JPH11500604A

JPH11500604A - 変性ニシンの製造

Info

Publication number: JPH11500604A
Application number: JP8516660A
Authority: JP
Inventors: ジョンギャソン，マイケル; メアードッド，ヘレン
Original assignee: インスティテュートオブフードリサーチ
Priority date: 1994-11-19
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1999-01-19
Also published as: EP0793727B1; SK62297A3; PL320328A1; HUT77421A; NO972277D0; CN1085249C; DE69534133T2; FI972100A; AU3876195A; KR970707290A; CZ152197A3; EP0793727A1; US6448034B1; ATE292686T1; GB9423404D0; DE69534133D1; CA2205204A1; CN1171134A; AU708788B2; NO972277L

Abstract

(57)【要約】変性ｎｉｓＡ遺伝子を含有し、変性ｎｉｓＡ遺伝子が、未変性のｎｉｓＡ遺伝子およびニシン修飾、分泌および免疫のための遺伝子を含有する遺伝子クラスターに対する未変性のｎｉｓＡ遺伝子と同じ関係を備えた、末変性ｎｉｓＡ遺伝子を含まないがニシンを発現する細胞。好ましくは、未変性の染色体ｎｉｓＡ遺伝子が欠失し、細胞が未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体局在位置に変性ｎｉｓＡ遺伝子を含む。細胞の作成方法、およびニシン、特に変性ニシンの産生方法が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】変性ニシンの製造本発明は、ニシン、特にタンパク工学によるニシンの製造のための改良された方法および菌株に関する。ニシンは、高度に修飾されたペプチド抗生物質であり、例えば、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)のある種の株によって産生される。多くの胞子細菌を含む広範囲のグラム陽性菌、及び食品病原、例えば、Listeria，Cloctr idia，及び Bacillus種（Food Preservatives(N.J. Russell & G.W. Goulds 編) 135-152頁，Blackie and Sons，Glasgou，UK の Fowler & Gasson(1990)参照）に対する有効性により、食品工業において特に興味深い。ニシンの化学構造は良好に確立されている（図１）。これは、ランチビオチックス(lantibiotics)と呼ばれる抗生物質に属する。これらの異常な多環ペプチドは、デヒドロー残基及び鎖間スルフィド架橋という構造的特徴を有し、ランチオノン(lanthionone)及びβ−メチランチオノン(methyllantionine)環を形成する。ペプチド前駆体（lantibiotics は、Jung（1991）による最近の詳細な総説，N Isins and novel lantibiotics（Jury，G．& Sahl，H.S．編）1-34頁，ESCOM，L eiden，Netherlands の主題である）の主要配列にあるアミノ酸であるセリン、スレオニン及びシステイン・ポスト翻訳変性によってアチピカル(atypical)な残基が導入される。ニシンの生合成は、プレ−ニシン（ｎｉｓＡ）として知られるニシンの両方の不活性前駆体を含み、及びニシン成熟のための酵素の修飾も含む。成熟ニシン分子は３４アミノ酸の配列に基づく。ｎｉｓＡにエンコードされるタンパク質は、２３アミノ酸Ｎ末端シグナル配列を含み、それはニシンの分泌の間に切断される。ｎｉｓＡにエンコードされたプレ−ニシンの成熟ニシンへの変換は、読み枠の切断及び個々のアミノ酸の変性を含む。ｎｉｓＡ遺伝子はクローンされ、特性化されて、染色体配置を有することが示された（Dodd 等,（1990） J．Gen．Microbiol．136，555-556 参照）。ｐｒｅニシンの酵素的変性、位置変換(translocation)及び免疫(immunity)に含まれる多くの付加的遺伝子が、ニシン産生株によってエンコードされる（Kuipers 等（1993）Eur．J．Biochem．216 281-2 91; Engelke 等（1994）Appl．Environ．Microbiol．60，814-825）。確立されたタンパク質工学技術が、ニシンのアミノ酸配列に変化を導入するために用いられる。これは、ニシン構造遺伝子、ｎｉｓＡのコード領域を、例えば、位置指向性またはランダムな突然変異によって修飾することを含む。これらの変化の発現は、ニシンがポスト翻訳的に変性されるという事実によって複雑化されている。変性ニシンは、必須成熟マシナリー(necessary maturation machinery)をエンコードする変性ｎｉｓＡ遺伝子の宿主中での発現によって構成され、よって修飾ペプチド前駆体を加工することができる。一つの試みは、ニシン産生株を変性ｎｉｓＡ遺伝子をエンコードする組み換えプラスミドで形質転換することである。このバックグラウンドでは、宿主の成熟酵素が内在するプレ−ニシンと、プラスミドにエンコードされたその変性体を加工することができる。このタイプの方法は、野生型ニシントランスポゾンを有する株に対して報告されている（Kuiper s 等（1991）Nisins and novel lantibiotics（Jury，G．& Sahl，H.S. 編）250 -259頁，ESCOM，Leiden，Netherlands）。しかしながら、このシステムの欠点は、宿主のニシン及び工学的変性体の両方がともに合成され、新規なペプチドの特性分析に先立って複雑な化学的分離手段が必要なことである。このような方法は、特に変性ニシンの工業的規模の製造には好ましくない。ＷＯ９３／２０２１３は、ラクトコッカスからの未変性ニシン無しでのニシンの製造方法を記載しており、そこでは、プラスミド由来の変性ｎｉｓＡ遺伝子（変性ニシンをエンコードする）が、未変性ｎｉｓＡニシンを分泌しないが、ニシンの修飾、免疫性、細胞からの位置変換のための遺伝子を発現することは可能なラクトコッカス株に導入される。ＷＯ９２／１８６３３は、未変性ｎｉｓＡを産生しないラクトコッカス株におけるｎｉｓＡ遺伝子（またはその突然変異体）からの変性ニシンを発現するプラスミドをベースとするシステムを開示している予想しないことだが、我々は、ｎｉｓＡ遺伝子（またはその少なくとも一部）の未変性の染色体コピーを変性ｎｉｓＡ遺伝子（またはそのコピー）で置換することにより、ラクトコッカスから驚くほど高レベルのニシン、特に変性ニシンを製造することができることを見いだした。よって、本発明は、高効率で変性ニシンを産生するための改良された方法及び生物を提供する。本発明の１つの態様は、未変性ｎｉｓＡは含まないがニシンを発現する細胞を製造する方法を提供し、この方法は、変性ｎｉｓＡ及びニシン修飾用の遺伝子を有する細胞の提供、分秘、及び免疫の工程からなり、前記変性ｎｉｓＡ遺伝子は、未変性ｎｉｓＡ遺伝子を含む遺伝子クラスター及びニシン修飾、分泌及び免疫用の遺伝子に対して、未変性ｎｉｓＡ遺伝子と同様の関係を持つ。「変性ｎｉｓＡ及びニシン修飾、分泌及び免疫用の遺伝子に対して、未変性ｎｉｓＡ遺伝子を有する細胞を提供する」というのは、ニシン修飾、分泌及び免疫用の遺伝子を既に含む細胞に、及び、変性ｎｉｓＡ遺伝子プラスニシン修飾、分泌及び免疫用の遺伝子を同時に含む細胞に変性ｎｉｓＡ遺伝子を挿入することを意味する。（加工されてニシンＡを形成する）プレ−ニシンＡをエンコードする遺伝子及びラクトコッカス・ラクチスから（ｎｉｓＡＢＴＣＩＰＲＫ）からのニシン修飾、分泌及び免疫用の遺伝子は、Kuipers,ら,（1993）Eur.J.Biochem．216，281-2 91 及び Engelke,ら,（1994）Appl．Environ．Microbiol．60，814-825 に記載せれており、ここに参考文献として取り入れる。ｎｉｓＡ遺伝子は、プレ−ニシン（プレ−ニシンは分泌中に切断される２３アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含む）；ｎｉｓＢ及びＣは、ｎｉｓＡ遺伝子の発現から直接形成されるプレ−ニシンを修飾する反応に含まれると思われる；ｎｉｓＰは、十分に成熟した前駆体ニシンの分子外加工に含まれている；ｎｉｓＲ及びＫは遺伝子発現に含まれ、ｎｉｓＩは、ニシンの免疫に含まれる。ｎｉｓＡＢＴＣＩＰＲＫ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を、図７及び８に示す。好ましくは、変性ｎｉｓＡ遺伝子は、遺伝子クラスターの未変性ｎｉｓＡ遺伝子と同じ位置に結合する。細胞はラクトコッカル細胞が好ましく、ラクトコッカス・ラクチス細胞が最も好ましい。好ましい細胞、特にラクトコッカス細胞は、当業者には容易に入手できる。明らかに、それらはニシン産生細胞、好ましくはニシン産生、成熟及び分泌細胞であることが要求されるが、そのような任意の細胞が使用できる。例えば、未変性のニシン産生株は、Institute of Food Resear ch, Norwich Laboratory，Norwich Research Park，Coleney，Norwich NR4 7UA の National Collection of Food Bacteria に、ＮＣＦＢ８９４として寄託され（Gasson（1984）FEMS Nicrobiol．Lett.，21，7-10 に記載され）ているが、これは本発明の方法で使用するのに好ましいＬａｃｔｏｃｏｃｃａｌ細胞である。「未変性ｎｉｎＡニシン」とは、いくつかの未変性ニシン産生株絹菌によって製造されるペプチド抗生物質を意味する。成熟分子は、遺伝子ｎｉｓＡによってエンコードされるアミノ酸の配列に基づく。未変性ｎｉｓＡニシンの化学構造を図１に示す。また、「未変性ｎｉｓＡニシン」という用語は、図１に示したｎｉｓＡニシンをベースとするが、これとは異なる他の未変性ニシンも含む。例えば、位置２７のヒスチジンがアスパラギンに置換された以外は、図１に示したｎｉｓＡニシンと同じ化学構造を持つニシンＺも含まれる。ニシンＺをエンコードする遺伝子は、図１に示したニシンＡをエンコードするｎｉｓＡ遺伝子に比較して１個だけヌクレオチド置換を含むことがわかった。「未変性レベルに比較して、その未変性ｎｉｓＡニシンのレベルが向上する」とは、同じ培養条件下で生育したときに、未修飾の細胞と比較して、少なくとも５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは５０％以上、そして最も好ましくは＞１００％の末変性ｎｉｓＡニシンを製造する方法で修飾した細胞を意味する。「変性ニシン」とは、未変性ｎｉｓＡニシンのタンパク質工学的な変性体を意味し、ｎｉｓＡ遺伝子の位置指向的またはランダムな突然変異の結果としてアミノ酸配列が変化している。便宜的に、１以上のミスセンス突然変異がタンパク質コード領域に挿入され、その結果、１以上のアミノ酸が他に置換される。あるいは、ノンセンス突然変異を導入し、トランケーテッド(truncated)ニシンを製造してもよい。この場合、ニシンは、なお抗生物質活性を維持している。さらに、結果的に得られるニシンが抗生物質活性を維持する限り、ｎｉｓＡ遺伝子の欠失及び／または挿入をしてもよい。ｎｉｓＡ遺伝子の位置指向的突然変異は、例えば、Zoller & Smith（1983）Me th．Enzymol．100，468-500 Zoller & Smith（1984）DNA 3，479-480 に記載されたように、突然変異の導入に符合しないオリゴヌクレオチドプライマーを用いるオリゴヌクレオチド指向的突然変異技術によってなしてもよい。例えば、Kunk el（1985）Proc.．Natl．Acad．Sci．USA 82，488-492 に記載されたｄｕｔ−ｕｎｇ法といった、突然変異の収率を向上させる方法を使用するのが便利である。あるいは、符合しないオリゴヌクレオチドを用いた突然変異を生成に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてもよい（Sakai（1988）Science 239，487-491 ）。ｎｉｓＡ遺伝子のランダム突然変異は、変異源として例えば二硫化ナトリウムまたはヒドロキシルアミンを用いて化学的になすことができる。あるいは、ランダム突然変異は、例えばＡＭＶ反転トランスクリプターゼまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼといった比較的フィレリティー(filelity)の低いＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素的誤挿入を用いて、あるいは、合成中にスパイクされたオリゴヌクレオチドの混合物によって各位置に各々異なる少量の塩基を導入することによって導入される。これらの方法は、この分野では周知である。「変性ｎｉｓＡ遺伝子」とは、ｎｉｓＡ遺伝子のフラグメントを含み、このフラグメントは、末変性ｎｉｓＡ遺伝子の等価な部分と比較すると変化している。「変性ｎｉｓＡ遺伝子」は、特に、未変性ｎｉｓＡ遺伝子のプロモーター領域が他のプロモーター、好ましくは未変性ｎｉｓＡ遺伝子プロモーターより強力であることが知られたプロモーターで置換されている遺伝子を含む。好ましいプロモーターの例は、導入可能なｌａｃＡプロモーター（van Rooijen,（1992）J．B acteriol．179，2273-2280）及びＴ７プロモーター（Wells，Mol.Microbiol.，5 , 1155-1162）であり、これら両者は、ここで参考文献として取り入れる。また、「変性ｎｉｓＡ遺伝子」なる用語は、未変性ｎｉｓＡ遺伝子のリボゾーム結合領域が、好ましくはｎｉｓＡコード領域の翻訳開始が有効に向上するために修飾された遺伝子を含む。さらに、「変性ｎｉｓＡ遺伝子」なる用語は、コード領域にサイレント突然変異を含む遺伝子、即ち、１以上のコドンがそのシノニムに変化しているが、それによって未変性ｎｉｓＡニシンがエンコードされる遺伝子を含む。翻訳の効率は、このような変性ニシンコード領域を用いることによって向上するだろう。また、変性コード領域の翻訳を制御する非相同性プロモーター、即ち未変性ｎｉｓＡ遺伝子プロモーター以外のプロモーターを備える遺伝子も含む。全ての場合において、プロモーター、リボゾーム結合領域、及びコード領域の組合せがコード領域にエンコードされるニシンの最適な発現を与えるのが好ましい。未変性ｎｉｓＡニシンに比較して向上した特性を有する変性ニシン、たとえば高い抗微生物活性を持つものまたは食品に添加されたときに高い加水分解または分解耐性をもつものが好ましい。変性ニシンは、ＷＯ９３／２０２１３及びＷＯ９２／１８６３３（ここで参考文献として取り入れる）、及び本発明を例示する実施例に記載されている。本発明の好ましい実施態様は、（ａ）未変性ｎｉｓＡニシンは表現しないが変性ニシンは表現する、または（ｂ）未変性レベルに比較して向上したレベルの未変性ｎｉｓＡニシンを表現する細胞のいずれかの細胞を製造する方法を提供し、いずれの場合も、未変性、染色体ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部を、前記未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体位置において変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部で置換する工程からなるニシン修飾及び免疫のための遺伝子を表現できる。変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部は、前記未変性、染色体ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部と、手未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体位置において、遺伝子置換によって一段階で置換できる。便宜的には、この変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部を含むプラスミドを、未変性ｎｉｓＡ遺伝子（そして、好ましくは細胞からのニシン修飾、免疫及び位置変換のための遺伝子）の染色体コピーを有する宿主細胞に導入する。二重のクロスーオーバー組み換え現象が、未変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部の変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部による置換を導く。結果的に得られる細胞は、変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体コピーを含み、よって、変性ニシンを産生し、変性ｎｉｓＡ遺伝子は修飾されたコード領域を有する。ｎｉｓＡ遺伝子の全てが置換される必要はない。むしろ、変性ニシンに存在するアミノ酸変化をエンコードする、または、異種のプロモーターを含むｎｉｓＡ遺伝子の１つまたは一部が置換されるのが便利である。ニシンの生合成、成熟及び分泌に必要なｎｉｓＡ遺伝子及び他の遺伝子は、未変性には、染色体の一部であるトランスポゾンに位置する。よって、染色体の配置は、染色体上の他の遺伝子マーカーに対する遺伝子クラスターの位置ではなく、ニシン遺伝子クラスター（ｎｉｓＡＢＴＣＩＰＲＫ）内の染色体ＤＮＡにおけるｎｉｓＡ遺伝子も存在を反映する。ラクトコッカスにおける相同的組み換えが、きわめて非効率的であり予測できないことが知られており、上記の直接的一段階方法が可能であるとしても、遺伝子置換が間接的な２段階方法によって実施できれば、ここで記載した好ましい組み換えを選択することができるのでよい。さらなる好ましい方法は、（１）未変性、染色体ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部を、前記未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体位置において、対向選択可能な(count er-selectable)ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部で置換し、（２）その対向選択可能な遺伝子またはその一部を、前記未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体位置において変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部と置換することからなる。「対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子」とは、未変性ｎｉｓＡ遺伝子または変性ｎｉｓＡ遺伝子とは容易に区別できる用に修飾されたｎｉｓＡ遺伝子を含む。便宜的には、対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子は、（エリスロマイシン耐性のような）抗微生物耐性遺伝子が挿入されたｎｉｓＡ遺伝子、または、コード領域の一部または全部が欠失したｎｉｓＡ遺伝子である。対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子は、ニシンを発現するのが好ましいが、必ずしもしなくてもよい。ｎｉｓＡ遺伝子の全てが置換される必要はない。むしろ対向選択可能なマーカーの１つまたは一部が置換されるのが便利である。これらの例において、対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子は、未変性または変性ｎｉｓＡ遺伝子と、対向選択可能な遺伝子の抗微生物耐性及び／またはサイズの相違によって区別される。従って、結果的に得られる細胞が、たとえば、向上した抗微生物耐性を有し、対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子が細胞の染色体ＤＮＡの特定のフラグメントを欠失するときは、サイズの欠落または低下があるので、好ましい方法の工程１が達成されるか否かの決定に比較的直接関わる。細胞の染色体ＤＮＡのサイズが欠落または低下したか否かは、サザン・ブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、または制限フラグメント長ポリモルフィズム（ＲＦＬＰ）等の周知の分子技術によって容易に決定することができる。同様に、結果的に得られる細胞が、たとえば、抗微生物耐性を失うこと、細胞の染色体ＤＮＡのフラグメントがゲインするので、好ましい方法の工程２が達成されるか否かの決定に比較的直接関わる。便宜的には、この好ましい実施態様では、工程２に伴う選択がある。例えば、工程１における対向選択可能な遺伝子がｎｉｓＡコード領域（ΔｎｉｓＡ）の一部または全部の欠失を伴う場合、工程２において変性ｎｉｓＡ遺伝子の正しい置換が選択されるのが好ましい。よって、好ましい方法では、（工程１で製造された）ΔｎｉｓＡ遺伝子を含むラクトコッカス・ラクチス株が工程２で用いられる。熱感応性シャトルベクター（低温では転写可能だが高温では不可能）は、ΔｎｉｓＡ株の染色体に変性ｎｉｓＡを導入するのに用いられる。例えば、ΔｎｉｓＡ株は、変性ｎｉｓＡ遺伝子及び抗生物質耐性の遺伝子で形質転換され、その細胞は抗生物質の存在下で許容温度でインキュベートされる。次いで、細胞は抗生物質存在下で非許容温度に移され、一重クロス−オーバー現象の結果、プラスミド／染色体相同性の部位（例えばΔｎｉｓＡ及び変性ｎｉｓＡ遺伝子の共通領域）においてプラスミドの染色体への一体化がなされる。次いで、細胞は許容温度に移されてプラスミド複製がなされる。一体化プラスミドに隣接する相同配列間の組み換えは、染色体からの励起をもたらす。第二のクロスーオーバーが起こり、一体化プラスミド（例えば変性ｎｉｓＡ遺伝子）起源の配列または最初（例えば対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子）の配列が染色体上に残る。上記の通り、変性ｎｉｓＡ遺伝子及び対向選択可能なｎｉｓＡ遺伝子は、区別可能であり、変性ｎｉｓＡ遺伝子を含む細胞が選択される。細胞は、抗生物質なしで培養することによりプラスミドにキュアされる。この好ましい方法では、全ｎｉｓＡ遺伝子及び隣接する配列は対応する配列で効率的に置換され、特異的に導入された突然変異を発現する。変性ｎｉｓＡ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡフラグメントのサイズは、それを横切って組み換えが起こり、プラスミドの一体化即ち置換が生ずることのできる（プラスミド及び染色体の両方の）相同配列が必要なことから制限される。ベクター構造にとって、約１ｋｂの任意の配列変化の相同隣接部位があるのが好ましい。例えば、我々の遺伝子置換ベクターは、ｎｉｓＡの一方の側に約８００ｂｐを持ち、他方に１２００ｂｐを持つ。このサイズの低減は、相同組み換えの可能性を低下させ、従って望まれる遺伝子置換を見いだす機会を低下させるだろう。図１０は、好ましい方法で起こる組み換え現象を例示する。本発明の方法は、変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体コピーからの変性ニシンまたは変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体コピーからの未変性ｎｉｓＡニシンを製造する細胞をもたらす。既に議論したように、変性ニシンは抗生物質活性を有するのが最も好ましい。よって、細胞は（未変性または変性の）ニシンを製造するので、細胞はＮｉｓ＋フェノタイプを表現する。これらのニシン産生細胞は、この抗微生物ペプチドを産生するのと同じレベルでニシンに対して免疫性である必要がある。よって、方法のさらに好ましい実施態様は、少なくとも１０００Ｕ／ｍｌまでのレベルでニシンに免疫性であるような細胞を選択する工程をさらに含む。製造された細胞は変性ニシンを発現するのが好ましいが、この方法は、強力な異種プロモーターから高いレベルで未変性ｎｉｓＡを発現することのできる細胞を製造することを含む。あまり好ましい実施態様ではないが、遺伝子クラスターは変性ｎｉｓＡ遺伝子及び二新修飾及び免疫用の遺伝子を含み、この遺伝子クラスターはオートノマスな(autonomously)置換ＤＮＡ要素において担持される。便宜的には、オートノマスな置換ＤＮＡ要素はプラスミドである。プラスミドの宿主細胞は、未変性ｎｉｓＡニシンを発現しない細胞である。例えば、未変性ｎｉｓＡニシン遺伝子を持たない、または未変性ｎｉｓＡ遺伝子が不活性なラクトコッカス細胞である。全ニシン遺伝子クラスターのプラスミドへのクローニングは、ＤＮＡの大きなセグメント（〜１１ｋｂ）の一体化を含む。このタイプの方法は、コピー数、即ち変化すべき遺伝子投与量が可能になるという利点を持ち、ニシン決定基の交換可能な宿主バックグラウンドへの移動を可能にする。複製の２つの好ましいタイプ（異なる複製モードを用いる）があり、それらは好ましいベクターを採用する：ローリング・サイクル・プラスミド（例えばpTG262，Dodda（1990）J.Gen.Mic robiol．136，555-566）またはテタ(theta)・タイプ・プラスミド（pIL253，高コピー数、pIL277，低コピー数、Simon & Chopin（1988）Biochemie 70，559-56 6）である。両方の論文を、参考としてここに取り入れる。本発明の方法がラクトコッカル細胞を用いる場合、プラスミドはシャトル・プラスミドであるのが好ましく、即ち、ラクトコッカル細胞で複製可能であり、大腸菌等の他の宿主細胞でも複製可能なプラスミドが好ましい。相補的接着末端を介したＤＮＡのベクターへの制御可能な結合をする種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクトが、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに添加される。このベクター及びＤＮＡセグメントは、次いで相補的ホモポリマー尾間の水素結合によって結合され、組み換えＤＮＡ分子を形成する。１以上の制限部位を持つ合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合する他の方法を提供する。既に述べたようなエンドヌクレアーゼ制限消化によって生成したＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、３’−５’−エキソヌクレオチティツク活性を持つ突出した３’一本鎖標準付着末端を除去し、重合活性を持つ凹んだ３’− 付着末端を満たす酵素で処理される。従って、これらの活性の組み合わせは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。平滑末端セグメントは、次いで、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの平滑末端ＤＮＡ分子の連鎖反応を触媒できる酵素の存在下で、大過剰のリンカー分子とともにインキュベートされる。よって、反応生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を具備するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、次いで適当な制限酵素で切断され、これらのＤＮＡセグメントに相当するめったんを生成する酵素で切断された発現ベクターにリゲートする。制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、International Biotechn ologies Inc.，New Haven，CN，USA を含む多くの供給元から入手可能である。本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Sa kai，等（1988）Science 239，487-491 に開示されたようなポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡには、それら自身が増幅ＤＮＡに取り込まれる２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーが隣接している。前記特定のプライマーは、この分野で周知の方法を用いて発現ベクターにクローニングするのに用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。本発明の第２の態様は、未変性ｎｉｓＡ遺伝子は含まないが変性ｎｉｓＡ遺伝子を含有するニシンは発現する細胞を提供し、変性ｎｉｓＡ遺伝子は、末変性ｎｉｓＡ遺伝子を含む遺伝子クラスター及びニシン修飾、分泌及び免疫用の未変性ｎｉｓＡ遺伝子に対して未変性ｎｉｓＡ遺伝子と同様の関係を有する。本発明の第２の態様の細胞は、本発明の第１の態様で述べた方法で得られる。最も好ましい実施態様では、未変性、染色体ｎｉｓＡ−遺伝子またはその一部が無く、細胞は、前記未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体位置に変性ｎｉｓＡ遺伝子またはその一部を含む。好ましくは、細胞はラクトコッカスであり、最も好ましくはラクトコッカス・ラクチスである。細胞は、変性ニシンを発現するのが好ましいが、この細胞は向上したレベルの未変性ｎｉｓＡを発現し、本発明の一部をなす。便宜的には、変性ｎｉｓＡ遺伝子は転写または翻訳制御配列を含み、細胞を変性ニシン、または未変性ｎｉｓＡの場合には、向上したレベルでそれを発現することを可能にする。よって、一つの実施態様では、細胞は、（未変性ｎｉｓＡニシンまたは変性ニシンも発現できる）ニシンコード領域の発現を導く異種プロモーターからなる変性ｎｉｓＡを含む。あまり好ましい実施態様ではないが、細胞は、変性ｎｉｓＡ遺伝子及びニシン修飾及び免疫用遺伝子を具備するオートノマスな置換ＤＮＡ要素を含有する。この場合、細胞は活性染色体ｎｉｓＡ遺伝子を有さず、好ましくは染色体ニシン遺伝子を持たない。本発明の第３の態様は、本発明の第３の態様で述べた細胞を培養し、それによって産生されたニシンを得ることからなるニシン製造法である。便宜的には、ニシンは変性ニシンである。細胞は最も好ましい実施態様のようなものが好ましい。この方法で最も好ましい実施態様の細胞を用いることにより、（プラスミド− 起源ニシン免疫、修飾及び分泌遺伝子無しで）ニシンの発現を特にプラスミド− 起源のｎｉｓＡ遺伝子に依存する周知の方法に比較して予想外に高収率でニシンを製造できることを見いだした。この驚くべき効果は、実施例において詳細に示す。しかし、デヒドロアラニン５がアラニンで置換され、デヒドロアラニン３３がアラニンで置換された（ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ、Ｄｈａ３３Ａとして知られた）変性ニシンの場合、未変性ｎｉｓＡ遺伝子が変性ｎｉｓＡで置換された本発明の細胞は、同じ変性ニシンがプラスミドにコードされる従来技術の細胞に比較して１００倍以上を産生する。さらに、試験した全ての変性ニシンは、プラスミドに変性ニシンを含む従来技術の細胞に比較して、本発明の細胞からはより高い収率を与えた。従来技術の方法および細胞を越えるさらなる利点は、ニシン製造の最も好ましい実施態様の細胞を用いて得られる。例えば、細胞はプラスミドを含まないので、培養中に抗微生物選択をする必要がなく、培養中のプラスミドの損失が問題にならない。よって、安定性のために、変性ニシン遺伝子が細菌染色体アルベイト(albeit) 内にニシントランスポゾンＴｍ５３０１の一部として一体化するという利点がある。後者は極めて安定であり、我々は実際に、故意に取り除くのが困難であるのを見いだした。実験室でのプラスミドマーカーの選択は、これが実際に問題になることを防止し、これを工業的に用いるのは不利である。発酵に抗生物質を添加するのも好ましくはない。あまり好ましい実施態様ではないが、変性ニシン及びニシン修飾及び免疫を具備する細胞は、プラスミドのようなオートノマスな置換ＤＮＡ要素に担持される。明らかに、この実施態様では、細胞の培養中にプラスミドの選択が必要である。本発明の第３の態様の特に好ましい実施態様では、細胞はニシン発現を誘発するｎｉｓＡニシンまたは変性ニシンの存在下で培養される。Ｉｌｅ３０がＴｒｐ（Ｉ３０Ｗ）で置換されたニシンＡは、変性体の例であり、その突然変異の結果、それ自身の生合成の誘導物質インデューサのように有効ではない。成長媒質にサブ−阻害性濃度のニシンを添加することにより、発酵の間、高いレベルの変性ニシンが産生される。誘導物質より有効性の低い任意の変性体は、成長媒質にニシンが含まれることの利益を受ける（例えば精製方法におけるニシン誘導工程）。誘導量は（誘導の結果の２倍以上のＩ３０ＷニシンＡ生成を持つ）任意の特別な変性体の初期誘導容量に依存する。誘導は、生成レベルを最大にする手段として日常的に含まれる。野生型分子の混入について、誘導に必要なニシン濃度の最小量は、精製されるニシン変性体の量に比較して無視できる。便宜的には、ｎｉｓＡニシンは、ニシン製造の最大誘導を与える最小量である。この量は、当業者であれば数値的に決定できる。この実施態様の誘導に好適なｎｉｓＡニシン濃度は、１ｎＭから５００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭから２５０ｎＭ、より好ましくは５０ｎＭから１５０ｎＭ、最も好ましくは１００ｎＭである。全ての精製における反転相ＨＰＬＣ工程は、変性ニシンからの任意の残存ｎｉｓＡニシンの分離を確実にする。本発明の第４の態様は、本発明の方法で製造されたニシンを提供する。ニシンを含むランチビオチックスにおける不飽和アミノ酸の存在、及び、これらの複雑な分子の生物学的活性においてそれらが果たす役割は、構造／機能分析において特に興味の対象である。デヒドロアミノ酸を特徴づける反応性不飽和結合が抗微生物活性において、サブチリン(subtilin)、ランチビオチック、細菌胞子外成長(outgrouth)に抗して作用する機能的役割を演じることが提唱されている。これらの残基は、分子の不安定性の元となりうるものとして注意される。長い間、未変性ｎｉｓＡニシンの商業的サンプルの抗微生物活性は、貯蔵において低下すること、及び、そのようなサンプル（Berridge 等，1952）及びChan 等に見られる多くの化学成分が、成熟分子のデヒドロアラニン残基において起こる特異的切断を示すことが知られている。Ｄｈａ５における切断は、ニシンの第１のレンチオニン(lanthionine)の開環をもたらし、抗微生物活性の低下を伴う。逆に、Ｄｈａ３３における切断の結果生ずる分解生成物は、実質的に野生型活性を保持する（Chan 等，1989）。ＷＯ９３／２０２１３において、我々は、ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ、ニシンＡ／Ｄｈａ３３Ａ及びニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ、Ｄｈａ３３Ａを発現するラクトコッカス・ラクチス(L.lactis)誘導体の構成を記載した。また我々は、その研究において、これらの工業的ニシンが、感受性インジケーター株に対して抗微生物活性を保持することを示した。明らかに、実施例において詳細に示すように、これらのニシンは本発明の方法によってより効率的に製造される。しかし、本方法は、それらが変性ｎｉｓＡ遺伝子にコードされる限り、他の向上した特性を有する任意のさらなる変性ニシンの製造にも用いられる。本発明の第５の態様は、本発明の方法で製造されたニシンの抗微生物薬としての使用である。ニシンの胞子細菌及び食物病原の成長を阻害する能力は、ある種の食品、特にソフトチーズ等の日常品における未変性保存剤としての広範な使用をもたらす。変性ニシンもまた使用される。以下の図面および実施例により、本願発明をより詳細に記載する。図１は、未変性ニシンＡの分子構造を示す。タンパク質操作により配列になされた変化は矢印で示されている。図２は、この研究で作成され用いられた組み換えプラスミドのいくつかを図式的に示す。図３は、エリスロマイシン耐性遺伝子がｎｉｓＡ遺伝子中に挿入されているか、あるいはフレームシフト欠失（ｎｉｓＡ−ｆｓ）がなされた対抗選択的ｎｉｓＡ遺伝子を図式的に示す。示された配列は、配列表のＳＥＱＩＤＮｏ．１２〜１７である。図４は、少なくとも一部の未変性ｎｉｓＡ遺伝子と発現シグナルのヌクレオチド配列を示し、ＰＣＲ介在部位特異的突然変異誘発によって導入された変化を示す。BamHIおよびBglII部位隣接ｎｉｓＡがプラスミドｐＦＩ７４０に設計された（図２ｄ）。変性ｎｉｓＡ遺伝子におけるＳｅｒ５およびＳｅｒ３３コドンからアラニンコドンへの置換が（表１）、配列の上に示されている。示された配列は、配列表のＳＥＱＩＤＮｏ．１８および１９である。図５は、プライマーＰ３９およびＰ４０を用いて生成されたＰＣＲフラグメントのアガロースゲル電気泳動を示す。ＰＣＲ反応は、遺伝子交換法の後に、トラック３、ＦＩ５８７６；４、ＦＩ７９９０；５−１０、ＦＩ７９９０（ｐＧｈｏｓｔ６誘導体）のコロニーで行われた。サイズ標準：トラック１および１２、 BglIで切断したλＤＮＡ；２および１１、HindIIIで切断されたλＤＮＡ。図６は、プレート拡散バイオアッセイを示す。株：４，ＦＩ５８７６；５，ＦＩ７９９０；６，ＦＩ８０７０；７，ＦＩ８１９８；８，ＦＩ８１９９からの細胞フリー抽出掖の１５０μｌサンプルを、指標株ラクトバチルスヘルベチカス(L actobacillus helveticus)ＣＨ−１をまいたＭＲＳ寒天に形成されたウェルに流し込んだ。プレートを４２℃で夜通しインキュベートした。アッセイプレートに含まれた標準は：１，５０；２，１００；３，２００；９，３００；１０，４００Ｕ／ｍｌである。図７は、L.lactis ＮＩＺＯＲ５のＴｎ５２７６のｎｉｓＡ、ｎｉｓＢ、ｎｉｓＴ、ｎｉｓＣおよびｎｉｓＩ遺伝子の配列を示し、Kuipersら(1993)Eur．J ．Biochem．216，281-291から得られるものである。推定されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）および逆方向反復（→）が示され、ｎｉｓＡ遺伝子の転写開始部位とそれに先行する標準的な配列が示されている。用いられた制限部位の位置は以下の通りである：AccI、６３８３−６３８８；BclI、２９１４−２９１９；Ec oRI、３４６１−３４６６；EcoRV、１８０５−１８１０；HaeIII、６５０９−６５１２；NcoI、６２１８−６２２３；NdeI、４５１８−４５２３；PstI、７４１８−７４２３；SstI、２８３−２８８，１５４７−１５５２および２４６３−２４６８。図８は、読み枠ｎｉｓＩ、ｎｉｓＰ、ｎｉｓＲおよびｎｉｓＫを備えたｎｉｓＣの下流のクローン化された５．０ｋｂ領域のヌクレオチド配列を示し、Engelk eら（1994）Appl．Environ．Microbiol．60，814-825から得られたものである。可能なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、制限部位、および逆方向反復に下線が付されている。読み枠は１文字コードで示されている。矢印はＮｉｓＩおよびＮｉｓＰの推定上のシグナルペプチド切断部位を示し；ＮｉｓＰの推定上の膜アンカー配列に下線が付されている。保存された、機能的かつ活性な部位のアミノ酸が太字で記載され、アスタリスクでマークされている。図９は、遺伝子交換ベクターを例証する。ｎｉｓＡカセットおよび隣接配列を成すクローン化されたフラグメントのサイズが塩基対で与えられている。図１０は、遺伝子交換プロトコルを図式的に示す。図１１は、ｎｉｓＡ遺伝子の二本鎖ヌクレオチド配列とプレニシンアミノ酸配列を示す。−３５および−１０領域と転写開始部位が、ＤＮＡ配列の上に、ｎｉｓＡ遺伝子カセットに用いられた制限酵素部位と共に示されている（図２参照）。カセットフラグメントの増幅およびＰＣＲ仲介突然変異誘発に用いられたプライマーの位置（５’末端）が、配列の上下に示されており、水平な黒い矢印はＤＮＡ合成の向きを示している。突然変異誘発による特異的アミノ酸の置換が、プレニシン配列の下に示されている。図１２は、ｎｉｓ遺伝子の構成を表す。実施例１：未変性の染色体ｎｉｓＡ遺伝子が変異ｎｉｓＡ遺伝子で置換されたラクトコッカル細胞(Lactococcal cells)の作製方法用いた微生物学的技術と株。この研究に用いられたラクトコッカル株とその入手元が、表１に与えられている。特に言及しない限り、０．５％（wt/vol）グルコースを含有するＭ１７培地（ Terzaghi & Sandine（1975）Appl．Environ．Microbiol．29，807-813）（ＧＭ１７培地）中で、３０℃で培養した。抗生物質耐性株の選別は、以下のレベルで行った：エリスロマイシン（Ｅｍ^r）５μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン（Ｓｍ^r ）２００μｇ／ｍｌ。大腸菌(Escherichia coli)ＭＣ１０２２（Casadaban & Cohen（1980）J．Mol ． Biol．138，179-207）を、作製用、並びにベクターｐＭＴＬ２３ｐ（Chamber sら（1988）Gene 68，139-149）、ｐＧＥＭ−３Ｚ（Promega）、ｐＣＲ^TMII（In vitrogen）およびｐＧ＋ｈｏｓｔ６（Appligene）から誘導された組換えプラスミドの分子分析用の宿主株とした。この研究の過程で使用、作製された組換えプラスミドは、図２に示されている。大腸菌培養を、Ｌブイヨン（Lennox（1955） Virology 9，190-206）において、３７℃で増殖させた。アンピシリン耐性（Ａｐ^r）の選別は１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール（Ｃｍ^r）は１５μｇ／ｍｌ、エリスロマイシン（Ｅｍ^r）は４００μｇ／ｍｌで行った。ラクトコッカル株のニシン活性を、延ばした(deferred)方法および直接的方法の両方によってアッセイした。先に記載されたようにして（Doddら（1992）Appl . Environ．Microbiol．58，3683-3693）、プレート拡散バイオアッセイを行った。ＧＭ１７プレートの表面で生育したコロニーを、１２分間クロロホルム上で反転させ、ニシン感受性L.lactis株ＭＧ１６１４が播種された寒天を載せることによって直接的にアッセイした。プレートを夜通しインキュベートし、コロニーのゾーンサイズを対照のものと比較した。徐々に増大させた濃度のニシンを含有する一連のＧＭ１７寒天プレート上に培養を画線してニシン免疫を調べ、種々のニシンレベルにおける生育の度合いを評価した。対照の培養（ＦＩ５８７６、陽性）およびＭＧ１６１４（陰性）が、各プレート上に含まれている。分子的技術全体のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを、Doddら（1990）J．Gen．Microbiol．136 ， 555-566およびHornら（1991）Mol．Gen．Genet．228，129-135に記載されたようにした。種々に由来する制限酵素および他のＤＮＡ修飾酵素を、製造者の指示に従って用いた。先に記載されているようにして（Doddら(1992)上掲）、E.coliの形質転換、あるいは、Doddら(1992)上掲の変更を加えたHoloとNes(1989)Appl. E nviron．Microbiol．55，3119-2123に従ったL.lactisの電気穿孔法によって組換えプラスミドを回収した。ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）に用いられた条件は、Hornら（1991）Mol．Gen．Genet．228，129-135に記載された通りである。Applied Biosystems DNA合成装置（モデル３８１Ａ）でプライマーを合成し、これらは表２に記載されている。遺伝子交換ベクターの作製のために生成されたフラグメントを、ジノザイム(Dynozyme)（Flowgen）を用いて増幅し、ヌクレオチド配列の確認の前にｐＣＲ^TMIIにクローン化した。組換えクローンの慣例的なＰＣＲスクリーニングでは、AmpliTaq-DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いた。精製されたＰＣＲ生成鋳型の直接的なヌクレオチド配列決定を、Applied Bi osystems DNAシークエンサー（モデル３７３Ａ）で、製造者のTaq“Dyedeoxy” ターミネーターサイクル配列決定キットを用いて行った。ｎｉｓＡ遺伝子交換ベクターの作製熱感受性シャトルベクターｐＧ＋ｈｏｓｔ６を用いて遺伝子交換を行った。ｎｉｓＡ遺伝子を含むＦＩ５８７６染色体（図２ａ）の２．１ｋｂ領域を含むｐＦＩ１７２（Doddら（1990）上掲）に由来する相同プラスミドＤＮＡ。ｎｉｓＡ遺伝子交換ベクターｐＦＩ６９０を生成するために、完全なフラグメントをｐＧ＋ｈｏｓｔ６にサブクローン化した（図２ｂ）。ｎｉｓＡ遺伝子の不活性化もしくは突然変異誘発を生じる（以下参照）、この領域の次なる操作を、ベクターｐＧＥＭ−３ＺもしくはｐＭＴＬ２３Ｐのいずれかに行った。各遺伝子交換ベクターの作製における最終段階は、ｐＧ＋ｈｏｓｔ６に修飾された２．１ｋｂのフラグメントをクローニングすることである。ｐＧ＋ｈｏｓｔ６の誘導体をE.coliに確立し、この宿主からのプラスミドＤＮＡを、Ｌ.lactis ＦＩ７９９０を形質転換するために用いた（表１）。ｎｉｓＡフレームシフト変異−ｎｉｓＡ−（ｆｓ）：内在性SacI部位にＥｍ^r遺伝子をクローニングすることによるｎｉｓＡ遺伝子の挿入不活性化が、以前に記載されている（Doddら(1992)上掲）。このプラスミドでは、Ｅｍ^r遺伝子に、短い多重クローニング部位が隣接している（図３）。制限酵素SmaIを用いた分解の後に、ベクター配列を再環状化すべくリゲーションを行うことにより、Ｅｍ^r遺伝子が削除される。多重クローニング部位からの残余配列はSacI部位の内部に２０ｂｐの挿入を残し、ｎｉｓＡ遺伝子のコドン１６にフレームシフト変異を引き起こす。この変異遺伝子［ｎｉｓＡ−（ｆｓ）と称する］にコードされた最初の３８アミノ酸は影響を受けない。しかしながら、推定される翻訳産物は、そのＣＯＯＨ末端にオンニシンアミノ酸配列(the on-nisin amino acid)ＲＹＰＧＴＥＬを含む切りつめられたプレニシン(prenisin)（４５残基）であろう（図３）。ｎｉｓＡ−（ｆｓ）変異を、遺伝子置換ベクターｐＦＩ６７４を生成するためにｐＧ＋ｈｏｓｔ６にサブクローン化した（図２ｃ）。ｎｉｓＡ欠失−ΔｎｉｓＡ：ｎｉｓＡ遺伝子の不活性化を、コード領域の欠失によっても行った。まさにｎｉｓＡの欠失に制限するために、遺伝子の各端に付加的な制限酵素部位を設計する必要がある。いずれの場合も２ｂｐ変化させることにより、ｎｉｓＡの開始の８０ｂｐ上流にBamHI部位（Ｐ１３、表２）ならびに停止コドンの２５ｂｐ下流にBglII部位（Ｐ３２、表２）を取り込んだ、染色体のこの領域のＰＣＲ増幅用プライマーを設計した（図３）。隣接フラグメント（図２ｄに示されている）も、ＰＣＲ増幅を用いて生成した。上流の２１１ｂｐのHincII／BamHIフラグメントを増幅するために、プライマーＰ２６およびＰ２５を用い、下流の１．１ｋｂのBglII／SalIフラグメントを増幅するためにプライマーＰ２８およびＰ２７を用いた（表２）。これらのＰＣＲ反応に用いられた鋳型はｐＦＩ１７２ＤＮＡであった。得られたプラスミド（ｐＦＩ７４０）は、設計されたBamHIおよびBglII部位が隣接した完全なｎｉｓＡ遺伝子を含み、染色体に相同な２．１ｋｂの配列の内部に全て含まれる（図２ｄ）。これらの二つの酵素でｐＦＩ７４０を分解した後に、これらの一致末端をリゲーションすることによって、ｎｉｓＡ遺伝子が欠如したプラスミドｐＦＩ７５１が生成され、ΔｎｉｓＡと称した（図２ｅ）。プラスミドのこの部分のＰＣＲ増幅、および増幅フラグメントにおける欠失を補う領域のヌクレオチド配列解析により、BamHIとBgl II部位の融合が起こったことが確認された。ｎｉｓＡ部位特異的変異：プラスミドｐＦＩ８７７の作製（図２ｆ）により、部位特異的突然変異をｎｉｓＡ遺伝子に導入するためのカセット突然変異誘発法 (a cassette mutagenesis strategy)を利用できるようになった。このｐＧＥＭ −３Ｚ誘導体は、ｐＦＩ６９０（図２ｂ）の配列に等価な配列を含むが、ｐＦＩ７４０（図２ｄ）のｎｉｓＡの下流に設計されたBglII部位を含む。ｐＦＩ８７７では、ｎｉｓＡのアミノ末端領域と上流発現シグナルをコードするHincII／Sa cIフラグメントが、設計されたBamHI部位を含むｐＦＩ７４０のＰＣＲ生成フラグメントと置き換わっている。しかして、ｐＦＩ８７７の配列と、等価の染色体野生型配列との間の差異は、ｎｉｓＡ遺伝子の下流に付加的なBglIIが存在することのみである。このｎｉｓＡカセットの作製により、部位特異的変異が容易に遺伝子に取り込まれる。それぞれｎｉｓＡ遺伝子のアミノ末端領域もしくはＣＯＯＨ末端領域を含むHincII／SacIもしくはSacI／BglIIフラグメントを増幅するために、ＰＣＲ介在突然変異を用いた（図２ｆ）。特異的変異を含むこれらのフラグメントを、ｐＦＩ８７７の野生型フラグメントと置換した。カセットフラグメントを増幅するために使用されたプライマーに変異を導入した、あるいは所望の変異部位が内在性である場合には、変異部位にわたる二つの相補プライマーに取り込まれた特異的変異と共にスプライスされた重複伸長の技術を用いた（Hoら（1989）Ge ne 77，51-59）（Doddら(1992)上掲）。遺伝子交換手順ｐＧ＋ｈｏｓｔ６の誘導体を含むL.lactis ＦＩ７９９０形質転換体を２８℃ で確立し、５μｇ／ｍｌのＥｍを含有するＧＭ１７（ＧＭ１７−Ｅｍ）中でこの温度で夜通し生育した。１００ｍｌの新鮮で予め温められたＧＭ１７−Ｅｍに播種するために、約１０⁵細胞を用い、培養を４時間２８℃でインキュベートした。３７℃の高い温度で、インキュベーションを夜通し続けた。この温度は、ｐＧ＋ｈｏｓｔ６の複製を許容するものではなく（Biswasら（1993）J．Bacteriol． 175, 3628-3635）、生育培地中にＥｍが存在することが、プラスミド／染色体相同部位において一回のクロスオーバーにより染色体に誘導体を組み込んだ細胞系の選択を確実にする（Leenhoutsら（1989）Appl．Environ．Microbiol．55，394 -400; Leenhoutsら（1990）Appl．Environ．Microbiol．56，2726-2735; Chopin ら(1989)Appl．Environ．Microbiol．55，1769-1774）。予め温められたＧＭ１７（Ｅｍ含まず）に、夜通し培養した約１０⁵細胞を播種し、２８℃で夜通しインキュベートした。この温度ではプラスミド複製が可能であり、組み込まれたプラスミドに隣接する相同配列との組換えにより、染色体からの切除を生じる。第二のクロスオーバーがどこで起こるかに応じて、組み込まれたプラスミドに由来する配列か、もしくは本来の配列が染色体に保持される。ＤＮＡ相同性の長さは図９に示されている。これらの配列は、プラスミドｐＦＩ１７２にクローン化されかつ配列決定されたSalIフラグメントの一部を構成するAccl／SalIフラグメントとして生ずる（Doddら（1990）J．Gen．Microbiol．136，555-566）。単一コロニーが得られるように、培養を希釈し、ＧＭ１７寒天プレート上に広く伸ばした。細胞からプラスミドを取り除くために、プレートを３７℃でインキュベートした。コロニー（約５０）を、Ｅｍ（５μｇ／ｍｌ）を含むＧＭ１７プレート上にパッチングすることにより、ｐＧ＋ｈｏｓｔ６誘導体の欠失を選別した。ｎｉｓＡ遺伝子を崩壊させるためにこの技術を用いた場合、コロニーもニシン活性の欠失で選別され、染色体の関連領域のＰＣＲ分析が、分子レベルで何らかの変化を確認するために用いられる。遺伝子交換方法は、図１０に図式的に例証されている。結果染色体にコードされたＦＩ５８７６ｎｉｓＡ遺伝子の不活性化変性ｎｉｓＡ遺伝子を獲得した細胞系を同定するために、内在性ｎｉｓＡ遺伝子を不活性化することによってＮｉｓ宿主株を最初に作製することが便利である。この目的のために、よく特徴が調べられたニシン産生株L.lactisＦＩ５８７６を選択した（Doddら（1990）上掲：Hornら（1991）上掲）。この株のニシン生合成遺伝子は、クローン化され配列決定されている（Doddら（1992）上掲）。ＦＩ５８７６の野生型ｎｉｓＡ遺伝子を、ｎｉｓＡ−（ｆｓ）遺伝子をコードしたプラスミドｐＦＩ６７４で置換するために、遺伝子交換を用いた（図２ｃ、図３）。選別された５０コロニーの内の５つが、Ｅｍ^sおよびＮｉｓ^-の両方であり、このことはこれらのＦＩ５８７６誘導体において遺伝子交換が起こったことを示唆している。さらに、この結果は、修飾されたｎｉｓＡ遺伝子が欠陥を備え、活性形態まで成熟する前駆分子を発現しないことを示唆した。ＦＩ７８４７と称されるＮｉｓ^-株の一つをさらに分析した。そのシステムをテストするために、ＦＩ７８４７のｎｉｓＡ−（ｆｓ）変異が、ｎｉｓＡ遺伝子交換ベクターｐＦＩ６９０（図２ｂ）を用いて等価実験を行うことによって野生型に復帰され得ることが示された。得られた遺伝子交換株ＦＩ７８９８によるニシン産生の回復は、ＦＩ７８４７により示されたＮｉｓ^-表現型が、単にｎｉｓＡ遺伝子の崩壊によることを示した。他のニシン生合成決定因子は、ｎｉｓＡ遺伝子の交換に影響されないようであった。別のアプローチは、ＦＩ５８７６の完全な染色体ｎｉｓＡ遺伝子の欠失によりＮｉｓ宿主を生成することである。プラスミドｐＦＩ７５１（図２ｅ）をこの目的のために作製し、遺伝子交換を、ｎｉｓＡに換えて約３００ｂｐ欠失ΔｎｉｓＡ（図４）を取り込むために用いた。Ｎｉｓ^-株は、ｎｉｓＡ−（ｆｓ）遺伝子交換で見られたのとほぼ同じ頻度で回復した。この場合、ΔｎｉｓＡ含有株は、ＰＣＲ解析によって親株から容易に区別することができた。プライマーＰ３９およびＰ４０（表２、図２ａ）は、野生型ｎｉｓＡをコードするＦＩ５８７６の等価領域から生成された２．１ｋｂフラグメント（図５、トラック３）に比べて、遺伝子交換株の１．８ｋｂフラグメント（図５、トラック４）を増幅した。ＦＩ７９９０と称されるＮｉｓ^-株の一つでは、ＰＣＲ生成１．８ｋｂフラグメントのヌクレオチド配列解析により、ΔｎｉｓＡが染色体の正確な領域に取り込まれることが確認された。再びシステムをテストしたところ、ｐＦＩ６９０で遺伝子交換を行うことによって、ニシン産物がＦＩ７９９０誘導株に保持されることが示された（図２ｂ）。これらのＮｉｓ⁺コロニーのＰＣＲ解析により、ΔｎｉｓＡ変異（１．８ｋｂフラグメント）が野生型ｎｉｓＡ遺伝子（２．１ｋｂフラグメント）によって置換されたことが示された。このシステムは、ＰＣＲ解析に基づいて遺伝子交換を容易に同定することができる利点を備えているので（図５参照）、さらなる特徴決定および変性作製は、宿主株としてＦＩ７９９０を用いて行った。ニシン免疫宿主株のニシンに対する免疫におけるｎｉｓＡ遺伝子の崩壊の効果が、以前に記載されている（Doddら（1992）上掲）。予想されるように、ＦＩ７８４７［ｎｉｓＡ−（ｆｓ）］およびＦＩ７９９０（ΔｎｉｓＡ）の両方が、ニシンに対する免疫が低減したことを示した（表１）。ｎｉｓＡ欠失株ＦＩ７９９０は、１０００Ｕ／ｍｌ以上のニシンの存在下で生育し続ける親株ＦＩ５８７６と比べて、２５０〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のニシンに対して感受性であった。興味深いことに、切りつめられたｎｉｓＡ遺伝子をコードするＦＩ７８４７は、ニシンに対して中間レベルの免疫を示した（５００〜７５０Ｕ／ｍｌの上限で、１０００Ｕ／ｍｌではほとんど生育し続けなかった、表１）。これら二つのＮｉｓ^-株のニシン感受性における差異の可能な説明は、ベクターｐＦＩ７４０（図２ｄ）に係る遺伝子交換研究から得られる。欠陥のあるｎｉｓＡを完全なプラスミドｐＦＩ７４０コード化ｎｉｓＡで置換することによって生成された株ＦＩ８００３はＮｉｓ^-表現型を備えていた。この結果は、Ｎｉｓ⁺ 表現型が回復された、ｐＦＩ６９０（図２ｂ）に係る、等価遺伝子置換実験のものと対称的である（上記参照）。関連する二つの配列の差異は、ｐＦＩ７４０がさらにｎｉｓＡのＡＴＧ開始コドンの８０ｂｐ上流に取り込まれた付加的なBamH Iと、コード領域のすぐ下流にBglII部位を備えていることのみである。これらの配列を調査することにより、BamHI部位が、Kuipersら（1993）Eur．J．Biochem ．216, 281-291によって同定されたプロモーターの提案された−３５領域と重複することがわかった。BamHI部位を操作した結果導入された単一塩基対の変化は、ＣＴＧＡＴＴからＣＣＧＡＴＴへと−３５配列を変換した（図４）。これらの結果は、ｐＦＩ７４０の未変性のｎｉｓＡプロモーターが壊れていることから、遺伝子交換によりBamHI部位を取り込んだＦＩ８００３等の株もまた欠陥のあるプロモーターを獲得することを示唆している。完全なｎｉｓＡ遺伝子であるにも関わらず、これらの株の増大したニシン感受性（野生型の約５０％）は、これらの潜在的なプロモーター活性配列がニシン免疫における役割を演じていることを示唆している。好ましいプロトコルは、遺伝子交換を受けたＮｉｓ⁺株を直接選択する手段としてニシン免疫を用い、ＦＩ７９９０のｎｉｓＡプロモーターを不活性化することにより、選択プレート上で親株が生育しないような、十分に高いニシン感受性が生じるという事実を利用する。上流プロモーター配列を保持したＮｉｓ^-株（例えばＦＩ７８４７）は、Ｎｉｓ⁺回復の選択に適切であることが見いだされたニシンレベル、すなわち５００Ｕ／ｍｌにおいてよく生育することから、この方法には不適切である（表１）。遺伝子交換−変性ｎｉｓＡコード化株の同定Ｎｉｓ^-株ＦＩ７８４７とＦＩ７９９０の作成と試験で行われた予備的遺伝子交換実験から、ｐＧ＋ｈｏｓｔ６誘導体による等価相同領域での染色体配列の置換が、低頻度で行われることがわかった。遺伝子交換による、これらの宿主における完全なｎｉｓＡ遺伝子の回復が、ニシン活性の回復を引き起こすことが予想される。個体群の内の全てのＮｉｓ⁺株が、元のＮｉｓ^-親株を越えた選択的有利性を備えている。しかしながら、活性なｎｉｓＡ遺伝子を回復する最初の試みは、再び、欠陥のあるｎｉｓＡ親配列を保持した選別された大多数のコロニーを生じた。Ｎｉｓ⁺表現形の回復は、機能的ニシン免疫メカニズムを必要とし、これはｎｉｓＡ遺伝子の発現を必要とする。ＦＩ７８４７およびＦＩ７９９０の作成物を用いた遺伝子交換プロトコルは、ニシンを産生するｎｉｓＡもしくは変性ｎｉｓＡ遺伝子を獲得した誘導体の同定を容易にするために変更された。Ｎｉｓ⁺コロニーの回復は、これらの細胞も、この抗菌ペプチドを産生するレベルにおいてニシンに対して必然的に免疫される必要があるという我々の解釈を結びつけた。変更された遺伝子交換プロトコルでは、最終段階に、ＧＭ１７寒天プレートに５００Ｕ／ｍｌのレベルでニシンを添加することを含む。この培地で生育したニシン免疫コロニーをＥｍ^rで選別し、ニシン産生をアッセイした。ゲノム配列の構成を調べるためにＰＣＲ解析も使用した。図５は、遺伝子交換方法を経た６つのコロニーのＰＣＲ生成フラグメントを示す（プライマーＰ３９とＰ４０を用いた、図２ａ）。ＰＣＲフラグメントのサイズが３００ｂｐ増大したことにより、全てがｎｉｓＡ遺伝子の機能的コピー（この場合にはｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ）を獲得したことがわかった。この方法は、宿主株自体が選択プレートに用いられたニシンレベルに感受性であることから、ＦＩ７９９０のＮｉｓ⁺誘導体を同定するための非常に信用できる手段であることがわかった。この方法で選別された大多数のコロニー（約９０％）は、遺伝子交換を受け、染色体傷害△ｎｉｓＡの代わりに機能的ｎｉｓＡ遺伝子もしくは変性を発現していたことがわかる。この方法は、現在ニシンＡの代わりに設計されたニシンを独占的に発現しているＦＩ７９９０のいくつかの誘導体を選別するために用いられてきた。上述したように、このプロトコルは、熱感受性プラスミドの組み込み、染色体中のｐ＋Ｇｈｏｓｔ６、さらにその切除を含む。変異のどちら側でも同じ頻度で相同配列間のクロスオーバーが起こると仮定すると、現在変異を有する細胞数が、親株に等しい細胞と同じであると予想される。この通りではなく、選別された大多数のコロニーが親株ＦＩ７９９０の遺伝子機構を保持していた。この理由は明らかではないが、機能的ｎｉｓＡ遺伝子の組み込みの直接的効果が、宿主細胞にとって有害であることを示唆している。ｎｉｓＡ遺伝子の発現が、隣接するｎｉｓＢ遺伝子の発現より３０分間早いこと（Engelkeら（1994）上掲）、並びにプレニシン産生に関して、ニシン遺伝子クラスターの他の決定因子の転写が同様に遅延しうることが報告された。遺伝子交換によってｎｉｓＡ遺伝子を獲得した株は、ニシン分子がその抗菌作用を発揮するまでは、完全な免疫を回復しなかったかもしれない。このような株は生育可能ではない。しかしながら、ニシン産生が遅延し、完全なニシン免疫が確立された場合に、遺伝子交換によってＮｉｓ⁺ 表現形を回復することができた。ＤｈａからＡｌａ残基への変換５および３３位のデヒドロアラニン（Ｄｈａ）（図１）を、ニシン分子における変化を導入する最初の標的とした。この目的は、Ｄｈａが誘導されるセリン残基を、潜在的に不安定な不飽和側鎖の無いアラニンに置換することである。ｎｉｓＡ、Ｓ５Ａにおける変異は、プライマーＰ２６およびＰ１７を用いたＰＣＲによって生成された（表２）。増幅により、ｎｉｓＡのアミノ末端を含み、Ｓｅｒコドン（１７３に配位、図４）をアラニンに特異的なＣＧＴに置換することを含んだ４０４ｂｐのHincII／SacIフラグメントが生成された。ｎｉｓＡのＣＯＯＨ末端を含む９０ｂｐのSacI/BglIIフラグメントを、プライマーＰ１０およびＰ３２（表２）を用いたＰＣＲで生成し、プライマー１８および１９（表２）を用いたスプライスされた重複延長段階(a spliced overlap extension step)を含む。相補的プライマーの後者の組は、２５７位のセリンコドンの代わりにアラニンコドンＣＧＴを含む（図４）。これらのＰＣＲ生成フラグメントを、個別あるいは一緒に適切な遺伝子交換ベクターにサブクローニングすることにより、ｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ、ｎｉｓＡ／Ｓ３３ＡもしくはｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ，Ｓ３３Ａ遺伝子のいずれかを特定する中断されていないコード領域を生成した。プラスミドＤＮＡでＦＩ７９９０を形質転換し、遺伝子交換方法を行うことによって多数のコロニーが生じ、その大半がＥｍ^sかつＮｉｓ⁺であることがわかった。Ｐ３９とＰ４０（図２ａ）のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲによって染色体の関連領域を評価したところ、それぞれの場合にＦＩ７９９０と比べて３００ｂｐのフラグメントサイズの増大が見られ（図５）、遺伝子交換が起こったことを示唆している。これらのＰＣＲ生成フラグメントのヌクレオチド配列解析により、それぞれの場合に、３つの変性ｎｉｓＡ遺伝子が、ΔｎｉｓＡ傷害の場所において、染色体に取り込まれたことが確認された。各遺伝子交換株ＦＩ８０７０（ｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ）、ＦＩ８１９８（ｎｉｓＡ／Ｓ３３Ａ）、およびＦＩ８１９９（ｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ，Ｓ３３Ａ）の特徴をさらに調べた。３つの変異したｎｉｓＡ遺伝子全ての発現により、コロニー積層（オーバーレイ）によって直接調べられた活性分子の産生が引き起こされた。細胞抽出物におけるプレート拡散バイオアッセイにより、親株ＦＩ５８７６よりラクトバチルスヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)に対する抗菌活性レベルが顕著であることが証明された（図６）。ｎｉｓＡ／Ｓ５ＡをコードするＦＩ８０７０は、親株ＦＩ５８７６と同様のサイズの阻害ゾーンを示した。このことは、ニシン変性（ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ）における変異が、この指標微生物に対する抗菌特性に重要に影響しないことを示唆している。ＦＩ８１９８（変異ニシンＡ／Ｄｈａ３３Ａ）からの細胞抽出物は、一貫して親株より大きな阻害ゾーンを生じることが見いだされた（図６）。このことは、ここで用いられた条件下において、約５０％のニシンＡレベルが増大したことに対応する（表１）。このより高レベルの産生は、二重変異ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ，Ｄｈａ３３Ａを生ずるＦＩ８１９９の抽出には見られなかった。このニシン変性の阻害効果は、単一変異を含有するニシンＡおよび野生型分子のものと同じであった（表１）。どの場合にも、特定のニシン変性の収率は、プラスミド相補システム(a plasmid complementation syste m)に等価プラスミドコード化遺伝子を用いた場合より、遺伝子交換法を用いた場合により高かった（表３，Doddら（1992）（1993）上掲）。ここで開発されたシステムは、ニシンＡ産生親株ＦＩ５８７６と同じ収率で変性ニシンを産生している（表１）。野生型ｎｉｓＡ遺伝子の場合には、これは類似プラスミド相補アプローチを用いて以前に行われたニシンレベルよりも約５０％高い（Doddら（1992）（1993）上掲）。これらの二つのシステムをさらに比較することにより、産生レベルの差異が、驚くべきことに、ニシン変性に対してよりはっきりしていることがわかった（表３）。遺伝子交換アプローチは、ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａの収率を約４倍に増大させ、ニシンＡ／Ｄｈａ３３Ａの収率を１０倍以上高くした。二重変異ニシンＡ／Ｄｈａ５Ａ，Ｄｈａ３３Ａの産生効率の増大は特に顕著である（表３）。この変性を特定する遺伝子が、コード化されたプラスミドであり、ｎｉｓＡ欠乏宿主株を補うために用いられた場合には、抗菌活性はより敏感なコロニー積層アッセイでのみ検出された。この株の細胞抽出物は、プレート拡散バイオアッセイで何の活性も示さなかった（表３）。しかしながら、遺伝子交換法で遺伝子が染色体に取り込まれた場合には、活性レベルは、１００％以上の産生の増大を示すニシンＡと同じであった。この予期せぬ発見は、次なる設計された分子の化学的かつ生化字的解析に関連する。顕著な量の精製されたペプチドが、新規のニシンを十分に特徴決定するため、食品防腐剤の市場を満たすに適切なスケールの量を産生するために必要であり、ここに記載されたシステムは比較的高い収率が得られることを確実にしそうである。この実施例に記載された方法を用いて種々の変異ニシン産生株を調製した。これらは表４に記載されている。特異的変異を生じる適切なオリゴヌクレオチドプライマーは、図４に与えられた配列から、図１１に示すようにして設計された。特異的変異を生じる適切なオリゴヌクレオチドプライマーは、図４に与えられた配列から、図１１に示すようにして設計された。ある環境では、誘導因子としてｎｉｓＡニシンを添加することが好ましい。表５は、種々の誘導剤を用いた効果を示している。実施例２：変性ニシンの精製株ＦＩ８０７０（ｎｉｓＡ／Ｓ５Ａ）を培養し、変異ニシン（Ｄｈａ５がアラニンに置換されている）を培養培地中に分泌させた。この変異ニシンを、Muldersら（1991）Eur．J．Biochem．201，581-584に記載されたことに基づく方法を用いて精製した。１リットルの培養液を３０℃で１６時間インキュベートした。培養液のｐＨを、ＨＣｌで２−３まで減少させた後に、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。細胞を含まない上清を保持して、ｐＨを１０ｍＭのＮａＯＨで５−６まで上げた。各１０ｍｌの上清に０．９９ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を添加した。この溶液を、濾過（Millipore、０．４５μｍ）した後に、０．８Ｍの（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄で予め平衡化したFractogel TSK Butyl 650S(Merk)カラム、ベッドボリューム５ｘ２０ｃｍに添加した。このカラムを〜１リットルの０．８Ｍの（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄で洗浄して、２２０における吸収を０．５以下に下げた。結合したニシンを５ｍＭのＨＣｌで溶出し、１０ｍｌのフラクションをニシン活性についてアッセイした。活性のあるフラクションを集め、乾燥冷凍した。室温で流したμ Bondapak C18カラム３．９ｘ３００ｍｍを用いて、再懸濁したサンプルに逆相ＨＰＬＣを行った。用いられた溶液は、０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸および９０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中の０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸であった。吸収を２２０ｎｍで測定した。実施例３：チーズへの変性ニシンの添加株ＦＩ８０７０（Ｄｈａ５がアラニンで置換されている）によって産生された変性ニシンを、食品損傷（food-spoilage）または病原性細菌の生育を防止するためにソフトチーズにｋｇ当たり１２．５ｍｇの濃度で添加した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ドッド，ヘレンメアーイギリス国ＮＲ４６ＡＡノーウィッチクリングルフォードイントウッドロード 32

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞に、変性ｎｉｓＡ遺伝子、およびニシン修飾、分泌および免疫のための遺伝子を与える段階を含み、変性ｎｉｓＡ遺伝子が、未変性のｎｉｓＡ遺伝子およびニシン修飾、分泌および免疫のための遺伝子を含有する遺伝子クラスターに対する未変性のｎｉｓＡ遺伝子と同じ関係を備えた、未変性ｎｉｓＡ遺伝子を含まないがニシンを発現する細胞を調製する方法。２．変性ｎｉｓＡ遺伝子が変性ニシンをコードする、請求項１記載の方法。３．変性ｎｉｓＡ遺伝子が、未変性ｎｉｓＡ遺伝子制御領域以外の制御領域およびニシンコード領域を含む、請求項１または２記載の方法。４．未変性のｎｉｓＡ遺伝子の染色体局在位置において未変性の染色体ｎｉｓＡ遺伝子を変性ｎｉｓＡ遺伝子で置換することを含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。５．自己複製ＤＮＡ分子上に、変性ｎｉｓＡ遺伝子およびニシン修飾および免疫のための遺伝子を含む遺伝子クラスターを供給することを含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。６．細胞がラクトコッカスである、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。７．（１）未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体局在位置において、未変性の染色体ｎｉｓＡ遺伝子を対抗選択性ｎｉｓＡ遺伝子で置換する工程、および（２）未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体局在位置において、対抗選択性ｎｉｓＡ遺伝子を変性ｎｉｓＡ遺伝子で置換する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。８．ニシンに対して免疫のある細胞を選択する工程を含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。９．対抗選択性ｎｉｓＡ遺伝子が抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。１０．抗生物質に感受性の細胞を選択する工程をさらに含む、請求項９記載の方法。１１．変性ｎｉｓＡ遺伝子が未変性ｎｉｓＡ遺伝子の転写もしくは翻訳制御配列に対する修飾を含み、細胞が天然レベルより高いレベルの未変性ｎｉｓＡニシンを発現する、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。１２．請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法で得られた細胞。１３．変性ｎｉｓＡ遺伝子を含有し、変性ｎｉｓＡ遺伝子が、未変性のｎｉｓＡ遺伝子およびニシン修飾、分泌および免疫のための遺伝子を含有する遺伝子クラスターに対する未変性のｎｉｓＡ遺伝子と同じ関係を備えた、未変性ｎｉｓＡ遺伝子を含まないがニシンを発現する細胞。１４．変性ｎｉｓＡ遺伝子が変性ニシンをコードする、請求項１３記載の細胞。１５．変性ｎｉｓＡ遺伝子が、未変性ｎｉｓＡ遺伝子制御領域以外の制御領域およびニシンコード領域を含む、請求項１３または１４記載の細胞。１６．未変性の染色体ｎｉｓＡ遺伝子もしくはその一部が欠失し、未変性ｎｉｓＡ遺伝子の染色体局在位置に変性ｎｉｓＡ遺伝子を含む、請求項１３ないし１５のいずれか一項に記載の細胞。１７．変性ｎｉｓＡ遺伝子およびニシン修飾、分泌および免疫のための遺伝子を備えた自己複製ＤＮＡ分子を含有する、請求項１３ないし１５のいずれか一項に記載の細胞。１８．細胞がラクトコッカスである、請求項１３ないし１７のいずれか一項に記載の細胞。１９．ニシンに対して免疫のある、請求項１３ないし１８のいずれか一項に記載の細胞。２０．変性ｎｉｓＡ遺伝子が未変性ｎｉｓＡ遺伝子の転写もしくは翻訳制御配列に対する修飾を含み、天然レベルより高いレベルの未変性ｎｉｓＡニシンを発現する、請求項１３ないし１９のいずれか一項に記載の細胞。２１．請求項１２ないし２０のいずれか一項に記載の細胞を培養し、産生されたニシンを得ることを含むニシンを産生する方法。２２．ニシンが変性ニシンである、請求項２１に記載の方法。２３．細胞をｎｉｓＡニシンもしくはニシンの発現を誘導することができる変性ニシンの存在下で培養する、請求項２１または２２に記載の方法。２４．ｎｉｓＡニシンの量が、ニシン産生の最大誘導を与える最小量である、請求項２３記載の方法。２５．請求項２１ないし２４のいずれか一項に記載の方法で産生されたニシン。２６．請求項２１ないし２４のいずれか一項に係るニシンの、殺菌薬としての使用。