KR101997841B1

KR101997841B1 - SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로 및 이의 초고속 탐색방법

Info

Publication number: KR101997841B1
Application number: KR1020160146853A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 박종현; 이용재
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2019-07-08
Also published as: KR20180050092A

Abstract

본 발명은 목적 유전자의 초고속 탐색 기술의 정확도를 높여주기 위한 SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로에 관한 것으로, 본 발명의 효소의 초고속 탐색을 위한 유전자 회로는 목적 단백질의 발현이 일찍 포화되는 것을 방지할 수 있어 FACS 상에서 결과 범위를 현저히 넓혀, 초고속 유세포 분리기(FACS) 등을 통한 효소의 초고속 탐색 기술의 정확도를 높여서 생명공학, 의학 및 산업적으로 유용한 단백질을 탐색하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로 및 이의 초고속 탐색방법{Genetic Circuit Containg SoxRS varient and Screening Method of thereof}

본 발명은 목적 유전자의 초고속 탐색 기술의 정확도를 높여주기 위한 SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로, SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리를 이용한 유전자 회로의 탐색방법에 관한 것이다.

최근 단백질공학 분야에서는 목적에 따라 기존의 단백질 특성이 향상된 변형체를 찾기 위한 탐색(screening)이 활발히 이루어지고 있다. 특히, 다수의 변형체를 생산한 후에 이로부터 원하는 특성을 갖는 변형체를 찾아내는 초고속 탐색 기술 (high-throughput screening)의 개발이 활발히 진행되고 있다. 초고속 탐색에 있어 핵심 기술은 단백질의 표현 형질과 이의 유전적 정보가 물리적으로 연결되어 있어 단백질의 특성으로 초고속 탐색을 진행하고 탐색된 단백질의 유전적 정보를 알아내는 것이다.

최근에 다양한 기질을 갖는 P450의 산화활성은 산업 분야에서 그 쓰임이 매우 유용하다. 구체적으로 P450은 힘(heme) 분자를 포함하는 산화효소이며 생물체내에서 다양한 내인성 및 외인성 물질의 산화작용을 수행한다. 따라서 기존의 야생형 P450 보다 활성이 증가되거나 새로운 활성을 갖는 변이체의 발굴이 꼭 수반되어야 한다. 아직까지 초고속 탐색을 통한 P450의 변이체 발굴이 이루어진 적이 없고, 본 발명의 유전적 회로는 특정 P450이 아닌 모든 P450에 적용이 가능한 방법이므로 향후 P450의 활용에 있어서 큰 도움이 될 것이다. 또한, 본 발명에서는 SoxRS 유전자 회로를 P450의 변이체 발굴을 위해 이용하지만, SoxRS로 구성된 유전적 회로는 P450 및 NADPH를 소모하며 활성을 갖는 모든 효소에 적용될 수 있다.

효소의 경우는 활성이 지속되는 것이 아니어서 초고속 탐색에 어려움을 겪고 있다. 따라서 효소의 초고속 탐색을 위해서는 효소의 활성을 지속적으로 나타내는 방법이 요구된다. 이를 극복하고자 효소의 활성을 형광신호로 바꾸어 주는 유전자 회로(genetic circuit)를 제작하여, 초고속 유세포 분리기 (Fluorescence activated cell sorter, FACS) 등을 통한 효소의 탐색 방법이 개발되었다.

유전자 회로에서 효소의 활성에 따라 발생하는 생성물 혹은 부산물을 인지하여 단백질의 발현을 조절하는 것은 중요하다. SoxRS 유전자 회로는 대장균 내에서 세포 내로 침입하는 활성산소에 대한 방어 기작으로 사용되는 유전자 회로로, 활성산소를 인지하여 이를 방어할 수 있는 단백질 생산을 조절한다(Proc Natl Acad Sci USA.1996 Wep 19;93(19):10094-10098). 따라서 SoxRS가 P450의 활성에 따라 발생하는 중간 부산물인 활성산소를 인지하여 형광단백질이 발현되도록 유전자 회로를 재조합한다. 상기 재조합 유전자 회로는 활성산소에 비례하여 형광 단백질이 발현되는 것이 확인되었다. 따라서 이러한 SoxRS 유전자 회로는 FACS를 이용한 효소의 초고속 탐색 기술로 이용될 수 있다고 보고되어있다(ACS synth Biol.2014 Jan 17;3(1):41-7). 그러나 SoxRS 유전자 회로는 목적 단백질의 발현이 일찍 포화되어 FACS 상에서 결과 범위(dynamic range)가 좁아 초고속 탐색에 어려움이 있다. 목적 단백질의 발현이 일찍 포화되면, 스크리닝을 진행할 때에 false positive를 유발할 수 있어서 탐색을 제대로 할 수 없고, 프로모터의 결과범위가 좁으면 효소의 반응에 따른 목적단백질의 발현이 비례하게 증가하기 어렵다. 따라서 유전자 회로에서 효소의 활성에 따른 형광신호의 변화의 폭이 좁아 초고속 탐색이 부정확하게 될 가능성이 높다.

이에, 본 발명자들은 효소 변이체로부터 원하는 특성을 갖는 변이체를 찾아내는 초고속 탐색 기술의 정확도를 높이고자 예의 노력한 결과, SoxRS 유전자 회로를 제작하고, 상기 유전자 회로를 포함하는 미생물을 이용할 경우, 원하는 특성을 갖는 효소를 정확하게 감지할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 효소의 초고속 탐색 기술의 정확도를 높여주는 SoxRS 변이체를 함유하는 유전자 회로를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SoxRS 유전자 회로 및 목적 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 함유하는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리와 목적 유전자를 함유하는 재조합 미생물 라이브러리를 이용한 유전자 회로의 초고속 탐색방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SoxR 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, SoxR 유전자, SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 및 SoxS 유전자를 포함하는 SoxRS 변이체 유전자 회로에 있어서, 상기 SoxR 유전자와 상기 유전자간 부위는 i) 서열번호 1로 표시되는 SoxR 변이체 유전자를 가지거나, ii) 서열번호 2로 표시되는 유전자간 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 SoxRS 변이체 유전자 회로를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SoxRS 유전자 회로에 목적 유전자를 추가로 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 함유하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리 각각에 목적유전자가 함유되어 있는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물 라이브러리와 목적 단백질 발현 유도제(inducer)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 목적 단백질의 활성을 분석하여 목적 단백질의 활성이 증가된 유전자 회로를 선별하는 단계를 포함하는 유전자 회로의 초고속 탐색방법을 제공한다.

본 발명의 SoxRS 변이체 유전자 회로는 목적 단백질의 발현이 일찍 포화되는 것을 방지하므로 FACS상에서 결과범위를 현저히 넓힌다. 따라서, 초고속 유세포 분리기(FACS) 등을 통한 효소의 초고속 탐색 기술의 정확도가 높아져서 생명공학, 의학 및 산업적으로 유용한 단백질을 탐색하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 목적으로서 효소의 초고속 탐색을 가능하게 할 수 있는 유전자 회로 (genetic circuit)를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 SoxRS 유전자 회로와 P450의 반응 메커니즘에 관한 모식도이다. (a): SoxRS 유전자 회로의 작동 원리를 나타낸 모식도이고, (b): P450의 반응 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 3는 본 발명에서 사용된 SoxRS 유전자 회로에 의해 발현되는 GFP의 활성을 나타낸 것이다. (a): SoxRS 유전자 회로에서 SoxS 단백질을 발현하는 부분만 제거한 SoxS의 일부분(SoxS'로 표시)을 포함하고 SoxS 하류(downstream)에 형광단백질인 sfGFP의 유전자를 포함하는 유전자 회로를 나타낸 것이다. (b): 상기 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도를 처리하였을 때 발현한 형광 단백질의 양을 나타낸 것이다. (c): 도 3b의 실험을 FACS를 통해 형광을 분석한 결과이다.
도 4는 야생형의 SoxRS 유전자 회로보다 FACS 상에서 결과범위가 넓어진 SoxRS 변이체 유전자 회로를 초고속 탐색으로 찾기 위한 전략을 나타낸 모식도이다.
도 5은 도 4의 방법으로 진행한 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리의 선별 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리에 대한 초고속 탐색의 결과로 얻어진 변이체 SoxRSm1(mutant#1)과 이것에서 파생된 SoxRSm2(mutant#2), SoxRSm3(mutant#3)의 모식도이다.
도 7은 야생형의 SoxRS 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물과 SoxRSm3(mutant#3)의 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도를 처리하였을 때 발현한 형광의 세기를 FACS를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형의 SoxRS 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물과 SoxRSm3(mutant#3)의 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도를 처리하였을 때 발현한 형광의 세기를 FACS를 통하여 분석하여 형광 수치를 나타낸 것이다.
도 9는 야생형의 SoxRS 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물과 SoxRSm3(mutant#3)의 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도를 처리하였을 때 발현한 형광의 세기를 FACS를 통하여 분석하여 형광 수치를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 야생형의 SoxRS 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물과 SoxRSm3(mutant#3)의 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도를 처리하였을 때 발현한 형광단백질을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 효소의 초고속 탐색을 위하여 SoxRS 유전자 회로의 FACS 상에서 결과범위를 넓히기 위해 SoxRS 변이체 유전자 회로를 제작하였다.

상기 SoxRS 변이체 유전자 회로와 목적 유전자를 함유하는 재조합 미생물 라이브러리를 제작한 후 FACS를 이용한 초고속 스크리닝을 통해 SoxRSm1, SoxRSm2 및 SoxRSm3이 기존 야생형 SoxRS 유전자 회로에 비해 형광단백질 발현이 일찍 포화되지 않고 낮은 활성 산소 농도에서 비특이적으로 형광단백질이 발현되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 야생형의 SoxRS 유전자 회로에 비해 형광이 약 4배 정도 높아진 것을 확인하여 FACS 상에서 결과범위가 넓어진 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SoxR 변이체 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 변이체에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, SoxR 유전자, SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 및 SoxS 유전자를 포함하는 SoxRS 변이체 유전자 회로에 있어서, 상기 SoxR 유전자와 상기 유전자간 부위는 i) 서열번호 1로 표시되는 SoxR 변이체 유전자를 가지거나, ii) 서열번호 2로 표시되는 유전자간 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 SoxRS 변이체 유전자 회로에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 SoxRS 유전자 회로는 서열번호 3~5 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명의 상기 SoxR 변이체는 SoxR 유전자 서열 중 5개의 변이를 포함하고, SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위는 DNA 서열 중 2개의 변이를 포함한다. 상기 유전자 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 예는 에러-유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling) 방법, 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법 등이 있다.

상기 SoxR 유전자 부분은 SoxR 단백질을 항시 발현하고 있다. 상기 SoxR 단백질은 활성산소 및 NADPH를 사용하며 반응을 하는 효소의 중간 산물(by-product) 등을 인지할 수 있다. 본 발명에서는 SoxR 단백질은 활성산소를 인지하여 SoxR-활성산소 복합체를 형성하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 복합체는 SoxS 유전자 부분을 자극하여 목적 단백질이 발현되게 한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 SoxRS 변이체 유전자 회로에 목적 유전자를 추가로 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 함유하는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 SoxRS 변이체 유전자 회로는 목적 유전자를 추가로 함유할 수 있고, 상기 목적 유전자는 SoxS 유전자 하류에 위치하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 SoxRS 변이체 유전자 회로는 리보솜 결합부위를 추가로 포함할 수 있다.

상기 SoxS 유전자는 SoxS 단백질 발현부위가 일부 제거되어 있는 것을 특징으로 하고 하류에 목적 유전자 등을 포함할 수 있다. 본 발명은 목적 유전자로 형광 단백질 유전자를 포함하고, 구체적으로 상기 형광 단백질은 sfGFP를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 이용한 대장균 균주 및 플라스미드는 하기 표 1과 같다.

균주/플라스미드		관련된 특징
대장균 균주	XL1-Blue	recA1,endA1,gyrA96,thi,hsdR17,suppE44,relA1,l ^- ,lac ^- , F'[proAB lacl ^q lacZ ΔM15 Tn10 (Tet)^r]
플라스미드	pUC19	Amp^R,pBAD322origin
	pSG19	pUC19 derivative, SoxRS-sfGFP gene
	pSG19N+	pSG19 derivative, NcoI site was added between SoxRS and sfGFP

본 발명에서 균주는 대장균 균주를 포함하고 있고, 플라스미드는 pUC19, pSG19 및 pSG19N+를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리의 각각에 목적유전자가 함유되어 있는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물 라이브러리와 목적 단백질 발현 유도제(inducer)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 목적 단백질의 활성을 분석하여 목적 단백질의 활성이 증가된 유전자 회로를 선별하는 단계를 포함하는 유전자 회로의 초고속 탐색방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 유전자 회로 변이체 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 예는 에러-유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling) 방법, 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법 등이 있다.

본 발명에서 상기 유도제(inducer)는 활성산소 및 NADPH를 사용하며 반응을 하는 효소의 중간 산물(by-product)를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 선별하는 단계는 FACS를 통해 negative sorting과 positive sorting을 반복하는 초고속 탐색기술을 포함한다. 자세히는, 활성산소가 없을 때 비특이적으로 발현되는 형광신호를 방지하기 위한 negative sorting을 수행하기 위하여, 라이브러리를 배지에서 배양한 후 OD600이 0.6에 도달할 때 활성산소가 없는 조건에서 추가 배양한 후 FACS를 통해 선별한다. 이후 활성산소를 추가하여 배양한 후, FACS를 통해 비교적 높은 형광신호를 낼 수 있는 유전자 회로를 찾기 위한 positive sorting을 진행한다. 이러한 일련의 과정을 4번 거쳐 스크리닝을 한 후, 얻어진 유전자 회로들을 분석하여 FACS 상에서 결과범위가 넓은 유전자 회로를 선별한다. 상기 유전자 회로는 높은 활성산소 수치에도 일찍 포화되는 야생형 유전자 회로에 비해 활성산소 농도에 비례하게 계속 형광 수치가 높아지는 결과가 나타났다(도 9). 또한, 야생형의 SoxRS 유전자 회로보다 본 발명의 SoxRS 변이체 유전자 회로의 형광이 약 4배 정도 증가하였으며, 활성산소가 없을 때는 형광이 약간 감소하는 결과가 나타났다(도 8). 즉, 본 발명의 SoxRS 변이체 유전자 회로가 FACS 상에서 결과범위가 넓어진 결과가 나타났다(도 7).

상기 SoxRS 변이체 유전자 회로와 실질적 활성이 동등하거나 유사한 상동성을 갖는 유전자 회로 또한 본 발명의 효소의 초고속 탐색용 SoxRS 유전자 회로의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명에서 "상동성"이란 천연형(wild type) 또는 동일 활성을 갖는 변이체의 핵산 서열과의 동일성을 나타내는 것으로, 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상기 유전자 회로 서열과의 상동성은 본 발명에서 효소의 초고속 탐색을 위한 활성을 보유하는 한, 본 발명에서 유래된 핵산 서열과 균등한 것임은 당업자에게 자명하다. 이러한 상동성 서열은 본 발명의 서열번호 3~5로 기재되는 핵산 서열과 바람직하게는 70% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 동일한 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에서 "유전자간 부위"란 유전자가 모여 있는 부분 사이에 위치한 DNA 서열을 나타내는 것으로, 유전자간 부위는 몇몇의 유전자를 포함하고 있거나 유전자가 위치해있지 않다.

본 발명에 사용된 SoxRS 유전자 회로는 SoxR 유전자, SoxS 유전자 및 상기 SoxR 유전자와 상기 SoxS 유전자간 부위 (intergenic region)을 포함하고 있다. 상기 SoxR 유전자는 SoxR 단백질을 항시 발현하고 있다. 상기 SoxR 단백질은 활성산소 및 NADPH를 사용하며 반응을 하는 효소의 중간 산물(by-product) 등을 인지할 수 있다. 본 발명에서는 SoxR 단백질은 활성산소를 인지하여 SoxR-활성산소 복합체를 형성하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 복합체는 하류의 SoxS 유전자 부분을 자극하여 SoxS 단백질이 발현되게 하였다(도 2a). 본 발명의 SoxRS 변이체 유전자 회로는 SoxS 단백질을 발현하는 부분만 제거한 SoxS의 일부분(SoxS'로 표시)만을 포함하고, 하류에 목적 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 SoxRS 변이체 유전자 회로는 효소의 초고속 탐색을 가능하게 한다. 세포 내에서 효소 반응에 의해 생성되는 생성물이나 중간 산물이 형광 단백질과 같은 목적 단백질을 발현시키는 유도 물질이 되어 효소 반응에 특이적으로 세포가 표지를 나타내게 하는 방법이다(도 1).

본 발명에서 상기 효소는 모든 P450 및 NADPH를 소모하며 활성을 갖는 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 시트크롬 P450(cytochrome P450, 이하 P450)를 포함하고 있다. 상기 P450은 활성 회로에서 중간 부산물로 활성산소를 생성한다(도 2b).

본 발명에서 유전자 회로는 목적 유전자 뿐만 아니라, 바람직하게는, 목적 단백질의 발현을 용이하게 해주는 RBS (Ribosome Binding Site) 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있다. 즉, 단백질의 발현을 조절하는 부위로써, 프로모터 이외에도 RBS 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있는 것이다. 예를 들면, 숙주인 대장균에서 목적 단백질의 발현을 용이하게 하기 위하여 대장균용 RBS(RBSε), 또는 모든 균주에 통합적으로 사용가능한 RBS(RBSx)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 형광 단백질은 GFP, GFP UV, sfGFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "벡터(Vector)"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

일반적으로 플라스미드 벡터는 염색체 외의 환형 이중가닥 DNA이고, 세포 내에 존재하며 다양한 기능을 한다.

항생물질에 내성을 가진 물질 및 박테리오신(Bacteriocin)을 생산하여 유사한 균주나 종들을 죽이는 저해 물질로 작용하고, 색소 생성, 화합물 분해, 질소 고정과 같은 생리학적 기능을 수행한다. 최고 약 10kb되는 길이의 외래 DNA 절편을 삽입하기 위해서 제한효소 부위를 가지고 있다.

벡터로 사용되는 플라스미드와 박테리오파지의 중대한 단점인 상대적으로 작은 DNA 절편만 삽입할 수 있는 것은 플라스미드와 파지 DNA의 조작된 혼성체인 코스미드(Cosmid)를 사용하여 더 큰 DNA 절편을 클로닝 할 수 있다.

파지 입자 안으로 포장되어 들어가는 코스(cos) 부위가 있고, 세균 숙주에서 복제하는 플라스미드의 복제 시작점과 플라스미드를 선별할 수 있는 유전자를 가지고 있다. 박테리오파지 벡터 같이 시험관 내에서 단백질 외피로 포장되지만, 포장된 DNA가 대장균 숙주세포를 감염한 후에, 그 DNA는 박테리오파지 DNA보다는 플라스미드 형태로 복제하고, 용균되지 않는다. 크기는 2.5kb, 숙주세포를 감염하여 포장된 후에 cos 부위가 37kb에서 52kb까지 분리되면, 외래 DNA를 삽입체로 수용한다. 일반적으로 35kb에서 45kb가 코스미드 벡터(Cosmid vector)로 클로닝 될 수 있다.

또한 박테리오파지의 벡터의 일반적인 형태인 파지의 경우는 염기쌍을 이룰 수 있는 12개 뉴클레오티드의 단일 가닥의 상보적인 말단으로 된 점착성 말단(cohesive termini) 혹은 cos를 가지는 50kb의 이중가닥으로 된 야생형 게놈에서 비롯된 것으로 용균성 경로에서 숙주세포는 새로운 바이러스가 복제되고, 자손 바이러스가 방출된 후에 융균된다. 이 형태의 DNA는 전체 52kb 크기에 3kb를 더하거나 그 게놈의 5% 만도 수용할 수 있으며, 외래DNA를 위한 공간을 만드는 벡터는 비필수적인 DNA 조각이 제거된 형태이다.

본 발명과 관련된 벡터는 SoxRS 변이체 유전자 회로의 벡터로, 플라스미드 벡터(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79 및 pUC19 등), 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터(예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등), 바이러스 벡터 등을 포함한다.

바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV), 생쥐백혈병 바이러스(Murine leukemia virus, MLV), 백혈증 바이러스(Avian sarcoma and leukosis virus, ASLV), 비장괴사바이러스(Spleen necrosis virus, SNV), 라우스육종바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 마우스 유방암 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 SoxR 변이체, SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 변이체 및 SoxS 유전자로 이루어진 SoxRS 변이체 유전자 회로 핵산 서열과 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 "조절 요소"란 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현벡터는 조절 요소로 본 발명의 유전자 회로를 필수적으로 포함하고, 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서(enhancer), 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다.

폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 핵산 서열이다. 신호서열에는 숙주가 에스케리키아(Escherichia) 속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스 속 균인 경우에는 -아밀라아제 신호서열, 서브틸리신(Subtilisin) 신호서열 등을, 숙주가 효모인 경우에는 MF(Mating factor ) 신호서열, SUC2 신호서열 등을, 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 벡터는 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제 개시점(replication origin)을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질 전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질 전환된 세포를 선별 가능하다. 선택 마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커(auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "숙주세포"란 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 숙주세포는 외부 DNA를 받아들일 수 있는 수용성(competence) 상태에서, 벡터와 같은 외부 DNA가 삽입될 수 있는데, 벡터가 숙주세포에 성공적으로 도입되면, 해당 벡터의 유전형질을 숙주세포에 제공하게 된다.

바람직하게 본 발명의 숙주 미생물은 그람 음성 균일 수 있으며, 상기 그람음성균은 살모넬라 속(Salmonella sp.), 아시네박터 속(Acinebacter sp.), 에스케리아 속(Escherichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 또는 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 균주 등을 포함하고, 예를 들면, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 아시네박터 칼코아세티쿠스(Acinebacter calcoaceticus), 대장균(E. coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 크렙시엘라 아에로제네스(Klebsiella aerogenes), 아시네박터 바우마니 또는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)등을 포함하나, 상기 예에 의해 본 발명의 벡터가 형질전환될 수 있는 숙주세포가 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명에서는 대장균(E. coli)를 숙주세포로 사용하였고, 더 바람직하게는 대장균(E. coli) XL1-Blue에 본 발명의 벡터를 형질전환시켜 SoxRS 변이체 유전자 회로의 활성을 확인한 결과, 형광 유전자 발현이 야생형 SoxRS 유전자 회로를 사용하는 경우에 비해 증가함을 확인하였다(도 8).

숙주 세포에 벡터를 도입하는 방법은 형질전환 방법이 이용될 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂침전법, CaCl₂방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원 물질을 사용함으로써 효율을 높인 하나한(Hanahan)방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아(Agrobacteria) 매개된 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트(Dextran sulfate), 리포펙타민(lipopectamine) 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 플라스미드를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서는 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 SoxRS 변이체 유전자 회로와 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 상기 서술한 바와 같이 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터에 제한효소 및 중합효소 연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 제조할 수 있다. 또한 제조된 벡터는 일반적인 형질 전환 방법으로 숙주세포에 도입함으로써 제조될 수 있으며, 본 발명에서는 대장균(E.coli) XL1-Blue에 도입하여 형광 단백질 발현량을 측정하였다.

또한, 상기 방법으로 형질전환된 숙주세포는 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 사용되는 배양 방법을 통하여 배양될 수 있으며, 사용될 수 있는 배지 및 배양기간은 필요에 따라 당업자에 의해 임의적으로 선택될 수 있다.

바람직하게 본 발명은 형질 전환된 대장균 균주를 LB(Luria Bertani) 배지에서 12시간 동안 배양한 후 재조합 유전자들로부터 형광 단백질의 생산을 유도하기 위하여 2시간 동안 추가 배양하였다.

상기 배지는 기술 분야에 일반적으로 사용될 수 있는 다양한 배지가 적용 가능할 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 SoxRS 변이체 유전자 회로로 형질전환된 미생물은 효소의 중간산물을 감지할 수 있는 감지 미생물(sensing microorganism)이 된다. 상기 효소는 모든 P450 및 NADPH를 소모하며 활성을 갖는 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 시트크롬 P450(cytochrome P450, 이하 P450)을 사용하였다.

SoxRS 변이체 유전자 회로 및 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 재조합 미생물에 임의의 활성산소 또는 NADPH를 사용하며 반응을 하는 효소의 중간산물을 처리하면 세포 내 SoxRS 변이체 유전자 회로의 기능 및 활성도에 따라서 상기 목적 단백질의 농도가 변화하게 된다. 따라서 SoxRS 변이체 유전자 회로의 발현 조절 기능에 의한 형광 등 리포터의 정량적 증가를 형광분석기 등 다양한 측정기술을 이용하여 탐색하면 세포내외의 SoxRS 변이체 유전자 회로의 발현 조절을 탐색할 수 있는 측정방법을 제공하게 된다.

본 발명에서, 상기 형광 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 형광 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석 (FACS)을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명에서 제작한 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리 각각에 목적유전자가 함유되어 있는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물 라이브러리의 초고속 탐색 결과, 야생형 SoxRS 유전자 회로를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물에 비해 형광 단백질이 일찍 포화되지 않고 동적 범위가 넓어진 유전자 회로를 얻을 수 있다(도 7).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: SoxRS 유전자 회로 및 형광단백질 유전자 재조합

SoxRS 유전자 회로는 대장균의 염색체에 프라이머 SoxRS-XbaI-F와 SoxRS-R을 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)으로 확보하였다. 형광 단백질 sfGFP의 유전자는 PRM GFP(Addgene plasmid 40127) 유전자에서 프라이머 SoxRS-sfGFP-F와 sfGFP-HindIII-R을 이용해 PCR로 확보하였다. 상기 SoxRS 유전자와 sfGFP 유전자는 서로 중첩되는 부분이 있도록 설계하였다. SoxRS-sfGFP 복합 유전자 상기 SoxRS 유전자 회로와 sfGFP 유전자에서 프라이머 SoxRS-XbaI-F, sfGFP-HindIII-R을 이용하여 중첩 PCR (overlap PCR)로 제작하였다. 상기 SoxRS-sfGFP 복합 유전자 및 pUC19 벡터를 제한효소 XbaI과 HindIII로 절단한 후 ligase를 이용하여 접합(ligation)시켰다(도 3a). 접합된 플라스미드(pSG19)는 대장균 균주 XL1-Blue에 형질전환(transformation)하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 표 2와 같다.

SoxRS-XbaI-F	ATGCTCTAGATACCAGCGGGATAGAGAGAAAGACAAAGAC(XbaI)* (서열번호 6)
SoxRS-R	GATATCAAAAATCGGACGCTCG (서열번호 7)
SoxRS-sfSGF-F	CGAGCGTCCGATTTTTGATATCTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTT (서열번호 8)
sfGFP-HindIII-R	GCATAAGCTTATCAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTAGAGCTCATCCATGC(HindIII) (서열번호 9)

* 프라이머에 포함된 제한효소 부위는 밑줄로 표시하였다.

실시예 2: 배양 조건 및 활성산소를 통한 단백질 발현 확인

실시예 1에서 제작한 SoxRS-sfGFP의 재조합 유전자를 포함한 대장균 균주 XL1-Blue는 100 μg/mL의 항생제 ampicillin을 함유하는 LB (Luria-Bertani) 배지에 접종하여 37 ℃, 200 RPM 조건에서 약 12시간 동안 배양한 후 신선한 LB 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일 조건에서 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때 상기 재조합 유전자들로부터 형광 단백질의 생산을 유도하기 위하여 다양한 농도의 PMS (Phenazine methosulfate)(배지 내에서 활성산소를 발생시키는 화학물질)를 첨가한 후, 30 ℃, 200 RPM 조건에서 2시간 동안 대장균을 추가 배양하였다. 이후 4 ℃, 6000 RPM 조건에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 대장균을 얻었다.

상기 재조합 유전자를 포함하는 대장균들은 버퍼(buffer)(100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4)로 재현탁(resuspension) 한 후 초음파 세포 파쇄기로 파쇄하였다. 상기 파쇄한 세포 현탁액을 4 ℃, 10000 RPM 조건에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 형광 단백질의 발현을 확인하기 위해 12%(w/v) sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)와 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 한 결과, 형광 단백질이 빨리 포화되는 것을 확인할 수 있었다(도 3b). 또한 대장균을 파쇄하지 않은 채로 FACS 분석을 통하여 형광 단백질의 발현을 확인한 결과, FACS 상에서 결과범위가 좁다는 것을 확인할 수 있었다(도 3c).

실시예 3: SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리 구축 및 초고속 탐색

SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리의 제작을 위하여 SoxRS와 sfGFP 유전자 사이에 인위적으로 제한효소 부위(NcoI)를 생성하였다. SoxRS-sfGFP 복합 유전자에 프라이머 SoxRS-XbaI-F, NcoI-R과 프라이머 NcoI-F, sfGFP-HindIII-R을 사용하여 PCR을 통해 두가지 생성물을 확보하였다. 상기 두가지 생산물의 중첩 PCR을 진행한 후, XbaI, HindIII로 절단하고 pUC19에 접합하여 NcoI 부위가 생성된 형태의 pSG19N+를 확보하였다. 상기 pSG19N+는 프라이머 SoxRS-XbaI과 SoxRS-NcoI-R을 이용하여 오류 유도 PCR (error-prone PCR)을 통해 SoxRS 유전자 회로의 무작위 변이를 일으켰다. 상기 유전자가 무작위로 변형된 SoxRS 유전자 회로 및 pSG19N+는 XbaI, HindIII로 절단 하고 접합시킨 후, 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리 각각에 목적유전자를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물 라이브러리를 제작하였다.

상기 재조합 미생물 라이브러리를 배양하여 초고속 탐색을 진행하였다. 활성산소가 없어도 비특이적으로 형광신호를 발현하는 유전자 회로를 제거하기 위하여 상기 실시예 2와 동일하게 배양한 라이브러리는 최초 활성산소가 없는 조건에서 추가 배양 후, FACS를 통해 negative sorting을 수행하였다. 제거되지 않은 대장균들은 배양한 후 50 nM의 PMS를 추가해서 추가 배양하고 FACS를 통해 positive sorting을 수행하였다. 이때, 높은 농도의 활성산소 조건에서 높은 농도로 형광 단백질을 발현시키는 유전자 회로를 확보하였다. 이어서 바로 재소팅을 진행하여 탐색의 정확성을 높혔다. 이러한 과정을 1라운드의 스크리닝으로 하여 얻어진 세포에서 SoxRS 변이체 유전자 회로를 PCR로 얻어 다음 라운드의 스크리닝을 수행하였다(도 4). 사용한 프라이머의 염기서열은 표 3과 같다. (서열번호 6, 서열번호 9의 프라이머를 사용하였다.)

NcoI-F	CCATGGTTGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC (NcoI)* (서열번호 10)
NcoI-R	CTTTGCTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTCAACCATGGGATATCAAAAATCGGACGCTCGGTGGT(NcoI) (서열번호11)
SoxRS-NcoI-R	GCATCCATGGGATATCAAAAATCGGACGCTCG(NcoI) (서열번호 12)

* 프라이머에 포함된 제한효소 부위는 밑줄로 표시하였다.

실시예 4: SoxRS 유전자 회로 발굴 및 분석

실시예 3의 스크리닝 과정을 4번 진행한 후(도 5), SoxRS 변이체 유전자 회로를 얻었다. 상기 유전자 회로들을 배양하여 PMS 농도(0 nM, 5 nM 및 50 nM)를 처리하고 FACS로 형광신호를 분석한 결과, FACS 상에서 결과 범위가 넓어진 변이체 SoxRSm1을 확보하였다. 상기 SoxRSm1은 SoxR 유전자 부위에 5개 염기, SoxR 유전자와 SoxS 유전자 사이 2개 염기가 변형된 것을 염기 서열 분석으로 확인하였다.

자세한 분석을 위하여 상기 SoxRSm1의 SoxR 유전자 부위에 염기만 변형된 SoxRSm2와 SoxR 유전자와 SoxS 유전자 사이 부위 염기만 변형된 mutatnt#3을 제작하였다(도 6). SoxRSm1에 프라이머 SoxRS-XbaI-F, RSibm-R과 프라이머 RSibm-F, SoxRS-NcoI-R을 이용해 PCR을 수행한 후, 각 생성물을 중첩 PCR을 하여 SoxRSm2을 확보하였다. pSG19N+에 프라이머 SoxRS-XbaI-F, RSim-R과 프라이머 RSim-F, SoxRS-NcoI-R을 이용해 PCR을 수행하여 얻은 생성물을 중첩 PCR을 하여 SoxRSm3을 확보하였다. 확보한 PCR 생성물들 및 pSG19N+는 XbaI, NcoI 효소로 절단한 후에 접합하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 표 4와 같다. (서열번호 6, 서열번호 12의 프라이머를 사용하였다.)

RSim-F	CCTCAAGCTAACTTGAGGAATTATGCTCCCCAACAGATGAATTAACG (서열번호 13)
RSim-R	GGGAGCATAATTCCTCAAGTTAGCTTGAGGTAAAGCGATTTATGGAAAAG (서열번호 14)
RSibm-F	CCTCAAGTTAACTTGAGGAATTATACTCCCCAACAGATGAATTAACG (서열번호 15)
RSibm-R	GGGAGTATAATTCCTCAAGTTAACTTGAGGTAAAGCGATTTATGGAAAAG (서열번호 16)

실시예 5: 최종 변형체 분석

실시예 4에서 얻어진 변이체 SoxRSm1, SoxRSm2 및 SoxRSm3의 발현 능력을 분석하기 위하여 야생형 SoxRS 유전자 회로 기반인 pSG19와 비교 분석을 수행하였다. 야생형의 SoxRS 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물과 SoxRSm3 유전자 회로를 가지는 재조합 미생물에 PMS 농도(0 nM, 0.1 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM 및 50 nM)를 처리하였을 때 FACS 상에서 결과범위를 분석하였다. 상기 분석 결과, 야생형의 SoxRS 유전자 회로 기반인 pSG19에 비해 변이체 SoxRSm3의 형광이 약 4배 정도 높은 것을 확인하였다(도 8). 즉, 변이체 SoxRSm3의 결과 범위가 넓어지는 것을 확인하였다(도 7 및 도 9). 또한, Western blotting 통하여 야생형 SoxRS 유전자 회로 기반 pSG19에 비해 변이체 SoxRSm3의 형광 단백질이 일찍 포화되지 않는 점과, 낮은 활성 산소 농도에서 비특이적으로 형광 단백질이 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 10).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Genetic Circuit Containg SoxRS varient and Screening Method of thereof <130> P16-B194 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SoxR Variant <400> 1 taccagcggg atagagagaa agacaaagac cggaaaacaa actaaagcgc ccttgtggcg 60 ctttagtttt gttcatcttc cagcaagcgt gcgccggtac cttcttctcc taagcggtcg 120 cccgggttac gcaacgggca atcactgcgc gaaaggcagc cacaaccaat acatccgtcc 180 agttcgtcac gcagcgccac taaggtatga atgcgccgat ccaactcttc tcgccattgg 240 gacgagagct gtttccactc tttcgcactt aacgtatgcc cttcgggcaa catgccaaac 300 gcttcaccaa tggtcgccag cgggatgcca atacgctgag caattttgat aattgcaaca 360 tatcgcaaca catcacgttt atatcaccgc tgattgccgc tgttacggat actggtaatc 420 aaccctttac tttcatagaa atgcagcgcc gataccgcca caccgctgcg tttcgccacc 480 tcgccggggg ttagcagcgc tttaatgcgg ggtaatttct tttccat 527 <210> 2 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant sequence between SoxR and SoxS <400> 2 aaatcgcttt acctcaagct aacttgagga attatgctcc ccaacagatg aattaacgaa 60 ctgaacactg aaaagaggca gattt 85 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SoxRSm1 <400> 3 taccagcggg atagagagaa agacaaagac cggaaaacaa actaaagcgc ccttgtggcg 60 ctttagtttt gttcatcttc cagcaagcgt gcgccggtac cttcttctcc taagcggtcg 120 cccgggttac gcaacgggca atcactgcgc gaaaggcagc cacaaccaat acatccgtcc 180 agttcgtcac gcagcgccac taaggtatga atgcgccgat ccaactcttc tcgccattgg 240 gacgagagct gtttccactc tttcgcactt aacgtatgcc cttcgggcaa catgccaaac 300 gcttcaccaa tggtcgccag cgggatgcca atacgctgag caattttgat aattgcaaca 360 tatcgcaaca catcacgttt atatcaccgc tgattgccgc tgttacggat actggtaatc 420 aaccctttac tttcatagaa atgcagcgcc gataccgcca caccgctgcg tttcgccacc 480 tcgccggggg ttagcagcgc tttaatgcgg ggtaatttct tttccataaa tcgctttacc 540 tcaagctaac ttgaggaatt atgctcccca acagatgaat taacgaactg aacactgaaa 600 agaggcagat ttatgtccca tcagaaaatt attcaggatc ttatcgcatg gattgacgag 660 catattgacc agccgcttaa cattgatgta gtcgcaaaaa 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ttatcgcatg gattgacgag 660 catattgacc agccgcttaa cattgatgta gtcgcaaaaa aatcaggcta ttcaaagtgg 720 tacttgcaac gaatgttccg cacggtgacg catcagacgc ttggcgatta cattcgccaa 780 cgccgcctgt tactggccgc cgttgagttg cgcaccaccg agcgtccgat ttttgatatc 840 840 <210> 5 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SoxRSm3 <400> 5 taccagcggg atagagagaa agacaaagac cggaaaacaa actaaagcgc ccttgtggcg 60 ctttagtttt gttcatcttc cagcaagcgt gcgccggtac cttcttctcc taagcggtcg 120 cccgggttac gcaacgggca atcactgcgc gaaaggcagc cacaaccaat acatccgtcc 180 agttcgtcac gcagcgccac taaggtatga atgcgccgat ccaactcttc tcgccattgg 240 gacgaaagct gtttccactc tttcgcactt aacgtatgcc cttcgggcaa cacgccaaac 300 gcttcaccaa tggtcgccag cggaatgcca atacgctgag caattttgat aattgcaaca 360 tatcgcaaca catcacgttt atatcgccgc tgattgccgc tgttacggat actggtaatc 420 aaccctttac tttcatagaa atgcagcgcc gataccgcca caccgctgcg tttcgccact 480 tcgccggggg ttagcagcgc tttaatgcgg ggtaatttct tttccataaa tcgctttacc 540 tcaagctaac ttgaggaatt atgctcccca acagatgaat 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11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctttgctcat atgtatatct ccttcttaaa gttcaaccat gggatatcaa aaatcggacg 60 ctcggtggt 69 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcatccatgg gatatcaaaa atcggacgct cg 32 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cctcaagcta acttgaggaa ttatgctccc caacagatga attaacg 47 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gggagcataa ttcctcaagt tagcttgagg taaagcgatt tatggaaaag 50 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cctcaagtta acttgaggaa ttatactccc caacagatga attaacg 47 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gggagtataa ttcctcaagt taacttgagg taaagcgatt tatggaaaag 50

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SoxR 유전자 변이체.
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 변이체.
SoxR 유전자, SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위 및 SoxS 유전자를 포함하는 SoxRS 변이체 유전자 회로에 있어서,
상기 SoxR 유전자와 상기 유전자간 부위는
i) 서열번호 1로 표시되는 SoxR 변이체 유전자를 가지거나,
ii) 서열번호 2로 표시되는 유전자간 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 SoxRS 변이체 유전자 회로.
제3항에 있어서, 서열번호 3~5 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 SoxRS 변이체 유전자 회로.
제4항의 상기 SoxRS 변이체 유전자 회로에 목적 유전자를 추가로 함유하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 목적유전자는 SoxS 하류에 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 리보솜 결합부위를 추가로 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터를 함유하는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법:
(a) 제8항의 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 목적 단백질을 수득하는 단계.
(a) SoxR 유전자, SoxS 유전자 및 상기 SoxR 유전자와 상기 SoxS 유전자간 부위를 포함하는 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리의 각각에 목적유전자가 함유되어 있는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물 라이브러리와 목적 단백질 발현 유도제(inducer)를 접촉시키는 단계; 및
(b) 목적 단백질의 활성을 분석하여 목적 단백질의 활성이 증가된 유전자 회로를 선별하는 단계를 포함하는 유전자 회로의 초고속 탐색방법으로,
상기 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리는
i) 서열번호 1로 표시되는 SoxR 변이체 유전자를 가지거나,
ii) 서열번호 2로 표시되는 SoxR 유전자와 SoxS 유전자간 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자 회로의 초고속 탐색방법.
제10항에 있어서, 상기 SoxRS 유전자 회로 변이체 라이브러리는 에러-유발 P CR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling) 방법, 위치-지정 돌연변이(site- directed mutagenesis) 방법 등으로 이루어진 군 중 어느 하나로 제조된 것을 특징으로 하는 유전자 회로의 초고속 탐색방법.
제10항에 있어서, 상기 목적 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 형광 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석 (FACS)로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.