JP3089036B2 - 一重鎖分子の過剰発現 - Google Patents

一重鎖分子の過剰発現

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Description

【発明の詳細な説明】
関連出願 本出願は、オオシマ（ohshima）等によって1993年３
月１日に出願された「一本鎖ステム−ループDNAの合成
方法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係
属中の米国特許出願第08/024676号の一部継続出願であ
り、この米国特許出願第08/024676号はさらに、「一本
鎖ステム−ループDNAの合成方法、その生成物、ならび
にその使用」という名称の係属中の米国特許出願第07/7
53111号の一部継続出願である。本明細書は、これらの
２件の特許出願（親出願）の双方の一言一句を、それら
の各件が以下に全編にわたって再度記載されているかの
ごとく、明確に包含するものである。 発明の分野 本発明は組換え体DNAの分野に関する。さらに詳しく
は、本発明はステム−ループ配列（ss−slDNA）を有す
る新規で有用な一重鎖DNAの合成方法に関する。本発明
はインビトロ及びインビボ合成方法に関する。さらに本
発明はこれらのss−slDNAを製造する複製ビークル（rep
licating vehicle）に関する。さらに、本発明はこれら
の新規な構造物に関し、これらの新規な構造物の使用を
開示する。さらに、標的タンパク質をコードする遺伝子
を用いた、または用いないss−slDNA増幅方法をも開示
する。さらにはまたss−slDNAを用いた遺伝子制御方法
を開示する。 背 景 逆転写酵素によって相補的DNA（cDNA）へと逆転写さ
れるRNA中間体を介して、ゲノムの一部の重複が生ずる
ことが判明している。この点については、ワイナー（We
iner）等のアニュアル・レビュー・オブ・バイオケミス
トリー（Ann.Rev.Biochem.）55、631（1986）を参照さ
れたい。結果として遺伝情報が逆流することは真核ゲノ
ムの進化の多様化に重要な役割を果すと考えられる。細
菌由来の逆転写酵素が最近発見されたことを考慮する
と、同様な機構が原核生物におけるゲノム進化の原因で
あるとみなされるものも非常にもっともなことだと思わ
れる。この点についてはイノウエ（Inouye）等のTIBS、
16、18（1991a）とイノウエ等による、アニュアル・レ
ビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ann.Rev.Microb
iol.）45、163（1991b）を参照されたい。逆転写酵素に
よるcDNA合成の結果生ずる遺伝子重複は進化中のゲノム
の多様化に重要な役割を果していると考えられる。 本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に伴って生じ
たものである。プラスミドDNAの複製に特有のss−slDNA
の合成が実証された。slDNAの形成は原核ならびに真核
生物の染色体DNA複製時に広く行われる。IR構造を伴う
染色体遺伝子要素は、IR構造の安定性とポリメラーゼの
性質によっては常にslDNAへと重複しやすいと考えられ
る。 反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対してはREP
として知られ、パリンドローム単位に対してはPUとして
知られる多くの逆方向反復（IR）構造が存在する（大腸
菌（E.coli.）中には約1000コピー）ことが判明してい
る〔ヒギンス（Higgins）等のネイチャー（Nature）29
8、760（1982）、ギルソン（Gilson）等、エンボ・ジャ
ーナル（EMBO.J.）３、1417（1984）及びギルソン等、
クヌレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids.Re
s.）19、1375（1991）〕。これらの構造はDNAポリメラ
ーゼＩを含む特定の細胞成分と会合して、染色体組織に
重要な役割を果すと考えられる〔ギルソン等、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ18、3941（1990）とギルソン
等、エンボ・ジャーナル３、1417（1984）参照〕。ヒト
ゲノムの約６％がAluと呼ばれる要素によって占めら
れ、Aluの転写生成物は実質的な第二構造を含むことが
判明している〔シメット（Simmett）等のジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）
266、8675（1991）参照〕。 slDNA合成はcDNA合成とは対照的にRNA中間体も逆転写
酵素活性も必要としないので、slDNAはcDNAよりも頻繁
に形成される。従って、slDNAはゲノム内に分散または
再配置された遺伝子要素を重複させることによって、原
核生物を真核生物の両方のゲノム進化においてcDNAと同
様な、重要な役割を果すと考えられる。 親出願は、双方とも、新規な一本鎖DNA構造物であるs
lDNAのインビボならびにインビトロでの合成方法、slDN
A構造物、ならびに他の各種の遺伝的構造物に関するも
のである。これらの親出願は、一本鎖部分にアンチ遺伝
子を保持しているslDNAにも関するものであり、このア
ンチジーンは、標的mRNAと結合してmRNAのタンパク質へ
の翻訳を阻害したり、二本鎖（ds）DNAと結合して三重
らせんを形成し、標的DNAの発現を阻害したりするアン
チセンスとなることができる。 本発明は、一本鎖DNA分子、特に、slDNA分子をこれま
で達成しえなかった高収率で過剰発現させることに関わ
るものであり、こうした構造を行う方法、ならびにこう
した目的を達成するための遺伝的構築物に関するもので
ある。 （上述の）slDNA構造物は、一本鎖のループと、二重
となった一本鎖の相補的な塩基からなる尾部から構成さ
れている。この尾部は、単一の５′末端と、単一の３′
末端で終端しており、一方の末端がもう一方の末端から
さらに延びて一本鎖のオーバーハング部となっていても
よい。 一本鎖の分子は不安定なことで有名であるという事実
からしても、本発明で一本鎖の構造物がこのような高収
率で生成しえたことは予期せざることであった。
【本発明の概要】
本発明によって、基本的な発見がなされた。ゲノムの
一部はゲノムから直接重複されることが判明した。判明
したこの遺伝子重複はRNA中間体も逆転写酵素も必要と
せず、DNA複製中に生ずる。 簡単に説明すると、本発明は新規で有用な一重鎖DNA
（ssDNA）分子の合成方法（又はプロセス）を提供す
る。この方法は一重鎖構造の合成を開始するために、DN
A逆方向反復（IR）と必要な成分との使用を含む。本発
明はまた、DNA逆方向反復を含む必要な成分からのこの
ようなssDNAの合成系をも提供する。本発明はさらに、
新規なssDNA分子の合成のための必要な成分の全てを含
む適切な複製ビークルを提供する。本発明はまた特有の
構造を形成する新規で有用なssDNA分子をも提供する。
この構造は相補的塩基鎖の二重DNAからなるステムを含
み、ステムはその端部の一つにおいて２個の末端、それ
ぞれ３′と５′末端を有し、他方の端部ではループ形成
ssDNAを有する。 本発明はインビトロまたはインビボでの方法及び系の
実施を含む。 本発明はまた改良された又は新規な生物学的性質を有
するタンパク質を形成する目的で遺伝子にランダムな突
然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分子の種々な
使用を開示する。他の重要な考えられる使用法は、本発
明ssDNA分子をDNAに加えて、安定性の高い三重鎖DNAを
形成することである。また本発明ssDNA分子のアンチセ
ンスDNAとしての使用である。他の使用法は単一プライ
マーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の適用であ
る。 本発明とその幾つかの実施態様を下記でさらに詳述す
る。 本発明の方法によるとssDNA内のアニールされた相補
的塩基の二重鎖DNAのステム部分を含む構造を有するssD
NA分子が製造される。このステムはその端部の一つにお
いてssDNA分子の５′と３′末端を形成し、他端部にお
いて２本のステム一重鎖を結合する非アニール塩基の一
重鎖からなるループを形成する。特定の実施態様では、
３′末端を端部に有する鎖は他方の鎖よりも長い。slDN
Aはタンパク質をコードしうるDNAセグメント、特に遺伝
子を含みうる。遺伝子はループと末端との間に配置され
る。遺伝子は突然変異を有する遺伝子でありうる。 slDNA合成に対して仮定される機構を図６のＡと図６
のＢに示す。この合成は概略的に下記の過程を含むと考
えられる:DNAの合成は複製開始部位にて始まり、第１鎖
（または“特定”もしくは“不特定”鎖）の複製は２本
鎖DNAの鎖の一方を鋳型として進行する（染色体DNAの複
製と同じ機構によって）〔トミザワ（Tomizawa）等、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・USA（Proc.Natl.A
cad.Sci.USA）、74、1865（1977）参照〕、そしてプラ
スミドを用いる場合には、IR構造を通しての進行は全プ
ラスミドの複製を生ずる。しかし、以下で詳述するよう
に、第１鎖合成が中断するまたはIR内で終了した場合
に、第１鎖の一部はループ構造を形成する（図６、工程
２〜３）。このループは連続DNA合成のプライミング部
位として機能する短い二重鎖部分を形成する。DNA鎖伸
長は新たに形成された３′端部から再開し、テンプレー
トとして発生期の第１鎖を用いて第２鎖（または“他方
の”鎖）を形成する。代替えの（または同時発生の）考
えられる合成過程は以下で説明する。このようにして、
テンプレート切換えによってDNA合成方向は逆になり、D
NAフラグメントを二重にする（図６、工程１〜４）。新
しく合成されたslDNA分子は親テンプレート鎖から解離
され、親テンプレート鎖は他の複製ラウンドを受けて他
のslDNAを形成する。slDNAを必要に応じて単離して精製
する。 本発明の他の実施態様では、DNA自己複製ビークル（s
elf−replicating vehicle）、例えば逆方向反復（IR）
構造を含むDNAフラグメントを挿入されたプラスミドを
提供する。このDNAフラグメントはssDNA合成のテンプレ
ートとして、及び適当なプライミング部位、例えば大腸
菌におけるColE1の複製始点として働く。IRはORの下流
に存在する。自己複製ビークルは適当なホスト（例えば
大腸菌）中で複製される。ホストは少なくとも１種のポ
リメラーゼを含んでテンプレートからssDNAを合成す
る。この特定の実施態様では、２種のポリメラーゼ、OR
からIRまでのssDNA部分、第１鎖の伸長に寄与する第1DN
Aポリメラーゼと、ssDNA鎖の残部もしくは第２鎖を合成
する第2DNAポリメラーゼが存在すると推定される。第１
鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニールされて一
重鎖非アニールループを形成する。その後に第２鎖の合
成が行われる。二重鎖DNAステムと反対端部の一重鎖ル
ープ構造とからなる、新しいDNA構造が合成される。こ
の新しいDNA構造に対して“ステム−ループ”または“s
lDNA"なる名称が設けられている。 他の特定の実施態様はプロモーター、特にlacプロモ
ーター−オペレーターが欠如した複製ビークルを提供す
る。それでもなお、以下で詳述するように、提案した合
成モデルを支持してslDNAが製造された。 プライミング部位とIRとの間のタンパク質をコードし
うる特定のDNA配列を含むようにプラスミドを構成する
ことができ、合成されたslDNAはDNA塩基配列またはその
突然変異を含むと考えられる。 また、本発明はslDNAを用いた遺伝子制御方法を提供
する。 本発明のslDNAは自己複製ビークルによって合成され
る必要はなく、IRと、ssDNA合成に必要な要素とを含
む、線状もしくは非線状のDNAセグメントから構成され
る適当なインビトロ系で合成されることができる。この
ような系を以下で説明する。 図１は本発明のプラスミド、pUCK106の説明図。 図２はpUCK19のXba I部位に挿入された215−bpのDNA
塩基配列を示す。 図３はpUCK106からのslDNAの形成とその特徴とを説明
するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を示
す。 図４はpUCK106からのslDNAのダイマー形成を説明する
ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。 図５はpUCK106からのslDNA塩基配列決定を説明する図
である。 （Ａ）はslDNAの５′端部のDNA塩基配列決定を説明す
る乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフで
ある。 （Ｂ）はslDNAのループ部分の５′端部塩基配列決定
を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオ
グラフである。 （Ｃ）はslDNAのループ部分の３′端部塩基配列決定
を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオ
グラフである。 （Ｄ）はslDNAの３′端部のDNA塩基配列の乾燥ポリア
クリルアミドゲルのオートラジオグラフである。 （Ｅ）はpUCK106からのslDNAの構造を説明する。 図６はslDNA合成の二つの可能なモデルを説明する図
である。 図７のレール１と３はサイズマーカーとしてのpBR322
のHae III消化体（digest）を示し、レーン２はpUC7か
らのslDNAを示す。 図８はslDNAを利用して、特定の遺伝子にランダムミ
ューテーションを導入する具体例を示す。 図９はプラスミドpUCK106d.P.O.、pUCK106d.P.O.−
Ｉ、及びpUCK106d.P.O.−IIを説明する図である。 図10はプラスミドpXX566の構築図である。 図11は実施例９−（３）におけるアンピシリン濃度と
コロニー数の関係を示す図である。 図12はプラスミドpUCKA106d.P.O.、pUCKAGT37、及びP
UCKACA37を説明する図である。 図13はプラスミドpMSTR37に挿入されている塩基配列
及びプライマーの位置を示す図である。 図14はプラスミドpYES2−８−106及びpYES2−９−106
の構築図である。 図15はpYES2−８−106,pYES2−９−106、及び生産さ
れたslDNAをSal Iで切断したときの生成断片を説明する
図である。 図16はslDNAの検出に用いた３種のプライマーの位置
を示す図である。 図17は、本発明のslDNAを過剰発現させるための複製
可能なビークルを構築する過程を示す模式図である。 図18は、最終構築物であるpHS2870を示す。 図19は、構築物pHS2870（約480bp）と、このpHS2870
のHind III制限部位に塩基49個のHind III断片を挿入す
ることによって構築されるpHS2870GTと称されるプラス
ミド（約500bp）の構築過程を示す模式図である。 図20は、pHS2870ならびにpHS2870GTから抽出したslDN
Aの電気泳動を示す。 図21は、大腸菌MC4100λpFTRlF′の構築過程を示す。 図22は、β−ガラクトシダーゼの発現レベルの検出を
示す。 プラスミドpUCK106はアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（ATCC）に受け入れ番号No.68679として寄託
されている。 プラスミドpUCK106ΔlacPOはATCCによって受け入れ番
号No.68680として寄託されている。
【実施例】
下記実施例は説明のためのものであり、本発明の如何
なる限定もを意図しないものである。これらの実施例で
は、全ての％は固体では重量％であり、液体では容量％
であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎり、摂氏度
によるものである。 便利さと簡潔さのために、実施例は図面に関連し、図
面の詳細な説明を提供する。 実施例 １ 図１はpUCK106（円形マップ）、以下に示すように製
造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中の白
抜きバー（open bar）はカナマイシン耐性遺伝子（Tn5
から）を表す上部右側に示す直線白抜きバーはXba I部
位に挿入した215−bpDNAフラグメントを表し、これは35
−bp逆方向反復（IR）塩基配列を含有している。中実矢
印（solid arrow）はIR構造を示す。中実円設定は複数
の始点（Ori）である。長い白抜き矢印ORからのDNA複製
の方向を示す。小さい白抜き矢印はlacプロモーター−
オペレーター（lacPO）の位置を示す。 図２はpUCK19のXba I部位に挿入された、配列表の配
列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるDNAより構
成される215−bpDNAフラグメントの塩基配列を示す。こ
のプラスミドはここではpUCK106と名づける。白抜き矢
印はIR塩基配列を示す。Hind III（AAGCTT）部位はIRの
中心を示す。 IR中の不適正位置はスペース内に挿入された不適正塩
基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペースによって
示す。 上記DNAフラグメント（IRを含む）は図２に示された
配列を有する。 実施例 ２ この実施例はpUCK106からのslDNAの形成とその特徴と
を説明する。 （Ａ） 大腸菌CL83をpUCK19,pUCK106のいずれかとpUCK
106ΔlacPOとによって形質転換し、プラスミドDNA画分
を形成した。DNA標本（リボヌクレアーゼＡ処理後）を
電気泳動のために５％アクリルアミドゲルに塗布した。
ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＡにお
いて、レーン１はサイズマーカーとしてのpBR322のHae
III消化体を示す。レーン２はpUCK19を収容する細胞か
らのDNA標本；レーン３はpUCK106;レーン４はpUCK106Δ
lacPOを示す。pUCK19はpUC19のカナマイシン変異体であ
る。 （Ｂ） pUCK106からのslDNAをポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって精製し、次に種々の制限酵素消化を行
った。消化体をポリアクリルアミド（５％）ゲル電気泳
動によって分析し、ゲルを臭化エチジウムによって染色
した。図３のＢにおいて、レーン１はサイズマーカーと
してのpBR322のHae III消化体；レーン２は消化されな
いslDNA;レーン３はXba Iによって消化されたslDNA;レ
ーン４はHind IIIによって消化されたslDNA;レーン５は
Pvu IIによって消化されたslDNAを示す。 （Ｃ） pUCK106からのslDNAの熱変性。精製slDNA（上
記のような）を10mM Tris−HCl（pH8.0）と1mM EDTA
中に溶解した。このslDNA溶液を沸とう水浴中で３分間
インキュベートし、氷浴中で急冷した。サンプルをＡに
述べたように分析した。図３のＣにおいて、レーン１は
サイズマーカーとしてのpBR322のHae III消化体；レー
ン２は熱処理なしのslDNA;レーン３は熱変性後に急冷し
たslDNAを示す。 このslDNAは、塩基53個のループ、塩基約440個のステ
ム、ならびに塩基15〜18個のオーバーハングした３′尾
部を有している。 実施例 ３ この実施例はpUCK106からのslDNAのダイマー形成を説
明する。 （Ａ） 実施例２について述べたようなpUCK106からの
精製slDNAを10mM Tris−HCl（pH8.0）、150mM NaCl及
び10mM MgCl2中に溶解した。このslDNA溶液を沸とう水
浴中で３分間インキュベートしてから、徐々に冷却す
る。再結合（renatured）DNAをXba Iによって消化さ
せ、このようにして生じたDNAフラグメントをそれらの
末端において〔γ−32P〕ATPとT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼによって標識した。これらの生成物を５％ポリアク
リルアミドゲルに塗布した。電気泳動後に、ゲルを乾燥
させ、このゲルにオートラジオグラフィーを実施した。 図４のＡにおいて、レーン１はサイズマーカーとして
のpBR322のHae III消化体；レーン２はサイズマーカー
としてのλDNAのEcoR IとHind III消化体；レーン３は
処理なしのpUCK106からのslDNA;レーン４は非処理slDNA
のXba I消化体；レーン５は熱変性後に徐冷したslDNA;
レーン６はレーン５からのslDNAのXba I消化体を示す。
帯を右手側において“a"から“e"までマークを付した。 （Ｂ） 図４のＡ中のフラグメント“d"の特性化（図４
のＢ）。フラグメント“d"はゲルから精製した。レーン
３は精製フラグメント“d"のHind III消化体；レーン４
では精製フラグメント“d"は図３に関して述べたように
熱変性し、急冷した。 （Ｃ） （Ａ）と（Ｂ）に示した“a"〜“b"帯の概略図
（図４のＣ）。ＸとＨはそれぞれXba IとHind IIIを示
す。Xba I部位に非常に近接したバンド“a"中に２個の
他のHind III部位があり、これはバンド“c"中にある。
これらのHind III部位は図示せず。 実施例 ４ この実施例はpUCK106からのslDNAのDNA塩基配列の決
定を説明する。 （Ａ） slDNAの５′端部のDNA塩基配列の決定。単離、
精製したslDNA0.2μｇを鎖停止方法（chain terminati
on method）による塩基配列決定に用いた。始点（図５
のＢ参照）から下流の配列96−bpに相当する配列表の配
列番号３で表されるプライマー“a"（５′GGTTATCCACAG
AATCAG3′）をプライマーとして用いた。 （Ｂ） slDNAのループ部分の５′端部塩基配列の決
定。slDNA0.5μｇをSac IIによって消化させ、このよう
にして生じたDNAフラグメントを５′端部におって〔γ
−32P〕ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼによって標識
した。約40−bp移動したDNAフラグメントを単離し、マ
キサム−ギルバート（Maxam−Gilbert）法によって塩基
配列を決定した。 （Ｃ） slDNAのループ部分の３′端部塩基配列の決
定。Sac II消化体slDNAを末端デオキシヌクレオチジル
転移酵素を用いて３′端部において〔γ−32P〕ジデオ
キシATPによって標識した。ループ部分を含むDNAフラグ
メントを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基
配列を決定した。 （Ｄ） slDNAの３′端部のDNA塩基配列。slDNAをAfl I
IIによって消化させた（図５のＥ参照）、５′端部を
〔γ−32P〕ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼによって
標識した。標識生成物を塩基配列決定用ゲルによって分
離した。76塩基移動した一重鎖DNAを単離し、マキサム
−ギルバート法によって塩基配列決定した。図５のＤを
参照すると、数字はpUCK19の始点からの残基数を表す。 （Ｅ） pUCK106からのslDNAの構造。このslDNAは1137
〜1139塩基の一重鎖DNAからなる。slDNAの５′端部は不
均一であるように見える；一部は＋１から開始し、他の
部分は−1,＋2,＋３から開始する。＋１位置はColE1 D
NA複製の始点に相当する。従って、種々のslDNAは異な
る長さの５′末端鎖を有する。３′端部では16塩基の配
列が５′末端の＋１位置を越えて伸長する。このループ
はHind III部位（AAGCTT）が配置されるように設定され
たIR構造の中心の配列に相当する４塩基配列（AGCT）に
よって形成されると考えられる。pUCK106中のIR構造中
の不適正に相当する塩基対はＣ・Ｔ（pUCK 106）から
Ｃ・Ｇ（slDNA中）に変えられSac II部位とPst I部位と
の間に示される。図５のＡのDNA塩基配列決定に用いら
れるプライマー“a"の位置は矢印によって示す。 このslDNAは、300〜4000個以上の塩基からなるステム
を有するよう構築することができる。オーバーハング部
は、たとえば、塩基10〜80個程度の任意所望の長さ、た
とえば塩基約50個の長さに調整することができる。この
部分の長さは、安定性が損なわれることのないよう選ぶ
必要がある。slDNAは、所望の長さのループを有するよ
う構築することができる。 slDNAの分離と精製は、モレキュラー クローニン
グ；ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloni
ng;A Laboratory Manual）、サムブルック（Sambroo
k）等、第２版（セクション1.121〜1.40）（“サムブル
ック”）に述べられている方法に従って標準方法によっ
て実施した。 実施例 ５ この実施例は二つの可能なslDNA合成方法を説明する
（図６参照）。ColE1 DNA複製の始点を中心とする二重
鎖DNAを上部に示す。斜線入り円は始点からDNA複製を開
始するDNA複製複合体を表す。DNA鎖上の白抜き矢印はDN
A塩基配列中の35−bp逆方向反復（IR）構造（図２参
照）の位置を示す。IR構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）
も矢印中に示す。 工程１において、DNA複製フォークは始点（＋１位
置）から斜線入り円によって示される位置にまで進行す
る。新たに合成された第１鎖が始点（中実円）から複製
フォークまで伸長するのが示される。DNA複製複合体は
中実矢印によって示されるIR構造中の不適正Ｔ残基の直
前に達する。工程２では、この新たに合成された第１鎖
の３′末端がDNA複製複合体から剥離して、２次構造がI
R構造によって形成される。工程３では、DNA合成がこの
新たに合成された第１鎖（モデルＡ）または上部の親鎖
（モデルＢ）をテンプレートとして用いてステーム−ル
ープ構造の３′末端から再開する。工程４では、DNA合
成が始点を越えて16塩基だけ進行する。 モデルＡでは、DNAの５′末端に結合して残留するプ
ライマーRNAがテンプレートRNAとして用いられる。続い
て、RNAが除去されて、slDNAが形成される。モデルＢで
は、DNA合成が第２鎖DNA合成の停止のために知られた機
構と同様な機構によってterH部位において停止する。 モデルＡとＢが合成を説明することができ、合成が両
ルートによって、少なくとも一部の時間では、同時に進
行しうることが考えられる。従って、第１鎖のテンプレ
ートであった鎖以外の第２鎖に対しては適当なテンプレ
ートが用いられる。 実施例 ６ pUCK106ΔlacPOの構成 lacプロモーター−オペレーターを含む199−bp Pvu
II−Hinc IIフラグメントがpUCK106（図１参照）から欠
失すると、結果として生ずるpUCK106ΔlacPOは図３の
Ａ、レーン４の位置（ｂ）に示すような、pUCK106からs
lDNAよりも迅速に移動する新しいslDNAを形成した。こ
の新しいslDNAのサイズは360−bp長さであり、pUCK106s
lDNAよりも、pUCK106ΔlacPO中の欠失サイズに殆ど等し
い長さだけ短い。 図３のＡでは、レーン３はpUCK106ΔlacPOを収容する
細胞からのDNA形成のslDNAを示す。 この実験は上記で提案したslDNA合成モデルを支持
し、lacプロモーター−オペレーターがslDNA合成にとっ
て本質的でないことをも実証する。この解釈はlac誘導
物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドの添加がpUCK106からのslDNAの形成に影響しないと
いう事実によってさらに支持された。しかし、pUCK106
ΔlacPOからのslDNA合成減少の理由は現在まだ不明であ
る。 実施例 ７ slDNAの合成はpUCK106に用いられるIR構造の一次塩基
配列に依存しなかった。興味あることには、ポリリンカ
ー部位にIR構造を有するpUC7ベクター自体も、始点から
ポリリンカー中心までのDNAフラグメントに対応するslD
NAを形成することができる。 pUC7から形成された単離精製されたslDNAは252bp長さ
であった。プラスミド画分を実施例２と同様に形成し、
処理し、電気泳動のためにアクリルアミドゲルに塗布し
染色した。 図７では、レーン１と３はサイズマーカーとしてのpB
R322のHae III消化体を示す。レーン２はpUC7から形成
されたslDNAを示す。 実施例 ８ slDNA構造の確認 上記slDNA構造と機構（図６に説明）は次のように確
認した： 合成によって構築したDNAフラグメントに不適正塩基C
TをCGの代りに故意に加えた。図２のIRの開放スペース
を参照のこと。slDNA合成（第１鎖上にスナップ−バッ
クした第２鎖を含む）後に、不適正は修正された。なぜ
なら図５のＥでは、CGが出現している。もし構造がスナ
ップ−バック構造でなかったとしたら、ポリメラーゼが
IR領域を正しく読み、Ｔを鋳型として読みＡが挿入され
るはずである。すなわち；新しい鎖はまだ不適正を含む
と思われる。不適正Ｔを置換するために、IR部分は第１
鎖に必然的にスナップ−バックして、ポリメラーゼにテ
ンプレートとして第１合成鎖を使わせて、第２鎖を合成
させ、第２鎖が合成されるとき、不適正Ｔの代りに相補
的Ｇを挿入させる。これは本発明のslDNAの合成機構と
構造を決定的に確立する。 実施例 ９ この実施例はアンチセンス配列を有するslDNA（以
下、アンチセンスslDNAと称する）による遺伝子制御を
説明する。 （１）slDNA生産プラスミドの構築 pUCK106のPvu II−Hinc II領域（199bp）を削除し、l
acZのプロモーター／オペレーター領域を欠失させたpUC
K106d.P.O.を構築した（図９）。次に、配列表の配列番
号４に示される配列（アンチセンス配列）を有するオリ
ゴヌクレオチド及び配列表の配列番号５に示される配列
（センス配列）を有するオリゴヌクレオチドを合成し、
５′末端をリン酸化したのちアニーリングさせ、pUCK10
6d.P.O.のHind IIIサイトに挿入した。センス配列を有
するslDNA（以下、センスslDNAと称する）を生産するプ
ラスミドをpUCK106d.P.O.−I,アンチセンスslDNAを生産
するプラスミドをpUCK106d.P.O.−IIと命名した（図
９）。 このslDNAは、塩基42個のループ、塩基360個が二重ら
せん状となったステム、ならびに塩基15〜18個の尾部、
すなわちオーバーハング部を有していた。 （２）β−ラクタマーゼ遺伝子を有する宿主大腸菌の創
製 pBR322（寳酒造社）をEcoR IとHae IIで切断し、β−
ラクタマーゼ遺伝子を含む約1.6kbの断片を得、該断片
を末端平滑後pHSG399（寳酒造社）のSma Iサイトに挿入
してpXX555を構築した。次に、ミニＦ（miniF）由来の
プラスミドpXX325〔プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA、第80巻、第4784−4788頁、（1983）に記載〕
のEcoR I−Hind IIIサイトにβ−ラクタマーゼ遺伝子を
含むpXX555のHind III−EcoR I断片を挿入し、プラスミ
ドpXX566を構築した（図10）。pXX566で大腸菌MC4100を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子を有する大腸菌MC
4100/pXX566を得た。 （３）アンチセンスslDNAによるβ−ラクタマーゼ遺伝
子の発現抑制 pUCK106d.P.O.−Ｉ、pUCK106d.P.O.−IIをそれぞれ大
腸菌MC4100/pXX566に導入し、それぞれMC4100/pXX566/
I、MC4100/pXX566/IIと命名した。それぞれの形質転換
体をカナマイシン50μg/mlを含むＬ−ブロスで37℃一昼
夜培養し、その培養液を10000倍希釈して、その50μ
を、カナマイシン50μg/mlとアンピシリンを50〜150μg
/ml含むＬ−ブロスプレートにまいて37℃で一昼夜培養
した。核プレートのコロニー数を決算した。表１にアン
ピシリン濃度50μ/mlの時のコロニー数を100としたと
きの相対％を、図11に縦軸にコロニー数（相対％）、横
軸にアンピシリン濃度をとったグラフを示す。その結
果、MC4100/pXX566/IIではアンチセンスslDNAによって
β−ラクタマーゼ遺伝子の発現が抑制されたアンピシリ
ンに対する耐性が低下し、死滅率が上昇した。 （４）ウエスタンブロッティングによるβ−ラクタマー
ゼ発現量の測定 実施例９−（３）で得られたMC4100/pXX566/I及びMC4
100/pXX566/IIの単一コロニーを無作為に選び、それぞ
れ5mlのＬ−ブロス（20μg/mlアンピシリン、50μg/ml
カナマイシンを含む）に植菌し、37℃で一昼夜培養した
後、その培養液100μを同じ培地5mlに植菌した。OD
600＝1.2付近で集菌し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.1）で洗浄した後、同緩衝液1mlに懸濁しOD600数
を測定した。各々0.750D600分の菌体を破砕し、その細
胞抽出液を15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。PVDF膜（イモビロン、ミリポア社）にブロッ
ティングした後、抗β−ラクタマーゼ抗体（５′プライ
ム→３′プライム社）を用いてウエスタンブロッティン
グを行った。検出にはイムノステインキット（コニカ
社）を使用した。その結果、アンチセンスslDNAを生産
しているMC4100/pXX566/IIではセンスslDNAを生産して
いるMC4100/pXX566/Iに比べて約30％のβ−ラクタマー
ゼの発現量の低下が認められた。 さらに、センスならびにアンチセンスslDNAの遺伝子
コピーが同一であり、いずれの分子も欠失あるいは組換
えを生じていないことが例証された。センスならびにア
ンチセンスslDNAを含むゲルの写真には、生成したslDNA
が予想通りのサイズを有することが示されており、これ
らの構築物中で遺伝子組換えが生じていないことが示唆
された。また、センスならびにアンチセンスslDNAのバ
ンドは似通った強度を有しており、センスならびにアン
チセンスslDNAのコピー数が似通ったものであることが
示された。 こうした結果は、カナマイシン耐性遺伝子について調
べた結果によって、さらに裏づけられるものである。カ
ナマイシン遺伝子の発現は、アンチセンス系とは独立し
ており、したがって、内部コントロールの役目をはた
す。センスならびにアンチセンスslDNAを発現する細胞
から誘導した抽出物のポリアクリルアミドゲルからは、
Km耐性タンパク質を表すバンドの強度が同一であること
が示される。さらに、これらの２種の抽出物のβ−ラク
タマーゼ以外のタンパク質の総量は同一である。こうし
た結果から、観察データに示す影響が、アンチセンスの
影響であることがわかる。このように、観察されるβ−
ラクタマーゼの発現の変化は、細胞での転写ならびに翻
訳に対する全体的影響の結果として生じるのではなく、
アンチセンスslDNAの発現に直接起因するものなのであ
る。 実施例 10 この実施例は三重鎖形成能を有するslDNA（以下、三
重鎖形成slDNAと称する）を説明する。 （１）pUCK106Ad.P.O.の構築 pUCK19のNde Iサイトに配列表の配列番号６および７
で示される配列で構成される106Nde I配列を挿入してpU
CK106Aを構築した。次に、lacプロモーター／オペレー
ター領域を含むHinc II−Vsp I領域（206pb）を欠失さ
せてpUCK106Ad.P.O.を構築した。 （２）三重鎖形成slDNAの調製 配列表の配列番号８に示すオリゴヌクレオチド（GT37
配列）及び配列表の配列番号９で示されるオリゴヌクレ
オチド（CA37配列）を合成し５′末端をリン酸化したの
ちアニーリングさせ、pUCK106Ad.P.O.の106Nde I配列中
のHind IIIサイトに挿入した。GT37配列を含むslDNAが
生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをpU
CKAGT37、CA37配列を含むslDNAが生産される方向に断片
が挿入されているプラスミドをpUCKACA37と命名した
（図12）。これらのプラスミドで大腸菌MC4100を形質転
換し、これらの形質転換体をそれぞれMC4100/pUCKAGT3
7、MC4100/pUCKACA37と命名した。これらの形質転換体
及び実施例９−（２）で作製したMC4100/pUCK106Ad.P.
O.をＬ−ブロス（70μg/mlのカナマイシンを含む）にて
培養後アルカリ−SDS法にてDNAを抽出し、次にRNaseAで
処理した。この抽出液をポリアクリルアミド電気泳動に
供し、各々の精製slDNAを得た。 （３）標的DNAの調製 配列表の配列番号10及び11に示されるオリゴヌクレオ
チドを合成し、５′末端をリン酸化した後アニーリング
させ、pMS434〔ジーン（Gene）、第57巻、第89〜99頁、
（1987）に記載〕のXho I−Hind IIIサイトに挿入し、p
MSTR37を構築した。37をテンプレートとし、配列表の配
列番号12で示されるプライマーMS1と配列表の配列番号1
3で示されるプライマーM4でPCRを行い、挿入断片を増幅
し、該増幅断片を標的DNAとした（図13）。 （４）三重鎖形成の確認 実施例10−（２）で調製した各slDNAの５′末端を32P
で放射性標識した。次に、各々の32P標識slDNAと実施例
10−（２）で調製した箇条量の標的DNAを10mlの三重鎖
形成用緩衝液（5mMトリス−酢酸 pH7.0、150mM NaC
l、10mM MgCl2）中で37℃で一昼夜処理した。 該処理液を、50mMトリス−ホウ酸、5mM MgCl2、pH8.
5の泳動用緩衝液を用いる12％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供し、三重鎖形成をゲルシフトアッセイによ
り検出した。その結果、GT37配列を含むslDNAは三重鎖
を形成してゲルシフトした。一方、CA37配列を含むslDN
A及び挿入配列のないslDNAはゲルシフトしなかった。 実施例 11 この実施例は酵母におけるslDNA生産を説明する。 （１）プラスミドpYES2−８−106及びpYES2−９−106の
構築 ColE1と２μの複製開始点を持つシャトルベクターpYE
S2（インビトロジョン社）を用い、酵母でのslDNA生産
を調べた。 pYES2をMul I及びSsp Iで切断した後、末端をT4DNAポ
リメラーゼを用い平滑化し環状化することによりMCS及
びGal Iプロモーター領域を除いた（ステップ１）。次
に、このプラスミドをAva Iで切断し、末端を平滑化し
た後、配列表の配列番号14,15でそれぞれ示されるDNA断
片Ａ又はＢを挿入した（ステップ２）。次に、これらの
プラスミドをBamH IとSal Iで切断し、そこにpUCK106の
BamH I−Sal I断片（227bp）を挿入した（ステップ
３）。構築されたプラスミドをそれぞれpYES2−８−106
（図14、左側）、pYES2−９−106（図14、右側）と命名
した。 （２）形質転換体からのプラスミドDNAとslDNAの回収 酢酸リチウム法（ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー（Journal of Bacteriology）、第153巻、第163〜1
68頁、（1983））によってサッカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）YPH499（ストラタジー
ン社）をプラスミドpYES2−８−106又はpYES2−９−106
で形質転換した。各々の形質転換体を100mlのYPD培地
（１％バクトイーストエキストラクト、２％アクトペプ
トン、２％デキストロース）にてOD600がおよそ1.5にな
るまで培養した後、集菌した。該菌体を10mlのSCE液（1
82g/ ソルビトール、29.4g/ クエン酸２ナトリウ
ム、22.3g/ EDTA2ナトリウム）で１回洗浄し、次に4
mlの溶液Ｉ（SCE10ml中に10μのβ−メルカプトエタ
ノールと5mgのザイモリアーゼ100Tを含む溶液）に懸濁
し37℃で２時間ゆっくり振とうしスフェロプラスト化し
た。次に、8mlの溶液II（0.2N水酸化ナトリウム、１％
ラウリル硫酸ナトリウム）を加え５分間氷中に静置し、
次に、6mlの溶液III（60mM酢酸カリウム、氷酢酸11.5m
l、水28.5ml）を加え５分間氷中に静置した後、遠心し
て上清を回収した。該上清にイソプロパノールを加えて
DNAを沈澱として回収し、該沈澱を70％エタノールで洗
浄後TE緩衝液（10mM トリス−塩酸、1mM EDTA、pH7.
6）に溶解した。フェノール／クロロホルム混合液によ
り除蛋白操作を行った後、エタノールで沈澱化し、更
に、キアーゲンチップ５（Qiagen tip5、キアーゲン
社）でDNAを精製し、回収したDNA画分を20μのTE緩衝
液に溶解した。 （３）プラスミドDNAとslDNAの分離 実施例11−（２）で得られた試料のうち10μ分をSa
l Iにて処理した。これによりプラスミドDNAは線状化し
て5024bpの２本鎖線状DNAになり、slDNAは127bpのslDNA
と長さ不明の２本鎖線状DNA断片に分離される（図1
5）。これに、２μのColE1のAfa I分割物（29,46,60,
62,69,99,120,126,130,243,252,323,413,415,564,778,9
50,976,991bpの各断片を含む）を混合して、12％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルの下
半分をエチジウムブロマイドで染色し、120〜130bpの間
のゲルを切り出し細かく切断後、回収し、滅菌水を加え
て60℃で30分間処理した。遠心後、その上清からグラス
ウールカラムにより不溶物を取り除き、凍結乾燥してDN
Aを回収した。回収したDNAを20μのTE緩衝液に溶解し
た。 （４）PCRによるslDNAの検出 図16に示すように、配列表の配列番号16に示されるプ
ライマー1871と配列表の配列番号17に示されるプライマ
ー20261を用いてPCRを用い、slDNAの存在を目的のDNA断
片が増幅されるか否かで判定した。このとき、プラスミ
ドDNAの混入の可能性を否定するため、同時に配列表の
配列番号18で示されるプライマー1870とプライマー1871
を用いてPCRを行った。なお、両プライマーの組合せに
よるPCR反応の効率をみるためプラスミドDNAを段階的に
希釈して検出限界の濃度を調べ、どちらも約2.5×10-20
モル分子であり差がないことを確認した。 まず、実施例11−（３）で得られた試料をPst Iで処
理し、その反応液の100分の１を用いて50μのスケー
ルでPCRを行った。PCRの反応条件は、94℃１分、55℃１
分、72℃１分で25サイクル行いプライマーの濃度は500n
Mで行った。反応後、反応液の５μを６％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染
色後FMBIO−100（寳酒造社）により生成物を検出した。
その結果、pYES2−８−106、pYES2−９−106のいずれで
形質転換した形質転換体もプライマー1871とプライマー
20261の組合せの場合のみ93bpの増幅物が確認され、slD
NAの生産が確認できた。また、いずれもプライマー1870
とプライマー1871の組合せでは増幅物は検出されずプラ
スミドの混入は否定された。 slDNAは、後述する他の真核生物から発現させること
もできる。 以上より、酵母のような真核細胞でもslDNAが生産で
きることが明らかになった。またpYES2−９−106でもsl
DNAが生産されることにより、リーディング鎖だけでな
くラギング鎖合成においてもslDNAが合成されることが
示唆された。 実施例 12 プラスミドの複製に存在しないsl−DNAの生産 （１）pHS2870の構築 配列表の配列番号６と７で表される配列からなる106
−Nde IリンカーをpUC19のNde Iサイトに挿入し、当該
プラスミドをpUC106Aと命名した。pUC106Aからlacプロ
モーター−オペレーター領域を含むPvu II断片を欠失さ
せてプラスミドpUC106Ad.P.O.を構築した。次に、配列
表の配列番号19で表されるRNA II Aプライマーと配列表
の配列番号20で表される1870プライマーとテンプレート
にpUC106Ad.P.O.を用いてPCRを行い、RNA1870断片を調
製した。なお、RNA II Aプライマーは複製プライマーRN
A II領域の５′末端にアニールし、1870プライマーは10
6−Nde Iリンカーの３′末端にアニールする。さらに、
これら二つのプライマーはそれぞれ５′末端にXba Iサ
イトを含んでおり、その結果、RNA1870断片は両側にXba
Iサイトをもつ。次に、RNA1870をXba Iで消化してpSTV
28（寳酒造社）のlacプロモーター−オペレーター下流
のXba Iサイトに挿入し、pHS2870を構築した。図17にpH
S2870の構築方法を示す。 図18にpHS2870の構造を示す。図18が示すように、pHS
2870ではプライマーRNAはlacプロモーターの下流におか
れており、逆方向反復配列はプラスミド自身の複製をす
るp15Aのオリジンの上流に置かれている。 （２）pHS2870をもつ細胞でのsl−DNAの生産量の解析 大腸菌JM109株をpHS2870で形質転換し、JM109/pHS287
0を得た。この形質転換体を100μg/mlのクロムフェニコ
ールを含むＬ−ブロスで2mMのIPTG存在下、非存在下の
両条件で培養した。アルカリSDS法にてDNAを調製し、RN
ase処理した。これらのDNAサンプルを６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し
た。その結果、IPTG存在下では非存在下に比べて、100
倍以上のslDNAの生産が確認された。 このslDNAは４塩基のループと15〜18塩基のオーバー
ハングと440塩基のステムをもっている。 以上より、このslDNA生産はプラスミドの複製に依存
せず、プライマーRNAをコントロールすることによりコ
ントロールされている。 プライマーRNAの合成にプライマーゼを利用する場合
は、プライマーゼの生産をコントロールすることによ
り、slDNAの生産がプラスミドの複製とは関係なくコン
トロールされる。プライマーゼを利用する系としては、
T7ファージの遺伝子４やT4ファージの遺伝子41,61があ
る。コーンベルグ（Kornberg）著、「DNAレプリケショ
ン（DNA Replication）」の第11−10章を参照。 実施例 13 大腸菌における三重鎖形成slDNAによる遺伝子発現阻
害 （１）pHS2870GTの構築 配列番号８および９に示されたオリゴヌクレオチドか
らなる実施例12に示された二本鎖オリゴヌクレオチドを
pHS2870のHind IIIサイトに導入した（図19）。Hind II
Iフラグメントの方向をDNAシークエンスにより確認し、
GT37配列を含むslDNAが生産される方向に断片が挿入さ
れているプラスミドをpHS2870GTと命名した（図19）。 （２）IPTG（isopropyl−β−Ｄ−thiogalactoside）に
よるslDNA発現の誘導 pHS2870またはpHS2870GTで大腸菌JM109を形質転換
し、2mlのＬ−ブロス（50μg/mlクロラムフェニコール
を含む）中37℃で一晩培養した。この培養液をＬ−ブロ
ス（50μg/mlクロラムフェニコールを含む）で102倍希
釈し、培養液のOD600が約0.7に到達した時点でIPTG（終
濃度1mM）を加え37℃でさらに２時間培養した。この培
養液からアルカリ−SDS法でslDNAを調製し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で解析した（図20）。IPTGを加え
た場合のslDNA（〜480bp:pHS2870,〜500bp:pHS2870GT）
の発現量はIPTGを加えない場合より約20倍増加した。 slDNAは53塩基のループ、約440塩基対のステム及び15
〜18塩基のオーバーハングを有する。 （３）大腸菌MC4100lpFTRlF′の創製 大腸菌MC4100をラムダファージλpF13（ジーン、第57
巻、第89〜99頁（1987）に記載）で溶原化した大腸菌MC
4100λpF13を、プラスミドpMSTR37（ATCC No.35695）で
形質転換した。λpF13は京都大学ウイルス研究所（京都
市左京区）から入手可能である。in vivo組換えにより
βガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に三重鎖
形成slDNAのターゲット配列を有するラムダファージλp
FTRlを得た。このλpFTRlを用いて大腸菌MC4100を溶原
化し、さらに大腸菌Nova Blue（Novagen社）との接合
によりＦ′を導入することによりMC4100λpFTRlF′を創
製した（図21）。 （４）パルスラベルと免疫沈澱法によるβガラクトシダ
ーゼ発現量の検出 大腸菌MC4100λpFTRlF′をpHS2870またはpHS2870GTで
形質転換し、2mlのＬ−ブロス（50μg/mlクロラムフェ
ニコール、15μg/mlテトラサイクリンを含む）中37℃で
一晩培養した。この終夜培養液をM9改変培地（1xM9塩、
0.2％グリセロール、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.001
％塩酸チアミン、40μg/mlアルギニン、５μg/ml各種ア
ミノ酸（メチオニン、システインを除く））で50倍希釈
し37℃で培養した。培養液のOD600が約0.2に達した時点
でIPTG（終濃度1mM）を加え、さらに37℃で３時間培養
した。この培養液0.5mlに407kBqの35S−Met,Cys（43.5T
Bq/mmol、エキスプレス〔35S〕プロテインラベリングミ
ックス（Express〔35S〕Protein Labeling Mix）、NE
N社）を加え37℃で30秒標識後、0.5mlの20％TCAを加え
反応を停止した。沈澱を遠心により回収し、0.5mlのア
セトンで洗浄後、50mM Tris−HclpH8.0、１％SDS、2mM
EDTAに溶解した。標識されたタンパク質の放射活性を
液体シンチレーションカウンターで測定し、１×106cpm
相当の試料を１μの抗βガラクトシダーゼ抗体（コス
モバイオ社、AB−986）と0.5mlのTBS−0.1％ Triton X
−100溶液中、４℃で一晩反応させた。抗原−抗体複合
体を回収するために、この反応液に20μのIgG Sorb
（ジエンザイムセンター（The Enzyme Center）社、I
GSL10）を加え、４℃で１時間激しく振盪した。沈澱を
遠心で回収し、TBS−0.1％ Triton X−100で３回、10mM
Tris−HClpH8.0で１回洗浄した。最終沈澱を20μの
SDS−PAGE試料液に懸濁し95℃で１分間加熱した。この
免疫沈澱した試料をSDSPポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離し、バイオイメージングアナライザーBAS2000
（フジ写真フィルム社）で解析した（図22）。pHS2870G
Tで形質転換したMC4100λpFTRlF′をIPTGで処理した場
合のβガラクトシダーゼのバンドの放射活性はpHS2870
で形質転換した場合よりも約50％減少していた。 当業者であれば以上に開示した教示内容からわかるよ
うに、本発明を実施するにあたっては、本発明の精神あ
るいは範囲から逸脱することなく、おおくの改変、変
更、および／または置換をたやすく行うことができる。
本発明の精神および範囲には、方法論として実質的に同
等な手段、ならびに、プラスミドの複製とは独立にslDN
Aを過剰生成するという、本発明と同一の目的を達成す
る遺伝的構築物、あるいは他の適当なビークルも含まれ
るものである。 本発明の種々の実施態様の詳細な説明 本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製され
るという菊本的な発見をした。開示する機構は周知のよ
うな、RNA中間体も逆転写酵素（RT）も必要としない。
ワイナー等、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミ
ストリー55、631（1986）；コーンベルグ（Kornber
g）、DNAレプリケーション（DNA Replication）〔ダブ
リュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.
Freeman and Company）、カルフォルニア州サンフラ
ンシスコ、1980〕、101〜166頁参照。ステム−ループDN
A（slDNA）と呼ばれる新しい、有用なDNA構造が発見さ
れた。 はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提供する。一
実施態様は新規で有用なssDNA分子の合成方法（又はプ
ロセス）である。他の実施態様は適当なプライミング部
位と、逆方向反復（IR）と、slDNA合成の他の必要な成
分とを有するDNAフラグメントを含む、このような分子
を合成するためのインビボ及びインビトロ系である。 このような分子を合成するためのインビボ系はコンピ
テント自己複製ビークルと系の他の成分とを用いる。こ
の実施態様の他の面は逆方向反復、slDNAの第１鎖の複
製のためのテンプレートとして役立つDNA、逆配向のDNA
合成をテンプレートに開始させるための適当なプライミ
ング部位、及び必要な場合の親DNAの第２鎖と以下で述
べる他の成分を含む自己複製ビークルである。 もう一つの実施態様は新規なss−slDNA分子である。 本発明は新規な一重鎖DNA（ssDNA）分子の合成方法を
提供する。この分子は、ステムがssDNA中のアニールさ
れた相補的塩基の二重鎖DNAからなり、一端において二
重鎖DNAの反対端部を結合するDNAの一重鎖ループを形成
するステム−ループ構造（slDNA）を含む。この方法はD
NA合成の通常の成分と下記成分： （ａ）適当なプライミング部位と、前記プライミング部
位の下流の逆方向反復（IR）とを含むテンプレートDNA; （ｂ）テンプレートにDNA重合を開始させるためのプラ
イマー；及び （ｃ）テンプレートからslDNAを複製するDNAポリメラー
ゼ を含む系において実施される。 この方法は次の工程： （１）DNA重合を開始させるためのDNAテンプレートのプ
ライミング工程； （２）テンプレートとしてDNAの二重鎖の一つを用いて
プライマーからssDNAを合成し、一つの鎖を形成し、IR
塩基配列に入るまで鎖のDNA合成を続け、IR塩基配列内
で合成を停止させる工程； （３）新しく合成された鎖内のIR塩基配列における相補
的塩基がその端において非重複部分を重複部分とからな
るループを形成するために、アニールし、重複部分を連
続DNA合成のプライミング部位として機能させる工程； （４）テンプレートとしてDNAの新たに合成された鎖及
び／又は他の鎖を用いてDNA合成を再開する工程； （５）slDNAを形成する工程；及び （６）必要に応じてslDNAを分離し、単離する工程を含
む。 この方法はDNA合成のために必要な通常の成分の全て
を含む系で実施される。これらの成分はインビボでこの
方法が実施されるときに本質的に存在し；この方法をイ
ンビトロで実施するときに通常、系に導入される。 この方法は、適当なプライミング部分と、このプライ
ミング部位から下流の逆方向反復とを有するDNAの存在
を必要とする。DNAはDNA複製を導くためのテンプレート
として機能する。プライマーは、DNA鎖に対して相補的
であるプライマー伸長生成物の合成を開始させるように
作用しうるオリゴヌクレオチド（天然に生成又は合成的
の製造）でありうる。DNA複製の開始方法は当然周知で
ある。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジ
ー・オブ・ザ・ジーン（Molecular Biology of the
Gene）、第３版、ダブリュ・エイ・ベンジャミン社
（W.A.Benjamin.Inc.）;DNAシンセシス：プレゼント・
アンド・フューチャー（DNA Synthesis:Present and
Future）、モリノイクス（Molineux）とコイヤマ（Ko
hiyama）編集、（1977）第Ｖ部、“G4アンドST−lDNAシ
ンセシス・イン・ビトロ（G4 and ST−lDNA Synthesi
s in Vitro）”ワーカー著；第VII部、“DNA・シンセ
シス・イン・パーミアブル・セル・シンセシス・フロム
・サッカロマイセス・セレヴィジュ（DNA Synthes is
in Permeable Cell Systems from Saccharomyce
s cerevisiae）オエルテル（Oertel）とゴーリアン（G
oulian）著を参照のこと。第１鎖の合成に寄与するポリ
メラーゼに対して、第２鎖の合成には異なるポリメラー
ゼが寄与する。プライマーはDNA又はRNAプライマーのい
ずれでも良い。合成はヌクレオチドと、例えばDNAポリ
メラーゼのような重合剤との存在下、適当な温度及びpH
において誘導される。 本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖の合成を触
媒する酵素のような重合材を用いる。このための適当な
酵素には、例えば大腸菌DNAポリメラーゼＩもしくはII
I、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）フラ
グメント、T4DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、逆
転写酵素（RT）；ウイルスポリメラーゼがあり、熱安定
性酵素をも含まれる。そのDNA複製開始部位を認識する
ポリメラーゼが適当である。一般に、このプロセスをイ
ンビボで実施する場合に、これらの遺伝要素が存在する
と考えられ；インビボで実施しない場合又はインビトロ
で実施する場合には、これらを系に加えることになる。 開始部位を認識するポリメラーゼは重合を惹起させる
又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特定の理論に
しばられるのを望むわけではないが、第1DNA鎖の合成に
寄与するポリメラーゼが他方のすなわち第2DNA鎖の合成
にも寄与することを除外することはできない。従って、
この方法は第２鎖が第１合成鎖の５′末端を越えて３′
末端において停止するまで、第２鎖の合成を続けること
を含む。このように、slDNAの重複ステムが形成され
る。 DNAポリメラーゼについての情報は入手可能である。
例えば、コーンベルグによるDNAレプリケーション（DNA
Replication）（ダブリュ・エッチ・フリーマン・ア
ンド・カンパニー、カリフォルニア州、サンフランシス
コ）、101〜160頁、第４章、DNAポリメラーゼ・オブ・
イー・コリ（DNA Polymerase Ｉ of E.Coli）、第
５章、アザー・プロカリオティック・ポリメラーゼズ
（Other Procaryotic Polymerases）、第６章、ユー
カリオティック・DNA・ポリメラーゼズ（Eucaryotic D
NA Polymerases）及び第７章を参照のこと。 cDNA中の第２鎖合成に有用であるポリメラーゼのよう
な、他のポリメラーゼも考えられる。 上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２種類:DNAポ
リメラーゼIIIとポリメラーゼＩであることが考えられ
る。 もし蛋白質をコードしうる好ましいもしくは標的とな
る核酸塩基配列を例えば合成されたslDNA部分遺伝子と
して複製することが望ましい場合にはこの塩基配列をIR
の上流に配置する。例えば、複製始点（OR）を有する、
例えばpUCK106等のベクターのような、複製ビークル中
で複製が行われる場合には、標的核酸配列はIRとORとの
間に位置する。 本発明の方法は、上述したように、プライミング部位
と逆方向反復（IR）すなわち逆配向で存在する二つの同
じ塩基配列を含む二重鎖DNAフラグメントを用いる。IR
は塩基配列又は“パリンドローム”として存在しうる。 後に述べるように、核酸配列へのランダム点突然変異
の導入を容易にすることが好ましい場合には、例えばRT
のような、ある特定の酵素が特に好ましい。 第１鎖の合成がdsDNAテンプレートに沿って接触しな
がら、IRを通って進行して、全プラスミドゲノムの複製
を生ずる。一定の周期で、DNA鎖の合成はIR内で停止し
て、それ自体に相補的である塩基配列の短い部分を形成
し、ループを形成し、IR塩基配列においてそれ自体にア
ニールする。新たに合成された鎖内のこの二重鎖部分は
第２鎖又は他のDNA鎖のプライミング部位として認識さ
れる。第２鎖の合成はDNAの最初に形成された鎖及び／
又は他の親鎖をテンプレートとして用いて出発する。従
って、テンプレート切換えが生ずると考えられる。 ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって第２鎖が合
成されるので、アニールされた相補的塩基からステムが
形成され、内部相補性を有する二重構造が生ずる。 第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオチドをはる
かに過ぎて、この第１鎖のRNAプライマーを通って進行
する、第１鎖は結局は減成して、３′−オーバーハング
を形成する。一つの特定の説明では、DNA合成はダスグ
プタ（Dasgupta）等、セル（Call）51、1113（1987）に
述べられている方法と同様な方法によってterH部位にお
いて停止すると考えられる。 適当な処置によって、３′末端オーバーハングの長さ
は、例えば延ばすように、terH部位をプライミング位置
から下流へ動かすことによって制御することができる。 さらに、３′末端オーバーハングを有するステムの代
りに、適当な停止位置、例えばterHをプライミング部位
の上流に配置することによって、第１鎖の端部の前で第
２鎖の合成をブロックすることが可能であると考えられ
る。従って、いずれかの鎖が他方に比べてかなりの長さ
で長くなると考えられる。 第２鎖合成が停止したときに、テンプレートと形成さ
れたslDNAが分離する。 本発明の方法は望ましい頻度のサイクルでくり返すこ
とができる。必要な成分のいずれかが欠乏すると、必要
に応じて補充することができる。 この方法をインビボで実施する場合には、プライミン
グ部位とこのプライミング部位の下流のIRとを含む、適
当なコンピテント複製ビークルが形成される。IRを有す
るDNAフラグメントは通常、ポリリンカー塩基配列中に
特有の制限部位に挿入される。ポリリンカーがIR（及び
対称的制限部位）を有するプラスミドが用いられてい
る。本質的に存在しない場合には、DNAフラグメントにD
NA塩基配列へのプライマーが提供される；ポリメラーゼ
はビークルに固有であっても固有でなくても良い。ビー
クルは複製とslDNA形成とに必要な、他の全ての成分を
含む。 上述したことから、テンプレートとして役立つDNAフ
ラグメント、IR塩基配列、slDNAを形成する鎖の複製を
プライムし、続けるために必要な要素を含む自己複製ビ
ークルがslDNAの合成に適することが理解されるであろ
う。 本発明の他の主要な実施態様は新しいslDNAを形成す
る。これらの構造はすでに上述した、以下では補足の説
明を述べる。 “ステム−ループ”又は“slDNA"と名づけられた新し
い構造は一重鎖である。slDNAの説明は図５のＥ（pUCK1
06から）と図７（pUC7から）に示す。 典型的なslDNAはアニールされた相補的塩基の重複二
重鎖ステムとステムの２鎖を結合する一重鎖ヌクレオチ
ドのループとを含む。ループの一重鎖性は本発明のslDN
Aのもう一つの興味ある特徴である。slDNAはヌクレオチ
ドの非常に短い配列またはかなり長い配列のループを含
むことができる。slDNAはループを形成するために充分
な長さのヌクレオチド配列と短い重複二重鎖を形成する
塩基対合を含むことができる。最小サイズは第２鎖の合
成開始のためのプライミング部位を形成するために充分
な塩基対合を与えるものであるべきである。ループの最
小サイズは安定構造になるための塩基対合を阻止する塩
基上の歪み（strain）によって限定される。最大サイズ
はslDNAに予定された用途によって影響される。図５の
Ｂに図示したループは４塩基からなるが;10塩基、20塩
基又はそれ以上の塩基のループも考えられる。slDNAル
ープの一重鎖性はslDNAに提案される用途に非常に有用
である特徴である。 slDNAに考えられる他の興味ある構造は二重体slDNAで
ある。この構造では、二つのslDNAの一重鎖の自由端部
が結合する。この構造は非常に安定であると期待され
る。通常DNAを変性させるような条件に暴露されると、
これらのssDNAはそれらのオリジナル構造に“スナップ
−バック”しがちである。鎖の結合はDNA及び／又はRNA
リガーゼによる通常の方法によって実施される。このよ
うな構造は蛋白質をコードするための特定の遺伝子をも
有し、それによって興味ある新しい実用的可能性を提供
する。 slDNAの重要な性質である安定性は重複端部（tail）
が長くなると共に増加する傾向があると考えられる；従
って、このような構造はこのことが強調されるべきで特
性である場合に好ましい。同一の複製ビークルから形成
されるslDNAの全てが必ずしも同じサイズでないことに
注目すべきである。上記説明では、pUCK106からのslDNA
において、第１鎖の５′末端は不均一であるように思わ
れ、一部の鎖は＋１位置（ColE1複製の始点に相当）か
ら出発するが〔トミザワ等、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザイ・USA、74、1885（1977）を参照のこ
と〕、他の鎖は、−1,＋2,＋３から出発する。従って、
DNAは類似したslDNAの類と見なすことができる。 DNAフラグメント内にIRを越えて一つ以上の不適正が
存在することがslDNAの合成にも構造にも不利な影響を
与えないことが認められる。このことはこの場合にパリ
ンドロームの中心から25ヌクレオチド離れたＧに対する
不適正Ｔによって説明される（図２参照）。この不適正
はslDNAの合成において修復された。 端部の１末端の他方の末端をこえたssDNAオーバーハ
ングを利用した、本発明のslDNAの幾つかの用途が提案
される。それ故、このことが本発明の新しい構造の重要
な特徴であることは理解されよう。 図示したプラスミド内のslDNAの合成は本発明の最も
良い形式（mode）を説明する。 しかし、IRとここに述べる他の成分とを含むベクター
はslDNAの合成に適切である。 IRは原核生物と真核生物にしばしば出現する構造であ
る。このようなIRは本発明に使用可能である。IR塩基配
列は合成的に製造することもできる。１例は図２に示す
合成IRである。 IRの塩基配列又はパリンドローム塩基配列は大腸菌か
ら得られている〔ギルソン（Gilson）等、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ18、3941（1990）〕；ギルソン等
のヌクレイック・アシッズ・リサーチ19、1375（1991）
は大腸菌とサモネラエンテリチカ（Salmonella enteri
tica）からのパリンドローム塩基配列を報告している
（パリンドローム単位配列40ヌクレオチド長さ）。チャ
ルカー（Chalher）等のジーン（Gene）71、（１）:201
−５（1988）は大腸菌における571−bpパリンドローム
の増殖を報告している；逆方向反復はルイス（Lewis）
等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol）（イングラント）215、（１）:73〜84
（1990）によって枯草菌（Bacillus subtilis）におい
て報告されている（26−塩基対反復）、サウリン（Saur
in）のコンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・
バイオサイエンシーズ（Comput.Appl.Biosci.）３、
（２）:121−７（1987）は大腸菌における反復パリンド
ローム構造を系統的に研究するための新しいコンピュー
タプログラムの使用を考察している。下記米国特許はポ
リドンローム塩基配列を開示する：第4975376号第48638
58号；第4840901号；第4746609号；第4719179号；第469
3980号及び第4693979号。 slDNAは、その当該使用目的に即して、様々な長さの
ループならびにステムを、尾部（すなわち３′末端ある
いは５′末端のオーバーハング部）とともに有するよう
構築することができる。ステムは、塩基100個、好まし
くは300個から5000個以上、好ましくは約4000個の鎖長
となるよう構築することができる。一方の末端からもう
一方の末端がさらに延びているオーバーハング部は、ヌ
クレオチド15〜18個、あるいは15〜30個といった比較的
短い鎖長から、塩基約50〜100個、あるいはそれ以上の
比較的長い鎖長までの範囲とすることができる。一本鎖
のオーバーハング部は、DNAアンチジーン断片を含んで
いる可能性があるので、３′あるいは５′末端の尾部の
オーバーハング部は、DNAアンチジーン断片の鎖長に対
して合理的な鎖長となるようにして、アンチジーン断片
が必要に応じてアンチセンスあるいは三重らせんとして
機能しうるようにするのが一般に好ましい。slDNAのル
ープの鎖長を決定する際にも、同様のことを考慮するの
が好ましい。塩基４個から80個の鎖長のループを想定し
うるものの、実施するうえでは、他の条件も勘案して、
塩基40個から60個のループが好ましい。 パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一ではない）
塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含むと定義さ
れている。一部は短いが（一方向に３〜10塩基）、他の
配列は数百の塩基対を含めて、非常に長い。ワトソン
（Watson）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・
ジーン第３版、224〜225頁。 DNAフラグメント中のIRはサイズがかなり変化しう
る。限定するわけではなく、10から30以上のヌクレオチ
ドの逆方向反復を含むslDNAが考えられる。逆方向反復
は300を越えるbpを含むと報告されている。カレント
プロトコール（Current Protocols）、セクション1.4.
10. slDNAは原核生物又は真核生物のホスト発現（例えば
細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生成物であり得
る。 プラスミドのような適当なベクターの例とこれによっ
て形質転換されるホスト細胞は、当業者に周知である。
必要な成分を有するプラスミドの適当なホストには、原
核生物と真核生物とが存在する。原核生物は、例えばエ
シエリキア（Escherichia）属、特に大腸菌；バチルス
（Bacillus）属；特に枯草菌のような微細物を含む。真
核生物は、例えば酵母、動物、植物等であり、動物細
胞、植物細胞等のような微細物を含む。 大腸菌を形質転換することのできるプラスミドは、例
えばpUC型とColE1型プラスミドがある。米国特許第4910
141号参照、大腸菌を形質転換することができるプラス
ミドは例えば、一般にColE1型プラスミドを含む。大腸
菌の形質転換に適当な、他のプラスミドを下記に挙げ
る:pSC101、pSF2124、pMB8、pMB9、pACYC184、pACYC17
7、pCK1、R6K、pBR312、pBR313、pML2、pML21、ColE1A
P、RSF1010、pVH51、pVH153。 枯草菌を形質転換することのできるプラスミドを下記
に挙げる:pC194、pC221、pC223、pUB112、pT127、pE19
4、pUB110、pSA0501、pSA2100、pTP4、pTP5及びこれら
の誘導体。 枯草菌と大腸菌の両方を形質転換することのできるプ
ラスミドは、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.
Bacteriol.）145、422〜428（1982）；プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ザ・USA、75、1433〜1436（1978）
及びプリンシプルズ・オブ・ジーン・マニピュレーショ
ン（Principles of Gene Manipulation）第２版、カ
ル（Carr）等編集、カリフォルニア大学出版局（バーク
レイ）、1981、48頁に述べられている。 真核生物においてslDNA合成を実施するために特に重
要であるのは、サッカロマイセス・セレヴィジェを形質
転換することのできるプラスミド:pMP78、YEp13、pBTI
1、pLC544、YEp2、YRp17、pRB8（YIp30）、pBT17、pBT1
9、pBT110、pAC1、pSLe1、pJDB219、pDB248及びYRp7で
ある。YIp5、pUC−URA3、pUC−LUE2及びpUC−HIS3も考
えられる。メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method
s in Enzymology）194巻、285、373〜378頁「ガイド
・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュ
ラー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics an
d Molecular Biology）」、グスリー（Guthrie）とフ
ィンク（Fenk）編集（1991）、アカデミック プレス社
（Academic Press.Inc.）を参照のこと。他の酵母ベク
ターはエクスペリメンタル・マニピュレーション・オブ
・ジーン・イクスプレッション（Experimental Manipu
lation of Gene Expression）イノウエ マサヨリ
（Masayori Inouye）編集、アカデミック プレス社
（1983）、100〜104頁に述べられている。 さらに、大腸菌ならびに例えばエス・セレヴィジェの
ような酵母の形質転換に用いることができるシャトルベ
クターが特に重要である。このようなベクターはpkb42
とpYC1を含む。他の例はア・プラクティカル・ガイド・
トゥ・モレキュラー・クローニング（Ａ Practical G
uide to Molecular Cloning）ベルナード ペルバル
（Bernard Perbal）による第２版（ウイリーアンドサ
ンズ）中の“コスミド・ベクター・フォー・ロー・アン
ド・ハイカー・ユーカリオーツ（Cosmid Vector for
Low and Hiher Eucaryotes）”に関するセクショ
ンに挙げられている。他の適当なベクターはカレント
プロトコール、２巻、セクション13.4.1、13.4.2（198
9）に述べられる。他の適当なビークルはYEp24〔ボトシ
ュタイン（Botstein）等、ジーン、８、17（1879）〕と
pJDB207〔ベッグ（Beggs）、ゲネチック エンジニヤリ
ング（Genetic Engineering）（ウィリアムソン（Will
iamson）編集）２巻、175頁、アカデミック プレス（1
982）のような、一般のマルチコピーベクターを含む。
選択可能な、他のベクターは、YEp51、YEp52、pYES2の
ようなYEpクラスのプラスミドを含む。 本発明の実施するための商業的に入手可能な真核ベク
ターの例は、例えばCOS、CHO及びHeLa細胞におけるpSVL
とpKSV−10である。他の例はア・プラクティカル・ガイ
ド・トゥ・モレキュラー・クローニングに挙げられてい
る。 こうした複製可能な遺伝的ビークルは、ビークルの複
製に適した遺伝的要素、たとえばビークルの複製起点、
プロモーターなどを含んでいるので、本明細書に記載す
る逆方向反復配列をはじめとする要素が挿入されると、
slDNAが発現されることとなる。しかし、本明細書に記
載する本発明の改善策、すなわちslDNAの過剰発現にお
いては、slDNAの合成ならびに生成は、ビークルの複製
を支配している要素とは異なった、すなわち、ビークル
の複製を支配している要素とは異なる要素に対して応答
あるいは作動する独立に誘導可能なプロモーターおよび
遺伝的要素によって、ビークル、たとえばベクターの複
製とは独立に制御するのが好適である。 形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知の標準的な
一般方法によって実施される。例えば、メソッズ イン
エンザイモロジー、185巻、ジーン・エクスプレッシ
ョン・テクノロジー（Gene Expression Technology）
〔編集者ゴッデル（Goeddel）〕1990（特に、グロス・
オブ・セル・ラインス（Groth of Cell Lines））を
参照、酵母に関しては、メソッズ イン エンザイモロ
ジー、194巻、ガイド・トゥ・イースト・ジェネティク
ス・アンド・モレキュラー・バイオロジーを参照；大腸
菌の増殖条件は、カレント プロトコール イン モレ
キュラー バイオロジー（Current Protocols in Mo
lecular Biology）、１巻、1.1.1、1.1.2、1.1.3、1.
1.4、1.3.1頁及びモレキュラー クローニング：ア ラ
ボラトリー マニュアル（Moloecular Cloning:A Lab
oratory Manual）第２版、1.21頁に述べられており、
プラスミドDNAの精製は、1.23頁に述べられており、哺
乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレント プロトコ
ール、１巻と２巻、9.0.4〜9.0.6、9.1、9.1.2、9.1.
3、9.2.5、9.4.3、11.5.2、11.6.2及び11.7.3頁に述べ
られている。 要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成のために必
要な成分、すなわち開始部位を含むDNAテンプレートフ
ラグメントとIR（及びポリメラーゼ）を複製ビークル中
に供給すると、slDNAが形成されると期待される。 本発明のslDNAの合成をインビトロで実施する場合
に、合成はテンプレートとしてDNAフラグメントを用い
るヌクレオチド鎖の合成のための通常の成分を含む培質
中で実施する。一般に、合成は好ましくはpH7〜９の緩
衝化水溶液中で行われる。DNAテンプレート鎖上にモル
過剰量のオリゴヌクレオチドが存在することが好まし
い、デオキシポリヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dG
TP及びTTPも合成混合物の成分である。溶液を加熱し、
次に冷却する。次にポリメラーゼを加えると、合成が進
行する。これらの成分はここに述べる本発明のための
「通常成分」と呼ばれる。 オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第4415734号
と、マットイシ（Matteuci）等ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティー（J.Am.Chem.Soc.）
103（11）:3185〜3191頁（1981）；アダムス（Adams）
等、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイ
エティー105（３）:661〜663頁（1983）；及びベムケー
ジ（Bemcage）等、テトラヘドロン レタース（Tetrahe
dron Letters）22（20）:1859〜1867（1981）に述べら
れている。 本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子クローニング
を利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子クローニン
グは下記文献に含まれる：サムブロック（Sambrook）
等、モノキュラー クローニング：ア ラボラトリー
マニュアル、第２版、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）、1990、ア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレ
キュラー・クローニング（Ａ Practical Guide to
Molecular Cloning）、第２番、バーナード ペルバル
（1988）；メソッズ イン エンザイモロジー、68巻、
リコンビナントDNA（Recombinant DNA）〔ウー（Wu）
編集者〕、アカデミック プレス、N.Y.,1979;メソッズ
イン エンザイモロジー、185巻、ジーン・エクスプ
レッション・テクノロジー（Gene Expression Techno
logy）〔ゴエデル（Goeddel）編集者〕1990、カレント
プロトコールス イン モレキュラー バイオロジ
ー、1,2及び３巻。 本発明のslDNAは幾つかの重要な用途を有する。本発
明の方法は特定の遺伝子にランダム突然変異を導入する
ために利用することができる。このような系は形質転換
ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を示す図７
に説明される。 この方法は、ステム中の配置された重要な遺伝子を含
むslDNAの合成、slDNAの単離、slDNAから遺伝子の切
断、適当な複製ビークルへのそれのクローニング及びそ
の遺伝子によってコードされる蛋白質の表現を含む。蛋
白質は目的の活性に関して試験することができる。標準
方法によって、コロニーを検査して、突然変異遺伝子を
有するコロニーを確認することができる。 突然変異の発生と確認の説明は次のように進める。la
cZ遺伝子を収容するpUCK19（実施例１参照）中に、DNA
フラグメントとOR（実施例１に示す）との間に35bpIR
（実施例に説明）を含む前出の配列表の配列番号１及び
２で構成され、図２で示す251bpDNAフラグメントを結合
させる。このプラスミドを標準条件下で増殖するコンピ
テント大腸菌CL83に形質転換させる。その後、slDNAを
単離し、lacZ遺伝子を切断して、pUC19中（IR含有フラ
グメントをもっていない）に挿入する。次いでこのプラ
スミドを大腸菌CL83に形質転換させる。突然変異の頻度
をβ−gal、無色基質を用いて公知のインビボ試験によ
って評価する、前記無色基質は加水分解されると暗青色
生成物を生ずる。コロニーが無色である場合には、この
ことがβ−ガラクトシダーゼが製造されないことを示唆
する。 lac遺伝子類の他の遺伝子、例えばlacYもしくはlacA
又は他の適当な遺伝子をこのスクリーニング試験に用い
ることができる。重要な蛋白質（又はポリペプチド）を
コードする遺伝子も、突然変異の頻度決定と、誘導蛋白
質（又はポリペプチド）をコードする適当な遺伝子の選
択とに用いることができる。 スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変異を導入
し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラーゼの選択
を可能にする。従って、例えばlacZ遺伝子のような適当
な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用いることがで
きる。複製確実度（replication fidelity）の低いこ
とが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコードする標的
遺伝子に突然変異を導入するために選択すべき酵素であ
るように思われる。 好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的性質のため
に選択された、突然変異遺伝子を有する、特定のコンピ
テント形質転換ホストによって表現される。 突然変異の頻度は、複製における確実度の低いことが
知られる適当な酵素を選択することによって影響されや
すいと考えられる。従って、標的DNAフラグメント又は
遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度又は不確実度
すなわち挿入DNAフラグメント又は遺伝子の複製におけ
るDNAポリメラーゼによってなされるエラー（error）頻
度に依存する。このようにして、各複製エラーに対して
ランダム突然変異が遺伝子に導入される。DNAポリメラ
ーゼの不確実度が高ければ高いほど、突然変異遺伝子類
は大きくなる（この逆もいえる）。 Pol IIIとPol Iとが有効であると考えられる本発明の
上記実施態様の一つでは、Pol Iが自己修正機能を有す
ることが知られているので、Pol IIが低い確実性を有す
ると考えられる。このようにして、系の複製確実度はDN
Aポリメラーゼの適当な選択によって調節することがで
きる。一般に、ランダム突然変異は第２鎖を合成するポ
リメラーゼによって導入されやすいと考えられる。興味
ある候補ポリメラーゼはRTである。 好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体交差（chro
mosomal crossover）に有用である。この方法によっ
て、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有するslDNAを
用いて、同種の一つの分子からもう一つの分子への遺伝
情報を融和させ、交換することができる。突然変異遺伝
子はゲノム内にベクター塩基配列に類似した塩基配列を
配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子によって複製さ
れる。 このようにして、突然変異遺伝子を含み、好ましい蛋
白質を表現する微生物の新しい系統が発生することがで
きる。突然変異遺伝子を有するslDNAはインビトロ又は
インビボで製造することができる。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はDNAの特定セグメント
をインビトロ酵素増幅するための迅速手段である。標準
PCR方法は増幅すべき二重鎖DNAセグメント、セグメント
と側面を接する常に二つの一重鎖オリゴヌクレオチドプ
ライマー、DNAポリメラーゼ、適当なデオキシリボヌク
レオシド三リン酸（dNTP）、バッファー及び塩を必要と
する。カレント プトロコール セクション15参照のこ
と。 本発明のss−slDNAは単一プライマーによって増幅す
ることができる。この特徴は増幅をかなり簡単化し、プ
ライマーがその適当な複製開始部位を見出す問題の解決
を助け、これをさらに経済的にし、従来のPCR方法に付
随する問題の解決を助ける。 slDNAの増幅はslDNAを変性して、一重鎖DNA（３′か
ら５′末端まで）を形成することを含む。この反応は通
常の順序:3′末端からのプライミング、ポリメラーゼ反
応、変性とアニーリングに従って行われる。これが25サ
イクル実施されると、slDNAの100万倍増幅が生ずる。sl
DNAは標的蛋白質をコードする遺伝子を有することがで
きる。 エルリッヒ（Erlich）等による“リーセント・アドバ
ンシーズ・イン・ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（Recent Advances in Polymerase Chain React
ion）”なるタイトルのサイエンス（Science）252、164
3〜1650（1991年６月21日）内の最近の報告はプライマ
ーに関連する問題と、PCR方法に提案されている改良と
を考察している。 従って、本発明のss−slDNA構造を１プライマーを用
いる方法によって増幅する方法は非常に重要である。sl
DNAは例えば改良された生物学的特性を有する突然変異
遺伝子のような、重要な遺伝子を有することができる。 本発明のslDNAのインビボ製造は目的の塩基配列を形
成するように操作されることができる。このようにして
製造されたslDNAを次に、アンチセンス（antisense）DN
Aとして用いることができる。 現在考えられている魅力的な用途は、本発明のslDNA
が三重鎖らせんDNA、すなわち三重鎖DNAを形成し、結果
としての新しい三重鎖slDNAの形成に果たす役割であ
る。サイエンス、252、1374〜1375（1991年６月27日）
における最近の報告、“トリプレックス・DNA・ファイ
ナリー・カムズ・オブ・エイジ（Triplex DNA Finall
y Comes of Age）”は本発明の適時性を強調してい
る。三重鎖DNAは第３鎖を染色体DNA上の特定認識部位に
結合させることによって製造することができる。好まし
くは塩基の完全量（full complement）（例えば11〜15
以上）を含むサイズの合成鎖を検討している。長い３′
（又は５′）末端（及び非重複塩基のループ）を有する
本発明のslDNAは良好な候補であるように思われる。結
果として生ずる三重鎖DNAは大きな安定性と有用性とを
有するように思われる。AIDS療法、選択的遺伝子阻害等
を含めた三重鎖らせん形成に基づく新しい療法がこの報
告に提案されている。 本発明の重要な実施態様の一つでは、slDNAは、その
一本鎖部分に、アンチセンス断片あるいは三重らせん形
成能をもつ配列として遺伝子機能を調節するDNA配列で
あるアンチジーンを有している。 アンチセンス配列、三重鎖形成配列等の遺伝子制御配
列（以下、アンチジーンと称す）を有するslDNAはイン
ビボの系において遺伝子制御DNAとして生成、利用でき
る。 生命現象はその根元をたどると遺伝子に組み込まれた
情報によってつかさどらえているので、その遺伝子に何
らかの方法で直接働きかけることは特定の遺伝子の発現
制御をするうえで最も効果的な手法である。遺伝子光学
的手法で遺伝子の発現制御する方法としてアンチセンス
RNA、アンチセンスDNA、それに三重鎖形成能をもつ核酸
等を使用する方法が知られている。アンチセンスRNA及
びアンチセンスDNAに関しては、ターゲット遺伝子から
生産されるメッセンジャーRNAと相補的な配列を持つRNA
又はDNAを細胞内に供給することによりメッセンジャーR
NAとアニーリングし、部分的に二重鎖の核酸を形成し、
メッセンジャーRNAから蛋白へと翻訳されるのを阻害す
る。このアンチセンスRNAは適当なプロモーターによっ
て細胞内で生産させることができるが、アンチセンスDN
Aは一重鎖DNAであるがゆえにインビボでの生産は難し
く、合成したDNAをアンチセンスDNAとして細胞の外から
供給し、遺伝子制御効果を見るにとどまっている。 次に三重鎖DNA形成能を持つ核酸に関して述べると、
例えばプリン塩基（ＧあるいはＡ）、他方に相補的なピ
リミジン塩基（ＣあるいはＴ）が並んだ二重鎖のポリプ
リン、ポリピリミジン配列に対してはHoogsteen型の結
合を介して酸本目の鎖が形成し、部分的に三重鎖になる
ことが知られている。この三本目の鎖が三重鎖形成能を
持つ核酸であり、遺伝子の制御ばかりではなく遺伝子工
学的にも様々な応用例が提唱されている。しかし、実際
に遺伝子の発現の調節という観点から治療法へと結びつ
けるにあたり、この三重鎖形成能を持つ核酸を細胞内で
生産させることはアンチセンスDNA同様難しく、合成DNA
を細胞の外から供給し遺伝子制御の効果を見るにとどま
っている。 インビトロの系においてアンチセンスDNA、三重鎖形
成能を持つDNAを生成させることは、最近のDNA合成機の
進歩によってもはや簡単に作ることができるようになっ
た。しかし、インビボの系においてこのような一重鎖DN
Aを人為的に生産させることはmsDNAを除いて知られてい
ない。しかし、msDNAは細胞内でmRNAを生成させ逆転写
酵素によって一重鎖cDNAを合成するもので、その生成過
程の複雑さから応用面に至ることが非常に難しい。 一方、アンチジーンを有するslDNAはインビボで生成
させるにあたりmRNAの中間体を介さずに直接二重鎖のDN
Aから一重鎖DNAを生成させ、それを遺伝子制御に応用さ
せ得る。 遺伝子が複製する際にその複製方向の途中に逆方向反
復配列（IR配列）が存在すると、第一鎖DNA合成がそのI
R配列内でそれまで鋳型としていたDNAとは別の同じIR配
列を持つ鋳型DNAとアニーリングし、そこから第二鎖のD
NA合成が始まり複製開始点に向かって合成が進む。そし
て適当な転写終結部位においてDNA合成が終わり、第一
鎖DNA合成の際に鋳型とした遺伝子からslDNAとして遊離
する。slDNAはループを形成している部分及び３′末端
または５′末端が一重鎖構造を有していて、アンチセン
スDNAまたは三重鎖形成能を持つDNAはこれらの部位にそ
の塩基配列を入れることができる。すると遺伝子が複製
する過程においてこれらアンチジーンの配列を持つslDN
Aが生成され、インビボの系においてもアンチセンスDN
A、または三重鎖形成能を持つ一重鎖DNAを生成させるこ
とができる。 アンチセンスDNA配列を持つslDNAはターゲットのRNA
とアニーリングし、その遺伝子機能を阻害するばかりで
なく、アンチセンスDNAを持つslDNAとアニーリングした
ターゲットRNAは通常細胞内に内在するRNaseHによって
分解されていく。 三重鎖形成能を持つDNAを含むslDNAも遺伝子が複製す
る際slDNAとして生産されるのでインビボで常時三重鎖
形成能を持つ一重鎖DNAが生産され、該DNAによるターゲ
ット遺伝子の二重鎖DNAの制御が可能となる。 次に、実際にアンチセンスDNAまたは三重鎖形成能を
持つDNAといったアンチジーンをslDNA内に組み込み、発
現させる方法について詳細に説明する。 まずslDNAのループ内にアンチジーンを入れるには、
例えばプラスミドを用いてslDNAを生成させる場合には
プラスミドの複製方向の途中にIR配列を挿入し、アンチ
ジーン配列は二つの反復配列の間にクローニングすれば
よい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転換すること
によって、このプラスミドを持つ細胞はプラスミドが複
製する際にアンチジーンを持つslDNAを生産し続ける。 またslDNAはその生産過程において、５′末端のプラ
イミング位置と転写終結部位とが異なる場合が多く、
５′末端または３′末端が突出した構造をとっている。
そこでこの突出した部分にアンチジーンを挿入すること
ができる。slDNAの３′末端または５′末端の突出した
部分にアンチジーンの入ったslDNAを生産させるには、I
R配列を含むプラスミドのslDNAが複製を開始する部分と
転写終結する部分の間にアンチジーンの配列をクローニ
ングすればよい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転
換しslDNAを生産させると、slDNAの５′末端または３′
末端のいずれか突出した部分にアンチジーンの配列の入
った一重鎖DNAが生成する。 slDNAは原核生物である大腸菌で発見されたが、真核
生物である酵母においてもslDNAは生産され、アンチジ
ーンを持つslDNAが様々な真核細胞（例えば動物細胞）
においても生産され、遺伝子制御に用いることができ
る。 本発明が技術と科学に有為な貢献をすることは認めら
れるであろう。 以上に述べたように、slDNAは価値ある遺伝的構築物
である。したがって、こうしたslDNAを、これまで達成
しえなかった収率で生成するという重要な必要性が存在
するのである。 本発明は、slDNAを高収率で発現する方法ならびに遺
伝的構築物を提供するものである。従来記載されてきた
態様の方法では、組換え型DNAのビークルの複製起点か
らの複製を開始するプライマーの内在的レベルによっ
て、slDNAの生成レベルが決定かつ制限されていた。本
発明のこの実施態様では、最良の結果をうるべく、組換
え型DNA構築物が、ビークルの複製を制御する遺伝的要
素とは独立に作動する一群の要素を含む系を構築した。
この系、すなわち一群の要素では、slDNA合成に関わる
プライマーの細胞でのソベルが劇的に上昇しているの
で、価値あるslDNAの合成が高率で開始され、高収率で
発現される。 slDNAは原核生物あるいは真核性物で発現させること
ができる。細胞の発現方法は、slDNAの発現を誘導しう
る、組換え型DNAが自己複製可能なビークルで形質転換
した原核生物あるいは真核生物の宿主を培養する工程か
らなるものである。この組換え型DNAビークルは、以下
の要素が作動可能に連結されたものである。すなわち、
このビークルは、誘導可能なプロモーター、好ましくは
強力なプロモーター−オペレーターをコードするDNA配
列を含んでおり、この誘導可能なプロモーターが誘導さ
れると、RNAプライマーあるいはタンパク質、たとえば
プライマーゼのような酵素が生成され、このRNAプライ
マーあるいはタンパク質が、宿主細胞に内在する適当な
基質ならびにDNAポリメラーゼを利用したslDNAの合成を
開始するべく機能する。さらに、このビークルは、RNA
プライマーあるいはプライマーゼをコードしているDNA
配列の下流側に、逆方向反復配列を有している。さら
に、この組換え型DNAビークルは、DNAビークル自体の複
製に際して機能する複製起点、ならびに選択を可能とす
るマーカー、たとえば、抗生物質に対する耐性を付与す
る遺伝子を有している。 本発明の好適実施態様では、slDNAの合成の開始は、
組換え型DNAビークルの複製に付随、あるいは依存する
ものではない。しかし、本発明は、slDNAの合成を開始
するプライマーがプラスミドの複製も開始するように組
換え型DNAビークルを構築することも包含するものであ
る。 一本鎖部分にアンチジーン断片を含むslDNAを過剰発
現させようとする場合には、複製可能なビークルは、二
つの反対向きの逆方向反復配列の間、あるいはslDNAの
合成開始に際して使用されるプライミング部位と逆方向
反復配列との間にアンチジーン断片を有するものとす
る。かくして、アンチジーン断片を保持するslDNAが高
収率で生成されることとなる。 RNAプライマーあるいはプライマーゼタンパク質をコ
ードしているDNA断片の発現を誘導するうえで有用な誘
導可能なプロモーターとしては、たとえば、SV40の初期
あるいは後期プロモーター、lacプロモーター、trpプロ
モーター、tacあるいはTRCプロモーター、λファージの
主要なプロモーター、たとえばλpl、λprなど、fdコー
トタンパク質のプロモーター、ｅ−ホスホグリセレート
キナーゼ等の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファター
ゼのプロモーター、酵母交配因子のプロモーターをはじ
めとする、真核生物あるいは原核生物の細胞、またはそ
れらのウイルスの遺伝子の発現を制御していることが既
知の種々の配列を挙げることができる。slDNAを哺乳動
物の細胞で発現しようとする場合には、遺伝子をデヒド
ロ葉酸還元酵素をコードしている遺伝子に結合し、所望
の遺伝子を増幅することとなる細胞の選択を行うことに
よって、発現単位を増幅することも可能である。 有用なプロモーターは、適当な誘導物質で誘導するこ
とが可能である。たとえば、lacならびにtacプロモータ
ーは、IPTGで誘導され、λplあるいはλprプロモーター
の発現を誘導する際には、マリディクシック（malidixi
c）酸が一般に使用される。こうした組み合わせは、当
業界で他にも公知である。たとえば、下記で引用するコ
ーンバーグ（Kornberg）の「DNAレプリケーション（DNA
Replication）」、ならびに「カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current P
rotocols in Molecular Biology）」、アウスベット
（Ausubet）ら、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社
（John Wiley ＆ Sons,Inc.）、1994（「カレント・プ
ロトコール（Current Protocols）」）を参照された
い。 真核生物、たとえば上述のような酵母細胞、あるいは
哺乳動物の細胞中でslDNAを過剰発現しようとする場合
には、酵母細胞の複製系がslDNAの合成系とは分離さ
れ、酵母細胞から発現されるslDNAが、酵母細胞の複製
より高レベルかつ高速に、しかも酵母細胞の複製とは独
立に発現される、上述のようなプロトコールを使用する
ものである。各種の適切な技法、ならびに酵母の分子生
物学については、「ガイド・トゥ・イースト・ジェネテ
ィクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Guide
to Yeast Genetics and Molecular Biolog
y）」、ガスリーら（GuthrieおよびFink）編、アカデミ
ック・プレス社（Academic Press,Inc.）、ならびにメ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzym
ology）、194巻、1991をはじめとする本明細書に引用し
た参考文献を参照されたい。また、「エキスペリメンタ
ル・マニピュレーション・オブ・ジーン・エキスプレッ
ション（Experimental Manipulation of Gene Expr
ession）」、井上（Masayori Inouye）編、アカデミッ
ク・プレス（Academic Press）、1983の全体ならびに
第５章、「ベクターズ・フォー・ハイ・レベル，インダ
クトリアル・エキスプレッション・オブ・クローンド・
ジーンズ・イン・イースト（Vectors for High Leve
l,Inducible Expression of Cloned Genes in Ye
ast）」も参照されたい。 図17および18は、本発明の好適な構築物を構成するプ
ロトコールを例示するものである。図17に示すように、
slDNAの合成を開始するべく機能するプライミング部位
は、プラスミド、たとえば図17のpUC19の複製起点から
誘導される。しかし、その最終形態では、このプライミ
ング部位が、slDNAをコードする組換え型DNAビークルの
複製において機能することはなく、組換え型DNAビーク
ルはそれ自身の機能的な複製起点を有している。 他の複製起点を使用してslDNAの合成を誘導すること
もでき、例としては、pMB1、ColE1、pSC101、R6−５、m
ini Ｆ、R1、R100、R6K、Rts1、RK2、P1、ColE II、Co
lE III、p15A、TAバクテリオファージ、T7バクテリオフ
ァージ、RSF1030、pBR、ならびにpUCを挙げることがで
きる。 当業界でも周知のように、こうした複製起点の中に
は、効率良く作用するうえでタンパク質を必要とするも
のがある。合成開始のプライミング部位がこうした複製
起点に由来する場合に、誘導可能なプロモーターを、こ
うした状況において、この種のタンパク質の発現を誘導
しうるものとすることも、本発明の範囲に包含される。
本発明は、フライミング部位を、図17に示した以外の複
製起点から誘導する場合も包含するものである。使用が
可能な図17以外の複製起点としては、pMB1、ColE1、pSC
101、R6−５、mini Ｆ、R1、R100、R6K、RTs1、RK2、P
1、ColE II、ColE III、p15A、RDF1030、T4バクテリオ
ファージ、T7バクテリオファージ、pBR、ならびにpUCが
ある。また、本発明は、組換え型DNAビークルの複製を
誘導する機能的複製起点を、図17に示したp15A以外のも
のとすることも包含するものであり、こうした複製起点
としては、pMBI、ColE1、pSC101、R6−５、mini Ｆ、R
1、R100、R6K、RTs1、RK2、P1、ColE II、ColE III、T4
バクテリオファージ、T7バクテリオファージ、p15A、RS
F1030、pBR、ならびにpUCがある。当業界では、これら
以外にも各種の複製起点が知られている。「DNAレプリ
ケーション（DNA Replication）」、オックスフォード
大学出版局（Oxford University Press）、1991;「DN
Aレプリケーション（DNA Replication）」、W.H.コー
ンバーグ（Kornberg,W.H.）、フリーマン・アンド・カ
ンパニー（Freeman and Company）、1980。 出発プラスミドとしては、pUC106以外にも、適切な複
製起点を有するものが多数あり、例として、たとえば、
pMB1、ColE1、mini Ｆ、R1、R100、R6K、Rts1、RK2、
Ｆ、P1、T4バクテリオファージ、T7バクテリオファー
ジ、ColE II、ColE IIIなどを挙げることができる。 DNA組換え型ビークルで形質転換あるいはトランスフ
ェクションした宿主を培養する方法は周知である。こう
した方法では、宿主を適当な成長条件で培養し、所望の
slDNAを培養から集める。本明細書に引用した「カレン
ト・プロトコール（Current Protocols）」を参照され
たい。 好適実施態様の詳細な説明 本発明の好適実施態様は、図17および18を参照するこ
とによって容易に説明することができる。 図17からわかるように、構築物である組換え型DNAビ
ークルpHS2780は、機能的複製起点p15A、すなわち、プ
ラスミドの複製に際してともに機能する開始プライマー
RNA I、RNA II、ならびにROPタンパク質をコードしてい
るプラスミドの領域を有している。図からわかるよう
に、p15A Ori領域は、pSTV28に由来するものである。 この一組の要素は、プラスミド自体の複製をつかさど
るものであって、slDNAの合成を誘導するものではな
い。slDNAを合成する機能を担っているのは、プラスミ
ドの複製とは独立にslDNAの合成を誘導する一組の要素
である。この一組の要素は、誘導されると逆方向反復配
列の上流側に位置するプライマーを生成する、誘導可能
な強力なプロモーター−オペレーターを有している。ま
たこのプロモーター−オペロンの下流側に隣接して、こ
のプラスミドは、slDNAの合成を開始するRNAプライマ
ー、たとえばRNA IIあるいはタンパク質、たとえば上述
のプライマーゼをコードするDNA断片を有している。こ
のDNA断片の下流には、上述したようにslDNAの合成に関
わり、slDNAの一部を構成する逆方向反復が位置してい
る。slDNAがアンチジーンを有していることが望ましい
場合には、このアンチジーンは、逆方向反復の上流側、
かつプライマーをコードするDNAの下流側、すなわちこ
れらの２要素の間、あるいは逆方向反復配列の二つの反
対向きのセグメントの間に、たとえば適当な制限部位へ
の挿入によって位置させるものとする。上述したよう
に、このアンチ遺伝子は、標的mRNAにアニーリングし
て、mRNAのタンパク質への翻訳を阻害するか、あるい
は、dsDNAと結合して三重らせんを形成することによっ
て、標的DNAの発現を阻害することのできる断片であ
る。 こうした説明から明らかなように、slDNAの合成に際
して作動する諸要素は、プラスミドの複製を制御する諸
要素とは異なった各種の遺伝的構築物を起源としうるも
のであるが、必ずしもそうでなくともかまわない。 本明細書に教示するように、本発明は、slDNAを、プ
ラスミド自体の複製とは独立に合成するプラスミドを構
築するにあたっての一般的なスキームを提供するもので
ある。このスキームでは、slDNAの合成に関与し、slDNA
のステムを構成する所望の長さの逆方向反復配列を含む
DNA断片が、任意所望の複製可能なビークルに挿入され
る。したがって、本発明では、プラスミド自体の合成と
は独立に、またプラスミド自体の合成より過剰となるよ
うに、slDNAの複製を調節することが可能となるもので
ある。 本発明は、例示した特定の構築物、あるいは機能的要
素の起点となる構築物に限定されるものではないことに
留意することが肝要である。また、本発明は、特定のプ
ラスミドに限定されるものでもなく、最終構築物に必要
とされる遺伝的要素を提供するような任意の他のプラス
ミドあるいはビークルを選択することが可能である。 また、本発明は、例示した特定の遺伝的要素に限定さ
れるものでもない。当業者であれば、本発明の概念を本
発明の一般的概念にしたがって実施する適当な手段を容
易に構築しうるはずである。 以上では、本発明の実施態様をいくつか記載した。以
上の記載から、本発明の教示内容を利用することによっ
て、slDNAのような一本鎖分子を過剰発現するのと実質
的に同一の結果をもたらすもっと別の実施態様も利用可
能となることが明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 井上 正順 米国， ニュージャージー 08807， ブリッジ ウォーター， リンベイル レーン ３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】適合性の宿主中でslDNAを過剰発現させる
    ための組換え型自己複製性DNA分子であって、以下の要
    素、すなわち、 強力な誘導性のプロモーター−オペレーター、 このプロモーター−オペレーターの下流側に隣接する、
    slDNAの合成を開始するプライマーをコードするDNA断
    片、ならびに このDNA断片の下流側に隣接する逆方向反復配列、 を含み、これらの要素が、分子の複製とは独立にslDNA
    を複製するべく作動し、さらに slDNAの合成とは独立に、プラスミドの複製を誘導する
    複製起点 を含むDNA分子。
  2. 【請求項２】プロモーターの誘導によって生成するプラ
    イマーが、逆方向反復配列の上流側のDNA断片によって
    コードされる複製起点にのみアニールする請求の範囲第
    １項に記載のDNA分子。
  3. 【請求項３】DNA分子の複製を生じる遺伝的要素が、slD
    NAの合成を生じる遺伝的要素とは遺伝子上異なった分子
    に由来するものである請求の範囲第２項に記載のDNA分
    子。
  4. 【請求項４】一方の複製起点が、分子の複製を誘導し、
    DNA断片によってコードされるもう一方の複製起点が、s
    lDNAの合成を誘導するものである請求の範囲第１項に記
    載のDNA分子。
  5. 【請求項５】DNA断片によってコードされるプライマー
    が、RNAプライマーである請求の範囲第４項に記載のDNA
    分子。
  6. 【請求項６】DNA断片によってコードされるプライマー
    が、プライマーゼである請求の範囲第１項に記載のDNA
    分子。
  7. 【請求項７】slDNAの複製要素である複製起点のプライ
    マーがRNA IIプライマーである請求の範囲第４項に記載
    のDNA分子。
  8. 【請求項８】分子の複製を誘導する複製起点が、pUC型
    プラスミド以外のプラスミドに由来するものである請求
    の範囲第３項に記載のDNA分子。
  9. 【請求項９】ビークルがプラスミドである請求の範囲第
    １項に記載のDNA分子。
  10. 【請求項１０】プラスミドがE.coli（大腸菌）のプラス
    ミドである請求の範囲第９項に記載のDNA分子。
  11. 【請求項１１】DNA分子が、プライマーをコードするDNA
    断片と逆方向反復配列との間、あるいは逆方向反復配列
    の二つの反対向きの配列の間に位置する、異種由来のDN
    Aアンチ遺伝子配列を有している請求の範囲第１項に記
    載のDNA分子。
  12. 【請求項１２】DNAアンチジーンが、逆方向反復配列に
    位置している請求の範囲第11項に記載のDNA分子。
  13. 【請求項１３】原核生物である宿主中で、slDNAをDNA分
    子の複製とは独立に高収率で発現する組換え型DNA分子
    で形質転換した宿主を培養する工程からなり、このDNA
    分子が以下の要素、すなわち 強力な誘導性のプロモーター−オペレーター、 このプロモーター−オペレーターの下流側に隣接する、
    slDNAの合成を開始するプライマーをコードするDNA断
    片、ならびに このDNA断片の下流側に隣接する逆方向反復配列、 を含み、これらの要素が、分子の複製とは独立にslDNA
    を複製するべく作動し、さらに slDNAの合成とは独立に、プラスミドの複製を誘導する
    複製起点 を含むものである、 slDNAの発現を改善する方法。
  14. 【請求項１４】プロモーターの誘導に際して生成するプ
    ライマーが、逆方向反復塩基配列の上流側のDNA断片に
    よってコードされる複製起点にのみアニールする請求の
    範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】DNA分子の複製を生じる遺伝的要素が、s
    lDNAの合成を生じる遺伝的要素とは遺伝上異なった分子
    に由来するものである請求の範囲第13項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】一方の複製起点が、分子の複製を誘導
    し、DNA断片によってコードされるもう一方の複製起点
    が、slDNAの合成を誘導するものである請求の範囲第13
    項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】DNA断片によってコードされるプライマ
    ーが、RNAプライマーである請求の範囲第15項に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】DNA断片によってコードされるプライマ
    ーが、プライマーゼである請求の範囲第13項に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】分子の複製を誘導する複製起点が、pUC
    型プラスミド以外のプラスミドに由来するものである請
    求の範囲第13項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】RNAプライマーが、RNA IIプライマーで
    ある請求の範囲第13項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】DNA分子を複製するべく作動する遺伝的
    要素が、slDNAを合成するべく機能する遺伝的要素とは
    独立に機能する請求の範囲第15項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】DNA分子が、プライマーをコードするDNA
    断片と逆方向反復配列との間、あるいは逆方向反復配列
    の二つの反対向きの配列の間に位置する、外来のDNAア
    ンチジーン配列を有している請求の範囲第13項に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】DNAアンチジーンが、逆方向反復配列に
    位置している請求の範囲第22項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】請求の範囲第2,3,4,5,8、および９項の
    いずれかに記載の組換え型分子によって形質転換された
    原核生物の宿主。
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