FR2815967A1

FR2815967A1 - Souche de lactobacillus sakei, et plasmide heberge par ladite souche

Info

Publication number: FR2815967A1
Application number: FR0013975A
Authority: FR
Inventors: Carl Alfred Alpert; Monique Zagorec
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2002-05-03
Anticipated expiration: 2020-10-31
Also published as: WO2002036756A2; FR2815967B1; WO2002036756A3; AU2002215088A1

Abstract

L'Invention est relative à une nouvelle souche de L. sakei, apte à assimiler le lactose, et à un nouveau plasmide hébergé par ladite souche, et utilisable pour transformer L. sakei.

Description

L'invention est relative à une nouvelle souche de Lactobacillus sakei et à ses utilisations.

Lactobacillus sakei est une bactérie lactique utilisée communément dans la fabrication de certains produits alimentaires fermentés, notamment les produits dérivés de la viande ou du poisson, ou la choucroute. Son rôle principal est la production d'acide lactique, par fermentation des hydrates de carbones présents naturellement en faibles quantités dans le produit de départ (par exemple le glucose ou le ribose), ou ajoutés (principalement du glucose, dusaccharose, des dextrines, ou du lactose sous forme de poudre de lait écrémé) à celui-ci pour stimuler la fermentation. L'acide lactique ainsi produit joue un rôle essentiel dans la texture et la qualité hygiénique du produit final.

Dans le cadre de la fabrication de produits fermentés ou dans celui de la production de ferments destinés à cette fabrication, il est important de disposer de cultures de Lactobacillus sakei dont la croissance soit rapide, bien maîtrisée, et reproductible. Ces propriétés dépendent essentiellement de la capacité de ces cultures à utiliser les sucres comme source de carbone pour assurer leur croissance, et notamment le lactose, qui est fréquemment employé par les industriels pour activer la fermentation.

Chez les bactéries, deux voies différentes de métabolisme du lactose ont été décrites.

La mieux connue est celle qui fait intervenir le système perméase/ss-galactosidase. Cette voie métabolique a été initialement mise en évidence chez Escherichia coli, et des systèmes similaires ont été ensuite observés chez de nombreuses bactéries, y compris des bactéries Gram-positives. Le lactose importé par la perméase dans la cellule bactérienne, est clivé par la ss-galactosidase en glucose et galactose, qui entrent ensuite dans le métabolisme des sucres.

Une autre voie de métabolisme des sucres, et entre autre du lactose a été observée chez certaines

bactéries Gram-positives : il s'agit du système des phosphotransférases (PTS).

Dans ce système l'entrée du sucre dans la cellule est couplée à une cascade de phosphorylations, qui font intervenir les enzymes non-spécifiques EI et HPr, et les enzymes EIIA, et EIIB/EIIC, qui sont spécifiques d'un sucre

donné. Ce processus débute par la phosphorylation de EI à partir du phosphoénolpyruvate (PEP), et aboutit à la phosphorylation de EIIB, selon l'enchaînement suivant : EI-HPr-EIIA-EIIB.

L'enzyme EIIB phosphorylée, associée à la protéine transmembranaire EIIC catalyse simultanément l'entrée du sucre dans la cellule et sa phosphorylation.

Ainsi, le lactose est importé dans la cellule sous forme de lactose phosphate ; celui-ci est hydrolysé par une P-ss-galactosidase en glucose, qui entre directement dans la glycolyse, et en galactose-6P, qui est converti par la voie du tagatose-6P, avant d'être métabolisé par la voie des trioses-phosphate.

Les gènes codant les enzymes spécifiques du système PTS sont organisés en opéron ; chez les bactéries à Gram positif, 4 opérons PTS spécifiques du lactose ont été caractérisés jusqu'à présent : - un opéron lacTEGF de Lactobacillus casei, qui comprend le gene lack codant un antiterminateur, les gènes lacE et lacF, codant respectivement les enzymes spécifiques EIIBClac et EIIAlac du système PTS du lactose, et le gène lacG codant la P-ss-galactosidase ; - un amas de gènes lacRABCDFEGX de Lactococcus lactis, qui comprend : * le gène lacR, codant un répresseur de la transcription de l'opéron lacABCDFE, * l'opéron lacABCDFE qui comprend les gènes lacA et lack codant respectivement les sous-unités A et B de la galactose 6-P isomerase, les gènes lacC et lacD codant respectivement la tagatose 6-P kinase et la tagatose 1,6-diP aldolase, les gènes lacE et lacF, codant respectivement les

Lac enzymes spécifiques EIIBCLac et EIIB

* l'opéron lacGX, qui comprend le gène lacG codant la P-ss-galactosidase, et le gène lacX qui pourrait intervenir dans la recombinaison ; - les amas de gènes lacRABCDFEG de Staphylococcus aureus, et de Streptococcus mutans, qui comprennent tous deux les gènes lacR, lacA, lack, lacC, lacD, lacE, lacF, et lacG.

Les régions du génome comprenant ces opérons sont représentés sur la Figure 1.

II est généralement admis que les sucres importés par le PTS sont plus rapidement métabolisés que ceux importés par le système perméase/ss-galactosidase, et sont utilisés préférentiellement. En outre, dans le cas du système perméase/ss-galactosidase, une partie du galactose résultant du clivage du lactose par la ss-galactosidase, peut être utilisée pour la synthèse de polysaccharides de paroi ou d'exopolysaccharides (EPS) ; en revanche, le galactose-6P issu du système PTS n'est disponible que pour la croissance et non pour la production d'EPS. Dans le cas de Lactobacillus sakei, une production importante d'EPS n'est généralement pas souhaitable ; en effet, ces EPS peuvent entraîner un aspect poisseux, mal accepté par le consommateur dans le cas de certains produits, par exemple les produits carnés.

Cependant, la capacité à utiliser le lactose est un caractère qui, chez l'espèce Lactobacillus sakei, est très variable d'une souche à l'autre. Il a été rapporté [OBST et al., FEMS Microbiol. Lett., 97,209-214, (1992)] que des souches de Lactobacillus sakei pouvaient posséder soit une activité ss-galactosidase, soit une activité P-ss-galactosidase, soit les deux activités, soit aucune des deux. En outre, la présence d'une ss-galactosidase active n'implique pas forcément un métabolisme du lactose fonctionnel, par exemple, la souche de laboratoire modèle 23K, ainsi que sa souche-mère 23 ont un phénotype Lac-bien qu'elles expriment une ss-galactosidase active.

L'aptitude à utiliser le lactose est en outre fréquemment un caractère instable, ce qui est particulièrement gênant dans le cas de souches destinées à un usage industriel, dont les propriétés doivent être

contrôlables et reproductibles. Cette instabilité a également été observée chez des bactéries lactiques autres que Lactobacillus sakei et a été attribuée à la localisation plasmidique des gènes qui codent pour les enzymes capables de métaboliser le lactose. La perte du plasmide au cours des cultures répétées entraînerait la perte du phénotype Lac+.

Il apparaît donc souhaitable de disposer de souches de Lactobacillus sakei capables d'utiliser le lactose via le système des phosphotransférases et dans lesquelles les gènes responsables de ce métabolisme sont situés sur le chromosome, ou du moins sur un plasmide stable.

La présente invention a pour but de fournir des souches répondant à ces caractéristiques, ainsi que les outils permettant leur obtention.

Les Inventeurs ont isolé et caractérisé une souche de Lactobacillus sakei, dénommée ci-après RV332, capable d'assimiler le lactose par l'intermédiaire d'un système PTS fonctionnel ; ils ont en outre identifié, dans cette souche, un nouveau plasmide, dénommé ci-après pRV500, capable de se maintenir et de se répliquer de façon stable chez Lactobacillus sakei.

Les Inventeurs ont identifié les gènes impliqués dans le métabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases chez la souche RV332 ; ils ont constaté que, de manière inattendue, ces gènes présentaient une homologie très importante (environ 95% d'identité au niveau de la séquence nucléotidique) avec les gènes spécifiques du système lac-PTS de Lactococcus lactis, et étaient organisés de manière identique, à savoir sous forme d'un amas de gènes lacRABCDFEGX, comprenant de 5'eo 3' : les gènes lacR, lacA, lack, lacC, lacD, lacE, lacF, lacG, et lacX.

L'amas de gènes lacRABCDFEGX est localisé sur le chromosome de la souche RV332 ; il est flanqué de part et d'autre de séquences présentant de fortes homologies avec des séquences d'insertion IS : la séquence d'un fragment d'ADN chromosomique de la souche RV332 comprenant les gènes spécifiques du système lac-PTS est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.

Les Inventeurs ont également séquencé le plasmide pRV500 ; ce plasmide porte des cadres ouverts de lecture codant des protéines significativement similaires à des protéines RepA et RepB connues, notamment des protéines RepA et RepB de Tetragenococcus halophilus, ainsi que la protéine RepB de Lactococcus lactis, des cadres ouverts de lecture codant des protéines similaires à des protéines de lactocoques, et des cadres ouverts de lecture codant des protéines significativement similaires à des protéines HsdM, HsdS et HsdR d'un système de restriction/modification de résistance aux bactériophages.

La séquence complète du plasmide pRV500 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 11.

La présente invention a pour objet la souche de Lactobacillus sakei RV332, qui a été déposée selon le traité de Budapest, le 15 mars 2000, auprès de la C. N. C. M.

(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le numéro 1-2398.

La présente invention englobe également des molécules d'intérêt biologique, obtenues à partir de ladite souche. Il s'agit en particulier de molécules d'acide nucléique utilisables pour la transformation génétique de bactéries lactiques, et plus particulièrement : - de molécules d'acide nucléique comprenant au moins un gène de l'amas lacRABCDFEGX de la souche RV332, et notamment au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases, choisi parmi le gène lacR, le gène lacA, le gène lack, le gène lacC, le gène lacD, le gène lacF, le gène lacE, et le gène lacG, du plasmide pRV500, ou de molécules d'acide nucléiques comprenant au moins un fragment dudit plasmide, et notamment de molécules d'acide nucléiques comprenant le système de réplication dudit plasmide, ou de molécules d'acide nucléique comprenant au moins un gène dudit plasmide choisi parmi hsdM, hsdS ou hsdR.

Selon un mode de réalisation préféré d'une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention, ledit gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases, est choisi parmi le gène lacA, le gène lack, le gène lacC, le gène lacD, le gène lacF, le gène lacE et le gène lacG.

Avantageusement une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention comprend plusieurs gènes de l'amas ac. RABCDFEGX ; il peut s'agir à titre d'exemples nonlimitatifs : - d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins l'ensemble des gènes permettant le métabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases ; d'une molécule d'acide nucléique comprenant l'ensemble des gènes lacABCDFE ;

- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacAB, et permettant ainsi l'expression d'une galactose 6-P isomérase ; - d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacCD, et permettant ainsi l'expression des enzymes de la voie du tagatose 6-P ;

- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacEF, et permettant ainsi l'expression des enzymes spécifiques EIIBCLac et EIIA Lac de transport du lactose.

Eventuellement, une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention peut également comprendre le gène de régulation lacR, ainsi que le gène lacX.

Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, contenant au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases, peuvent être utilisées notamment pour la transformation génétique de bactéries lactiques, notamment de lactobacilles, tels que Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii (subsp. delbrueckii ou bulgaricus), Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus zeae, Lactobacillus helveticus, etc... et en particulier de Lactobacillus sakei, afin de leur conférer la

capacité d'utiliser le lactose par la voie des phosphotransférases.

La présente invention fournit également des moyens de sélection de souches de Lactobacillus sakei capables d'utiliser le lactose par la voie des phosphotransférases.

En particulier la présente invention a pour objet un procédé de sélection d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransférases, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence, chez les souches de Lactobacillus sakei à tester, de gènes lacA, lack, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, présentant respectivement au moins 90% d'identité avec les gènes lacA, lacke, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, de la souche CNCM 1-2398, et la sélection d'une souche comprenant l'ensemble desdits gènes. Eventuellement, le procédé conforme à l'invention peut en outre comprendre la détection de la présence des gènes lacR et lacX.

Le procédé conforme à l'invention peut en

particulier être mis en ceuvre en utilisant, pour la détection de la présence des gènes lacA, lack, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, et éventuellement des gènes lacR et lacX, des sondes d'acide nucléique dérivées des gènes correspondants de la souche CNCM 1-2398, ou bien des sondes d'acide nucléique dérivées des gènes homologues de Lactococcus lactis.

Alternativement, on peut détecter l'expression des protéines codées par ces gènes, par exemple à l'aide d'anticorps dirigés contre celles-ci ou contre leurs homologues de Lactococcus lactis.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransférases, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de Lactobacillus sakei par au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi : - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacA de la souche

- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacB de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacC de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacD de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacF de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacE de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacG de la souche CNCM 1-2398.

Selon un mode de mise en ceuvre préféré du procédé conforme à l'invention, il comprend en outre la transformation de ladite souche avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacR de la souche CNCM 1-2398, et/ou avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacX de la souche CNCM 1-2398.

Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence sur un alignement des 2 séquences assurant une correspondance maximale entre les positions des résidus.

Pour la mise en ceuvre du procédé conforme à l'invention, on peut notamment utiliser des gènes ou combinaisons de gènes issus de la souche CNCM 1-2398, ou des gènes ou combinaisons de gènes homologues issus de toute autre souche de Lactobacillus sakei, ou des gènes ou combinaison de gènes homologues issus de Lactococcus lactis.

Pour déterminer le gène ou la combinaison de gènes le plus approprié, on peut au préalable effectuer, comme indiqué ci-dessus, la détection de la présence, chez la souche à transformer, d'un ou plusieurs des gènes laca, lacb, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, et éventuellement des gènes lacR et/ou lacX, et effectuer la transformation avec une molécule d'acide nucléique comprenant le ou les gènes manquants.

Des méthodes de transformation de Lactobacillus sakei et des vecteurs convenant à la mise en oeuvre de ces méthodes sont connus en eux-mêmes (cf. par exemple AXELSSONN et al., FEMS Microbiol. Lett., 168,137-143, 1998 ; BERTHIER et al., Microbiology, 142,1273-1279, 1996 ; LANGELLA et al., FEMS Microbiol. Lett., 139,51-56, 1996 ; Demande PCT EP/00/03099 au nom de l'INRA).

Dans le cadre de la mise en ceuvre de la présente invention, on choisira avantageusement un vecteur intégratif, permettant d'insérer la séquence choisie dans le chromosome bactérien, et ainsi d'obtenir des transformants stables. On peut par exemple utiliser le vecteur pRV300, décrit par LELOUP et al. [Appl. Environm. Microbiol., 63,2117-2123, (1997)].

L'insertion dans le chromosome bactérien peut s'effectuer par exemple en utilisant les séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX, ou bien par recombinaison homologue ; dans ce dernier cas on l'effectuera de préférence au niveau d'un gène ou d'une région nonessentiels de Lactobacillus sakei, par exemple au niveau de l'opéron lacLM, comme décrit dans la Demande PCT/EPOO/03099 citée ci-dessus, ou bien au niveau de la région du chromosome de Lactobacillus sakei homologue à celle dans laquelle l'amas lacRABCDFEGX est inséré dans la souche RV332.

On peut également utiliser comme vecteur un plasmide réplicatif capable de se maintenir de façon stable chez Lactobacillus sakei ; la présente invention fournit également de nouveaux plasmides utilisables en particulier dans ce but. Il s'agit du plasmide pRV500 et des dérivés de celui-ci comprenant son système de réplication.

On entend par système de réplication du plasmide pRV500, un fragment d'acide nucléique comprenant : - l'origine de réplication de pRV500, - le gène repA de pRV500 ou une séquence codant pour une protéine présentant au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la protéine RepA codée par ledit gène, - le gène repB de pRV500 ou une séquence codant pour une protéine présentant au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la protéine RepB codée par ledit gène.

La présente invention a en conséquence également pour objet un plasmide, capable de se répliquer chez Lactobacillus sakei, choisi parmi : - le plasmide pRV500, de la souche CNCM 1-2398 ; - un plasmide comprenant au moins le système de réplication dudit plasmide pRV500.

Les plasmides conformes à l'invention ont un système de réplication type théta, et permettent l'insertion de grandes séquences d'acide nucléique, notamment plusieurs gènes contigus ou un opéron complet. Ils sont donc particulièrement intéressants dans le cadre de la mise en ceuvre de la présente invention pour l'obtention de souches transformées de Lactobacillus sakei capables d'assimiler le lactose, mais également pour l'introduction et le maintien de tout autre gène ou ensemble de gènes d'intérêt chez Lactobacillus sakei.

Ils peuvent également être utilisés nonseulement chez Lactobacillus sakei mais également chez d'autres espèces de bactéries lactiques, par exemple des lactocoques tels que Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, etc., et avantageusement chez des lactobacilles, Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, tels que Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii (subsp. delbrueckii ou bulgaricus), Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus fermentum, Lactobacillus zeae, Lactobacillus helveticus, etc.

Ils peuvent aussi être utilisés pour l'obtention de vecteurs navettes capables de se répliquer chez Escherichia coli.

La présente invention a également pour objet des plasmides dérivés des plasmides conformes à l'invention définis ci-dessus, et notamment des plasmides à réplication conditionnelle.

On définit ici comme plasmide à réplication conditionnelle un plasmide dont la réplication ne s'effectue que dans certaines conditions (par exemple de température, de pH, de concentration en sels minéraux, de présence dans le milieu de culture d'un composé particulier, etc. ), par exemple du fait qu'une ou plusieurs séquence (s) dudit plasmide intervenant dans sa réplication (notamment l'origine de réplication et/ou les gènes repA et/ou repB) porte (nt) une mutation conditionnelle, ou bien du fait qu'une ou plusieurs des protéines intervenant dans la réplication sont placées sous contrôle d'un promoteur inductible.

La transformation peut ainsi être effectuée en deux étapes : dans la première, les bactéries sont cultivées dans des conditions permettant la réplication du plasmide, ce qui permet une première sélection de celles dans lesquelles il s'est répliqué ; dans la seconde, les bactéries sont cultivées dans des conditions ne permettant pas la réplication du plasmide, ce qui permet de sélectionner celles dans lesquelles les séquences du plasmide sont intégrées au chromosome. Ce système permet de découpler la transformation et la recombinaison, rendant possible la modification de souches faiblement transformables.

Des exemples de plasmides à réplication conditionnelle sont par exemple les plasmides de la famille pGhost [BISWAS et al., J. Bacteriol., 175,3628-3635, (1993) ; Demande PCT WO 93/18164 ; MAGUIN et al., J.

Bacteriol., 178,931-935, (1996)], qui sont des dérivés thermosensibles du plasmide pWVO1 de Lactococcus lactis, résultant d'une mutation au niveau du gène repA. Chez

Lactococcus lactis, ces plasmides se répliquent normalement à 28 C, et leur réplication est inactivée à 37 C ; en revanche, ils ne sont pas thermosensibles chez Lactobacillus sakei. Des plasmides dotés de propriétés similaires, utilisables chez Lactobacillus sakei peuvent par exemple être obtenus en effectuant des mutations dans le gène repA de pRV500 au niveau de la région analogue à celle du gène repA du plasmide pWVO1 portant la mutation thermosensible.

Les cadres de lecture présents sur le plasmide pRV500, et notamment les séquences codant les protéines HsdM, HsdS et HsdR, peuvent également être utilisés pour transformer des bactéries lactiques, par exemple pour augmenter leur résistance aux bactériophages.

La présente invention a également pour objet des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332 (CNCM 1-2398), et notamment : - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par délétion des séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX, afin d'augmenter encore la stabilité de leur phénotype Lac+ ; - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par délétion ou inactivation du gène lac ; ces souches peuvent assimiler le lactose de manière constitutive ; - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par modification d'un ou plusieurs éléments de régulation (notamment promoteurs) de l'expression d'un ou plusieurs gènes de l'amas lacRABCDFEGX.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement, la caractérisation, et l'utilisation de la souche RV332, et du plasmide pRV500.

EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE LA SOUCHE RV332.

192 souches de Lactobacillus sakei isolées de produits carnés fermentés, ont été criblées sur la base de leur capacité à assimiler le lactose.

9 souches possédant un phénotype Lac+ ont été identifiées. 4 d'entre elles apparaissant identiques après analyse de leur génome par RAPD, 6 souches ont été retenues pour la suite des analyses. Parallèlement, la souche LTH1182 (fournie par le laboratoire du Prof. HAMMES, Université de Hohenheim ; Stuttgart, Allemagne), qui est connue pour exprimer à la fois une activité ss-galactosidase et une activité P-p-galactosidase, ainsi que la souche type de Lactobacillus sakei ATCC15521 ont été analysées à titre de témoins.

La présence de séquences codant des gènes impliqués dans le métabolisme du lactose, a été recherchée à l'aide de sondes dérivées du plasmide pLZ617 [ALPERT et CHASSY, J. Biol. Chem., 265,22561-22568, (1990)], qui comprend les séquences codant la portion C-terminale de l'antiterminateur LacT, l'enzyme LacIIBC, et la majeure partie de la P-p-galactosidase de Lactobacillus casei (lac'TEG'). D'autres sondes ont été dérivées des plasmides pNZ391 et pNZ392, qui codent pour l'opéron lacABCDFE'de Lactococcus lactis, c'est à dire les gènes lacABCD de la galactose 6-P isomérase, et de la voie du tagatose 6-P, et les gènes de transport lacFE' (enzymes EIIA et enzyme EIIBCLAC) [VAN ROOIJEN et al., J. Biol. Chem., 266,7176-7181, (1991)].

Dans le cas des sondes dérivées de pLZ617 on n'observe d'hybridation qu'avec une souche de L. casei utilisée à titre de contrôle positif ; aucune hybridation n'est observée avec les souches de Lactobacillus sakei testées.

Dans le cas des sondes dérivées de Lactococcus lactis, on n'observe d'hybridation qu'avec la souche LTH 1182, et l'une des 6 souches Lac+ étudiées (souche RV332). Les profils de restriction HindIII et HindIII/EcoRI de LTH1182 et de RV332 sont similaires ; cependant, les profils de restriction EcoRI diffèrent par le décalage d'une bande, ce qui confirme qu'il s'agit de 2 souches différentes.

Le fait qu'aucune hybridation ne soit observée avec les autres souches Lac+ peut indiquer soit qu'elles

possèdent un système PTS ne présentant pas de similitude suffisante avec les sondes utilisées pour être détecté, soit que leur phénotype Lac+ est du à un système perméase/ss- galactosidase, et non d'un système PTS.

La souche RV332 a été retenue pour la recherche des gènes du système PTS.

4 clones, correspondant aux fragments de restriction par HindIII et/ou EcoRI, s'hybridant avec les sondes dérivées de Lactococcus lactis ont été obtenus à partir de l'ADN total de RV332 : pRV501 (2 kb, EcoRI), pRV502 (1,75 kb, HindIII/EcoRI, pRV503 (1,8 kb, HindIII) et pRV504 (1,6 kb, HindIII/EcoRI). Le séquençage de ces clones montre que pRV502 est compris dans pRV501, et pRV504 dans pRV503, et permet leur localisation au niveau de l'extrémité 5'de la région lac : pRV501 comprend les séquences correspondant à lacRAB', et pRV503 celles correspondant à lac'BCD'.

De manière surprenante, les régions codantes identifiées sur ces clones ont un pourcentage d'identité remarquablement élevé (environ 95%) avec les séquences connues de la région lac de Lactococcus lactis (GenBank M60447).

Cette observation a permis d'obtenir directement le reste de la région lac à partir de l'ADN génomique de la souche RV332, à l'aide d'amorces dérivées de la séquence de l'opéron lac de Lactococcus lactis.

Il a ainsi été constaté que le niveau élevé d'identité entre les séquences de Lactococcus lactis et de Lactobacillus sakei persiste sur la totalité de la longueur de la région lac (9 kb), y compris le gène lacX, dont la fonction n'est pas encore bien identifiée. Des déviations mineures entre les 2 séquences sont observées au niveau des régions intergéniques, dans lesquelles on trouve des insertions ou des délétions de petite taille, qui n'ont probablement pas d'influence sur la fonction globale de la région.

La séquence d'un fragment de 17075 pb comprenant la totalité de la région lac de la souche RV332 de Lactobacillus sakei est représentée dans la liste de

séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ; les séquences polypeptidiques des enzymes du système lac-PTS codées par ce fragment sont également représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 10.

Contrairement à l'opéron lac de Lactococcus lactis, qui a été cloné à partir d'un plasmide, (pMG820) la totalité de la région lac de RV332 est située sur le chromosome bactérien. Cette localisation chromosomique a été confirmée par le séquençage du seul plasmide de RV332, pRV500 (cf exemple 4 ci-dessous).

Caractérisation des régions du chromosome flanquant l'opéron lac.

Les régions du chromosome de Lactobacillus sakei flanquant l'opéron lac ont été séquencées :
La région en 5'de l'opéron présente 2 éléments possédant une similitude de séquence élevée avec des éléments d'insertion flanquant 2 cadres ouverts de lecture codant des protéines possédant une similitude significative avec des oxydo-réductases du type réductase mercurique et avec une protéine de surface de Lactobacillus rhamnosus, dont la fonction est à l'heure actuelle inconnue.

Dans la région en 3'de l'opéron, lacX est suivi directement par une seconde copie d'un élément iso-ISS30 ; d'autres séquences rappelant celles d'éléments d'insertion sont également présentes dans cette région.

La localisation des différentes régions caractéristiques du fragment de 17075pb est récapitulée sur les Tableaux la et Ib ci-après. Le Tableau la indique la position des régions identifiées sur le brin de séquence SEQ ID NO : 1, ainsi que leurs caractéristiques, et le Tableau Ib indique la position des régions identifiées sur le brin complémentaire inverse ainsi que leurs caractéristiques.

TABLEAU la

<tb>
<tb> Position
<tb> Nom <SEP> Caractéristique <SEP> Remarques
<tb> de <SEP> à
<tb> 237 <SEP> séquence
<tb> PDCRAFOPER <SEP> ; <SEP> 4 <SEP> frameshifts <SEP> dans <SEP> l'ORF <SEP> codant <SEP> une
<tb> transposase <SEP> hypothétique
<tb> 4043 <SEP> 4628 <SEP> DNA <SEP> 97% <SEP> d'identité <SEP> avec <SEP> des <SEP> portions <SEP> de <SEP> PPSURFOP
<tb> 4418 <SEP> 5260 <SEP> ORF <SEP> Similarité <SEP> avec <SEP> des <SEP> portions <SEP> de <SEP> l'élément <SEP> IS <SEP> de
<tb> Pediococcus <SEP> pentosaceus <SEP> SPTR~BA <SEP> : <SEP> Q52262, <SEP> et <SEP> avec <SEP> la
<tb> transposase <SEP> SPTR <SEP> : <SEP> BA053033 <SEP> d'Enterococcus <SEP> faecium
<tb> 6665 <SEP> 7090 <SEP> lacA <SEP> ORF <SEP> Gal-6-P <SEP> lsomerase <SEP> sous-unité <SEP> A
<tb> 7107 <SEP> 7622 <SEP> lacB <SEP> ORF <SEP> Gal-6-P <SEP> isomerase <SEP> sous-unité <SEP> B
<tb> 7633 <SEP> 8565 <SEP> lacC <SEP> ORF <SEP> Tagatose-6-P <SEP> kinase
<tb> 8568 <SEP> 9545 <SEP> lack <SEP> ORF <SEP> Tagatose-1, <SEP> 6-P <SEP> aldolase
<tb> 9576 <SEP> 9893 <SEP> lacF <SEP> ORF <SEP> EIIA
<tb> 9893 <SEP> 11599 <SEP> lacE <SEP> ORF <SEP> EIIBCLac
<tb> 11710 <SEP> 13143 <SEP> lacG <SEP> ORF <SEP> Phospho-p-ga <SEP> ! <SEP> actosidase
<tb> 13458 <SEP> 14357 <SEP> lacX <SEP> ORF <SEP> Potentiellement <SEP> impliqué <SEP> dans <SEP> la <SEP> réponse <SEP> SOS
<tb> 14382 <SEP> 15424 <SEP> DNA <SEP> 98% <SEP> d'identité <SEP> avec <SEP> des <SEP> portions <SEP> de <SEP> l'élément <SEP> IS
<tb> hypothétique <SEP> GBBA1 <SEP> : <SEP> PDCRAFOPER, <SEP> . <SEP> Frameshift <SEP> dans
<tb> 14398 <SEP> 15308 <SEP> ORF <SEP> la <SEP> région <SEP> codant <SEP> une <SEP> transposase <SEP> hypothétique, <SEP> vers <SEP> le
<tb> nucléotide <SEP> 15207
<tb>
TABLEAU ! b

<tb>
<tb> Position
<tb> Nom <SEP> Remarques
<tb> de <SEP> à
<tb> 58 <SEP> 698 <SEP> DNA <SEP> Similaire <SEP> aureus
<tb> (similitude <SEP> au <SEP> niveau <SEP> de <SEP> l'ADN)
<tb> 58 <SEP> 689 <SEP> ORF <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> une <SEP> transposase <SEP> hypothétique <SEP> du <SEP> prophage
<tb> phiPV83 <SEP> de <SEP> S. <SEP> aureus
<tb> 884 <SEP> 1564 <SEP> ORF <SEP> IS <SEP> 1297 <SEP> de <SEP> Lactococcus <SEP> lactis
<tb> 10886 <SEP> 11652 <SEP> lacr <SEP> ORF <SEP> Répresseur <SEP> de <SEP> l'opéron <SEP> lac
<tb> 13237 <SEP> 13704 <SEP> ORF <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> la <SEP> protéine <SEP> de <SEP> surface <SEP> hypothétique
<tb> SPTR~BA <SEP> : <SEP> 030701 <SEP> de <SEP> L. <SEP> rhamnosus, <SEP> à <SEP> la <SEP> ferritine <SEP> nonhémique <SEP> hypothétique <SEP> SW <SEP> : <SEP> FREI-LYSIN <SEP> P80725 <SEP> de
<tb> Listeria <SEP> innouca, <SEP> à <SEP> la <SEP> protéine <SEP> de <SEP> stress <SEP> hypothétique
<tb> SW <SEP> : <SEP> MRGA <SEP> BACSU <SEP> P37960 <SEP> de <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> 13751 <SEP> 13920 <SEP> ORF <SEP> Vestiges <SEP> de <SEP> l'IS30 <SEP> de <SEP> Pediococcus <SEP> pentosaceus
<tb> 14168 <SEP> 15507 <SEP> merA <SEP> ORF <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> la <SEP> pyndine <SEP> nucléotide <SEP> disulfide
<tb> oxydoréductase <SEP> hypothétique <SEP> YGKCECOU, <SEP> et <SEP> à <SEP> la
<tb> réductase <SEP> mercurique <SEP> SPTR~BA <SEP> : <SEP> 069236 <SEP> de <SEP> Bacillus
<tb> cereus
<tb> 15796 <SEP> 16838 <SEP> DNA <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> l'IS30 <SEP> de <SEP> Pediococcus <SEP> pentosaceus
<tb> (similitude <SEP> au <SEP> niveau <SEP> de <SEP> l'ADN)
<tb> 15815 <SEP> 16825 <SEP> ORF <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> l'IS30 <SEP> de <SEP> Pediococcus <SEP> pentosaceus
<tb> (nombreux <SEP> frameshifts <SEP> localisés <SEP> à <SEP> l'extrémité <SEP> 3'de
<tb> l'ORF <SEP> codant <SEP> la <SEP> transposase <SEP> putative)
<tb>
EXEMPLE 2 : FONCTIONNALITE DE LA REGION LAC DE LACTOBACILLUS SAKEI.

Construction de mutants lac.

Afin de déterminer si les gènes identifiés à l'exemple 1 ci-dessus, étaient fonctionnels et intervenaient effectivement dans le métabolisme du lactose chez

Lactobacillus sakei, différents mutants de RV332 ont été construits par double crossing-over, selon la technique décrite par STENTZ et ZAGOREC [J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1 (1), 165-173, (1999)], en utilisant le plasmide pRV300, non-réplicatif chez Lactobacillus sakei [LELOUP et al., 1997, publication précitée].

Le principe de construction de ces mutants est le suivant : des dérivés de pRV300 contenant des fragments obtenus par PCR homologues de la région à modifier, à l'exception de la mutation à introduire, sont introduits dans le chromosome par simple crossing-over ; la sélection des intégrants s'effectue sur la base de la résistance à l'érythromycine, conférée par les séquences de pRV300.

L'insertion d'une seule copie du plasmide dans le gène cible est vérifiée par PCR. Les recombinants obtenus sont cultivés en milieu MRS [DE MAN et al., Journal of Applied Bacteriology, 23,130-135, (1960)] pendant 100 générations, en conditions non-sélectives (c'est à dire en l'absence d'érythromycine), ce qui permet la perte de la résistance à l'érythromycine, lors d'un second crossing-over. Si ce second crossing-over intervient du même côté du site prévu pour la mutation, le caractère sauvage est restauré ; en revanche, si le second crossing-over intervient de l'autre côté du site prévu pour la mutation, la région du chromosome portant le caractère sauvage située entre les emplacements des deux crossing-over est échangée avec la région mutée.

Les mutants construits de cette manière ne contiennent aucun ADN exogène ou plasmidique, puisque les dérivés de pRV300 utilisés ne peuvent pas se répliquer de façon autonome chez Lactobacillus sakei.

Dans un premier temps, une délétion a été introduite dans l'opéron lacLM qui code la ss-galactosidase, afin de vérifier que le système lac-PTS est fonctionnel dans RV332, et afin d'éliminer une activité ss-galactosidase potentielle, qui interférerait avec les mesures d'activité P-p-galactosidase.

La souche résultante, dénommée RV3001 a ensuite été utilisée pour la construction des souches mutantes suivantes : - RV3003, dans laquelle l'expression de l'opéron lac est rendue constitutive par l'inactivation du répresseur, par une délétion dans lac ; - RV3005, dans laquelle l'enzyme générale EI du système PTS est inactivée par une mutation du gène ptsI, entraînant le remplacement de l'histidine en position 190 par une alanine, et résultant en un phénotype Lac- [STENTZ et ZAGOREC, 1999, publication précitée] ; - RV3007, la voie du tagatose-6P est inactivée par une délétion dans le gène lack codant la tagatose-6P kinase, résultant en un phénotype Lac- ;

RV3008 dans laquelle l'enzyme spécifique EIIBC est inactivée par une délétion dans le gène lacE codant cette enzyme, résultant en un phénotype Lac-.

Les délétions ont été effectuées de manière à ce que les cadres de lecture situés en aval demeurent en phase, afin d'éviter tout effet de polarité sur la traduction des gènes en 3'de la délétion.

En outre, un mutant de la souche RV332 (RV3004)

dans lequel l'enzyme générale EI du système PTS est inactivée a été construit, par mutation du gène ptsI, identique à celle effectuée sur la souche mutante RV3005 ; un phénotype Lac-de cette souche permet de vérifier que le métabolisme du lactose chez RV332 dépend uniquement de l'activité du système lac-PTS.

Les caractéristiques de ces mutants sont récapitulées dans le Tableau II ci-après.

TABLEAU) !

<tb>
<tb> Souche <SEP> Génotype
<tb> RV <SEP> 332 <SEP> sauvage
<tb> RV <SEP> 3001 <SEP> l/acLM
<tb> RV <SEP> 3003 <SEP> #LacLM#lacR
<tb> RV <SEP> 3004 <SEP> ptsi <SEP> Hl <SEP> 90A
<tb> RV <SEP> 3005 <SEP> A/acLMpts/H190A
<tb> RV <SEP> 3007 <SEP> #lacLM# <SEP> lacB
<tb> RV <SEP> 3008 <SEP> #lacLM# <SEP> lacE
<tb>
Caractérisation des mutants lac.

Les souches mutantes ont été caractérisées par leur comportement de croissance sur milieu chimiquement défini, (MCD) [LAURET et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1922-1927, (1996)], supplémenté avec soit du glucose, du lactose ou du galactose.

Les résultats des expérimentations sont illustrés ci-après dans les Tableaux III (cultures avec glucose), IV, (cultures avec lactose), et V (cultures avec galactose). TABLEAU II

<tb>
<tb> SOUCHES <SEP> TEMPS <SEP> DE <SEP> DO <SEP> FINALE <SEP> pH <SEP> FINAL
<tb> GENERATION
<tb> (minutes)
<tb> RV <SEP> 332 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb> RV <SEP> 3001 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb> RV <SEP> 3003 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb> RV <SEP> 3004 <SEP> 200 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 3
<tb> RV <SEP> 3005 <SEP> 200 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 3
<tb> RV <SEP> 3007 <SEP> 90 <SEP> 0,7 <SEP> 4,7
<tb> RV <SEP> 3008 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7
<tb>
TABLEAU IV

<tb>
<tb> SOUCHES <SEP> TEMPS <SEP> DE <SEP> DO <SEP> FINALE <SEP> pH <SEP> FINAL
<tb> GENERATION
<tb> (minutes)
<tb> RV <SEP> 332 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 6
<tb> RV <SEP> 3001 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 6
<tb> RV <SEP> 3 <SEP> 003 <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 8
<tb> nd <SEP> : <SEP> non <SEP> déterminé
<tb>
TABLEAU V

<tb>
<tb> SOUCHES <SEP> TEMPS <SEP> DE <SEP> DO <SEP> FINALE <SEP> pH <SEP> FINAL
<tb> GENERATION
<tb> (minutes)
<tb> RV <SEP> 332 <SEP> 231 <SEP> 0,32 <SEP> 5, <SEP> 2
<tb> RV <SEP> 3001 <SEP> 151 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 5, <SEP> 3
<tb> RV <SEP> 3003 <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> 5, <SEP> 2
<tb> RV <SEP> 3004 <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> RV <SEP> 3005 <SEP> 169 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> RV <SEP> 3007 <SEP> 350 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> RV <SEP> 3008 <SEP> 350 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 5, <SEP> 5
<tb>

Parallèlement, les activités ss-galactosidase et P-ss-galactosidase de ces souches ont été mesurées : les résultats sont illustrés par le Tableau VI ci-dessous.

TABLEAU VI

<tb>
<tb> Cultures <SEP> glucose <SEP> Cultures <SEP> lactose <SEP> Cultures <SEP> galactose
<tb> SOUCHES <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> ss-Gal <SEP> P-ss-Gal <SEP> ss-Gal <SEP> P-ss-Gal <SEP> ss-Gal <SEP> P-ss-Gal
<tb> RV <SEP> 332 <SEP> 69 <SEP> 3 <SEP> 16 <SEP> 296 <SEP> 63 <SEP> 375
<tb> RV <SEP> 3001 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 201 <SEP> 1 <SEP> 343
<tb> RV <SEP> 3003 <SEP> 1 <SEP> 576 <SEP> 0 <SEP> 478 <SEP> 1 <SEP> 657
<tb> RV <SEP> 3004 <SEP> 65 <SEP> 14 <SEP> 92 <SEP> 11
<tb> RV <SEP> 3005 <SEP> 1 <SEP> 27 <SEP> nd <SEP> nd <SEP> 2 <SEP> 13
<tb> Ru <SEP> 3007 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 120
<tb> RV <SEP> 3008 <SEP> 2 <SEP> 173 <SEP> 178
<tb> nd <SEP> : <SEP> non <SEP> déterminé
<tb>

Ces résultats montrent que le système lac-PTS est fonctionnel chez Lactobacillus sakei, et que l'utilisation du lactose chez RV332 s'effectue par l'intermédiaire de ce système. Il est à noter que RV332 présente une phase de latence relativement longue si elle est pré-cultivée sur milieu comprenant du glucose, tandis que le mutant constitutif RV3003 ne présente aucune phase de latence dans ces conditions.

D'autre part, l'opéron lac apparaît également être induit pendant la croissance sur galactose chez les souches inductibles par le lactose, ainsi que chez les souches Lac-du fait d'une inactivation de la voie du tagatose-6P. En revanche, il n'est pas inductible chez les souches pts. Comme il ne devrait pas y avoir de transport du galactose par l'activité résiduelle EIIB CLac chez RV3008, dont l'opéron lac est cependant induit par ce substrat, on peut supposer qu'il existe un système PTS séparé pour le galactose, qui produirait un inducteur gratuit de l'opéron lac, ou bien dont l'activité optimale dépendrait de l'activité accessoire de la voie tagatose-6P de l'opéron lac.

Il faut également noter que les souches pts RV3004 et RV3005 atteignent une DO finale sur galactose plus élevée que les autres souches. Plusieurs explications sont possibles : par exemple, il est possible que le gain de masse cellulaire totale par rapport au nombre de cellules soit plus rapide chez RV3004 et RV3005 que chez les autres souches, ou

bien que, du fait de l'absence d'un métabolisme du galactose par la voie des PTS la quantité de galactose disponible pour la production d'exopolysaccharides soit plus importante, ce qui entraînerait une DO finale plus élevée due à la présence de ces exopolysaccharides. Un effet régulateur du PTS sur le métabolisme du galactose est aussi envisageable.

EXEMPLE 3 : STABILITE DU PHENOTYPE LAC+
La stabilité du phénotype Lac+ en cultures prolongées a été étudiée sur les souches RV332 et RV3003.

Des bactéries de ces 2 souches issues de cultures de réserve congelées dans le glycérol sont striées sur MRS agar et incubées à 300C.

Les colonies isolées sont remises en culture dans du milieu MCD 0,05% Glucose/1% Lactose.

Des dilutions successives de ces cultures sont étalées sur des boites de milieu solide MRS agar, pour déterminer le nombre de bactéries à la génération 0.

100 III d'une dilution 10-3 de ces cultures sont inoculés dans 100 ml de milieu MRS et incubés pendant 24 heures ce qui correspond à une croissance pendant environ 20 générations.

A cette étape, 100 jul d'une dilution 10-3 de chacune de ces cultures sont prélevés, et inoculés dans 100 ml de milieu MRS pour continuer la croissance.

Parallèlement, le dénombrement des bactéries lac+ et celui des bactéries lac-sont effectués sur un autre prélèvement de chaque culture, selon le protocole suivant :
Des dilutions successives de chaque prélèvement sont étalées sur MRS agar pour isoler les colonies. Chacune des colonies isolées est inoculée dans l'un des puits d'une plaque de microtitration (96 puits/plaque) dans 100 ; J. l de milieu MCD, contenant 10 g/l de lactose, et 15 mg/1 de pourpre de bromocrésol (indicateur de pH). Les plaques sont incubées 24 heures à 300C ; dans ces conditions, les colonies lac+ poussent dans les puits des plaques de microtitration et le pourpre de bromocrésol vire au jaune. En revanche, les colonies lac-ne poussent pas et la coloration reste violette.

Des contrôles sont effectués par incubation de puits sans bactéries et par incubation de puits inoculés avec des bactéries de la génération 0 et des souches témoins Lac+ (RV332) et Lac- (mutants).

Ces opérations sont répétées toutes les 20 générations.

Ces résultats sont illustrés par la Figure 2
Les premières pertes détectables du phénotype Lac+ interviennent, dans le cas de la souche RV3003, après 60 générations, où entre 60 et 90% des colonies testées conservent leur phénotype Lac+ (Fig. 2 : 0 et V : 2 expérimentations séparées avec RV3003).

La perte est beaucoup moins prononcée dans le cas de RV332 (0), ou plus de 50% des colonies conservent le phénotype Lac+ au delà de 300 générations.

Les essais de stabilité du phénotype Lac+ de la souche RV332 ont été poursuivis pendant plus de 600 générations, pour suivre le processus complet de perte du phénotype Lac+ ; de manière surprenante, il a été constaté qu'au delà de 380 générations, le pourcentage de cellules Lac+ semble se stabiliser à un plateau d'environ 50%.

On peut estimer qu'à partir d'une bactérie, il faut 55 générations pour obtenir une culture de 10 m3 avec une densité de 1,8 x 109 cfu/ml ; 4 générations supplémentaires sont suffisantes pour atteindre une densité de 2,9 x 109 cfu/ml dans un volume de 100 m3.

La stabilité de RV3003 peut donc être suffisante pour certaines utilisations, notamment s'il est possible de diminuer le temps de culture en conditions non-sélectives pour le phénotype Lac+, par exemple par réalisation d'une préculture sur milieu contenant du lactose. Une préculture de 1 litre dans ces conditions permet déjà l'obtention des 41 premières générations.

Toutefois, pour les utilisations dans lesquelles on ne recherche pas l'expression constitutive de l'opéron lac, la souche RV332 est préférable, du fait de sa stabilité beaucoup plus importante pour le phénotype Lac+.

Une activité plus importante de transposition des séquences d'insertion flanquant l'opéron lac pourrait expliquer la perte plus rapide du phénotype Lac+ chez RV3003. En effet, la probabilité que la transcription à partir du promoteur en amont de lacA, franchisse l'opéron lac jusqu'à

la séquence iso-ISS30 en aval de lacX est plus importante dans la souche RV3003, où la transcription de l'opéron lac est constitutive, que dans celui de RV332, où la transcription de l'opéron lac est fortement réprimée dans les cultures sur glucose (activité spécifique de la P-ss-galactosidase en cultures sur glucose : 3 nmoles/min/mg pour RV332 ; 576 nmoles/min/mg pour RV3003).

La même explication peut s'appliquer dans la direction opposée ; la transcription interviendrait alors à partir du promoteur du gène 2ac. R, jusqu'à la séquence iso-ISS30 en amont de ce gène.

EXEMPLE 4 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU PLASMIDE PRV500
Le plasmide pRV500 a été purifié à partir de la souche RV332, par une méthode adaptée du protocole décrit par ANDERSON et Mc KAY [Applied and Environmental Microbiology, 46,549-552, (1983)], ou par séparation, à partir d'un lysat cellulaire brut obtenu par traitement au lysozyme, à l'aide d'un kit de purification QIAGEN plasmid MAXIPREP en suivant le protocole recommandé par le fabricant (QIAGEN, France).

Plusieurs sous-clones ont été obtenus chez Escherichia coli dans le vecteur de clonage PBLUESCRIPTO. Le séquencage de ces clones a permis d'établir la séquence complète de 12955 nucléotides de pRV500.

Cette séquence est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 11. Le plasmide pRV500 est schématisé sur la Figure 3.

13 cadres ouverts de lecture (ORFs), précédés par des sites potentiels de liaison aux ribosomes (RBS) ont été ldentifiés. La localisation de ces ORFs est représentée dans le Tableau VII ci-après.

Les séquences des protéines RepA et RepB codées par le plasmide RV500 sont représentées respectivement dans

la liste de séquences jointe en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. TABLEAU VII

<tb>
<tb> Gène <SEP> Position <SEP> Sens <SEP> Taille <SEP> Taille <SEP> Site <SEP> RBS <SEP> Remarques
<tb> (nt) <SEP> (aa) <SEP> propose
<tb> hsdR <SEP> 10170-376 <SEP> + <SEP> 3162 <SEP> 1053 <SEP> GGAAGG
<tb> ORF-2 <SEP> 9023-9982 <SEP> - <SEP> 960 <SEP> 319 <SEP> AGGAG <SEP> recourvement
<tb> /MS7902-902611Ï25374AGGAAG4nt
<tb> hsdS'7450-7905 <SEP> + <SEP> 456 <SEP> 151 <SEP> AGGAGA <SEP> recouvrement
<tb> hsdM <SEP> 5928-7460 <SEP> + <SEP> 1533 <SEP> 510 <SEP> AGAGGA <SEP> 11 <SEP> nt
<tb> repB <SEP> 5193-5762 <SEP> + <SEP> 570 <SEP> 189 <SEP> AGGA
<tb> repA <SEP> 4130-5065+ <SEP> 936 <SEP> 311 <SEP> AGGAGG
<tb> ORF-8 <SEP> 3218-3409 <SEP> + <SEP> 192 <SEP> 63 <SEP> AGGAG
<tb> ORF-9 <SEP> recouvrement <SEP> de
<tb> 2940/2973 <SEP> -201/23466/77GAGG
<tb> ORF-10 <SEP> 2256-2843 <SEP> + <SEP> 588 <SEP> 195 <SEP> GAGG <SEP> codons
<tb> ORF-1 <SEP> 1 <SEP> 1767-2117-351 <SEP> 116 <SEP> ATAAG <SEP> ? <SEP> recouvrement
<tb> ORF-12 <SEP> 1486-1770 <SEP> - <SEP> 285 <SEP> 94 <SEP> AGGAGG <SEP> 4 <SEP> nt
<tb> ORF-13 <SEP> 664-1452 <SEP> - <SEP> 789 <SEP> 262 <SEP> AGGAG
<tb>

Ces ORFs représentent au total 11139 nucléotides soit 86% de la taille du plasmide.

Bien que le GC% global de pRV500 (38,1%) soit compris dans les limites usuelles pour Lactobacillus sakei, il convient de noter que ce plasmide apparaît divisé en 2 régions : les séquences hsd. R à hsdM, avec un GC% de 38, 3% à 43,3% (région à GC élevé) et la région de repB à ORF-13 avec un GC% de 31, 3% à 38, 3% (région à GC faible) ; toutefois, ORF-10, localisé dans cette seconde région atteint un GC% de 38,3%, c'est à dire environ 2,2% au dessus du GC% d'ORF-12 (36,1%).

La majeure partie de la région à GC élevé code pour des protéines similaires aux systèmes de restriction/modification bactériens de type I. Elle possède également quelques caractéristiques inhabituelles au niveau de son organisation : le gène hsdM recouvre sur 3 codons l'ORF hsdS, qui code seulement une protéine HsdS partielle (HsdS'), et qui est joint à une séquence hsdS complète, qui est elle-même précédée par ORF-2, codant une protéine similaire à des intégrases/recombinases de type XerC.

L'orientation du gène hsdR est opposée à celle d'ORF-2, et dans la même direction qu'hsdM et hsdS'. Les protéines HsdM et HsdS'ont toutes deux environ 51%

d'identité avec des protéines de Klebsiella pneumoniae, tandis qu'HsdS possède 25% d'identité avec une protéine hypothétique de Methanococcus jannaschii et HsdR possède 39% d'identité avec une protéine hypothétique d'Haemophilus influenzae.

La région à GC faible peut être divisée en 2 sous-régions : l'une comprenant les fonctions de réplication du plasmide, et l'autre comprenant les ORFs 8 à 13.

Aucun homologue d'ORF-9 n'a été identifié dans les bases de données disponibles ; en revanche, ORF-8 et ORF-10 à ORF-13 présentent des pourcentages d'identité de respectivement 45%, 90%, 86%, 85% et 29% avec les protéines les plus proches des bases de données. Cependant, on ne connaît aucune fonction pour ces protéines.

La région de réplication contient des gènes codant des protéines de type RepA et RepB : respectivement 79% d'identité avec RepA et 31% d'identité avec RepB du

plasmide pUCL287 de Tetragenococcus halophilus, et 62% d'identité avec un ORF du plasmide pSRQ900 de Lactococcus lactis. Ces gènes sont précédés par 2 ensembles de séquences répétées directes concaténées (trois fois ACCTCTTTTA et quatre fois et demie TTTATCAAGTAGGTTTTGTCTG).

Le Tableau VIII ci-dessous récapitule les GC% des différentes ORFs, ainsi que leur % de similarité avec les protéines les plus proches.

TABLEAU VIII

<tb>
<tb> % <SEP> identité <SEP> Similaire <SEP> à <SEP> :
<tb> Gène <SEP> Fonction <SEP> Proposée <SEP> % <SEP> GC
<tb> (% <SEP> aa) <SEP> (protéine/organisme)
<tb> hsdR <SEP> 39 <SEP> F641114 <SEP> hsdR <SEP> 41,52
<tb> H. <SEP> influenzae
<tb> ORF-2 <SEP> 30 <SEP> BAA30945.1 <SEP> integrase/recombinase <SEP> 38,31
<tb> P. <SEP> horikoshii
<tb> H64514
<tb> hsdS <SEP> 25 <SEP> hsdS <SEP> 40,53
<tb> M. <SEP> jannaschfi
<tb> U93843
<tb> hsdS' <SEP> 51 <SEP> hsdS' <SEP> 38,38
<tb> K. <SEP> pneumoniae
<tb> U93843
<tb> hsdM <SEP> 51 <SEP> hsdM <SEP> 43,31
<tb> K. <SEP> pneumoniae
<tb> AF001314
<tb> repB <SEP> 62 <SEP> repB <SEP> 35,26
<tb> L. <SEP> lactis
<tb> X75607
<tb> repA <SEP> 79 <SEP> repA <SEP> 34,40
<tb> T. <SEP> halophilus
<tb> ORF-8 <SEP> 45 <SEP> AAD25913.1 <SEP> inconnue <SEP> 31,25
<tb> T. <SEP> halophilus
<tb> ORF-9 <SEP> 35, <SEP> 82
<tb> ORF-10 <SEP> 90 <SEP> CAA10964 <SEP> inconnue <SEP> 38, <SEP> 33
<tb> L. <SEP> helveticus
<tb> ORF-11 <SEP> 86 <SEP> 2065482 <SEP> inconnue <SEP> 35,31
<tb> L. <SEP> lactis
<tb> 2065483
<tb> ORF-12 <SEP> 36,14
<tb> L. <SEP> lactis
<tb> CAA20542
<tb> ORF-13 <SEP> inconnue <SEP> 31,56
<tb> S. <SEP> coelicolor
<tb>
EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE REPLICATIF STABLE CHEZ LACTOBACILLUS SAKEI, A PARTIR DU REPLICON DE PRV500
Afin de démontrer la fonctionnalité de la région comprenant les fonctions de réplication, un fragment KpnI-EcoRI fragment couvrant les séquences répétées, ainsi que les ORFs repA et repB, a été cloné aux sites correspondants de pRV300 [LELOUP et al., 1997, précité], le plasmide résultant est dénommé pRV566.

Les étapes du clonage sont illustrées par les Figures 4A et 4B.

Le plasmide pRV566 a été établi chez Escherichia coli TG1, puis transféré par électroporation chez la souche modèle Lactobacillus sakei 23K.

On n'observe aucune croissance sur les boites réalisées à partir de cultures contrôle de Lactobacillus sakei 23K traitées par le tampon d'électroporation sans ADN ; en revanche, sur les boîtes réalisées à partir des cultures de 23K/pRV566, on observe un nombre important de colonies,

indiquant que le plasmide recombinant pRV566 peut se répliquer chez Lactobacillus sakei.

23K/pRV566 est cultivée à 300C pendant 24 heures dans 100 ml MRS, sans sélection par antibiotiques. 100 fll

d'une dilution 10-3 sont ensuite transférés dans 100 ml de MRS frais et cultivés à nouveau pendant 24 heures. On considère que chaque transfert représente une croissance de 20 générations en 24 heures.

Parallèlement à chaque transfert, des aliquotes sont étalées à la fois sur boîtes de milieu MRS-agar et de milieur MRS-agar contenant 5 mg/1 d'érythromycine, afin de déterminer le pourcentage de bactéries restées résistantes à l'érythromycine.

La stabilité du plasmide pRV566 au cours des transferts successifs a été étudiée.

Les résultats sont illustrés par la Figure 5, qui représente le pourcentage de colonies résitantes à l'érythromycine en fonction du nombre de générations.

Ces résultats montrent que la perte de la résistance à l'érythromycine intervient lentement ; environ 80% des colonies conservent ce phénotype après 60 générations, et même après 100 générations, on obtient un score d'au moins 40%. Cette stabilité apparaît d'ores et déjà suffisante pour la plupart des études d'expression en conditions non-sélectives.

Ces expériences montrent que la région comprenant repA, repB, et les séquences répétées directes de pRV500 permet la réplication d'un plasmide chez Lactobacillus sakei.

En outre, le transfert de pRV566 entre Escherichia coli et Lactobacillus sakei montre qu'il est possible de construire des vecteurs navette pour ces 2 organismes avec les éléments de réplication de pRV500 et une origine de réplication de Escherichia coli.

D'autre part, la similitude des protéines de réplication RepA et RepB de pRV500 avec celles de plasmides d'autres bactéries permet de supposer que ce plasmide possède un spectre d'hôtes plus large, et en outre qu'il se réplique selon un mécanisme de type thêta, ce qui présente un intérêt

particulier dans la construction de vecteurs ; en effet il a été observé que les plasmides de ce type peuvent accepter des insert de tailles variées, ce qui permet de cloner non seulement des gènes isolés, mais également des ensembles de gènes, voire des opérons complets.

Claims

REVENDICATIONS 1) Souche de Lactobacillus sakei déposée auprès de la CNCM le 15 mars 2000 sous le numéro 1-2398.
2) Molécule d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir de la souche de Lactobacillus sakei CNCM 1-2398 et utilisable pour la transformation génétique de bactéries lactiques, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi :

- une molécule d'acide nucléique comprenant au moins un gène de l'amas lacRABCDFEGX de la souche RV332 (CNCM 1-2398) ; - une molécule d'acide nucléique comprenant au moins un fragment du plasmide, dénommé pRV500, de la souche CNCM 1-2398.
3) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases, choisi parmi le gène lacR, le gène lacA, le gène lack, le gène lacC, le gène lacD, le gène lacF, le gène lacE, et le gène lacG de la souche RV332.
4) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : - les molécules d'acide nucléique comprenant le système de réplication du plasmide pRV500 ; - les molécules d'acide nucléique comprenant au moins un gène du plasmide pRV500 choisi parmi hsdM, hsdS ou hsdR.
5) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 3 ou 4, pour la transformation génétique d'une bactérie lactique.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite bactérie lactique est un lactobacille.
7) Procédé de sélection d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransférases, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence, chez les souches de

<Desc/Clms Page number 30>

Lactobacillus sakei à tester, de gènes lacA, lack, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, présentant respectivement au moins 90% d'identité avec les gènes lacA, lack, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, de la souche CNCM 1-2398, et la sélection d'une souche comprenant l'ensemble desdits gènes.
8) Procédé d'obtention d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransférases, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de Lactobacillus sakei par au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi : - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacA de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacB de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacC de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacD de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacF de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacE de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacG de la souche CNCM 1-2398.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la transformation de ladite souche avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacR de la souche CNCM 1-2398, et/ou avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacX de la souche CNCM 1-2398.

<Desc/Clms Page number 31>
10) Plasmide, capable de se répliquer chez Lactobacillus sakei, choisi parmi : - le plasmide pRV500, de la souche CNCM 1-2398 ; - un plasmide comprenant au moins le système de réplication dudit plasmide pRV500.
11) Utilisation d'un plasmide selon la revendication 10 pour la transformation génétique d'une bactérie lactique.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite bactérie lactique est un lactobacille.
13) Souche de Lactobacillus sakei dérivée de la souche CNCM 1-2398, et choisie parmi : - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche CNCM 1-2398, par délétion des séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX ; - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche CNCM 1-2398, par délétion ou inactivation du gène lacR.