAAAATTTGATTACTCCGTGCAGTTCTCAAAAACTGTAAGGCCCCGCT

TTTCCACTC

CGTCATGAAGGATCGCAATAGAATACTGCTATGTATCATCTTTATTTGCATTATGTGCCTCATT

TGTATTTAC

TTTAAACGTCGTTGTGTTTTTACTCCGTCTCCAGACAAAGCAGATCTGCGAGTGGAATTTCCCT

CGTTACCCC

CGTGTATTGGCATACAGTGCGCTGCATGAGAACACGCGTGACACATAGCGTACCCCTGGACGGT

ACAGTTTA

T GATAAC G TAAT T CAG G GAAAG TATACAT T CATAC CAACAT G T TAT CACATAACACACAGAT T T

TCTGCGTG

TTTTATAAAAGAGCGTCTCGAAGCAGCTTGAGCCACACTACGGTCCAGATGACGAGCGTAATTA

AAAATATG

CCGCGCAGTATTCGAAAGCCGTACTGAGCGTGCGAGGCGGGTAGGGTGCCGAACGACGGATATG

CGTCGTT

GTCATCTTCGACTATAAGGATCGCGACCGAGTCTTCGGCCATGGTAAACGTCACCCTGTGTGGC

TGGTATGT

AGCGTATCCGGTTTGGAATTGTTCTGCTCCAGCTCGGGGGATAGTGAGGAATTCTCAAGGGATA

CGGGACCC

AATGACTGGATAAGAGAAGGGTTTTTCCCCGTAAGATGATCCTCGTATCACATGAGGTCTGGAT

ATGTATAA

ATGAAGAGTGAAATAGGCACAGGGAATCAGATGCCAGCCTCGTGATGCAGCCGCTGGTTCTCTC

GGCGAAG

AAACTGTCGTCTTTGCTGACTTGCAAATACATCCCGCCTTAAGCGATGAGTCTATAAAGCACCG

TTGCCCGA

GTACGGTAAAAGTGACCCGGATTGTAGAACGTCCTTTTTTTTTGTTTTTGCATCGTTTATCGTC

ACTAGTAGT

- 75 038595

GCAATATTTTGATTGTAAGGCTGAAAGAGTATCGTTATGATGCTTAGAACGTGGAGATTATTAC

AGATGGTA

CTGCTTGCCGCGTACTGTTATTATGTTTTTGCGACTTGTTCAATCAGCACGACGACTGCTCCTG

TGGAATGGA

AGTCTCCCGACCGTCAGATTCCCAAGAATATTACCTGCGCTAATTACTCAGGGACCGTCAACGG

CAACGTTA

GTTCGTTCTTCCC GAAAC T C CAG G G TAAG TAT GAG GAACAAGAT TACAGATAT GAAG TAG C GAA

CCTGACGT

ATAACTGCACCTATAACCGCTTGACGTTGCTGAATCTGACGACGGAAAACAGCGGAAAGTACTA

TTTCAAAA

GGGAAGATGCGAATTTCACCTTCTATTACTCTTGTTACAACTTGACCGTGTCCTAAAGATCGCA

CGTGAAGTT

TCACAGAGCCGCGTGGCTGTAGCTATTGTGTTTACGTTGCTTTTGAAATGTTAAGCGTCCCTAC

GGCGCTAAC

ATGTTTCTAGGCTACTCTGACTGTGTAGATCCCGGCCTTGCTGTGTATCGTGTATCTAGATCAC

GCTTAAAGC

TCATGTTGTCTTTTGTGTGGTTGGTCGGTTTGCGTTTCTATGATTGTGCCGCGTTCGAGTCCTG

CTGTTACGAC

ATCACCGAGGCGGAGAGTAACAAGGCTATATCAAGGGACGAAGCAGCATTCACCTCCAGCGTGA

GCACCCG

TACACCGTCCCTGGCGATCGCGCCTCCTCCTGACCGATCGATGCTGTTGTCGCGAGAGGAAGAA

CTCGTTCC

GTGGAGTCGTCTCATCATCACTAAGCAGTTCTACGGAGGCCTGATTTTCCACACCACCTGGGTC

ACCGGCTTC

GTCCTGCTAGGACTCTTGACGCTTTTCGCCAGCCTGTTTCGCGTACCGCAATCCATCTGTCGTT

TCTGCATAG

ACCGTCTCCGGGACATCGCCCGTCCTCTGAAATACCGCTATCAACGTCTTGTCGCTACCGTGTA

GCTAGTTAG

CCAGCTGTGTGTAGTGTTTTGCTTTTGCATATTTGTTTTCAGTCAGAGAGTCTGAAACGGGGTG

GGAGGGACT

TTTGCGGGTAGTGCATGCTAAGATGAACGGGTGGGCTGGGGTGTGCTTGATAACTCACTGTTTG

AATACGCG

CTCACGCACATATGTAGCACTCAACATGTTAGCTTTTGCCCGCACGCCCCGGGGCGTGCCGAGC

TGCCTTTTT

AATAAAGTCTGGGTTTCCAGATACGCGCTGGTTCTGATTTTGATGGTTTGTGCCTCTGAAAGCT

CTACGAGCT

- 76 038595

GGGCCGTGACATCCAATGGACTGCCTAACTGTAGCACGGTAACTAGAACAGCGGGTCAAGACGC

TGAATTG

CACGGTCCGGCACCGTTAAGCTGTAATGTGACCCAGTGGGGACGTTACGAGAATGGAAGCACAC

CCGTGTT

ATGGTGCACTTTACGGGGATCAAGCATGCGAGTCTCATTAGGACACCGTGTAGCGTTTGGCTGT

TCTTGGAA

AACATTTTTTATTTATAACGTTTCTGAAAGTAGCGGTGGCACTTACTATCAAAAAGGTTACAAC

TGCACCGA

CAAACATATAACACTATCTTGTTTCAACTTAACGGTGGTTCCTCGAGCGGTTCAAAGCACAACC

ACCGTAAT

GACACCCACGCTGGTTACAAACTCCACATTCAGTGTGTCACTTGTTCCGTTGAGACTGACGACA

AATTCCAG

CGCGTTTGGACACGCTATTTATCAACGACAACAGCGTGTTGAAAACGGGACGTTATCCAAGAAC

ATAACTAA

CTTGGCATTCACCTATGGCAGCTGGGGCGTTGCGATGCTGCTGTTTGCCGCCGTGATGGTGCTC

GTTGATTTG

GGTTTGCCTCAATCGGCTTGGCGACGCTGGCGAAGCCACGTGGACGATGAAGAACGTGGTTTGT

TAATGTAG

GAAATAAAAGGCAGTTTGAGCATGACTGTTTCCAAACCGTAACGTGGTAAATAAATCATGGCTT

CCGACGTG

GGTTCTCATCCTCTGACGGTTACACGATTTCGCTGCAGAGTGCATTATGTGTACAATAAACTGT

TGATTTTAA

CTTTGTTTGCCCCCGTGATTCTGGAATCCGTCATCTACGTGTCCGGGCCACAGGGAGGGAACGT

TACCCTGGT

ATCCAACTTCACTTCAAACATCAGCGCACGGTGGTTCCGCTGGGACGGCAACGATAGCCATCTC

ATTTGCTT

TTACAAACGTGGAGAGGGTCTTTCTACGCCCTATGTGGGTTTAAGCCTAAGTTGTGCGGCTAAC

CAAATCAC

CATCTTCAACCTCACGTTGAACGACTCCGGTCGTTACGGAGCAGAAGGTTTTACGAGAAGCGGC

GAAAATG

AAACGTTCCTGTGGTATAATTTGACCGTGAAACCCAAACCTTTGGAAACTACTCCAGCTAGTAA

CGTAACAA

С CAT C G T GAG GAG GAGAT C GAG GAT GAT C GAG G C GAAAAG TAAG G T TAGAG G GAAC G C CAG TTT

AGCACCA

CAATTACGTGCCGTCGCTGGATTCTCCAATCAGACGCCTTTGGAAAACAACACGCACCTGGCCT

TGGTAGGT

- 77 038595

GTTGTTGTGTTTTTAGTTCTGATAGTTGTTTGCATTATGGGGTGGTGGAAATTGTTGTGTGGTA

AACCAGAGT

TATAGTAATGTGCTTTTTATCAGGGAGAAGGTTTTGTGCCAACAATGACTAGCCCGGGACTATC TGCGTCAG

AAAAT TAT GAG G GAAAT TAT GAAT T GAG G GAAAC CGG GAATACAAG G C G TAGAAATAGAAG T GA CTGGACA

ACGTTAGAAACCAGTGCATTGCTATTGAAAAACACGGAGACTGCAGTGAACCTCAGCAACGCGA

CTACGGT

CATCCCACAACCTGTAGAATACCCGGCTGGGGAAGTACAATATCAAAGAACGGCAACGCATTAT TCTTGGAT

GC TAAT CAT TGT CAT CAT TCT CAT CAT TTT TAT TAT CAT С T G T C TAG GAGCAC С T C GAAAAAT C TAGCATCACT

G GAAAGACAGTAAACAGTACGGACAAGT GT T TAT GACAGACACGGAAC TGT GACAGT GAT GT С T AAGCGTT

T GCAGG TAT T T C CAT GGATAACAAT T T TAT T T TACACAT CAAAAT С C CAG TAT T GGAAC TATAT GGCAATACC

ATGTACCCCTACAGTTGGATACGGCAGTCATAATATTAGCTTGCATCCGCTTAATAACTCATTA

TTTCAAGAC

GATGTTTTT GAAT G G TAGATAGACAAAC CAAT GGT TAGAAG TTATGTCTTTAT CAAAG TAAT GA

ACGCACAA

AAT С CAAT С TAGAC T С T С CAAATAT T G T G T G G CAAT G CACAGATAAT C G ТАСAC TAATTCTCAT GAACTTAA

С СACAACATACAG TAGAAAC TATTATTTT CAAT С С T T TAAATAT С T C G GAC GAG GAG ТАС CAAA ACCGAATA

AC T T G T G T TATAAC G T TAG T G ТАСAC T T TAC С СAC CAAACACAT TGC CATACAAC TAGAT CATC CCTGTATCC

AC C TAG AT CTG TAG AC GAT T CAT T AGAAAT AT C AC AG T C AT T С AC С T C AAC C AAC T T C AC AC AT ACCGCGGT

С СAC TAC G С CAC CGG TAAC GTT GAAG CACAACAC GACAC ТАС СAC T С CACATACAAT G T G GAT C ATACCCCT

AGTTATCGTTATAACAATCATCGTTTTAACTTGTTTCAAATTСССCCAGAAAGСTTGGAATAAA TTCACACAA

GATATGTACGTTTATTTTT CAG С T СAC T G T T T GAATAC C G TAAACATAAT GAC G TAGATATAC G

TGGTTATAC

- 78 038595

AACAGGTGTTTGTGTTATGCGGCGACTGATTAACCATATCGTGAACCATGATCTTTTCCGATGG

TCCGTCGTG

AC C G CAAT GATAT T T TACAGATAT T С C GAAAC С T G TAT G GAG G T CAC TGT CAGAG TAG G T GAT C

CAGTТАСC

CTCGGTAGTGGACATGGTTATCATCCAGGTAGGGATAACAGGGTAATGATCCTCTAGAGTCGAC

CTGCAGGC

AT GCAAGC T T GAGTAT T C TATAGT С T CACC TAAATAGC T TGG

SEQ ID NO: 11

ДНК

Род/вид - цитомегаловирус ЦМВЧ

Описательное название- пост-редактирование фрагмента ЦМВЧ

ACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGATTAC

CCTGTTAT

CCCTACCATTCCGGGCCGTGTGCTGGGTCCCCGAGGGGCGGGGGGGTGTTTTTAGCGGGGGGGT

GAAATTTG

GAGTCTTGGAGCCGCGTGTGCTGTGGAGGACGGTGACGGTGGTAAGAGTGTGCTGCGGTGCGGT

TGGGACG

GCGGCGGCGAATAAAAGCGGCGTGCGGCGCGCACGGCGAAAAGCAGACGCGCGTCTGTGTTGTG

TGTCTTT

GACCGCGGCGGAACACACGCGGAAAAGCGAGTCCCAGGGGACACACGACGAGCGAGTCCCAGGG

GGGGAC

GACGACGGCCAGGGACGCGGAAACGACGCGGAAAAGAGGAAGTCCCCAGGGGGACGGGCGGAAA

AGAGG

AAGCGCCTAGGGGACCGCGGGGGCAGGAACAGACGAAGTACGCCGCAACCCGCGTCGAGGACAC

ACGCAG

AAGCGGCCGCCCAGGGGAGGGGGGGGGGGGGACTCGCGGGCCCCGGGGCACACTTGTTGTTCCC

TCCGGCC

GCCGACACGCACCCCGAAGCCGCGCACACCGCCGACACACCCCTGACACACCCGCGACACACCC

GCCACAC

G С С С GACACAC G С С С G С GACАСАС С С GAC С GACАСАС С С Т GACАСАС С С С G С СААСАСАС С СAG

CCGCACC

CGCCCCGCCAACACACCCCCGACACACCCGACACACGCCCGCGACACACCCGGCACACACCCAC

ССАСССА

GCCGCGCCCCCGACACACCCCGAACGGCGCCGGTGCGGGACAGGGCTCACGGAGGTTTGCGGGC

CGTGAGC

ACGCCTCCCTTTGTACACACTACCGGTGCGTGGCGTCCCACGCTATTTGTTCGCGAGACCGGAC

- 79 038595

TAAGGGAG

GTTTGCGGTGCGTCAGCGCGGGGCGGCGTTTGCGGCGTGTTTCGACCAGCGCTTTGTGCGCGCT

GCCTGTGC

GTGTCGTCCCATGGTCTTTGTCAGCGGCACGGCGCTGGGGACGGGGTTTCACCGCGCTGAGGGA

TCTTTCTG

CGGGTGTGAGGGACGGAGCTTTTTTCGCACGCTGGGCACCGGGCTGGGGGACGGGGGGTGTGCG

GGACGGC

GGTGGGGCCGGGGCGTTGCGGGTACGGGGATTACGCTGGGAACGGGGACTCGCGGACCCGGGCT

GAGGGA

CGGGGGTGGCGGGGGTGTTTGCGGCGAGGACGGGGGCCTTTTGCGGCGGGGACGGGGACTCACC

CTCGCCT

ATT TAAC С T С СAC С СAC T T CAACACACACATGСCGCACAATCAT GCCAGСCACAGACACAAACA

GCACCCAC

AC CAC G С C G C T T СAC С CAGAG ТАС CAACACACGT TACСС T ТАСACCACAGCAACACACAACCGC

CTATCCAA

ACCTCGGACAAACACGCCAACGAAGAACACCGCACGCAGATGGAGCTCGACGCCGCGGATTACG

CTGCTTG

CGCGCAGGCCCGCCAACACCTCTACGCTCAAACACAACCCCAACTACACGCATACCCCAACGCC

AACCCTCA

GGAAAGCGC TCAT TTT T CCACAGAAAATCAACAT CAAC T CACGCAT С ТАС T T CACAACAT T GGC

GAAGGCGC

AGCGCTCGGCTACCCCGTCCCCCGCGCGGAAATCCGCCGCGGCGGTGGCGACTGGGCCGACAGC

GCGAGCG

ACTTCGACGCCGACTGCTGGTGCATGTGGGGACGCTTCGGAACCATGGGCCGCCAACCTATCGT

GACCTTAC

TGTTGGCGCGCCAACGCGACGGCCTCGCTGACTGGAACGTCGTACGCTGCCGCGGCACAGGCTT

TCGCGCAC

ACGATTCCGAGGACGGCGTCTCTGTCTGGCGTCAGCACTTGGTTTTTTTACTCGGAGGCCACGG

CCGCCGTGT

ACAGTTAGAACGTCCATCCGCGGGAGAAGCCCAAGCTCGAGGCCTATTGCCACGCATCCGGATC

ACCCCCAT

CTCCACATCTCCACGCCCAAAACCACCCCAGCCCACCATATCCACCGCATCGCACCCACATGCT

ACGACTCG

CCCACATCACACGCTCTTTCCTATCCCTTCTACACCCTCAGCCACGGTTCACAATCCCCGAAAC

TACGCCGTC

CAACTTCACGCCGAAACGACCCGCACATGGCGCTGGGCACGACGCGGTGAACGTGGCGCGTGGA

- 80 038595

TGCCGGC

CGAGACATTTACATGTCCCAAGGATAAACGTCCCTGGTAGACGGGGTAGGGGGATCTACCAGCC

CAGGGAT

CGCGTATTTCGCCGCCACGCTGCTTCACCGATATCCAATAAACCCATCCCCTCGCCACGACGTC

TCCGCGTAT

CTTTGTAGCCTCAGGAATCCGTCCCCACGTCCATCCATCCCGAGCACTCCACACGCTATAACAG

ACCACGGA

CACGGCAAATGCATGCAAACTTCTCATTTATTGTGTCTACTACTCTGTGTTGCTACAGGGAGTG

AAGGGGGT

GAAGGCAAAGAAAAAAAAAAGGAACAAAATAATAGATTAGCAGAAGGAATAATCCGTGCGACCG

AGCTTG

TGCTTСTTTTСTTATAAGGAGGCAAATATACTAGGGAAAACTTAAGAATAGGAAGAAACCGAGG

TTTGGGA

GAAAAGCTGAGATAAAATAGCGCATTTTCCATACAGAGGTTGTTGTTTTTGTGGATCCTAAGAG

GTTTCAAG

TGCGAATСTCAAAGTTСTCACGAGAATATTGTСTTCAAGAATCGACAACTGTGGTСCAAGATTT

TTTTTTGGT

CTTTTTAGGTTCTGCGAGGGACATCACGATGGATCGTTGCGATGAAGTCACGCGTACGCCTCTG

GTGTGGCG

CGGTGTCGTGACAGGAGAGTGTGTTTTCAGTGCAGAGCTGTCTTGATTCCTATATCCGAGTATC

TGTTTTCTC

GTAAGGACGGTAATCTTCTTTGGTGTAAGTACATCTAAAAGCTGCAAACTATATTTTAAGGGCT

GTCTCTAG

GTGTACTTTGATGCTGGAGTTTTTCCrCTGTGTTGATGTGAATAAATCTACTACTACTATTATA

TGCAGAAAGA

GTGATTATGCCGAGACAAGATTGCATTGGCTGAACTGTTTCAAAAACGCCTACACTCTACTTAT

CCGTAAAC

CTAAGGTAATACTATGTGTAAGTTGTTTTTTTTTCTTTTTGTAGTAAAATGGTGATACGTGCAA

TTAAAACTG

TATTCCATGTTTCCATCCTTTCATTTCAACTTTAAAGGCGGCTTTGAGAGCGAAGAAGTGCGAG

TGGATGACTCCTTCGTGTCCAGGGAGTCGACTACTGCAACGCTGATTGATTAAAAGATGGTCTC

CGATGATG

ATGTTGTTATTGATCGAATCATGGTGCAGAACGGCGACGGAGAGGAGCGTGTCCGCCGCCGGGA

AGGTGGT

CTCTTTCTCTTTTCTTTTTTCAAGAAATCTTCCATGTGTTTATCGTAGTGATCGAAATCGACTG

- 81 038595

ATCTCGGGTT

TTCATGAGCAA

TTCCTCGCCCGGCGCCGGCATGCCGAGGTGGGGCCACTGCGATCAGCGGCATGCCGACGCCGAC

CCGGGGA

TCTTGGATTCACCGTTTTCTCTCTTCTCTCTCTACATACAGACCGGGTGGCAGGAGCGGTAAGG

AATCATCGT

C G T С T T T CAT T С T T C GAT GAT TAT GG TAATAC TAAAT С T TAT C TAGGAGCATATACAT С TAAGA

TTGGAGTAC

TTGATAATAAT

ATAATAAAAACTCATGGACCrTGAAATCTCrCrCTTGGTTGTGGTGATTTCATTCTCATTATTG

TTCrTTTTCTTTCC

GTCTTGCGGATGAAGATGTTGCGATGCGGTTGTTGTTGGTGTTGCTATACACCGAGAGAGATGA

TCTTCTGGTTCATTTCCTATGATTGTTTGGCTGCTGACCGACGCGTCAGGATGTGCAGGGCATG

CGGGGAATC

AGGACCGGACACGGGATAATTTCATCTACCTATACGGAGATCGCGGTCCTCGCCATGAGGATCG

CGACAGG

CGCGTCGAGGGGGCAGGAACACCCTTGCGGATTGACATTCTTGGTGGTGTTTCGTTGTTGTCGG

TAGTTGTTG

GACTTTGAA

TGCGATTCGTGGTAGGTAGGAGAGGGAAATGATAATCCGAGATTAAGGAAAGGAGAAGATAAAA

AATAAA

AAAAAAATAATAAAACAGAAGCCGACCGGCCGCCGACCCGTTCCCCAGGACCAGCCTACGAGGA

ATGGATA

ACGCGGTGGCGACGGCAGCGGTGGTGGCGCTGGGGGTGGCGGCAGTGGTACTGCTGATGGTAGT

CGGGACG

GAGGAGAGGCGATGCATACATACACGCGTGCATGCTGCATGGGTGGATGGTACGGCCGGGAGAC

GCGGAA

GAGAAAC T C AC AT AAAAAG G T GAC AAAAAGAG C G G T T GAAAAAAGAAAAC GAGAT T C GAC C AGA

CAGAAG

AGAAGGACCGGGGCTTGGCGACCCTTCCACGACTGCTGTTGTCATCTCGGCTCCCCCGTCTTCT

- 82 038595

CCCGGCCAC

GGGCGGCTAAGTCACCGCCGTTCTCCCCATCCGTCCGAGCGCCGACCGACCAGCCGGCCGATTC

GCCCGCCG

GGGCTTCTGGAGAACGCCGGGGCAGCAGCGATCTGGGGAAGCCGCTAAACCCCTGCGTTTTTAT

ATGGTAGC

TCTGCCGAGCGCGGGCTGACGCGTTGAGTAAGCGGAAAGACGTGTGTGACGAAAAGGGGTCCCA

TGGTATT

TCACGTGACGATGAGGAGATGCGGTTTGGAGCACATACGGTTTAGAAAAAGGGAGTTGTCGTGA

CAAGGGC

TGAGGGACCTCTGTCTCCATGTGTGTATAAAAAGCAAGGCACGTTCATAATGTAAAAAAGAACA

CGTTGTAA

ACAAGCTATTGCTGTATCATTCGGCTGACTATGCTTCATTCGGACTGATTTTCTTTTCCTAACG GCGTAACTT

AAAG T GAT TAAC GTATGATATTTGTTCCC CAGAG TTATACTATAGTCATCATCC TAAAAT T CAG ATATAAATG

AACACATGTCGTATGGGATTATTAAGAAACCGAAACTСTСCACAGTTСACCATСTTСTTCGTCA

TTCAACCG

ATGACCCACTCCGTACAACGAATCAGTCTGCTGTGTCACACTGCAAACTACTAGCGACGTATGC

AAACAACT

T GAAAC AC GGGCTGTTGTATT GAC GAC C G T T G T AC C AT T AC T AG T C AC AT T G C AT AGAGAC CAT

CCACCGTC

ATCCCATCTTTCCCACCCGATGGAAAACCGTCTTCTATCATCAACTATGGTAAGATTTCGACCC TGCGAGGTA

T T CAG TTTCCCCATATC CATAAC CTGGATTTTATCAT TAAAC С С CAATAT TAAACAC T T T T T TA GTACCCCCCC

ACCCACCAAAAAATGTGACTGGACCGGTTCCTAGCAGCTCTGGGAGCCATGTTCAGGTTGAACC

ACAGCTAC

AGCGAAACCGAGTCCAGTGACCGGTAACCACGTCCAGCCCCTGCGTATGTACCAGTCCAAGCAC GTCCGGTC

AT T G T T C TAGACAG GAAAT С TAAC TAG G T CAAC G CAAT T T TAT T С СAC C G T TAC G CAGAATAC T AACAAACA

AACACACAAAT T TAAC GAAT TAGAC GTAGTTTAT TAGAT GAAAAC T G TAAGAACAC CAAT T CAC TAAGCGAT

ACAACAT T TAG С T GAC T T С CAAG TGC CACACAT СAC CAC TGTATTCATCCATGTTTT СAC C GAA CCAACGAG

ACAGAT C GAAGAAG С CAGAAT С T С С C GAC T T TAAAT TAGATAAAT С CAAC G TAT TAT GAC CACA

- 83 038595

GCTCGACA

СACAAATAG TTGCGTTACTATT CACAG TAG CAT TAC С TATAC С C G TAAC G T T G СACAAC СAC T G

АТСACCATT

GTTACCAAAAACGGTTTTCCACTTAGTTGTCAACGGATCTTTCCCATGCGTAATGGTCAAATTA CTACCAGTC

GTCGCTTTTAGCTCATTACGAGTATTATCCGCATCCACATATATCAACGTCATAGCTAGGCACG CTATAAGTA

CCCCCCCCCCACAATGGAATGTTGCCAAACCGGTTCTTTCCCGTTATAGCCATAGCGTTCCCAG GCAAAAGC

AAACGCCAAACCTAATGCAGTGAAAAGCGCTTGCAGCCAGAACCAGCTTATGTACCAGCCACAA TCACATC

CGGTTATTGTTTCCACAGGAAATCCTACCAGGCAAAGCCCCGCTTGTTTTGTTCCTGACCATCT TGTTTAGCA

ATTCGTAAACTGTCAGCCTAGCGACGTCCGTTTAGATCAAAAGTCACGTATATAGCGACGCTGT TTCCACCC

GTTTCCCCGTCCCGCCGTTTCCGAACAACCCACCCGGGTTCAGACAACCGACCACCAACAGAAA TATACACA

CAGACCACCGGGAGTTCAGTTAAAGATTTCATCAGGTTTATTTTGGCTGCTGCTAGTCTTTTGC

TTCTTAGAA

AAAAAATACCCATATAGAGAAATAAT GATAGT T T GACAACACATAT GGCAGGGAT TTCTTCTTC ATCAATAA

GATAT G CAAT T С С С C CAG G GAGAGAC TTT CAACAAT T GAAT T TACAAAAACAAAAT TACAT CAG GAGAAAG

AGAGGATACAT TAATAAATATAT TATAT С T GGT GTATATAC T GAAT GC T GC T GGT T CATAAGGT

AACGATGC

TACTTTTTTTAATTCCAAGATGGTTTTTCTTTGTTAGTCTTTTGTTGACTTGCTGGTTCCTAAA

AGTTCGCAAA

AACGATTGTGTGAAGATTATGACGTTGGTTGACTAGTTCATGAGATTCTGCTGTACGTGTGATG GTTATTCGC

TGGTTCGTTCTAAGATGAGTATCGTACTGTGTCTGCGATGGTCGTCTCTTACTGGCATTCTCTC GGCTGCCTCT

TGTTTTCATGATTGAAAAGGAAAAAAGGACTCCGAGGGCGCGGTCATCTTTTACTTTTCGGTTT

TCTCGTTGG

CGGGTCAGAGGTAGTCAGATCATGAGACTGTCGTGGTCGATGAAACTGTGTCTGCTCAAGTGAC GTCCATTT

CTTGTACGGAGAAAAAAGTCATCGGGATAAATAAGGCTATACAAGGCGTTGTCAAGCGTGCGGC

- 84 038595

TCTAAAC

AAATTAAGCGATACAAAATTACAGTGATACGAATAATAAATTACCCCCTCCCCCTGTGGTCCCC

CCGAGGCG

AGAGCCACCCATCGTGTACTCTCGCACCACCCACGACCACAGGGGGAGACGGGACGAAGAGACG

ACGCAG

AGCGCCATCTCCTCCTGGAGGCCGGCGGCGTTAACTGCTACAGCTGCGGCGGCGACGACAGCTG

CGATTTGT

CGGCCGACATGCCGATGGTATGGGCGGCGGCGGCGGTGGCCGCGGCAGCGGGGAGGAGAGGAGA

GAGAAG

AGGAGCGGGGCGTCCGAAGGCGAGGATGGCATGGTCTCGCCGGAGCGCCCGGCTTTTATGGAAC

ACTCGCG

TCCGGTTGGGTAT САС С СACAG GAAGAT GAAT САСААС Т Т С САААС САТ С Т Т GAGAC С С GAG ТА

ACGGTTTA

CAGGTCGCACGCCAGTCTCAGCTAAAAACAGCGGACAGTCCCACGCTGTTTCTGTTGTGGCTCT

CTCCAGTTT

CCTCATCGCCGTCTTGGTCTCCGTCATCATCGGAAGAATACCACCCGCTCTCATGCGGCAGTCG

ATCAGCCTC

GATGAACGAGACGCGGCGACGCCTTTCTACGGCCGACTGGTTGTGGTGGTGAAAGAAGAGCACC

AGCAATC

CCAGGAGGAGCAACAAGCCCTCACATGTCCAGGAGGTCGGGGAGAGGGCCTGTCGGAGATGACC

GTGAGG

CATCACGTACGGCAGCTGAGGAGAAACGGAGAAGAAAGGAAAATTACCGTCAGGGGCCGGGGTT

СТТАТТА

GAGAAACAGCACGTAGGTCAGGATCCAGATGCTAATGGCAATCATGATGACGATGATCATGCAG

GCCAAGA

CGCGGCGCACCAATGCAGAATCCAATAGCCGCCGTGCCTCCGGTTGGTGGCCGGCGGCATCTAG

AGACATG

ATTTGGGGGGGGGACCGGCGGCGCAAAAAGACAGGGAGATGGACAGTGCCACGGTGTTTTGTTA

TGATTAG

GACATGGGGACCGGAAGCCGAGACAGAGTACTACAGGGTGTTGAAGGGTAACGTGAGGGAGATC

ATGTCAT

GGGCGGGCTGAAGACCGTGCGGGGAGGATCGACGTGTGCGGTGCTTGTGGAACACGGTGTTTTA

ATATGTA

TCCGCGTGTAATGCACGCGGTGTGCTTTTTAGCACTCGGCTTGATAAGCTACGTGACCGTCTGC

GCTGAAAC

СATGGТСGССАССААСТGТСТСGТGAAAACAGAAAATАСССАССТAGСATGТAAGТGСААТССG

- 85 038595

AATAGТАС

ATCTACCAATGGCAGCAAGTGCCACGCGATGTGCAAATGCCGGGTCACAGAACCCATTACCATG

CTAGGCG

CATACTCGGCCTGGGGCGCGGGCTCGTTCGTGGCCACGCTGATAGTCCTGCTGGTGGTCTTCTT

CGTAATTTA

CGCGCGCGAGGAGGAGAAAAACAACACGGGCACCGAGGTAGATCAATGTCTGGCCTATCGGAGC

CTGACAC

GCAAAAAGCTGGAACAACACGCGGCTAAAAAGCAGAACATCTACGAACGGATTCCATACCGACC

CTCCAGA

CAGAAAGATAACTCCCCGTTGATCGAACCGACGGGCACAGACGACGAAGAGGACGAGGACGACG

ACGTTT

AACGAGGAAGACGAGAACGTGTTTTGCACCATGCAGACCTACAGCAACTCCCTCACGCTTGTCA

TAGTCACG

TCGCTGTTTTTATTCACAGCTCAGGGAAGTTTATCGAATGCCGTCGAACCAATCAAAAAACCCC

TAAAGCTC

GCCAACTACCGCGCCACTTGCGAAAACCGTACACGCACGCTGGTTACCAGGCTTAACACTAGCC

ATCACAGC

GTAGTCTGGCAACGTTATGATATCTACAGCAGATACATGCGTCGTATGCCGCCACTTTGCATCA

TTACAGAC

GCCTATAAAGAAACCACGCGTCAGGGTGGCGCAACTTTCACGTGCACGCGCCAAAATCTCACGC

TGTACAAT

CTTACGGTTAAAGATACGGGAGTCTACCTTCTACAGGATCAGTATACCGGCGATGTCGAAGCTT

TCTACCTC

ATCATCCACCCACGCAGCTTCTGCCGAGCCTTGGAAACGCGTCGATGCTTTTATCCGGGACCAG

GCAGAGTC

GGTGTGGTCACGGATTCCCAAGAGGCAGACCGAGCAATTATCTCGGATTTAAAACGCCAGTGGT

CCGGCCTC

TCACTCCATTGCGCCTGGGTTTCGGGACTGATGATCTTTGTTGGCGCACTGGTCATCTGCTTTC

TGCGATCGC

AACGAATCGGAGAACAGGACGTTGAACATCTGCGGACGGACCTGGATACGGAACCTTTGTTGTT

GACGGTG

GACGGGAATTTGGAATAAAAGATGCGTAACACCTGTCGAAGATGCGATAACTTTACATACAGGC

AAACAGT

G TATACAAT TATAGTATTTTGTATGTTG CATAAAG T TAGAT G СAACAG TAC T G С TAACAG TACT GCATCCATT

AC G С TAT С CAACAC TGCCTCTAC СAC T T T T G TAAC CAACATATAT T CAAC T С C GAATAACAACA

- 86 038595

CATCAACG

AC G С CACACACAT С T G T СAC С T CACAAG CGT CAAC CAT T G G CAACAT СAC CAAC GTTACCTCCG

ACTTGAGT

AC T T T CACAAC CGTATATTC TAGAT T CAATACAT CAT T T G C CAATATAT CTAATACGGCTGTCA

CTACAGAAT

T GAT T T CAACAAATAC CAACAC TATCTCATCTTTTAC CAAC G TAACAG СAAAC G C TAGAT CATC

TTATAACAC

AACAAT СAC C G TAAC TGT CAC G T CAGAT GAAAC T T C G CACAAC G TAT С СAC TAATAAT G СAC T T

ATAAGCAC

ACCATGGCCTACAAATTGCAGCGCCACAACATACACCACGTACAACCTTACTAACTCTTCCAAC

GCTTGTCA

C AC AGAGAC AAC AAT C AT AC G T T T C AAG GAAAC CAAT AC AAC AG GAAT AGAAG G GAG T AAT G T C

ACCATAA

AGGGTAATTCTACGTGGGACTGTCTTTCAGTCGCCTGGATACGACATTACAATAGATCCACACA

CGGACATC

ATCTAGGTTATCGTAAGAACGCACATACCCAATCTTGGTATTGGCTACGCATCCTTACCTCTCA

CACTGTATG

T CAT T С T CAACAT GAAAGAC CTT СAC T G TAG CAT GAC TTATGTCGTTCGTG CAACAACACAGAA

TTACATCTG

TAG GAT С TAAATAT CAC CAAT T С C G G CAG G TAGAG CAGAC G T T G T T T TAAAGAAAAT TAC T T CA

CAGGACAT

CAC GAAGAT GAAAAT TTCTACCTATTAG TAACAC СAAAAAAT CATAC T GAAG CTATTAATGCTA

CTTTCGTT

T G С С С TAGATACAACAC C GATAT C GAAAAT GAAGATAGAGAGAAAG GAAG T CAACATAC TAACA

ATACACA

TCACCACAAACGTAATCTCTATCATAGCTCGCAAAGAAGCCGCACCGTATGGACCATCGTGTTG

GTTTGTAT

GGCCTGCATAGTTCTGTTTTTTGCACGACGAGCCTTTAACAAAAAGTATCATATGTTACAAGAC

ACCGTCAG

T GAAT CAGAAT TCATTGTTCGATAT СAC С CAGAACAT GAAGAT T GAG CTACGTTTCCGGG CAGA

CATCTTAT

GAAG С T GAACAATAAAC TAAAACAT T С T G TAAGAC T CAG C G T T CAAAG GAATAT TAATGCCCAT

TGAGCGA

AAACTAATATTGCAATGGACTGGCGATTTACGGTTACGTGGACGATACTAATGTCCGCGTTGTC

AGAAAGCT

GCAATCAAACCTGTTCTTGTCAATGTCCCTGTAGTACTACCGTTAACTATTCAACTAGTACTGA

- 87 038595

GACAGCCAC

AT CAACATACAGTAGAACAGT TAT CAGCAATAAAAGCAC T T CAGAAT C TATAAAT T GC T С ТАС T

GCAACTAC

T T GAGAC ТАС CACAT G TAC CAACAC СAC CAC GAC CGTTACTTGTGATGGTTT CAAT TATACAG T

CCATAAAA

GATGCGATCGCAGTTACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGTAGCAACATAACTCTAAA

AAAATGC

AAT CAGAC T GAGAAAT G G CACAAT G TAGAC TGGATTCATTAT GAG TAC С С CAC G CATAAAAT G T

GCGAATT

AGGCAACTATCACCAAACCACACCACGGCACGACATATGTTTTGACTGCAACGACACCTCCCTA

ACTATСТА

CAACTTAACCACAAAAAACGCTGGAAAATATACCAGGCGTCACCGTGATAACGGTCAAGAAGAA

AATTACT

ACGTAACGGTGTTAATTGGAGACACAACGTTATTCACTCTTGGCACATGCCCTGTAAGATATAA

AGAATCTA

C GAACAC T GAAAACAC CAT T G GAAG TAG CAT CATAGAAAC CATT GAGAAAG С TAACAT T С С С С T

GGGAATT

CATGCTGTATGGGCAGGCGTAGTGGTATCAGTGGCGCTTATAGCGTTGTACATGGGTAGCCATC

GCATTCCC

AAAAAGCCGCATTACACCAAACTTCCCAAATATGATCCAGATGAATTTTGGACTAAGGCTTAAC

ATGCTGAT

CAATAAACTTTTTTTAACCAATAACATGTСTСCGTTTTTTTTTGTTAACAACСTATGATATAAA

GCGTTATATT

CAGTCGTTACTAAACAAAAAAACATGGGCATGCAATGCAACACTAAATTGTTATTGCCAGTCGC

ACTAATAC

CGGTTGCAATCATCCTAATTGGTACTCTAGTGCCGATACTTTTACATGAACAAAAAAAGGCGTT

TTACTGGC

GACTTTTTCTGCAAAGTCAACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTA

CCTAGACG

CTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTTTGTGGATG

GAACGGAT

AT С TAC G CAAT G T TAGACAT TAG TAGACAAACACAT CGTGTTCCCCG CAAT T CAT С T G CATAAA

CGAAACTA

AAGGTCTGCAGTTATATAATGTAACATTAAACGATTCAGGCGCTTATACTGAACACGTTTACGA

- 88 038595

ATGTGACC

T T T C G T G ΤAAGАТТАС ТАС ТAATAACGAATATGAAATACT CAAT TAT T T T GATAAC T GTAAC TA

CACCATAAA

TAG С AC C AAG CAT AT TAT C AC CGTGGTGTCTT C AC G T C AT T С T AAAC AAAC AAAT T С С C AC G T A

TCCACTCAC

GCTGGTTGGGCAGTCGCCGTGGTGACGGTAATTATGATCTACGTTCTGATCCACTTTAACGTCC

CGGCAACTC

T GAGACACAAACTAGGAAC TAGAAACAACGTAAAT CGCATAGCGT GAT TATAAAGTAT CGACGC

TAATTTCT

CCAAGATAAAATTTGATTACTCCGTGCAGTTCTCAAAAACTGTAAGGCCCCGCTTTTCCACTCC

GTCATGAA

GGATCGCAATAGAATACTGCTATGTATCATCTTTATTTGCATTATGTGCCTCATTTGTATTTAC

TTTAAACGTC

GTTGTGTTTTTACTCCGTCTCCAGACAAAGCAGATCTGCGAGTGGAATTTCCCTCGTTACCCCC

GTGTATTGG

CATACAGTGCGCTGCATGAGAACACGCGTGACACATAGCGTACCCCTGGACGGTACAGTTTATG

ATAACGTA

ATT CAG G GAAAG TATACAT T CATAC CAACATGT TAT CACATAACACACAGATTTTCTGCGTGTT

TTATAAAA

GAGCGTCTCGAAGCAGCTTGAGCCACACTACGGTCCAGATGACGAGCGTAATTAAAAATATGCC

GCGCAGT

ATTCGAAAGCCGTACTGAGCGTGCGAGGCGGGTAGGGTGCCGAACGACGGATATGCGTCGTTGT

CATCTTCG

ACTATAAGGATCGCGACCGAGTCTTCGGCCATGGTAAACGTCACCCTGTGTGGCTGGTATGTAG

CGTATCCG

GTTTGGAATTGTTCTGCTCCAGCTCGGGGGATAGTGAGGAATTCTCAAGGGATACGGGACCCAA

TGACTGGA

T AAGAGAAG GGTTTTTCCCCG T AAGAT GATCCTCGTAT C AC AT GAG GTCTGGATATG T AT AAAT

GAAGAGTG

AAATAGGCACAGGGAATCAGATGCCAGCCTCGTGATGCAGCCGCTGGTTCTCTCGGCGAAGAAA

CTGTCGT

CTTTGCTGACTTGCAAATACATCCCGCCTTAAGCGATGAGTCTATAAAGCACCGTTGCCCGAGT

ACGGTAAA

AGTGACCCGGATTGTAGAACGTCCTTTTTTTTTGTTTTTGCATCGTTTATCGTCACTACTAGTG

CAATATTTTG

ATTGTAAGGCTGAAAGAGTATCGTTATGATGCTTAGAACGTGGAGATTATTACAGATGGTACTG

- 89 038595

CTTGCCGC

GTACTGTTATTATGTTTTTGCGACTTGTTCAATCAGCACGACGACTGCTCCTGTGGAATGGAAG

TCTCCCGAC

CGTCAGATTCCCAAGAATATTACCTGCGCTAATTACTCAGGGACCGTCAACGGCAACGTTACAT

TTCGAGGT

CTTCAGAACAAAACGGAAGACTTTTTGTACTGGTTGTTAGGATGGGGTCATAAGTCCATTTGTT

CGTTCTTCC

C GAAAC T C CAG G G TAAC TAT GAC GAACAACATTACAGATAT GAAGTAGCGAACС T GACGTATAA

CTGCACC

TATAACCGCTTGACGTTGCTGAATCTGACGACGGAAAACAGCGGAAAGTACTATTTCAAAAGGG

AAGATGC

GAATTTCACCTTCTATTACTCTTGTTACAACTTGACCGTGTCCTAAAGATCGCACGTGAAGTTT

CACAGAGCC

GCGTGGCTGTAGCTATTGTGTTTACGTTGCTTTTGAAATGTTAAGCGTCCCTACGGCGCTAACA

TGTTTCTAG

GCTACTCTGACTGTGTAGATCCCGGCCTTGCTGTGTATCGTGTATCTAGATCACGCTTAAAGCT

CATGTTGTC

TTTTGTGTGGTTGGTCGGTTTGCGTTTCTATGATTGTGCCGCGTTCGAGTCCTGCTGTTACGAC

ATCACCGAG

GCGGAGAGTAACAAGGCTATATCAAGGGACGAAGCAGCATTCACCTCCAGCGTGAGCACCCGTA

CACCGTC

CCTGGCGATCGCGCCTCCTCCTGACCGATCGATGCTGTTGTCGCGAGAGGAAGAACTCGTTCCG

TGGAGTCG

TCTCATCATCACTAAGCAGTTCTACGGAGGCCTGATTTTCCACACCACCTGGGTCACCGGCTTC

GTCCTGCTA

GGACTCTTGACGCTTTTCGCCAGCCTGTTTCGCGTACCGCAATCCATCTGTCGTTTCTGCATAG

ACCGTCTCC

GGGACATCGCCCGTCCTCTGAAATACCGCTATCAACGTCTTGTCGCTACCGTGTAGCTAGTTAG

CCAGCTGT

GTGTAGTGTTTTGCTTTTGCATATTTGTTTTCAGTCAGAGAGTCTGAAACGGGGTGGGAGGGAC

TTTTGCGGG

TAGTGCATGCTAAGATGAACGGGTGGGCTGGGGTGTGCTTGATAACTCACTGTTTGAATACGCG

CTCACGCA

CATATGTAGCACTCAACATGTTAGCTTTTGCCCGCACGCCCCGGGGCGTGCCGAGCTGCCTTTT

TAATAAAGT

CTGGGTTTCCAGATACGCGCTGGTTCTGATTTTGATGGTTTGTGCCTCTGAAAGCTCTACGAGC

- 90 038595

TGGGCCGTG

ACATCCAATGGACTGCCTAACTGTAGCACGGTAACTAGAACAGCGGGTCAAGACGCTGAATTGC

ACGGTCC

GGCACCGTTAAGCTGTAATGTGACCCAGTGGGGACGTTACGAGAATGGAAGCACACCCGTGTTA

TGGTGCA

CTTTACGGGGATCAAGCATGCGAGTCTCATTAGGACACCGTGTAGCGTTTGGCTGTTCTTGGAA

AACATTTTT

TATTTATAACGTTTCTGAAAGTAGCGGTGGCACTTACTATCAAAAAGGTTACAACTGCACCGAC

AAACATAT

AACACTATCTTGTTTCAACTTAACGGTGGTTCCTCGAGCGGTTCAAAGCACAACCACCGTAATG

ACACCCAC

GCTGGTTACAAACTCCACATTCAGTGTGTCACTTGTTCCGTTGAGACTGACGACAAATTCCAGC

GCGTTTGG

ACAC GCTATTTAT СAAC GACAACAG C G T G T T GAAAAC G G GAC G T TAT С CAAGAACATAAC TAAC

TTGGCATT

CACCTATGGCAGCTGGGGCGTTGCGATGCTGCTGTTTGCCGCCGTGATGGTGCTCGTTGATTTG

GGTTTGCCT

CAATCGGCTTGGCGACGCTGGCGAAGCCACGTGGACGATGAAGAACGTGGTTTGTTAATGTAGG

AAATAAA

AGGCAGTTTGAGCATGACTGTTTCCAAACCGTAACGTGGTAAATAAATCATGGCTTCCGACGTG

GGTTCTCA

TCCTCTGACGGTTACACGATTTCGCTGCAGAGTGCATTATGTGTACAATAAACTGTTGATTTTA

ACTTTGTTT

GCCCCCGTGATTCTGGAATCCGTCATCTACGTGTCCGGGCCACAGGGAGGGAACGTTACCCTGG

TATCCAAC

TTCACTTCAAACATCAGCGCACGGTGGTTCCGCTGGGACGGCAACGATAGCCATCTCATTTGCT

TTTACAAA

CGTGGAGAGGGTCTTTCTACGCCCTATGTGGGTTTAAGCCTAAGTTGTGCGGCTAACCAAATCA

CCATCTTC

AACCTCACGTTGAACGACTCCGGTCGTTACGGAGCAGAAGGTTTTACGAGAAGCGGCGAAAATG

AAACGTT

ССTGTGGTATAATTTGACCGTGAAACССAAACСTTTGGAAACTACTСCAGСTAGTAACGTAACA

ACCATCGT

CACGACGACATCGACGATGATCGACGCGAAAAGTAACGTTACAGGGAACGCCAGTTTAGCACCA

CAATTAC

GTGCCGTCGCTGGATTCTCCAATCAGACGCCTTTGGAAAACAACACGCACCTGGCCTTGGTAGG

- 91 038595

TGTTGTTG

TGTTTTTAGTTCTGATAGTTGTTTGCATTATGGGGTGGTGGAAATTGTTGTGTGGTAAACCAGA

GTTATAGTA

ATGTGCTTTTTATCAGGGAGAAGGTTTTGTGCCAACAATGACTAGCCCGGGACTATCTGCGTCA

GAAAATTA

TGACGGAAATTATGAATTCACGGAAACCGCCAATACAACGCGTACAAATAGAAGTGACTGGACA

ACGTTAG

AAACCAGTGCATTGCTATTGAAAAACACGGAGACTGCAGTGAACCTCAGCAACGCGACTACGGT CATCCCA

CAACCTGTAGAATACCCGGCTGGGGAAGTACAATATCAAAGAACGGCAACGCATTATTCTTGGA

TGCTAATC

ATTGTCATCATTCTCATCATTTTTATTATCATCTGTCTACGAGCACCTCGAAAAATCTACCATC ACTGGAAAG

ACAG TAAACAG TAC G GACAAG T G T T TAT GACAGACAC G GAAC TGT GACAG T GAT G T С TAAG CGT TTGCAGG

TAT T T C CAT GGATAACAAT T T TAT T T TACACAT CAAAAT С C CAG TAT T GGAAC TATAT GGCAAT ACCATGTAG

CCCTACAGTTGGATACGGCAGTCATAATATTAGCTTGCATCCGCTTAATAACTCATTATTTCAA GACGATGTT

TTT GAAT G G TAG AT AGAC AAAC C AAT GGT TAG AAG TTATGTCTTTAT C AAAG T AAT GAAC G C AC AAAATCCA

АТС TAGAC T С T С СAAATAT T G T G T G G CAAT G CACAGATAAT C G ТАСAC TAATTCTCAT GAAC T T AACCACAA

CATACAG TAGAAAC TATTATTTT CAAT С С T T TAAATAT С T C G GAC GAG GAG ТАС СAAAAC C GAA TAACTTGT

G T TATAAC G T TAG T G ТАСAC T T TAC С СAC CAAACACAT TGC CATACAAC TAGAT CATCCCTGTA TCCACCTAC

AT С T G TAGAC GAT T CAT TAGAAATAT CACAG T CAT T СAC С T CAAC CAAC T T CACACATAC C G C G GTCCACTA

C G С CAC CGG TAAC GTT GAAG CACAACAC GACAC ТАС СAC T С CACATACAAT G T G GAT CATAC С C CTAGTTAT

CGTTATAACAATCATCGTTTTAACTTGTTTCAAATTССССCAGAAAGСTTGGAATAAATTCACA CAATACAG

ATACAGCGGTATGCTCGCCGCCGCTTAAAGAATCAACGCCAAGGAAACCAAAACGTAAAAAGAA

TAGATAT

GTACGTTTATTTTT CAG С T СAC T G T T T GAATAC C G TAAACATAAT GAC G TAGATATAC G T G G T T

- 92 038595

ATACAACAG

GTGTTTGTGTTATGCGGCGACTGATTAACCATATCGTGAACCATGATCTTTTCCGATGGTCCGT

CGTGACCGC

AATGATATTT T AC AGAT AT T С C GAAAC С T G T AT G GAG G T C AC TGT C AGAG T AG G T GAT C CAG T T

ACCCTCGG

TAGTGGACATGGTTATCATCCAGGTAGGGATAACAGGGTAATGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA

GGCATGCA

AGC T T GAG TAT T C TATAG TCT САС С TAAATAGC T TGG

SEQ ID NO: 12

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LKA1

Описательное название - последовательность gp49 LKA1

ATGGCGCAAACACCCAGTACATGGGCCGACTACGTAGGCGACGGCGTAGAGGATACGTTCCAAG

TCACAT

TCCCGTACCAGAAGCAGCAAGAGGTGTTTGTGACTGTGGGCGGCGATCCGGCAGCTTTCACATT

CATCTC

GGCAGGTTGGATTCAACTGGCAGCGGTCCCGGTAAATGGGGCCGCAATCCGTGTACGGCGCAGC

ACTGAG

GCATTCGAGCCTCGGCACGAGTTCGCCAACGGCGTGCCATTACTGCCGCGATTCATAGACGAGA

ATAATA

CCCAGTTCTTGTACACTGTACAAGAGGCAGTGAATGAGACACATGGCATTGCTTCCGAAGCGCT

GAGTGT

CGCAGAGGAGGCCAGAGGCATTGCGCAGGCGGCATCGGATAAAGTGGATGCTGCCACCATTGAC

TCCGCA

CACCAGTTGCGTCTAGACCTCGCCGACCCGGCGAAGGGGCCTGGGCTGCTAGGCTACGACCGAG

ACGTAA

GTTATCCGGTCGGGTCGGTCGGTCAAAGCCTACAGTTTCTGGAAATGGGTCGGGTCACACCAGC

GCAATT

TGGCGCCGTTGGTGATGGCGCCAGCCACCCCCTCTCTGAGCGATACGCAACTCTAGCGGAAGCT

CAGACT

GTCTATCCGCATGCAGTCGCACTCTCCGACGAAATAGACTGGGCCGCATTGCAAGCTGCCGTGG

ATT CAG

GGGCACCTGTACACATACCGTCTGGGGACTATCAGATAAATAGGGGGATTAGCAGTACGGGCTC

TСТАСА

GATTGCGGGTGATGGCGCTACATCTATTATACGCCCGACTGCTGCGTTCACTGGTACATCGGTC

CTCAGT

- 93 038595

TGTGTGGGGAGCTTAGTTGCCTTGCCGAATATATCCTCCGTGTCGGCTGGGTCCCTAACCATTG

ACTTTG

CCAGCACCCCTAATCTTGTAGCGGGGGATGTATTCATCATCTACAACCCGACTGATAGCAGCTT

CTCGGG

ATTTCGGACGAGCTATCGCGCAGGAGAGTTCTGTGAGGTCAGGGCGGTTTCTGGGAACACCGTG

AGAATC

CGTTCCGCACTCTATGCCGCATACGACGGGGCTACTGTTGCTATTTACAAAGTAGTCTCTGGTG

TAGTTG

ATATAGCTAGCATCCAAATCGTTGGCGGGACAGTCCCAATGAATGGACTGTTAGTGGAGGCTGT

CGTTTC

ACCGCGCGTCGATGACGTGACGGTCACCCTTGCAAACAACGCCGGTGTGTATTTTGCCCGCTGC

TAT GAC

GCTAAGATCACAAACAGTAATATATCGAACATCGGCGACGGTGGCGATGACTATGGAATCATCT

TTGGGA

ACTGTCACGACGGTGGGGCAGACAACTGTAAAGTCTACGCTAGGCGACATGCCATCGCCACGGG

CGGCGA

TGCAGAAGTAGGCTGCGTTCCGGTCCGTAATGTGCGTATGCGTAACTGCACACTTAGGAATGAT

ATТАСC

TCTGGTACACACTGCGCAGACTTCCACGGTAACGCCGAGGATTGCAGCTACGAAAACTGCACAA

TCTACG

GTGGTGCAACTTGGCAGGGGAAGGATATCAGCTACAGACACTGTACAATCACTAACGCGTCGGG

TGGTTG

GATTGTTATATCCGCTGAGATTCTTGGTGGTACATTCCTTCTCGACCAATGCACATTGTACACA

ACCGGC

GATCCGCAGCCTGGTAACCGTGGGGTTATAGATGTAGGTGGGAACTCCGCAGTCCTCACTACAA

ATACAA

CGCAACCCTGTAACTTCCTTATACAAGGCGGCAGTCTGCGAGCGCCCAGCTTAAGTACGTCTAG

TTACCT

ACTGCGCGCACGTCTTGAGGGTAGTACAGTTCCAGTAAACATACAGTACAGCGGACAGGCTATT

GATGTA

GGCTCTCTGGGCAAGGTACTACAACTCGATATTACCTCGGGCAGTACCTCTCCTGAGTATTTGA

TCGTGG

AGAATTTAGCGGGGTTGCCATCTGGCATCACGCTGGCGTCTGCTGCTGGTGGTTTCGCAAGTGC

CCCGAT

GCGTATGCCTGTGCTGGGTGGTAGGGTTCAAGTAACTACGGCAACCAACGCGAGTAGCGTTACT

GCTCCA

- 94 038595

GTAACGTTCAGGTACATTTATCCTAAGGCCCCAACCGTCCAGGTCACAAAGACGGACAGGAGCT

ACGCCG

GTAACAGGGTCGGCGTTGCTATCGCCAATCCGACCTCTGCGTCTGGGGCGACGTTGGGTCTGTT

CACGGA

CGACGGGACAAACTTTAGCTCAGCCGTTACTAACCAGTTGAACTGGCAGGCAGGTATTTATGAG

GTGTAA

SEQ ID NO: 13

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1

Описательное название- gp34 NTUH-K2044-K1-1

ATGGCCCTGATCCGGCTCGTGGCGCCCGAGCGCGTGTTCAGCGACCTGGCCAGCATGGTCGCCT

ATCCGAAC

TTCCAGGTGCAGGACAAGATCACCCTGCTGGGCTCGGCCGGCGGCGACTTCACCTTCACCACCA

CCGCGTCG

GTGGTGGACAACGGCACCGTGTTCGCCGTGCCCGGCGGCTATCTCCTGCGGAAGTTCGTCGGCC

CGGCGTAT

AGCTCGTGGTTCAGCAACTGGACCGGGATCGTCACGTTCATGAGCGCGCCGAACCGGCACCTGG

TGGTGGA

CACCGTGCTGCAGGCCACGAGCGTGCTGAACATCAAGAGCAACAGCACGCTGGAATTCACGGAC

ACGGGCC

GCATCCTGCCCGACGCCGCCGTGGCCCGCCAGGTGCTGAACATCACCGGCTCCGCGCCCTCGGT

GTTCGTGC

CCCTCGCCGCCGACGCCGCCGCGGGGTCGAAGGTGATCACCGTGGCCGCCGGCGCGCTGTCCGC

GGTGAAA

GGCACCTACCTCTATCTGCGCTCCAACAAGCTGTGCGACGGCGGGCCGAACACCTATGGCGTCA

AGATCAGC

CAAATCCGTAAGGTGGTCGGCGTGAGCACCAGCGGGGGCGTGACGTCCATCCGCCTCGACAAAG

CCCTGCA

CTATAACTACTACCTCTCGGATGCCGCCGAAGTGGGCATCCCGACCATGGTGGAGAACGTCACC

CTGGTGAG

CCCGTACATCAACGAGTTCGGCTACGACGACCTGAACCGCTTCTTCACCAGCGGCATCTCCGCG

AACTTCGC

GGCCGACCTGCACATCCAGGACGGCGTCATCATCGGCAACAAGCGTCCGGGCGCCTCCGACATC

GAGGGCC

GCAGCGCCATCAAGTTCAACAACTGCGTGGATAGCACCGTGAAGGGCACCTGCTTCTATAATAT

CGGCTGGT

- 95 038595

ACGGCGTGGAGGTCCTCGGCTGCTCGGAGGACACCGAGGTGCACGACATCCACGCCATGGACGT

GCGCCAT

GCCATCTCCCTGAACTGGCAAAGCACCGCCGACGGCGATAAGTGGGGCGAACCGATCGAGTTCC

TGGGCGT

GAACTGTGAGGCGTACAGCACCACCCAGGCCGGCTTCGACACCCACGACATCGGGAAGCGTGTC

AAATTCG

TCCGCTGCGTGTCCTACGACAGCGCGGATGACGGCTTCCAGGCCCGCACCAACGGCGTGGAGTA

CCTCAACT

GCCGCGCCTACCGCGCCGCCATGGACGGCTTCGCCTCGAACACGGGCGTCGCCTTCCCGATCTA

CCGCGAAT

GCCTGGCCTACGACAACGTGCGCAGCGGGTTCAACTGCAGCTACGGCGGCGGGTATGTGTACGA

CTGCGAG

GCGCACGGCAGCCAGAACGGCGTCCGCATCAACGGCGGCCGGGTCAAAGGCGGGCGCTACACCC

GCAACTC

GTCGAGCCACATCTTCGTGACGAAAGATGTGGCGGAAACCGCCCAAACCAGCCTCGAGATCGAC

GGCGTCT

CCATGCGGTACGACGGCACCGGCCGCGCCGTGTACTTCCACGGCACCGTGGGCATCGATCCGAC

GCTCGTGA

GCATGTCCAACAACGACATGACCGGCCACGGCCTGTTCTGGGCCCTGCTGTCCGGCTATACCGT

GCAGCCGA

CCCCGCCGCGCATGTCGCGCAACCTGCTCGACGATACCGGCATCCGCGGCGTCGCGACCCTGGT

CGCGGGCG

AAGCGACCGTCAATGCCCGCGTCCGCGGGAACTTCGGCAGCGTGGCCAACAGCTTCAAGTGGGT

GTCGGAG

GTGAAGCTGACGCGCCTCACGTTCCCGTCGTCGGCCGGCGCCCTCACGGTCACCAGCGTCGCCC

AAAACCAG

GACGTGCCGACCCCCAACCCGGACCTGAACAGCTTCGTCATCCGCAGCAGCAACGCCGCCGACG

TGTCCCA

AGTC GC CT GGG AGGT CT ACCTGT G A

SEQ ID NO: 14

ДНК

Род/вид - Т7-подобный Ppl5

Описательное название - добавлена последовательность др44

Рр15

ATGGCACGAACTATCGTCCAGAACGCCCTAACAGGCGGACAACAGGACTTCGAGGTACCTTTCG

АСТАСАТС

- 96 038595

TTGCAGCGCTTCGTTAAGCTTACCCTGATCGGTGACGGTAACCGACAAGAGCTGGTCCTCGGTA

CCGACTTC

CGGTTCATCGGTCCTCGCACCGTTCGCACTAACGTCTTCTGGGGACCAGCGCAGGGGTATACCT

CCATCGAG

ATCCGACGAGTTACCAGCGCTTCTGATCGTCGCGTAGAGTTCTCGGACGGGTCCATCCTGACCG

CAGGTGAT

CTGAACATCGCCCAGCTTCAGGCCATCCACATTGCCGAAGAAGCGCGAGACTCTGCCACTGAGA

ACCTGAG

CCCAGATGCTGATGGCAACTACGATGCACGTGGTGCGCGCATTTACAACCTCGGTGACGCTGTT

CAGCCGAA

GGATGCGGTCAACCGGTACACTCTTGACCTCGCTATCGCAGCCGCTCTGGCCATGAATACCGGC

AACCCGAA

CAACGCCCAGAACATCTCGTACACCCCTAACGGGCCTGGTCAGTCGATCCGAAGTGTTGAAGGC

CGTCTGCG

GGATGCTGTGTTCGTCTCGGACTACATGACCACTCCACGTGATGGAGTTACCAGTAACCAGCAG

GACCTCGA

AAAGGCACTCGCTGCGGCGAACGCTAAAGGTGCCGACCTATTCTGGCCTGACGACATCCCGTTC

TTCTCCAC

GTCCCCGCTGGCACTGATCCACGCGGTCTACCATGTTGGACGTGGTGTCATCAACGCGAACGGT

ACGCTGTT

CTACGTGAACCCGAAGAACGGCCAACACAACAGGCTACACGTGTCTCCCGGGGGCACCGGGGAT

GGTCTGG

CAGCTGGCCGCCCACTGGGGACCATCTGGAGTGCACTCGCGGCCCTTAACATGCGAGCCCCACT

GACCACGC

GCTGGTCCTTGGAGATGACCGCTGGCGCCTATAATGAAGCCGTTACACTTCCGAACTACCTGAC

CAGCTGTA

ACGACTACTTGGCGTTTAACTGGCCGAACACCGGTCAGGAACGTATGGAGCCCACTGCGTACCC

ATCAGCTC

TCGACGGCACAGGCCAGACCGGCCTCACAGGTTTCCACACTGGCATCGGCAACCGCATTACCAT

CAACAAC

GTGTGCATGTCCAACTGGTACGACACTGCGCTGACTCCTACCCAACAGGTGCGAAGAGCGTTCG

TTGTAGGT

GCGTATTCGACTGCCTACGTGGTCAACTGCGCGTTCATTTACAACGGCATCGCGAGCGTGTCTG

TGCTGCCC

GGTGGCACTGCTATCGTAACCGGTGGCATCGTCGATGGTGGGCGGTTCGGCCTCGACAACACTG

GCGGTCGC

- 97 038595

CTGTCCCTGACGGCAACCAAGAGCAATTATACGCAGGTCCGGAACTGCCTCGAATATGGACTGT

ACTCGAAG

CATGACGCATCGACCGTAATGGACAACACCGAGTTCCGCAACTGCGGTAATCACCCTGCGGCTG

TTGCGTAT

GGTGCTGCAATCTTCGCGTACAAGTTCAACTGTTCTGTTGACACTCGTGGGGTCAAGTTCTACG

GCAACAAC

ATCGCCCAGCACTGCCGTGGCGGTATCACCTCGGACAATCCGGGCGATCCGGACATCTACGGTA

CCGGCGCA

GATGCTAATAAGCGTCTATTCCTGTGCACCGGTGGTGGCTCTGACGACATCCAGTTCTACGAAG

CTCGGCGC

GTCATGGACATCACGAAGCGCACTGGTGGCGGCTCAACTACTGCCAGCGTATCGTCGCTGCTAC

TGGCTGCC

GTTGCGTCTGTCCGTAAGGGCTACTTTGCGCACAACGATCAGGTGATCCGGATGACCCTGATGT

TCCGCGCT

ACAGGCTCGGCTGGCATCTTCACGCCGACCTTGCGCACACCTCTGGGGACTATCCCTCTGGGTA

GCTTCAGG

GTCGCATCGGGACAGTACGGCGAGATCAAGTTGACCATTCGACCTACTCTGACATCTGATGGTC

TCATAGTC

GGGTTCTCCTGCATCAACGCCGTGCAGAATCTTGGGTCCTCTGTTGGTCAAATCATCGTCAGCG

GCACCGTA

GACCTCCGCACCGTCGACCAGCTGGTCGAGATGTGGGGCTATTCGGAAGCTGGTGGCACCGCTT

CGTACATT

CAAGGCCT GATCGAGCT GGTCGGGT GA

SEQ ID NO: 15

ДНК

Род/вид - Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Описательное название - добавлена последовательность dspB

ATGAACTGTTGCGTCAAGGGCAATTCCATCTACCCCCAGAAGACCTCCACCAAGCAGACCGGCC

TGATGCTC

GATATCGCCCGGCATTTCTACAGCCCCGAGGTGATCAAGAGCTTCATCGATACGATCAGCCTGA

GCGGCGGC

AACTTCCTCCACCTGCACTTCTCGGACCATGAAAACTATGCCATCGAGTCGCACCTGCTCAACC

AGCGGGCG

GAGAACGCCGTCCAGGGGAAGGATGGCATCTACATCAATCCGTACACCGGGAAACCGTTCCTGA

GCTACCG

CCAGCTGGACGACATCAAGGCCTACGCCAAGGCCAAGGGCATCGAACTGATCCCGGAGCTGGAC

- 98 038595

AGCCCGA

ACCATATGACGGCCATCTTCAAACTGGTCCAGAAGGACCGCGGCGTCAAGTACCTGCAGGGGCT

GAAATCC

CGCCAGGTGGACGACGAGATCGACATCACCAACGCCGATAGCATCACCTTCATGCAGAGCCTGA

TGAGCGA

GGTCATCGATATCTTCGGCGACACGAGCCAGCACTTCCACATCGGCGGCGACGAATTCGGCTAC

TCCGTCGA

GAGCAACCACGAGTTCATCACCTACGCCAACAAGCTGTCGTACTTCCTGGAGAAGAAGGGGCTC

AAGACCC

GCATGTGGAACGACGGCCTCATCAAGAACACCTTCGAGCAGATCAATCCCAACATCGAAATCAC

GTACTGG

TCGTACGACGGCGACACCCAGGATAAGAACGAAGCGGCCGAGCGCCGCGACATGCGCGTGAGCC

TGCCGGA

GCTGCTGGCGAAGGGCTTCACCGTGCTGAACTACAACAGCTACTACCTCTACATCGTGCCGAAG

GCGAGCCC

GACGTTCTCGCAGGACGCCGCCTTCGCCGCCAAAGACGTGATCAAGAACTGGGATCTGGGCGTC

TGGGATG

GCCGGAACACCAAGAACCGCGTGCAGAACACCCATGAGATCGCCGGGGCGGCGCTGTCGATCTG

GGGCGAG

GATGCGAAGGCGCTCAAGGACGAGACGATCCAGAAGAACACCAAAAGCCTGCTCGAGGCCGTCA

TCCACAA

GACCAACGGCGACGAGTGA

SEQ ID NO: 16

ДНК

Род/вид- Staphylococcus aureus

Описательное название- добавлена последовательность SaPSMaS

ATGGAGTTCGTGGCGAAGCTCTTCAAGTTCTTCAAGGACCTGCTCGGGAAGTTCCTGGGGAATA

ACT GA

SEQ ID NO: 17

ДНК

Род/вид- Staphylococcus aureus

Описательное название- добавлена последовательность SaPAMb2

ATGACCGGCCTGGCCGAGGCGATCGCGAATACCGTCCAGGCGGCCCAGCAGCACGACAGCGTCA

AGCTGGG

CACCTCGATCGTGGACATCGTCGCCAACGGCGTGGGCCTGCTGGGCAAACTCTTCGGCTTCTGA

SEQ ID NO: 18

- 99 038595

ДНК

Род/вид- Staphylococcus epidermidis

Описательное название - добавлена последовательность SePSMa ATGGCGGACGTCATCGCCAAGATCGTCGAGATCGTGAAGGGCCTGATCGACCAGTTCACCCAGA AGT GA

SEQ ID NO: 19

ДНК

Род/вид- Levivirus MS2

Описательное название- добавлена последовательность L MS2 ATGGAGACCCGGTTCCCGCAGCAGTCCCAGCAAACCCCGGCCAGCACCAACCGCCGCCGCCCCT TCAAGCA

CGAGGACTACCCGTGCCGCCGGCAGCAGCGCAGCTCCACCCTGTACGTGCTGATCTTCCTGGCG АТСТТССТ

GAGCAAGTTCACCAACCAGCTGCTGCTGTCCCTGCTGGAGGCGGTCATCCGGACCGTCACCACC CTGCAGCA

GCTGCTGACCTGA

SEQ ID NO:20

ДНК

Род/вид- Levivirus PRR1

Описательное название- добавлена последовательность L PRR1

AT G Т G СAAG G Т G Т С ТАС ТAAG G ТAGAC Т С ТАААС Т GAC Т GAG Т СAG Т Т G GACAAC Т САС САТАА GGAGCTAC

CTATGGCTACGGAATATCCTAGCATTAGCAGGACTTCTTTTCGTAATCCTTCTTGCGACCAATC АТТТАТССА

TCGCTATCTACAGTCCGTAA

SEQ ID NO:21

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - промотор gp32 (Р32) LGZ19

CGACCCTGCCCTACTCCGGCCTTAAACCCACATCCAAAAGAGAGAGAATCGC

SEQ ID NO:22

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - терминатор gp32 (Т₃₂) LGZ19

TGCCACGAAACCCCGCACTTCGGTGTGGGGTTTCTTCAAAGCCTAACGACCCGCGCAGATTCCC TGCGTGGG

- 100 038595

TTTTTGCGCTTTAGGAGAAACCCT

SEQ ID NO:23

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - область gp7 LUZ19 дикого типа

TACAAGGTGGTGGCACCCAGCTCGGCGGAAGGTATCATTGTGCTGGCGACCAAGCAGACGCCGG

CGCTAGC

CCAAGCAGCCGTCGTACTGCACAGCATGAACCCTGCGCAGTATCCCGCAGGTTCGGCTATCCTC

AACACGGC

CTGGAAGTGCCGCCGCCTGGGAGTGGGCGAGTACGTCAAGCTCGTCCAAGGGGAGGAGGAC

SEQ ID NO:24

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название- область gp!8 LUZ19 дикого типа

GAATGCCAACCGAAGAAGAACGCATGATCCGCTGTTTACTGGCGGATATCCACGAGCCACTGGA

CCTGCTGT

TCCCCGGCCTCCGTACCAAGGCCCATATGGACCCGCAAGCAGAGGAACTGTCGATTCGAATTGA

CTACGACC

ATGCGAAGCTGGGCCGTATGGGATTCTGCCACGCGGTATCCCTATATCAACTGTCCATATATGG

CCGCGAGG

GGATGGTCCGCTACCTGATGCAGGAGATTCCCCGCCGCGTGCTGGAAGGTCTGCTGGTCAAGGC

GCAGCAGT

ACAGCCAAAGCAACTGGTACAGCAAATGACGAC

SEQ ID NO:25

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - др49 и межгенная область др48-др49

LUZ19 дикого типа

GGGGACACCATGAGCAAAGCCAAACTACGAGTCATCGCCGACACCCCGGAGCTGGAGTCAGTGC

TAAAAGC

ATTGCTGACCGCCACCTACGCTATCGAGGACCTGCTCAACGAGGCCGTGGCTAGCAAGGTGCTA

AACTCCCG

CCTGGGCTGGTCCGCAGTCGGCGAGTATGTCGAACTGTTCAACCGCACGCAATCCCGCGTGGCC

GGGTTGAT

TCCCGAGTAG

SEQ ID NO:26

- 101 038595

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LKD16

Описательное название - ген gp!8 LKD16 дикого типа

GTGCGAGTACCAACTGAACACGAGCGCACCCTGCGCTGCCTGCTCCAAGACATCCACGGGCCGC

TGAATCTG

CTGTTCCCAGGTATCCGGGTGAAGGTGGAGGAGGCGTGCCTCGGATACTTGGGCTACAGGGAGC

GGGGCTA

TTGGGAGCTGCGCCTCCAGGTGGACTACGACCACCCGAAGCTTGGGCACCTCCGCTACAGTCAG

GCCGTGCC

GGAGTACGTGCTGATCAACGACCGCGACAGCATCATCAAGTACCTGATGGAAGCAGTCCCTCGG

CAGGTAC

TAGAGGGCATGCTCAATAAGGCCCAGGAATTCGTAACCAAGAACTGGTATTCCCTATGA

SEQ ID NO:27

ДНК

Синтетический (искусственный/неизвестный)

Описательное название - ген, кодирующий NLS-FLAG-CAS9-His

ATGCCCAAGAAAAAGCGGAAGGTCGGCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTTGGAGCCTGGAG

AGAAGC

CCTACAAATGCCCTGAGTGCGGAAAGAGCTTCAGCCAATCTGGAGCCTTGACCCGGCATCAACG

AACGCAT

ACACGAGACAAGAAGTACTCCATCGGGCTGGACATCGGGACGAACTCCGTGGGATGGGCCGTGA

ТСACAGA

CGAATACAAGGTGCCTTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGGAACACGGACAGACACTCCATCAAG

AAGAACC

TCATCGGGGCCTTGCTCTTCGACTCCGGAGAAACCGCCGAAGCAACGCGATTGAAAAGAACCGC

CAGAAGA

CGATACACACGACGGAAGAACCGCATCTGCTACCTCCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCA

AGGTGGA

CGACTCGTTCTTTCATCGCCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAAGACAAGAAACATGAGCGC

САСССGA

TCTTCGGGAACATCGTGGACGAAGTGGCCTACCACGAGAAATACCCCACGATCTACCACTTGCG

CAAGAAA

CTCGTGGACTCCACGGACAAAGCGGACTTGCGGTTGATCTACTTGGCCTTGGCCCACATGATCA

AATTTCGG

GGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACTTGAATCCCGACAATTCCGACGTGGACAAGCTCTTCATCC

AGCTGGTG

- 102 038595

CAGACCTACAACCAGCTCTTCGAGGAGAACCCCATCAATGCCTCCGGAGTGGACGCCAAAGCCA

TCTTGTCC

GCCCGATTGTCCAAATCCAGACGCTTGGAGAACTTGATCGCACAACTTCCTGGCGAGAAGAAGA

ACGGCCT

CTTCGGCAACTTGATCGCGCTGTCGCTGGGATTGACGCCTAACTTCAAGTCCAACTTCGACTTG

GCCGAGGA

CGCCAAGTTGCAACTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTCGACAACCTGCTGGCCCAAATT

GGCGACC

AATACGCGGACTTGTTTTTGGCGGCCAAGAACTTGAGCGACGCCATCTTGTTGAGCGACATCTT

GCGCGTGA

ATACGGAGATCACCAAAGCCCCTTTGTCCGCCTCTATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCA

AGACTTGA

CCCTGTTGAAAGCCCTCGTGCGGCAACAATTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCA

GTCCAAGA

ACGGGTACGCCGGCTACATCGACGGAGGAGCCTCCCAAGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCC

CATCCTG

GAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGTTGCTCGTGAAGCTGAACCGCGAAGACTTGTTGCGAAAAC

AGCGGAC

GTTCGACAATGGCAGCATCCCCCACCAAATCCATTTGGGAGAGTTGCACGCCATCTTGCGACGG

CAAGAGG

ACTTСTACСCGTTССTGAAGGACAACCGCGAGAAAATCGAGAAGATССTGACGTTCAGAATССC

CTAGTAGG

TGGGACCCTTGGCCCGAGGCAATTCCCGGTTTGCATGGATGACGCGCAAAAGCGAAGAGACGAT

CACCCCC

TGGAACTTCGAAGAAGTGGTCGACAAAGGAGCATCCGCACAGAGCTTCATCGAGCGAATGACGA

ACTTCGA

CAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGTTGCCCAAGCATTCGCTGCTGTACGAGTACTTCACGGTG

TAGAACGA

GCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGCAAACCCGCGTTCCTGTCGGGAGAGCAA

AAGAAGG

CCATTGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAACAGCTGAAAGAGGACTA

CTTCAAG

AAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGATTCAATGCCTCCTTGG

GAACCTAC

CATGACCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCC

TGGAGGA

- 103 038595

CATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGAGAGATGATCGAGGAACGGTTGAAAACGTAC

GCCCACTT

GTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAACGCCGCCGCTACACCGGATGGGGACGATTGAGC

CGCAAAC

TGATTAATGGAATTCGCGACAAGCAATCCGGAAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGG

GTTCGCCA

ACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGACGACTCCTTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGC

CCAAGTGT

CCGGACAAGGAGACTCCTTGCACGAGCACATCGCCAATTTGGCCGGATCCCCCGCAATCAAAAA

AGGCATC

TTGCAAACCGTGAAAGTGGTCGACGAACTGGTGAAGGTGATGGGACGGCACAAGCCCGAGAACA

TCGTGAT

CGAAATGGCCCGCGAGAACCAAACCACCCAAAAAGGACAGAAGAACTCCCGAGAGCGCATGAAG

CGGATC

GAAGAGGGCATCAAGGAGTTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCATCCCGTGGAGAATACCCAAT

TGCAAAA

CGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGGCGGGACATGTACGTCGACCAAGAGCTGGAC

ATCAACC

GCCTCTCCGACTACGATGTGGATCATATTGTGCCCCAGAGCTTCCTCAAGGACGACAGCATCGA

CAACAAGG

TCCTGACGCGCAGCGACAAGAACCGGGGCAAGTCTGACAATGTGCCTTCCGAAGAAGTCGTGAA

GAAGATG

AAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTCAACGCCAAGCTCATCACCCAACGGAAGTTCGACAACCTGA

CCAAGGC

CGAGAGAGGAGGATTGTCCGAGTTGGACAAAGCCGGCTTCATTAAACGCCAACTCGTGGAGACC

CGCCAGA

TCACGAAGCACGTGGCCCAAATCTTGGACTCCCGGATGAACACGAAATACGACGAGAATGACAA

GCTGATC

CGCGAGGTGAAGGTGATCACGCTGAAGTCCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGT

TCTACAA

GGTGCGGGAGATCAACAACTACCATCACGCCCATGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTCGGAACC

GCCCTGA

TCAAGAAATACCCCAAGCTGGAGTCCGAATTCGTGTACGGAGATTACAAGGTCTACGACGTGCG

GAAGATG

ATCGCGAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAAGCCACCGCCAAGTACTTCTTTTACTCCAACATCA

TGAACTTC

- 104 038595

TTCAAGACCGAGATCACGCTCGCCAACGGCGAGATCCGCAAGCGCCCCCTGATCGAGACCAACG GCGAGAC GGGAGAGATTGTGTGGGACAAAGGAAGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAGGTGCTGTCCATGCCT CAGGTGA

ACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAAACAGGAGGGTTTTCCAAAGAGTCCATTTTGCCTAAGAG GAATTCC GACAAGCTCATCGCCCGCAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGGGGCTTCGACTCCCCCA CGGTGGC CTACTCCGTGTTGGTGGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGAGCAAGAAGCTGAAATCCGTGAAG GAGTTGC TCGGAATCACGATCATGGAACGATCGTCGTTCGAGAAAAACCCCATCGACTTCCTCGAAGCCAA AGGGTAC

AAAGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACG GCCGCAA GCGGATGCTGGCCTCCGCCGGGGAACTGCAGAAAGGGAACGAATTGGCCTTGCCCTCCAAATAC GTGAACT TCCTCTACTTGGCCTCCCATTACGAAAAGCTCAAAGGATCCCCTGAGGACAATGAGCAGAAGCA ACTCTTCG TGGAACAACACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGCGCGT GATCCTC GCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTCTCCGCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCTATCCGCG AGCAAGC CGAGAATATCATTCACCTGTTTACCCTGACGAATTTGGGAGCCCCTGCCGCCTTTAAATACTTT GACACCACC ATCGACCGCAAAAGATACACСTССACCAAGGAAGTСTTGGACGССACССTCATССACCAGTСCA TCACGGGC CTCTACGAGACGCGCATCGACCTCTCCCAATTGGGCGGCGACCATCATCACCACCACCACTAA

SEQ ID NO:28

ДНК

Род/вид - Inovirus M13MP18

Описательное название - заменена область М13МР18 дикого типа ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATG CAAGCTTG GCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCC TTGCAGCA

- 105 038595

CATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGT

TGCGCAGC

CTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGG

AGTGCGA

TCTTCCTGAGGCCGATACGGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCC

ATCTACAC

CAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGT

TACTCGCTC

ACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTC

CTATTGGT

TAA

SEQ ID NO:29

ДНК

Неизвестный/искусственный - коммерчески доступный из DNA2.О

Описательное название - последовательность паприка

AT GGT GT CAAAGGGAGAAGAAC Т GAT CAAAGAGAATAT GAGGAT GAAAC Т С ТАСАТ GGAAGGAA

CTGTGA

ACAACCACCATTTCAAGTGCACGAGCGAGGGTGAAGGGAAACCTTACGAAGGTACCCAGACCAT

GCGGATT

AAGGTCGTCGAAGGAGGACCACTCCCCTTCGCATTCGACATCCTGGCCACTTCCTTCATGTACG

GGTCGCGC

ACTTTCATCAAGTACCCAAAAGGGATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTTCCGGAGGGATTCA

CTTGGGAA

CGCGTCACTAGATACGAGGATGGCGGAGTGGTCACCGTGATGCAAGACACCTCTTTGGAAGATG

GATGCCT

GGTGTACCACGTGCAAGTCAGAGGAGTGAACTTTCCGAGCAATGGGCCGGTGATGCAGAAGAAA

ACCAAGG

GCTGGGAACCGAACACCGAAATGCTGTATCCAGCAGACGGAGGCTTGGAGGGCCGGTCCGACAT

GGCTCTG

AAGCTTGTTGGAGGAGGACATCTGTCCTGCTCGTTCGTGACGACCTACCGGAGCAAGAAGCCGG

CGAAAAA

CCTTAAGATGCCGGGGATCCACGCGGTGGATCATCGCCTGGAAAGGCTCGAGGAGTCAGACAAC

GAGATGT

TTGTCGTGCAACGCGAGCACGCCGTGGCCCGCTACTGTGATCTCCCTTCAAAGCTGGGCCACAA

GCTGAATT

CCGGCCTCCGGTCGAGAGCCCAGGCTTCGAATTCAGCCGTGGACGGAACTGCGGGCCCTGGTTC

- 106 038595

GACCGGA AGCCGATGA

SEQ ID NO :30

ДНК

Род/вид- Lambdavirus лямбда

Описательное название - последовательность ell фага X дикого типа Е. coli ATGGTTCGTGCAAACAAACGCAACGAGGCTCTACGAATCGAGAGTGCGTTGCTTAACAAAATCG CAATGCTT GGAACTGAGAAGACAGCGGAAGCTGTGGGCGTTGATAAGTCGCAGATCAGCAGGTGGAAGAGGG ACTGGA TTCCAAAGTTCTCAATGCTGCTTGCTGTTCTTGAATGGGGGGTCGTTGACGACGACATGGCTCG ATTGGCGC GACAAGTTGCTGCGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAAT CCAGATG GAGTTCTGA

SEQ ID NO :31

Белок

Синтетический (искусственный/неизвестный)

Описательное название - белок NLS-FLAG-CAS9-His, транслируемый из SEQ ID NO: 27 MPKKKRKVGDYKDDDDKLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTRDKKYSIGLDIGTNSV GWAVITDEYK VPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEM AKVDDSFFHRLE ESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRG HFLIEGDLNPDN SDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLI ALSLGLTPNFKSN FDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSA SMIKRYDEHHQ DLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLN REDLLRKQRTFD NGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSE ETITPWNFEEWD KGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKA

- 107 038595

IVDLLFKTNR

KVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVL

TLTLFEDREMIEE

RLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIH

DDSLTFKEDIQ

KAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKWDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKG

QKNSRERMKR

IEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFL

KDDSIDNKVLTR

SDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVE

TRQITKHVA

QILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTA

LIKKYPKLESE

FVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGE

IVWDKGRDFATV

RKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVA

KVEKGKSKKL

KSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ

KGNELALPSKYV

NFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKH

RDKPIREQAENII

HLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDHHHHHH

SEQ ID NO:32

ДНК

Род/вид - цитомегаловирус ЦМВЧ

Описательное название - фрагмент RL13 ЦМВЧ после редактирования

ATGGACTGGCGATTTACGGTTACGTGGACGATACTAATGTCCGCGTTGTCAGAAAGCTGCAATC

AAACCTGT

Т С Т Т G Т СAAT GTCCCTGTAGTACTACCGT ТААС ТАТТ СAAC TAG ТАС Т GAGACAG С САСАТ САА

САТАСAGТА

CAACAGT ТАТ CAGCAATAAAAGCAC Т Т CAGAAT С ТАТАААТ Т GC Т С ТАС Т GCAAC TACACCAGC

AAACACCG

Т Т Т С ТАСААААС С G Т С G GAAACAAC СACACAGATАТ С СACAAC GAC GAACACАААС G Т Т GAGAC

ТАССАСА

Т G ТАС СААСАС САС САС GAC CGTTACTTGTGATGGTTT СAAT ТАТACAG Т С СATAAAAGAT G С G

- 108 038595

ATCGCAGT

TACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGTAGCAACATAACTCTAAAAAAATGCAATCAGA CTGAGAA

ATGGCACAATGTAGACTGGATTCATTATGAGTACCCCACGCATAAAATGTGCGAATTAGGCAAC TATСАСGA

AAG САСAC CAC G G CAC GACATAT G T T T T GAC T G СAAC GACAC С T С С С TAAC TAT С TACAAC T TA ACCACAAA

AAACGCTGGAAAATATACCAGGCGTCACCGTGATAACGGTCAAGAAGAAAATTACTACGTAACG GTGTTAA

TTG GAGACACAAC G T TAT T СAC T С T T G G CACAT G С С С T G TAAGATATAAAGAAT С TAC GAACAC TGAAAACA

CCATTGGAAGTAGCATCATAGAAACCATTGAGAAAGCTAACATTCCCCTGGGAATTCATGCTGT ATGGGCAG

GCGTAGTGGTATCAGTGGCGCTTATAGCGTTGTACATGGGTAGCCATCGCATTCCCAAAAAGCC GCATTACA

С СAAAC T T С С СAAATAT GAT С CAGAT GAAT T T T G GAC TAAG G С T TAA

SEQ ID NO:33

ДНК

Род/вид - цитомегаловирус ЦМВЧ

Описательное название - предварительное редактирование фрагмента RL13 ЦМВЧ ATGGACTGGCGATTTACGGTTACGTGGACCGTTACTTGTGATGGTTTCAATTATACAGTCCATA AAAGATGC GATCGCAGTTACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGTAGCAACATAACTCTAAAAAAAT GCAATCA GACTGAGAAATGGCACAATGTAGACTGGATTCATTATGAGTACCCCACGCATAAAATGTGCGAA TTAGGCA АСТАТ САС С AAAC С АС АС САС G G САС GAC AT AT G Т Т Т Т GAC Т G С AAC GAC АС С Т С С С Т ААС ТАТ СТАСААСТ

Т AAC С AC AAAAAAC G С Т G GAAAAT АТ АС С AG G С G Т САС С G Т GAT AAC G G Т С AAGAAGAAAAT ТА CTACGTA

ACGGTGTTAATTGGAGACACAACGTTATTCACTCTTGGCACATGCCCTGTAAGATATAAAGAAT СТАСGAAC

ACTGAAAACACCATTGGAAGTAGCATCATAGAAACCATTGAGAAAGCTAACATTCCCCTGGGAA TTCATGCT GTATGGGCAGGCGTAGTGGTATCAGTGGCGCTTATAGCGTTGTACATGGGTAGCCATCGCATTC

- 109 038595

CCAAAAAG

С C G CAT ТАСАС СAAAC Т Т С С СAAATAT GAT С СAGAT GAAT Т Т Т G GAC ТAAG G С Т ТАА SEQ ID NO:34 Белок Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gpl3 LUZ19 дикого типа MLALGAFDLSGLMVGSCLWGGELKALCVDDRHSRQGIGAELVRAAELAGAEYLTCFEFLEPFY ADLGWSTTH REANWTAGEPDVLHMRAPGHDV

SEQ ID NO:35

Белок

Род/вид- PMkmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gp38 LUZ19 дикого типа MARFKNPETIHVADGVEAVFSLDFPFLRREDVFVQVDKILVTDYTWVDDTNIQLAVVPKKDQEV RIFRDTPAQVP DTQFSQDIPFLPRYIDANNKQLLYAVQEGINTANLALDGVLDAIRIAEEARRLAQEALDAANEA LRRALGFAEIRT VTEDSDIDPSWRGYWNRCITADKPLTLTMQMEDPDAPWVEFSEVHFEQAGVRDLNIVAGPGVTI NRLQNTTMQL YGENGVCTLKRLGANHWIWGAMEDE SEQ ID NO:36 Белок Род/вид- PMkmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gp40 LUZ19 дикого типа MFKTEVKGRYTLIRRKADGTPVETLEFDNIITNAGLDWIAAMDTDLMGEPVAVSTSTADPNPSA PAIPEWQRTS ASAPGGGTTSGLDGEWLFWRRRWRFPQGTLAGQVLATVGLICNSDRRFESNTGELIPKDTPLSY TRIKDAAGQPT TLWAADEILDVQYEFRSRPVGTAEAKFVISGVERTFRLIPKPFANRANLSGERYIFYNTNPYI NGKDASGGNVRD GQWQKKYPKYVRGSYKAQITLLAQVQNGNMAGGITGTEELQIYNGRNYVLDINPPVVKNNTQEF TVTLEFTVAR А

- 110 038595

SEQ ID NO:37

Белок

Род/вид- Pseudomonas aeruginosa

Описательное название - последовательность белка PyoS5

MSNDNEVPGSMVIVAQGPDDQYAYEVPPIDSAAVAGNMFGDLIQREIYLQKNIYYPVRSIFEQG TKEKKEINKKV

SDQVDGLLKQITQGKREATRQERVDVMSAVLHKMESDLEGYKKTFTKGPFIDYEKQSSLSIYEA WVKIWEKNSW

EERKKYPFQQLVRDELERAVAYYKQDSLSEAVKVLRQELNKQKALKEKEDLSQLERDYRTRKAN LEMKVQSEL

DQAGSALPPLVSPTPEQWLERATRLVTQAIADKKQLQTTNNTLIKNSPTPLEKQKAIYNGELLV DEIASLQARLVK

LNAETTRRRTEAERKAAEEQALQDAIKFTADFYKEVTEKFGARTSEMARQLAEGARGKNIRSSA EAIKSFEKHKD

ALNKKLSLKDRQAIAKAFDSLDKQMMAKSLEKFSKGFGWGKAIDAASLYQEFKISTETGDWKP FFVKIETLAA

GAAASWLVGIAFATATATPIGILGFALVMAVTGAMIDEDLLEKANNLVISI

SEQ ID NO:38

Белок

Род/вид- PMkmvlikevirus LKD16

Описательное название - последовательность белка Gpl8 LKD16 MRVPTEHERTLRCLLQDIHGPLNLLFPGIRVKVEEACLGYLGYRERGYWELRLQVDYDHPKLGH LRYSQAVPEY

VLINDRDSIIKYLMEAVPRQVLEGMLNKAQEFVTKNWYSL

SEQ ID NO:39

Белок

Род/вид- PMkmvlikevirus LKA1

Описательное название - последовательность белка Gp49 LKA1

MAQT PS TWADYVGDGVEDT FQVT FPYQKQQEVFVTVGGDPAAFT FISAGWIQLAAVPVNGAAIR

VRRSTEAFEP

RHEFANGVPLLPRFIDENNTQFLYTVQEAVNETHGIASEALSVAEEARGIAQAASDKVDAATID SAHQLRLDLAD

PAKGPGLLGYDRDVSYPVGSVGQSLQFLEMGRVTPAQFGAVGDGASHPLSERYATLAEAQTVYP HAVALSDEID

WAALQAAVDSGAPVHIPSGDYQINRGISSTGSLQIAGDGATSIIRPTAAFTGTSVLSCVGSLVA LPNISSVSAGSLTI

- 111 038595

DFASTPNLVAGDVFIIYNPTDSSFSGFRTSYRAGEFCEVRAVSGNTVTIRSALYAAYDGATVAI

YKWSGWDIASI

QIVGGTVPMNGLLVEAVVSPRVDDVTVTLANNAGVYFARCYDAKITNSNISNIGDGGDDYGIIF

GNCHDGGADN

CKVYARRHAIATGGDAEVGCVPVRNVRMRNCTLRNDITSGTHCADFHGNAEDCSYENCTIYGGA

TWQGKDISY

RHCTITNASGGWIVISAEILGGTFLLDQCTLYTTGDPQPGNRGVIDVGGNSAVLTTNTTQPCNF

LIQGGSLRAPSLS

TSSYLLRARLEGSTVPVNIQYSGQAIDVGSLGKVLQLDITSGSTSPEYLIVENLAGLPSGITLA

SAAGGFASAPMRM

PVLGGRVQVTTATNASSVTAPVTFRYIYPKAPTVQVTKTDRSYAGNRVGVAIANPTSASGATLG

LFTDDGTNFSS

AVTNQLNWQAGIYEV

SEQ ID NO:40

Белок

Род/вид- PMkmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1

Описательное название - последовательность белка Gp34 NTUHК2044-К1-1

MALIRLVAPERVFSDLASMVAYPNFQVQDKITLLGSAGGDFTFTTTASWDNGTVFAVPGGYLL

RKFVGPAYSS

WFSNWTGIVTFMSAPNRHLWDTVLQATSVLNIKSNSTLEFTDTGRILPDAAVARQVLNITGSA

PSWVPLAADA

AAGSKVITVAAGALSAVKGTYLYLRSNKLCDGGPNTYGVKISQIRKWGVSTSGGVTSIRLDKA

LHYNYYLSDA

AEVGIPTMVENVTLVSPYINEFGYDDLNRFFTSGISANFAADLHIQDGVIIGNKRPGASDIEGR

SAIKFNNCVDSTV

KGTCFYNIGWYGVEVLGCSEDTEVHDIHAMDVRHAISLNWQSTADGDKWGEPIEFLGVNCEAYS

TTQAGFDTH

DIGKRVKFVRCVSYDSADDGFQARTNGVEYLNCRAYRAAMDGFASNTGVAFPIYRECLAYDNVR

SGFNCSYGG

GYVYDCEAHGSQNGVRINGGRVKGGRYTRNSSSHIFVTKDVAETAQTSLEIDGVSMRYDGTGRA

VYFHGTVGID

PTLVSMSNNDMTGHGLFWALLSGYTVQPTPPRMSRNLLDDTGIRGVATLVAGEATVNARVRGNF

GSVANSFKW

VSEVKLTRLTFPSSAGALTVTSVAQNQDVPTPNPDLNSFVIRSSNAADVSQVAWEVYL

SEQ ID NO :41

- 112 038595

Белок

Род/вид - Т7-подобный Рр15

Описательное название - последовательность белка Gp44 Рр15

MARTIVQNALTGGQQDFEVPFDYILQRFVKLTLIGDGNRQELVLGTDFRFIGPRTVRTNVFWGP

AQGYTSIEIRRV

TSASDRRVEFSDGSILTAGDLNIAQLQAIHIAEEARDSATENLSPDADGNYDARGARIYNLGDA

VQPKDAVNRYT

LDLAIAAALAMNTGNPNNAQNISYTPNGPGQSIRSVEGRLRDAVFVSDYMTTPRDGVTSNQQDL

EKALAAANAK

GADLFWPDDIPFFSTSPLALIHAVYHVGRGVINANGTLFYVNPKNGQHNRLHVSPGGTGDGLAA

GRPLGTIWSAL

AALNMRAPLTTRWSLEMTAGAYNEAVTLPNYLTSCNDYLAFNWPNTGQERMEPTAYPSALDGTG

QTGLTGFHT

GIGNRITINNVCMSNWYDTALTPTQQVRRAFVVGAYSTAYVVNCAFIYNGIASVSVLPGGTAIV

TGGIVDGGRFG

LDNTGGRLSLTATKSNYTQVRNCLEYGLYSKHDASTVMDNTEFRNCGNHPAAVAYGAAIFAYKF

NCSVDTRGV

KFYGNNIAQHCRGGITSDNPGDPDIYGTGADANKRLFLCTGGGSDDIQFYEARRVMDITKRTGG

GSTTASVSSLL

LAAVASVRKGYFAHNDQVIRMTLMFRATGSAGIFTPTLRTPLGTIPLGSFRVASGQYGEIKLTI

RPTLTSDGLIVGF

SCINAVQNLGSSVGQIIVSGTVDLRTVDQLVEMWGYSEAGGTASYIQGLIELVG

SEQ ID NO:42

Белок

Род/вид - Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Описательное название - последовательность белка DspB

MNCCVKGNSTYPQKTSTKQTGI.MI,DTARHFYSPF.VTKSFTDTTSLSGGNFI. HI,HFSDHF .NYATF. SHI,1,NQRAF.NAV

QGKDGIYINPYTGKPFLSYRQLDDIKAYAKAKGIELIPELDSPNHMTAIFKLVQKDRGVKYLQG

LKSRQVDDEIDI

TNADSITFMQSLMSEVIDIFGDTSQHFHIGGDEFGYSVESNHEFITYANKLSYFLEKKGLKTRM

WNDGLIKNTFEQI

NPNIEITYWSYDGDTQDKNEAAERRDMRVSLPELLAKGFTVLNYNSYYLYIVPKASPTFSQDAA

FAAKDVIKNW

DLGVWDGRNTKNRVQNTHEIAGAALSIWGEDAKALKDETIQKNTKSLLEAVIHKTNGDE SEQ ID NO:43

- 113 038595

Белок

Род/вид- Staphylococcus aureus

Описательное название - последовательность белка SaPSMaS MEFVAKLFKFFKDLLGKFLGNN

SEQ ID NO:44

Белок

Род/вид- Staphylococcus aureus

Описательное название - последовательность белка SaPAMb2

MTGLAEAIANTVQAAQQHDSVKLGTSIVDIVANGVGLLGKLFGF SEQ ID NO:45 Белок

Род/вид- Staphylococcus epidermidis

Описательное название - последовательность белка SEPSMa MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK SEQ ID NO:46 Белок Род/вид- Levivirus MS2

Описательное название - последовательность белка L MS2 METRFPQQSQQTPASTNRRRPFKHEDYPCRRQQRSSTLYVLIFLAIFLSKFTNQLLLSLLEAVI RTVTTLQQLLT

SEQ ID NO:47

Белок

Род/вид- Levivirus PRR1

Описательное название - последовательность белка L PRR1

MCKVSTKVDSKLTESVGQLTIRSYLWLRNILALAGLLFVILLATNHLSIAIYSP SEQ ID NO:48 Белок

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gpl8 LUZ19 MRMPTEEERMIRCLLADIHEPLDLLFPGLRTKAHMDPQAEELSIRIDYDHAKLGRMGFCHAVSL YQLSIYGREGM

VRYLMQEIPRRVLEGLLVKAQQYSQSNWYSK

SEQ ID NO:49

Белок

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gp49 LUZ19

- 114 038595

MSKAKLRVIADTPELESVLKALLTATYAIEDLLNEAVASKVLNSRLGWSAVGEYVELFNRTQSR VAGLIPE

SEQ ID NO :50

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность гена gp!8 LUZ19

ATGAGAATGCCAACCGAAGAAGAACGCATGATCCGCTGTTTACTGGCGGATATCCACGAGCCAC TGGACCT

GCTGTTCCCCGGCCTCCGTACCAAGGCCCATATGGACCCGCAAGCAGAGGAACTGTCGATTCGA ATTGACTA

CGACCATGCGAAGCTGGGCCGTATGGGATTCTGCCACGCGGTATCCCTATATCAACTGTCCATA TATGGCCG

CGAGGGGATGGTCCGCTACCTGATGCAGGAGATTCCCCGCCGCGTGCTGGAAGGTCTGCTGGTC

AAGGCGC

AGCAGTACAGCCAAAGCAACTGGTACAGCAAATGA

SEQ ID NO:51

ДНК

Род/вид- Phikmvlikevirus LUZ19

Описательное название - последовательность белка Gp49 LUZ19

ATGAGCAAAGCCAAACTACGAGTCATCGCCGACACCCCGGAGCTGGAGTCAGTGCTAAAAGCAT ТGCTGAC

CGCCACCTACGCTATCGAGGACCTGCTCAACGAGGCCGTGGCTAGCAAGGTGCTAAACTCCCGC CTGGGCTG

GTCCGCAGTCGGCGAGTATGTCGAACTGTTCAACCGCACGCAATCCCGCGTGGCCGGGTTGATT CCCGAGTA

G

- 115 038595

Перечень последовательностей < 110> SYNTHETIC GENOMICS, INC. DIPETRILLO, Christen CADY, Kyle C. BARBU, Elana M.

< 120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВИРУСНОГО ГЕНОМА IN VITRO < 130> SGI1840-3WO < 150> US 62/092,707 < 151> 2014-12-16 < 150> US 62/102,362 < 151> 2015-01-15 < 150> US 62/242,811 < 151> 2015-10-16 < 160> 51 < 170> Patentin версии 3.5 < 210> 1 < 211> 288 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19

<220>
< 221> misc_feature < 223> gpl3 LUZ19 дикого типа < 400> 1 gtgctggccc tcggtgcctt cgacctgtcc	ggcctgatgg	taggttcctg	cctcgtagta	60
ggtggtgagc	tgaaggccct	gtgcgttgat	gaccggcaca	gcaggcaggg	tatcggcgct	120
gagctggtac	gggccgctga	gctggctggt	gccgagtatc	tgacctgctt	cgagttcctg	180
gagccgttct	acgccgactt	gggctggagc	accacccacc	gcgaggcgaa	ctggacagca	240
ggagagccgg	acgtgctgca	catgagggca	cccggtcatg	acgtatga		288

< 210> 2 < 211> 756 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

- 116 038595 < 221> misc_feature < 223> gp38 LUZ19 дикого типа <400> 2

gtggctcggt	tcaagaatcc	cgagaccatc cacgttgcag	atggggtcga	ggctgtcttc	60
agtctcgact	tcccgttcct	gcggcgtgag gacgtattcg	tccaggtcga	taagatactc	120
gtcaccgact	atacgtgggt	agacgacacc aacatccaat	tggccgtggt	gccgaagaag	180
gaccaagagg	tccgcatctt	ccgcgacacg cccgcccagg	tcccggacac	acagttcagc	240
caggacatcc	cgttcctgcc	tcgatacatc gacgcgaaca	acaagcagct	cctgtacgct	300
gtgcaggaag	gcatcaacac	cgcgaacctc gctctcgatg	gcgtactcga	cgcgatccgt	360
atcgccgagg	aggctcgtcg	cctggcgcag gaagcactcg	acgccgccaa	tgaggcgctt	420
cgccgtgccc	tgggcttcgc	tgagattcgc accgtgaccg	aggactcgga	catcgatccg	480
agctggcgcg	gttactggaa	ccgttgcatc accgccgata	aacctctgac	cctgaccatg	540
cagatggaag	acccggatgc	accgtgggtc gagttcagcg	aggttcactt	cgagcaggcc	600
ggtgtgcgtg	acctaaacat	cgtagccggt cctggcgtta	ccatcaaccg	tttgcagaac	660
accaccatgc	agctctacgg	cgagaatggc gtgtgtactc	tcaagcggct	gggcgctaac	720
cactggatcg	tgttcggggc	catggaggac gaataa			756

< 210> 3 < 211> 906 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature < 223> gp40 LUZ19 дикого типа <400> 3

atgtttaaga	ccgaagtaaa	gggacgttac accctgattc	gccgcaaggc	ggacggcact	60
ccggtggaga	ctctggagtt	cgacaacatc attacgaatg	cgggcctgga	ttggatcgcc	120
gctatggata	ccgacctcat	gggcgaaccc gtagcggtca	gcacttctac	agccgatccc	180
aacccgagcg	cacccgccat	cccggaggtt gtgcaacgca	cgtccgcatc	tgcccctggt	240
ggaggtacta	cgtcgggcct	ggatggcgag tggctgttct	ggcggaggcg	ttggagattc	300

- 117 038595

ccgcagggca	ccctagctgg	tcaagtcctg	gccaccgtgg	gcctcatctg	caactcggat	360
cgtcgcttcg	agagtaacac	gggtgagctg	atcccgaagg	ataccccgct	gtcgtacact	420
cgcatcaagg	acgccgccgg	gcagcctact	actctggtgg	tggccgctga	cgagattctg	480
gatgtccagt	acgagttccg	cagccggccc	gtaggaacgg	ctgaggccaa	gttcgtgatc	540
tccggcgtgg	aacgcacctt	ccggctgatc	ccaaagcctt	ttgcgaaccg	tgctaatctc	600
tccggggaac	gctacatctt	ctacaacacc	aacccctaca	tcaacggcaa	ggacgcctcc	660
ggcggcaatg	tccgagacgg	tcagtggcag	aagaaatatc	ccaagtacgt	gcgcggctcc	720
tacaaggcgc	agatcacgct	gctggcccag	gtccagaacg	gcaatatggc	tggcggcatc	780
accggcaccg	aggaactcca	gatttacaat	ggacgtaact	atgtgctcga	tatcaacccg	840
cctgttgtga	agaacaatac	ccaggagttc	accgtgaccc	tggagtttac	ggtggcgagg	900
gcataa						906

< 210> 4 < 211> 2481 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature < 223> gp34 LUZ19 дикого типа <400> 4

atgagctaca	agcaatccgc	gtatcccaat	ctgctgatgg	gtgtgagcca	gcaggtgccc	60
ttcgagcgcc	tgccgggcca	gctcagcgag	cagatcaaca	tggtatccga	tcccgtgtca	120
ggacttcggc	ggcgcagcgg	tatcgagctg	atggcccacc	tgctgcatac	cgaccagccc	180
tggccgaggc	cgttcctcta	ccacacgaac	ctcggtggcc	gcagcattgc	gatgctggtg	240
gcgcagcacc	gtggcgagct	gtacctgttc	gacgagcggg	acggtcgcct	gctgatgggt	300
cagcccctgg	tgcatgacta	cctcaaggcc	aacgattaca	ggcagctacg	ggccgccacg	360
gtggccgatg	acctgttcat	cgccaacctg	agtgtaaagc	ccgaggccga	ccgcaccgac	420
atcaagggcg	tagaccccaa	caaggccggc	tggctgtaca	tcaaggcagg	ccagtattcg	480
aaggcattct	ccatgaccat	caaggtcaag	gacaacgcca	ccggcaccac	ctacagccac	540

- 118 038595

acggccacct	acgtgacgcc	ggacaacgcc	agcacgaacc	ccaacctcgc	tgaggcgcca	600
ttccaaacga	gcgtaggcta	catcgcgtgg	cagctctacg	gcaagttctt	cggtgcgccg	660
gagtacactc	tgcccaactc	gacgaagaag	tacccgaagg	tagacccgga	cgccaacgcg	720
gcaaccatag	ccggttacct	caaccaacgg	ggcgtgcagg	acgggtacat	cgcgttccgt	780
ggcgacgccg	atatccacgt	tgaagtgtcc	acggacatgg	gcaacaacta	cggcatagcc	840
tccggcggta	tgagcctcaa	cgccacggca	gacctgccgg	ccttactgcc	gggcgcgggt	900
gctcctggcg	tgggtgtgca	gttcatggac	ggcgctgtca	tggccaccgg	ctccaccaag	960
gccccggtat	acttcgagtg	ggattccgct	aaccgccgct	gggcagagcg	ggccgcctac	1020
ggcaccgatt	gggtcctgaa	gaagatgcca	ctggccctgc	gctgggatga	ggctaccgac	1080
acctacagct	tgaacgagct	ggagtatgat	cgacgtggct	ccggcgacga	ggatacgaac	1140
cccacgttca	acttcgtcac	ccgaggcatc	accggcatga	cgaccttcca	gggtcgcctc	1200
gtcctcctgt	cgcaggagta	cgtctgcatg	tcggccagta	acaatccaca	ccgctggttc	1260
aagaagtcgg	cagccgcgct	gaacgacgat	gatcctatcg	agatcgcagc	ccaggggagc	1320
ctgactgaac	cgtacgagca	cgcggtcacc	ttcaacaagg	acttgatcgt	cttcgccaag	1380
aagtatcagg	ccgtggtccc	cggtggcggc	attgtaactc	cccggacggc	ggttatcagc	1440
atcaccacgc	agtacgacct	cgataccagg	gcggcacctg	ccgtgactgg	ccgcagtgtg	1500
tacttcgctg	cggagcgtgc	cctgggtttc	atgggcctgc	atgagatggc	cccgtctccg	1560
tccacggaca	gccactacgt	cgccgaagac	gttaccagcc	acatcccgag	ctacatgccg	1620
gggcctgctg	agtacatcca	ggcggcggcc	tccagcggct	acctggtgtt	cggcaccagc	1680
acggcggacg	agatgatctg	ccaccagtac	ctctggcagg	gcaacgagaa	agtgcagaac	1740
gcgtttcatc	gctggacgtt	gcggcatcag	atcatcggcg	cctacttcac	tggtgacaac	1800
ctgatggttc	tgattcagaa	gggccaggag	atcgccctgg	gacggatgca	cctgaacagc	1860
ctgccagccc	gtgagggtct	gcaataccct	aaatacgact	actggcggcg	tatcgaggcg	1920
accgtcgatg	gtgagctgga	actgaccaag	cagcattggg	acctgatcaa	ggatgcctct	1980
gccgtgtacc	agctacagcc	tgtggccggc	gcctacatgg	agcgtaccca	tctcggcgtg	2040
aagcgcgaga	cgaatacgaa	ggtgttcctc	gacgtgcccg	aggccgtggt	cggggcggtg	2100

- 119 038595

tatgtggtcg	gctgcgagtt ctggtcgaag	gtggagttca	ctccgccggt	tctccgggac	2160
cacaatggcc	tgcccatgac	ctcgacccgt	gcagtgcttc	atcggtacaa	cgtaaacttc	2220
ggctggaccg	gcgagttcct	gtggcgcatc	agcgacacgg	ctcgacccaa	ccagccgtgg	2280
tacgacacga	cgcccctccg	gttgttcagc	cggcaactca	atgccgggga	gcctctggtg	2340
gatagcgctg	tggtgccgct	gccggcacgg	gtcgatatgg	ccacgtccaa	gttcgagctg	2400
agctgtcaca	gtccgtacga	catgaacgtt	cgggctgtcg	agtacaactt	caagtccaac	2460
caaacctaca	ggagggtgtg	a				2481

<210> 5 <211> 826 <212> белок <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> белок Gp34 LUZ19 дикого <400> 5

Met Ser Tyr Lys Gin Ser Ala Tyr 1 5 типа

Pro Asn Leu Leu Met Gly Vai Ser

15

Gin Gin Vai Pro Phe Glu Arg Leu 20

Pro Gly Gin Leu Ser Glu Gin lie 25 30

Asn Met Vai Ser Asp Pro Vai Ser

40

Gly Leu Arg Arg Arg Ser Gly lie 45

Glu Leu Met Ala His Leu Leu His

55

Thr Asp Gin Pro Trp Pro Arg Pro 60

Phe Leu Tyr His Thr Asn Leu Gly 65 70

Gly Arg Ser lie Ala Met Leu Vai

80

Ala Gin His Arg Gly Glu Leu Tyr 85

Leu Phe Asp Glu Arg Asp Gly Arg

95

Leu Leu Met Gly Gin Pro Leu Vai

His Asp Tyr Leu Lys Ala Asn Asp

- 120 038595

100 105110

Tyr Arg Gln Leu Arg Ala Ala Thr Vai Ala Asp Asp Leu Phe lie Ala

115 120125

Asn Leu Ser Vai Lys Pro Glu Ala Asp Arg Thr Asp lie Lys Gly Vai

130 135140

Asp Pro Asn Lys Ala Gly Trp Leu Tyr lie Lys Ala Gly Gln Tyr Ser

145 150 155160

Lys Ala Phe Ser Met Thr lie Lys Vai Lys Asp Asn Ala Thr Gly Thr

165 170175

Thr Tyr Ser His Thr Ala Thr Tyr Vai Thr Pro Asp Asn Ala Ser Thr

180 185190

Asn Pro Asn Leu Ala Glu Ala Pro Phe Gln Thr Ser Vai Gly Tyr lie

195 200205

Ala Trp Gln Leu Tyr Gly Lys Phe Phe Gly Ala Pro Glu Tyr Thr Leu

210 215220

Pro Asn Ser Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Vai Asp Pro Asp Ala Asn Ala

225 230 235240

Ala Thr lie Ala Gly Tyr Leu Asn Gln Arg Gly Vai Gln Asp Gly Tyr

245 250255 lie Ala Phe Arg Gly Asp Ala Asp lie His Vai Glu Vai Ser Thr Asp

260 265270

Met Gly Asn Asn Tyr Gly lie Ala Ser Gly Gly Met Ser Leu Asn Ala

275 280285

Thr Ala Asp Leu Pro Ala Leu Leu Pro Gly Ala Gly Ala Pro Gly Vai

290 295300

Gly Vai Gln Phe Met Asp Gly Ala Vai Met Ala Thr Gly Ser Thr Lys

- 121 038595

Ala

335

Arg

Arg

Trp

305

310

315

320

Ala

Pro

Val

Tyr

Phe

325

Glu

Trp

Asp

Ser

Ala

330

Asn

Glu

Arg

Ala

Ala

Tyr 340

Gly

Thr

Asp

Trp

Val

345

Leu

Lys

Lys

Met

Pro

350

Leu

Ala

Leu

Arg

Trp 355

Asp

Glu

Ala

Thr

Asp 360

Thr

Tyr

Ser

Leu

Asn

365

Glu

Leu

Glu

Tyr

Asp 370

Arg

Arg

Gly

Ser

Gly 375

Asp

Glu

Asp

Thr

Asn

380

Pro

Thr

Phe

Asn

Phe

385

Val

Thr

Arg

Gly lie

390

Thr

Gly

Met

Thr

Thr

395

Phe

Gln

Gly

Arg

Leu

400

Val

Leu

Leu

Ser

Gln

405

Glu

Tyr

Val

Cys

Met

410

Ser

Ala

Ser

Asn

Asn

415

Pro

His

Arg

Trp

Phe

420

Lys

Lys

Ser

Ala

Ala

425

Ala

Leu

Asn

Asp

Asp

430

Asp

Pro lie

Glu lie

435

Ala

Ala

Gln

Gly

Ser

440

Leu

Thr

Glu

Pro

Tyr 445

Glu

His

Ala

Val

Thr

450

Phe

Asn

Lys

Asp

Leu

455 lie

Val

Phe

Ala

Lys 460

Lys

Tyr

Gln

Ala

Val

465

Val

Pro

Gly

Gly

Gly 470 lie

Val

Thr

Pro

Arg 475

Thr

Ala

Val lie

Ser

480 lie

Thr

Thr

Gln

Tyr 485

Asp

Leu

Asp

Thr

Arg 490

Ala

Ala

Pro

Ala

Val

495

Thr

Gly

Arg

Ser

Val

500

Tyr

Phe

Ala

Ala

Glu

505

Arg

Ala

Leu

Gly

Phe

510

Met

Gly

Leu

His

Glu

Met

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr

Asp

Ser

His

Tyr

Val

Ala

- 122 038595

	515	520	525
Glu Asp 530	Vai Thr Ser	His lie Pro Ser Tyr 535	Met Pro Gly Pro Ala Glu 540
Tyr lie 545	Gln Ala Ala	Ala Ser Ser Gly Tyr 550	Leu Vai Phe Gly Thr Ser 555 560
Thr Ala	Asp Glu Met 565	lie Cys His Gln Tyr 570	Leu Trp Gln Gly Asn Glu 575
Lys Vai	Gln Asn Ala 580	Phe His Arg Trp Thr 585	Leu Arg His Gln lie lie 590
Gly Ala	Tyr Phe Thr 595	Gly Asp Asn Leu Met 600	Vai Leu lie Gln Lys Gly 605
Gln Glu 610	lie Ala Leu	Gly Arg Met His Leu 615	Asn Ser Leu Pro Ala Arg 620
Glu Gly 625	Leu Gln Tyr	Pro Lys Tyr Asp Tyr 630	Trp Arg Arg lie Glu Ala 635 640
Thr Vai	Asp Gly Glu 645	Leu Glu Leu Thr Lys 650	Gln His Trp Asp Leu lie 655
Lys Asp	Ala Ser Ala 660	Vai Tyr Gln Leu Gln 665	Pro Vai Ala Gly Ala Tyr 670
Met Glu	Arg Thr His 675	Leu Gly Vai Lys Arg 680	Glu Thr Asn Thr Lys Vai 685
Phe Leu 690	Asp Vai Pro	Glu Ala Vai Vai Gly 695	Ala Vai Tyr Vai Vai Gly 700
Cys Glu 705	Phe Trp Ser	Lys Vai Glu Phe Thr 710	Pro Pro Vai Leu Arg Asp 715 720
His Asn	Gly Leu Pro	Met Thr Ser Thr Arg	Ala Vai Leu His Arg Tyr

- 123 038595

725 730735

Asn Val Asn Phe Gly Trp Thr Gly Glu Phe Leu Trp Arg lie Ser Asp

740 745750

Thr Ala Arg Pro Asn Gln Pro Trp Tyr Asp Thr Thr Pro Leu Arg Leu

755 760765

Phe Ser Arg Gln Leu Asn Ala Gly Glu Pro Leu Val Asp Ser Ala Val

770 775780

Val Pro Leu Pro Ala Arg Val Asp Met Ala Thr Ser Lys Phe Glu Leu

785 790 795800

Ser Cys His Ser Pro Tyr Asp Met Asn Val Arg Ala Val Glu Tyr Asn

805 810815

Phe Lys Ser Asn Gln Thr Tyr Arg Arg Val

820825 <210> 6 <211> 1497 < 212> ДНК < 213> Pseudomonas aeruginosa < 400> 6 atgtccaatg acaacgaagt acctggttcc atggttattg tcgcacaagg tccagacgat60 caatacgcat acgaggttcc ccctatcgat agcgcggccg ttgccgggaa tatgtttggc120 gacttaattc aaagagaaat atatctacag aaaaacattt attatccagt ccgatctatt180 tttgaacaag gaacaaaaga aaagaaggag atcaacaaga aagtatctga tcaagtcgat240 ggcttgctaa agcagatcac tcaaggaaaa agggaggcca caaggcaaga gcgagtcgat300 gtcatgtcgg cagtcctgca caagatggaa tctgatcttg aaggatacaa aaagaccttt360 accaaaggcc cattcattga ctacgaaaag cagtcaagcc tctccatcta tgaggcctgg420 gtcaagatct gggagaagaa ctcttgggaa gaaagaaaga agtacccttt tcagcagctt480 gttagagatg aactggagcg ggcggttgcc tactacaaac aagattcact ctctgaagcg540 gtaaaagtgc taagacagga gctcaacaag caaaaagcgc taaaggaaaa agaggacctc600

- 124 038595

tctcaactgg	agcgggacta	cagaacccga	aaggcgaatc	tcgagatgaa	agtacaatcc	660
gagcttgatc	aagcgggaag	tgctttgcct	ccattggtca	gtccaacgcc	agagcaatgg	720
cttgaacgtg	ccacaagact	ggttacgcaa	gcaattgctg	ataaaaagca	gctgcagacc	780
acaaacaata	ctcttatcaa	gaattcccca	acccctctag	aaaagcagaa	agccatctac	840
aatggtgagc	tacttgtgga	tgagatagcc	agtctacagg	cccgcttagt	taagctgaac	900
gccgaaacga	cacgacgcag	gacagaagca	gaacgcaagg	cggccgagga	acaagcgttg	960
caagatgcta	ttaaatttac	tgccgacttt	tataaggaag	taactgagaa	atttggcgca	1020
cgaacatcgg	agatggcgcg	ccaactggcc	gaaggcgcca	gggggaaaaa	tatcaggagt	1080
tcggcggaag	caatcaagtc	gtttgaaaag	cacaaggatg	cgttaaataa	aaaacttagc	1140
cttaaagata	ggcaagccat	tgccaaagcc	tttgattctc	tagacaagca	gatgatggcg	1200
aagagccttg	agaaatttag	caaaggcttt	ggagttgtag	gcaaagctat	tgacgccgcc	1260
agcctgtacc	aagagttcaa	gatatctacg	gaaaccgggg	actggaaacc	attctttgta	1320
aaaattgaaa	cactagctgc	tggtgcggcc	gccagttggc	ttgtgggtat	tgcatttgcc	1380
acggcaacag	ccactcctat	aggcattctg	gggttcgcac	tggtaatggc	agttaccggg	1440
gcgatgattg	acgaagacct	tctagaaaaa	gcaaacaatc	ttgtaatatc	catttaa	1497

< 210> 7 < 211> 345 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LKD16 <400> 7

gagtaccaac	tgaacacgag	cgcaccctgc	gctgcctgct	ccaagacatc	cacgggccgc	60
tgaatctgct	gttcccaggt	atccgggtga	aggtggagga	ggcgtgcctc	ggatacttgg	120
gctacaggga	gcggggctat	tgggagctgc	gcctccaggt	ggactacgac	cacccgaagc	180
ttgggcacct	ccgctacagt	caggccgtgc	cggagtacgt	gctgatcaac	gaccgcgaca	240
gcatcatcaa	gtacctgatg	gaagcagtcc	ctcggcaggt	actagagggc	atgctcaata	300
aggcccagga	attcgtaacc	aagaactggt	attccctatg	acgac		345

<210> 8

- 125 038595 <211> 204 < 212> ДНК <213> Phikmvlikevirus phi-KF77 <220>

<221> misc_feature <223> добавлена последовательность gp7 Phi KF77 <400> 8

tacaaggtgg	tgacgcctag ctcggcagag	ggcgccgttg	tgctggcgac	caagcagacg	60
cctgccctcg	ctcaggcagt catcgtactg	cacagcatga	accccgcgca	gtacgcggtg	120
ggcacggcca	tactaaacac agactggcgg	tgccgccgcc	tgggtgccgg	cgagtacatc	180
aagctcgttc	aaggggaggc cgac				204

< 210> 9 < 211> 60 < 212> ДНК < 213> Lambdavirus лямбда <220>

< 221> misc_feature < 223> фаг E. coli < 400> 9 atggttcgtg caaacaaacg caacgaggct cgttctgaac aaatccagat ggagttctga 60 < 210> 10 < 211> 17757 < 212> ДНК < 213> Цитомегаловирус ЦМВ человека <220>

< 221> misc_feature < 223> предварительное редактирование фрагмента ЦМВ человека <400> 10

acgacggcca	gtgaattgta	atacgactca ctatagggcg	aattcgagct	cggtacccga	60
ttaccctgtt	atccctacca	ttccgggccg tgtgctgggt	ccccgagggg	cgggggggtg	120
tttttagcgg	gggggtgaaa	tttggagtct tggagccgcg	tgtgctgtgg	aggacggtga	180
cggtggtaag	agtgtgctgc	ggtgcggttg ggacggcggc	ggcgaataaa	agcggcgtgc	240
ggcgcgcacg	gcgaaaagca	gacgcgcgtc tgtgttgtgt	gtctttgacc	gcggcggaac	300

- 126 038595

acacgcggaa	aagcgagtcc	caggggacac	acgacgagcg	agtcccaggg	ggggacgacg	360
acggccaggg	acgcggaaac	gacgcggaaa	agaggaagtc	cccaggggga	cgggcggaaa	420
agaggaagcg	cctaggggac	cgcgggggca	ggaacagacg	aagtacgccg	caacccgcgt	480
cgaggacaca	cgcagaagcg	gccgcccagg	ggaggggggg	ggggggactc	gcgggccccg	540
gggcacactt	gttgttccct	ccggccgccg	acacgcaccc	cgaagccgcg	cacaccgccg	600
acacacccct	gacacacccg	cgacacaccc	gccacacgcc	cgacacacgc	ccgcgacaca	660
cccgaccgac	acaccctgac	acaccccgcc	aacacaccca	gccgcacccg	ccccgccaac	720
acacccccga	cacacccgac	acacgcccgc	gacacacccg	gcacacaccc	acccacccag	780
ccgcgccccc	gacacacccc	gaacggcgcc	ggtgcgggac	agggctcacg	gaggtttgcg	840
ggccgtgagc	acgcctccct	ttgtacacac	taccggtgcg	tggcgtccca	cgctatttgt	900
tcgcgagacc	ggactaaggg	aggtttgcgg	tgcgtcagcg	cggggcggcg	tttgcggcgt	960
gtttcgacca	gcgctttgtg	cgcgctgcct	gtgcgtgtcg	tcccatggtc	tttgtcagcg	1020
gcacggcgct	ggggacgggg	tttcaccgcg	ctgagggatc	tttctgcggg	tgtgagggac	1080
ggagcttttt	tcgcacgctg	ggcaccgggc	tgggggacgg	ggggtgtgcg	ggacggcggt	1140
ggggccgggg	cgttgcgggt	acggggatta	cgctgggaac	ggggactcgc	ggacccgggc	1200
tgagggacgg	gggtggcggg	ggtgtttgcg	gcgaggacgg	gggccttttg	cggcggggac	1260
ggggactcac	cctcgcctat	ttaacctcca	cccacttcaa	cacacacatg	ccgcacaatc	1320
atgccagcca	cagacacaaa	cagcacccac	accacgccgc	ttcacccaga	gtaccaacac	1380
acgttaccct	tacaccacag	caacacacaa	ccgcctatcc	aaacctcgga	caaacacgcc	1440
aacgaagaac	accgcacgca	gatggagctc	gacgccgcgg	attacgctgc	ttgcgcgcag	1500
gcccgccaac	acctctacgc	tcaaacacaa	ccccaactac	acgcataccc	caacgccaac	1560
cctcaggaaa	gcgctcattt	ttccacagaa	aatcaacatc	aactcacgca	tctacttcac	1620
aacattggcg	aaggcgcagc	gctcggctac	cccgtccccc	gcgcggaaat	ccgccgcggc	1680
ggtggcgact	gggccgacag	cgcgagcgac	ttcgacgccg	actgctggtg	catgtgggga	1740
cgcttcggaa	ccatgggccg	ccaacctatc	gtgaccttac	tgttggcgcg	ccaacgcgac	1800
ggcctcgctg	actggaacgt	cgtacgctgc	cgcggcacag	gctttcgcgc	acacgattcc	1860

- 127 038595

gaggacggcg	tctctgtctg	gcgtcagcac	ttggtttttt	tactcggagg	ccacggccgc	1920
cgtgtacagt	tagaacgtcc	atccgcggga	gaagcccaag	ctcgaggcct	attgccacgc	1980
atccggatca	cccccatctc	cacatctcca	cgcccaaaac	caccccagcc	caccatatcc	2040
accgcatcgc	acccacatgc	tacgactcgc	ccacatcaca	cgctctttcc	tatcccttct	2100
acaccctcag	ccacggttca	caatccccga	aactacgccg	tccaacttca	cgccgaaacg	2160
acccgcacat	ggcgctgggc	acgacgcggt	gaacgtggcg	cgtggatgcc	ggccgagaca	2220
tttacatgtc	ccaaggataa	acgtccctgg	tagacggggt	agggggatct	accagcccag	2280
ggatcgcgta	tttcgccgcc	acgctgcttc	accgatatcc	aataaaccca	tcccctcgcc	2340
acgacgtctc	cgcgtatctt	tgtagcctca	ggaatccgtc	cccacgtcca	tccatcccga	2400
gcactccaca	cgctataaca	gaccacggac	acggcaaatg	catgcaaact	tctcatttat	2460
tgtgtctact	actctgtgtt	gctacaggga	gtgaaggggg	tgaaggcaaa	gaaaaaaaaa	2520
aggaacaaaa	taatagatta	gcagaaggaa	taatccgtgc	gaccgagctt	gtgcttcttt	2580
tcttataagg	aggcaaatat	actagggaaa	acttaagaat	aggaagaaac	cgaggtttgg	2640
gagaaaagct	gagataaaat	agcgcatttt	ccatacagag	gttgttgttt	ttgtggatcc	2700
taagaggttt	caagtgcgaa	tctcaaagtt	ctcacgagaa	tattgtcttc	aagaatcgac	2760
aactgtggtc	caagattttt	ttttggtctt	tttaggttct	gcgagggaca	tcacgatgga	2820
tcgttgcgat	gaagtcacgc	gtacgcctct	ggtgtggcgc	ggtgtcgtga	caggagagtg	2880
tgttttcagt	gcagagctgt	cttgattcct	atatccgagt	atctgttttc	tcgtaaggac	2940
ggtaatcttc	tttggtgtaa	gtacatctaa	aagctgcaaa	ctatatttta	agggctgtct	3000
ctaggtgtac	tttgatgctg	gagtttttcg	ctgtgttgat	gtgaataaat	ctactactac	3060
tattatatgc	agaaagagtg	attatgccga	gacaagattg	cattggctga	actgtttcaa	3120
aaacgcctac	actctactta	tccgtaaacc	taaggtaata	ctatgtgtaa	gttgtttttt	3180
tttctttttg	tagtaaaatg	gtgatacgtg	caattaaaac	tgtattccat	gtttccatcc	3240
tttcatttca	actttaaagg	cggctttgag	agcgaagaag	tgcgaggata	aaaatggatg	3300
actccttcgt	gtccagggag	tcgactactg	caacgctgat	tgattaaaag	atggtctccg	3360
atgatgatgt	tgttattgat	cgaatcatgg	tgcagaacgg	cgacggagag	gagcgtgtcc	3420

- 128 038595

gccgccggga	aggtggtctc	tttctctttt	cttttttcaa	gaaatcttcc	atgtgtttat	3480
cgtagtgatc	gaaatcgact	gatctcgggt	tctttttgtt	ggtttctttt	cggttaatca	3540
tgtattgttt	tcttttttta	cagaaagata	cttttttcat	gagcaattcc	tcgcccggcg	3600
ccggcatgcc	gaggtggggc	cactgcgatc	agcggcatgc	cgacgccgac	ccggggatct	3660
tggattcacc	gttttctctc	ttctctctct	acatacagac	cgggtggcag	gagcggtaag	3720
gaatcatcgt	cgtctttcat	tcttcgatga	ttatggtaat	actaaatctt	atctaggagc	3780
atatacatct	aagattggag	tactagtagt	cgtttgtggt	ttctattttt	tttatattta	3840
tctatgacag	tttttctgtt	tttcgttttg	ataataatat	aataaaaact	catggacgtg	3900
aaatctggct	tggttgtggt	gatttcattc	tcattattgt	tgttttcttt	ccgtcttgcg	3960
gatgaagatg	ttgcgatgcg	gttgttgttg	gtgttgctat	acaccgagag	agatgatctt	4020
tttgttcttc	tggttcattt	cctatgattg	tttggctgct	gaccgacgcg	tcaggatgtg	4080
cagggcatgc	ggggaatcag	gaccggacac	gggataattt	catctaccta	tacggagatc	4140
gcggtcctcg	ccatgaggat	cgcgacaggc	gcgtcgaggg	ggcaggaaca	cccttgcgga	4200
ttgacattct	tggtggtgtt	tcgttgttgt	cggtagttgt	tgttgacgat	gaggataaat	4260
aaaaatgacc	ttgtttttgt	tctgttttct	cttgttggga	atcgtcgact	ttgaattctt	4320
cgagttatcg	gaaagctgag	gtacccaaat	gtctgtagct	tttttctttt	taccctcttg	4380
tttatcatct	gcgattcgtg	gtaggtagga	gagggaaatg	ataatccgag	attaaggaaa	4440
ggagaagata	aaaaataaaa	aaaaaataat	aaaacagaag	ccgaccggcc	gccgacccgt	4500
tccccaggac	cagcctacga	ggaatggata	acgcggtggc	gacggcagcg	gtggtggcgc	4560
tgggggtggc	ggcagtggta	ctgctgatgg	tagtcgggac	ggaggagagg	cgatgcatac	4620
atacacgcgt	gcatgctgca	tgggtggatg	gtacggccgg	gagacgcgga	agagaaactc	4680
acataaaaag	gtgacaaaaa	gagcggttga	aaaaagaaaa	cgagattcga	ccagacagaa	4740
gagaaggacc	ggggcttggc	gacccttcca	cgactgctgt	tgtcatctcg	gctcccccgt	4800
cttctcccgg	ccacgggcgg	ctaagtcacc	gccgttctcc	ccatccgtcc	gagcgccgac	4860
cgaccagccg	gccgattcgc	ccgccggggc	ttctggagaa	cgccggggca	gcagcgatct	4920
ggggaagccg	ctaaacccct	gcgtttttat	atggtagctc	tgccgagcgc	gggctgacgc	4980

- 129 038595

gttgagtaag	cggaaagacg	tgtgtgacga	aaaggggtcc	catggtattt	cacgtgacga	5040
tgaggagatg	cggtttggag	cacatacggt	ttagaaaaag	ggagttgtcg	tgacaagggc	5100
tgagggacct	ctgtctccat	gtgtgtataa	aaagcaaggc	acgttcataa	tgtaaaaaag	5160
aacacgttgt	aaacaagcta	ttgctgtatc	attcggctga	ctatgcttca	ttcggactga	5220
ttttcttttc	ctaacggcgt	aacttaaagt	gattaacgta	tgatatttgt	tccccagagt	5280
tatactatag	tcatcatcct	aaaattcaga	tataaatgaa	cacatgtcgt	atgggattat	5340
taagaaaccg	aaactctcca	cagttcacca	tcttcttcgt	cattcaaccg	atgacccact	5400
ccgtacaacg	aatcagtctg	ctgtgtcaca	ctgcaaacta	ctagcgacgt	atgcaaacaa	5460
cttgaaacac	gggctgttgt	attgacgacc	gttgtaccat	tactagtcac	attgcataga	5520
gaccatccac	cgtcatccca	tctttcccac	ccgatggaaa	accgtcttct	atcatcaact	5580
atggtaagat	ttcgaccctg	cgaggtattc	agtttcccca	tatccataac	ctggatttta	5640
tcattaaacc	ccaatattaa	acactttttt	agtacccccc	cacccaccaa	aaaatgtgac	5700
tggaccggtt	cctagcagct	ctgggagcca	tgttcaggtt	gaaccacagc	tacagcgaaa	5760
ccgagtccag	tgaccggtaa	ccacgtccag	cccctgcgta	tgtaccagtc	caagcacgtc	5820
cggtcattgt	tctacacagg	aaatctaact	aggtcaacgc	aattttattc	caccgttacg	5880
cagaatacta	acaaacaaac	acacaaattt	aacgaattac	acgtagttta	ttacatgaaa	5940
actgtaagaa	caccaattca	ctaagcgata	caacatttag	ctgacttcca	agtgccacac	6000
atcaccactg	tattcatcca	tgttttcacc	gaaccaacga	gacagatcga	agaagccaga	6060
atctcccgac	tttaaattac	ataaatccaa	cgtattatga	ccacagctcg	acacacaaat	6120
agttgcgtta	ctattcacag	tagcattacc	tatacccgta	acgttgcaca	accactgatc	6180
accattgtta	ccaaaaacgg	ttttccactt	agttgtcaac	ggatctttcc	catgcgtaat	6240
ggtcaaatta	ctaccagtcg	tcgcttttag	ctcattacga	gtattatccg	catccacata	6300
tatcaacgtc	atagctaggc	acgctataag	tacccccccc	ccacaatgga	atgttgccaa	6360
accggttctt	tcccgttata	gccatagcgt	tcccaggcaa	aagcaaacgc	caaacctaat	6420
gcagtgaaaa	gcgcttgcag	ccagaaccag	cttatgtacc	agccacaatc	acatccggtt	6480
attgtttcca	caggaaatcc	taccaggcaa	agccccgctt	gttttgttcc	tgaccatctt	6540

- 130 038595

gtttagcaat	tcgtaaactg	tcagcctagc	gacgtccgtt	tagatcaaaa	gtcacgtata	6600
tagcgacgct	gtttccaccc	gtttccccgt	cccgccgttt	ccgaacaacc	cacccgggtt	6660
cagacaaccg	accaccaaca	gaaatataca	cacagaccac	cgggagttca	gttaaagatt	6720
tcatcaggtt	tattttggct	gctgctagtc	ttttgcttct	tagaaaaaaa	atacccatat	6780
agagaaataa	tgatagtttg	acaacacata	tggcagggat	ttcttcttca	tcaataagat	6840
atgcaattcc	cccagggaga	gactttcaac	aattgaattt	acaaaaacaa	aattacatca	6900
ggagaaagag	aggatacatt	aataaatata	ttatatctgg	tgtatatact	gaatgctgct	6960
ggttcataag	gtaacgatgc	tacttttttt	aattccaaga	tggtttttct	ttgttagtct	7020
tttgttgact	tgctggttcc	taaaagttcg	caaaaacgat	tgtgtgaaga	ttatgacgtt	7080
ggttgactag	ttcatgagat	tctgctgtac	gtgtgatggt	tattcgctgg	ttcgttctaa	7140
gatgagtatc	gtactgtgtc	tgcgatggtc	gtctcttact	ggcattctct	cggctgcctc	7200
ttgttttcat	gattgaaaag	gaaaaaagga	ctccgagggc	gcggtcatct	tttacttttc	7260
ggttttctcg	ttggcgggtc	agaggtagtc	agatcatgag	actgtcgtgg	tcgatgaaac	7320
tgtgtctgct	caagtgacgt	ccatttcttg	tacggagaaa	aaagtcatcg	ggataaataa	7380
ggctatacaa	ggcgttgtca	agcgtgcggc	tctaaacaaa	ttaagcgata	caaaattaca	7440
gtgatacgaa	taataaatta	ccccctcccc	ctgtggtccc	cccgaggcga	gagccaccca	7500
tcgtgtactc	tcgcaccacc	cacgaccaca	gggggagacg	ggacgaagag	acgacgcaga	7560
gcgccatctc	ctcctggagg	ccggcggcgt	taactgctac	agctgcggcg	gcgacgacag	7620
ctgcgatttg	tcggccgaca	tgccgatggt	atgggcggcg	gcggcggtgg	ccgcggcagc	7680
ggggaggaga	ggagagagaa	gaggagcggg	gcgtccgaag	gcgaggatgg	catggtctcg	7740
ccggagcgcc	cggcttttat	ggaacactcg	cgtccggttg	ggtatcaccc	acaggaagat	7800
gaatcacaac	ttccaaacca	tcttgagacc	cgagtaacgg	tttacaggtc	gcacgccagt	7860
ctcagctaaa	aacagcggac	agtcccacgc	tgtttctgtt	gtggctctct	ccagtttcct	7920
catcgccgtc	ttggtctccg	tcatcatcgg	aagaatacca	cccgctctca	tgcggcagtc	7980
gatcagcctc	gatgaacgag	acgcggcgac	gcctttctac	ggccgactgg	ttgtggtggt	8040
gaaagaagag	caccagcaat	cccaggagga	gcaacaagcc	ctcacatgtc	caggaggtcg	8100

- 131 038595

gggagagggc	ctgtcggaga	tgaccgtgag	gcatcacgta	cggcagctga	ggagaaacgg	8160
agaagaaagg	aaaattaccg	tcaggggccg	gggttcttat	tagagaaaca	gcacgtaggt	8220
caggatccag	atgctaatgg	caatcatgat	gacgatgatc	atgcaggcca	agacgcggcg	8280
caccaatgca	gaatccaata	gccgccgtgc	ctccggttgg	tggccggcgg	catctagaga	8340
catgatttgg	gggggggacc	ggcggcgcaa	aaagacaggg	agatggacag	tgccacggtg	8400
ttttgttatg	attaggacat	ggggaccgga	agccgagaca	gagtactaca	gggtgttgaa	8460
gggtaacgtg	agggagatca	tgtcatgggc	gggctgaaga	ccgtgcgggg	aggatcgacg	8520
tgtgcggtgc	ttgtggaaca	cggtgtttta	atatgtatcc	gcgtgtaatg	cacgcggtgt	8580
gctttttagc	actcggcttg	ataagctacg	tgaccgtctg	cgctgaaacc	atggtcgcca	8640
ccaactgtct	cgtgaaaaca	gaaaataccc	acctagcatg	taagtgcaat	ccgaatagta	8700
catctaccaa	tggcagcaag	tgccacgcga	tgtgcaaatg	ccgggtcaca	gaacccatta	8760
ccatgctagg	cgcatactcg	gcctggggcg	cgggctcgtt	cgtggccacg	ctgatagtcc	8820
tgctggtggt	cttcttcgta	atttacgcgc	gcgaggagga	gaaaaacaac	acgggcaccg	8880
aggtagatca	atgtctggcc	tatcggagcc	tgacacgcaa	aaagctggaa	caacacgcgg	8940
ctaaaaagca	gaacatctac	gaacggattc	cataccgacc	ctccagacag	aaagataact	9000
ccccgttgat	cgaaccgacg	ggcacagacg	acgaagagga	cgaggacgac	gacgtttaac	9060
gaggaagacg	agaacgtgtt	ttgcaccatg	cagacctaca	gcaactccct	cacgcttgtc	9120
atagtcacgt	cgctgttttt	attcacagct	cagggaagtt	tatcgaatgc	cgtcgaacca	9180
atcaaaaaac	ccctaaagct	cgccaactac	cgcgccactt	gcgaaaaccg	tacacgcacg	9240
ctggttacca	ggcttaacac	tagccatcac	agcgtagtct	ggcaacgtta	tgatatctac	9300
agcagataca	tgcgtcgtat	gccgccactt	tgcatcatta	cagacgccta	taaagaaacc	9360
acgcgtcagg	gtggcgcaac	tttcacgtgc	acgcgccaaa	atctcacgct	gtacaatctt	9420
acggttaaag	atacgggagt	ctaccttcta	caggatcagt	ataccggcga	tgtcgaagct	9480
ttctacctca	tcatccaccc	acgcagcttc	tgccgagcct	tggaaacgcg	tcgatgcttt	9540
tatccgggac	caggcagagt	cggtgtggtc	acggattccc	aagaggcaga	ccgagcaatt	9600
atctcggatt	taaaacgcca	gtggtccggc	ctctcactcc	attgcgcctg	ggtttcggga	9660

- 132 038595

ctgatgatct	ttgttggcgc	actggtcatc	tgctttctgc	gatcgcaacg	aatcggagaa	9720
caggacgttg	aacatctgcg	gacggacctg	gatacggaac	ctttgttgtt	gacggtggac	9780
gggaatttgg	aataaaagat	gcgtaacacc	tgtcgaagat	gcgataactt	tacatacagg	9840
caaacagtgt	atacaattat	agtattttgt	atgttgcata	aagttacatg	caacagtact	9900
gctaacagta	ctgcatccat	tacgctatcc	aacactgcct	ctaccacttt	tgtaaccaac	9960
atatattcaa	ctccgaataa	caacacatca	acgacgccac	acacatctgt	cacctcacaa	10020
gcgtcaacca	ttggcaacat	caccaacgtt	acctccgact	tgagtacttt	cacaaccgta	10080
tattctacat	tcaatacatc	atttgccaat	atatctaata	cggctgtcac	tacagaattg	10140
atttcaacaa	ataccaacac	tatctcatct	tttaccaacg	taacagcaaa	cgctacatca	10200
tcttataaca	caacaatcac	cgtaactgtc	acgtcagatg	aaacttcgca	caacgtatcc	10260
actaataatg	cacttataag	cacaccatgg	cctacaaatt	gcagcgccac	aacatacacc	10320
acgtacaacc	ttactaactc	ttccaacgct	tgtcacacag	agacaacaat	catacgtttc	10380
aaggaaacca	atacaacagg	aatagaaggg	agtaatgtca	ccataaaggg	taattctacg	10440
tgggactgtc	tttcagtcgc	ctggatacga	cattacaata	gatccacaca	cggacatcat	10500
ctaggttatc	gtaagaacgc	acatacccaa	tcttggtatt	ggctacgcat	ccttacctct	10560
cacactgtat	gtcattctca	acatgaaaga	ccttcactgt	accatgactt	atgtcgttcg	10620
tgcaacaaca	cagaattaca	tctgtacgat	ctaaatatca	ccaattccgg	caggtacagc	10680
agacgttgtt	ttaaagaaaa	ttacttcaca	ggacatcacg	aagatgaaaa	tttctaccta	10740
ttagtaacac	caaaaaatca	tactgaagct	attaatgcta	ctttcgtttg	ccctagatac	10800
aacaccgata	tcgaaaatga	agatagagag	aaaggaagtc	aacatactaa	caatacacat	10860
caccacaaac	gtaatctcta	tcatagctcg	caaagaagcc	gcaccgtatg	gaccatcgtg	10920
ttggtttgta	tggcctgcat	agttctgttt	tttgcacgac	gagcctttaa	caaaaagtat	10980
catatgttac	aagacaccgt	cagtgaatca	gaattcattg	ttcgatatca	cccagaacat	11040
gaagattgag	ctacgtttcc	gggcagacat	cttatgaagc	tgaacaataa	actaaaacat	11100
tctgtaagac	tcagcgttca	aaggaatatt	aatgcccatt	gagcgaaaac	taatattgca	11160
atggactggc	gatttacggt	tacgtggacc	gttacttgtg	atggtttcaa	ttatacagtc	11220

- 133 038595

cataaaagat	gcgatcgcag	ttacgaggta	atcaacgtaa	caggatacgt	tggtagcaac	11280
ataactctaa	aaaaatgcaa	tcagactgag	aaatggcaca	atgtagactg	gattcattat	11340
gagtacccca	cgcataaaat	gtgcgaatta	ggcaactatc	accaaaccac	accacggcac	11400
gacatatgtt	ttgactgcaa	cgacacctcc	ctaactatct	acaacttaac	cacaaaaaac	11460
gctggaaaat	ataccaggcg	tcaccgtgat	aacggtcaag	aagaaaatta	ctacgtaacg	11520
gtgttaattg	gagacacaac	gttattcact	cttggcacat	gccctgtaag	atataaagaa	11580
tctacgaaca	ctgaaaacac	cattggaagt	agcatcatag	aaaccattga	gaaagctaac	11640
attcccctgg	gaattcatgc	tgtatgggca	ggcgtagtgg	tatcagtggc	gcttatagcg	11700
ttgtacatgg	gtagccatcg	cattcccaaa	aagccgcatt	acaccaaact	tcccaaatat	11760
gatccagatg	aattttggac	taaggcttaa	catgctgatc	aataaacttt	ttttaaccaa	11820
taacatgtct	ccgttttttt	ttgttaacaa	cctatgatat	aaagcgttat	attcagtcgt	11880
tactaaacaa	aaaaacatgg	gcatgcaatg	caacactaaa	ttgttattgc	cagtcgcact	11940
aataccggtt	gcaatcatcc	taattggtac	tctagtgccg	atacttttac	atgaacaaaa	12000
aaaggcgttt	tactggcgac	tttttctgca	aagtcaacat	gtagaagcac	ccattacagt	12060
aacgcaggga	gacacagtct	acctagacgc	tagcaataat	ccctgtaatt	attccagctt	12120
ttggtaccac	ggtaattgcg	aactttgtgg	atggaacgga	tatctacgca	atgttacaca	12180
ttactacaca	aacacatcgt	gttccccgca	attcatctgc	ataaacgaaa	ctaaaggtct	12240
gcagttatat	aatgtaacat	taaacgattc	aggcgcttat	actgaacacg	tttacgaatg	12300
tgacctttcg	tgtaacatta	ctactaataa	cgaatatgaa	atactcaatt	attttgataa	12360
ctgtaactac	accataaata	gcaccaagca	tattatcacc	gtggtgtctt	cacgtcattc	12420
taaacaaaca	aattcccacg	tatccactca	cgctggttgg	gcagtcgccg	tggtgacggt	12480
aattatgatc	tacgttctga	tccactttaa	cgtcccggca	actctgagac	acaaactacg	12540
aactagaaac	aacgtaaatc	gcatagcgtg	attataaagt	atcgacgcta	atttctccaa	12600
gataaaattt	gattactccg	tgcagttctc	aaaaactgta	aggccccgct	tttccactcc	12660
gtcatgaagg	atcgcaatag	aatactgcta	tgtatcatct	ttatttgcat	tatgtgcctc	12720
atttgtattt	actttaaacg	tcgttgtgtt	tttactccgt	ctccagacaa	agcagatctg	12780

- 134 038595

cgagtggaat	ttccctcgtt	acccccgtgt	attggcatac	agtgcgctgc	atgagaacac	12840
gcgtgacaca	tagcgtaccc	ctggacggta	cagtttatga	taacgtaatt	cagggaaagt	12900
atacattcat	accaacatgt	tatcacataa	cacacagatt	ttctgcgtgt	tttataaaag	12960
agcgtctcga	agcagcttga	gccacactac	ggtccagatg	acgagcgtaa	ttaaaaatat	13020
gccgcgcagt	attcgaaagc	cgtactgagc	gtgcgaggcg	ggtagggtgc	cgaacgacgg	13080
atatgcgtcg	ttgtcatctt	cgactataag	gatcgcgacc	gagtcttcgg	ccatggtaaa	13140
cgtcaccctg	tgtggctggt	atgtagcgta	tccggtttgg	aattgttctg	ctccagctcg	13200
ggggatagtg	aggaattctc	aagggatacg	ggacccaatg	actggataag	agaagggttt	13260
ttccccgtaa	gatgatcctc	gtatcacatg	aggtctggat	atgtataaat	gaagagtgaa	13320
ataggcacag	ggaatcagat	gccagcctcg	tgatgcagcc	gctggttctc	tcggcgaaga	13380
aactgtcgtc	tttgctgact	tgcaaataca	tcccgcctta	agcgatgagt	ctataaagca	13440
ccgttgcccg	agtacggtaa	aagtgacccg	gattgtagaa	cgtccttttt	ttttgttttt	13500
gcatcgttta	tcgtcactac	tagtgcaata	ttttgattgt	aaggctgaaa	gagtatcgtt	13560
atgatgctta	gaacgtggag	attattacag	atggtactgc	ttgccgcgta	ctgttattat	13620
gtttttgcga	cttgttcaat	cagcacgacg	actgctcctg	tggaatggaa	gtctcccgac	13680
cgtcagattc	ccaagaatat	tacctgcgct	aattactcag	ggaccgtcaa	cggcaacgtt	13740
acatttcgag	gtcttcagaa	caaaacggaa	gactttttgt	actggttgtt	aggatggggt	13800
cataagtcca	tttgttcgtt	cttcccgaaa	ctccagggta	actatgacga	acaacattac	13860
agatatgaag	tagcgaacct	gacgtataac	tgcacctata	accgcttgac	gttgctgaat	13920
ctgacgacgg	aaaacagcgg	aaagtactat	ttcaaaaggg	aagatgcgaa	tttcaccttc	13980
tattactctt	gttacaactt	gaccgtgtcc	taaagatcgc	acgtgaagtt	tcacagagcc	14040
gcgtggctgt	agctattgtg	tttacgttgc	ttttgaaatg	ttaagcgtcc	ctacggcgct	14100
aacatgtttc	taggctactc	tgactgtgta	gatcccggcc	ttgctgtgta	tcgtgtatct	14160
agatcacgct	taaagctcat	gttgtctttt	gtgtggttgg	tcggtttgcg	tttctatgat	14220
tgtgccgcgt	tcgagtcctg	ctgttacgac	atcaccgagg	cggagagtaa	caaggctata	14280
tcaagggacg	aagcagcatt	cacctccagc	gtgagcaccc	gtacaccgtc	cctggcgatc	14340

- 135 038595

gcgcctcctc	ctgaccgatc	gatgctgttg	tcgcgagagg	aagaactcgt	tccgtggagt	14400
cgtctcatca	tcactaagca	gttctacgga	ggcctgattt	tccacaccac	ctgggtcacc	14460
ggcttcgtcc	tgctaggact	cttgacgctt	ttcgccagcc	tgtttcgcgt	accgcaatcc	14520
atctgtcgtt	tctgcataga	ccgtctccgg	gacatcgccc	gtcctctgaa	ataccgctat	14580
caacgtcttg	tcgctaccgt	gtagctagtt	agccagctgt	gtgtagtgtt	ttgcttttgc	14640
atatttgttt	tcagtcagag	agtctgaaac	ggggtgggag	ggacttttgc	gggtagtgca	14700
tgctaagatg	aacgggtggg	ctggggtgtg	cttgataact	cactgtttga	atacgcgctc	14760
acgcacatat	gtagcactca	acatgttagc	ttttgcccgc	acgccccggg	gcgtgccgag	14820
ctgccttttt	aataaagtct	gggtttccag	atacgcgctg	gttctgattt	tgatggtttg	14880
tgcctctgaa	agctctacga	gctgggccgt	gacatccaat	ggactgccta	actgtagcac	14940
ggtaactaga	acagcgggtc	aagacgctga	attgcacggt	ccggcaccgt	taagctgtaa	15000
tgtgacccag	tggggacgtt	acgagaatgg	aagcacaccc	gtgttatggt	gcactttacg	15060
gggatcaagc	atgcgagtct	cattaggaca	ccgtgtagcg	tttggctgtt	cttggaaaac	15120
attttttatt	tataacgttt	ctgaaagtag	cggtggcact	tactatcaaa	aaggttacaa	15180
ctgcaccgac	aaacatataa	cactatcttg	tttcaactta	acggtggttc	ctcgagcggt	15240
tcaaagcaca	accaccgtaa	tgacacccac	gctggttaca	aactccacat	tcagtgtgtc	15300
acttgttccg	ttgagactga	cgacaaattc	cagcgcgttt	ggacacgcta	tttatcaacg	15360
acaacagcgt	gttgaaaacg	ggacgttatc	caagaacata	actaacttgg	cattcaccta	15420
tggcagctgg	ggcgttgcga	tgctgctgtt	tgccgccgtg	atggtgctcg	ttgatttggg	15480
tttgcctcaa	tcggcttggc	gacgctggcg	aagccacgtg	gacgatgaag	aacgtggttt	15540
gttaatgtag	gaaataaaag	gcagtttgag	catgactgtt	tccaaaccgt	aacgtggtaa	15600
ataaatcatg	gcttccgacg	tgggttctca	tcctctgacg	gttacacgat	ttcgctgcag	15660
agtgcattat	gtgtacaata	aactgttgat	tttaactttg	tttgcccccg	tgattctgga	15720
atccgtcatc	tacgtgtccg	ggccacaggg	agggaacgtt	accctggtat	ccaacttcac	15780
ttcaaacatc	agcgcacggt	ggttccgctg	ggacggcaac	gatagccatc	tcatttgctt	15840
ttacaaacgt	ggagagggtc	tttctacgcc	ctatgtgggt	ttaagcctaa	gttgtgcggc	15900

- 136 038595

taaccaaatc	accatcttca	acctcacgtt	gaacgactcc	ggtcgttacg	gagcagaagg	15960
ttttacgaga	agcggcgaaa	atgaaacgtt	cctgtggtat	aatttgaccg	tgaaacccaa	16020
acctttggaa	actactccag	ctagtaacgt	aacaaccatc	gtcacgacga	catcgacgat	16080
gatcgacgcg	aaaagtaacg	ttacagggaa	cgccagttta	gcaccacaat	tacgtgccgt	16140
cgctggattc	tccaatcaga	cgcctttgga	aaacaacacg	cacctggcct	tggtaggtgt	16200
tgttgtgttt	ttagttctga	tagttgtttg	cattatgggg	tggtggaaat	tgttgtgtgg	16260
taaaccagag	ttatagtaat	gtgcttttta	tcagggagaa	ggttttgtgc	caacaatgac	16320
tagcccggga	ctatctgcgt	cagaaaatta	tgacggaaat	tatgaattca	cggaaaccgc	16380
caatacaacg	cgtacaaata	gaagtgactg	gacaacgtta	gaaaccagtg	cattgctatt	16440
gaaaaacacg	gagactgcag	tgaacctcag	caacgcgact	acggtcatcc	cacaacctgt	16500
agaatacccg	gctggggaag	tacaatatca	aagaacggca	acgcattatt	cttggatgct	16560
aatcattgtc	atcattctca	tcatttttat	tatcatctgt	ctacgagcac	ctcgaaaaat	16620
ctaccatcac	tggaaagaca	gtaaacagta	cggacaagtg	tttatgacag	acacggaact	16680
gtgacagtga	tgtctaagcg	tttgcaggta	tttccatgga	taacaatttt	attttacaca	16740
tcaaaatccc	agtattggaa	ctatatggca	ataccatgta	cccctacagt	tggatacggc	16800
agtcataata	ttagcttgca	tccgcttaat	aactcattat	ttcaagacga	tgtttttgaa	16860
tggtacatag	acaaaccaat	ggttacaagt	tatgtcttta	tcaaagtaat	gaacgcacaa	16920
aatccaatct	agactctcca	aatattgtgt	ggcaatgcac	agataatcgt	acactaattc	16980
tcatgaactt	aaccacaaca	tacagtagaa	actattattt	tcaatccttt	aaatatctcg	17040
gacgaggagt	accaaaaccg	aataacttgt	gttataacgt	tagtgtacac	tttacccacc	17100
aaacacattg	ccatacaact	acatcatccc	tgtatccacc	tacatctgta	cacgattcat	17160
tagaaatatc	acagtcattc	acctcaacca	acttcacaca	taccgcggtc	cactacgcca	17220
ccggtaacgt	tgaagcacaa	cacgacacta	ccactccaca	tacaatgtgg	atcatacccc	17280
tagttatcgt	tataacaatc	atcgttttaa	cttgtttcaa	attcccccag	aaagcttgga	17340
ataaattcac	acaatacaga	tacagcggta	tgctcgccgc	cgcttaaaga	atcaacgcca	17400
aggaaaccaa	aacgtaaaaa	gaatagatat	gtacgtttat	ttttcagctc	actgtttgaa	17460

- 137 038595

taccgtaaac	ataatgacgt	acatatacgt	ggttatacaa	caggtgtttg	tgttatgcgg	17520
cgactgatta	accatatcgt	gaaccatgat	cttttccgat	ggtccgtcgt	gaccgcaatg	17580
atattttaca	gatattccga	aacctgtatg	gaggtcactg	tcagagtagg	tgatccagtt	17640
accctcggta	gtggacatgg	ttatcatcca	ggtagggata	acagggtaat	gatcctctag	17700
agtcgacctg	caggcatgca	agcttgagta	ttctatagtc	tcacctaaat	agcttgg	17757
<210> 11 <211> 18036 <212> ДНК <213> Цитомегаловирус ЦМВ человека
<220> <221> misc_feature <223> предварительное редактирование фрагмента ЦМВ человека
<400> 11 acgacggcca	gtgaattgta	atacgactca	ctatagggcg	aattcgagct	cggtacccga	60
ttaccctgtt	atccctacca	ttccgggccg	tgtgctgggt	ccccgagggg	cgggggggtg	120
tttttagcgg	gggggtgaaa	tttggagtct	tggagccgcg	tgtgctgtgg	aggacggtga	180
cggtggtaag	agtgtgctgc	ggtgcggttg	ggacggcggc	ggcgaataaa	agcggcgtgc	240
ggcgcgcacg	gcgaaaagca	gacgcgcgtc	tgtgttgtgt	gtctttgacc	gcggcggaac	300
acacgcggaa	aagcgagtcc	caggggacac	acgacgagcg	agtcccaggg	ggggacgacg	360
acggccaggg	acgcggaaac	gacgcggaaa	agaggaagtc	cccaggggga	cgggcggaaa	420
agaggaagcg	cctaggggac	cgcgggggca	ggaacagacg	aagtacgccg	caacccgcgt	480
cgaggacaca	cgcagaagcg	gccgcccagg	ggaggggggg	ggggggactc	gcgggccccg	540
gggcacactt	gttgttccct	ccggccgccg	acacgcaccc	cgaagccgcg	cacaccgccg	600
acacacccct	gacacacccg	cgacacaccc	gccacacgcc	cgacacacgc	ccgcgacaca	660
cccgaccgac	acaccctgac	acaccccgcc	aacacaccca	gccgcacccg	ccccgccaac	720
acacccccga	cacacccgac	acacgcccgc	gacacacccg	gcacacaccc	acccacccag	780
ccgcgccccc	gacacacccc	gaacggcgcc	ggtgcgggac	agggctcacg	gaggtttgcg	840
ggccgtgagc	acgcctccct	ttgtacacac	taccggtgcg	tggcgtccca	cgctatttgt	900

- 138 038595

tcgcgagacc	ggactaaggg	aggtttgcgg	tgcgtcagcg	cggggcggcg	tttgcggcgt	960
gtttcgacca	gcgctttgtg	cgcgctgcct	gtgcgtgtcg	tcccatggtc	tttgtcagcg	1020
gcacggcgct	ggggacgggg	tttcaccgcg	ctgagggatc	tttctgcggg	tgtgagggac	1080
ggagcttttt	tcgcacgctg	ggcaccgggc	tgggggacgg	ggggtgtgcg	ggacggcggt	1140
ggggccgggg	cgttgcgggt	acggggatta	cgctgggaac	ggggactcgc	ggacccgggc	1200
tgagggacgg	gggtggcggg	ggtgtttgcg	gcgaggacgg	gggccttttg	cggcggggac	1260
ggggactcac	cctcgcctat	ttaacctcca	cccacttcaa	cacacacatg	ccgcacaatc	1320
atgccagcca	cagacacaaa	cagcacccac	accacgccgc	ttcacccaga	gtaccaacac	1380
acgttaccct	tacaccacag	caacacacaa	ccgcctatcc	aaacctcgga	caaacacgcc	1440
aacgaagaac	accgcacgca	gatggagctc	gacgccgcgg	attacgctgc	ttgcgcgcag	1500
gcccgccaac	acctctacgc	tcaaacacaa	ccccaactac	acgcataccc	caacgccaac	1560
cctcaggaaa	gcgctcattt	ttccacagaa	aatcaacatc	aactcacgca	tctacttcac	1620
aacattggcg	aaggcgcagc	gctcggctac	cccgtccccc	gcgcggaaat	ccgccgcggc	1680
ggtggcgact	gggccgacag	cgcgagcgac	ttcgacgccg	actgctggtg	catgtgggga	1740
cgcttcggaa	ccatgggccg	ccaacctatc	gtgaccttac	tgttggcgcg	ccaacgcgac	1800
ggcctcgctg	actggaacgt	cgtacgctgc	cgcggcacag	gctttcgcgc	acacgattcc	1860
gaggacggcg	tctctgtctg	gcgtcagcac	ttggtttttt	tactcggagg	ccacggccgc	1920
cgtgtacagt	tagaacgtcc	atccgcggga	gaagcccaag	ctcgaggcct	attgccacgc	1980
atccggatca	cccccatctc	cacatctcca	cgcccaaaac	caccccagcc	caccatatcc	2040
accgcatcgc	acccacatgc	tacgactcgc	ccacatcaca	cgctctttcc	tatcccttct	2100
acaccctcag	ccacggttca	caatccccga	aactacgccg	tccaacttca	cgccgaaacg	2160
acccgcacat	ggcgctgggc	acgacgcggt	gaacgtggcg	cgtggatgcc	ggccgagaca	2220
tttacatgtc	ccaaggataa	acgtccctgg	tagacggggt	agggggatct	accagcccag	2280
ggatcgcgta	tttcgccgcc	acgctgcttc	accgatatcc	aataaaccca	tcccctcgcc	2340
acgacgtctc	cgcgtatctt	tgtagcctca	ggaatccgtc	cccacgtcca	tccatcccga	2400
gcactccaca	cgctataaca	gaccacggac	acggcaaatg	catgcaaact	tctcatttat	2460

- 139 038595

tgtgtctact	actctgtgtt	gctacaggga	gtgaaggggg	tgaaggcaaa	gaaaaaaaaa	2520
aggaacaaaa	taatagatta	gcagaaggaa	taatccgtgc	gaccgagctt	gtgcttcttt	2580
tcttataagg	aggcaaatat	actagggaaa	acttaagaat	aggaagaaac	cgaggtttgg	2640
gagaaaagct	gagataaaat	agcgcatttt	ccatacagag	gttgttgttt	ttgtggatcc	2700
taagaggttt	caagtgcgaa	tctcaaagtt	ctcacgagaa	tattgtcttc	aagaatcgac	2760
aactgtggtc	caagattttt	ttttggtctt	tttaggttct	gcgagggaca	tcacgatgga	2820
tcgttgcgat	gaagtcacgc	gtacgcctct	ggtgtggcgc	ggtgtcgtga	caggagagtg	2880
tgttttcagt	gcagagctgt	cttgattcct	atatccgagt	atctgttttc	tcgtaaggac	2940
ggtaatcttc	tttggtgtaa	gtacatctaa	aagctgcaaa	ctatatttta	agggctgtct	3000
ctaggtgtac	tttgatgctg	gagtttttcg	ctgtgttgat	gtgaataaat	ctactactac	3060
tattatatgc	agaaagagtg	attatgccga	gacaagattg	cattggctga	actgtttcaa	3120
aaacgcctac	actctactta	tccgtaaacc	taaggtaata	ctatgtgtaa	gttgtttttt	3180
tttctttttg	tagtaaaatg	gtgatacgtg	caattaaaac	tgtattccat	gtttccatcc	3240
tttcatttca	actttaaagg	cggctttgag	agcgaagaag	tgcgaggata	aaaatggatg	3300
actccttcgt	gtccagggag	tcgactactg	caacgctgat	tgattaaaag	atggtctccg	3360
atgatgatgt	tgttattgat	cgaatcatgg	tgcagaacgg	cgacggagag	gagcgtgtcc	3420
gccgccggga	aggtggtctc	tttctctttt	cttttttcaa	gaaatcttcc	atgtgtttat	3480
cgtagtgatc	gaaatcgact	gatctcgggt	tctttttgtt	ggtttctttt	cggttaatca	3540
tgtattgttt	tcttttttta	cagaaagata	cttttttcat	gagcaattcc	tcgcccggcg	3600
ccggcatgcc	gaggtggggc	cactgcgatc	agcggcatgc	cgacgccgac	ccggggatct	3660
tggattcacc	gttttctctc	ttctctctct	acatacagac	cgggtggcag	gagcggtaag	3720
gaatcatcgt	cgtctttcat	tcttcgatga	ttatggtaat	actaaatctt	atctaggagc	3780
atatacatct	aagattggag	tactagtagt	cgtttgtggt	ttctattttt	tttatattta	3840
tctatgacag	tttttctgtt	tttcgttttg	ataataatat	aataaaaact	catggacgtg	3900
aaatctggct	tggttgtggt	gatttcattc	tcattattgt	tgttttcttt	ccgtcttgcg	3960
gatgaagatg	ttgcgatgcg	gttgttgttg	gtgttgctat	acaccgagag	agatgatctt	4020

- 140 038595

tttgttcttc	tggttcattt	cctatgattg	tttggctgct	gaccgacgcg	tcaggatgtg	4080
cagggcatgc	ggggaatcag	gaccggacac	gggataattt	catctaccta	tacggagatc	4140
gcggtcctcg	ccatgaggat	cgcgacaggc	gcgtcgaggg	ggcaggaaca	cccttgcgga	4200
ttgacattct	tggtggtgtt	tcgttgttgt	cggtagttgt	tgttgacgat	gaggataaat	4260
aaaaatgacc	ttgtttttgt	tctgttttct	cttgttggga	atcgtcgact	ttgaattctt	4320
cgagttatcg	gaaagctgag	gtacccaaat	gtctgtagct	tttttctttt	taccctcttg	4380
tttatcatct	gcgattcgtg	gtaggtagga	gagggaaatg	ataatccgag	attaaggaaa	4440
ggagaagata	aaaaataaaa	aaaaaataat	aaaacagaag	ccgaccggcc	gccgacccgt	4500
tccccaggac	cagcctacga	ggaatggata	acgcggtggc	gacggcagcg	gtggtggcgc	4560
tgggggtggc	ggcagtggta	ctgctgatgg	tagtcgggac	ggaggagagg	cgatgcatac	4620
atacacgcgt	gcatgctgca	tgggtggatg	gtacggccgg	gagacgcgga	agagaaactc	4680
acataaaaag	gtgacaaaaa	gagcggttga	aaaaagaaaa	cgagattcga	ccagacagaa	4740
gagaaggacc	ggggcttggc	gacccttcca	cgactgctgt	tgtcatctcg	gctcccccgt	4800
cttctcccgg	ccacgggcgg	ctaagtcacc	gccgttctcc	ccatccgtcc	gagcgccgac	4860
cgaccagccg	gccgattcgc	ccgccggggc	ttctggagaa	cgccggggca	gcagcgatct	4920
ggggaagccg	ctaaacccct	gcgtttttat	atggtagctc	tgccgagcgc	gggctgacgc	4980
gttgagtaag	cggaaagacg	tgtgtgacga	aaaggggtcc	catggtattt	cacgtgacga	5040
tgaggagatg	cggtttggag	cacatacggt	ttagaaaaag	ggagttgtcg	tgacaagggc	5100
tgagggacct	ctgtctccat	gtgtgtataa	aaagcaaggc	acgttcataa	tgtaaaaaag	5160
aacacgttgt	aaacaagcta	ttgctgtatc	attcggctga	ctatgcttca	ttcggactga	5220
ttttcttttc	ctaacggcgt	aacttaaagt	gattaacgta	tgatatttgt	tccccagagt	5280
tatactatag	tcatcatcct	aaaattcaga	tataaatgaa	cacatgtcgt	atgggattat	5340
taagaaaccg	aaactctcca	cagttcacca	tcttcttcgt	cattcaaccg	atgacccact	5400
ccgtacaacg	aatcagtctg	ctgtgtcaca	ctgcaaacta	ctagcgacgt	atgcaaacaa	5460
cttgaaacac	gggctgttgt	attgacgacc	gttgtaccat	tactagtcac	attgcataga	5520
gaccatccac	cgtcatccca	tctttcccac	ccgatggaaa	accgtcttct	atcatcaact	5580

- 141 038595

atggtaagat	ttcgaccctg	cgaggtattc	agtttcccca	tatccataac	ctggatttta	5640
tcattaaacc	ccaatattaa	acactttttt	agtacccccc	cacccaccaa	aaaatgtgac	5700
tggaccggtt	cctagcagct	ctgggagcca	tgttcaggtt	gaaccacagc	tacagcgaaa	5760
ccgagtccag	tgaccggtaa	ccacgtccag	cccctgcgta	tgtaccagtc	caagcacgtc	5820
cggtcattgt	tctacacagg	aaatctaact	aggtcaacgc	aattttattc	caccgttacg	5880
cagaatacta	acaaacaaac	acacaaattt	aacgaattac	acgtagttta	ttacatgaaa	5940
actgtaagaa	caccaattca	ctaagcgata	caacatttag	ctgacttcca	agtgccacac	6000
atcaccactg	tattcatcca	tgttttcacc	gaaccaacga	gacagatcga	agaagccaga	6060
atctcccgac	tttaaattac	ataaatccaa	cgtattatga	ccacagctcg	acacacaaat	6120
agttgcgtta	ctattcacag	tagcattacc	tatacccgta	acgttgcaca	accactgatc	6180
accattgtta	ccaaaaacgg	ttttccactt	agttgtcaac	ggatctttcc	catgcgtaat	6240
ggtcaaatta	ctaccagtcg	tcgcttttag	ctcattacga	gtattatccg	catccacata	6300
tatcaacgtc	atagctaggc	acgctataag	tacccccccc	ccacaatgga	atgttgccaa	6360
accggttctt	tcccgttata	gccatagcgt	tcccaggcaa	aagcaaacgc	caaacctaat	6420
gcagtgaaaa	gcgcttgcag	ccagaaccag	cttatgtacc	agccacaatc	acatccggtt	6480
attgtttcca	caggaaatcc	taccaggcaa	agccccgctt	gttttgttcc	tgaccatctt	6540
gtttagcaat	tcgtaaactg	tcagcctagc	gacgtccgtt	tagatcaaaa	gtcacgtata	6600
tagcgacgct	gtttccaccc	gtttccccgt	cccgccgttt	ccgaacaacc	cacccgggtt	6660
cagacaaccg	accaccaaca	gaaatataca	cacagaccac	cgggagttca	gttaaagatt	6720
tcatcaggtt	tattttggct	gctgctagtc	ttttgcttct	tagaaaaaaa	atacccatat	6780
agagaaataa	tgatagtttg	acaacacata	tggcagggat	ttcttcttca	tcaataagat	6840
atgcaattcc	cccagggaga	gactttcaac	aattgaattt	acaaaaacaa	aattacatca	6900
ggagaaagag	aggatacatt	aataaatata	ttatatctgg	tgtatatact	gaatgctgct	6960
ggttcataag	gtaacgatgc	tacttttttt	aattccaaga	tggtttttct	ttgttagtct	7020
tttgttgact	tgctggttcc	taaaagttcg	caaaaacgat	tgtgtgaaga	ttatgacgtt	7080
ggttgactag	ttcatgagat	tctgctgtac	gtgtgatggt	tattcgctgg	ttcgttctaa	7140

- 142 038595

gatgagtatc	gtactgtgtc	tgcgatggtc	gtctcttact	ggcattctct	cggctgcctc	7200
ttgttttcat	gattgaaaag	gaaaaaagga	ctccgagggc	gcggtcatct	tttacttttc	7260
ggttttctcg	ttggcgggtc	agaggtagtc	agatcatgag	actgtcgtgg	tcgatgaaac	7320
tgtgtctgct	caagtgacgt	ccatttcttg	tacggagaaa	aaagtcatcg	ggataaataa	7380
ggctatacaa	ggcgttgtca	agcgtgcggc	tctaaacaaa	ttaagcgata	caaaattaca	7440
gtgatacgaa	taataaatta	ccccctcccc	ctgtggtccc	cccgaggcga	gagccaccca	7500
tcgtgtactc	tcgcaccacc	cacgaccaca	gggggagacg	ggacgaagag	acgacgcaga	7560
gcgccatctc	ctcctggagg	ccggcggcgt	taactgctac	agctgcggcg	gcgacgacag	7620
ctgcgatttg	tcggccgaca	tgccgatggt	atgggcggcg	gcggcggtgg	ccgcggcagc	7680
ggggaggaga	ggagagagaa	gaggagcggg	gcgtccgaag	gcgaggatgg	catggtctcg	7740
ccggagcgcc	cggcttttat	ggaacactcg	cgtccggttg	ggtatcaccc	acaggaagat	7800
gaatcacaac	ttccaaacca	tcttgagacc	cgagtaacgg	tttacaggtc	gcacgccagt	7860
ctcagctaaa	aacagcggac	agtcccacgc	tgtttctgtt	gtggctctct	ccagtttcct	7920
catcgccgtc	ttggtctccg	tcatcatcgg	aagaatacca	cccgctctca	tgcggcagtc	7980
gatcagcctc	gatgaacgag	acgcggcgac	gcctttctac	ggccgactgg	ttgtggtggt	8040
gaaagaagag	caccagcaat	cccaggagga	gcaacaagcc	ctcacatgtc	caggaggtcg	8100
gggagagggc	ctgtcggaga	tgaccgtgag	gcatcacgta	cggcagctga	ggagaaacgg	8160
agaagaaagg	aaaattaccg	tcaggggccg	gggttcttat	tagagaaaca	gcacgtaggt	8220
caggatccag	atgctaatgg	caatcatgat	gacgatgatc	atgcaggcca	agacgcggcg	8280
caccaatgca	gaatccaata	gccgccgtgc	ctccggttgg	tggccggcgg	catctagaga	8340
catgatttgg	gggggggacc	ggcggcgcaa	aaagacaggg	agatggacag	tgccacggtg	8400
ttttgttatg	attaggacat	ggggaccgga	agccgagaca	gagtactaca	gggtgttgaa	8460
gggtaacgtg	agggagatca	tgtcatgggc	gggctgaaga	ccgtgcgggg	aggatcgacg	8520
tgtgcggtgc	ttgtggaaca	cggtgtttta	atatgtatcc	gcgtgtaatg	cacgcggtgt	8580
gctttttagc	actcggcttg	ataagctacg	tgaccgtctg	cgctgaaacc	atggtcgcca	8640
ccaactgtct	cgtgaaaaca	gaaaataccc	acctagcatg	taagtgcaat	ccgaatagta	8700

- 143 038595

catctaccaa	tggcagcaag	tgccacgcga	tgtgcaaatg	ccgggtcaca	gaacccatta	8760
ccatgctagg	cgcatactcg	gcctggggcg	cgggctcgtt	cgtggccacg	ctgatagtcc	8820
tgctggtggt	cttcttcgta	atttacgcgc	gcgaggagga	gaaaaacaac	acgggcaccg	8880
aggtagatca	atgtctggcc	tatcggagcc	tgacacgcaa	aaagctggaa	caacacgcgg	8940
ctaaaaagca	gaacatctac	gaacggattc	cataccgacc	ctccagacag	aaagataact	9000
ccccgttgat	cgaaccgacg	ggcacagacg	acgaagagga	cgaggacgac	gacgtttaac	9060
gaggaagacg	agaacgtgtt	ttgcaccatg	cagacctaca	gcaactccct	cacgcttgtc	9120
atagtcacgt	cgctgttttt	attcacagct	cagggaagtt	tatcgaatgc	cgtcgaacca	9180
atcaaaaaac	ccctaaagct	cgccaactac	cgcgccactt	gcgaaaaccg	tacacgcacg	9240
ctggttacca	ggcttaacac	tagccatcac	agcgtagtct	ggcaacgtta	tgatatctac	9300
agcagataca	tgcgtcgtat	gccgccactt	tgcatcatta	cagacgccta	taaagaaacc	9360
acgcgtcagg	gtggcgcaac	tttcacgtgc	acgcgccaaa	atctcacgct	gtacaatctt	9420
acggttaaag	atacgggagt	ctaccttcta	caggatcagt	ataccggcga	tgtcgaagct	9480
ttctacctca	tcatccaccc	acgcagcttc	tgccgagcct	tggaaacgcg	tcgatgcttt	9540
tatccgggac	caggcagagt	cggtgtggtc	acggattccc	aagaggcaga	ccgagcaatt	9600
atctcggatt	taaaacgcca	gtggtccggc	ctctcactcc	attgcgcctg	ggtttcggga	9660
ctgatgatct	ttgttggcgc	actggtcatc	tgctttctgc	gatcgcaacg	aatcggagaa	9720
caggacgttg	aacatctgcg	gacggacctg	gatacggaac	ctttgttgtt	gacggtggac	9780
gggaatttgg	aataaaagat	gcgtaacacc	tgtcgaagat	gcgataactt	tacatacagg	9840
caaacagtgt	atacaattat	agtattttgt	atgttgcata	aagttacatg	caacagtact	9900
gctaacagta	ctgcatccat	tacgctatcc	aacactgcct	ctaccacttt	tgtaaccaac	9960
atatattcaa	ctccgaataa	caacacatca	acgacgccac	acacatctgt	cacctcacaa	10020
gcgtcaacca	ttggcaacat	caccaacgtt	acctccgact	tgagtacttt	cacaaccgta	10080
tattctacat	tcaatacatc	atttgccaat	atatctaata	cggctgtcac	tacagaattg	10140
atttcaacaa	ataccaacac	tatctcatct	tttaccaacg	taacagcaaa	cgctacatca	10200
tcttataaca	caacaatcac	cgtaactgtc	acgtcagatg	aaacttcgca	caacgtatcc	10260

- 144 038595

actaataatg	cacttataag	cacaccatgg	cctacaaatt	gcagcgccac	aacatacacc	10320
acgtacaacc	ttactaactc	ttccaacgct	tgtcacacag	agacaacaat	catacgtttc	10380
aaggaaacca	atacaacagg	aatagaaggg	agtaatgtca	ccataaaggg	taattctacg	10440
tgggactgtc	tttcagtcgc	ctggatacga	cattacaata	gatccacaca	cggacatcat	10500
ctaggttatc	gtaagaacgc	acatacccaa	tcttggtatt	ggctacgcat	ccttacctct	10560
cacactgtat	gtcattctca	acatgaaaga	ccttcactgt	accatgactt	atgtcgttcg	10620
tgcaacaaca	cagaattaca	tctgtacgat	ctaaatatca	ccaattccgg	caggtacagc	10680
agacgttgtt	ttaaagaaaa	ttacttcaca	ggacatcacg	aagatgaaaa	tttctaccta	10740
ttagtaacac	caaaaaatca	tactgaagct	attaatgcta	ctttcgtttg	ccctagatac	10800
aacaccgata	tcgaaaatga	agatagagag	aaaggaagtc	aacatactaa	caatacacat	10860
caccacaaac	gtaatctcta	tcatagctcg	caaagaagcc	gcaccgtatg	gaccatcgtg	10920
ttggtttgta	tggcctgcat	agttctgttt	tttgcacgac	gagcctttaa	caaaaagtat	10980
catatgttac	aagacaccgt	cagtgaatca	gaattcattg	ttcgatatca	cccagaacat	11040
gaagattgag	ctacgtttcc	gggcagacat	cttatgaagc	tgaacaataa	actaaaacat	11100
tctgtaagac	tcagcgttca	aaggaatatt	aatgcccatt	gagcgaaaac	taatattgca	11160
atggactggc	gatttacggt	tacgtggacg	atactaatgt	ccgcgttgtc	agaaagctgc	11220
aatcaaacct	gttcttgtca	atgtccctgt	agtactaccg	ttaactattc	aactagtact	11280
gagacagcca	catcaacata	cagtacaaca	gttatcagca	ataaaagcac	ttcagaatct	11340
ataaattgct	ctactgcaac	tacaccagca	aacaccgttt	ctacaaaacc	gtcggaaaca	11400
accacacaga	tatccacaac	gacgaacaca	aacgttgaga	ctaccacatg	taccaacacc	11460
accacgaccg	ttacttgtga	tggtttcaat	tatacagtcc	ataaaagatg	cgatcgcagt	11520
tacgaggtaa	tcaacgtaac	aggatacgtt	ggtagcaaca	taactctaaa	aaaatgcaat	11580
cagactgaga	aatggcacaa	tgtagactgg	attcattatg	agtaccccac	gcataaaatg	11640
tgcgaattag	gcaactatca	ccaaaccaca	ccacggcacg	acatatgttt	tgactgcaac	11700
gacacctccc	taactatcta	caacttaacc	acaaaaaacg	ctggaaaata	taccaggcgt	11760
caccgtgata	acggtcaaga	agaaaattac	tacgtaacgg	tgttaattgg	agacacaacg	11820

- 145 038595

ttattcactc	ttggcacatg	ccctgtaaga	tataaagaat	ctacgaacac	tgaaaacacc	11880
attggaagta	gcatcataga	aaccattgag	aaagctaaca	ttcccctggg	aattcatgct	11940
gtatgggcag	gcgtagtggt	atcagtggcg	cttatagcgt	tgtacatggg	tagccatcgc	12000
attcccaaaa	agccgcatta	caccaaactt	cccaaatatg	atccagatga	attttggact	12060
aaggcttaac	atgctgatca	ataaactttt	tttaaccaat	aacatgtctc	cgtttttttt	12120
tgttaacaac	ctatgatata	aagcgttata	ttcagtcgtt	actaaacaaa	aaaacatggg	12180
catgcaatgc	aacactaaat	tgttattgcc	agtcgcacta	ataccggttg	caatcatcct	12240
aattggtact	ctagtgccga	tacttttaca	tgaacaaaaa	aaggcgtttt	actggcgact	12300
ttttctgcaa	agtcaacatg	tagaagcacc	cattacagta	acgcagggag	acacagtcta	12360
cctagacgct	agcaataatc	cctgtaatta	ttccagcttt	tggtaccacg	gtaattgcga	12420
actttgtgga	tggaacggat	atctacgcaa	tgttacacat	tactacacaa	acacatcgtg	12480
ttccccgcaa	ttcatctgca	taaacgaaac	taaaggtctg	cagttatata	atgtaacatt	12540
aaacgattca	ggcgcttata	ctgaacacgt	ttacgaatgt	gacctttcgt	gtaacattac	12600
tactaataac	gaatatgaaa	tactcaatta	ttttgataac	tgtaactaca	ccataaatag	12660
caccaagcat	attatcaccg	tggtgtcttc	acgtcattct	aaacaaacaa	attcccacgt	12720
atccactcac	gctggttggg	cagtcgccgt	ggtgacggta	attatgatct	acgttctgat	12780
ccactttaac	gtcccggcaa	ctctgagaca	caaactacga	actagaaaca	acgtaaatcg	12840
catagcgtga	ttataaagta	tcgacgctaa	tttctccaag	ataaaatttg	attactccgt	12900
gcagttctca	aaaactgtaa	ggccccgctt	ttccactccg	tcatgaagga	tcgcaataga	12960
atactgctat	gtatcatctt	tatttgcatt	atgtgcctca	tttgtattta	ctttaaacgt	13020
cgttgtgttt	ttactccgtc	tccagacaaa	gcagatctgc	gagtggaatt	tccctcgtta	13080
cccccgtgta	ttggcataca	gtgcgctgca	tgagaacacg	cgtgacacat	agcgtacccc	13140
tggacggtac	agtttatgat	aacgtaattc	agggaaagta	tacattcata	ccaacatgtt	13200
atcacataac	acacagattt	tctgcgtgtt	ttataaaaga	gcgtctcgaa	gcagcttgag	13260
ccacactacg	gtccagatga	cgagcgtaat	taaaaatatg	ccgcgcagta	ttcgaaagcc	13320
gtactgagcg	tgcgaggcgg	gtagggtgcc	gaacgacgga	tatgcgtcgt	tgtcatcttc	13380

- 146 038595

gactataagg	atcgcgaccg	agtcttcggc	catggtaaac	gtcaccctgt	gtggctggta	13440
tgtagcgtat	ccggtttgga	attgttctgc	tccagctcgg	gggatagtga	ggaattctca	13500
agggatacgg	gacccaatga	ctggataaga	gaagggtttt	tccccgtaag	atgatcctcg	13560
tatcacatga	ggtctggata	tgtataaatg	aagagtgaaa	taggcacagg	gaatcagatg	13620
ccagcctcgt	gatgcagccg	ctggttctct	cggcgaagaa	actgtcgtct	ttgctgactt	13680
gcaaatacat	cccgccttaa	gcgatgagtc	tataaagcac	cgttgcccga	gtacggtaaa	13740
agtgacccgg	attgtagaac	gtcctttttt	tttgtttttg	catcgtttat	cgtcactact	13800
agtgcaatat	tttgattgta	aggctgaaag	agtatcgtta	tgatgcttag	aacgtggaga	13860
ttattacaga	tggtactgct	tgccgcgtac	tgttattatg	tttttgcgac	ttgttcaatc	13920
agcacgacga	ctgctcctgt	ggaatggaag	tctcccgacc	gtcagattcc	caagaatatt	13980
acctgcgcta	attactcagg	gaccgtcaac	ggcaacgtta	catttcgagg	tcttcagaac	14040
aaaacggaag	actttttgta	ctggttgtta	ggatggggtc	ataagtccat	ttgttcgttc	14100
ttcccgaaac	tccagggtaa	ctatgacgaa	caacattaca	gatatgaagt	agcgaacctg	14160
acgtataact	gcacctataa	ccgcttgacg	ttgctgaatc	tgacgacgga	aaacagcgga	14220
aagtactatt	tcaaaaggga	agatgcgaat	ttcaccttct	attactcttg	ttacaacttg	14280
accgtgtcct	aaagatcgca	cgtgaagttt	cacagagccg	cgtggctgta	gctattgtgt	14340
ttacgttgct	tttgaaatgt	taagcgtccc	tacggcgcta	acatgtttct	aggctactct	14400
gactgtgtag	atcccggcct	tgctgtgtat	cgtgtatcta	gatcacgctt	aaagctcatg	14460
ttgtcttttg	tgtggttggt	cggtttgcgt	ttctatgatt	gtgccgcgtt	cgagtcctgc	14520
tgttacgaca	tcaccgaggc	ggagagtaac	aaggctatat	caagggacga	agcagcattc	14580
acctccagcg	tgagcacccg	tacaccgtcc	ctggcgatcg	cgcctcctcc	tgaccgatcg	14640
atgctgttgt	cgcgagagga	agaactcgtt	ccgtggagtc	gtctcatcat	cactaagcag	14700
ttctacggag	gcctgatttt	ccacaccacc	tgggtcaccg	gcttcgtcct	gctaggactc	14760
ttgacgcttt	tcgccagcct	gtttcgcgta	ccgcaatcca	tctgtcgttt	ctgcatagac	14820
cgtctccggg	acatcgcccg	tcctctgaaa	taccgctatc	aacgtcttgt	cgctaccgtg	14880
tagctagtta	gccagctgtg	tgtagtgttt	tgcttttgca	tatttgtttt	cagtcagaga	14940

- 147 038595

gtctgaaacg	gggtgggagg	gacttttgcg	ggtagtgcat	gctaagatga	acgggtgggc	15000
tggggtgtgc	ttgataactc	actgtttgaa	tacgcgctca	cgcacatatg	tagcactcaa	15060
catgttagct	tttgcccgca	cgccccgggg	cgtgccgagc	tgccttttta	ataaagtctg	15120
ggtttccaga	tacgcgctgg	ttctgatttt	gatggtttgt	gcctctgaaa	gctctacgag	15180
ctgggccgtg	acatccaatg	gactgcctaa	ctgtagcacg	gtaactagaa	cagcgggtca	15240
agacgctgaa	ttgcacggtc	cggcaccgtt	aagctgtaat	gtgacccagt	ggggacgtta	15300
cgagaatgga	agcacacccg	tgttatggtg	cactttacgg	ggatcaagca	tgcgagtctc	15360
attaggacac	cgtgtagcgt	ttggctgttc	ttggaaaaca	ttttttattt	ataacgtttc	15420
tgaaagtagc	ggtggcactt	actatcaaaa	aggttacaac	tgcaccgaca	aacatataac	15480
actatcttgt	ttcaacttaa	cggtggttcc	tcgagcggtt	caaagcacaa	ccaccgtaat	15540
gacacccacg	ctggttacaa	actccacatt	cagtgtgtca	cttgttccgt	tgagactgac	15600
gacaaattcc	agcgcgtttg	gacacgctat	ttatcaacga	caacagcgtg	ttgaaaacgg	15660
gacgttatcc	aagaacataa	ctaacttggc	attcacctat	ggcagctggg	gcgttgcgat	15720
gctgctgttt	gccgccgtga	tggtgctcgt	tgatttgggt	ttgcctcaat	cggcttggcg	15780
acgctggcga	agccacgtgg	acgatgaaga	acgtggtttg	ttaatgtagg	aaataaaagg	15840
cagtttgagc	atgactgttt	ccaaaccgta	acgtggtaaa	taaatcatgg	cttccgacgt	15900
gggttctcat	cctctgacgg	ttacacgatt	tcgctgcaga	gtgcattatg	tgtacaataa	15960
actgttgatt	ttaactttgt	ttgcccccgt	gattctggaa	tccgtcatct	acgtgtccgg	16020
gccacaggga	gggaacgtta	ccctggtatc	caacttcact	tcaaacatca	gcgcacggtg	16080
gttccgctgg	gacggcaacg	atagccatct	catttgcttt	tacaaacgtg	gagagggtct	16140
ttctacgccc	tatgtgggtt	taagcctaag	ttgtgcggct	aaccaaatca	ccatcttcaa	16200
cctcacgttg	aacgactccg	gtcgttacgg	agcagaaggt	tttacgagaa	gcggcgaaaa	16260
tgaaacgttc	ctgtggtata	atttgaccgt	gaaacccaaa	cctttggaaa	ctactccagc	16320
tagtaacgta	acaaccatcg	tcacgacgac	atcgacgatg	atcgacgcga	aaagtaacgt	16380
tacagggaac	gccagtttag	caccacaatt	acgtgccgtc	gctggattct	ccaatcagac	16440
gcctttggaa	aacaacacgc	acctggcctt	ggtaggtgtt	gttgtgtttt	tagttctgat	16500

- 148 038595

agttgtttgc	attatggggt	ggtggaaatt	gttgtgtggt	aaaccagagt	tatagtaatg	16560
tgctttttat	cagggagaag	gttttgtgcc	aacaatgact	agcccgggac	tatctgcgtc	16620
agaaaattat	gacggaaatt	atgaattcac	ggaaaccgcc	aatacaacgc	gtacaaatag	16680
aagtgactgg	acaacgttag	aaaccagtgc	attgctattg	aaaaacacgg	agactgcagt	16740
gaacctcagc	aacgcgacta	cggtcatccc	acaacctgta	gaatacccgg	ctggggaagt	16800
acaatatcaa	agaacggcaa	cgcattattc	ttggatgcta	atcattgtca	tcattctcat	16860
catttttatt	atcatctgtc	tacgagcacc	tcgaaaaatc	taccatcact	ggaaagacag	16920
taaacagtac	ggacaagtgt	ttatgacaga	cacggaactg	tgacagtgat	gtctaagcgt	16980
ttgcaggtat	ttccatggat	aacaatttta	ttttacacat	caaaatccca	gtattggaac	17040
tatatggcaa	taccatgtac	ccctacagtt	ggatacggca	gtcataatat	tagcttgcat	17100
ccgcttaata	actcattatt	tcaagacgat	gtttttgaat	ggtacataga	caaaccaatg	17160
gttacaagtt	atgtctttat	caaagtaatg	aacgcacaaa	atccaatcta	gactctccaa	17220
atattgtgtg	gcaatgcaca	gataatcgta	cactaattct	catgaactta	accacaacat	17280
acagtagaaa	ctattatttt	caatccttta	aatatctcgg	acgaggagta	ccaaaaccga	17340
ataacttgtg	ttataacgtt	agtgtacact	ttacccacca	aacacattgc	catacaacta	17400
catcatccct	gtatccacct	acatctgtac	acgattcatt	agaaatatca	cagtcattca	17460
cctcaaccaa	cttcacacat	accgcggtcc	actacgccac	cggtaacgtt	gaagcacaac	17520
acgacactac	cactccacat	acaatgtgga	tcatacccct	agttatcgtt	ataacaatca	17580
tcgttttaac	ttgtttcaaa	ttcccccaga	aagcttggaa	taaattcaca	caatacagat	17640
acagcggtat	gctcgccgcc	gcttaaagaa	tcaacgccaa	ggaaaccaaa	acgtaaaaag	17700
aatagatatg	tacgtttatt	tttcagctca	ctgtttgaat	accgtaaaca	taatgacgta	17760
catatacgtg	gttatacaac	aggtgtttgt	gttatgcggc	gactgattaa	ccatatcgtg	17820
aaccatgatc	ttttccgatg	gtccgtcgtg	accgcaatga	tattttacag	atattccgaa	17880
acctgtatgg	aggtcactgt	cagagtaggt	gatccagtta	ccctcggtag	tggacatggt	17940
tatcatccag	gtagggataa	cagggtaatg	atcctctaga	gtcgacctgc	aggcatgcaa	18000
gcttgagtat	tctatagtct	cacctaaata	gcttgg			18036

- 149 038595 <210> 12 <211> 2310 < 212> ДНК < 213> последовательность gp49 LKA1 <400> 12

atggcgcaaa	cacccagtac	atgggccgac	tacgtaggcg	acggcgtaga	ggatacgttc	60
caagtcacat	tcccgtacca	gaagcagcaa	gaggtgtttg	tgactgtggg	cggcgatccg	120
gcagctttca	cattcatctc	ggcaggttgg	attcaactgg	cagcggtccc	ggtaaatggg	180
gccgcaatcc	gtgtacggcg	cagcactgag	gcattcgagc	ctcggcacga	gttcgccaac	240
ggcgtgccat	tactgccgcg	attcatagac	gagaataata	cccagttctt	gtacactgta	300
caagaggcag	tgaatgagac	acatggcatt	gcttccgaag	cgctgagtgt	cgcagaggag	360
gccagaggca	ttgcgcaggc	ggcatcggat	aaagtggatg	ctgccaccat	tgactccgca	420
caccagttgc	gtctagacct	cgccgacccg	gcgaaggggc	ctgggctgct	aggctacgac	480
cgagacgtaa	gttatccggt	cgggtcggtc	ggtcaaagcc	tacagtttct	ggaaatgggt	540
cgggtcacac	cagcgcaatt	tggcgccgtt	ggtgatggcg	ccagccaccc	cctctctgag	600
cgatacgcaa	ctctagcgga	agctcagact	gtctatccgc	atgcagtcgc	actctccgac	660
gaaatagact	gggccgcatt	gcaagctgcc	gtggattcag	gggcacctgt	acacataccg	720
tctggggact	atcagataaa	tagggggatt	agcagtacgg	gctctctaca	gattgcgggt	780
gatggcgcta	catctattat	acgcccgact	gctgcgttca	ctggtacatc	ggtcctcagt	840
tgtgtgggga	gcttagttgc	cttgccgaat	atatcctccg	tgtcggctgg	gtccctaacc	900
attgactttg	ccagcacccc	taatcttgta	gcgggggatg	tattcatcat	ctacaacccg	960
actgatagca	gcttctcggg	atttcggacg	agctatcgcg	caggagagtt	ctgtgaggtc	1020
agggcggttt	ctgggaacac	cgtgacaatc	cgttccgcac	tctatgccgc	atacgacggg	1080
gctactgttg	ctatttacaa	agtagtctct	ggtgtagttg	atatagctag	catccaaatc	1140
gttggcggga	cagtcccaat	gaatggactg	ttagtggagg	ctgtcgtttc	accgcgcgtc	1200
gatgacgtga	cggtcaccct	tgcaaacaac	gccggtgtgt	attttgcccg	ctgctatgac	1260
gctaagatca	caaacagtaa	tatatcgaac	atcggcgacg	gtggcgatga	ctatggaatc	1320
atctttggga	actgtcacga	cggtggggca	gacaactgta	aagtctacgc	taggcgacat	1380

- 150 038595

gccatcgcca	cgggcggcga	tgcagaagta	ggctgcgttc	cggtccgtaa	tgtgcgtatg	1440
cgtaactgca	cacttaggaa	tgatattacc	tctggtacac	actgcgcaga	cttccacggt	1500
aacgccgagg	attgcagcta	cgaaaactgc	acaatctacg	gtggtgcaac	ttggcagggg	1560
aaggatatca	gctacagaca	ctgtacaatc	actaacgcgt	cgggtggttg	gattgttata	1620
tccgctgaga	ttcttggtgg	tacattcctt	ctcgaccaat	gcacattgta	cacaaccggc	1680
gatccgcagc	ctggtaaccg	tggggttata	gatgtaggtg	ggaactccgc	agtcctcact	1740
acaaatacaa	cgcaaccctg	taacttcctt	atacaaggcg	gcagtctgcg	agcgcccagc	1800
ttaagtacgt	ctagttacct	actgcgcgca	cgtcttgagg	gtagtacagt	tccagtaaac	1860
atacagtaca	gcggacaggc	tattgatgta	ggctctctgg	gcaaggtact	acaactcgat	1920
attacctcgg	gcagtacctc	tcctgagtat	ttgatcgtgg	agaatttagc	ggggttgcca	1980
tctggcatca	cgctggcgtc	tgctgctggt	ggtttcgcaa	gtgccccgat	gcgtatgcct	2040
gtgctgggtg	gtagggttca	agtaactacg	gcaaccaacg	cgagtagcgt	tactgctcca	2100
gtaacgttca	ggtacattta	tcctaaggcc	ccaaccgtcc	aggtcacaaa	gacggacagg	2160
agctacgccg	gtaacagggt	cggcgttgct	atcgccaatc	cgacctctgc	gtctggggcg	2220
acgttgggtc	tgttcacgga	cgacgggaca	aactttagct	cagccgttac	taaccagttg	2280
aactggcagg	caggtattta	tgaggtgtaa				2310

< 210> 13 < 211> 1956 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1 <220>

< 221> misc_feature < 223> gp34 NTUH-K2044-K1-1 <400> 13

atggccctga	tccggctcgt	ggcgcccgag	cgcgtgttca gcgacctggc	cagcatggtc	60
gcctatccga	acttccaggt	gcaggacaag	atcaccctgc tgggctcggc	cggcggcgac	120
ttcaccttca	ccaccaccgc	gtcggtggtg	gacaacggca ccgtgttcgc	cgtgcccggc	180
ggctatctcc	tgcggaagtt	cgtcggcccg	gcgtatagct cgtggttcag	caactggacc	240

- 151 038595

gggatcgtca	cgttcatgag	cgcgccgaac	cggcacctgg	tggtggacac	cgtgctgcag	300
gccacgagcg	tgctgaacat	caagagcaac	agcacgctgg	aattcacgga	cacgggccgc	360
atcctgcccg	acgccgccgt	ggcccgccag	gtgctgaaca	tcaccggctc	cgcgccctcg	420
gtgttcgtgc	ccctcgccgc	cgacgccgcc	gcggggtcga	aggtgatcac	cgtggccgcc	480
ggcgcgctgt	ccgcggtgaa	aggcacctac	ctctatctgc	gctccaacaa	gctgtgcgac	540
ggcgggccga	acacctatgg	cgtcaagatc	agccaaatcc	gtaaggtggt	cggcgtgagc	600
accagcgggg	gcgtgacgtc	catccgcctc	gacaaagccc	tgcactataa	ctactacctc	660
tcggatgccg	ccgaagtggg	catcccgacc	atggtggaga	acgtcaccct	ggtgagcccg	720
tacatcaacg	agttcggcta	cgacgacctg	aaccgcttct	tcaccagcgg	catctccgcg	780
aacttcgcgg	ccgacctgca	catccaggac	ggcgtcatca	tcggcaacaa	gcgtccgggc	840
gcctccgaca	tcgagggccg	cagcgccatc	aagttcaaca	actgcgtgga	tagcaccgtg	900
aagggcacct	gcttctataa	tatcggctgg	tacggcgtgg	aggtcctcgg	ctgctcggag	960
gacaccgagg	tgcacgacat	ccacgccatg	gacgtgcgcc	atgccatctc	cctgaactgg	1020
caaagcaccg	ccgacggcga	taagtggggc	gaaccgatcg	agttcctggg	cgtgaactgt	1080
gaggcgtaca	gcaccaccca	ggccggcttc	gacacccacg	acatcgggaa	gcgtgtcaaa	1140
ttcgtccgct	gcgtgtccta	cgacagcgcg	gatgacggct	tccaggcccg	caccaacggc	1200
gtggagtacc	tcaactgccg	cgcctaccgc	gccgccatgg	acggcttcgc	ctcgaacacg	1260
ggcgtcgcct	tcccgatcta	ccgcgaatgc	ctggcctacg	acaacgtgcg	cagcgggttc	1320
aactgcagct	acggcggcgg	gtatgtgtac	gactgcgagg	cgcacggcag	ccagaacggc	1380
gtccgcatca	acggcggccg	ggtcaaaggc	gggcgctaca	cccgcaactc	gtcgagccac	1440
atcttcgtga	cgaaagatgt	ggcggaaacc	gcccaaacca	gcctcgagat	cgacggcgtc	1500
tccatgcggt	acgacggcac	cggccgcgcc	gtgtacttcc	acggcaccgt	gggcatcgat	1560
ccgacgctcg	tgagcatgtc	caacaacgac	atgaccggcc	acggcctgtt	ctgggccctg	1620
ctgtccggct	ataccgtgca	gccgaccccg	ccgcgcatgt	cgcgcaacct	gctcgacgat	1680
accggcatcc	gcggcgtcgc	gaccctggtc	gcgggcgaag	cgaccgtcaa	tgcccgcgtc	1740
cgcgggaact	tcggcagcgt	ggccaacagc	ttcaagtggg	tgtcggaggt	gaagctgacg	1800

- 152 038595

cgcctcacgt	tcccgtcgtc ggccggcgcc	ctcacggtca	ccagcgtcgc	ccaaaaccag	1860
gacgtgccga	cccccaaccc	ggacctgaac	agcttcgtca	tccgcagcag	caacgccgcc	1920
gacgtgtccc	aagtcgcctg	ggaggtctac	ctgtga			1956

<210> 14 < 211> 2184 < 212> ДНК < 213> Т7-подобный Ppl5 <220>

< 221> misc_feature < 223> добавлена последовательность gp44 Ppl5 <400> 14

atggcacgaa	ctatcgtcca	gaacgcccta	acaggcggac	aacaggactt	cgaggtacct	60
ttcgactaca	tcttgcagcg	cttcgttaag	cttaccctga	tcggtgacgg	taaccgacaa	120
gagctggtcc	tcggtaccga	cttccggttc	atcggtcctc	gcaccgttcg	cactaacgtc	180
ttctggggac	cagcgcaggg	gtatacctcc	atcgagatcc	gacgagttac	cagcgcttct	240
gatcgtcgcg	tagagttctc	ggacgggtcc	atcctgaccg	caggtgatct	gaacatcgcc	300
cagcttcagg	ccatccacat	tgccgaagaa	gcgcgagact	ctgccactga	gaacctgagc	360
ccagatgctg	atggcaacta	cgatgcacgt	ggtgcgcgca	tttacaacct	cggtgacgct	420
gttcagccga	aggatgcggt	caaccggtac	actcttgacc	tcgctatcgc	agccgctctg	480
gccatgaata	ccggcaaccc	gaacaacgcc	cagaacatct	cgtacacccc	taacgggcct	540
ggtcagtcga	tccgaagtgt	tgaaggccgt	ctgcgggatg	ctgtgttcgt	ctcggactac	600
atgaccactc	cacgtgatgg	agttaccagt	aaccagcagg	acctcgaaaa	ggcactcgct	660
gcggcgaacg	ctaaaggtgc	cgacctattc	tggcctgacg	acatcccgtt	cttctccacg	720
tccccgctgg	cactgatcca	cgcggtctac	catgttggac	gtggtgtcat	caacgcgaac	780
ggtacgctgt	tctacgtgaa	cccgaagaac	ggccaacaca	acaggctaca	cgtgtctccc	840
gggggcaccg	gggatggtct	ggcagctggc	cgcccactgg	ggaccatctg	gagtgcactc	900
gcggccctta	acatgcgagc	cccactgacc	acgcgctggt	ccttggagat	gaccgctggc	960
gcctataatg	aagccgttac	acttccgaac	tacctgacca	gctgtaacga	ctacttggcg	1020

- 153 038595

tttaactggc cgaacaccgg	tcaggaacgt	atggagccca	ctgcgtaccc	atcagctctc	1080
gacggcacag	gccagaccgg	cctcacaggt	ttccacactg	gcatcggcaa	ccgcattacc	1140
atcaacaacg	tgtgcatgtc	caactggtac	gacactgcgc	tgactcctac	ccaacaggtg	1200
cgaagagcgt	tcgttgtagg	tgcgtattcg	actgcctacg	tggtcaactg	cgcgttcatt	1260
tacaacggca	tcgcgagcgt	gtctgtgctg	cccggtggca	ctgctatcgt	aaccggtggc	1320
atcgtcgatg	gtgggcggtt	cggcctcgac	aacactggcg	gtcgcctgtc	cctgacggca	1380
accaagagca	attatacgca	ggtccggaac	tgcctcgaat	atggactgta	ctcgaagcat	1440
gacgcatcga	ccgtaatgga	caacaccgag	ttccgcaact	gcggtaatca	ccctgcggct	1500
gttgcgtatg	gtgctgcaat	cttcgcgtac	aagttcaact	gttctgttga	cactcgtggg	1560
gtcaagttct	acggcaacaa	catcgcccag	cactgccgtg	gcggtatcac	ctcggacaat	1620
ccgggcgatc	cggacatcta	cggtaccggc	gcagatgcta	ataagcgtct	attcctgtgc	1680
accggtggtg	gctctgacga	catccagttc	tacgaagctc	ggcgcgtcat	ggacatcacg	1740
aagcgcactg	gtggcggctc	aactactgcc	agcgtatcgt	cgctgctact	ggctgccgtt	1800
gcgtctgtcc	gtaagggcta	ctttgcgcac	aacgatcagg	tgatccggat	gaccctgatg	1860
ttccgcgcta	caggctcggc	tggcatcttc	acgccgacct	tgcgcacacc	tctggggact	1920
atccctctgg	gtagcttcag	ggtcgcatcg	ggacagtacg	gcgagatcaa	gttgaccatt	1980
cgacctactc	tgacatctga	tggtctcata	gtcgggttct	cctgcatcaa	cgccgtgcag	2040
aatcttgggt	cctctgttgg	tcaaatcatc	gtcagcggca	ccgtagacct	ccgcaccgtc	2100
gaccagctgg	tcgagatgtg	gggctattcg	gaagctggtg	gcaccgcttc	gtacattcaa	2160
ggcctgatcg	agctggtcgg	gtga				2184

< 210> 15 < 211> 1089 < 212> ДНК < 213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <220>

< 221> misc_feature <223> добавлена последовательность dspB

- 154 038595

<400> 15
atgaactgtt	gcgtcaaggg	caattccatc	tacccccaga	agacctccac	caagcagacc	60
ggcctgatgc	tcgatatcgc	ccggcatttc	tacagccccg	aggtgatcaa	gagcttcatc	120
gatacgatca	gcctgagcgg	cggcaacttc	ctccacctgc	acttctcgga	ccatgaaaac	180
tatgccatcg	agtcgcacct	gctcaaccag	cgggcggaga	acgccgtcca	ggggaaggat	240
ggcatctaca	tcaatccgta	caccgggaaa	ccgttcctga	gctaccgcca	gctggacgac	300
atcaaggcct	acgccaaggc	caagggcatc	gaactgatcc	cggagctgga	cagcccgaac	360
catatgacgg	ccatcttcaa	actggtccag	aaggaccgcg	gcgtcaagta	cctgcagggg	420
ctgaaatccc	gccaggtgga	cgacgagatc	gacatcacca	acgccgatag	catcaccttc	480
atgcagagcc	tgatgagcga	ggtcatcgat	atcttcggcg	acacgagcca	gcacttccac	540
atcggcggcg	acgaattcgg	ctactccgtc	gagagcaacc	acgagttcat	cacctacgcc	600
aacaagctgt	cgtacttcct	ggagaagaag	gggctcaaga	cccgcatgtg	gaacgacggc	660
ctcatcaaga	acaccttcga	gcagatcaat	cccaacatcg	aaatcacgta	ctggtcgtac	720
gacggcgaca	cccaggataa	gaacgaagcg	gccgagcgcc	gcgacatgcg	cgtgagcctg	780
ccggagctgc	tggcgaaggg	cttcaccgtg	ctgaactaca	acagctacta	cctctacatc	840
gtgccgaagg	cgagcccgac	gttctcgcag	gacgccgcct	tcgccgccaa	agacgtgatc	900
aagaactggg	atctgggcgt	ctgggatggc	cggaacacca	agaaccgcgt	gcagaacacc	960
catgagatcg	ccggggcggc	gctgtcgatc	tggggcgagg	atgcgaaggc	gctcaaggac	1020
gagacgatcc	agaagaacac	caaaagcctg	ctcgaggccg	tcatccacaa	gaccaacggc	1080
gacgagtga						1089
<210> 16 <211> 69 <212> ДНК <213> Staphylococcus	aureus

<220>

<221> misc_feature <223> добавлена последовательность SaPSMa3 <400> 16 atggagttcg tggcgaagct cttcaagttc ttcaaggacc tgctcgggaa gttcctgggg 60

- 155 038595 aataactga < 210> 17 < 211> 135 < 212> ДНК < 213> Staphylococcus aureus <220>

< 221> misc_feature < 223> добавлена последовательность SaPAMb2 < 400> 17 atgaccggcc tggccgaggc gatcgcgaat accgtccagg cggcccagca gcacgacagc 60 gtcaagctgg gcacctcgat cgtggacatc gtcgccaacg gcgtgggcct gctgggcaaa 120 ctcttcggct tctga 135 < 210> 18 < 211> 69 < 212> ДНК < 213> Staphylococcus epidermidis <220>

< 221> misc_feature <223> добавлена последовательность SePSMa <400> 18 atggcggacg tcatcgccaa gatcgtcgag atcgtgaagg gcctgatcga ccagttcacc cagaagtga <210> 19 <211> 228 < 212> ДНК < 213> Levivirus MS2 <220>

< 221> misc_feature <223> добавлена последовательность L MS2 <400> 19 atggagaccc ggttcccgca gcagtcccag caaaccccgg ccagcaccaa ccgccgccgc 60 cccttcaagc acgaggacta cccgtgccgc cggcagcagc gcagctccac cctgtacgtg 120

- 156 038595 ctgatcttcc tggcgatctt cctgagcaag ttcaccaacc agctgctgct gtccctgctg 180 gaggcggtca tccggaccgt caccaccctg cagcagctgc tgacctga 228 <210> 20 <211> 165 < 212> ДНК <213> Levivirus PRR1 <220>

< 221> misc_feature < 223> добавлена последовательность L PRR1 < 400> 20 atgtgcaagg tgtctactaa ggtagactct aaactgactg agtcagttgg acaactcacc60 ataaggagct acctatggct acggaatatc ctagcattag caggacttct tttcgtaatc120 cttcttgcga ccaatcattt atccatcgct atctacagtc cgtaa165 < 210> 21 < 211> 52 < 212> ДНК <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature < 223> промотор gp32 (P32) LUZ19 < 400> 21 cgaccctgcc ctactccggc cttaaaccca catccaaaag agagagaatc gc 52 < 210> 22 < 211> 96 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> терминатор gp32 (T32) LUZ19 <400> 22 tgccacgaaa ccccgcactt cggtgtgggg tttcttcaaa gcctaacgac ccgcgcagat 60 tccctgcgtg ggtttttgcg ctttaggaga aaccct

- 157 038595 <210> 23 <211> 204 <212> ДНК <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> область gp7 LUZ19 дикого типа <400> 23

tacaaggtgg	tggcacccag ctcggcggaa	ggtatcattg	tgctggcgac	caagcagacg	60
ccggcgctag	cccaagcagc cgtcgtactg	cacagcatga	accctgcgca	gtatcccgca	120
ggttcggcta	tcctcaacac ggcctggaag	tgccgccgcc	tgggagtggg	cgagtacgtc	180
aagctcgtcc	aaggggagga ggac				204

<210> 24 <211> 321 <212> ДНК <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> область gpl8 LUZ19 дикого типа <400> 24

gaatgccaac	cgaagaagaa	cgcatgatcc	gctgtttact	ggcggatatc	cacgagccac	60
tggacctgct	gttccccggc	ctccgtacca	aggcccatat	ggacccgcaa	gcagaggaac	120
tgtcgattcg	aattgactac	gaccatgcga	agctgggccg	tatgggattc	tgccacgcgg	180
tatccctata	tcaactgtcc	atatatggcc	gcgaggggat	ggtccgctac	ctgatgcagg	240
agattccccg	ccgcgtgctg	gaaggtctgc	tggtcaaggc	gcagcagtac	agccaaagca	300
actggtacag	caaatgacga	c				321

<210> 25 <211> 225 <212> ДНК <213> Phikmvlikevirus LKD16

- 158 038595

<220>
<221> misc_feature <223> gp49 и межгенная область gp48-gp49 LUZ19 дикого	типа
<400> 25 ggggacacca tgagcaaagc caaactacga gtcatcgccg	acaccccgga	gctggagtca	60
gtgctaaaag cattgctgac cgccacctac gctatcgagg	acctgctcaa	cgaggccgtg	120
gctagcaagg tgctaaactc ccgcctgggc tggtccgcag	tcggcgagta	tgtcgaactg	180
ttcaaccgca cgcaatcccg cgtggccggg ttgattcccg	agtag		225
<210> 26 <211> 345 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LKD16 <220> < 221> misc_feature < 223> ген gpl8 LKD16 дикого типа < 400> 26 gtgcgagtac caactgaaca cgagcgcacc ctgcgctgcc	tgctccaaga	catccacggg	60
ccgctgaatc tgctgttccc aggtatccgg gtgaaggtgg	aggaggcgtg	cctcggatac	120
ttgggctaca gggagcgggg ctattgggag ctgcgcctcc	aggtggacta	cgaccacccg	180
aagcttgggc acctccgcta cagtcaggcc gtgccggagt	acgtgctgat	caacgaccgc	240
gacagcatca tcaagtacct gatggaagca gtccctcggc	aggtactaga	gggcatgctc	300
aataaggccc aggaattcgt aaccaagaac tggtattccc	tatga		345
<210> 27 <211> 4269 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220> < 223> ген, кодирующий l\ILS-FLAG-CAS9-His <400> 27 atgcccaaga aaaagcggaa ggtcggcgac tacaaggatg	acgatgacaa	gttggagcct	60
ggagagaagc cctacaaatg ccctgagtgc ggaaagagct	tcagccaatc	tggagccttg	120
acccggcatc aacgaacgca tacacgagac aagaagtact	ccatcgggct	ggacatcggg	180

- 159 038595

acgaactccg	tgggatgggc	cgtgatcaca	gacgaataca	aggtgccttc	caagaagttc	240
aaggtgctgg	ggaacacgga	cagacactcc	atcaagaaga	acctcatcgg	ggccttgctc	300
ttcgactccg	gagaaaccgc	cgaagcaacg	cgattgaaaa	gaaccgccag	aagacgatac	360
acacgacgga	agaaccgcat	ctgctacctc	caggagatct	tcagcaacga	gatggccaag	420
gtggacgact	cgttctttca	tcgcctggag	gagagcttcc	tggtggagga	agacaagaaa	480
catgagcgcc	acccgatctt	cgggaacatc	gtggacgaag	tggcctacca	cgagaaatac	540
cccacgatct	accacttgcg	caagaaactc	gtggactcca	cggacaaagc	ggacttgcgg	600
ttgatctact	tggccttggc	ccacatgatc	aaatttcggg	gccacttcct	gatcgagggc	660
gacttgaatc	ccgacaattc	cgacgtggac	aagctcttca	tccagctggt	gcagacctac	720
aaccagctct	tcgaggagaa	ccccatcaat	gcctccggag	tggacgccaa	agccatcttg	780
tccgcccgat	tgtccaaatc	cagacgcttg	gagaacttga	tcgcacaact	tcctggcgag	840
aagaagaacg	gcctcttcgg	caacttgatc	gcgctgtcgc	tgggattgac	gcctaacttc	900
aagtccaact	tcgacttggc	cgaggacgcc	aagttgcaac	tgtccaagga	cacctacgac	960
gacgacctcg	acaacctgct	ggcccaaatt	ggcgaccaat	acgcggactt	gtttttggcg	1020
gccaagaact	tgagcgacgc	catcttgttg	agcgacatct	tgcgcgtgaa	tacggagatc	1080
accaaagccc	ctttgtccgc	ctctatgatc	aagcggtacg	acgagcacca	ccaagacttg	1140
accctgttga	aagccctcgt	gcggcaacaa	ttgcccgaga	agtacaagga	gatcttcttc	1200
gaccagtcca	agaacgggta	cgccggctac	atcgacggag	gagcctccca	agaagagttc	1260
tacaagttca	tcaagcccat	cctggagaag	atggacggca	ccgaggagtt	gctcgtgaag	1320
ctgaaccgcg	aagacttgtt	gcgaaaacag	cggacgttcg	acaatggcag	catcccccac	1380
caaatccatt	tgggagagtt	gcacgccatc	ttgcgacggc	aagaggactt	ctacccgttc	1440
ctgaaggaca	accgcgagaa	aatcgagaag	atcctgacgt	tcagaatccc	ctactacgtg	1500
ggacccttgg	cccgaggcaa	ttcccggttt	gcatggatga	cgcgcaaaag	cgaagagacg	1560
atcaccccct	ggaacttcga	agaagtggtc	gacaaaggag	catccgcaca	gagcttcatc	1620
gagcgaatga	cgaacttcga	caagaacctg	cccaacgaga	aggtgttgcc	caagcattcg	1680
ctgctgtacg	agtacttcac	ggtgtacaac	gagctgacca	aggtgaagta	cgtgaccgag	1740

- 160 038595

ggcatgcgca	aacccgcgtt	cctgtcggga	gagcaaaaga	aggccattgt	ggacctgctg	1800
ttcaagacca	accggaaggt	gaccgtgaaa	cagctgaaag	aggactactt	caagaagatc	1860
gagtgcttcg	actccgtgga	gatctccggc	gtggaggacc	gattcaatgc	ctccttggga	1920
acctaccatg	acctcctgaa	gatcatcaag	gacaaggact	tcctggacaa	cgaggagaac	1980
gaggacatcc	tggaggacat	cgtgctgacc	ctgaccctgt	tcgaggaccg	agagatgatc	2040
gaggaacggt	tgaaaacgta	cgcccacttg	ttcgacgaca	aggtgatgaa	gcagctgaaa	2100
cgccgccgct	acaccggatg	gggacgattg	agccgcaaac	tgattaatgg	aattcgcgac	2160
aagcaatccg	gaaagaccat	cctggacttc	ctgaagtccg	acgggttcgc	caaccgcaac	2220
ttcatgcagc	tcatccacga	cgactccttg	accttcaagg	aggacatcca	gaaggcccaa	2280
gtgtccggac	aaggagactc	cttgcacgag	cacatcgcca	atttggccgg	atcccccgca	2340
atcaaaaaag	gcatcttgca	aaccgtgaaa	gtggtcgacg	aactggtgaa	ggtgatggga	2400
cggcacaagc	ccgagaacat	cgtgatcgaa	atggcccgcg	agaaccaaac	cacccaaaaa	2460
ggacagaaga	actcccgaga	gcgcatgaag	cggatcgaag	agggcatcaa	ggagttgggc	2520
tcccagatcc	tgaaggagca	tcccgtggag	aatacccaat	tgcaaaacga	gaagctctac	2580
ctctactacc	tccagaacgg	gcgggacatg	tacgtcgacc	aagagctgga	catcaaccgc	2640
ctctccgact	acgatgtgga	tcatattgtg	ccccagagct	tcctcaagga	cgacagcatc	2700
gacaacaagg	tcctgacgcg	cagcgacaag	aaccggggca	agtctgacaa	tgtgccttcc	2760
gaagaagtcg	tgaagaagat	gaagaactac	tggcggcagc	tgctcaacgc	caagctcatc	2820
acccaacgga	agttcgacaa	cctgaccaag	gccgagagag	gaggattgtc	cgagttggac	2880
aaagccggct	tcattaaacg	ccaactcgtg	gagacccgcc	agatcacgaa	gcacgtggcc	2940
caaatcttgg	actcccggat	gaacacgaaa	tacgacgaga	atgacaagct	gatccgcgag	3000
gtgaaggtga	tcacgctgaa	gtccaagctg	gtgagcgact	tccggaagga	cttccagttc	3060
tacaaggtgc	gggagatcaa	caactaccat	cacgcccatg	acgcctacct	gaacgccgtg	3120
gtcggaaccg	ccctgatcaa	gaaatacccc	aagctggagt	ccgaattcgt	gtacggagat	3180
tacaaggtct	acgacgtgcg	gaagatgatc	gcgaagtccg	agcaggagat	cggcaaagcc	3240
accgccaagt	acttctttta	ctccaacatc	atgaacttct	tcaagaccga	gatcacgctc	3300

- 161 038595

gccaacggcg agatccgcaa	gcgccccctg	atcgagacca	acggcgagac	gggagagatt	3360
gtgtgggaca aaggaagaga	ttttgccaca	gtgcgcaagg	tgctgtccat	gcctcaggtg	3420
aacatcgtga agaagaccga	ggtgcaaaca	ggagggtttt	ccaaagagtc	cattttgcct	3480
aagaggaatt ccgacaagct	catcgcccgc	aagaaggact	gggaccccaa	gaagtacggg	3540
ggcttcgact cccccacggt	ggcctactcc	gtgttggtgg	tggccaaagt	ggagaaaggg	3600
aagagcaaga agctgaaatc	cgtgaaggag	ttgctcggaa	tcacgatcat	ggaacgatcg	3660
tcgttcgaga aaaaccccat	cgacttcctc	gaagccaaag	ggtacaaaga	ggtgaagaag	3720
gacctgatca tcaagctgcc	caagtactcc	ctgttcgagc	tggagaacgg	ccgcaagcgg	3780
atgctggcct ccgccgggga	actgcagaaa	gggaacgaat	tggccttgcc	ctccaaatac	3840
gtgaacttcc tctacttggc	ctcccattac	gaaaagctca	aaggatcccc	tgaggacaat	3900
gagcagaagc aactcttcgt	ggaacaacac	aagcactacc	tggacgagat	catcgagcag	3960
atcagcgagt tctccaagcg	cgtgatcctc	gccgacgcca	acctggacaa	ggtgctctcc	4020
gcctacaaca agcaccgcga	caagcctatc	cgcgagcaag	ccgagaatat	cattcacctg	4080
tttaccctga cgaatttggg	agcccctgcc	gcctttaaat	actttgacac	caccatcgac	4140
cgcaaaagat acacctccac	caaggaagtc	ttggacgcca	ccctcatcca	ccagtccatc	4200
acgggcctct acgagacgcg	catcgacctc	tcccaattgg	gcggcgacca	tcatcaccac	4260

caccactaa 4269 <210> 28 < 211> 507 < 212> ДНК < 213> Inovirus M13MP18 <220>

< 221> misc_feature < 223> заменена область M13MP18 дикого типа <400> 28

atgaccatga	ttacgaattc gagctcggta	cccggggatc	ctctagagtc	gacctgcagg	60
catgcaagct	tggcactggc cgtcgtttta	caacgtcgtg	actgggaaaa	ccctggcgtt	120
acccaactta	atcgccttgc agcacatccc	cctttcgcca	gctggcgtaa	tagcgaagag	180

- 162 038595

gcccgcaccg	atcgcccttc	ccaacagttg	cgcagcctga	atggcgaatg	gcgctttgcc	240
tggtttccgg	caccagaagc	ggtgccggaa	agctggctgg	agtgcgatct	tcctgaggcc	300
gatacggtcg	tcgtcccctc	aaactggcag	atgcacggtt	acgatgcgcc	catctacacc	360
aacgtaacct	atcccattac	ggtcaatccg	ccgtttgttc	ccacggagaa	tccgacgggt	420
tgttactcgc	tcacatttaa	tgttgatgaa	agctggctac	aggaaggcca	gacgcgaatt	480
atttttgatg	gcgttcctat	tggttaa				507

< 210> 29 < 211> 792 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Неизвестный <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность Paprika <220>

< 221> misc_feature < 223> коммерчески доступный из ДНК2.0 <400> 29

atggtgtcaa	agggagaaga	actgatcaaa	gagaatatga	ggatgaaact	ctacatggaa	60
ggaactgtga	acaaccacca	tttcaagtgc	acgagcgagg	gtgaagggaa	accttacgaa	120
ggtacccaga	ccatgcggat	taaggtcgtc	gaaggaggac	cactcccctt	cgcattcgac	180
atcctggcca	cttccttcat	gtacgggtcg	cgcactttca	tcaagtaccc	aaaagggatc	240
cccgacttct	tcaagcagtc	ctttccggag	ggattcactt	gggaacgcgt	cactagatac	300
gaggatggcg	gagtggtcac	cgtgatgcaa	gacacctctt	tggaagatgg	atgcctggtg	360
taccacgtgc	aagtcagagg	agtgaacttt	ccgagcaatg	ggccggtgat	gcagaagaaa	420
accaagggct	gggaaccgaa	caccgaaatg	ctgtatccag	cagacggagg	cttggagggc	480
cggtccgaca	tggctctgaa	gcttgttgga	ggaggacatc	tgtcctgctc	gttcgtgacg	540
acctaccgga	gcaagaagcc	ggcgaaaaac	cttaagatgc	cggggatcca	cgcggtggat	600
catcgcctgg	aaaggctcga	ggagtcagac	aacgagatgt	ttgtcgtgca	acgcgagcac	660

- 163 038595 gccgtggccc gctactgtga tctcccttca aagctgggcc acaagctgaa ttccggcctc

720 cggtcgagag cccaggcttc gaattcagcc gtggacggaa ctgcgggccc tggttcgacc

780 ggaagccgat ga

792 <210> 30 <211> 294 <212> ДНК <213> Lambdavirus лямбда <220>

< 221> misc_feature < 223> фаг дикого типа E. coli < 400> 30 atggttcgtg caaacaaacg caacgaggct ctacgaatcg agagtgcgtt gcttaacaaa60 atcgcaatgc ttggaactga gaagacagcg gaagctgtgg gcgttgataa gtcgcagatc120 agcaggtgga agagggactg gattccaaag ttctcaatgc tgcttgctgt tcttgaatgg180 ggggtcgttg acgacgacat ggctcgattg gcgcgacaag ttgctgcgat tctcaccaat240 aaaaaacgcc cggcggcaac cgagcgttct gaacaaatcc agatggagtt ctga294 <210> 31 < 211> 1422 < 212> белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Неизвестный <220>

< 221> misc_feature < 223> NLS-ME4EHblli-CAS9-His белок, транслируемый c SEQ ID NO:27 < 400> 31

Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Vai Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 15 10 15

Lys Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys

- 164 038595

Ser Phe Ser Gin Ser Gly Ala Leu Thr Arg His Gin Arg Thr His Thr 35 4045

Arg Asp Lys Lys Tyr Ser lie Gly Leu Asp lie Gly Thr Asn Ser Vai 50 5560

Gly Trp Ala Vai lie Thr Asp Glu Tyr Lys Vai Pro Ser Lys Lys Phe 65 70 7580

Lys Vai Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser lie Lys Lys Asn Leu lie 85 9095

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

100 105110

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg lie Cys

115 120125

Tyr Leu Gin Glu lie Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Vai Asp Asp Ser

130 135140

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Vai Glu Glu Asp Lys Lys

145 150 155160

His Glu Arg His Pro lie Phe Gly Asn lie Vai Asp Glu Vai Ala Tyr

165 170175

His Glu Lys Tyr Pro Thr lie Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Vai Asp

180 185190

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu lie Tyr Leu Ala Leu Ala His

195 200205

Met lie Lys Phe Arg Gly His Phe Leu lie Glu Gly Asp Leu Asn Pro

210 215220

Asp Asn Ser Asp Vai Asp Lys Leu Phe lie Gin Leu Vai Gin Thr Tyr

225 230 235240

- 165 038595

Asn

Gln

Leu

Phe

Glu

245

Glu

Asn

Pro

He

Asn

250

Ala

Ser

Gly

Val

Asp 255

Ala

Lys

Ala

He

Leu

260

Ser

Ala

Arg

Leu

Ser

265

Lys

Ser

Arg

Arg

Leu

270

Glu

Asn

Leu

He

Ala

275

Gln

Leu

Pro

Gly

Glu

280

Lys

Lys

Asn

Gly

Leu

285

Phe

Gly

Asn

Leu

He

290

Ala

Leu

Ser

Leu

Gly 295

Leu

Thr

Pro

Asn

Phe

300

Lys

Ser

Asn

Phe

Asp 305

Leu

Ala

Glu

Asp

Ala

310

Lys

Leu

Gln

Leu

Ser

315

Lys

Asp

Thr

Tyr

Asp 320

Asp

Asp

Leu

Asp

Asn

325

Leu

Leu

Ala

Gln

He

330

Gly

Asp

Gln

Tyr

Ala

335

Asp

Leu

Phe

Leu

Ala

340

Ala

Lys

Asn

Leu

Ser

345

Asp

Ala

He

Leu

Leu

350

Ser

Asp

He

Leu

Arg 355

Val

Asn

Thr

Glu

He

360

Thr

Lys

Ala

Pro

Leu

365

Ser

Ala

Ser

Met

He

370

Lys

Arg

Tyr

Asp

Glu

375

His

His

Gln

Asp

Leu

380

Thr

Leu

Leu

Lys

Ala

385

Leu

Val

Arg

Gln

Gln

390

Leu

Pro

Glu

Lys

Tyr

395

Lys

Glu

He

Phe

Phe

400

Asp

Gln

Ser

Lys

Asn

405

Gly

Tyr

Ala

Gly

Tyr 410

He

Asp

Gly

Gly

Ala

415

Ser

Gln

Glu

Glu

Phe

420

Tyr

Lys

Phe

He

Lys

425

Pro

He

Leu

Glu

Lys 430

Met

Asp

Gly

Thr

Glu

435

Glu

Leu

Leu

Val

Lys 440

Leu

Asn

Arg

Glu

Asp 445

Leu

Leu

Arg

- 166 038595

Lys Gin Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser lie Pro His Gin lie His Leu

450 455460

Gly Glu Leu His Ala lie Leu Arg Arg Gin Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

465 470 475480

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys lie Glu Lys lie Leu Thr Phe Arg lie

485 490495

Pro Tyr Tyr Vai Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

500 505510

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr lie Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

515 520525

Vai Vai Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gin Ser Phe lie Glu Arg Met Thr

530 535540

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Vai Leu Pro Lys His Ser

545 550 555560

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Vai Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Vai Lys

565 570575

Tyr Vai Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gin

580 585590

Lys Lys Ala lie Vai Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Vai Thr

595 600605

Vai Lys Gin Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys lie Glu Cys Phe Asp

610 615620

Ser Vai Glu lie Ser Gly Vai Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

625 630 635640

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys lie lie Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

645 650655

- 167 038595

Asn Glu Glu Asn Glu Asp lie Leu Glu Asp lie Vai Leu Thr Leu Thr

660 665670

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met lie Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

675 680685

His Leu Phe Asp Asp Lys Vai Met Lys Gin Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

690 695700

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu lie Asn Gly lie Arg Asp

705 710 715720

Lys Gin Ser Gly Lys Thr lie Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

725 730735

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gin Leu lie His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

740 745750

Lys Glu Asp lie Gin Lys Ala Gin Vai Ser Gly Gin Gly Asp Ser Leu

755 760765

His Glu His lie Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala lie Lys Lys Gly

770 775780 lie Leu Gin Thr Vai Lys Vai Vai Asp Glu Leu Vai Lys Vai Met Gly

785 790 795800

Arg His Lys Pro Glu Asn lie Vai lie Glu Met Ala Arg Glu Asn Gin

805 810815

Thr Thr Gin Lys Gly Gin Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg lie

820 825830

Glu Glu Gly lie Lys Glu Leu Gly Ser Gin lie Leu Lys Glu His Pro

835 840845

Vai Glu Asn Thr Gin Leu Gin Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

850 855860

- 168 038595

Gin Asn Gly Arg Asp Met Tyr Vai Asp Gin Glu Leu Asp lie Asn Arg

865 870 875880

Leu Ser Asp Tyr Asp Vai Asp His lie Vai Pro Gin Ser Phe Leu Lys

885 890895

Asp Asp Ser lie Asp Asn Lys Vai Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

900 905910

Gly Lys Ser Asp Asn Vai Pro Ser Glu Glu Vai Vai Lys Lys Met Lys

915 920925

Asn Tyr Trp Arg Gin Leu Leu Asn Ala Lys Leu lie Thr Gin Arg Lys

930 935940

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

945 950 955960

Lys Ala Gly Phe lie Lys Arg Gin Leu Vai Glu Thr Arg Gin lie Thr

965 970975

Lys His Vai Ala Gin lie Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

980 985990

Glu Asn Asp Lys Leu lie Arg Glu Vai Lys Vai lie Thr Leu Lys Ser 995 10001005

Lys Leu Vai Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gin Phe Tyr Lys Vai

1010 10151020

Arg Glu lie Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn

1025 10301035

Ala Vai Vai Gly Thr Ala Leu lie Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu

1040 10451050

Ser Glu Phe Vai Tyr Gly Asp Tyr Lys Vai Tyr Asp Vai Arg Lys

1055 10601065

- 169 038595

Met

He 1070

Ala

Lys

Ser

Glu

Gin 1075

Glu

lie Gly

Lys

Ala 1080

Thr

Ala

Lys

Туг

Phe 1085

Phe

Tyr

Ser

Asn

He 1090

Met

Asn

Phe

Phe

Lys 1095

Thr

Glu

He

Thr

Leu 1100

Ala

Asn

Gly

Glu

He 1105

Arg

Lys

Arg

Pro

Leu 1110

He

Glu

Thr

Asn

Gly 1115

Glu

Thr

Gly

Glu

He 1120

Vai

Trp

Asp

Lys

Gly 1125

Arg

Asp

Phe

Ala

Thr 1130

Vai

Arg

Lys

Vai

Leu 1135

Ser

Met

Pro

Gin

Vai 1140

Asn

He

Vai

Lys

Lys 1145

Thr

Glu

Vai

Gin

Thr 1150

Gly

Gly

Phe

Ser

Lys 1155

Glu

Ser

He

Leu

Pro 1160

Lys

Arg

Asn

Ser

Asp 1165

Lys

Leu

He

Ala

Arg 1170

Lys

Lys

Asp

Trp

Asp 1175

Pro

Lys

Lys

Tyr

Gly 1180

Gly

Phe

Asp

Ser

Pro 1185

Thr

Vai

Ala

Tyr

Ser 1190

Vai

Leu

Vai

Vai

Ala 1195

Lys

Vai

Glu

Lys

Gly 1200

Lys

Ser

Lys

Lys

Leu 1205

Lys

Ser

Vai

Lys

Glu 1210

Leu

Leu

Gly

He

Thr 1215

He

Met

Glu

Arg

Ser 1220

Ser

Phe

Glu

Lys

Asn 1225

Pro

He

Asp

Phe

Leu 1230

Glu

Ala

Lys

Gly

Tyr 1235

Lys

Glu

Vai

Lys

Lys 1240

Asp

Leu

He

He

Lys 1245

Leu

Pro

Lys

Tyr

Ser 1250

Leu

Phe

Glu

Leu

Glu 1255

Asn

Gly

Arg

Lys

Arg 1260

Met

Leu

Ala

- 170 038595

Ser

Ala 1265

Gly

Glu

Leu Gln

Lys 1270

Gly Asn

Glu

Leu

Ala 1275

Leu

Pro

Ser

Lys

Tyr 1280

Val

Asn

Phe

Leu

Tyr 1285

Leu

Ala

Ser

His

Tyr 1290

Glu

Lys

Leu

Lys

Gly 1295

Ser

Pro

Glu

Asp

Asn 1300

Glu

Gln

Lys

Gln

Leu 1305

Phe

Val

Glu

Gln

His 1310

Lys

His

Tyr

Leu

Asp 1315

Glu

lie

lie

Glu

Gln 1320

lie

Ser

Glu

Phe

Ser 1325

Lys

Arg

Val

lie

Leu 1330

Ala

Asp

Ala

Asn

Leu 1335

Asp

Lys

Val

Leu

Ser 1340

Ala

Tyr

Asn

Lys

His 1345

Arg

Asp

Lys

Pro

lie 1350

Arg

Glu

Gln

Ala

Glu 1355

Asn

lie

lie

His

Leu 1360

Phe

Thr

Leu

Thr

Asn 1365

Leu

Gly

Ala

Pro

Ala 1370

Ala

Phe

Lys

Tyr

Phe 1375

Asp

Thr

Thr

lie

Asp 1380

Arg

Lys

Arg

Tyr

Thr 1385

Ser

Thr

Lys

Glu

Val 1390

Leu

Asp

Ala

Thr

Leu 1395

lie

His

Gln

Ser

lie 1400

Thr

Gly

Leu

Tyr

Glu 1405

Thr

Arg

lie

Asp

Leu 1410

Ser

Gln

Leu

Gly

Gly 1415

Asp

His

His

His

His 1420

His

His

<210> 32 <211> 909 < 212> ДНК < 213> Цитомегаловирус ЦМВЧ <220>

< 221> misc_feature

- 171 038595 <223> пост-редактирование фрагмента RL14 ЦМВЧ <400> 32

atggactggc	gatttacggt	tacgtggacg	atactaatgt	ccgcgttgtc	agaaagctgc	60
aatcaaacct	gttcttgtca	atgtccctgt	agtactaccg	ttaactattc	aactagtact	120
gagacagcca	catcaacata	cagtacaaca	gttatcagca	ataaaagcac	ttcagaatct	180
ataaattgct	ctactgcaac	tacaccagca	aacaccgttt	ctacaaaacc	gtcggaaaca	240
accacacaga	tatccacaac	gacgaacaca	aacgttgaga	ctaccacatg	taccaacacc	300
accacgaccg	ttacttgtga	tggtttcaat	tatacagtcc	ataaaagatg	cgatcgcagt	360
tacgaggtaa	tcaacgtaac	aggatacgtt	ggtagcaaca	taactctaaa	aaaatgcaat	420
cagactgaga	aatggcacaa	tgtagactgg	attcattatg	agtaccccac	gcataaaatg	480
tgcgaattag	gcaactatca	ccaaaccaca	ccacggcacg	acatatgttt	tgactgcaac	540
gacacctccc	taactatcta	caacttaacc	acaaaaaacg	ctggaaaata	taccaggcgt	600
caccgtgata	acggtcaaga	agaaaattac	tacgtaacgg	tgttaattgg	agacacaacg	660
ttattcactc	ttggcacatg	ccctgtaaga	tataaagaat	ctacgaacac	tgaaaacacc	720
attggaagta	gcatcataga	aaccattgag	aaagctaaca	ttcccctggg	aattcatgct	780
gtatgggcag	gcgtagtggt	atcagtggcg	cttatagcgt	tgtacatggg	tagccatcgc	840
attcccaaaa	agccgcatta	caccaaactt	cccaaatatg	atccagatga	attttggact	900

aaggcttaa 909 <210> 33 <211> 630 < 212> ДНК < 213> Цитомегаловирус ЦМВЧ <220>

< 221> misc_feature <223> пост-редактирование RL13 ЦМВЧ <400> 33 atggactggc gatttacggt tacgtggacc gttacttgtg atggtttcaa ttatacagtc60 cataaaagat gcgatcgcag ttacgaggta atcaacgtaa caggatacgt tggtagcaac120 ataactctaa aaaaatgcaa tcagactgag aaatggcaca atgtagactg gattcattat180

- 172 038595 gagtacccca cgcataaaat gtgcgaatta ggcaactatc accaaaccac accacggcac240 gacatatgtt ttgactgcaa cgacacctcc ctaactatct acaacttaac cacaaaaaac300 gctggaaaat ataccaggcg tcaccgtgat aacggtcaag aagaaaatta ctacgtaacg360 gtgttaattg gagacacaac gttattcact cttggcacat gccctgtaag atataaagaa420 tctacgaaca ctgaaaacac cattggaagt agcatcatag aaaccattga gaaagctaac480 attcccctgg gaattcatgc tgtatgggca ggcgtagtgg tatcagtggc gcttatagcg540 ttgtacatgg gtagccatcg cattcccaaa aagccgcatt acaccaaact tcccaaatat600 gatccagatg aattttggac taaggcttaa

630 <210> 34 <211> 95 < 212> белок < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка <400> 34

Met Leu Ala Leu Gly Ala Phe Asp 1 5

Gpl3 LUZ19 дикого типа

Leu Ser Gly Leu Met Vai Gly Ser

15

Cys Leu Vai Vai Gly Gly Glu Leu

Lys Ala Leu Cys Vai Asp Asp Arg 25 30

His Ser Arg Gln Gly lie Gly Ala

40

Glu Leu Vai Arg Ala Ala Glu Leu 45

Ala Gly Ala Glu Tyr Leu Thr Cys

55

Phe Glu Phe Leu Glu Pro Phe Tyr 60

Ala Asp Leu Gly Trp Ser Thr Thr 65 70

His Arg Glu Ala Asn Trp Thr Ala

80

Gly Glu Pro Asp Vai Leu His Met 85

Arg Ala Pro Gly His Asp Vai

95

- 173 038595 <210> 35 <211> 251 < 212> белок <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка Gp38 LUZ19 дикого типа <400> 35

Met Ala Arg Phe Lys Asn Pro Glu 1 5

Thr lie His Vai Ala Asp Gly Vai

15

Glu Ala Vai Phe Ser Leu Asp Phe

Pro Phe Leu Arg Arg Glu Asp Vai 25 30

Phe Vai Gin Vai Asp Lys lie Leu

40

Vai Thr Asp Tyr Thr Trp Vai Asp 45

Asp Thr Asn lie Gin Leu Ala Vai

55

Vai Pro Lys Lys Asp Gin Glu Vai

Arg lie Phe Arg Asp Thr Pro Ala 65 70

Gin Vai Pro Asp Thr Gin Phe Ser

80

Gin Asp lie Pro Phe Leu Pro Arg 85

Tyr lie Asp Ala Asn Asn Lys Gin

95

Leu Leu Tyr Ala Vai Gin Glu Gly

100 lie Asn Thr Ala Asn Leu Ala Leu

105 110

Asp Gly Vai Leu Asp Ala lie Arg

115 120 lie Ala Glu Glu Ala Arg Arg Leu

125

Ala Gin Glu Ala Leu Asp Ala Ala

130 135

Asn Glu Ala Leu Arg Arg Ala Leu

140

Gly Phe Ala Glu lie Arg Thr Vai

145 150

Thr Glu Asp Ser Asp lie Asp Pro

155 160

- 174 038595

Ser Trp Arg Gly Tyr Trp Asn Arg

165

Cys lie Thr Ala Asp Lys Pro Leu

170 175

Thr Leu Thr Met Gln Met Glu Asp

180

Pro Asp Ala Pro Trp Val Glu Phe

185 190

Ser Glu Val His Phe Glu Gln Ala

195 200

Gly Val Arg Asp Leu Asn lie Val

205

Ala Gly Pro Gly Val Thr lie Asn

210 215

Arg Leu Gln Asn Thr Thr Met Gln

220

Leu Tyr Gly Glu Asn Gly Val Cys

225 230

Thr Leu Lys Arg Leu Gly Ala Asn

235 240

His Trp lie Val Phe Gly Ala Met

245

Glu Asp Glu

250 <210> 36 <211> 301 <212> белок <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> послеовательность белка <400> 36

Met Phe Lys Thr Glu Val Lys Gly 1 5

Gp40 LUZ19 дикого типа

Arg Tyr Thr Leu lie Arg Arg Lys

15

Ala Asp Gly Thr Pro Val Glu Thr 20

Leu Glu Phe Asp Asn lie lie Thr 25 30

Asn Ala Gly Leu Asp Trp lie Ala

40

Ala Met Asp Thr Asp Leu Met Gly

Glu Pro Val Ala Val Ser Thr Ser

55

Thr Ala Asp Pro Asn Pro Ser Ala 60

- 175 038595

Pro 65

Ala lie

Pro

Glu

Val 70

Val

Gln

Arg

Thr

Ser 75

Ala

Ser

Ala

Pro

Gly 80

Gly

Gly

Thr

Thr

Ser 85

Gly

Leu

Asp

Gly

Glu 90

Trp

Leu

Phe

Trp

Arg 95

Arg

Arg

Trp

Arg

Phe

100

Pro

Gln

Gly

Thr

Leu

105

Ala

Gly

Gln

Val

Leu

110

Ala

Thr

Val

Gly

Leu

115 lie

Cys

Asn

Ser

Asp 120

Arg

Arg

Phe

Glu

Ser

125

Asn

Thr

Gly

Glu

Leu

130 lie

Pro

Lys

Asp

Thr

135

Pro

Leu

Ser

Tyr

Thr

140

Arg lie

Lys

Asp

Ala

145

Ala

Gly

Gln

Pro

Thr

150

Thr

Leu

Val

Val

Ala

155

Ala

Asp

Glu lie

Leu

160

Asp

Val

Gln

Tyr

Glu

165

Phe

Arg

Ser

Arg

Pro

170

Val

Gly

Thr

Ala

Glu

175

Ala

Lys

Phe

Val lie

180

Ser

Gly

Val

Glu

Arg 185

Thr

Phe

Arg

Leu lie

190

Pro

Lys

Pro

Phe

Ala

195

Asn

Arg

Ala

Asn

Leu

200

Ser

Gly

Glu

Arg

Tyr 205 lie

Phe

Tyr

Asn

Thr

210

Asn

Pro

Tyr lie

Asn

215

Gly

Lys

Asp

Ala

Ser

220

Gly

Gly

Asn

Val

Arg 225

Asp

Gly

Gln

Trp

Gln

230

Lys

Lys

Tyr

Pro

Lys 235

Tyr

Val

Arg

Gly

Ser

240

Tyr

Lys

Ala

Gln lie

245

Thr

Leu

Leu

Ala

Gln

250

Val

Gln

Asn

Gly

Asn

255

Met

Ala

Gly

Gly lie

260

Thr

Gly

Thr

Glu

Glu

265

Leu

Gln lie

Tyr

Asn

270

Gly

Arg

- 176 038595

Asn Tyr Vai Leu Asp lie Asn Pro Pro Vai Vai Lys Asn Asn Thr Gin

275 280 285

Glu Phe Thr Vai Thr Leu Glu Phe Thr Vai Ala Arg Ala

290 295 300 <210> 37 <211> 498 < 212> белок < 213> Pseudomonas aeruginosa <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка PyoS5 < 400> 37

Met Ser Asn Asp Asn Glu Vai Pro Gly Ser Met Vai lie Vai Ala Gin 15 1015

Gly Pro Asp Asp Gin Tyr Ala Tyr Glu Vai Pro Pro lie Asp Ser Ala 20 2530

Ala Vai Ala Gly Asn Met Phe Gly Asp Leu lie Gin Arg Glu lie Tyr 35 4045

Leu Gin Lys Asn lie Tyr Tyr Pro Vai Arg Ser lie Phe Glu Gin Gly

5560

Thr Lys Glu Lys Lys Glu lie Asn Lys Lys Vai Ser Asp Gin Vai Asp 65 70 7580

Gly Leu Leu Lys Gin lie Thr Gin Gly Lys Arg Glu Ala Thr Arg Gin 85 9095

Glu Arg Vai Asp Vai Met Ser Ala Vai Leu His Lys Met Glu Ser Asp

100 105110

Leu Glu Gly Tyr Lys Lys Thr Phe Thr Lys Gly Pro Phe lie Asp Tyr

115 120125

- 177 038595

Glu Lys Gin Ser Ser Leu Ser lie Tyr Glu Ala Trp Vai Lys lie Trp

130 135140

Glu Lys Asn Ser Trp Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Pro Phe Gin Gin Leu

145 150 155160

Vai Arg Asp Glu Leu Glu Arg Ala Vai Ala Tyr Tyr Lys Gin Asp Ser

165 170175

Leu Ser Glu Ala Vai Lys Vai Leu Arg Gin Glu Leu Asn Lys Gin Lys

180 185190

Ala Leu Lys Glu Lys Glu Asp Leu Ser Gin Leu Glu Arg Asp Tyr Arg

195 200205

Thr Arg Lys Ala Asn Leu Glu Met Lys Vai Gin Ser Glu Leu Asp Gin

210 215220

Ala Gly Ser Ala Leu Pro Pro Leu Vai Ser Pro Thr Pro Glu Gin Trp

225 230 235240

Leu Glu Arg Ala Thr Arg Leu Vai Thr Gin Ala lie Ala Asp Lys Lys

245 250255

Gin Leu Gin Thr Thr Asn Asn Thr Leu lie Lys Asn Ser Pro Thr Pro

260 265270

Leu Glu Lys Gin Lys Ala lie Tyr Asn Gly Glu Leu Leu Vai Asp Glu

275 280285 lie Ala Ser Leu Gin Ala Arg Leu Vai Lys Leu Asn Ala Glu Thr Thr

290 295300

Arg Arg Arg Thr Glu Ala Glu Arg Lys Ala Ala Glu Glu Gin Ala Leu

305 310 315320

Gin Asp Ala lie Lys Phe Thr Ala Asp Phe Tyr Lys Glu Vai Thr Glu

325 330335

- 178 038595

Lys Phe Gly Ala Arg Thr Ser Glu Met Ala Arg Gin Leu Ala Glu Gly

340 345350

Ala Arg Gly Lys Asn lie Arg Ser Ser Ala Glu Ala lie Lys Ser Phe

355 360365

Glu Lys His Lys Asp Ala Leu Asn Lys Lys Leu Ser Leu Lys Asp Arg

370 375380

Gin Ala lie Ala Lys Ala Phe Asp Ser Leu Asp Lys Gin Met Met Ala

385 390 395400

Lys Ser Leu Glu Lys Phe Ser Lys Gly Phe Gly Vai Vai Gly Lys Ala

405 410415 lie Asp Ala Ala Ser Leu Tyr Gin Glu Phe Lys lie Ser Thr Glu Thr

420 425430

Gly Asp Trp Lys Pro Phe Phe Vai Lys lie Glu Thr Leu Ala Ala Gly

435 440445

Ala Ala Ala Ser Trp Leu Vai Gly lie Ala Phe Ala Thr Ala Thr Ala

450 455460

Thr Pro lie Gly lie Leu Gly Phe Ala Leu Vai Met Ala Vai Thr Gly

465 470 475480

Ala Met lie Asp Glu Asp Leu Leu Glu Lys Ala Asn Asn Leu Vai lie

485 490495

Ser lie <210> 38 <211> 114 <212> белок <213> Phikmvlikevirus LKD16

- 179 038595 <220>

<221> misc_feature

<223>	последовательность белка	Gpl8 LKD16
<400> Met Arg	38 Val Pro Thr Glu His Glu	Arg Thr Leu Arg Cys Leu Leu Gln
1 Asp He	5 His Gly Pro Leu Asn Leu	10 15 Leu Phe Pro Gly lie Arg Val Lys
Val Glu	20 Glu Ala Cys Leu Gly Tyr	25 30 Leu Gly Tyr Arg Glu Arg Gly Tyr
Trp Glu	35 40 Leu Arg Leu Gln Val Asp	45 Tyr Asp His Pro Lys Leu Gly His
50 Leu Arg	55 Tyr Ser Gln Ala Val Pro	60 Glu Tyr Val Leu lie Asn Asp Arg
65 Asp Ser	70 lie lie Lys Tyr Leu Met	75 80 Glu Ala Val Pro Arg Gln Val Leu
Glu Gly	85 Met Leu Asn Lys Ala Gln	90 95 Glu Phe Val Thr Lys Asn Trp Tyr
Ser Leu <210> <211> <212> <213> <220> <221> <223> <400> Met Ala	100 39 769 белок Phikmvlikevirus LKA1 misc_feature последовательность белка 39 Gln Thr Pro Ser Thr Trp	105 110 Gp49 LKA1 Ala Asp Tyr Val Gly Asp Gly Val
1	5	10 15

- 180 038595

Glu Asp Thr Phe Gin Vai Thr Phe Pro Tyr Gin Lys Gin Gin Glu Vai 20 2530

Phe Vai Thr Vai Gly Gly Asp Pro Ala Ala Phe Thr Phe He Ser Ala 35 4045

Gly Trp lie Gin Leu Ala Ala Vai Pro Vai Asn Gly Ala Ala lie Arg

5560

Vai Arg Arg Ser Thr Glu Ala Phe Glu Pro Arg His Glu Phe Ala Asn 65 70 7580

Gly Vai Pro Leu Leu Pro Arg Phe lie Asp Glu Asn Asn Thr Gin Phe 85 9095

Leu Tyr Thr Vai Gin Glu Ala Vai Asn Glu Thr His Gly lie Ala Ser

100 105110

Glu Ala Leu Ser Vai Ala Glu Glu Ala Arg Gly lie Ala Gin Ala Ala

115 120125

Ser Asp Lys Vai Asp Ala Ala Thr lie Asp Ser Ala His Gin Leu Arg

130 135140

Leu Asp Leu Ala Asp Pro Ala Lys Gly Pro Gly Leu Leu Gly Tyr Asp

145 150 155160

Arg Asp Vai Ser Tyr Pro Vai Gly Ser Vai Gly Gin Ser Leu Gin Phe

165 170175

Leu Glu Met Gly Arg Vai Thr Pro Ala Gin Phe Gly Ala Vai Gly Asp

180 185190

Gly Ala Ser His Pro Leu Ser Glu Arg Tyr Ala Thr Leu Ala Glu Ala

195 200205

Gin Thr Vai Tyr Pro His Ala Vai Ala Leu Ser Asp Glu lie Asp Trp

210 215220

- 181 038595

Ala Ala Leu Gin Ala Ala Vai Asp Ser Gly Ala Pro Vai His lie Pro

225 230 235240

Ser Gly Asp Tyr Gin lie Asn Arg Gly lie Ser Ser Thr Gly Ser Leu

245 250255

Gin lie Ala Gly Asp Gly Ala Thr Ser lie lie Arg Pro Thr Ala Ala

260 265270

Phe Thr Gly Thr Ser Vai Leu Ser Cys Vai Gly Ser Leu Vai Ala Leu

275 280285

Pro Asn lie Ser Ser Vai Ser Ala Gly Ser Leu Thr lie Asp Phe Ala

290 295300

Ser Thr Pro Asn Leu Vai Ala Gly Asp Vai Phe lie lie Tyr Asn Pro

305 310 315320

Thr Asp Ser Ser Phe Ser Gly Phe Arg Thr Ser Tyr Arg Ala Gly Glu

325 330335

Phe Cys Glu Vai Arg Ala Vai Ser Gly Asn Thr Vai Thr lie Arg Ser

340 345350

Ala Leu Tyr Ala Ala Tyr Asp Gly Ala Thr Vai Ala lie Tyr Lys Vai

355 360365

Vai Ser Gly Vai Vai Asp lie Ala Ser lie Gin lie Vai Gly Gly Thr

370 375380

Vai Pro Met Asn Gly Leu Leu Vai Glu Ala Vai Vai Ser Pro Arg Vai

385 390 395400

Asp Asp Vai Thr Vai Thr Leu Ala Asn Asn Ala Gly Vai Tyr Phe Ala

405 410415

Arg Cys Tyr Asp Ala Lys lie Thr Asn Ser Asn lie Ser Asn lie Gly

420 425430

- 182 038595

Asp Gly Gly Asp Asp Tyr Gly lie lie Phe Gly Asn Cys His Asp Gly

435 440445

Gly Ala Asp Asn Cys Lys Vai Tyr Ala Arg Arg His Ala lie Ala Thr

450 455460

Gly Gly Asp Ala Glu Vai Gly Cys Vai Pro Vai Arg Asn Vai Arg Met 465 470 475480

Arg Asn Cys Thr Leu Arg Asn Asp lie Thr Ser Gly Thr His Cys Ala

485 490495

Asp Phe His Gly Asn Ala Glu Asp Cys Ser Tyr Glu Asn Cys Thr lie

500 505510

Tyr Gly Gly Ala Thr Trp Gin Gly Lys Asp lie Ser Tyr Arg His Cys

515 520525

Thr lie Thr Asn Ala Ser Gly Gly Trp lie Vai lie Ser Ala Glu lie

530 535540

Leu Gly Gly Thr Phe Leu Leu Asp Gin Cys Thr Leu Tyr Thr Thr Gly

545 550 555560

Asp Pro Gin Pro Gly Asn Arg Gly Vai lie Asp Vai Gly Gly Asn Ser

565 570575

Ala Vai Leu Thr Thr Asn Thr Thr Gin Pro Cys Asn Phe Leu lie Gin

580 585590

Gly Gly Ser Leu Arg Ala Pro Ser Leu Ser Thr Ser Ser Tyr Leu Leu

595 600605

Arg Ala Arg Leu Glu Gly Ser Thr Vai Pro Vai Asn lie Gin Tyr Ser

610 615620

Gly Gin Ala lie Asp Vai Gly Ser Leu Gly Lys Vai Leu Gin Leu Asp

625 630 635640

- 183 038595 lie Thr Ser Gly Ser Thr Ser Pro Glu Tyr Leu lie Val Glu Asn Leu

645 650655

Ala Gly Leu Pro Ser Gly lie Thr Leu Ala Ser Ala Ala Gly Gly Phe

660 665670

Ala Ser Ala Pro Met Arg Met Pro Val Leu Gly Gly Arg Val Gln Val

675 680685

Thr Thr Ala Thr Asn Ala Ser Ser Val Thr Ala Pro Val Thr Phe Arg

690 695700

Tyr lie Tyr Pro Lys Ala Pro Thr Val Gln Val Thr Lys Thr Asp Arg

705 710 715720

Ser Tyr Ala Gly Asn Arg Val Gly Val Ala lie Ala Asn Pro Thr Ser

725 730735

Ala Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Phe Thr Asp Asp Gly Thr Asn Phe

740 745750

Ser Ser Ala Val Thr Asn Gln Leu Asn Trp Gln Ala Gly lie Tyr Glu

755 760765

Val <210> 40 < 211> 651 < 212> белок <213> Phikmvlikevirus NTUH-K2044-K1-1 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка Gp34 NTUH-K2044-K1-1 <400> 40

Met Ala Leu lie Arg Leu Val Ala Pro Glu Arg Val Phe Ser Asp Leu 15 10 15

- 184 038595

Ala Ser Met Vai Ala Tyr Pro Asn Phe Gin Vai Gin Asp Lys lie Thr 20 2530

Leu Leu Gly Ser Ala Gly Gly Asp Phe Thr Phe Thr Thr Thr Ala Ser 35 4045

Vai Vai Asp Asn Gly Thr Vai Phe Ala Vai Pro Gly Gly Tyr Leu Leu

5560

Arg Lys Phe Vai Gly Pro Ala Tyr Ser Ser Trp Phe Ser Asn Trp Thr 65 70 7580

Gly lie Vai Thr Phe Met Ser Ala Pro Asn Arg His Leu Vai Vai Asp 85 9095

Thr Vai Leu Gin Ala Thr Ser Vai Leu Asn lie Lys Ser Asn Ser Thr

100 105110

Leu Glu Phe Thr Asp Thr Gly Arg lie Leu Pro Asp Ala Ala Vai Ala

115 120125

Arg Gin Vai Leu Asn lie Thr Gly Ser Ala Pro Ser Vai Phe Vai Pro

130 135140

Leu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ser Lys Vai lie Thr Vai Ala Ala

145 150 155160

Gly Ala Leu Ser Ala Vai Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Leu Arg Ser Asn

165 170175

Lys Leu Cys Asp Gly Gly Pro Asn Thr Tyr Gly Vai Lys lie Ser Gin

180 185190 lie Arg Lys Vai Vai Gly Vai Ser Thr Ser Gly Gly Vai Thr Ser lie

195 200205

Arg Leu Asp Lys Ala Leu His Tyr Asn Tyr Tyr Leu Ser Asp Ala Ala

210 215220

- 185 038595

Glu

225

Val

Gly lie

Pro

Thr

230

Met

Val

Glu

Asn

Val

235

Thr

Leu

Val

Ser

Pro

240

Tyr lie

Asn

Glu

Phe

245

Gly

Tyr

Asp

Asp

Leu

250

Asn

Arg

Phe

Phe

Thr

255

Ser

Gly lie

Ser

Ala

260

Asn

Phe

Ala

Ala

Asp 265

Leu

His lie

Gln

Asp

270

Gly

Val lie lie

Gly 275

Asn

Lys

Arg

Pro

Gly

280

Ala

Ser

Asp lie

Glu

285

Gly

Arg

Ser

Ala lie

290

Lys

Phe

Asn

Asn

Cys

295

Val

Asp

Ser

Thr

Val

300

Lys

Gly

Thr

Cys

Phe

305

Tyr

Asn lie

Gly

T rp 310

Tyr

Gly

Val

Glu

Val

315

Leu

Gly

Cys

Ser

Glu

320

Asp

Thr

Glu

Val

His

325

Asp lie

His

Ala

Met

330

Asp

Val

Arg

His

Ala

335 lie

Ser

Leu

Asn

Trp

340

Gln

Ser

Thr

Ala

Asp 345

Gly

Asp

Lys

Trp

Gly 350

Glu

Pro lie

Glu

Phe

355

Leu

Gly

Val

Asn

Cys

360

Glu

Ala

Tyr

Ser

Thr

365

Thr

Gln

Ala

Gly

Phe

370

Asp

Thr

His

Asp lie

375

Gly

Lys

Arg

Val

Lys 380

Phe

Val

Arg

Cys

Val

385

Ser

Tyr

Asp

Ser

Ala

390

Asp

Asp

Gly

Phe

Gln

395

Ala

Arg

Thr

Asn

Gly 400

Val

Glu

Tyr

Leu

Asn

405

Cys

Arg

Ala

Tyr

Arg 410

Ala

Ala

Met

Asp

Gly 415

Phe

Ala

Ser

Asn

Thr

420

Gly

Val

Ala

Phe

Pro

425 lie

Tyr

Arg

Glu

Cys 430

Leu

Ala

- 186 038595

Tyr Asp Asn Vai Arg Ser Gly Phe Asn Cys Ser Tyr Gly Gly Gly Tyr

435 440445

Vai Tyr Asp Cys Glu Ala His Gly Ser Gln Asn Gly Vai Arg lie Asn

450 455460

Gly Gly Arg Vai Lys Gly Gly Arg Tyr Thr Arg Asn Ser Ser Ser His

465 470 475480 lie Phe Vai Thr Lys Asp Vai Ala Glu Thr Ala Gln Thr Ser Leu Glu

485 490495 lie Asp Gly Vai Ser Met Arg Tyr Asp Gly Thr Gly Arg Ala Vai Tyr

500 505510

Phe His Gly Thr Vai Gly lie Asp Pro Thr Leu Vai Ser Met Ser Asn

515 520525

Asn Asp Met Thr Gly His Gly Leu Phe Trp Ala Leu Leu Ser Gly Tyr

530 535540

Thr Vai Gln Pro Thr Pro Pro Arg Met Ser Arg Asn Leu Leu Asp Asp

545 550 555560

Thr Gly lie Arg Gly Vai Ala Thr Leu Vai Ala Gly Glu Ala Thr Vai

565 570575

Asn Ala Arg Vai Arg Gly Asn Phe Gly Ser Vai Ala Asn Ser Phe Lys

580 585590

Trp Vai Ser Glu Vai Lys Leu Thr Arg Leu Thr Phe Pro Ser Ser Ala

595 600605

Gly Ala Leu Thr Vai Thr Ser Vai Ala Gln Asn Gln Asp Vai Pro Thr

610 615620

Pro Asn Pro Asp Leu Asn Ser Phe Vai lie Arg Ser Ser Asn Ala Ala

625 630 635640

- 187 038595

Asp Vai Ser Gin Vai Ala Trp Glu

645

Vai Tyr Leu

650 <210> 41 <211> 727 < 212> белок < 213> Т7-подобный Ppl5 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка < 400> 41

Met Ala Arg Thr lie Vai Gin Asn 1 5

Gp44 Ppl5

Ala Leu Thr Gly Gly Gin Gin Asp

15

Phe Glu Vai Pro Phe Asp Tyr lie

Leu Gin Arg Phe Vai Lys Leu Thr 25 30

Leu lie Gly Asp Gly Asn Arg Gin

40

Glu Leu Vai Leu Gly Thr Asp Phe 45

Arg Phe lie Gly Pro Arg Thr Vai

55

Arg Thr Asn Vai Phe Trp Gly Pro 60

Ala Gin Gly Tyr Thr Ser lie Glu 65 70 lie Arg Arg Vai Thr Ser Ala Ser

80

Asp Arg Arg Vai Glu Phe Ser Asp 85

Gly Ser lie Leu Thr Ala Gly Asp

95

Leu Asn lie Ala Gin Leu Gin Ala

100 lie His lie Ala Glu Glu Ala Arg

105 110

Asp Ser Ala Thr Glu Asn Leu Ser

115 120

Pro Asp Ala Asp Gly Asn Tyr Asp

125

Ala Arg Gly Ala Arg lie Tyr Asn

130 135

Leu Gly Asp Ala Vai Gin Pro Lys

140

- 188 038595

Asp 145

Ala

Val

Asn

Arg

Tyr 150

Thr

Leu

Asp

Leu

Ala

155

He

Ala

Ala

Ala

Leu

160

Ala

Met

Asn

Thr

Gly 165

Asn

Pro

Asn

Asn

Ala

170

Gln

Asn

He

Ser

Tyr 175

Thr

Pro

Asn

Gly

Pro

180

Gly

Gln

Ser

He

Arg 185

Ser

Val

Glu

Gly

Arg 190

Leu

Arg

Asp

Ala

Val

195

Phe

Val

Ser

Asp

Tyr 200

Met

Thr

Thr

Pro

Arg 205

Asp

Gly

Val

Thr

Ser

210

Asn

Gln

Gln

Asp

Leu

215

Glu

Lys

Ala

Leu

Ala

220

Ala

Ala

Asn

Ala

Lys 225

Gly

Ala

Asp

Leu

Phe

230

Trp

Pro

Asp

Asp

He

235

Pro

Phe

Phe

Ser

Thr

240

Ser

Pro

Leu

Ala

Leu

245

He

His

Ala

Val

Tyr

250

His

Val

Gly

Arg

Gly 255

Val

He

Asn

Ala

Asn

260

Gly

Thr

Leu

Phe

Tyr 265

Val

Asn

Pro

Lys

Asn

270

Gly

Gln

His

Asn

Arg 275

Leu

His

Val

Ser

Pro

280

Gly

Gly

Thr

Gly

Asp 285

Gly

Leu

Ala

Ala

Gly

290

Arg

Pro

Leu

Gly

Thr

295

He

Trp

Ser

Ala

Leu

300

Ala

Ala

Leu

Asn

Met

305

Arg

Ala

Pro

Leu

Thr

310

Thr

Arg

Trp

Ser

Leu

315

Glu

Met

Thr

Ala

Gly

320

Ala

Tyr

Asn

Glu

Ala

325

Val

Thr

Leu

Pro

Asn

330

Tyr

Leu

Thr

Ser

Cys 335

Asn

Asp

Tyr

Leu

Ala

340

Phe

Asn

Trp

Pro

Asn

345

Thr

Gly

Gln

Glu

Arg 350

Met

Glu

- 189 038595

Pro Thr Ala Tyr Pro Ser Ala Leu Asp Gly Thr Gly Gin Thr Gly Leu

355 360365

Thr Gly Phe His Thr Gly He Gly Asn Arg lie Thr lie Asn Asn Vai

370 375380

Cys Met Ser Asn Trp Tyr Asp Thr Ala Leu Thr Pro Thr Gin Gin Vai

385 390 395400

Arg Arg Ala Phe Vai Vai Gly Ala Tyr Ser Thr Ala Tyr Vai Vai Asn

405 410415

Cys Ala Phe lie Tyr Asn Gly lie Ala Ser Vai Ser Vai Leu Pro Gly

420 425430

Gly Thr Ala lie Vai Thr Gly Gly lie Vai Asp Gly Gly Arg Phe Gly

435 440445

Leu Asp Asn Thr Gly Gly Arg Leu Ser Leu Thr Ala Thr Lys Ser Asn

450 455460

Tyr Thr Gin Vai Arg Asn Cys Leu Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Lys His

465 470 475480

Asp Ala Ser Thr Vai Met Asp Asn Thr Glu Phe Arg Asn Cys Gly Asn

485 490495

His Pro Ala Ala Vai Ala Tyr Gly Ala Ala lie Phe Ala Tyr Lys Phe

500 505510

Asn Cys Ser Vai Asp Thr Arg Gly Vai Lys Phe Tyr Gly Asn Asn lie

515 520525

Ala Gin His Cys Arg Gly Gly lie Thr Ser Asp Asn Pro Gly Asp Pro

530 535540

Asp lie Tyr Gly Thr Gly Ala Asp Ala Asn Lys Arg Leu Phe Leu Cys

545 550 555560

- 190 038595

Thr Gly Gly Gly Ser Asp Asp lie Gin Phe Tyr Glu Ala Arg Arg Vai

565 570575

Met Asp lie Thr Lys Arg Thr Gly Gly Gly Ser Thr Thr Ala Ser Vai

580 585590

Ser Ser Leu Leu Leu Ala Ala Vai Ala Ser Vai Arg Lys Gly Tyr Phe

595 600605

Ala His Asn Asp Gin Vai lie Arg Met Thr Leu Met Phe Arg Ala Thr

610 615620

Gly Ser Ala Gly lie Phe Thr Pro Thr Leu Arg Thr Pro Leu Gly Thr

625 630 635640 lie Pro Leu Gly Ser Phe Arg Vai Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Glu lie

645 650655

Lys Leu Thr lie Arg Pro Thr Leu Thr Ser Asp Gly Leu lie Vai Gly

660 665670

Phe Ser Cys lie Asn Ala Vai Gin Asn Leu Gly Ser Ser Vai Gly Gin

675 680685 lie lie Vai Ser Gly Thr Vai Asp Leu Arg Thr Vai Asp Gin Leu Vai

690 695700

Glu Met Trp Gly Tyr Ser Glu Ala Gly Gly Thr Ala Ser Tyr lie Gin

705 710 715720

Gly Leu lie Glu Leu Vai Gly

725 <210> 42 <211> 362 < 212> белок < 213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans

- 191 038595 <220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка DspB <400> 42

Met Asn Cys Cys Vai Lys Gly Asn Ser lie Tyr Pro Gin Lys Thr Ser

1015

Thr Lys Gin Thr Gly Leu Met Leu Asp lie Ala Arg His Phe Tyr Ser 20 2530

Pro Glu Vai lie Lys Ser Phe lie Asp Thr lie Ser Leu Ser Gly Gly 35 4045

Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala lie Glu

5560

Ser His Leu Leu Asn Gin Arg Ala Glu Asn Ala Vai Gin Gly Lys Asp 65 70 7580

Gly lie Tyr lie Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser Tyr Arg 85 9095

Gin Leu Asp Asp lie Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly lie Glu Leu

100 105110 lie Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala lie Phe Lys Leu

115 120125

Vai Gin Lys Asp Arg Gly Vai Lys Tyr Leu Gin Gly Leu Lys Ser Arg

130 135140

Gin Vai Asp Asp Glu lie Asp lie Thr Asn Ala Asp Ser lie Thr Phe

145 150 155160

Met Gin Ser Leu Met Ser Glu Vai lie Asp lie Phe Gly Asp Thr Ser

165 170175

Gin His Phe His lie Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Vai Glu Ser

180 185190

- 192 038595

Asn His Glu Phe lie Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe Leu Glu

195 200205

Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu lie Lys Asn

210 215220

Thr Phe Glu Gin lie Asn Pro Asn lie Glu lie Thr Tyr Trp Ser Tyr

225 230 235240

Asp Gly Asp Thr Gin Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg Asp Met

245 250255

Arg Vai Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Vai Leu Asn

260 265270

Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr lie Vai Pro Lys Ala Ser Pro Thr Phe

275 280285

Ser Gin Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Vai lie Lys Asn Trp Asp

290 295300

Leu Gly Vai Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Vai Gin Asn Thr

305 310 315320

His Glu lie Ala Gly Ala Ala Leu Ser lie Trp Gly Glu Asp Ala Lys

325 330335

Ala Leu Lys Asp Glu Thr lie Gin Lys Asn Thr Lys Ser Leu Leu Glu

340 345350

Ala Vai lie His Lys Thr Asn Gly Asp Glu

355360 <210> 43 <211> 22 < 212> белок < 213> Staphylococcus aureus

- 193 038595 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка SaPSMa3 <400> 43

Met Glu Phe Vai Ala Lys Leu Phe Lys Phe Phe Lys Asp Leu Leu Gly 15 10 15

Lys Phe Leu Gly Asn Asn < 210> 44 < 211> 44 < 212> белок < 213> Staphylococcus aureus <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка SaPAMb2 < 400> 44

Met Thr Gly Leu Ala Glu Ala lie Ala Asn Thr Vai	Gin Ala	Ala 15	Gin
1	5	10
Gin His Asp Ser Vai Lys Leu Gly Thr Ser lie Vai 20 25 Asn Gly Vai Gly Leu Leu Gly Lys Leu Phe Gly Phe 35 40 <210> 45 <211> 22 <212> белок <213> Staphylococcus epidermidis	Asp lie 30	Vai	Ala

<220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка SePSMa <400> 45

Met Ala Asp Vai lie Ala Lys lie Vai Glu lie Vai Lys Gly Leu lie

10 15

- 194 038595

Asp Gln Phe Thr Gln Lys 20 <210> 46 <211> 75 < 212> белок < 213> Levivirus MS2 <220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка L MS2 <400> 46

Met Glu Thr Arg Phe Pro Gln Gln Ser Gln Gln Thr Pro Ala Ser Thr 15 1015

Asn Arg Arg Arg Pro Phe Lys His Glu Asp Tyr Pro Cys Arg Arg Gln 20 2530

Gln Arg Ser Ser Thr Leu Tyr Vai Leu lie Phe Leu Ala lie Phe Leu 35 4045

Ser Lys Phe Thr Asn Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Glu Ala Vai lie

5560

Arg Thr Vai Thr Thr Leu Gln Gln Leu Leu Thr 65 7075 <210> 47 <211> 54 < 212> белок <213> Levivirus PRR1 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность белка L PRR1 <400> 47

Met Cys Lys Vai Ser Thr Lys Vai Asp Ser Lys Leu Thr Glu Ser Vai 15 10 15

- 195 038595

Gly Gin Leu Thr lie Arg Ser Tyr Leu Trp Leu Arg Asn lie Leu Ala 20 25 30

Leu Ala Gly Leu Leu Phe Vai lie Leu Leu Ala Thr Asn His Leu Ser 35 40 45 lie Ala lie Tyr Ser Pro 50 <210> 48 < 211> 106 < 212> белок <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка Gpl8 LUZ19 <400> 48

Met Arg Met Pro Thr Glu Glu Glu 1 5

Arg Met lie Arg Cys Leu Leu Ala

15

Asp lie His Glu Pro Leu Asp Leu 20

Leu Phe Pro Gly Leu Arg Thr Lys 25 30

Ala His Met Asp Pro Gin Ala Glu

40

Glu Leu Ser lie Arg lie Asp Tyr 45

Asp His Ala Lys Leu Gly Arg Met

55

Gly Phe Cys His Ala Vai Ser Leu 60

Tyr Gin Leu Ser lie Tyr Gly Arg 65 70

Glu Gly Met Vai Arg Tyr Leu Met

80

Gin Glu lie Pro Arg Arg Vai Leu 85

Glu Gly Leu Leu Vai Lys Ala Gin

95

Gin Tyr Ser Gin Ser Asn Trp Tyr

100

Ser Lys 105

- 196 038595 <210> 49 < 211> 71 < 212> белок <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature <223> последовательность белка Gp49 LUZ19 <400> 49

Met Ser 1	Lys Ala	Lys 5	Leu	Arg Vai	lie Ala 10	Asp	Thr	Pro	Glu	Leu 15	Glu
Ser Vai	Leu Lys 20	Ala	Leu	Leu Thr	Ala Thr 25	Tyr	Ala	He	Glu 30	Asp	Leu
Leu Asn	Glu Ala 35	Vai	Ala	Ser Lys 40	Vai Leu	Asn	Ser	Arg 45	Leu	Gly	Trp
Ser Ala 50	Vai Gly	Glu	Tyr	Vai Glu 55	Leu Phe	Asn	Arg 60	Thr	Gin	Ser	Arg

Vai Ala Gly Leu lie Pro Glu 65 70 <210> 50 <211> 321 <212> ДНК <213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

<221> misc_feature <223> последовательность гена gpl8 LUZ19 <400> 50

atgagaatgc caaccgaaga	agaacgcatg	atccgctgtt	tactggcgga	tatccacgag	60
ccactggacc tgctgttccc	cggcctccgt	accaaggccc	atatggaccc	gcaagcagag	120
gaactgtcga ttcgaattga	ctacgaccat	gcgaagctgg	gccgtatggg	attctgccac	180
gcggtatccc tatatcaact	gtccatatat	ggccgcgagg	ggatggtccg	ctacctgatg	240

- 197 038595 caggagattc cccgccgcgt gctggaaggt ctgctggtca aggcgcagca gtacagccaa

300 agcaactggt acagcaaatg a

321 <210> 51 <211> 216 < 212> ДНК < 213> Phikmvlikevirus LUZ19 <220>

< 221> misc_feature < 223> последовательность гена Gp49 LUZ19 < 400> 51 atgagcaaag ccaaactacg agtcatcgcc gacaccccgg agctggagtc agtgctaaaa60 gcattgctga ccgccaccta cgctatcgag gacctgctca acgaggccgt ggctagcaag120 gtgctaaact cccgcctggg ctggtccgca gtcggcgagt atgtcgaact gttcaaccgc180 acgcaatccc gcgtggccgg gttgattccc gagtag216

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Сконструированный вирус, способный при введении в клетку-хозяина продуцировать не встречающиеся в природе вирусные частицы с одним или более улучшенными вирусными свойствами, содержащий:

   (i) весь или часть сконструированного гена gp34, где сконструированный ген gp34 кодирует аминокислотную последовательность, содержащую делецию в положении, соответствующем аминокислотному положению 55 в SEQ ID NO: 5 (белок gp34); и/или (ii) модификацию одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34 (белок gp13), SEQ ID NO: 35 (белок gp38), SEQ ID NO: 36 (белок gp40) и SEQ ID NO: 48 (белок gp18), где модификации включают замену С на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 17 в SEQ ID NO: 34 (белок gp13), замену D на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO: 48 (белок gp18), замену D на G в положении, соответствующем аминокислотному положению 82 в SEQ ID NO: 35 (белок gp38), замену I на S в положении, соответствующем аминокислотному положению 83 в SEQ ID NO: 35 (белок gp38), и замену N на D в положении, соответствующем аминокислотному положению 253 в SEQ ID NO: 36 (белок gp40); и/или (iii) вставку гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 49 (белок gp49), или замену последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 49 (gp49), молекулой гетерологичной нуклеиновой кислоты; и/или (iv) весь или часть гетерологичного гена gp18, где гетерологичный ген gp18 кодирует аминокислотную последовательность по меньшей мере с 85% идентичностью с SEQ ID NO: 38 (последовательность белка gp18).
2. 2. Сконструированный вирус по п.1, причем указанный вирус содержит сконструированный ген gp34, где сконструированный ген gp34 кодирует аминокислотную последовательность, содержащую делецию в положении, соответствующем аминокислотному положению 55 в SEQ ID NO: 5 (белок gp34), причем указанный фаг проявляет повышенную литическую активность по сравнению с LUZ19 дикого типа.
3. 3. Сконструированный вирус по любому из пп. 1 и 2, причем указанный вирус содержит модификацию одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34 (белок gp13), SEQ ID NO: 35 (белок gp38), SEQ ID NO: 36 (белок gp40) и SEQ ID NO: 48 (белок gp18), где модификации включают замену С на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 17 в SEQ ID NO: 34 (белок gp13), замену D на Y в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO: 48 (белок gp18), замену D на G в положе-

   - 198 038595 нии, соответствующем аминокислотному положению 82 в SEQ ID NO: 35 (белок gp38), замену I на S в положении, соответствующем аминокислотному положению 83 в SEQ ID NO: 35 (белок gp38), и замену

   N на D на положении, соответствующем аминокислотному положению 253 в SEQ ID NO: 36 (белок gp40), в результате чего указанный вирус демонстрирует улучшенный диапазон хозяев по сравнению с

   LUZ19 дикого типа.
4. 4. Сконструированный вирус по любому из пп.1-3, причем указанный вирус содержит замену последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность с SEQ ID NO: 49 (gp49), гетерологичной нуклеиновой кислотой.
5. 5. Сконструированный вирус по п.4, в котором указанная гетерологичная нуклеиновая кислота содержит ген, который кодирует агент, диспергирующий биопленку.
6. 6. Сконструированный вирус по п.5, в котором указанная гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует экзополисахаридную (EPS) деполимеразу или фенолрастворимый модулин (PSM).
7. 7. Сконструированный вирус по п.5, в котором указанная гетерологичная нуклеиновая кислота содержит ген, выбранный из группы, состоящей из деполимеразы EPS (Ppl5gp44 хвостовой шип gp44 из Pseudomonas pudita Ф15 (SEQ ID NO: 14)), NTn34 хвостовой шип gp34 из фага Klebsiella pneumoniae NTU (SEQ ID NO: 13), LKAlgp49 хвостовой шип gp49 из фага P.aeruginosa (SEQ ID NO: 12), поверхностно-активные фенол-растворимые модулины из Staphylococcus epidermidis (PSMa, SEQ ID NO: 18), Staphylococcus aureus (PSMa3 (SEQ ID NO: 16) и/или PSMb2 (SEQ ID NO: 17) и сурфактин DspB из Aggregatibacteractinomycetemcomitans (SEQ ID NO: 15).
8. 8. Сконструированный вирус по любому из пп.5-7, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с основным капсидным промотором P_gP32 (SEQ ID NO: 21).
9. 9. Сконструированный вирус по любому из пп.5-8, в котором гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с терминатором T_gp32 (SEQ ID NO: 22).
10. 10. Сконструированный вирус по любому из пи. 1-9, причем сконструированный вирус представляет собой бактериофаг, сконструированный для экспрессии противомикробного пептида.
11. 11. Сконструированный вирус по п. 10, в котором противомикробный пептид выбран из группы, состоящей из литического фермента, ацилазы, аминопептидазы, амилазы, карбогидразы, карбоксипептидазы, каталазы, целлюлазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстрин гликозилтрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, липазы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитического фермента, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглутаминазы, ксиланазы, РНКазы, ДНКазы, лизостафина или порообразующего пептида.
12. 12. Сконструированный вирус по п. 10, где противомикробный пептид представляет собой ДНКазу.
13. 13. Сконструированный вирус по любому из пп.1-12, в котором указанный модифицированный геном представляет собой модифицированный phiKMV-подобный геном.
14. 14. Сконструированный вирус по любому из пп.1-13, в котором указанный модифицированный геном представляет собой модифицированный геном LUZ19.
15. 15. Сконструированный вирус по п. 14, в котором gpl8 LUZ19 дикого типа заменен на gpl8 вируса LKD16 (SEQIDNO: 7).

    А) Очистка вирусного генома непосредственно из вирусных частиц

    Б) Сайт-специфическое расщепление очищенного вирусного генома (ДНК или РНК) с очищенной РНК-управляемой нуклеазой и нацеливающей РНК(ами) __________

    В) Деактивация РНК-управляемой нуклеазы и необязательная очистка расщепленных продуктов с использованием фенольно-хпороформной экстракции

    Г) Создание вставленного фрагмента посредством прямого синтеза ДНК/РНК, сборки множества олигонуклеотидов, выделения рекомбинанатной ДНК (такой как плазмиды), или ПЦР-амплификации из матрицы

    Д) Сборка in vitro геномных фрагментов с использованием методик in vitro, таких как, но без ограничений, сборка Гибсона, SLIC, лигирование и др.

    Е) Трансформация рекомбинантного генома непосредственно в клетки хозяина для образования функциональных вирусных , частиц _s