JP2007111015A - 宿主dnaの欠失対象領域の欠失方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の5'側領域、3'側領域及び宿主DNAの有する第1相同組換え領域を有し、更に第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する供与体DNAと、宿主DNAとにおいて、前記5'側領域と前記第1相同組換え領域との間で相同組換え(第1相同組換え)を行い、上記第1相同組換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の欠失対象領域の外側の3'側領域と供与体DNA由来の宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域との間で相同組換え(第2相同組換え)を行うことで、上記第2相同組換え後には、宿主DNAから第1選択マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子及び欠失対象領域を欠失させる。
【選択図】 なし
Description
(1)供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組換えを行う工程を含む宿主DNAの欠失対象領域を欠失させる方法であって、上記欠失方法は、宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の5'側領域、3'側領域及び宿主DNAの有する第1相同組換え領域を有し、更に第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する供与体DNAと、宿主DNAとにおいて、前記5'側領域と前記第1相同組換え領域との間で相同組換え(第1相同組換え)を行う第1工程と、上記第1相同組換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の欠失対象領域の外側の3'側領域と供与体DNA由来の宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域との間で相同組換え(第2相同組換え)を行う第2工程とを含み、上記第1相同組換え領域は、(a)欠失対象領域の一部又は全部からなる領域、又は(b)前記3'側領域の5'末端を含む領域であり、上記第2工程後には、宿主DNAから第1選択マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子及び欠失対象領域が欠失されることを特徴とする、宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
本発明に係る宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法は、宿主DNAにおける欠失対象領域を欠失させるとともに、形質転換体の選択に用いた選択マーカー遺伝子を欠失させる方法である。本方法においては、先ず、宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の5'側領域、3'側領域及び宿主DNAの有する第1相同組換え領域を有し、更に第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する供与体DNAを作製する。供与体DNAにおける宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の5'側領域(以下、「5'外側領域」という)とは、宿主DNAにおける5'外側領域と相同組換えを生じうる程度に高い同一性を有する領域である。同様に、供与体DNAにおける宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域(以下、「3'外側領域」という)とは、宿主DNAにおける3'外側領域と相同組換えを生じうる程度に高い同一性を有する領域である。
1. カセットの作製(PNm及びCRC)
図2には、本実施例で用いるPNm(ParaA-neo)カセット及びCRC(cat-araR)カセットを示す。PNmカセットは、枯草菌168株由来のaraA遺伝子プロモーター(ParaA)(配列番号3)の下流にネオマイシン耐性遺伝子(neo)を連結したカセットである。一方、CRCカセットは、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)の下流にaraR遺伝子(塩基配列:配列番号1、アミノ酸配列:配列番号2)を連結したカセットである。なお、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)とaraR遺伝子との間には、araR遺伝子プロモーター(配列番号58)が存在する。
(1) PNmカセットの作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したParaf(配列番号30)及びPara/Nmr(配列番号31)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のaraA遺伝子のプロモーター領域0.2kb断片(A)をPCRにより増幅した。また、プラスミドpUB110(Plasmid 15, 93 (1986))を鋳型とし、表1に示したNmf(配列番号32)及びNmr(配列番号33)のプライマーセットを用いて、プロモーターを含まない0.85kbのネオマイシン耐性遺伝子(Nm)断片をPCRによって調製した。
プラスミドpC194(J. Bacteriol. 150 (2) 815 (1982))を鋳型とし、表1に示したcatf(配列番号34)及びcatr(配列番号35)のプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm)断片(0.9kb)をPCRによって調製した。また、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したaraRf/Cm(配列番号36)及びaraRr(配列番号37)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のプロモーター(配列番号58)を含むaraR遺伝子領域1.3kb断片(B)をPCRにより増幅した。
図3に示すように、マーカーフリー削除菌株構築の際のベース株であるAR3株を以下のように構築した。なお、図3において、B、D、L、M、N、P及びQの記号は、所定のL-アラビノース資化遺伝子(ara遺伝子)群である。また、Paraは、araA遺伝子プロモーターを意味する。
(1) AR31株の作製
以下に、図4に従って、AR31株の作製を説明する。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したiolfw(配列番号44)及びiol/csbCUr(配列番号45)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のiolR遺伝子を含む1.0kb断片(E)(5'外側領域)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型として、表1に示したiol/CRf(配列番号46)及びiolrv(配列番号47)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のiolS遺伝子を含む1.0kb断片(F)(第1相同組換え領域)をPCRにより増幅した。さらに、上記ゲノムDNAを鋳型として、表1に示したcsbC-Df(配列番号48)及びcsbC/Cmr(配列番号49)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のcsbC遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片(G)(3'外側領域)をPCRにより増幅した。
以上のようにAR31株を構築した。
以下に、図6に従って、AR32株の作製を説明する。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したhutMfw(配列番号52)及びhutM-Dr(配列番号53)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のhutM遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(I)(5'外側領域)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型として、表1に示したhutM/CRf(配列番号54)及びhutMrv(配列番号55)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のhutM遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片(J)(第1相同組換え領域)をPCRにより増幅した。
以上のようにAR32株を構築した。
(1) 3.8kb削除株(AR31d株)の選抜
以下に、図4に従って、AR31d株の選抜を説明する。
以下に、図6に従って、AR32d株の選抜を説明する。
上記3(2)(AR32株の作製)で得られたAR32株をLB培地に植菌し、37℃で4時間振とう培養した。その培養液をLB培地で適当に希釈し、ネオマイシンを含むLB寒天培地にまき、37℃で一晩培養した。培養後、生育したコロニーの寒天培地にまく時の生菌数に対する割合は1.18 x 10-4であった。次に、そのコロニー100個をクロラムフェニコールを含むLB寒天培地にレプリカしたところ、98個がクロラムフェニコール感受性であった。さらに、そのネオマイシン耐性でクロラムフェニコール感受性のコロニー6個からゲノムDNAを抽出し、hutMfw(配列番号52)とcsbC/Cmr(配列番号49)のプライマーセットを用いたPCRによってhutM遺伝子からcsbC遺伝子までの42kbの断片(欠失対象領域)が欠失したことを確認した。PCRの結果(電気泳動写真)を図9に示す。なお、図9において、各レーン1〜6は、上述した6個のコロニーの各PCR産物の結果を示す。また、Mレーンは、分子量マーカーを示す。
Claims (10)
- 供与体DNAと宿主DNAとの間で相同組換えを行う工程を含む宿主DNAの欠失対象領域を欠失させる方法であって、
上記欠失方法は、
宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の5'側領域、3'側領域及び宿主DNAの有する第1相同組換え領域を有し、更に第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する供与体DNAと、宿主DNAとにおいて、前記5’側領域と前記第1相同組換え領域との間で相同組換えを行う第1工程と、
上記相同組換え後の宿主DNAにおいて、宿主DNA由来の欠失対象領域の外側の3'側領域と供与体DNA由来の宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域との間で相同組換えを行う第2工程とを含み、
上記第1相同組換え領域は、
(a)欠失対象領域の一部又は全部からなる領域、又は
(b)前記3'側領域の5'末端を含む領域、
であり、
上記第2工程後には、宿主DNAから第1選択マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子及び欠失対象領域が欠失されることを特徴とする、宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。 - 上記宿主DNAにおいて、欠失対象領域、欠失対象領域の外側の5'側領域及び3'側領域以外の領域に、上記リプレッサーに制御されるオペレーターを含むプロモーターの下流に第2選択マーカー遺伝子が存在することを特徴とする、請求項1記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記第1工程後に、第1選択マーカー遺伝子を指標に、上記供与体DNA由来の宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域と第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、請求項1記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記第1工程後に、第1選択マーカー遺伝子及び/又は第2選択マーカー遺伝子を指標に、上記供与体DNA由来の宿主DNAの有する欠失対象領域の外側の3'側領域と第1選択マーカー遺伝子とリプレッサー遺伝子とを有する形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、請求項2記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記第2工程後に、第1選択マーカー遺伝子を指標に、第1選択マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子及び欠失対象領域を欠失した形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、請求項1又は3記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記第2工程後に、第1選択マーカー遺伝子及び/又は第2選択マーカー遺伝子を指標に、第1選択マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子及び欠失対象領域を欠失した形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、請求項2又は4記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記リプレッサー遺伝子がaraR遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の宿主DNAの欠失対象領域の欠失方法によって得られた形質転換体。
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