JP2000316576A - 枯草菌組換え体およびその作成法 - Google Patents
枯草菌組換え体およびその作成法Info
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- JP2000316576A JP2000316576A JP11125648A JP12564899A JP2000316576A JP 2000316576 A JP2000316576 A JP 2000316576A JP 11125648 A JP11125648 A JP 11125648A JP 12564899 A JP12564899 A JP 12564899A JP 2000316576 A JP2000316576 A JP 2000316576A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 所望の表現型を有する枯草菌組換え体の提
供。 【解決手段】 枯草菌のゲノムＤＮＡに挿入した1 以上
の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上のＤＮＡ断片で
同時または逐次に置換して得られる組換え体から、所望
の表現型を有する枯草菌組換え体を選択する。 【効果】 細菌または細胞の染色体の一部を微妙に変化
させて、多種の性質を有する遺伝子群が得られる。
供。 【解決手段】 枯草菌のゲノムＤＮＡに挿入した1 以上
の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上のＤＮＡ断片で
同時または逐次に置換して得られる組換え体から、所望
の表現型を有する枯草菌組換え体を選択する。 【効果】 細菌または細胞の染色体の一部を微妙に変化
させて、多種の性質を有する遺伝子群が得られる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、枯草菌組換え体お
よびその作成法ならびに該枯草菌組換え体を使用するゲ
ノムＤＮＡライブラリーの作成法およびトランスジェニ
ック動物または植物に関する。さらに詳しくは、枯草菌
の形質転換システムを利用して得られる枯草菌組換え体
およびその作成法ならびににゲノムＤＮＡライブラリー
の作成およびトランスジェニック動物または植物を作成
するための該枯草菌組換え体の使用に関する。本発明の
方法によれば、細菌または細胞の染色体の一部を微妙に
置換させて多種の性質を持った遺伝子群が得られる。具
体的には、本発明の方法により、環境浄化に優れた遺伝
子群やＤＮＡ再編成で生じる新たな免疫グロブリン遺伝
子群を枯草菌で創出することが可能になる。
よびその作成法ならびに該枯草菌組換え体を使用するゲ
ノムＤＮＡライブラリーの作成法およびトランスジェニ
ック動物または植物に関する。さらに詳しくは、枯草菌
の形質転換システムを利用して得られる枯草菌組換え体
およびその作成法ならびににゲノムＤＮＡライブラリー
の作成およびトランスジェニック動物または植物を作成
するための該枯草菌組換え体の使用に関する。本発明の
方法によれば、細菌または細胞の染色体の一部を微妙に
置換させて多種の性質を持った遺伝子群が得られる。具
体的には、本発明の方法により、環境浄化に優れた遺伝
子群やＤＮＡ再編成で生じる新たな免疫グロブリン遺伝
子群を枯草菌で創出することが可能になる。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の塩基配列の改変は、クローニン
グ技術、塩基配列決定技術、組換えＤＮＡ技術の展開に
よって可能となっている。部位特異的変異といわれる手
法によって目的とする塩基を置換、挿入、欠失させた
り、制限酵素を用いて行う遺伝子組換え法で特定領域の
入れ換えが可能になっている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆ Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅ
ｃｏｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）．）。しかしながら、大腸菌を
用いるクローニング手法には限界があり、一度に扱える
サイズのＤＮＡは、比較的小さなものに限定される。さ
らに多数の塩基配列を一度に変えることは困難である。
グ技術、塩基配列決定技術、組換えＤＮＡ技術の展開に
よって可能となっている。部位特異的変異といわれる手
法によって目的とする塩基を置換、挿入、欠失させた
り、制限酵素を用いて行う遺伝子組換え法で特定領域の
入れ換えが可能になっている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆ Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅ
ｃｏｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）．）。しかしながら、大腸菌を
用いるクローニング手法には限界があり、一度に扱える
サイズのＤＮＡは、比較的小さなものに限定される。さ
らに多数の塩基配列を一度に変えることは困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】自然界では２種のゲノ
ムＤＮＡが混ざり合って中間雑種が得られ、中間の形質
を発現する。たとえば、メンデルのエンドウ豆の交配実
験で赤色の花の親と白色の花の親から桃色の花を持つ中
間雑種が得られたり、ロバとウマからラバが生まれた
り、オレンジとカラタチからオレタチを育種したりとか
枚挙にいとまがない。これをＤＮＡレベルの交配として
見ると、ＤＮＡ（遺伝子）とある程度の相同性を持つＤ
ＮＡ（遺伝子）との中間の塩基配列を持つＤＮＡ（中間
雑種）の中に、それぞれの性質が強化されたものを得る
には、部位特異的変異を多数回繰り返して行う必要があ
る。たとえば、ヒトの遺伝子とマウスの遺伝子との間で
塩基配列が９６％の相同性の有する、２つの遺伝子の中
間遺伝子を作製するためには１００塩基当たり最大３塩
基を置換しなければならず、モザイク遺伝子を作製する
場合には、塩基配列を比較して部位特異的変異操作を繰
り返して行うことが必要である。
ムＤＮＡが混ざり合って中間雑種が得られ、中間の形質
を発現する。たとえば、メンデルのエンドウ豆の交配実
験で赤色の花の親と白色の花の親から桃色の花を持つ中
間雑種が得られたり、ロバとウマからラバが生まれた
り、オレンジとカラタチからオレタチを育種したりとか
枚挙にいとまがない。これをＤＮＡレベルの交配として
見ると、ＤＮＡ（遺伝子）とある程度の相同性を持つＤ
ＮＡ（遺伝子）との中間の塩基配列を持つＤＮＡ（中間
雑種）の中に、それぞれの性質が強化されたものを得る
には、部位特異的変異を多数回繰り返して行う必要があ
る。たとえば、ヒトの遺伝子とマウスの遺伝子との間で
塩基配列が９６％の相同性の有する、２つの遺伝子の中
間遺伝子を作製するためには１００塩基当たり最大３塩
基を置換しなければならず、モザイク遺伝子を作製する
場合には、塩基配列を比較して部位特異的変異操作を繰
り返して行うことが必要である。
【０００４】しかしながらこの方法では、ＤＮＡのサイ
ズが大きくなったり相同性が低下すればこれらの組み合
わせは等比級数的に増加することになり、部位特異的変
異で全てを網羅することが困難になる。遺伝子をその単
位領域毎に入れ換えたり（Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．，Ｙｏｓｈ
ｉｄａ，Ｙ．，Ｓａｔｏｈ，Ａ．，Ｋｈｏｎｏ，Ｔ．，
ａｎｄ Ｙａｎａｇａｗａ、Ｈ．（１９９９）Ｆｏｌｄ
ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｂａｒｎａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｏｄｕｌｅｓ ｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｕｎｉｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、２８６，１５８１−１５９６）、タンパク質のＮ
- 端とＣ- 端とを別の菌からとったＤＮＡで繋ぎ変えた
りした例（桐野裕美、山岸明彦、大島泰郎、蛋白質・ 核
酸・酵素、Ｖｏｌ. ３７、ｐ３３５−３４５（１９９
２））はあるが、これらは頭と尾が別々のキメラＤＮＡ
であり、中間雑種とは言いがたく、まばらに似ている２
つの大きなＤＮＡの間でモザイクを創製する一般的な技
術はまだ存在しない。
ズが大きくなったり相同性が低下すればこれらの組み合
わせは等比級数的に増加することになり、部位特異的変
異で全てを網羅することが困難になる。遺伝子をその単
位領域毎に入れ換えたり（Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．，Ｙｏｓｈ
ｉｄａ，Ｙ．，Ｓａｔｏｈ，Ａ．，Ｋｈｏｎｏ，Ｔ．，
ａｎｄ Ｙａｎａｇａｗａ、Ｈ．（１９９９）Ｆｏｌｄ
ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｂａｒｎａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｏｄｕｌｅｓ ｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｕｎｉｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、２８６，１５８１−１５９６）、タンパク質のＮ
- 端とＣ- 端とを別の菌からとったＤＮＡで繋ぎ変えた
りした例（桐野裕美、山岸明彦、大島泰郎、蛋白質・ 核
酸・酵素、Ｖｏｌ. ３７、ｐ３３５−３４５（１９９
２））はあるが、これらは頭と尾が別々のキメラＤＮＡ
であり、中間雑種とは言いがたく、まばらに似ている２
つの大きなＤＮＡの間でモザイクを創製する一般的な技
術はまだ存在しない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、枯草菌のゲ
ノムに巨大な外来性ＤＮＡを組み込める手法を見出し、
また枯草菌がもっている形質転換能によって２％程度の
塩基配列の違いを乗り越えることができることを既に見
出しているが、この２つの要素技術を組み合わせると、
枯草菌ゲノムに組み込んだどのようなＤＮＡでもモザイ
ク化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
ノムに巨大な外来性ＤＮＡを組み込める手法を見出し、
また枯草菌がもっている形質転換能によって２％程度の
塩基配列の違いを乗り越えることができることを既に見
出しているが、この２つの要素技術を組み合わせると、
枯草菌ゲノムに組み込んだどのようなＤＮＡでもモザイ
ク化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の発明を包含す
る。 （１）ゲノムＤＮＡに挿入された、所望の表現型を付与
するモザイク組換えＤＮＡを含有する枯草菌組換え体。 （２）モザイク組換えＤＮＡが、殺虫性、耐旱魃性、耐
高温性または耐低温性を付与するＤＮＡを含有する１項
に記載の枯草菌組換え体。 （３）モザイク組換えＤＮＡが、免疫グロブリン遺伝子
または免疫グロブリンの可変領域重鎖もしくは軽鎖をコ
ードするＤＮＡを含有する１項に記載の枯草菌組換え
体。
る。 （１）ゲノムＤＮＡに挿入された、所望の表現型を付与
するモザイク組換えＤＮＡを含有する枯草菌組換え体。 （２）モザイク組換えＤＮＡが、殺虫性、耐旱魃性、耐
高温性または耐低温性を付与するＤＮＡを含有する１項
に記載の枯草菌組換え体。 （３）モザイク組換えＤＮＡが、免疫グロブリン遺伝子
または免疫グロブリンの可変領域重鎖もしくは軽鎖をコ
ードするＤＮＡを含有する１項に記載の枯草菌組換え
体。
【０００７】（４）枯草菌のゲノムＤＮＡに挿入した1
以上の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上のＤＮＡ断
片で同時または逐次に置換して得られる、モザイク組換
え体ＤＮＡを含有する枯草菌組換え体から、所望の表現
型を有する枯草菌組換え体を選択することからなる枯草
菌組換え体の作成法。 （５）１以上のＤＮＡ断片が二本鎖のＤＮＡ断片である
４項に記載の方法。 （６）二本鎖ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡである５項に
記載の方法。 （７）二本鎖ＤＮＡ断片が、ランダムな合成ＤＮＡであ
る５項に記載の方法。 （８）１以上のＤＮＡ断片がコンピテントである枯草菌
または形質転換能を有する枯草菌のゲノムに置換により
導入される４項に記載の方法。
以上の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上のＤＮＡ断
片で同時または逐次に置換して得られる、モザイク組換
え体ＤＮＡを含有する枯草菌組換え体から、所望の表現
型を有する枯草菌組換え体を選択することからなる枯草
菌組換え体の作成法。 （５）１以上のＤＮＡ断片が二本鎖のＤＮＡ断片である
４項に記載の方法。 （６）二本鎖ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡである５項に
記載の方法。 （７）二本鎖ＤＮＡ断片が、ランダムな合成ＤＮＡであ
る５項に記載の方法。 （８）１以上のＤＮＡ断片がコンピテントである枯草菌
または形質転換能を有する枯草菌のゲノムに置換により
導入される４項に記載の方法。
【０００８】（９）１以上の異種ＤＮＡが、１以上のＤ
ＮＡ断片で置換された組換え体の選択が、選択マーカが
発現している細胞が生き残る選択条件での陽性選択であ
る４項に記載の方法。 （１０）選択マーカが、抗生物質耐性遺伝子である９項
に記載の方法。 （１１）選択マーカが、ネオマイシン耐性遺伝子である
１０項に記載の方法。 （１２）所望の表現型を有する組換え体の選択が、抗体
との結合、酵素活性、ホルモン活性、受容体との結合ま
たは抗原との親和性に基づいて行われる４項に記載の方
法。 （１３）置換により導入されるＤＮＡ断片が殺虫性、耐
旱魃性、耐高温性または耐低温性を付与するＤＮＡを含
有する４項に記載の方法。
ＮＡ断片で置換された組換え体の選択が、選択マーカが
発現している細胞が生き残る選択条件での陽性選択であ
る４項に記載の方法。 （１０）選択マーカが、抗生物質耐性遺伝子である９項
に記載の方法。 （１１）選択マーカが、ネオマイシン耐性遺伝子である
１０項に記載の方法。 （１２）所望の表現型を有する組換え体の選択が、抗体
との結合、酵素活性、ホルモン活性、受容体との結合ま
たは抗原との親和性に基づいて行われる４項に記載の方
法。 （１３）置換により導入されるＤＮＡ断片が殺虫性、耐
旱魃性、耐高温性または耐低温性を付与するＤＮＡを含
有する４項に記載の方法。
【０００９】（１４）環境浄化のための遺伝子群を枯草
菌ゲノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝子群を
環境浄化微生物に由来するＤＮＡまたはランダムな合成
ＤＮＡで置換してさらに環境浄化に優れた遺伝子群を枯
草菌ゲノムに導入する４項に記載の方法。 （１５）さらに環境浄化に優れた遺伝子群が、環境浄化
のためのｐＨ, 温度、重金属浄化または圧力に関し、優
れたものである１４項に記載の方法。 （１６）免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリンの
可変領域重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草菌
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝子のＤＮ
Ａ再編成で生じるＤＮＡ断片またはランダムな合成ＤＮ
Ａで置換して所望の免疫グロブリン遺伝子または免疫グ
ロブリンの重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草
菌ゲノムに導入する４項に記載の方法。
菌ゲノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝子群を
環境浄化微生物に由来するＤＮＡまたはランダムな合成
ＤＮＡで置換してさらに環境浄化に優れた遺伝子群を枯
草菌ゲノムに導入する４項に記載の方法。 （１５）さらに環境浄化に優れた遺伝子群が、環境浄化
のためのｐＨ, 温度、重金属浄化または圧力に関し、優
れたものである１４項に記載の方法。 （１６）免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリンの
可変領域重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草菌
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝子のＤＮ
Ａ再編成で生じるＤＮＡ断片またはランダムな合成ＤＮ
Ａで置換して所望の免疫グロブリン遺伝子または免疫グ
ロブリンの重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草
菌ゲノムに導入する４項に記載の方法。
【００１０】（１７）動物または植物の高頻度反復配列
または中頻度反復配列を含有するＤＮＡ断片を枯草菌の
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により動物または植物
のゲノムに由来する該反復配列を含有するＤＮＡ断片で
置換してゲノムＤＮＡライブラリーを作成する方法。 （１８）動物または植物に由来する遺伝子ＤＮＡをゲノ
ムＤＮＡに挿入した枯草菌の形質転換により、該遺伝子
ＤＮＡに類似した遺伝子ＤＮＡを枯草菌ゲノムに導入
し、次いで所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを選択し、
さらに所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを動物または植
物に導入して得られるトランスジェニック動物または植
物。
または中頻度反復配列を含有するＤＮＡ断片を枯草菌の
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により動物または植物
のゲノムに由来する該反復配列を含有するＤＮＡ断片で
置換してゲノムＤＮＡライブラリーを作成する方法。 （１８）動物または植物に由来する遺伝子ＤＮＡをゲノ
ムＤＮＡに挿入した枯草菌の形質転換により、該遺伝子
ＤＮＡに類似した遺伝子ＤＮＡを枯草菌ゲノムに導入
し、次いで所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを選択し、
さらに所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを動物または植
物に導入して得られるトランスジェニック動物または植
物。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のモザイク組換え体ＤＮＡ
を含有する枯草菌組換え体は、枯草菌のゲノムＤＮＡに
挿入した1 以上の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上
のＤＮＡ断片で同時または逐次に置換して得られるモザ
イク組換え体ＤＮＡを含有する枯草菌組換え体から、所
望の表現型を有する枯草菌組換え体を選択して作成され
る。所望の表現型を有する枯草菌組換え体を作成するた
めの、本発明の方法では、異種ＤＮＡは、形質転換によ
り予め枯草菌ゲノムに挿入される必要があり、挿入され
た異種ＤＮＡの少なくとも一部はさらなる形質転換によ
って、１以上のＤＮＡ断片で置換される。
を含有する枯草菌組換え体は、枯草菌のゲノムＤＮＡに
挿入した1 以上の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上
のＤＮＡ断片で同時または逐次に置換して得られるモザ
イク組換え体ＤＮＡを含有する枯草菌組換え体から、所
望の表現型を有する枯草菌組換え体を選択して作成され
る。所望の表現型を有する枯草菌組換え体を作成するた
めの、本発明の方法では、異種ＤＮＡは、形質転換によ
り予め枯草菌ゲノムに挿入される必要があり、挿入され
た異種ＤＮＡの少なくとも一部はさらなる形質転換によ
って、１以上のＤＮＡ断片で置換される。
【００１２】異種ＤＮＡは、枯草菌のゲノムＤＮＡに組
み込むことができるものであれば、どのようなＤＮＡで
あってもよい。たとえば、ＧＣ含量が７０％の高度好熱
菌由来のＤＮＡであってもよい。異種ＤＮＡの大きさに
ついては、枯草菌に組み込むことができれば特に制限は
なく、１００ｋｂの大きさのＤＮＡであっても枯草菌の
ゲノムＤＮＡに挿入可能である（Ｉｔａｙａ、Ｍ． Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｌａｒｇｅ
ｓｉｚｅｄ ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｓ ｔｏｄｅｓｉｇ
ｎａｔｅｄ ｌｏｃｉ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｇｅｎｏｍｅ． Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，１０４５−１０４８（１
９９９）参照）。
み込むことができるものであれば、どのようなＤＮＡで
あってもよい。たとえば、ＧＣ含量が７０％の高度好熱
菌由来のＤＮＡであってもよい。異種ＤＮＡの大きさに
ついては、枯草菌に組み込むことができれば特に制限は
なく、１００ｋｂの大きさのＤＮＡであっても枯草菌の
ゲノムＤＮＡに挿入可能である（Ｉｔａｙａ、Ｍ． Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｌａｒｇｅ
ｓｉｚｅｄ ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｓ ｔｏｄｅｓｉｇ
ｎａｔｅｄ ｌｏｃｉ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｇｅｎｏｍｅ． Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，１０４５−１０４８（１
９９９）参照）。
【００１３】異種ＤＮＡは、一回以上複数回、枯草菌ゲ
ノム中に挿入することが可能である。異種ＤＮＡが挿入
される枯草菌ゲノムの位置としては、挿入によって枯草
菌が死滅することがない限り、どのような位置であって
も良いが、実際１〜２ｋｂの大きさの薬剤耐性遺伝子
は、５０箇所以上の位置で枯草菌のゲノム中に挿入可能
である（Ｉｔａｙａ、Ｍ．ａｎｄ Ｔ．Ｔａｎａｋａ、
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ
ａ ｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
０、６３１−６４８（１９９１）参照）。このような枯
草菌ゲノム上での異種ＤＮＡの挿入部位の例として、枯
草菌ゲノム上のｐｒｏＢ遺伝子が挙げられる。挿入され
る異種ＤＮＡの両末端には、挿入された異種ＤＮＡの選
択マーカとして、クロラムフェニコール耐性遺伝子やエ
リスロマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が存
在するのが好ましい。
ノム中に挿入することが可能である。異種ＤＮＡが挿入
される枯草菌ゲノムの位置としては、挿入によって枯草
菌が死滅することがない限り、どのような位置であって
も良いが、実際１〜２ｋｂの大きさの薬剤耐性遺伝子
は、５０箇所以上の位置で枯草菌のゲノム中に挿入可能
である（Ｉｔａｙａ、Ｍ．ａｎｄ Ｔ．Ｔａｎａｋａ、
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ
ａ ｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
０、６３１−６４８（１９９１）参照）。このような枯
草菌ゲノム上での異種ＤＮＡの挿入部位の例として、枯
草菌ゲノム上のｐｒｏＢ遺伝子が挙げられる。挿入され
る異種ＤＮＡの両末端には、挿入された異種ＤＮＡの選
択マーカとして、クロラムフェニコール耐性遺伝子やエ
リスロマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が存
在するのが好ましい。
【００１４】枯草菌ゲノム中に組み込まれた異種ＤＮＡ
の一部または全部を形質転換により同時または逐次置換
する１以上のＤＮＡ断片の大きさは, 数十ｂｐ以上であ
ればよいが、置換の頻度を上げるためには、数ｋｂ以上
であることがが好ましい。上記ＤＮＡ断片は、異種ＤＮ
Ａ中に含まれる相同領域と組換えを起こす。したがっ
て、異種ＤＮＡは、これと置換可能な相同領域を有する
複数のＤＮＡ断片によって同時または逐次置換され得
る。異種の相同領域部分と置換するＤＮＡ断片は、枯草
菌に取り込まれる段階では、二本鎖である必要がある。
二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡでも、ランダムに合成さ
れたＤＮＡであっても良い。二本鎖ゲノムＤＮＡは、リ
ゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて、細菌を溶菌する
ことによっても得られる。得られるゲノムＤＮＡは、必
要に応じて使用前精製される。
の一部または全部を形質転換により同時または逐次置換
する１以上のＤＮＡ断片の大きさは, 数十ｂｐ以上であ
ればよいが、置換の頻度を上げるためには、数ｋｂ以上
であることがが好ましい。上記ＤＮＡ断片は、異種ＤＮ
Ａ中に含まれる相同領域と組換えを起こす。したがっ
て、異種ＤＮＡは、これと置換可能な相同領域を有する
複数のＤＮＡ断片によって同時または逐次置換され得
る。異種の相同領域部分と置換するＤＮＡ断片は、枯草
菌に取り込まれる段階では、二本鎖である必要がある。
二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡでも、ランダムに合成さ
れたＤＮＡであっても良い。二本鎖ゲノムＤＮＡは、リ
ゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて、細菌を溶菌する
ことによっても得られる。得られるゲノムＤＮＡは、必
要に応じて使用前精製される。
【００１５】また、ゲノムＤＮＡの供給源が温度感受溶
菌性大腸菌の場合には、枯草菌と大腸菌を接触させ、温
度を上昇させることにより、溶菌した大腸菌中のゲノム
ＤＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで枯草菌中に取り込ませること
ができる。枯草菌の細胞表面には、非特異的エンドヌク
レアーゼが存在し、トラップした二本鎖ＤＮＡの片方を
切断し、一本鎖を枯草菌中に取り込むとともに、残りの
一本鎖（相補鎖）を完全に分解する。枯草菌中に取り込
まれた一本鎖ＤＮＡ断片は、枯草菌ゲノムに挿入された
異種ＤＮＡ中の相同領域を探して、置換が生じると考え
られる。このようにして、ＤＮＡ断片を取り込むことが
可能な枯草菌は、コンピテントであるか、あるいは形質
転換能を有する。
菌性大腸菌の場合には、枯草菌と大腸菌を接触させ、温
度を上昇させることにより、溶菌した大腸菌中のゲノム
ＤＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで枯草菌中に取り込ませること
ができる。枯草菌の細胞表面には、非特異的エンドヌク
レアーゼが存在し、トラップした二本鎖ＤＮＡの片方を
切断し、一本鎖を枯草菌中に取り込むとともに、残りの
一本鎖（相補鎖）を完全に分解する。枯草菌中に取り込
まれた一本鎖ＤＮＡ断片は、枯草菌ゲノムに挿入された
異種ＤＮＡ中の相同領域を探して、置換が生じると考え
られる。このようにして、ＤＮＡ断片を取り込むことが
可能な枯草菌は、コンピテントであるか、あるいは形質
転換能を有する。
【００１６】１以上の異種ＤＮＡが、１以上のＤＮＡ断
片で置換された組換え体は、選択マーカが発現している
細胞が生き残る選択条件での陽性選択によって選択され
る。選択マーカとしては、ネオマイシン耐性遺伝子等の
抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。たとえば、枯草菌ゲ
ノム中の３，５１６ｋｂの部位にＰｒ−ｎｅｏのカセッ
トを挿入し、異種ＤＮＡが、ＤＮＡ断片で置換された場
合にＰｒプロモータが働くと、下流のネオマイシン耐性
遺伝子が発現し、ネオマイシン耐性となった、ＤＮＡ断
片で置換された組換え体を選択できる。
片で置換された組換え体は、選択マーカが発現している
細胞が生き残る選択条件での陽性選択によって選択され
る。選択マーカとしては、ネオマイシン耐性遺伝子等の
抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。たとえば、枯草菌ゲ
ノム中の３，５１６ｋｂの部位にＰｒ−ｎｅｏのカセッ
トを挿入し、異種ＤＮＡが、ＤＮＡ断片で置換された場
合にＰｒプロモータが働くと、下流のネオマイシン耐性
遺伝子が発現し、ネオマイシン耐性となった、ＤＮＡ断
片で置換された組換え体を選択できる。
【００１７】また、遺伝子産物が発現している細胞が生
き残る選択条件での陽性選択（ポジティブ選択）と細胞
に遺伝子を導入したとき、その形質が発現することによ
り細胞が死滅するような選択条件での陰性選択（ネガテ
ィブ選択）とを組み合わせた二重選択により、組換え体
を選択することもできる。具体的には、枯草菌の制限酵
素認識部位（ＳｆｉＩ等）に挿入したクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子（ｃａｔ）、ネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）、ブラストサイジンS 耐性遺伝子（ｂｓｒ）
等は、陰性選択に使用される。
き残る選択条件での陽性選択（ポジティブ選択）と細胞
に遺伝子を導入したとき、その形質が発現することによ
り細胞が死滅するような選択条件での陰性選択（ネガテ
ィブ選択）とを組み合わせた二重選択により、組換え体
を選択することもできる。具体的には、枯草菌の制限酵
素認識部位（ＳｆｉＩ等）に挿入したクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子（ｃａｔ）、ネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏ）、ブラストサイジンS 耐性遺伝子（ｂｓｒ）
等は、陰性選択に使用される。
【００１８】枯草菌ゲノム中に組み込まれた異種ＤＮＡ
の一部または全部の形質転換により同時または逐次的な
置換により導入されるＤＮＡ断片の具体例としては、殺
虫性、耐旱魃性、耐高温性または耐低温性を付与するＤ
ＮＡ断片等が例示される。さらに具体的には、環境浄化
のための遺伝子群を枯草菌ゲノムに挿入し、次いで相同
的組換えにより該遺伝子群を環境浄化微生物に由来する
ＤＮＡまたはランダムな人工のＤＮＡで置換してさらに
環境浄化に優れた遺伝子群を枯草菌ゲノムに導入するこ
とができる。環境浄化に優れた遺伝子群としては、環境
浄化のためのｐＨ, 温度、重金属浄化または圧力に関
し、優れたものが挙げられる。
の一部または全部の形質転換により同時または逐次的な
置換により導入されるＤＮＡ断片の具体例としては、殺
虫性、耐旱魃性、耐高温性または耐低温性を付与するＤ
ＮＡ断片等が例示される。さらに具体的には、環境浄化
のための遺伝子群を枯草菌ゲノムに挿入し、次いで相同
的組換えにより該遺伝子群を環境浄化微生物に由来する
ＤＮＡまたはランダムな人工のＤＮＡで置換してさらに
環境浄化に優れた遺伝子群を枯草菌ゲノムに導入するこ
とができる。環境浄化に優れた遺伝子群としては、環境
浄化のためのｐＨ, 温度、重金属浄化または圧力に関
し、優れたものが挙げられる。
【００１９】具体的には、このような環境浄化微生物と
して、耐塩素イオン硝化菌、有機塩素化合物分解微生
物、チトクロムＰ４５０に由来する遺伝子、芳香環水酸
化酵素ジオキシゲナーゼ遺伝子等を含有する微生物等が
挙げられる。さらに具体的には、有機塩素化合物分解酵
素を産生するシュードモナス・セパシア、シュードモナ
ス・プチダ等の細菌由来の同酵素遺伝子を枯草菌ゲノム
中に挿入し、次いで他の微生物由来のゲノムＤＮＡの断
片で同酵素遺伝子を置換することにより、同酵素活性の
優れたＤＮＡ断片を含有する枯草菌を選択できる。一般
に環境浄化微生物の生育は良くないが、枯草菌は生育に
優れるため、優れた環境浄化に関与する遺伝子を導入し
た枯草菌は、環境浄化においてより効率的である。
して、耐塩素イオン硝化菌、有機塩素化合物分解微生
物、チトクロムＰ４５０に由来する遺伝子、芳香環水酸
化酵素ジオキシゲナーゼ遺伝子等を含有する微生物等が
挙げられる。さらに具体的には、有機塩素化合物分解酵
素を産生するシュードモナス・セパシア、シュードモナ
ス・プチダ等の細菌由来の同酵素遺伝子を枯草菌ゲノム
中に挿入し、次いで他の微生物由来のゲノムＤＮＡの断
片で同酵素遺伝子を置換することにより、同酵素活性の
優れたＤＮＡ断片を含有する枯草菌を選択できる。一般
に環境浄化微生物の生育は良くないが、枯草菌は生育に
優れるため、優れた環境浄化に関与する遺伝子を導入し
た枯草菌は、環境浄化においてより効率的である。
【００２０】また、クローニングした免疫グロブリン遺
伝子または免疫グロブリンの可変領域重鎖（ＶＨ）もし
くは軽鎖（ＶＬ）をコードするＤＮＡを枯草菌ゲノムに
挿入し、次いで形質転換により該遺伝子のＤＮＡ再編成
で生じるＤＮＡ断片またはランダム合成ＤＮＡで置換し
て所望の免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリンの
重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草菌ゲノムに
導入して重鎖および軽鎖のライブラリーを作成できる。
たとえば、ランダム合成ＤＮＡを用いて、フレームワー
ク領域にランダムな変異を含むヒト化抗体等のライブラ
リーを作成できる。このようにして作成したライブラリ
ーの中から抗体遺伝子産物の特異性が変化した抗体や、
マウスとヒトのモザイク抗体を作成できる。このように
して得られるゲノムライブラリーから所望の表現型を有
する枯草菌組換え体を選択できる。
伝子または免疫グロブリンの可変領域重鎖（ＶＨ）もし
くは軽鎖（ＶＬ）をコードするＤＮＡを枯草菌ゲノムに
挿入し、次いで形質転換により該遺伝子のＤＮＡ再編成
で生じるＤＮＡ断片またはランダム合成ＤＮＡで置換し
て所望の免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリンの
重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡを枯草菌ゲノムに
導入して重鎖および軽鎖のライブラリーを作成できる。
たとえば、ランダム合成ＤＮＡを用いて、フレームワー
ク領域にランダムな変異を含むヒト化抗体等のライブラ
リーを作成できる。このようにして作成したライブラリ
ーの中から抗体遺伝子産物の特異性が変化した抗体や、
マウスとヒトのモザイク抗体を作成できる。このように
して得られるゲノムライブラリーから所望の表現型を有
する枯草菌組換え体を選択できる。
【００２１】さらに、動物または植物の高頻度反復配列
または中頻度反復配列を含有するＤＮＡ断片を枯草菌の
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により動物または植物
のゲノムに由来する該反復配列を含有するＤＮＡ断片で
置換してゲノムＤＮＡライブラリーを作成できる。この
ようにして得られるゲノムライブラリーから所望の表現
型を有する枯草菌組換え体を選択できる。
または中頻度反復配列を含有するＤＮＡ断片を枯草菌の
ゲノムに挿入し、次いで形質転換により動物または植物
のゲノムに由来する該反復配列を含有するＤＮＡ断片で
置換してゲノムＤＮＡライブラリーを作成できる。この
ようにして得られるゲノムライブラリーから所望の表現
型を有する枯草菌組換え体を選択できる。
【００２２】また、本発明の方法を応用して、動物また
は植物に由来する遺伝子ＤＮＡをゲノムＤＮＡに挿入し
た枯草菌の形質転換により、該遺伝子ＤＮＡに類似した
遺伝子ＤＮＡを枯草菌ゲノムに導入し、所望の性質を有
する遺伝子ＤＮＡを選択し、さらに選択した所望の性質
を有する遺伝子ＤＮＡを動物または植物に導入して、ト
ランスジェニック動物または植物を作成できる。
は植物に由来する遺伝子ＤＮＡをゲノムＤＮＡに挿入し
た枯草菌の形質転換により、該遺伝子ＤＮＡに類似した
遺伝子ＤＮＡを枯草菌ゲノムに導入し、所望の性質を有
する遺伝子ＤＮＡを選択し、さらに選択した所望の性質
を有する遺伝子ＤＮＡを動物または植物に導入して、ト
ランスジェニック動物または植物を作成できる。
【００２３】本発明の方法に従い、上記のようにして得
られるゲノムライブラリー等から、所望の表現型を有す
る組換え体を選択するには、抗体との特異的結合、酵素
活性、ホルモン活性等の生理活性、リガンドあるいは受
容体との結合および抗原との親和性等のタンパク質−タ
ンパク質相互作用等が利用される。
られるゲノムライブラリー等から、所望の表現型を有す
る組換え体を選択するには、抗体との特異的結合、酵素
活性、ホルモン活性等の生理活性、リガンドあるいは受
容体との結合および抗原との親和性等のタンパク質−タ
ンパク質相互作用等が利用される。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認
識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は
下記の実施例により何ら制限されるものでない。
説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認
識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は
下記の実施例により何ら制限されるものでない。
【００２５】実施例１ 以下、図１を参照して、枯草菌ゲノムに挿入したラムダ
ＤＮＡを、マウスゲノム由来のＤＮＡ断片を含有する異
種ラムダＤＮＡを用いてモザイク化した例を示す。ま
ず、枯草菌１６８ｔｒｐＣ２株のゲノム上のｐｒｏＢ遺
伝子にラムダ( ｃＩ８５７ Ｓａｍ) （Ｓａｎｇｅｒ
Ｆ、Ｃｏｕｌｓｏｎ ＡＲ，Ｈｏｎｇ ＧＦ，Ｈｉｌｌ
ＤＦ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＧＢ（１９８２） Ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａＤＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ １６２：７２９−７７３）を組み込んだ株Ｂ
ＥＳＴ２１９３株をレシピエント株とする（Ｉｔａｙ
ａ、Ｍ．Ｔｏｗａｒｄ ａｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎ
ｏｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｐｒｏｐｈａｇｅｌａｍｂｄａ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ
ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
１６８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ． Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．、２４８，９−１６（１９９５））。ラムダ
ＤＮＡと枯草菌ゲノムとの境界にはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子（Ｃｍ）とエリスロマイシン耐性遺伝子
（Ｅｍ）を組み込んであり、両薬剤耐性株はラムダを持
っていることを示すマーカーである。
ＤＮＡを、マウスゲノム由来のＤＮＡ断片を含有する異
種ラムダＤＮＡを用いてモザイク化した例を示す。ま
ず、枯草菌１６８ｔｒｐＣ２株のゲノム上のｐｒｏＢ遺
伝子にラムダ( ｃＩ８５７ Ｓａｍ) （Ｓａｎｇｅｒ
Ｆ、Ｃｏｕｌｓｏｎ ＡＲ，Ｈｏｎｇ ＧＦ，Ｈｉｌｌ
ＤＦ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＧＢ（１９８２） Ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａＤＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ １６２：７２９−７７３）を組み込んだ株Ｂ
ＥＳＴ２１９３株をレシピエント株とする（Ｉｔａｙ
ａ、Ｍ．Ｔｏｗａｒｄ ａｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎ
ｏｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｐｒｏｐｈａｇｅｌａｍｂｄａ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ
ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
１６８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ． Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．、２４８，９−１６（１９９５））。ラムダ
ＤＮＡと枯草菌ゲノムとの境界にはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子（Ｃｍ）とエリスロマイシン耐性遺伝子
（Ｅｍ）を組み込んであり、両薬剤耐性株はラムダを持
っていることを示すマーカーである。
【００２６】ＢＥＳＴ２１９３のラムダにはラムダマッ
プＳｍａＩ（３１，６１７ｂｐ）部位にｃＩ−ＢＳカセ
ットを挿入してあり、またゲノム中の３，５１６ｋｂの
部位にＰｒ−ｎｅｏのカセットが組み込んである。これ
らの２つのカセットの役割はｃＩの組み込み場所を他の
ラムダで置き換える際の選択に使用することにある。そ
の原理はｃＩが他の塩基配列に置き換わってゲノムから
消失するとＰｒプロモータが働き始めて下流のｎｅｏ
（ネオマイシン耐性遺伝子）が発現してネオマイシン耐
性株を与える。この作用により、ｃＩ−ＢＳが挿入され
ている領域が別のＤＮＡで置き換わった株をネオマイシ
ン耐性で選択できるシステムである（Ｉｔａｙａ
Ｍ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｕ
ｎｍａｒｋｅｄＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔ
ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８
ｇｅｎｏｍｅ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６３，６０２−６０４（１９９
９））。
プＳｍａＩ（３１，６１７ｂｐ）部位にｃＩ−ＢＳカセ
ットを挿入してあり、またゲノム中の３，５１６ｋｂの
部位にＰｒ−ｎｅｏのカセットが組み込んである。これ
らの２つのカセットの役割はｃＩの組み込み場所を他の
ラムダで置き換える際の選択に使用することにある。そ
の原理はｃＩが他の塩基配列に置き換わってゲノムから
消失するとＰｒプロモータが働き始めて下流のｎｅｏ
（ネオマイシン耐性遺伝子）が発現してネオマイシン耐
性株を与える。この作用により、ｃＩ−ＢＳが挿入され
ている領域が別のＤＮＡで置き換わった株をネオマイシ
ン耐性で選択できるシステムである（Ｉｔａｙａ
Ｍ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｕ
ｎｍａｒｋｅｄＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔ
ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８
ｇｅｎｏｍｅ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６３，６０２−６０４（１９９
９））。
【００２７】ＢＥＳＴ２１９３に、ラムダクローンＧＳ
Ａ１８７−２を加えて形質転換させた。ＧＳＡ１８７−
２は、ＥＭＢＬ３ベクター（東洋紡社製）由来で、ｃＩ
組み込み部位に相当する場所にはマウスゲノム由来の約
１４ｋｂの断片が入っている。ＥＭＢＬ３ベクターの両
アームはＢＥＳＴ２１９３中のラムダ( ｃＩ８５７Ｓａ
ｍ) とは制限酵素マップが変わっており完全な相同塩基
配列を有しない。しかしながら、この形質転換実験でＧ
ＳＡ１８７−２がｃＩと置き換わって挿入されている株
を多数得た（ＢＥＳＴ２１９５）。ＢＥＳＴ２１９５を
３株解析した結果、これらの株は、ＧＳＡ１８７−２が
ｃＩ８５７ Ｓａｍと部分的に置き換わったモザイクラ
ムダを含有することが確認された。
Ａ１８７−２を加えて形質転換させた。ＧＳＡ１８７−
２は、ＥＭＢＬ３ベクター（東洋紡社製）由来で、ｃＩ
組み込み部位に相当する場所にはマウスゲノム由来の約
１４ｋｂの断片が入っている。ＥＭＢＬ３ベクターの両
アームはＢＥＳＴ２１９３中のラムダ( ｃＩ８５７Ｓａ
ｍ) とは制限酵素マップが変わっており完全な相同塩基
配列を有しない。しかしながら、この形質転換実験でＧ
ＳＡ１８７−２がｃＩと置き換わって挿入されている株
を多数得た（ＢＥＳＴ２１９５）。ＢＥＳＴ２１９５を
３株解析した結果、これらの株は、ＧＳＡ１８７−２が
ｃＩ８５７ Ｓａｍと部分的に置き換わったモザイクラ
ムダを含有することが確認された。
【００２８】
【発明の効果】本発明による生物の形質転換を利用した
遺伝子組換え法により、細菌または細胞中の染色体の一
部を微妙に変化させて、優れた生物活性等を付与する、
所望の表現型を有する枯草菌組換え体を選択できる。ま
た、所望の表現型を付与する遺伝子を枯草菌から単離し
て、トランスジェニック動物あるいは植物を作成でき
る。その他、本発明の方法は、細菌または細胞のゲノム
ＤＮＡあるいはランダム合成ＤＮＡ断片からのゲノムＤ
ＮＡライブラリーの作成にも応用できる。
遺伝子組換え法により、細菌または細胞中の染色体の一
部を微妙に変化させて、優れた生物活性等を付与する、
所望の表現型を有する枯草菌組換え体を選択できる。ま
た、所望の表現型を付与する遺伝子を枯草菌から単離し
て、トランスジェニック動物あるいは植物を作成でき
る。その他、本発明の方法は、細菌または細胞のゲノム
ＤＮＡあるいはランダム合成ＤＮＡ断片からのゲノムＤ
ＮＡライブラリーの作成にも応用できる。
【００２９】
【図１】図１は、枯草菌ゲノムに挿入したラムダＤＮＡ
がモザイク化したゲノムの構築を示す図である。
がモザイク化したゲノムの構築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AB03 AD05 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA07 AA08 AA17 AA20 CA03 CA04 DA01 DA02 DA07 EA03 FA02 FA13 GA11 GA27 HA20 4B065 AA19X AB01 AC02 AC03 AC10 BA02 CA47 CA53 CA55 CA56
Claims (18)
- 【請求項１】 ゲノムＤＮＡに挿入された、所望の表現
型を付与するモザイク組換えＤＮＡを含有する枯草菌組
換え体。 - 【請求項２】 モザイク組換えＤＮＡが、殺虫性、耐旱
魃性、耐高温性または耐低温性を付与するＤＮＡを含有
する請求項１に記載の枯草菌組換え体。 - 【請求項３】 モザイク組換えＤＮＡが、免疫グロブリ
ン遺伝子または免疫グロブリンの可変領域重鎖もしくは
軽鎖をコードするＤＮＡを含有する請求項１に記載の枯
草菌組換え体。 - 【請求項４】 枯草菌のゲノムＤＮＡに挿入した1 以上
の異種ＤＮＡを形質転換により、1 以上のＤＮＡ断片で
同時または逐次に置換して得られる、モザイク組換えＤ
ＮＡを含有する枯草菌組換え体から、所望の表現型を有
する枯草菌組換え体を選択することからなる枯草菌組換
え体の作成法。 - 【請求項５】 １以上のＤＮＡ断片が二本鎖のＤＮＡ断
片である請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 二本鎖ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡであ
る請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 二本鎖ＤＮＡ断片が、ランダムな合成Ｄ
ＮＡである請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 １以上のＤＮＡ断片がコンピテントであ
る枯草菌または形質転換能を有する枯草菌のゲノムに置
換により導入される請求項４に記載の方法。 - 【請求項９】 １以上の異種ＤＮＡが、１以上のＤＮＡ
断片で置換された組換え体の選択が、選択マーカが発現
している細胞が生き残る選択条件での陽性選択である請
求項４に記載の方法。 - 【請求項１０】 選択マーカが、抗生物質耐性遺伝子で
ある請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 選択マーカが、ネオマイシン耐性遺伝
子である請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 所望の表現型を有する組換え体の選択
が、抗体との結合、酵素活性、ホルモン活性、受容体と
の結合または抗原との親和性に基づいて行われる請求項
４に記載の方法。 - 【請求項１３】 置換により導入されるＤＮＡ断片が、
殺虫性、耐旱魃性、耐高温性または耐低温性を付与する
ＤＮＡを含有する請求項４に記載の方法。 - 【請求項１４】 環境浄化のための遺伝子群を枯草菌ゲ
ノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝子群を環境
浄化微生物に由来するＤＮＡまたはランダムな合成ＤＮ
Ａで置換してさらに環境浄化に優れた遺伝子群を枯草菌
ゲノムに導入する請求項４に記載の方法。 - 【請求項１５】 さらに環境浄化に優れた遺伝子群が、
環境浄化のためのｐＨ, 温度、重金属浄化または圧力に
関し、優れたものである請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 免疫グロブリン遺伝子または免疫グロ
ブリンの可変領域重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮＡ
を枯草菌ゲノムに挿入し、次いで形質転換により該遺伝
子のＤＮＡ再編成で生じるＤＮＡ断片またはランダムな
合成ＤＮＡで置換して所望の免疫グロブリン遺伝子また
は免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖をコードするＤＮ
Ａを枯草菌ゲノムに導入する請求項４に記載の方法。 - 【請求項１７】 動物または植物の高頻度反復配列また
は中頻度反復配列を含有するＤＮＡ断片を枯草菌のゲノ
ムに挿入し、次いで形質転換により動物または植物のゲ
ノムに由来する該反復配列を含有するＤＮＡ断片で置換
してゲノムＤＮＡライブラリーを作成する方法。 - 【請求項１８】 動物または植物に由来する遺伝子ＤＮ
ＡをゲノムＤＮＡに挿入した枯草菌の形質転換により、
該遺伝子ＤＮＡに類似した遺伝子ＤＮＡを枯草菌ゲノム
に導入し、次いで所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを選
択し、さらに所望の性質を有する遺伝子ＤＮＡを動物ま
たは植物に導入して得られるトランスジェニック動物ま
たは植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11125648A JP2000316576A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 枯草菌組換え体およびその作成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11125648A JP2000316576A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 枯草菌組換え体およびその作成法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000316576A true JP2000316576A (ja) | 2000-11-21 |
Family
ID=14915230
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11125648A Pending JP2000316576A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 枯草菌組換え体およびその作成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000316576A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007111015A (ja) * | 2005-10-24 | 2007-05-10 | Kao Corp | 宿主ｄｎａの欠失対象領域の欠失方法 |
-
1999
- 1999-05-06 JP JP11125648A patent/JP2000316576A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007111015A (ja) * | 2005-10-24 | 2007-05-10 | Kao Corp | 宿主ｄｎａの欠失対象領域の欠失方法 |
| JP4721868B2 (ja) * | 2005-10-24 | 2011-07-13 | 花王株式会社 | 宿主ｄｎａの欠失対象領域の欠失方法 |
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