CN1085249C - 变体乳链菌肽的生产 - Google Patents

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Abstract

一种不含天然nisA基因、但能表达乳链菌肽的细胞，它含有一个变体nisA基因。其中的变体nisA基因和天然nisA基因，与一个基因簇的关系相同，该基因簇含有天然nisA基因以及关于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因。优选为细胞中不含天然的染色体nisA基因，而在所述天然nisA基因的染色体位置含有一个变体nisA基因。本发明描述了制备细胞的方法和生产乳链菌肽、特别是变体乳链菌肽的工艺。

Description

变体乳链菌肽的生产
本发明涉及改进的生产乳链菌肽，特别是蛋白质改造的乳链菌肽的方法和细菌菌株。
乳链菌肽是一种经高度修饰的肽类抗生素(抗菌肽)，例如，它可以由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的某些菌株产生。乳链菌肽在食品工业中具有很重要的意义，因为它对大量的革兰氏阳性菌，包括很多腐败菌和食物病原菌，如李斯特菌属(Listeria)、梭状芽胞杆菌(Clostridia)和芽胞杆菌属(Bacillus)的种具有效的抗微生物活性(见Fowler & Gasson(1990)的“食品保藏剂”(FoodPreservatives)(N.J.Russell & G.W.Goulds编)PP 135-152，Blackie and Sons出版，英国Glasgow)。
乳链菌肽的化学结构已完全确定(图1)，它是抗生素族中的一员，被称为羊毛硫抗生素。这些独特的多环肽的共同结构特征为脱氢残基和链内硫桥形成羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸环。非典型残基是通过前体肽一级序列中氨基酸丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸的翻译后修饰而引入的(羊毛硫抗生素是“乳链菌肽和新的羊毛硫抗生素”(Nisins and novel lantibiotics)(Jury，G.和Sahl，H.-S.编)中Jung(1991)最近所写综述的主题，PP1-34，ESCOM，荷兰Leiden)。因而乳链菌肽的生物合成既涉及乳链菌肽的无活性的前体(称作前乳链菌肽)的基因(nisA)，也涉及决定乳链菌肽成熟的修饰酶基因。成熟的乳链菌肽分子是基于34个氨基酸的一段序列。由nisA编码的蛋白质包括一段23个氨基酸的N末端的信号序列，它在乳链菌肽分泌时被切除。由nisA编码的前乳链菌肽转变为成熟的乳链菌肽涉及前导序列的切除和个别氨基酸的修饰。nisA基因已被克隆和表征，并显示出具有染色体位点(见Dodd等(1990)，“普通微生物学杂志”(J.Gen.Microbiol.)136，555-566)。很多涉及前乳链菌肽的酶学修饰、转运和免疫性的其他基因由产生乳链菌肽的菌株编码(Kuipers等(1993)“欧洲生物化学杂志”(Eur.J.Biochem.)216，281-291；Engelke等(1994)，“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)，60，814-825)。
可以使用已确立的蛋白质改造技术来引入对乳链菌肽氨基酸序列的变化。这涉及到修饰乳链菌肽结构基因nisA的编码区，如通过位点特异性诱变或随机诱变进行。这些变化的表达由于乳链菌肽的翻译后修饰而变得复杂。
变体乳链菌肽可通过在宿主菌株中表达变体nisA基因进行构建，其中的宿主菌株编码必要的成熟“工具”，因而可生产经过修饰的前体肽。一种方法是用编码一个变体nisA基因的重组质粒转化产生乳链菌肽的菌株。在这一基础上，可获得宿主成熟酶来加工固有的前乳链菌肽和其质粒编码的变体。对这种用于带有野生型乳链菌肽转座子的菌株的方法已有报道。(Kuipers等(1991)，“乳链菌肽和新的羊毛硫抗生素”(Nisins and novellantibiotics)(Jung，G & Sahl，H.-S.编)，PP250-259，ESCOM，荷兰Leiden)。然而这一系统的缺点是宿主的乳链菌肽和改造的变体一起合成，使在分析新肽的特性之前需经过复杂的化学分离步骤。这一过程对于工业上大规模地生产变体乳链菌肽来说特别是不理想的。
WO 93/20213描述了在缺乏天然的乳链菌肽情况下，从乳球菌生产变体乳链菌肽的方法，在这一方法中将位于质粒上的变体nisA基因(编码变体乳链菌肽)导入乳球菌菌株，该菌株不分泌其天然nisA乳链菌肽(因为nisA基因已被灭活)，但能表达用于乳链菌肽的修饰、免疫性和转运出细胞的基因。
WO 92/18633公开了由不产生天然nisA乳链菌肽的乳球菌菌株的nisZ基因(或其突变体)表达变体乳链菌肽的以质粒为基础的系统。
我们意外地发现，用一个变体nisA基因(或其一部分)替代nisA基因(或其至少一部分)天然的染色体拷贝，可以从乳球菌中产生意想不到高含量的乳链菌肽，尤其是变体乳链菌肽。因此，本发明提供了改进的用于高效生产变体乳链菌肽的方法和生物。
本发明的一个方面是提供构建一种细胞的方法，该细胞不含天然的nisA基因，但表达乳链菌肽，该方法包括下列步骤：提供带有变体nisA基因和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因的细胞，其中的变体nisA基因和天然nisA基因与基因簇的关系相同，该基因簇含有天然nisA基因和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因。
“提供含有变体nisA基因和乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因的细胞”，不仅包括将变体nisA基因插入已含有乳链菌肽的修饰、分泌和免疫性的基因的细胞，同时将变体nisA基因加上乳链菌肽的修饰、分泌和免疫性的基因插入细胞。
乳酸乳球菌中含编码前乳链菌肽A(被加工形成乳链菌肽A)和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因的基因簇(nis ABTCIPRK)，描述于Kuipers等(1993)“欧洲生物化学杂志”(Eur.J.Biochem.)216，281-291和Engelke等(1994)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol)，60，814-825中，将这些文献引入本文作为参考。
nisA基因是编码前乳链菌肽(前乳链菌肽包括23个氨基酸的N末端信号序列，它在分泌过程中被切除)；nisB和C被认为与修饰前乳链菌肽的反应有关，前乳链菌肽直接来自nisA基因的表达；nisT与转运ATP酶相似，它与乳链菌肽转运出细胞有关；nisP与完全成熟的前体乳链菌肽的胞外加工有关；nisR和K编码与基因表达有关的调节蛋白，而nisI涉及乳链菌肽的免疫性。nisABTCIPRK基因簇的核苷酸序列示于图7和图8。
在基因簇中变体nisA基因优选处于与天然nisA基因相同的位置。优选的细胞为乳球菌细胞，最优选的细胞为乳酸乳球菌细胞。合适的细胞，尤其是乳球菌细胞对熟练技术人员来说很容易获得。显然，要求它们是产乳链菌肽的细胞，优选为一种能产生、成熟和分泌乳链菌肽的细胞，但任何这样的细胞均能采用。例如，保藏于国立食用菌保藏中心(在英国Norwich NR47UA，Colney的Norwich研究园区，Norwich实验室，食品研究所)(以及描述于Gasson(1984)的“欧洲微生物学会联合会微生物学通报”(FEMSMicrobiol.Lett.)21，7-10)的产生天然的乳链菌肽的菌株NCFB894是适用于本发明方法的合适乳球菌细胞。
“天然nisA乳链菌肽”包括由一些产生天然乳链菌肽的菌株所产生的肽类抗生素。成熟分子基于nisA基因所编码的氨基酸序列。天然nisA乳链菌肽的化学结构示于图1。我们也将基于图1所示的nisA乳链菌肽，但又与之不同的其他天然的乳链菌肽包括在术语“天然nisA乳链菌肽”中。例如，我们将与图1所示nisA乳链菌肽有相似化学结构、仅在第27位由天冬酰胺替代组氨酸的乳链菌肽Z包括在内。我们发现，编码乳链菌肽Z的基因与图1所示的编码乳链菌肽A的nisA基因相比，只有一个核苷酸取代。
“与天然量相比，其天然nisA乳链菌肽的量增加”包括根据本发明的方法修饰的细胞，该细胞产生的天然nisA乳链菌肽的量比在相同培养条件下培养的未修饰细胞所产生的量多至少5％、优选至少10％、最优选多100％。
“变体乳链菌肽”包括天然nisA乳链菌肽的蛋白质改造的变体，其中氨基酸序列的改变是经过nisA基因的位点特异性诱变或随机诱变。为方便起见，将一个或多个错义突变引入蛋白质编码区而使一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代。或者，引入无义突变以产生截短的乳链菌肽。在这种情况下，乳链菌肽仍保持抗生素活性。还有一种可采用的方法是进行nisA基因的缺失和/或插入，只要所得的乳链菌肽仍然保持抗生素活性。
nisA基因的位点特异性突变可通过Zoller & Smith(1983)“酶学方法”(Meth.Enzymol.)，100，468-500)和Zoller & Smith(1984)DNA3，479-480中的寡核苷酸指导的诱变技术进行，这一技术用错配的寡核苷酸引物引入突变。可方便地采用提高突变体产量的方法，如Kunkel(1985)在“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82，488-492中所描述的dut-ung方法。或者可用聚合酶链反应(PCR)采用错配的寡核苷酸产生突变体(Saiki等(1988)“科学”(Science)239，487-491)。nisA基因的随机突变体可通过化学方法产生，例如用亚硫酸氢钠或羟基胺作为诱变剂。或者，用酶促错掺法利用保真性比较低的DNA聚合酶(如AMV逆转录酶或Taq DNA聚合酶)，或者利用在合成过程中掺入的寡核苷酸混合物，将随机突变引入nisA基因中，使在各位点掺入少量不同的碱基。这些方法为本领域所熟知。
“变体nisA基因”包括nisA基因的片段，其中所述的片段不同于天然nisA基因的相应部分。
“变体nisA基因”特别包括了一些基因，其中的天然nisA基因的启动子区被另一个(异源的)启动子所代替，优选为已知比天然nisA基因的启动子更强的启动子。合适的启动子的实例是可诱导的lacA启动子(Van Rooijen等(1992)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)179，2273-2280)和T7启动子(Wells等(1993)“分子微生物学”(Mol.Microbiol.)，5，1155-1162)，这两篇论文都引入本文作为参考。
术语“变体nisA基因”还包括一些基因，其中，天然nisA基因的核糖体结合区被修饰，优选以提高nisA编码区翻译起始的效率。
术语“变体nisA基因”还包括在编码区有沉默突变的基因，即其中的一个或多个密码子发生同义变化的基因，但天然nisA乳链菌肽由其编码。采用这种变体乳链菌肽编码区可提高翻译效率。“变体nisA基因”还包括了含有驱动变体编码区转录的一个异源启动子的基因，该异源启动子即一个非天然nisA基因启动子的启动子。
就一切情况而论，优选为启动子、核糖体结合位点和编码区的结合使编码区编码的乳链菌肽具有最佳表达。
优选的是与天然nisA乳链菌肽相比具有改善了性能的变体乳链菌肽，例如具更有效的抗微生物活性或者在加入食品中时具更有效的抗水解和抗降解特性的变体乳链菌肽。WO 93/20213和WO 92/18633(引入本文作为参考)以及用于说明本发明的实施例中描述了变体乳链菌肽。
本发明优选的实施方案提供了构建一种细胞的方法，该细胞a)不表达天然nisA乳链菌肽但能表达变体乳链菌肽或b)与天然量相比，表达天然nisA乳链菌肽的量增加，在上述任何一种情况下都能表达用于乳链菌肽修饰和免疫性的基因。该方法包括在所述天然nisA基因的染色体位置用一个变体nisA基因或其部分替代天然的染色体nisA基因或其部分的步骤。
在一个步骤中，通过基因替换可以在所述天然nisA基因的染色体位置由变体nisA基因或其部分替代天然染色体nisA基因或其部分。简便的方法是将含有变体nisA基因或其部分的质粒导入含有天然nisA基因(和优选用于乳链菌肽修饰、免疫性和将乳链菌肽转运出细胞的基因)的染色体拷贝的宿主细胞。双交换重组事件可造成天然nisA基因或其部分被变体nisA基因或其部分替代。所得的细胞将含有变体nisA基因的染色体拷贝，因此如果该变体nisA基因含有经过修饰的编码区，细胞就会产生变体乳链菌肽。
整个nisA基因替代是不需要的。相反较方便的是替换nisA基因的一部分，它编码变体乳链菌肽中的氨基酸变化或含有异源启动子。
nisA基因和乳链菌肽生物合成、成熟和分泌所必需的其他基因，天然地位于作为染色体一部分的转座子上。因此，染色体位置指乳链菌肽基因簇中(nisABTCIPRK)染色体DNA内的nisA基因的存在，而不是基因簇相对于染色体上其他基因标记的位置。
众所周知，在乳球菌属中同源重组的发生效率低且不可预测，并且，尽管上述直接的一步法是可行的，但用间接的两步法进行基因置换更优选，在该方法中可能筛选到如上所述的所需的重组体。
更优选的方法包括步骤(1)在所述天然nisA基因的染色体位置上，用可反选择的nisA基因或其部分替代天然的染色体nisA基因或其部分，和(2)在所述天然nisA基因的染色体位置，用变体nisA基因或其部分替代可反选择的nisA基因或其部分。
“可反选择的nisA基因”包括经修饰的nisA基因，该基因被修饰以致它可很容易地与天然nisA基因或变体nisA基因区分开。
为方便起见，可反选择的nisA基因为插入了抗生素抗性基因(如抗红霉素基因)的nisA基因，或者是编码区的部分或全部缺失的nisA基因。优选为可反选择的nisA基因不表达乳链菌肽，但这一点不是必需的。
整个nisA基因置换不是必需的，但将带有可反选择标记的nisA基因的一部分进行置换是较为方便的。
在这些实施例中，通过可反选择基因的对抗生素抗性和/或大小差异，将可反选择的nisA基因与天然或变体nisA基因区分开。
因此，测定优选方法中步骤1是否完成较为直截了当，因为所得细胞，例如，已获得抗生素抗性，或者如果可反选择nisA基因有缺失，细胞染色体DNA的特定片段会缺失或变小。
可采用熟知的分子技术方便地测定细胞染色体DNA特定片段是否缺失或变小，这些技术如Southern印迹、聚合酶链反应(PCR)分析或限制性片段长度多态性(RFLP)分析。
同样地，测定优选方法的步骤2是否完成也比较直接，因为所得的细胞，例如，已失去抗生素抗性或得到一个染色体DNA的片段。
方便地，在这一优选的实施方案中，有一个与步骤2相关的筛选。例如，如果步骤1的可反选择基因包含了全部或部分nisA编码区(△nisA)的缺失，优选在步骤2中选择变体nisA基因的正确替换。因此，在一个优选的方法中，在步骤2中采用含有△nisA基因(用步骤1构建)的乳酸乳球菌菌株。用一种热敏穿梭载体(在低温下允许复制，但高温下不能)，将变体nisA基因导入△nisA菌株的染色体。例如，用含有变体nisA基因和用于对抗生素具有抗性的基因的质粒转化△nisA菌株，在抗生素条件存在下在允许的温度培养细胞。然后将细胞转至存在有抗生素的非允许温度下，单交换事件的发生使质粒在质粒/染色体同源位点(即在△nisA和变体nisA基因的共同区)整合在染色体内。
接着将细胞转至允许温度下以使质粒复制。位于整合质粒旁侧的同源序列之间的重组导致其从染色质上被切除。第二次交换事件的发生产生源自整合质粒(即变体nisA基因)的序列或留在染色体上的起始序列(即可反选择的nisA基因)。如上所讨论的，可以区分开变体nisA基因和可反选择的nisA基因，并且选择含变体nisA基因的细胞。
细胞在不含抗生素条件下培养可消除质粒。
在这一优选的方法中，除了具体掺入的突变，整个nisA基因和旁侧序列可用相同序列进行有效替换。含有变体nisA基因的质粒DNA片段的大小受同源序列(在质粒和染色体两者上)的限制，在这些同源序列之间可发生重组而产生质粒整合及随后的基因替换。关于载体构建，优选在任何序列改变位点的旁侧有约1Kb的同源序列。例如，基因替换载体在nisA基因的一侧有约800碱基(bp)，另一侧有1200bp。大小减少将减低同源重组的发生率，因而会减少检测到所需基因替换的可能性。图10说明了在优选的方法中发生的重组事件。
本发明的方法结果得到这样一些细胞，它们从变体nisA基因的染色体拷贝产生变体乳链菌肽，或从变体nisA基因的染色体拷贝产生天然nisA乳链菌肽。如上所讨论的，最优选为变体乳链菌肽具有抗生素活性。因此，由于细胞产生乳链菌肽(天然的或变体)，细胞表现出Nis+表型。
我们已确定，这些产生乳链菌肽的细胞在其产生抗菌肽的水平下还必须对乳链菌肽是免疫的。因此，本方法的另一个优选实施方案还包括选择对含量至少为1000U/ml的乳链菌肽具免疫性的细胞的步骤。
尽管优选的是由本方法产生的细胞表达变体乳链菌肽，但本方法也包括构建一种细胞，该细胞能在强的异源启动子下大量表达天然nisA。
在一个不甚优选的实施方案中，基因簇含有一个变体nisA基因和用于乳链菌肽修饰和免疫性的基因，并且该基因簇携带在自动复制的DNA元件上。为简便起见，该自动复制的DNA元件是质粒。该质粒的宿主细胞是不表达天然nisA乳链菌肽的细胞。例如不含天然乳链菌肽基因或天然nisA基因失活的乳球菌细胞。
在质粒上克隆整个乳链菌肽基因簇涉及到大片段(～11Kb)DNA的整合。这种方法的优点是可以使拷贝数改变，因而使基因含量也改变，还有利于将乳链菌肽决定簇转至各种其他宿主中。有两类优选的复制子(它们采用不同的复制模式)可作为合适的载体，滚环质粒(如pTG262，Dodd等(1990)“普通微生物学杂志”(J.Gen.Microbiol.)136，555-566)或θ型质粒(如多拷贝数的pIL 253和低拷贝数的pIL 277，Simon & Chopin(1988)“生物化学”(Biochimie)70，559-566)。两篇论文引入本文作为参考。当本发明的方法采用乳球菌细胞时，优选为该质粒是穿梭质粒，即这一质粒能够在乳球菌细胞中复制，并且也能在另一个宿主细胞如大肠杆菌中复制。
已设计出各种方法来通过互补粘性末端可操作地将DNA连接至载体上。例如，可将互补均聚物片段加至将要插入载体DNA的DNA片段上。然后载体和DNA片段在互补均聚物尾部之间通过氢键结合而形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供了另一种把DNA片段连接到载体上的方法。如前所述，把由内切核酸酶限制性消化所产生的DNA片段用噬菌体T 4 DNA聚合酶或大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I处理，这些酶以3′-5′核酸外切活性去除突出的3′单链末端，并且以其聚合活性补平凹入的3′端。
因此这些活性联合产生平端DNA片段。平端片段随后与过量摩尔数的接头分子一起保温，在有能够催化平端DNA分子连接的酶，如在有噬菌体T4 DNA连接酶存在下进行。因此，反应的产物为在其末端带有聚合物接头序列的DNA片段。然后用适当的限制酶切这些DNA片段，并连接到一个表达载体上，该载体经过一种酶的酶切，该酶能产生与那些DNA片段相匹配的末端。
含有各种限制性内切酶位点的合成接头可从很多来源购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，U.S.A)。
一种合乎要求的修饰编码本发明多肽的DNA的方法是运用Saiki等(1988)“科学”(Science)239，487-491中公开的聚合酶链反应方法。
在这一方法中，将要用酶促扩增的DNA两侧为两个特异的寡核苷酸引物，这两个引物本身也掺入扩增的DNA中。所述的特异性引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，用本领域已知的方法可将这些位点用于克隆入表达载体中。
本发明的第二方面是提供了一种不含天然nisA基因、但能表达含变体nisA基因的乳链菌肽的细胞，其中的变体nisA基因与天然nisA基因与基因簇有相同的关系，该基因簇包含天然nisA基因和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因。
本发明第二方面中的细胞可采用本发明第一方面中所述的方法得到。
在最优选的实施方案中，不存在天然的染色体nisA基因或其部分，细胞在所述天然nisA基因的染色体位置含有一个变体nisA基因或其部分。
优选的细胞为乳球菌，最优选的为乳酸乳球菌。
虽然表达增加量的天然nisA乳链菌肽的细胞也构成了本发明的一部分，但优选的是，细胞表达变体乳链菌肽。
为方便起见，变体nisA基因含有转录或翻译控制序列，这使得细胞能够表达变体乳链菌肽，或者在表达天然nisA乳链菌肽时，能使细胞表达量增加。因此，在一个实施方案中，细胞包含由异源启动子组成的变体nisA基因，该启动子能驱动乳链菌肽编码区(它可表达天然nisA乳链菌肽或变体乳链菌肽)的表达。
在一个不甚优选的实施方案中，细胞含有一个自动复制的DNA元件，它带有一个变体nisA基因以及乳链菌肽修饰和免疫性的基因。在这种情况下，细胞不含有活性染色体nisA基因，优选不含有染色体乳链菌肽基因。
本发明第三方面提供了一种生产乳链菌肽的方法，包括按本发明第三方面中的所述培养细胞，以及获得由此产生的乳链菌肽。
为方便起见，乳链菌肽是变体乳链菌肽。
优选的细胞为最优选实施方案中的细胞。
我们发现在本方法中采用最优选实施方案的细胞，可产生意想不到高产量的乳链菌肽，特别是与已知的依赖于质粒上的nisA基因来表达乳链菌肽(缺少位于质粒上的乳链菌肽免疫性、修饰和分泌的基因)的方法相比较时。这一出人意料效果的细节见实施例。然而，在这一方面值得注意的是，在其中5位的脱氢丙氨酸被丙氨酸代替和33位的脱氢丙氨酸被丙氨酸代替(即乳链菌肽A/Dha 5A，Dha 33A)的乳链菌肽变体的情况下，本发明的其中天然nisA基因被变体nisA基因取代的细胞比现有技术中的细胞产生的乳链菌肽多100倍以上，在现有技术的细胞中，同样的变体乳链菌肽(乳链菌肽A/Dha5A，Dha 33A)是由质粒编码的。此外，与现有技术的、具有位于质粒上的变体乳链菌肽基因的细胞相比，所有经检测的、来源于本发明的细胞的变体乳链肽产量要高一些。
采用最优选实施方案来生产乳链菌肽获得了相对于现有技术的方法和细胞的进一步的优点。例如，由于细胞不含质粒，所以在培养过程中就不需要抗生素筛选，并且在培养过程中质粒的丢失不会成为一个问题。
因此，对稳定性来说，有利之处在于变体乳链菌肽基因整合在细菌染色体之内，尽管它是乳链菌肽转座子Tn 5301的一部分。后者极其稳定，实际上我们发现很难故意将其消除掉。在实验室中，筛选一个质粒标记使之不成为一个实际的问题，但对工业上应用来说，这将是一个缺点。在发酵中加入抗生素可能是不理想的。
在一个不甚优选的实施方案中，带有变体nisA基因及用于乳链菌肽修饰和免疫性的基因的细胞携带于一个自动复制的DNA元件，如质粒上。很明显，在该实施方案中，在细胞培养过程中需要进行质粒筛选。
在本发明第三方面的一个特别优选的实施方案中，在有nisA乳链菌肽或能诱导乳链菌肽表达的变体乳链菌肽存在下，培养细胞。其中Ile30被Trp(I30W)取代的乳链菌肽A是变体的一个例子，由于该突变，变体作为其自身生物合成的诱导剂不能很好发挥作用。通过在发酵中向生长培养基中加入低于抑制浓度的乳链菌肽，就能产生较高量的变体乳链菌肽。在生长培养基中加入乳链菌肽(即纯化过程中的乳链菌肽诱导步骤)对作为诱导剂的效率较低的任何变体有好处。诱导量取决于任何特定变体(诱导结果产生的I30W乳链菌肽A产量超过两倍)的起始诱导量。诱导可能通常被包括在该方法中，以此作为使产量达到最大的一种手段。任何对野生型分子污染的考虑是极小的，因为需要的诱导的乳链菌肽浓度与纯化的乳链菌肽变体的量相比是可忽略的。方便起见，nisA乳链菌肽的量是对乳链菌肽生产提供最大诱导的最小量。这一量可由本领域熟练技术人员凭经验确定。在本实施方案中用于诱导的nisA乳链菌肽的合适浓度为1nM-500nM，优选为10nM-250nM，更优选为50nM-150nM，最优选为100nM。
任何纯化中的反相高效液相色谱(HPLC)步骤可确保把任何残余的nisA乳链菌肽从变体乳链菌肽中分离出来。
本发明的第四方面提供了由本发明的方法所生产的乳链菌肽。
不饱和氨基酸在羊毛硫抗生素(包括乳链菌肽)中的存在，以及它们在这些复杂分子的生物特性中所起的作用，引起了人们对结构/功能分析的特别的兴趣。在枯草杆菌(一种羊毛硫醇)对细菌孢子生长的抗微生物活性中，据推测，表征脱氢氨基酸的活性不饱和键起着功能性作用。由于它们可能是分子不稳定的原因，这些残基还引起了人们注意。很久以前人们就知道天然nisA乳链菌肽的商品样本在贮藏过程中的抗微生物活性会下降，并且在这些样品中发现了很多化学组分(Berridge等1952和Chan等1989)证明了在成熟分子的脱氢丙氨酸残基中出现特异性的切割。Dha5位置的切割导致乳链菌肽的第一个羊毛硫氨酸环的打开，并且伴随有抗微生物活性的消失。相反，由于Dha33位置切割而产生的降解产物基本保留了野生型的活性(Chan等，1989)。
在WO 93/20213中，我们描述了表达乳链菌肽A/Dha 5A、乳链菌肽A/Dha 33A和乳链菌肽A/Dha 5A、Dha33A的乳酸乳球菌衍生物的构建。我们在该项工作中还证明了这些改造的乳链菌肽对敏感的指示菌株保留着抗微生物活性。显然，如实施例中的详细描述，可采用本发明的方法更有效地生产这些乳链菌肽。但本发明的方法也可以用于生产任何其他的变体乳链菌肽，这些变体乳链菌肽有其他的改良特性，只要它们是由变体nisA基因所编码的就行。
本发明第五方面是将按本发明方法所生产的乳链菌肽用作抗微生物剂。乳链菌肽能够抑制酸败细菌和食品病原菌使得在某些食品特别是乳制品，如软干酪中广泛将其用作天然保藏剂。变体乳链菌肽也用在这一方面。
下面将参考附图和实施例更详细描述本发明，其中：
图1示出天然乳链菌肽A的分子结构，以箭头表示由蛋白质改造所产生的序列上的变化。
图2为本发明中构建和采用的一些重组质粒的示意图。
图3为可反选择的nisA基因的示意图，其中将红霉素抗性基因插入nisA基因或进行移码缺失(nisA-fs)。所示的序列为序列表中的序列12-17。
图4示出天然nisA基因和表达信号的至少一部分核苷酸序列，示出由PCR介导的位点特异性诱变所引入的变化。将nisA两侧的BamHI和BglII位点改造入pFI 740质粒(图2d)。序列上示出变体nisA基因(表1)中Ser5和Ser33密码子替代丙氨酸密码子。所示序列为序列表中的序列18和序列19。
图5示出用引物P39和P40产生的PCR片段的琼脂糖凝胶电泳。在基因置换步骤后对集落进行PCR反应，其中泳道3为FI5876；泳道4，FI7990；泳道5-10，FI7990(pG宿主6衍生物)。分子量标准：泳道1和12，为BglI消化的λDNA；泳道2和11，HindIII消化的λDNA。
图6示出平板扩散生物测定。在接种有瑞士乳芽孢杆菌(Lactobacillushelveticus)CH-1菌株指示菌的MRS琼脂上所打的孔中加入来自下列菌株的无细胞提取液样品150μl，所述菌株为：4，FI5876；5，FI7990；6，FI8070；7，FI8198；8，FI8199。平板在42℃培养过夜。测定平板上的标准为：1,50U/ml；2,100U/ml；3,200U/ml；9,300U/ml；10,400U/ml。
图7示出乳酸乳球菌NIZO R5的Tn5276的nisA，nisB，nisT，nisC和nisI基因序列，其来自Kuipers等(1993)“欧洲生物化学杂志”(Eur.J.Biochem.)216，281-291。指示出推断的核糖体结合位点(RBS)和反向重复序列(→)，也指示出nisA基因的转录起始位点和其前面的规范序列。所用的限制位点的位置如下：AccI，6383-6388；BclI，2914-2919；EcoRI，3461-3466；EcoRV，1805-1810；HaeIII，6509-6512；NcoI，6218-6223；NdeI，4518-4523；PstI，7418-7423；SstI，283-288，1547-1552和2463-2468。
图8示出一段克隆的5.0kb的核苷酸序列，它位于nisC下游区，开放读码框为nisI，nisP，nisR和nisK，该序列来自Engelke等(1994)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol)60，814-825。在可能的核糖体结合位点(RBS)、限制位点和反向重复序列划线。单字母密码表示开放读码框。箭头表示推断的NisI和NisP的信号肽切割位点；NisP的推断的膜锚定序列加了下划线。保守的、功能性的和活性位点的氨基酸用黑体字表示并标上了星号。
图9示出一个基因置换载体。组成nisA盒和旁侧序列的克隆片段的大小以碱基对表示。
图10为基因置换流程的示意图。
图11示出nisA基因的双链核苷酸序列和前乳链菌肽的氨基酸序列。在DNA序列上方表示了-35和-10区、转录起始位点以及nisA基因盒(见图2)中所用的限制性酶切位点。在序列的上、下方表示了用于扩增盒片段的引物(5′端)和PCR-介导的诱变的位置，水平方向的黑箭头表示DNA合成的方向。由于诱变产生的特定氨基酸替代示于前乳链菌肽序列下方。
图12表示nis基因的组成。
实施例1：天然的染色体nisA基因被变体nisA基因替代的乳球菌细胞的构建
方法
采用微生物技术和菌株。用于本研究的菌株和其来源列于表1。
                          表1本研究所用的乳球菌菌株
  菌株   nisA突变 活性   免疫性(U/ml×103)     参考文献
  MG1614   - -   0.01     Gasson(1983)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)，154，1-9。
  FI5876   野生型 +   ＞1     Dodd等(1990)“普通微生物学杂志”(J.Gen.Microbiol.)136，555-566；Horn等(1991)“分子和普通遗传学”(Mol.Gen.Genet.)228，129-135.
  FI7847   nisA-(fs) -   0.5-0.75     本研究
  FI7990   △nisA -   0.25-0.5     本研究
  FI8070   nisA/S5A +   ＞1     本研究
  FI8198   nisA/S33A +   ＞1     本研究
  FI8199   nisA/S5A，S33A +   ＞1     本研究
  FI7893   nisA +   ＞1     本研究
  FI8003   nisA -   0.25-0.5     本研究
除非另有说明，培养物生长在30℃补充了0.5％(重量/体积)(Wt/Vol)葡萄糖的M17培养基中(GM17培养基)(Terzaghi和Sandine(1975)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)29，807-813)(GM17培养基)。用下列量筛选抗生素耐药菌株：红霉素，(Er m)5μg/ml；链霉素，(Smr)200μg/ml。
大肠杆菌(Escherichia coli)MC1022(Casadaban & Cohen(1980)“分子生物学杂志”(J.Mol.Biol.)138，179-207)是用于重组质粒构建和分子分析的宿主菌株，这些重组质粒来自载体pMTL23p(Chambers等(1988)“基因”(Gene)68，139-149)，pGEM-3Z(Promega)、pCRTMII(Invitrogen)和pG+host6(Appligene)。本研究过程中所用的和构建的重组质粒示于图2。大肠杆菌培养物在37℃的L肉汤(Lennox(1955)“病毒学”(Virology)9，190-206)中繁殖。氨苄青霉素抗性(Apr)的筛选在100μg/ml的浓度下进行，氯霉素抗性(Cmr)在15μg/ml下进行，红霉素抗性(Emr)在400μg/ml下进行。
乳球菌菌株中的乳链菌肽活性同时用延迟法和直接法进行测定。如前述(Dodd等(1992)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)58，3683-3693)进行平板扩散生物测定。通过把在GM17平板表面生长的菌落在氯仿上倒置12分钟，并覆以接种了乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌MG1614菌株的琼脂，对所述菌落直接测定。把平板培养过夜，并将菌落周围的区域大小与对照物的大小相比。通过在一系列含有逐渐增加浓度的乳链菌肽的GM17琼脂平板上对培养物划线，并评价在不同乳链菌肽含量下的生长状况，来测定乳链菌肽的免疫性。在各平板上都含有对照培养物(FI5876，阳性)和MG1614(阴性)。
分子技术
总DNA、质粒DNA按Dodd等(1990)“普通微生物学杂志”(J.Gen.Microbiol.)136，555-566和Horn等(1991)“分子和普通遗传学”(Mol.Gen.Genet.)228，129-135的方法进行操作。按照提供者推荐的方法来使用不同来源的限制性酶和其他DNA修饰酶。通过如前(Dodd等(1992)，同上)所述转化大肠杆菌，或按照Holo和Nes(1989)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)55，3119-2123的乳酸乳球菌电穿孔法和Dodd等(1992)(同上)的改进方法(同上)来回收重组质粒。进行聚合酶链反应(PCR)的条件如Horn等(1991)“分子和普通遗传学”(Mol.Gen.Genet.)228，129-135中所述。引物在Applied Biosystems DNA合成仪(381A型)上合成，并列于表2。用于基因置换载体构建的片段用Dynozyme(Flowgen)进行扩增，并在核苷酸序列验证前克隆至pCRTMII中。将Ampli Taq-DNA聚合酶(Perkin Elmer)用于重组克隆的常规PCR筛选。用生产厂家的Taq“Dyedeoxy”终止子循环测序盒，在Applied Biosystems DNA测序仪(373A型)上进行纯化的PCR-产生的模板的核苷酸序列的直接测定。
                表2用于本研究的引物：
P13(序列  No 1)5′-AACGGATCCGATTAAATTCTGAAGTTTG-3′
                          BamHI
P17(序列  No 2)5′-TCAGAGCTCCTGTTTTACAACCGGGTGTACATA
GTGCAAT-3′
P18(序列  No 3)5′-TAGTATTCACGTAGCTAAATAACC-3′
P19(序列  No 4)5′-TTGGTTATTTAGCTACGTGAATAC-3′
P25(序列  No 6)5′-AATCGGATCCGTTTATTATGCTCGC-3′
                          BamHI
P26(序列  No 6)5′-ATAGTTGACGAATATTTAATAATTTT-3′
                          HincII
P27(序列) No 7)5′-CTTGGTCGACACCATATTTT-3′
                           SalI
P28(序列  No 8)5′-GTTAGATCTGACATGGATAC-3′
                          BglII
P32 (序列  No 9)5′-CCATGTCAGATCTAACAAAATAC-3′
                               BglII
P39(序列  No 10)5′-GACTTTCCATTATGCTTGGATTTTT-3′
P40(序列  No 11)5′-GCTCCTATGCCAAATGTAGAATC-3′
nisA基因置换型载体的构建。
用热敏穿梭载体pG+host6进行基因置换。同源质粒DNA源自pFI172(Dodd等(1990)，同上)，该载体含有包括nisA基因的FI5876染色体(图2a)的一段2.1kb区。整个片段亚克隆至pG+host6中生成nisA基因置换型载体pFI690(图2b)。导致nisA基因失活或诱变(见以下)的对这一区域的随后操作在载体pGEM-3Z或pMTL23P上进行。构建各基因置换型载体的最后步骤是将经修饰的2.1kb片段克隆入pG+host6中。pG+host6的衍生物在大肠杆菌中构建，来自该宿主的质粒DNA用于转化乳酸乳球菌FI7990(表1)。
nisA移码突变-nisA-(fs)：通过将一个Emr基因克隆入内部SacI位点的nisA基因插入灭活，对此已描述于前(Dodd等(1992)同上)。在这一质粒中，Emr基因旁侧为一个短的多克隆位点(图3)。用限制性酶SamI消化，然后连接以重新环化载体序列，就产生Emr基因的缺失。多克隆位点的残留序列在SacI位点内留下一个20bp插入片段，并且引起nisA基因密码子16中发生移码突变。由这一突变基因(称为nisA-(fs))编码的头38个氨基酸未受影响。但预计的翻译产物是一个截短的前乳链菌肽(45个残基)，其中包括乳链菌肽上COOH-末端的氨基酸序列RYPGTEL(图3)。nisA-(fs)突变被亚克隆入pG+host6中以产生基因置换型载体pFI674(图2c)。
nisA缺失-△nisA：nisA基因的失活也是通过编码区缺失而获得。为使缺失正好局限于nisA，有必要在基因的任何一侧构建另外的限制酶位点。设计引物以用于染色体上这一区域的PCR扩增，由于在每种情况下改变了2bp(图3)，在nisA起始位点上游80bp处引入了BamHI位点(P13，表2)，而在终止密码子之外25bp处引入了BglII位点(P32，表2)。旁侧片段(示于图2d)也用PCR扩增获得。引物P26和P25用于扩增上游211bp的HincII/BamHI片段，引物P28和P27用于下游1.1kb BglII/SalI片段的扩增(表2)。用于这些PCR反应的模板为pFI172 DNA。所得的质粒(pFI740)含一个完整nisA基因，其旁侧为构建的BamHI和BglII位点，所有这些包含在与染色体同源的2.1kb的序列内(图2d)。用这两种酶消化pFI740，然后连接它们相匹配的末端，产生质粒pFI751，其中的nisA基因缺失，称为△nisA(图2e)。这一部分质粒中的PCR扩增，以及跨越扩增片段中缺失的区域的核苷酸序列分析证明了BamHI和BglII位点发生了融合。
NisA位点特异性突变：质粒pFI877的构建(图2f)使得可以采用盒式诱变方法以将位点特异性突变导入nisA基因。这一pGEM-3Z衍生物含有与pFI690(图2b)中相应的序列，但包括了pFI740(图2d)中nisA下游的改造的BglII位点。在pFI877中，编码nisA的氨基末端区和上游表达信号的一段HincII/SacI片段，取代了含有改造的BamHI位点的pFI740的PCR产生的片段。因此，pFI877中的序列和相应的染色体野生型序列的唯一差别是nisA基因下游另外一个BglII位点的存在。该nisA盒的构建使位点特异性突变能容易地掺入基因中。将PCR介导的诱变用于扩增HincII/SacI或SacI/BglII片段，所述片段分别含nisA基因的氨基或羧基末端区(图2f)。然后用含有一个特异性突变的这些片段替代pFI877的野生型片段。突变掺入用于扩增盒片段的每一引物，或者，如果所需的突变位点在内部，则采用剪接重叠延伸技术(Ho等(1989)“基因”(Gene)77，51-59)，将特异性突变掺入跨越突变位点的两个互补引物中(Dodd等(1992)，同上)。
基因置换流程
在28℃下构建含pG+host6衍生物的乳酸乳球菌FI7990转化体，并在此温度下于含5μg/ml Em的GM17培养基(GM17-Em)中培养过夜。用约105细胞接种100ml新鲜预热的GM17-Em，将培养物在28℃下培养4小时。在升温至37℃下继续培养过夜。这一温度不会使pG+host6复制(Biswas等(1993)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)175，3628-3635)，生长培养基中Em的存在保证了对细胞系的筛选，这些细胞系中的单交换使衍生物在质粒/染色体同源位点(Leenhouts等(1989)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)55，394-400；Leenhouts等(1990)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)56，2726-2735；Chopin等(1989)“应用环境微生物学”(Appl.Environ.Microbiol.)55，1769-1774)上整合至染色体中。将过夜培养物的约105细胞接种预热的GM17(不含Em)，并在28℃培养过夜。在这一温度下质粒的复制是可能的，整合的质粒旁侧同源序列之间的重组导致其从染色体上被切除。根据第二个互换发生的位置不同，在染色体中将保留来源于整合质粒的序列，或原来的序列。同源DNA的长度示于图9。这些序列以AccI/SalI片段出现，构成了克隆至质粒pFI172中和在此质粒中测序的SalI片段的部分(Dodd等(1990)“普通微生物学杂志”(J.Gen.Microbiol.)136，555-566)。
稀释培养物并涂布于GM17琼脂平板上以获得单菌落。为从细胞清除质粒，将平板培养于37℃下。通过在含Em的GM17平板上贴上小片(5μg/ml)，筛选缺失pG+host6衍生物的菌落(约50)。当运用这一技术破坏nisA基因时，同时筛选失去乳链菌肽活性的菌株，并且用PCR分析染色体相关区来证实分子水平的任何变化。
基因置换流程图示说明于图10。
结果
染色体编码的FI5876 nisA基因的失活
为鉴定已获得变体nisA基因的细胞系，较为方便的是通过灭活固有的nisA基因先构建一个Nis宿主菌株。选择已充分表征的产生乳链菌肽的菌株乳酸乳球菌FI5876用于这一目的(Dodd等(1990)同上；Horn等(1991)同上)。从这一菌株中所得的乳链菌肽生物合成基因已被克隆和测序(Dodd等(1992)同上)。
采用基因置换，用质粒pFI674编码的nisA-(fs)基因替代FI5876的野生型nisA基因(图2c，图3)。在筛选的50个菌落中，5个同时为Ems和Nis-，这表明在这些FI5876衍生物中，已发生了基因置换。而且，这一结果表明经过修饰的nisA基因有缺陷，它不能表达能成熟成活性形式的前体分子。对称为FI7847的Nis-菌株之一进行进一步分析。为检测这一系统，证明了，通过相应的实验，用nisA基因置换型载体pFI690(图2b)，FI7874中的nisA-(fs)突变可回复至野生型。所得的基因置换菌株FI7898产生乳链菌肽的恢复，表明了FI7847表现出的Nis-表型完全是由于nisA基因的破坏所致。其他的乳链菌肽生物合成决定因素似乎未受nisA基因的改变所影响。
另一个方法是通过使FI5876中整个染色体nisA基因缺失产生Nis-宿主。为此目的而构建质粒pFI751(图2e)，并用基因置换掺入约300bp缺失的△nisA(图4)以替代nisA。Nis-菌株的恢复的频率与所发现的nisA-(fs)基因置换的频率大致相同。在此情况下，含△nisA的菌株可用PCR分析很方便地与亲代菌株区别开。在基因置换菌株(图5，泳道4)中引物P39和P40(表2，图2a)扩增一个1.8kb片段，而在编码野生型nisA(图5，泳道3)的FI5876的相应区中产生2.1kb片段。在称为FI7990的Nis-菌株中，对由PCR产生的1.8kb片段的核苷酸序列分析证实了△nisA掺入了染色体中正确的区段。再次测试该系统，结果表明通过用pFI690(图2b)基因置换，可在FI7990衍生的菌株中恢复乳链菌肽的产生。这些Nis+菌落的PCR分析证明了△nisA突变(1.8kb片段)已被野生型nisA基因(2.1kb片段)所置换。由于这一系统的优点是能够根据PCR分析很容易地鉴定基因置换(见图5)，因此用FI7990作为宿主菌株进行了进一步的表征和突变的构建。
对乳链菌肽的免疫性
nisA基因的破坏对宿主菌株对乳链菌肽免疫性的影响在先已有描述(Dodd等(1992)同上)。如人们所预料的，FI7847[nisA-(fs)]和FI7990(△nisA)都显示出对乳链菌肽免疫性的降低(表1)。缺失了nisA的FI7990菌株对250-500U/ml之间浓度的乳链菌肽敏感，而其亲代菌株FI5876在有浓度超过100U/ml的乳链菌肽存在下继续生长。有趣的是，编码一个截短的nisA基因的FI7847，表现出中等水平的对乳链菌肽的免疫性(上限为500-750U/ml，继续增高至1000U/ml则生长不良，表1)。
关于这两个Nis-菌株对乳链菌肽敏感性的差异，一种可能的解释来自与pFI740载体(图2d)相关的基因置换研究。由完整质粒pFI740编码的nisA替代缺陷的nisA基因所产生的FI8003菌株具有Nis-表型。这一结果与相应的涉及pFI690(图2b)的基因置换实验的结果形成对照，后一实验中，Nis+表型得到恢复(见上文)。相关的两个序列之间的唯一差别在于：pFI740有一另外的在nisA的ATG起始密码子上游80bp处掺入的BamHI位点，和一个紧靠编码区下游的BglII位点(图4)。这些序列研究表明：BamHI位点与Kuipers等(1993)“欧洲生物化学杂志”(Eur.J.Biochem.)216，281-291中鉴定的启动子的推断-35区相重叠。由改造BamHI位点所导入的单个碱基对变化具有将-35序列从CTGATT转成CCGATT(图4)的作用。
这些结果表明，在pFI740中天然的nisA启动子已被破坏，因此，通过基因置换掺入BamHI位点的那些菌株，如FI8003，也会获得有缺陷的启动子。尽管有一个完整的nisA基因，这些菌株具有的增加的乳链菌肽敏感性(约是野生型的50％)，表明这些具有潜在启动子活性的序列在对乳链菌肽的免疫性中发挥着作用。
优选的方案是用对乳链菌肽的免疫性作为直接筛选经过基因置换的Nis+菌株的手段，并且依赖于事实，即FI7990中nisA启动子失活会导致足够高的对乳链菌肽的敏感性，而使亲代菌株在选择性平板上不生长。保留上游启动子序列(如FI7847)的Nis-菌株不适合于这一步骤，因为在最适于筛选Nis+恢复的乳链菌肽量下，即500U/ml(表1)下，这些菌株生长良好。
变体nisA编码菌株的基因置换鉴定
根据构建中进行的初步基因置换实验和Nis-菌株FI7847和FI7990的试验，了解到以染色体序列替代pG+host6衍生物所带的相应同源区的发生频率低。可以料想的是，在这些宿主中，通过基因置换，随后发生的一个完整nisA基因的恢复将导致乳链菌肽活性的恢复。于是，种群内的任何Nis+菌株将会比原来Nis-亲代具有选择优势。然而最初的使活性nisA基因恢复的努力又会使大多数筛选的菌落保留着有缺陷的亲代nisA序列。
Nis+表型的恢复需要一个功能性乳链菌肽免疫机制，并且这需要nisA基因的表达。有人对用于构建FI7847和FI7990的基因置换方法进行了修改，以利于对衍生物的鉴定，这些衍生物已获得nisA或变体nisA基因，从而能产生乳链菌肽。Nis+菌落的回收关键在于：我们认为这些细胞一定有必要还对在其产生该抗微生物肽的水平下对乳链菌肽有免疫作用。在修改后的基因置换流程中，最后步骤包括向GM17琼脂平板加入500U/ml的量的乳链菌肽。筛选生长在这一培养基上的对乳链菌肽免疫的菌落的Emr，并测定其乳链菌肽的生成。还应用PCR分析来测定基因组序列的组成。图5示出由经过基因置换过程的6个菌落通过PCR(用引物P39和P40，图2a)所产生的片段。如PCR片段的大小增加300bp所证实的，发现所有的菌落已获得nisA基因(此处为nisA/S5A)的一个功能性拷贝。发现该过程是鉴定FI7990的Nis+衍生物非常可靠的方法，因为这一宿主菌株本身对用于筛选平板中的乳链菌肽含量敏感。发现按这一方法筛选的大多数菌落(约90％)已经过基因置换，并且会表达一个功能性nisA基因或变体，以替代染色体上缺失的△nisA。这一方法已成功地被用于筛选几种FI7990衍生物，这些衍生物现在专门表达改造的乳链菌肽以替代乳链菌肽A。
如上所述，本方案涉及到将热敏质粒pG+host6整合入染色体，然后进行切除。假定突变任何一边的同源序列之间的交换发生频率相等，那么预计带有突变的细胞数目会同与亲代菌株完全相同的细胞的数目一致。但事实证明不是这样，多数筛选的菌落保留着亲代菌株FI7990的遗传组织。这一情况的原因尚不清楚，但它表明了整合一个功能性nisA基因的直接影响是不利于宿主细胞。已有报道，nisA基因的表达比邻近的nisB基因早30分钟(Engelke等(1994)同上)，并且就产生前乳链菌肽而言，在乳链菌肽基因簇中其他决定簇的转录也可能被类似地延迟。通过基因置换获得nisA基因的那些菌株，在乳链菌肽分子发挥其抗微生物作用之前可能尚未恢复完全的免疫性。这些菌株不能存活。但是当乳链菌肽产生延迟后，我们能够用基因置换的方法恢复Nis+表型，以产生完全的乳链菌肽免疫性。
将脱氢丙氨酸转化成丙氨酸残基
在5位和33位的脱氢丙氨酸(Dha)残基(图1)是乳链菌肽分子中最初用于改造的目标残基。目的是用丝氨酸残基取代缺少潜在不稳定的不饱和侧链的丙氨酸，Dha就是来自于其中的丝氨酸。nisA中的突变-S5A是用引物P26和P17(表2)通过PCR所产生的。扩增产生404bp的HincII/SacI片段，这一片段含有nisA的氨基末端，并且包括一个Ser密码子(标号173，图4)替代表示丙氨酸的CGT。含有nisACOOH末端的90bp的SacI/BglII片段，用引物P10和P32(表2)通过PCR而生成，并包括了用引物P18和P19(表2)的剪接重叠延伸步骤。后一对互补引物有一个丙氨酸密码子CGT，以替代257位的(图4)丝氨酸密码子。将这些PCR产生的片段，无论以分开或以合并方式亚克隆至适当的基因置换型载体中，形成不间断的编码区，指定为nisA/S5A，nisA/S33A或nisA/S5A，S33A基因。用质粒DNA转化FI7990，然后进行基因置换过程产生大量菌落，其中的多数为Ems和Nis+，用P39和P40(图2a)的引物组合通过PCR研究染色体的相关区域，当与FI7990(见图5)相比，在每种情况下，片段大小增加300bp，表明已发生了基因置换。这些PCR产生片段的核苷酸序列分析证实了，在各种情形下，三个变体nisA基因被掺入染色体，替代了△nisA缺损。下面对每一种基因置换菌株的代表，即FI8070(nisA/S5A)，FI8198(nisA/S33A)和FI8199(nisA/S5A，S33A)的特征进行表征。
如由菌落涂布直接测定到的，所有三种突变的nisA基因的表达产生了一种活性分子。细胞提取液的平板扩散生物测定证明了抗瑞士乳芽孢杆菌的抗微生物活性的水平可与亲代FI5876菌株(图6)相比。编码nisA/S5A的FI8070产生一个抑制区，其大小与亲代菌株FI5876的相同。这表明乳链菌肽变体(nisA/Dha5A)中的突变不明显影响抗这种指示微生物的抗微生物性能。发现FI8198(产生变体乳链菌肽A/Dha 33A)的细胞提取液总比亲代菌株产生较大的抑制区(图6)。在此处所采用的条件下(表1)，这与乳链菌肽A的量增加了约50％一致。这种较高产量不出现在产生双重突变的乳链菌肽A/Dha 5A，Dha 33A的FI8199提取液中。这种乳链菌肽变体的抑制作用与含有单个突变的乳链菌肽A以及野生型分子相同(表1)。在所有情况下，用这一基因置换方法，比在质粒互补系统(表3，Dodd等(1992)(1993)同上)中用相应的质粒编码基因时，特定乳链菌肽变体有较高产量。
  表3来自乳球菌表达系统的乳链菌肽活性的比较
乳链菌肽变体 乳链菌肽活性a(占野生型的百分比)
互补b 基因置换c
乳链菌肽A(野生型) 50 100
乳链菌肽A(Dha5A) 25 100
乳链菌肽A(Dha33A) 10 150
乳链菌肽A(Dha5A，Dha33A ＜1d 100
a.用平板扩散生物测定法测定
b.在宿主菌株FI7332中互补于nisA缺陷的质粒编码的nisA基因所获得的抗微生物活性
c.通过基因置换所得的抗微生物活性。功能性的nisA基因掺入FI7990染色体中替代nisA缺失
d.活性低于生物测定法所检测的量
此处所研制的系统产生变体乳链菌肽，其产量相当于产生乳链菌肽A的亲代菌株FI5876的产量(表1)。对于野生型nisA基因，它比以前用类似的质粒互补方法(Dodd等(1992)(1993)同上)所得的乳链菌肽的量大约高50％。进一步比较这两个系统显示：产量的差别在乳链菌肽变体中出人意料地显著(表3)。基因置换方法使乳链菌肽A/Dha 5A的产量增加了约4倍，而使乳链菌肽A/Dha 33A的产量高出10倍。双突变乳链菌肽A/Dha 5A，Dha 33A的生产效率的增加尤其显著(表3)。当确定该变体乳菌肽的基因是由质粒编码，并且该基因用于补偿宿主菌株nisA缺陷时，抗微生物活性只能在更加敏感的菌落涂布试验中检测到。从这一菌株所得的细胞提取物在平板扩散生物测定中不显示任何活性(表3)。然而，当用基因置换方法将基因掺入染色体时，活性水平与乳链菌肽A的相当，表示产量的增加超过100％。这一出乎意料的发现与随后进行的该改造分子的化学和生物化学分析相关。需要有大量纯化的肽以完全表征新的乳链菌肽，和生产出适于满足食品保藏剂市场要求的规模的量，这里所述的系统看来能保证获得相对高产量。
我们运用本实施例中所述的方法，构建了各种产变体乳链菌肽的菌株，这些菌株的描述见表4。从图4给出的序列设计进行特定突变的合适的寡核苷酸引物，这些引物示于图11。
  表4通过基因置换产生的产乳链菌肽的菌株
菌株号   nisA突变   活性a(占野生型百分比)   MICHb(μg ml-1)
MG1614   -   -   -
FI5876   wt   100   0.13
FI7990   ΔnisA-   -   -
FI8070   S5A   100   0.25
FI8198   S33A   150   0.25
FI8199   S5A，S33A   100   1.00
FI8167   H27W   ＜1   ndc
FI8122   S5A，H27W   10   nd
FI8307   II27K   100   0.13
FI8328   H31K   25   nd
FI8330   H27K-，H31K   10   nd
FI8256   K12L   10   0.13
FI8290   ΔM21   ＜1   nd
FI8289   I30W   ＜1   0.16
a用平板扩散生物测定法测定的培养物上清中的抗微生物活性。
b针对敏感的乳酸乳球菌菌株MG1614测定的最小抑制浓度(MICs)
nd，未测定。
在某些情况下，需要加入nisA乳链菌肽作为一种诱导剂，表5示出用各种诱导剂所得的结果。
表5
菌株   诱导剂(乳链菌肽变体)                诱导a100ng ml-1          1mg ml-1   MICb(mg ml-1)
MG1614   -     2     4   -
FI5876   -     94     100   -
FI7847   -     3     3   -
FI7847   A(野生型)     104     104   0.13
FI7847   Dha5A     114     107   0.25
FI7847   Dha33A     17     101   0.25
FI7847   Dha5，33A     34     106   1.00
FI7847 H27K 86 nt 0.13
FI7847   K12L     81     nt   0.13
FI7847   I30W     41     nt   0.16
实施例2：变体乳链菌肽的纯化
培养菌株FI8070(nisA/S5A)，变体乳链菌肽(其中的Dha5被丙氨酸替代)分泌入培养基中。
依照Mulders等(1991)在“欧洲生物化学杂志”(Eur.J.Biochem.)201，581-584中所述方法纯化变体乳链菌肽。在30℃下把1升培养物培养16小时。用HCl调节培养物pH值至2-3，然后在10,000rpm下离心10分钟。取不含细胞的上清液，用10mM NaOH调高pH值至5-6。在每10ml上清液中加入0.99克的(NH4)2SO4。然后将溶液过滤(Millipore，0.45μm)，再过FractogelTSK Butyl 650S(Merk)柱，柱床体积5×20cm，事先用0.8M(NH4)2SO4平衡。用约1升的0.8M(NH4)2SO4洗柱，直至220处的吸光度降至0.5以下。结合的乳链菌肽用5mMHCl洗脱，测定10ml级分的乳链菌肽活性。将活性级分汇合在一起并冻干。用μBondapak C18柱3.9×300mm在室温下对重悬的样品进行反相HPLC。所用的溶剂为0.06％(V/V)的三氟乙酸和0.06％(V/V)的三氟乙酸90％(V/V)在含水乙腈中的溶液。在220nm处测定吸光度。
实施例3：在干酪中加变体乳链菌肽
由菌株FI8070(其中Dha5被丙氨酸替代)产生的变体乳链菌肽以每千克12.5mg的浓度加至软干酪中并分散，以防止食品腐败菌或病原菌的生长。

Claims (22)

1.一种构建不含天然nisA基因、但能表达乳链菌肽的细胞的方法，包括下列步骤：
(1)提供一种细胞，该细胞含有天然的染色体nisA基因和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因；
(2)在所述天然nisA基因或其部分的染色体位置上用变体nisA基因或其部分来替代天然的染色体nisA基因或其部分。
2.如权利要求1的方法，其中变体nisA基因编码一个变体乳链菌肽。
3.如权利要求1或2的方法，其中变体nisA基因除了包含天然nisA基因调节区和乳链菌肽编码区之外，还包含一个调节区。
4.如上述权利要求中任一项的方法，其中细胞为乳球菌属。
5.如权利要求1或2的方法，包括下列步骤：(1)在所述天然nisA基因的染色体位置上，用可反选择的nisA基因替代天然的染色体nisA基因和(2)在所述天然nisA基因的染色体位置，用变体nisA基因替代可反选择的nisA基因。
6.如上述权利要求任一项中的方法，包括随后的选择对乳链菌肽产生免疫的细胞的步骤。
7.如权利要求5或6的方法，其中的可反选择的nisA基因包括一个对抗生素具抗性的基因。
8.如权利要求7的方法，它还包括选择对所述抗生素敏感的细胞的步骤。
9.如上述权利要求中任一项的方法，其中的变体nisA基因包含了天然nisA基因的转录或翻译控制序列的修饰，结果是，细胞表达天然nisA乳链菌肽的量比在相同培养条件下生长的未修饰细胞的量增加。
10.一种通过上述权利要求中任一项的方法可获得的细胞。
11.一种细胞，其得自含有天然的染色体nisA基因和用于乳链菌肽修饰、分泌和免疫性的基因的细胞，其中天然的染色体nisA基因或其部分不存在，且细胞包含所述天然的染色体nisA基因或其部分的染色体位置上的变体nisA基因或其部分。
12.如权利要求11的细胞，其中变体nisA基因编码一个变体乳链菌肽。
13.如权利要求11或12的细胞，其中的变体nisA基因除了含有天然nisA基因调节区和乳链菌肽编码区之外，还含有一个调节区。
14.如权利要求11-13中任一项的细胞，其中细胞为乳球菌属。
15.如权利要求11-14中任一项的细胞，它对乳链菌肽具有免疫性。
16.如权利要求11-15中的任一项的细胞，其中变体nisA基因包含对天然nisA基因的转录或翻译控制序列的修饰，结果是，细胞表达天然nisA乳链菌肽的量比在相同培养条件下生长的未修饰细胞的量增加。
17.一种生产乳链菌肽的方法，包括培养根据权利要求10-16任一项的细胞，并获得由此产生的乳链菌肽。
18.如权利要求17的方法，其中乳链菌肽是一种变体乳链菌肽。
19.如权利要求17或18的方法，其中在nisA乳链菌肽或能诱导乳链菌肽表达的变体乳链菌肽的存在下培养细胞。
20.如权利要求19的方法，其中nisA乳链菌肽的量是提供最大诱导乳链菌肽产生的最小量。
21.根据权利要求17-20中任一项的方法生产的乳链菌肽，其中该乳链菌肽是非天然存在的变体乳链菌肽。
22.根据权利要求21的乳链菌肽作为抗菌剂的用途。
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