JP2001095592A - ｔｈｒＥをコードする新規ヌクレオチド配列およびコリネフォルムバクテリアを使用したＬ−スレオニンの酵素的製法 - Google Patents
ｔｈｒＥをコードする新規ヌクレオチド配列およびコリネフォルムバクテリアを使用したＬ−スレオニンの酵素的製法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｌ−スレオニンの酵素的製法を改良するための
新規方法の提供。 【解決手段】ｉ）ｔｈｒＥ遺伝子をコードする特定のヌ
クレオチド配列、又は（ｉｉ）遺伝暗号の変性領域内の
前記配列に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉ
ｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリ
ダイズする少なくとも１つの配列、及び／又は場合によ
り（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異を有す
る、ｔｈｒＥをコードするヌクレオチド配列を少なくと
も１つ含有する、コリネバクテリウムに由来し、かつコ
リネフォルム微生物中で複製可能な組み換えＤＮＡ。コ
リネフォルムバクテリアの中でｔｈｒＥをコードするヌ
クレオチド配列を増幅し、Ｌ−スレオニンを産生する方
法。
新規方法の提供。 【解決手段】ｉ）ｔｈｒＥ遺伝子をコードする特定のヌ
クレオチド配列、又は（ｉｉ）遺伝暗号の変性領域内の
前記配列に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉ
ｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリ
ダイズする少なくとも１つの配列、及び／又は場合によ
り（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異を有す
る、ｔｈｒＥをコードするヌクレオチド配列を少なくと
も１つ含有する、コリネバクテリウムに由来し、かつコ
リネフォルム微生物中で複製可能な組み換えＤＮＡ。コ
リネフォルムバクテリアの中でｔｈｒＥをコードするヌ
クレオチド配列を増幅し、Ｌ−スレオニンを産生する方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｔｈｒＥ遺伝子を
コードするヌクレオチド配列に関するとともに、コリネ
フォルムバクテリアを使用し、その中でｔｈｒＥ遺伝子
を増幅させる、Ｌ−スレオニンの酵素的製法に関する。
コードするヌクレオチド配列に関するとともに、コリネ
フォルムバクテリアを使用し、その中でｔｈｒＥ遺伝子
を増幅させる、Ｌ−スレオニンの酵素的製法に関する。
【０００２】Ｌ−スレオニンは、動物の栄養分、ヒト用
薬剤および医薬品産業に利用されている。
薬剤および医薬品産業に利用されている。
【０００３】Ｌ−スレオニンがコリネフォルムバクテリ
ア株、特にコリネバクトリウム グルタミカム（Coryne
bacterium glutamicum）の発酵によって製造され得るこ
とは、公知である。Ｌ−スレオニンは非常に重要である
ので、常に製法の改良が試みられている。製法の改良
は、攪拌や酸素供給のような発酵技術、または発酵時の
糖濃度のような栄養培地の組成、またはイオン交換クロ
マトグラフィーのような製造物の後処理、または微生物
自体の内因的な生産特性に関連する。
ア株、特にコリネバクトリウム グルタミカム（Coryne
bacterium glutamicum）の発酵によって製造され得るこ
とは、公知である。Ｌ−スレオニンは非常に重要である
ので、常に製法の改良が試みられている。製法の改良
は、攪拌や酸素供給のような発酵技術、または発酵時の
糖濃度のような栄養培地の組成、またはイオン交換クロ
マトグラフィーのような製造物の後処理、または微生物
自体の内因的な生産特性に関連する。
【０００４】突然変異誘発、選別および変異体の選択か
ら成る方法を、微生物の生産特性の改良のために使用す
る。このようにして、スレオニン類似体であるα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）のような代謝拮抗
物質への抵抗性を有する株または重要なアミノ酸を制御
するための栄養要求性を獲得した株を取得し、Ｌ−スレ
オニンを製造する。
ら成る方法を、微生物の生産特性の改良のために使用す
る。このようにして、スレオニン類似体であるα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）のような代謝拮抗
物質への抵抗性を有する株または重要なアミノ酸を制御
するための栄養要求性を獲得した株を取得し、Ｌ−スレ
オニンを製造する。
【０００５】近年、コリネバクテリアのＬ−スレオニン
産生株を改良するために、各スレオニン生合成遺伝子を
増幅してＬ−スレオニン産生への効果を調査することか
ら成る組み換えＤＮＡ技術法が利用されている。
産生株を改良するために、各スレオニン生合成遺伝子を
増幅してＬ−スレオニン産生への効果を調査することか
ら成る組み換えＤＮＡ技術法が利用されている。
【０００６】本発明は、Ｌ−スレオニンの酵素的製法を
改良するための新規方法を提供することを目的としてい
る。
改良するための新規方法を提供することを目的としてい
る。
【０００７】Ｌ−スレオニンは、動物の栄養分、ヒト用
薬剤および医薬品産業において利用されている。従っ
て、Ｌ−スレオニンを製造するための新規に改良された
方法の提供には、常に関心が集まっている。
薬剤および医薬品産業において利用されている。従っ
て、Ｌ−スレオニンを製造するための新規に改良された
方法の提供には、常に関心が集まっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、有利
に、コリネバクテリウムに由来しかつコリネフォルム微
生物中で増幅可能な組み換えＤＮＡであり、これは配列
番号１および配列番号３で示されるｔｈｒＥをコードす
るヌクレオチド配列を、少なくとも１つ含有する。
に、コリネバクテリウムに由来しかつコリネフォルム微
生物中で増幅可能な組み換えＤＮＡであり、これは配列
番号１および配列番号３で示されるｔｈｒＥをコードす
るヌクレオチド配列を、少なくとも１つ含有する。
【０００９】本発明の課題は、（ｉ）ｔｈｒＥをコード
する、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配
列、または（ｉｉ）遺伝暗号の変性領域内の、配列
（ｉ）に相当する、少なくとも１つの配列、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする少なくとも１つの配列、および／または
場合により（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異
を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡでもある。
する、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配
列、または（ｉｉ）遺伝暗号の変性領域内の、配列
（ｉ）に相当する、少なくとも１つの配列、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイ
ブリダイズする少なくとも１つの配列、および／または
場合により（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異
を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡでもある。
【００１０】本発明の課題は、さらに、コリネフォルム
微生物、特に前記の複製可能なＤＮＡを導入して形質転
換させたコリネバクテリウム属の微生物である。
微生物、特に前記の複製可能なＤＮＡを導入して形質転
換させたコリネバクテリウム属の微生物である。
【００１１】最後に、本発明は、コリネフォルムバクテ
リアを使用したＬ−スレオニンの酵素的製法に関し、こ
こで、該コリネフォルムバクテリアの中でｔｈｒＥをコ
ードするヌクレオチド配列が増幅、特に過剰発現され、
該コリネフォルムバクテリアはＬ−スレオニンを有利に
産生する。
リアを使用したＬ−スレオニンの酵素的製法に関し、こ
こで、該コリネフォルムバクテリアの中でｔｈｒＥをコ
ードするヌクレオチド配列が増幅、特に過剰発現され、
該コリネフォルムバクテリアはＬ−スレオニンを有利に
産生する。
【００１２】本明細書において“増幅”とは、例えば遺
伝子のコピー数を増加させる、あるいは強力なプロモー
ターまたは相当する高活性な酵素をコードした遺伝子を
使用する、および場合によりこれらの方法を組み合わせ
ることにより、相当するＤＮＡでコードされた微生物中
の１つ以上の酵素の細胞内活性を強化することである。
伝子のコピー数を増加させる、あるいは強力なプロモー
ターまたは相当する高活性な酵素をコードした遺伝子を
使用する、および場合によりこれらの方法を組み合わせ
ることにより、相当するＤＮＡでコードされた微生物中
の１つ以上の酵素の細胞内活性を強化することである。
【００１３】本発明の課題である微生物は、グルコー
ス、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースから、またはグリセロ
ールおよびエタノールから、Ｌ−スレオニンを製造でき
る。このような微生物の典型例はコリネフォルムバクテ
リアであり、特にコリネバクテリウム属である。コリネ
バクテリウム属の中でも、そのＬ−アミノ酸産生能力の
ために当業者に公知の、コリネバクテリウム グルタミ
カムは特記すべきである。
ス、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースから、またはグリセロ
ールおよびエタノールから、Ｌ−スレオニンを製造でき
る。このような微生物の典型例はコリネフォルムバクテ
リアであり、特にコリネバクテリウム属である。コリネ
バクテリウム属の中でも、そのＬ−アミノ酸産生能力の
ために当業者に公知の、コリネバクテリウム グルタミ
カムは特記すべきである。
【００１４】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム属グルタミカム種の好適な株は、有利に、 コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ （Corynebacterium glutaicum） コリネバクテリウム アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６ （Corynebacterium acetoglutamicum） コリネバクテリウム アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０ （Corynebacterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム メラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５ （Corynebacterium melassecola） コリネバクテリウム サーモアミノジーン ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ （Corynebacterium thermoaminogenes） ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ （Brevibacterium flavum） ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９および （Brevibacterium lactofermentum） ブレビバクテリウム ジバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ （Brevibacterium divaricatum） のような野生株であり、これらから、例えば コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１６４９ ブレビバクテリウム フラバム ＢＢ６９ ブレビバクテリウム フラバム ＤＳＭ５３９９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−ＢＰ２６９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＴＢＢ−１０ のようなＬ−スレオニン−産生突然変異体またはＬ−ス
レオニン−産生株が得られる。
リウム属グルタミカム種の好適な株は、有利に、 コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ （Corynebacterium glutaicum） コリネバクテリウム アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６ （Corynebacterium acetoglutamicum） コリネバクテリウム アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０ （Corynebacterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム メラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５ （Corynebacterium melassecola） コリネバクテリウム サーモアミノジーン ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ （Corynebacterium thermoaminogenes） ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ （Brevibacterium flavum） ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９および （Brevibacterium lactofermentum） ブレビバクテリウム ジバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ （Brevibacterium divaricatum） のような野生株であり、これらから、例えば コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１６４９ ブレビバクテリウム フラバム ＢＢ６９ ブレビバクテリウム フラバム ＤＳＭ５３９９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−ＢＰ２６９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＴＢＢ−１０ のようなＬ−スレオニン−産生突然変異体またはＬ−ス
レオニン−産生株が得られる。
【００１５】本発明は、コリネバクテリウム グルタミ
カムのｔｈｒＥ遺伝子を首尾よく単離する。ｔｈｒＥ遺
伝子を単離するために、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損させたコ
リネバクテリウム グルタミカム突然変異体を最初に製
造する。この際、好適な出発株、例えばＡＴＣＣ１４７
５２またはＡＴＣＣ１３０３２に突然変異誘発法を実施
する。
カムのｔｈｒＥ遺伝子を首尾よく単離する。ｔｈｒＥ遺
伝子を単離するために、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損させたコ
リネバクテリウム グルタミカム突然変異体を最初に製
造する。この際、好適な出発株、例えばＡＴＣＣ１４７
５２またはＡＴＣＣ１３０３２に突然変異誘発法を実施
する。
【００１６】慣用の突然変異誘発法には、Ｎ−メチル−
Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような化学薬品
またはＵＶ照射による処理が含まれる。突然変異を誘起
するためのこのような方法は一般的に公知であり、特に
Millerの文献（A Short Course in Bacterial Genetic
s、A Laboratory Manual and Handbook for Escherichi
a Coli and Related Bacteria( Cold Spring Harbor La
boratory Press, 1992））またはThe American Society
for Bacteriology（WashingtonＤ.Ｃ.、ＵＳＡ、198
1）出版の“Manual of Methods for General Bacteriol
ogy”中に記載される。
Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような化学薬品
またはＵＶ照射による処理が含まれる。突然変異を誘起
するためのこのような方法は一般的に公知であり、特に
Millerの文献（A Short Course in Bacterial Genetic
s、A Laboratory Manual and Handbook for Escherichi
a Coli and Related Bacteria( Cold Spring Harbor La
boratory Press, 1992））またはThe American Society
for Bacteriology（WashingtonＤ.Ｃ.、ＵＳＡ、198
1）出版の“Manual of Methods for General Bacteriol
ogy”中に記載される。
【００１７】その他の突然変異誘発法は、トランスポゾ
ンの特性をＤＮＡ配列への“組込”に利用し、関連遺伝
子の機能を障害または停止させる、トランスポゾン突然
変異誘発法である。コリネフォルムバクテリアのトラン
スポゾンは当業者に公知である。例えば、エリスロマイ
シン耐性トランスポゾンＴｎ５４３２（Tauch等、Plasm
id (1995) 33: 168〜179）およびクロラムフェニコール
耐性トランスポゾンＴｎ５５４６は、コリネバクテリウ
ム キセローシス（Corynebacterium xerosis）株Ｍ８
２Ｂから単離されている。
ンの特性をＤＮＡ配列への“組込”に利用し、関連遺伝
子の機能を障害または停止させる、トランスポゾン突然
変異誘発法である。コリネフォルムバクテリアのトラン
スポゾンは当業者に公知である。例えば、エリスロマイ
シン耐性トランスポゾンＴｎ５４３２（Tauch等、Plasm
id (1995) 33: 168〜179）およびクロラムフェニコール
耐性トランスポゾンＴｎ５５４６は、コリネバクテリウ
ム キセローシス（Corynebacterium xerosis）株Ｍ８
２Ｂから単離されている。
【００１８】その他のトランスポゾンには、Ankri等に
よって記載されたトランスポゾンＴｎ５５３１（Journa
l of Bacteriology (1996) 178: 4412〜4419）があり、
例えば本発明の過程に使用される。トランスポゾンＴｎ
５５３１は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を含み、
例えば図１に記載のプラスミドベクターｐＣＧＬ００４
０の形で運搬できる。トランスポゾンＴｎ５５３１のヌ
クレオチド配列は、National Center for Biotechnolog
y Information（NCBI、Bethesda、MD、USA）から登録番
号Ｕ５３５８７として任意に入手できる。
よって記載されたトランスポゾンＴｎ５５３１（Journa
l of Bacteriology (1996) 178: 4412〜4419）があり、
例えば本発明の過程に使用される。トランスポゾンＴｎ
５５３１は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を含み、
例えば図１に記載のプラスミドベクターｐＣＧＬ００４
０の形で運搬できる。トランスポゾンＴｎ５５３１のヌ
クレオチド配列は、National Center for Biotechnolog
y Information（NCBI、Bethesda、MD、USA）から登録番
号Ｕ５３５８７として任意に入手できる。
【００１９】突然変異誘発、有利にトランスポゾン突然
変異誘発後に、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損した突然変異体を
検索する。最小栄養寒天培地上で良好な増殖を示すが、
スレオニン−含有オリゴペプチド、例えばスレオニル−
スレオニル−スレオニントリペプチドを補足した最小寒
天培地上ではほとんど増殖しないという事実から、ｔｈ
ｒＥ遺伝子を欠損した突然変異体を識別する。
変異誘発後に、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損した突然変異体を
検索する。最小栄養寒天培地上で良好な増殖を示すが、
スレオニン−含有オリゴペプチド、例えばスレオニル−
スレオニル−スレオニントリペプチドを補足した最小寒
天培地上ではほとんど増殖しないという事実から、ｔｈ
ｒＥ遺伝子を欠損した突然変異体を識別する。
【００２０】このような突然変異体の例は、ＡＴＣＣ１
４７５２ΔｉｌｖＡｔｈｒＥ：：Ｔｎ５５３１株であ
る。
４７５２ΔｉｌｖＡｔｈｒＥ：：Ｔｎ５５３１株であ
る。
【００２１】記載の方法で製造される株を、ｔｈｒＥ遺
伝子の単離およびクローン化に使用できる。
伝子の単離およびクローン化に使用できる。
【００２２】この際、関連するバクテリアの遺伝子バン
クを構築してよい。遺伝子バンクの構築は、公知の文献
およびマニュアルに記載されている。例としてWinnacke
rによる文献：Gene und Klone, eine Einfuhrung in di
e Gentechnologie (Gene and Clones, An Introduction
to Gene Technology）（Verlag Chemie、weinheim、Ge
rmahy、1990）またはSambrook等のマニュアル：Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1989）が挙げられる。非常によく
知られた遺伝子バンクは、Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ
３１００のもので、これは、Kohara等によってλ−ベク
ター中に構築された（Cell、50、495〜508（1987））。
Bathe等は（Molecular and General Genetics、252：25
5〜265、1996）コリネバクテリウム グルタミカムＡＴ
ＣＣ１３０３２の遺伝子バンクについて記載しており、
これは、コスミドベクターであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩ(W
ahl等、1987、Proceedings of the National Academy o
f Science USA、84：2160〜2164）の助成のもと、Ｅ.Ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleigh等、1988、Nuc
leic Acid Research 16：1563〜1575）中に構築され
る。コリネフォルムバクテリア、特にコリネバクテリウ
ム グルタミカム中で複製されるので、これらのベクタ
ーは本発明に好適である。このようなベクターは当業者
に公知であり；例としてプラスミドベクターｐＺ１を挙
げることができ、これは、Menkel等の文献（Applied an
d Environmental Microbiology（1989）64：549〜554）
に記載されている。記載の方法で獲得した遺伝子バンク
を、次いで、形質転換またはエレクトロポレーションの
手段により、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損した指示株に変換
し、これらの形質転換体を、スレオニン−含有オリゴペ
プチドの存在する最小寒天培地上での増殖能により検索
する。次に、クローン化したＤＮＡ断片の配列分析を行
う。
クを構築してよい。遺伝子バンクの構築は、公知の文献
およびマニュアルに記載されている。例としてWinnacke
rによる文献：Gene und Klone, eine Einfuhrung in di
e Gentechnologie (Gene and Clones, An Introduction
to Gene Technology）（Verlag Chemie、weinheim、Ge
rmahy、1990）またはSambrook等のマニュアル：Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1989）が挙げられる。非常によく
知られた遺伝子バンクは、Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ
３１００のもので、これは、Kohara等によってλ−ベク
ター中に構築された（Cell、50、495〜508（1987））。
Bathe等は（Molecular and General Genetics、252：25
5〜265、1996）コリネバクテリウム グルタミカムＡＴ
ＣＣ１３０３２の遺伝子バンクについて記載しており、
これは、コスミドベクターであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩ(W
ahl等、1987、Proceedings of the National Academy o
f Science USA、84：2160〜2164）の助成のもと、Ｅ.Ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleigh等、1988、Nuc
leic Acid Research 16：1563〜1575）中に構築され
る。コリネフォルムバクテリア、特にコリネバクテリウ
ム グルタミカム中で複製されるので、これらのベクタ
ーは本発明に好適である。このようなベクターは当業者
に公知であり；例としてプラスミドベクターｐＺ１を挙
げることができ、これは、Menkel等の文献（Applied an
d Environmental Microbiology（1989）64：549〜554）
に記載されている。記載の方法で獲得した遺伝子バンク
を、次いで、形質転換またはエレクトロポレーションの
手段により、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損した指示株に変換
し、これらの形質転換体を、スレオニン−含有オリゴペ
プチドの存在する最小寒天培地上での増殖能により検索
する。次に、クローン化したＤＮＡ断片の配列分析を行
う。
【００２３】Ｔｎ５５３１を用いた突然変異誘発によっ
て製造されたコリネフォルムバクテリアの突然変異体、
例えばＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡｔｈｒＥ：：Ｔｎ
５５３１株を使用する場合には、ｔｈｒＥ：：Ｔｎ５５
３１対立遺伝子を、後者に含まれるカナマイシン耐性遺
伝子ａｐｈ３を直接利用してクローン化し、単離しても
よい。この際、公知のクローニングベクター、例えばｐ
ＵＣ１８（Norrander等、Gene（1983）26：101〜106お
よびYanisch Perron等、Gene（1985）33：103〜119）を
使用する。クローニングの宿主として特に好適なのは、
制限−欠損および組み換え−欠損させた両Ｅ.Ｃｏｌｉ
株である。例えばＤＨ５αｍｃｒ株であり、これはGran
t等によって記載されている（Proceeding of the Natio
nal Academy of Sciences USA、87（1990）4645〜464
9）。形質転換体の選択を、カナマイシンの存在下に実
施する。次いで、得られた形質転換体のプラスミドＤＮ
Ａの配列を調べる。このために、Sanger等によって記載
されたジデオキシチェーンターミネーション法（Procee
dings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America USA（1977）74：5463〜546
7）を利用してもよい。これにより、Ｔｎ５５３１装入
部位の上流および下流に、ｔｈｒＥ遺伝子配列が得られ
る。次いで、得られたヌクレオチド配列を分析し、購入
可能な配列分析プログラム、例えばレーザージーン（La
ser gene、Biocomputing Software forWindows、DNASTA
R, Madison、USA）またはプログラムパッケージＨＵＳ
ＡＲ（Release 4.0、EMBL、Heidelberg、Germany）を用
いて組み立てる。
て製造されたコリネフォルムバクテリアの突然変異体、
例えばＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡｔｈｒＥ：：Ｔｎ
５５３１株を使用する場合には、ｔｈｒＥ：：Ｔｎ５５
３１対立遺伝子を、後者に含まれるカナマイシン耐性遺
伝子ａｐｈ３を直接利用してクローン化し、単離しても
よい。この際、公知のクローニングベクター、例えばｐ
ＵＣ１８（Norrander等、Gene（1983）26：101〜106お
よびYanisch Perron等、Gene（1985）33：103〜119）を
使用する。クローニングの宿主として特に好適なのは、
制限−欠損および組み換え−欠損させた両Ｅ.Ｃｏｌｉ
株である。例えばＤＨ５αｍｃｒ株であり、これはGran
t等によって記載されている（Proceeding of the Natio
nal Academy of Sciences USA、87（1990）4645〜464
9）。形質転換体の選択を、カナマイシンの存在下に実
施する。次いで、得られた形質転換体のプラスミドＤＮ
Ａの配列を調べる。このために、Sanger等によって記載
されたジデオキシチェーンターミネーション法（Procee
dings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America USA（1977）74：5463〜546
7）を利用してもよい。これにより、Ｔｎ５５３１装入
部位の上流および下流に、ｔｈｒＥ遺伝子配列が得られ
る。次いで、得られたヌクレオチド配列を分析し、購入
可能な配列分析プログラム、例えばレーザージーン（La
ser gene、Biocomputing Software forWindows、DNASTA
R, Madison、USA）またはプログラムパッケージＨＵＳ
ＡＲ（Release 4.0、EMBL、Heidelberg、Germany）を用
いて組み立てる。
【００２４】この方法により、配列番号１に示される、
ｔｈｒＥ遺伝子をコードしたコリネバクテリウム グル
タミカムの新規ＤＮＡ配列が得られ、これは本発明の構
成要素である。相当するタンパク質のアミノ酸配列も、
前記方法による本発明のＤＮＡ配列を基にしている。得
られたｔｈｒＥ遺伝子産物のアミノ酸配列を、配列番号
２に示す。
ｔｈｒＥ遺伝子をコードしたコリネバクテリウム グル
タミカムの新規ＤＮＡ配列が得られ、これは本発明の構
成要素である。相当するタンパク質のアミノ酸配列も、
前記方法による本発明のＤＮＡ配列を基にしている。得
られたｔｈｒＥ遺伝子産物のアミノ酸配列を、配列番号
２に示す。
【００２５】遺伝暗号の変性により配列番号１から製造
されたコードＤＮＡ鎖配列も、同様に、本発明の構成要
素である。同様に、配列番号１または配列番号１の一部
とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の構成要素で
ある。
されたコードＤＮＡ鎖配列も、同様に、本発明の構成要
素である。同様に、配列番号１または配列番号１の一部
とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の構成要素で
ある。
【００２６】さらに、保存的なアミノ酸の置換、例えば
タンパク質であれば、グリシンのアラニンによる置換ま
たはアスパラギン酸のグルタミン酸による置換は、セン
ス変異として専門家の間では公知であり、この際タンパ
ク活性の機能的な変化は生じない、すなわち機能的に中
立である。タンパクのＮ−および／またはＣ−末端での
置換が、その機能に対し実質的に影響を及ぼさないばか
りか、安定化させることさえあることも周知である。当
業者は、このことの詳細を、特にBen-Bassat等の文献
（Journal of Bacteriology 169：751〜757（198
7））、O'Regan等の文献（Gene 77：237〜251（198
9））、Sahin-Toth等の文献（Protein Sciences 3：240
〜247（1994））、Hochuli等の文献（Bio/Technology
6：1321〜1325（1988））および遺伝子および分子生物
学に関する書物に見出すことができる。相当する方法で
配列番号２から製造されたアミノ酸配列も同様に本発明
の構成要素である。
タンパク質であれば、グリシンのアラニンによる置換ま
たはアスパラギン酸のグルタミン酸による置換は、セン
ス変異として専門家の間では公知であり、この際タンパ
ク活性の機能的な変化は生じない、すなわち機能的に中
立である。タンパクのＮ−および／またはＣ−末端での
置換が、その機能に対し実質的に影響を及ぼさないばか
りか、安定化させることさえあることも周知である。当
業者は、このことの詳細を、特にBen-Bassat等の文献
（Journal of Bacteriology 169：751〜757（198
7））、O'Regan等の文献（Gene 77：237〜251（198
9））、Sahin-Toth等の文献（Protein Sciences 3：240
〜247（1994））、Hochuli等の文献（Bio/Technology
6：1321〜1325（1988））および遺伝子および分子生物
学に関する書物に見出すことができる。相当する方法で
配列番号２から製造されたアミノ酸配列も同様に本発明
の構成要素である。
【００２７】好適なプライマーを、配列番号１に示した
ヌクレオチド配列を使用して合成でき、次に、これら
を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、種々
のコリネフォルムバクテリアおよび株に含まれるｔｈｒ
Ｅ遺伝子の増幅に使用する。当業者は、このことの詳細
を、例えばGaitのマニュアル：Oligonucleotide synthe
sis: a practical approach (IRL Press、Oxford、UK、
1984）さらにNewtonおよびGrahamの文献：PCR (SPktrum
Akademischer Verlag、Heidelberg、Germany、1994）
に見出すことができる。また、配列番号１またはその一
部のヌクレオチド配列を、特に、コリネフォルムバクテ
リアの遺伝子バンク中に存在する、ｔｈｒＥ遺伝子の検
索のためのプローブとして使用することができる。当業
者は、このことの詳細を、例えばBoehringer Mannheim
GmbH (Mannheim、Germany、1993）より出版されたマニ
ュアル“The DIG System Users Guide for Filter Hybr
idization”およびLiebl等の文献（International Jour
nal of Systematic Bacteriology（1991）41：255〜26
0）に見出すことができる。このようにして増幅したｔ
ｈｅＥ遺伝子−含有ＤＮＡ断片をクローン化し、配列を
調べる。
ヌクレオチド配列を使用して合成でき、次に、これら
を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、種々
のコリネフォルムバクテリアおよび株に含まれるｔｈｒ
Ｅ遺伝子の増幅に使用する。当業者は、このことの詳細
を、例えばGaitのマニュアル：Oligonucleotide synthe
sis: a practical approach (IRL Press、Oxford、UK、
1984）さらにNewtonおよびGrahamの文献：PCR (SPktrum
Akademischer Verlag、Heidelberg、Germany、1994）
に見出すことができる。また、配列番号１またはその一
部のヌクレオチド配列を、特に、コリネフォルムバクテ
リアの遺伝子バンク中に存在する、ｔｈｒＥ遺伝子の検
索のためのプローブとして使用することができる。当業
者は、このことの詳細を、例えばBoehringer Mannheim
GmbH (Mannheim、Germany、1993）より出版されたマニ
ュアル“The DIG System Users Guide for Filter Hybr
idization”およびLiebl等の文献（International Jour
nal of Systematic Bacteriology（1991）41：255〜26
0）に見出すことができる。このようにして増幅したｔ
ｈｅＥ遺伝子−含有ＤＮＡ断片をクローン化し、配列を
調べる。
【００２８】配列番号３に示されたＡＴＣＣ１３０３２
株のｔｈｒＥ遺伝子のＤＮＡ配列をこの方法で獲得し、
これも同様に本発明の構成要素である。得られたアミノ
酸配列を配列番号４に示す。
株のｔｈｒＥ遺伝子のＤＮＡ配列をこの方法で獲得し、
これも同様に本発明の構成要素である。得られたアミノ
酸配列を配列番号４に示す。
【００２９】本発明は、ｔｈｒＥ遺伝子を欠損した突然
変異体、有利にはコリネフォルムバクテリアを、スレオ
ニン−含有オリゴペプチドを含む栄養培地上で増殖しな
いかほとんど増殖しない指示株として獲得し、 ａ）遺伝子バンクの構築後に、ｔｈｒＥ遺伝子を同定か
つ単離し、 ｂ）トランスポゾン突然変異誘発の場合には、有利に抗
生物質に耐性のトランスポゾンを選択し、それによりｔ
ｈｒＥ遺伝子が獲得されることから成る、ｔｈｒＥ遺伝
子の単離方法を提供する。
変異体、有利にはコリネフォルムバクテリアを、スレオ
ニン−含有オリゴペプチドを含む栄養培地上で増殖しな
いかほとんど増殖しない指示株として獲得し、 ａ）遺伝子バンクの構築後に、ｔｈｒＥ遺伝子を同定か
つ単離し、 ｂ）トランスポゾン突然変異誘発の場合には、有利に抗
生物質に耐性のトランスポゾンを選択し、それによりｔ
ｈｒＥ遺伝子が獲得されることから成る、ｔｈｒＥ遺伝
子の単離方法を提供する。
【００３０】
【課題を解決するための手段】このことから発明者は、
改良された方法により、ｔｈｒＥ遺伝子の過剰発現後
に、コリネフォルムバクテリアがＬ−スレオニンを製造
することを見出した。
改良された方法により、ｔｈｒＥ遺伝子の過剰発現後
に、コリネフォルムバクテリアがＬ−スレオニンを製造
することを見出した。
【００３１】過剰発現を実現するために、相当する遺伝
子のコピー数を増加させることもできるし、またはプロ
モーターおよび制限領域あるいは構造遺伝子の上流に位
置するリボゾームの結合部位に変異を起こすこともでき
る。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは同
じように機能する。誘導性プロモーターを用いて酵素的
にＬ−スレオニンを製造しながら、さらに発現を強化す
ることも可能である。発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命の延長
を目的とする方法によっても向上する。酵素活性は、酵
素タンパクの分解を妨げることにより増加する。遺伝子
または遺伝構造体を、プラスミド中に異なるコピー数で
存在させることも、染色体中に集積させ増幅させること
もできる。また、関連遺伝子の過剰発現は、培地の組成
および培養条件を変化させることにより実現できる。
子のコピー数を増加させることもできるし、またはプロ
モーターおよび制限領域あるいは構造遺伝子の上流に位
置するリボゾームの結合部位に変異を起こすこともでき
る。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは同
じように機能する。誘導性プロモーターを用いて酵素的
にＬ−スレオニンを製造しながら、さらに発現を強化す
ることも可能である。発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命の延長
を目的とする方法によっても向上する。酵素活性は、酵
素タンパクの分解を妨げることにより増加する。遺伝子
または遺伝構造体を、プラスミド中に異なるコピー数で
存在させることも、染色体中に集積させ増幅させること
もできる。また、関連遺伝子の過剰発現は、培地の組成
および培養条件を変化させることにより実現できる。
【００３２】当業者は、このことの詳細を、特に、Mart
in等の文献（Bio/Technology 5、137〜146（1987）、Gu
errero等の文献（Gene 138，35〜41（1994））、Tsuchi
yaおよびMorinagaの文献（Bio/Technology 6、428〜430
（1988））、Eikmanns等の文献（Gene 102、93〜98（19
91））、ヨーロッパ特許ＥＰＳ第０４７２８６９号、ア
メリカ特許第４６０１８９３号、SchwarzerおよびPuehl
erの文献（Bio/Technology 9、84〜87（1991））、Rein
scheid等の文献（Applied and EnvironmentalMirobiolo
gy 60、126〜132（1994））、LaBarre等の文献（Journa
l of Bacteriology 175、1001〜1007（1993））、ＷＯ
９６／１５２４６、Malumbres等の文献（Gene 134、15
〜24（1993））、ＪＰ−Ａ−１０２２９８９１、Jensen
およびHammerの文献（Biotechnology and Bioengineeri
ng 58、191〜195（1998））、Makridesの文献（Microbi
ological Reviews 60：512〜538（1996））さらに遺伝
子および分子生物学に関する公知の書物に見出すことが
できる。
in等の文献（Bio/Technology 5、137〜146（1987）、Gu
errero等の文献（Gene 138，35〜41（1994））、Tsuchi
yaおよびMorinagaの文献（Bio/Technology 6、428〜430
（1988））、Eikmanns等の文献（Gene 102、93〜98（19
91））、ヨーロッパ特許ＥＰＳ第０４７２８６９号、ア
メリカ特許第４６０１８９３号、SchwarzerおよびPuehl
erの文献（Bio/Technology 9、84〜87（1991））、Rein
scheid等の文献（Applied and EnvironmentalMirobiolo
gy 60、126〜132（1994））、LaBarre等の文献（Journa
l of Bacteriology 175、1001〜1007（1993））、ＷＯ
９６／１５２４６、Malumbres等の文献（Gene 134、15
〜24（1993））、ＪＰ−Ａ−１０２２９８９１、Jensen
およびHammerの文献（Biotechnology and Bioengineeri
ng 58、191〜195（1998））、Makridesの文献（Microbi
ological Reviews 60：512〜538（1996））さらに遺伝
子および分子生物学に関する公知の書物に見出すことが
できる。
【００３３】ｔｈｒＥ遺伝子を過剰発現させることので
きるプラスミドの例は、ｐＺ１ｔｈｒＥ（図２）であ
り、これは、ＤＭ３６８−２ｐＺ１ｔｈｒＥ株に含まれ
ている。プラスミドｐＺ１ｔｈｒＥは、プラスミドｐＺ
１を基礎とするコリネバクテリウム グルタミカム−
Ｅ.Ｃｏｌｉシャトルベクターであり、このことは、Men
kel等の文献（Applied and Environmental Microbiolog
y（1989）64：549〜554）に記載されている。その他
の、コリネバクテリウム グルタミカム中で複製可能な
プラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns
等、Gene 102：93〜98（1991））またはｐＺ８−１（Ｅ
Ｐ−Ｂ−０３７５８８９）を、同様に使用できる。
きるプラスミドの例は、ｐＺ１ｔｈｒＥ（図２）であ
り、これは、ＤＭ３６８−２ｐＺ１ｔｈｒＥ株に含まれ
ている。プラスミドｐＺ１ｔｈｒＥは、プラスミドｐＺ
１を基礎とするコリネバクテリウム グルタミカム−
Ｅ.Ｃｏｌｉシャトルベクターであり、このことは、Men
kel等の文献（Applied and Environmental Microbiolog
y（1989）64：549〜554）に記載されている。その他
の、コリネバクテリウム グルタミカム中で複製可能な
プラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns
等、Gene 102：93〜98（1991））またはｐＺ８−１（Ｅ
Ｐ−Ｂ−０３７５８８９）を、同様に使用できる。
【００３４】さらに、Ｌ−スレオニンの製造には、新規
ｔｈｒＥ遺伝子に加えて、公知のスレオニン合成経路に
関する１つ以上の酵素、または補充代謝反応に関する酵
素、あるいはクエン酸回路の酵素を過剰発現させるのが
有利である。以下は同時過剰発現の例である： ・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍ遺伝
子（Peoples等、Molecular Microbiology 2、63〜72（1
988））またはフィードバックに耐性なホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ（feedback-resistant homoserine dehydr
ogenase）をコードするｈｏｍdr対立遺伝子（Archer
等、Gene 107、53〜59（1991））、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等、European Journal of Biochemistry
254，395〜403（1998））。
ｔｈｒＥ遺伝子に加えて、公知のスレオニン合成経路に
関する１つ以上の酵素、または補充代謝反応に関する酵
素、あるいはクエン酸回路の酵素を過剰発現させるのが
有利である。以下は同時過剰発現の例である： ・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍ遺伝
子（Peoples等、Molecular Microbiology 2、63〜72（1
988））またはフィードバックに耐性なホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ（feedback-resistant homoserine dehydr
ogenase）をコードするｈｏｍdr対立遺伝子（Archer
等、Gene 107、53〜59（1991））、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等、European Journal of Biochemistry
254，395〜403（1998））。
【００３５】Ｌ−スレオニンの製造には、ｔｈｒＥ遺伝
子の過剰発現に加え、不所望な二次反応、例えばスレオ
ニン−デヒドロゲナーゼ反応（Nakayama：“Breeding o
f Amino Acid Prducing Microorganisms”: Overproduc
tion of Microbial Products、Krumphanzl、Sikyta、Va
nek(eds.)、Academic Press、London、UK（1982）さら
に、BellおよびTurner、Biochemical Journal 156、449
〜458（1976））を回避するのが有利である。
子の過剰発現に加え、不所望な二次反応、例えばスレオ
ニン−デヒドロゲナーゼ反応（Nakayama：“Breeding o
f Amino Acid Prducing Microorganisms”: Overproduc
tion of Microbial Products、Krumphanzl、Sikyta、Va
nek(eds.)、Academic Press、London、UK（1982）さら
に、BellおよびTurner、Biochemical Journal 156、449
〜458（1976））を回避するのが有利である。
【００３６】本発明により製造される微生物は、Ｌ−ス
レオニンを製造するために、連続法で、あるいはバッチ
法（バッチ培養）または供給バッチ法（供給法）または
反復供給バッチ法（反復供給法）でバッチ毎に培養して
よい。公知の培養法の概要は、Chemiel等の書物（Biopr
ozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenste
chnik(Gustav Fischer verlag, Stuttgart, 1991）また
はStorhasの書物（Bioreaktoren und periphere Einric
htungen (Vieweg Verlag, Brunswick/ Wiesbaden, 199
4）に記載されている。
レオニンを製造するために、連続法で、あるいはバッチ
法（バッチ培養）または供給バッチ法（供給法）または
反復供給バッチ法（反復供給法）でバッチ毎に培養して
よい。公知の培養法の概要は、Chemiel等の書物（Biopr
ozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenste
chnik(Gustav Fischer verlag, Stuttgart, 1991）また
はStorhasの書物（Bioreaktoren und periphere Einric
htungen (Vieweg Verlag, Brunswick/ Wiesbaden, 199
4）に記載されている。
【００３７】使用する培地を、適当な手段により、各株
の要求を満たすものとしなければならない。各微生物の
ための培地の詳細は、“Manual of Methods for Genera
l Bacteriology”The Ameican Society for Bacteriolo
gy（ワシントンD.C、 ＵＳＡ、1981）に記載されてい
る。使用する炭素源には、糖および炭水化物が含まれ、
例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルク
トース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロー
ス、油および脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、落花生
油およびココナッツオイル、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例え
ばグリセロールおよびエタノール、および有機酸、例え
ば酢酸がある。これらの物質を、単独であるいは混合し
て使用してよい。使用する窒素源には、窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、イーストエキストラクト、肉抽
出物、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆ミール
および尿素、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アン
モニウムおよび硝酸アンモニウムがある。窒素源を、単
独でまたは混合して使用してよい。使用するリン源に
は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二
カリウム、または相当のナトリウム塩が含まれる。さら
に培地には、増殖に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシ
ウムまたは硫酸鉄も含まれなければならない。最後に、
増殖に必要な物質、例えばアミノ酸およびビタミンを前
記物質に追加して使用してもよい。さらに、好適な先駆
物質を培地に添加してもよい。前記物質は、培養中に単
バッチの形でまたは適当な手段で添加できる。
の要求を満たすものとしなければならない。各微生物の
ための培地の詳細は、“Manual of Methods for Genera
l Bacteriology”The Ameican Society for Bacteriolo
gy（ワシントンD.C、 ＵＳＡ、1981）に記載されてい
る。使用する炭素源には、糖および炭水化物が含まれ、
例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルク
トース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロー
ス、油および脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、落花生
油およびココナッツオイル、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例え
ばグリセロールおよびエタノール、および有機酸、例え
ば酢酸がある。これらの物質を、単独であるいは混合し
て使用してよい。使用する窒素源には、窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、イーストエキストラクト、肉抽
出物、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆ミール
および尿素、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アン
モニウムおよび硝酸アンモニウムがある。窒素源を、単
独でまたは混合して使用してよい。使用するリン源に
は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二
カリウム、または相当のナトリウム塩が含まれる。さら
に培地には、増殖に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシ
ウムまたは硫酸鉄も含まれなければならない。最後に、
増殖に必要な物質、例えばアミノ酸およびビタミンを前
記物質に追加して使用してもよい。さらに、好適な先駆
物質を培地に添加してもよい。前記物質は、培養中に単
バッチの形でまたは適当な手段で添加できる。
【００３８】水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アン
モニアまたはアンモニア水のような塩基化合物、あるい
はリン酸または硫酸のような酸化合物を適当な手段で添
加し、培地のｐＨを調整してよい。脂肪酸ポリグリコー
ルエステルのような消泡剤を、泡の形成を調整するため
に添加してよい。抗生物質のような好適な選択的活性物
質を、プラスミドの安定を維持するために培地に添加し
てもよい。酸素または酸素含有気体混合物、例えば空気
を培地に供給し、好気条件を維持してもよい。培養温度
は通常２０〜４５℃、有利に２５〜４０℃である。培養
を、最高量のＬ−スレオニンが形成されるまで継続す
る。最高量に達するには通常１０〜１６０時間を要す
る。
モニアまたはアンモニア水のような塩基化合物、あるい
はリン酸または硫酸のような酸化合物を適当な手段で添
加し、培地のｐＨを調整してよい。脂肪酸ポリグリコー
ルエステルのような消泡剤を、泡の形成を調整するため
に添加してよい。抗生物質のような好適な選択的活性物
質を、プラスミドの安定を維持するために培地に添加し
てもよい。酸素または酸素含有気体混合物、例えば空気
を培地に供給し、好気条件を維持してもよい。培養温度
は通常２０〜４５℃、有利に２５〜４０℃である。培養
を、最高量のＬ−スレオニンが形成されるまで継続す
る。最高量に達するには通常１０〜１６０時間を要す
る。
【００３９】Ｌ−スレオニンの分析を、Spackman等の文
献（Analytical Chemistry、30、（1958）、1190）の記
載のように、ニンヒドリン誘導による陰イオン交換クロ
マトグラフィーで実施してもよく、Lindroth等の文献
（Analytical Chemistry（1979）51：1167〜1174）の記
載のように逆相ＨＰＬＣで実施してもよい。
献（Analytical Chemistry、30、（1958）、1190）の記
載のように、ニンヒドリン誘導による陰イオン交換クロ
マトグラフィーで実施してもよく、Lindroth等の文献
（Analytical Chemistry（1979）51：1167〜1174）の記
載のように逆相ＨＰＬＣで実施してもよい。
【００４０】以下の微生物は、ブタペスト条約に基づい
てGerman Collection for Microorganisms and Cell Cu
ltures（DSMZ, Brunswick, Germany）に寄託されてい
る。
てGerman Collection for Microorganisms and Cell Cu
ltures（DSMZ, Brunswick, Germany）に寄託されてい
る。
【００４１】・ ＤＳＭ１２８４０として寄託されたブ
レビバクテリウム フラバム株 ＤＭ３６８−２ ｐＺ
１ｔｈｒＥ ・ ＤＳＭ１２８３９として寄託されたエシェリキア
コリ（Escherichia coli）株 ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ０
０４０
レビバクテリウム フラバム株 ＤＭ３６８−２ ｐＺ
１ｔｈｒＥ ・ ＤＳＭ１２８３９として寄託されたエシェリキア
コリ（Escherichia coli）株 ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ０
０４０
【００４２】
【実施例】本発明を実施例により、図例を交えながら詳
細に説明する。
細に説明する。
【００４３】あらゆる制限技術、クレノウおよびアルカ
リホスファターゼ処理と同様に、エシェリキア コリか
らのプラスミドＤＮＡの単離を、Sambrook等の書物（Mo
lecular cloning. A laboratory manual（1989）Cold S
pring Harbour Laboratory Press）に従って実施した。
特別に記載しない限り、Chung等の記載（Proceedingof
the Natioal Academy of the Science of United State
s of America USA（1989）86：2172〜2175）に従って、
エシェリキア コリを形質転換させた。
リホスファターゼ処理と同様に、エシェリキア コリか
らのプラスミドＤＮＡの単離を、Sambrook等の書物（Mo
lecular cloning. A laboratory manual（1989）Cold S
pring Harbour Laboratory Press）に従って実施した。
特別に記載しない限り、Chung等の記載（Proceedingof
the Natioal Academy of the Science of United State
s of America USA（1989）86：2172〜2175）に従って、
エシェリキア コリを形質転換させた。
【００４４】例１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５
２のｔｈｒＥ遺伝子のクローニングと配列決定 １. トランスポゾンによる突然変異誘発と突然変異体
の選択 コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２
ΔｉｌｖＡ株を、配列が登録番号Ｕ５３５８７としてNa
tional Center for Biotechnology Information（Bethe
sda、USA）のヌクレオチドデータバンクに管理されてい
るトランスポゾンＴｎ５５３１によって、突然変異を誘
発した。Schaefer等の文献（Gene（1994）145：69〜7
3）に記載される遺伝子交換システムを用いて、コリネ
バクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２のｉ
ｌｖＡ遺伝子に欠失箇所を生じさせた。この際、欠失さ
せるのに、Sahm等によって構築された不活化ベクター
（inactivation vector）ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉ
ｌｖＡ（Applied and Environmental Microbiology（19
99）65：1973〜1979）を使用した。ストラタジーン社
（Heidelberg、Germany）製のメチラーゼ−欠損エシェ
リキア コリ株ＳＣＳ１１０（Jerpseth and Kretz、ST
RATEGIES、molecular biology 6、22，（1993））を、
最初に、ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡ
２００ｎｇを用いて形質転換した。形質転換体を、その
カナマイシン耐性を利用して、カナマイシン５０μｇ／
ｍｌを含有するＬＢ寒天培地プレート上で同定した。プ
ラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡを、１個の
形質転換体から製造した。この不活化プラスミドを、次
いで、エレクトロポレーションにより、コリネバクテリ
ウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２株に導入した
（Haynes等、FEMS MicrobiologyLetters（1989）61：32
9〜334）。不活化ベクターがゲノム中に組み込まれて存
在するクローンを、そのカナマイシン耐性を利用して、
カナマイシン１５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳ寒天
培地プレート上で同定した（Liebl等、FEMS Microbiolo
gy Letters（1989）65：299〜304）。ベクターの除去を
選択するために、カナマイシン−耐性クローンを、スク
ロース含有ＬＢＧ培地（寒天１５ｇ／Ｌ、グルコース２
％およびスクロース１０％を含有するＬＢ培地）上で培
養した。このようにして得られたコロニーは、２度目の
組み換えによりベクターを再び消失した（Jaeger等、Jo
urnal of Bacteriology（1992）174：5462〜5465）。Ｌ
−イソロイシン３００ｍｇ／Ｌを含有するか、含有しな
い、さらにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するか、
含有しない最小培地プレート（寒天１５ｇ／Ｌを含むＣ
ＧＸＩＩ培地（Keilhauer等、Journal of Bacteriology
（1993）175：5595〜5603））上にヘテロ接種（hetero
inoculation）することにより、ベクターが消失してカ
ナマイシン感受性かつイソロイシン要求性となり、さら
にゲノム中に不完全なｉｌｖＡ−Ｇｅｎ（ｉｌｖＡ対立
遺伝子）しか有さない６個のクローンを単離した。これ
らのクローンの１つをＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡ株
とし、トランスポゾン突然変異誘発に使用した。
２のｔｈｒＥ遺伝子のクローニングと配列決定 １. トランスポゾンによる突然変異誘発と突然変異体
の選択 コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２
ΔｉｌｖＡ株を、配列が登録番号Ｕ５３５８７としてNa
tional Center for Biotechnology Information（Bethe
sda、USA）のヌクレオチドデータバンクに管理されてい
るトランスポゾンＴｎ５５３１によって、突然変異を誘
発した。Schaefer等の文献（Gene（1994）145：69〜7
3）に記載される遺伝子交換システムを用いて、コリネ
バクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２のｉ
ｌｖＡ遺伝子に欠失箇所を生じさせた。この際、欠失さ
せるのに、Sahm等によって構築された不活化ベクター
（inactivation vector）ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉ
ｌｖＡ（Applied and Environmental Microbiology（19
99）65：1973〜1979）を使用した。ストラタジーン社
（Heidelberg、Germany）製のメチラーゼ−欠損エシェ
リキア コリ株ＳＣＳ１１０（Jerpseth and Kretz、ST
RATEGIES、molecular biology 6、22，（1993））を、
最初に、ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡ
２００ｎｇを用いて形質転換した。形質転換体を、その
カナマイシン耐性を利用して、カナマイシン５０μｇ／
ｍｌを含有するＬＢ寒天培地プレート上で同定した。プ
ラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡを、１個の
形質転換体から製造した。この不活化プラスミドを、次
いで、エレクトロポレーションにより、コリネバクテリ
ウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２株に導入した
（Haynes等、FEMS MicrobiologyLetters（1989）61：32
9〜334）。不活化ベクターがゲノム中に組み込まれて存
在するクローンを、そのカナマイシン耐性を利用して、
カナマイシン１５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳ寒天
培地プレート上で同定した（Liebl等、FEMS Microbiolo
gy Letters（1989）65：299〜304）。ベクターの除去を
選択するために、カナマイシン−耐性クローンを、スク
ロース含有ＬＢＧ培地（寒天１５ｇ／Ｌ、グルコース２
％およびスクロース１０％を含有するＬＢ培地）上で培
養した。このようにして得られたコロニーは、２度目の
組み換えによりベクターを再び消失した（Jaeger等、Jo
urnal of Bacteriology（1992）174：5462〜5465）。Ｌ
−イソロイシン３００ｍｇ／Ｌを含有するか、含有しな
い、さらにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するか、
含有しない最小培地プレート（寒天１５ｇ／Ｌを含むＣ
ＧＸＩＩ培地（Keilhauer等、Journal of Bacteriology
（1993）175：5595〜5603））上にヘテロ接種（hetero
inoculation）することにより、ベクターが消失してカ
ナマイシン感受性かつイソロイシン要求性となり、さら
にゲノム中に不完全なｉｌｖＡ−Ｇｅｎ（ｉｌｖＡ対立
遺伝子）しか有さない６個のクローンを単離した。これ
らのクローンの１つをＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡ株
とし、トランスポゾン突然変異誘発に使用した。
【００４５】トランスポゾンＴｎ５５３１をも含有する
プラスミドｐＣＧＬ００４０（Ankri等、Journal of Ba
cteriology（1996）178：4412〜4419）を、メチラーゼ
−欠損エシェリキア コリ ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００
４０株から単離した（E.ColiGM2929: Palmer等、Gene
（1994）143：1〜12）。コリネバクテリウム グルタミ
カム ＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡ株を、プラスミド
ｐＣＧＬ００４０を用いてエレクトロポレーションによ
り形質転換した（Haynes等、FEMS Microbiology Letter
s（1989）61：329〜334）。トランスポゾンＴｎ５５３
１をゲノム中に取り込んでいるクローンを、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌを
含有するＬＢＨＩＳ寒天培地プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（1989）65：299〜3
04）。このようにして２０００個のクローンを獲得し、
それらのクローンは、スレオニル−スレオニル−スレオ
ニンの存在下に増殖が遅延することが確認された。この
目的のために、全てのクローンを、個別に、スレオニル
−スレオニル−スレオニン２ｍＭを含有するおよび含有
しないＣＧＸＩＩ最小寒天培地プレートに移動した。培
地は、Keilhauer等の記載（Journal of Bacteriology
（1993）175：5593〜5603）のＣＧＸＩＩ培地と同一で
あるが、ただし、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、Ｌ−イ
ソロイシン３００ｍｇ／ｌおよび寒天１５ｇ／ｌを付加
的に含有する。Keilhauer等の記載する培地の組成は表
１の通りである。
プラスミドｐＣＧＬ００４０（Ankri等、Journal of Ba
cteriology（1996）178：4412〜4419）を、メチラーゼ
−欠損エシェリキア コリ ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００
４０株から単離した（E.ColiGM2929: Palmer等、Gene
（1994）143：1〜12）。コリネバクテリウム グルタミ
カム ＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡ株を、プラスミド
ｐＣＧＬ００４０を用いてエレクトロポレーションによ
り形質転換した（Haynes等、FEMS Microbiology Letter
s（1989）61：329〜334）。トランスポゾンＴｎ５５３
１をゲノム中に取り込んでいるクローンを、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌを
含有するＬＢＨＩＳ寒天培地プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（1989）65：299〜3
04）。このようにして２０００個のクローンを獲得し、
それらのクローンは、スレオニル−スレオニル−スレオ
ニンの存在下に増殖が遅延することが確認された。この
目的のために、全てのクローンを、個別に、スレオニル
−スレオニル−スレオニン２ｍＭを含有するおよび含有
しないＣＧＸＩＩ最小寒天培地プレートに移動した。培
地は、Keilhauer等の記載（Journal of Bacteriology
（1993）175：5593〜5603）のＣＧＸＩＩ培地と同一で
あるが、ただし、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、Ｌ−イ
ソロイシン３００ｍｇ／ｌおよび寒天１５ｇ／ｌを付加
的に含有する。Keilhauer等の記載する培地の組成は表
１の通りである。
【００４６】
【表１】
【００４７】寒天培地プレートを３０℃でインキュベー
トし、１２，１８および２４時間後の増殖を調べた。ス
レオニル−スレオニル−スレオニンを含まない場合に
は、元のコリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１
４７５２ΔｉｌｖＡ株と同程度に増殖するが、スレオニ
ル−スレオニル−スレオニン２ｍＭの存在下では、増殖
が遅延するようなトランスポゾン突然変異体が獲得され
た。
トし、１２，１８および２４時間後の増殖を調べた。ス
レオニル−スレオニル−スレオニンを含まない場合に
は、元のコリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１
４７５２ΔｉｌｖＡ株と同程度に増殖するが、スレオニ
ル−スレオニル−スレオニン２ｍＭの存在下では、増殖
が遅延するようなトランスポゾン突然変異体が獲得され
た。
【００４８】これを、ＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡｔ
ｈｒＥ：：Ｔｎ５５３１とした。
ｈｒＥ：：Ｔｎ５５３１とした。
【００４９】２. ＡＴＣＣ１４７５２ΔｉｌｖＡｔｈ
ｒＥ：：Ｔｎ５５３１中のＴｎ５５３１挿入部位のクロ
ーニングと配列決定 例１.１に記載される突然変異体中のトランスポゾンＴ
ｎ５５３１の上流に位置する挿入部位をクローニングす
るために、この突然変異株の染色体ＤＮＡを、まず、Sc
hwarzer等の記載（Bio/Technology（1990）9：84〜87）
に従って単離し、後半部分の４００ｎｇを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩで切断した。制限挿入部の全体
を、Roche Diagnostics社（Mnnheim、Germany）製のＥ
ｃｏＲＩで同様にして直鎖にしたベクターｐＵＣ１８
（Norander等、Gene（1983）26：101〜106）と結合させ
た。エシェリキア コリＤＨ５α−ｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National Academy of science
s of the United States of America USA（1990）87：4
645〜4649）を、結合挿入部全体を用いたエレクトロポ
レーションにより、形質転換させた（Dower等、Nucleic
Acid Research（1988）16：6127〜6145）。トランスポ
ゾンＴｎ５５３１の挿入部位がベクターｐＵＣ１８上に
クローン化されて存在する形質転換体を、そのカルベニ
シリン耐性およびカナマイシン耐性を利用して、カルベ
ニシリン５０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／
ｍｌを含有するＬＢ−寒天培地プレート上で同定した。
プラスミドを、３個の形質転換体から製造し、クローン
化された挿入部の大きさを制限分析により測定した。あ
るプラスミドの挿入部位のヌクレオチド配列は、Sanger
等のジデオキシターミネーション法（Proceedings of t
he National Academy of Sciences of the United Stat
es of America USA（1977）74：5463〜5467）から、約
５.７ｋｂ長さの挿入部であることが分かった。この
際、挿入部の２.２ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチド
プライマー：５’−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＣＣＧ
ＣＴ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＧ−３’を起点に配列決定し
た。
ｒＥ：：Ｔｎ５５３１中のＴｎ５５３１挿入部位のクロ
ーニングと配列決定 例１.１に記載される突然変異体中のトランスポゾンＴ
ｎ５５３１の上流に位置する挿入部位をクローニングす
るために、この突然変異株の染色体ＤＮＡを、まず、Sc
hwarzer等の記載（Bio/Technology（1990）9：84〜87）
に従って単離し、後半部分の４００ｎｇを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩで切断した。制限挿入部の全体
を、Roche Diagnostics社（Mnnheim、Germany）製のＥ
ｃｏＲＩで同様にして直鎖にしたベクターｐＵＣ１８
（Norander等、Gene（1983）26：101〜106）と結合させ
た。エシェリキア コリＤＨ５α−ｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National Academy of science
s of the United States of America USA（1990）87：4
645〜4649）を、結合挿入部全体を用いたエレクトロポ
レーションにより、形質転換させた（Dower等、Nucleic
Acid Research（1988）16：6127〜6145）。トランスポ
ゾンＴｎ５５３１の挿入部位がベクターｐＵＣ１８上に
クローン化されて存在する形質転換体を、そのカルベニ
シリン耐性およびカナマイシン耐性を利用して、カルベ
ニシリン５０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／
ｍｌを含有するＬＢ−寒天培地プレート上で同定した。
プラスミドを、３個の形質転換体から製造し、クローン
化された挿入部の大きさを制限分析により測定した。あ
るプラスミドの挿入部位のヌクレオチド配列は、Sanger
等のジデオキシターミネーション法（Proceedings of t
he National Academy of Sciences of the United Stat
es of America USA（1977）74：5463〜5467）から、約
５.７ｋｂ長さの挿入部であることが分かった。この
際、挿入部の２.２ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチド
プライマー：５’−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＣＣＧ
ＣＴ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＧ−３’を起点に配列決定し
た。
【００５０】トランスポゾンの下流に位置する挿入部位
を同定するために、突然変異体の染色体ＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼＸｂａＩで切断し、ＸｂａＩで直鎖に
したベクターｐＵＣ１８中で結合させた。前記と同様に
クローニングを実施した。あるプラスミドの挿入部位の
ヌクレオチド配列は、Sanger等のジデオキシターミネー
ション法（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA（197
7）74：5463〜5467）から、約８.５ｋｂ長さの挿入部で
あることが分かった。この際、挿入部の０.６５ｋｂ
を、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＧ
Ｇ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧ−
３’を起点に配列決定した。
を同定するために、突然変異体の染色体ＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼＸｂａＩで切断し、ＸｂａＩで直鎖に
したベクターｐＵＣ１８中で結合させた。前記と同様に
クローニングを実施した。あるプラスミドの挿入部位の
ヌクレオチド配列は、Sanger等のジデオキシターミネー
ション法（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA（197
7）74：5463〜5467）から、約８.５ｋｂ長さの挿入部で
あることが分かった。この際、挿入部の０.６５ｋｂ
を、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＧ
Ｇ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧ−
３’を起点に配列決定した。
【００５１】得られたヌクレオチド配列を分析し、プロ
グラムパッケージレーザージーン（Program package La
sergene、Biocomputing software for Windows、DNASTA
R、Madison、USA）で連結させた。このヌクレオチド配
列を配列番号１として再度製造した。分析により、１４
６７ｂｐ長さの読みとり枠が同定された。相当する遺伝
子を、ｔｈｒＥ遺伝子とした。関連遺伝子産物は、４８
９アミノ酸を有し、配列番号２として再度製造した。
グラムパッケージレーザージーン（Program package La
sergene、Biocomputing software for Windows、DNASTA
R、Madison、USA）で連結させた。このヌクレオチド配
列を配列番号１として再度製造した。分析により、１４
６７ｂｐ長さの読みとり枠が同定された。相当する遺伝
子を、ｔｈｒＥ遺伝子とした。関連遺伝子産物は、４８
９アミノ酸を有し、配列番号２として再度製造した。
【００５２】例２ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３
２からの遺伝子ｔｈｒＥのクローニングと配列決定 遺伝子ｔｈｒＥを、エシェリキア コリ クローニング
ベクターｐＵＣ１８中でクローン化した（Norrander
等、Gene（1983）26：101〜106，Roche Diagnostics、M
annheim、Germany）。クローニングは２工程で実施し
た。最初に、コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴ
ＣＣ１３０３２を、配列番号１由来のオリゴヌクレオチ
ドプライマー：ＴｈｒＥ−順向
２からの遺伝子ｔｈｒＥのクローニングと配列決定 遺伝子ｔｈｒＥを、エシェリキア コリ クローニング
ベクターｐＵＣ１８中でクローン化した（Norrander
等、Gene（1983）26：101〜106，Roche Diagnostics、M
annheim、Germany）。クローニングは２工程で実施し
た。最初に、コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴ
ＣＣ１３０３２を、配列番号１由来のオリゴヌクレオチ
ドプライマー：ＴｈｒＥ−順向
【００５３】
【外１】
【００５４】ＴｈｒＥ−逆向
【００５５】
【外２】
【００５６】を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により増幅した。ＰＣＲ反応を、デオキシヌクレオ
チド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）２００μＭ、それぞれ相応のオリゴヌクレオチド１
μＭ、コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１
３０３２由来の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０倍の反応
バッファー１／１０容量および熱−安定Ｔａｑ−／Ｐｗ
ｏ−ＤＮＡポリメラーゼ混合物２.６単位（Roche Diagn
ostics社製Expand High Fidelity PCR System、Mnnhei
m、Germany）の存在下に、熱循環装置（PTC-100、MJ Re
search Inc.、Watertown、USA）中で、以下の条件下に
実施した：９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で
２分。
Ｒ）により増幅した。ＰＣＲ反応を、デオキシヌクレオ
チド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）２００μＭ、それぞれ相応のオリゴヌクレオチド１
μＭ、コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１
３０３２由来の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０倍の反応
バッファー１／１０容量および熱−安定Ｔａｑ−／Ｐｗ
ｏ−ＤＮＡポリメラーゼ混合物２.６単位（Roche Diagn
ostics社製Expand High Fidelity PCR System、Mnnhei
m、Germany）の存在下に、熱循環装置（PTC-100、MJ Re
search Inc.、Watertown、USA）中で、以下の条件下に
実施した：９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で
２分。
【００５７】次に、増幅された約１.９ｋｂ長さの断片
を、使用説明書通りにSureClone Ligation Kit（Amersh
am Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden）を用いて、
ベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に結合させた。
エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant等、Pro
ceedings of the National Academy of Sciences of th
e United States of America、USA（1990）87：4645〜4
649）を、結合挿入部位全体を使用して形質転換させ
た。形質転換体を、そのカルベニシリン耐性を利用し、
カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地
プレート上で同定した。プラスミドを、８個の形質転換
体から製造し、挿入部位である１.９ｋｂのＰＣＲ断片
の存在を、制限分析により調べた。得られた組み換えプ
ラスミドを、ｐＵＣ１８ｔｈｒＥとする。
を、使用説明書通りにSureClone Ligation Kit（Amersh
am Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden）を用いて、
ベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に結合させた。
エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant等、Pro
ceedings of the National Academy of Sciences of th
e United States of America、USA（1990）87：4645〜4
649）を、結合挿入部位全体を使用して形質転換させ
た。形質転換体を、そのカルベニシリン耐性を利用し、
カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地
プレート上で同定した。プラスミドを、８個の形質転換
体から製造し、挿入部位である１.９ｋｂのＰＣＲ断片
の存在を、制限分析により調べた。得られた組み換えプ
ラスミドを、ｐＵＣ１８ｔｈｒＥとする。
【００５８】プラスミドｐＵＣ１８ｔｈｒＥ中の１.９
ｋｂのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、Sanger等のデ
オキシチェーンターミネーション法（Proceedings of t
he National Academy of Scicence of the United Stat
es of America USA（1977）74：5463〜5467）により決
定した。この際、ｐＵＣ１８ｔｈｒＥの完全な挿入部
を、Roche Diagnostics社（Mannheim、Germany）製の以
下のプライマーを用いて配列決定した。
ｋｂのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、Sanger等のデ
オキシチェーンターミネーション法（Proceedings of t
he National Academy of Scicence of the United Stat
es of America USA（1977）74：5463〜5467）により決
定した。この際、ｐＵＣ１８ｔｈｒＥの完全な挿入部
を、Roche Diagnostics社（Mannheim、Germany）製の以
下のプライマーを用いて配列決定した。
【００５９】 プライマー−順向： ５’−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴ−３’ プライマー−逆向： ５’−ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ Ｇ−３’ ヌクレオチド配列を配列番号３として、再度製造した。
含まれるヌクレオチド配列をプログラムパッケージレー
ザージーン（Biocomputing Software for Windows、DNA
STAR、Madison、USA）を用いて分析した。分析から、ｔ
ｈｒＥ遺伝子と見なされる、１４６７ｂｐ長さの読みと
り枠が同定された。これは、４８９アミノ酸から成るペ
プチドをコードしており、配列番号４として再度製造し
た。
含まれるヌクレオチド配列をプログラムパッケージレー
ザージーン（Biocomputing Software for Windows、DNA
STAR、Madison、USA）を用いて分析した。分析から、ｔ
ｈｒＥ遺伝子と見なされる、１４６７ｂｐ長さの読みと
り枠が同定された。これは、４８９アミノ酸から成るペ
プチドをコードしており、配列番号４として再度製造し
た。
【００６０】例３ コリネバクテリウム グルタミカムにおけるｔｈｒＥ遺
伝子の発現 例２に記載したコリネバクテリウム グルタミカム Ａ
ＴＣＣ１３０３２由来ｔｈｒＥ遺伝子を、ベクターｐＺ
１（Menkel等、Applied and Environmental Microbiolo
gy（1989）64：549〜554）中で発現させるためにクロー
ン化した。この際、ｔｈｒＥ遺伝子を含む１８８１ｂｐ
長さのＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩ
を使用して、プラスミドｐＵＣ１８ｔｈｒＥから切り出
した。この断片の５’−および３’−末端をクレノウ酵
素で処理した。得られたＤＮＡ断片を、ＳａｃＩで予め
直鎖にし、脱リン酸化したベクターｐＺ１中で連結させ
た。エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National Academy of Science
s of the United States of America USA（1990）87：4
645〜4649）を、結合部全体を用いて形質転換した。形
質転換体を、そのカナマイシン耐性を利用して、カナマ
イシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地プレート
上で同定した。プラスミドを、２個の形質転換体から製
造し、挿入部である１８８１ｂｐのＳｃａＩ／ＸｂａＩ
断片の存在を、制限分析により確認した。このようにし
て製造した組み換えプラスミドをｐＺ１ｔｈｒＥとする
（図２）。
伝子の発現 例２に記載したコリネバクテリウム グルタミカム Ａ
ＴＣＣ１３０３２由来ｔｈｒＥ遺伝子を、ベクターｐＺ
１（Menkel等、Applied and Environmental Microbiolo
gy（1989）64：549〜554）中で発現させるためにクロー
ン化した。この際、ｔｈｒＥ遺伝子を含む１８８１ｂｐ
長さのＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩ
を使用して、プラスミドｐＵＣ１８ｔｈｒＥから切り出
した。この断片の５’−および３’−末端をクレノウ酵
素で処理した。得られたＤＮＡ断片を、ＳａｃＩで予め
直鎖にし、脱リン酸化したベクターｐＺ１中で連結させ
た。エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National Academy of Science
s of the United States of America USA（1990）87：4
645〜4649）を、結合部全体を用いて形質転換した。形
質転換体を、そのカナマイシン耐性を利用して、カナマ
イシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地プレート
上で同定した。プラスミドを、２個の形質転換体から製
造し、挿入部である１８８１ｂｐのＳｃａＩ／ＸｂａＩ
断片の存在を、制限分析により確認した。このようにし
て製造した組み換えプラスミドをｐＺ１ｔｈｒＥとする
（図２）。
【００６１】プラスミドｐＺ１およびｐＺ１ｔｈｒＥ
を、エレクトロポレーション（Haynes等、FEMS Microbi
ology Letters（1989）61：329〜334）により、スレオ
ニン−形成株である、ブレビバクテリウム フラバム
ＤＭ３６８−２に組み込んだ。ＤＭ３６８−２株は、Ｅ
Ｐ−Ｂ−０３８５９４０に記載されており、ＤＳＭ５３
９９として保存管理される。形質転換体を、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌを
含有するＬＢＨＩＳ寒天培地プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters （1989）65：299〜
304）。このようにして、ブレビバクテリウム フラバ
ムのＤＭ３６８−２ｐＺ１株およびＤＭ３６８−２ｐＺ
１ｔｈｒＥ株を得た。
を、エレクトロポレーション（Haynes等、FEMS Microbi
ology Letters（1989）61：329〜334）により、スレオ
ニン−形成株である、ブレビバクテリウム フラバム
ＤＭ３６８−２に組み込んだ。ＤＭ３６８−２株は、Ｅ
Ｐ−Ｂ−０３８５９４０に記載されており、ＤＳＭ５３
９９として保存管理される。形質転換体を、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌを
含有するＬＢＨＩＳ寒天培地プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters （1989）65：299〜
304）。このようにして、ブレビバクテリウム フラバ
ムのＤＭ３６８−２ｐＺ１株およびＤＭ３６８−２ｐＺ
１ｔｈｒＥ株を得た。
【００６２】例５ ブレビバクテリウム フラバムによるＬ−スレオニンの
製造 スレオニンの形成を調べるために、ブレビバクテリウム
フラバム ＤＭ３６８−２ｐＺ１株およびＤＭ３６８
−２ｐＺ１ｔｈｒＥ株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
を含有する脳−心臓浸出物培地（Difco Laboratories、
Detroit、USA）１００ｍｌ中で、３０℃で１４時間プレ
インキュベートした。次いで、０.９％（Ｗ／Ｖ）濃度
の塩化ナトリウム溶液で、細胞を１回洗浄し、ＣｇＸＩ
Ｉ培地６０ｍｌにこの懸濁液を接種したところ、ＯＤ
600（６００ｎｍでの光学濃度）は０.５であった。培地
は、Keilhauer等の培地（Journal of Bacteriology（19
93）175：5593〜5603）と同一であるが、カナマイシン
５０μｇ／ｍｌを付加的に含有している。いずれの株も
３０℃で７２時間培養した。０、２４、４８および７２
時間後のサンプルを採取し、細胞を速やかに遠心分離し
た（Heraeus社（Osterode、Germany）製Biofuge pico
により、１３０００ＲＰＭで５分間）。
製造 スレオニンの形成を調べるために、ブレビバクテリウム
フラバム ＤＭ３６８−２ｐＺ１株およびＤＭ３６８
−２ｐＺ１ｔｈｒＥ株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
を含有する脳−心臓浸出物培地（Difco Laboratories、
Detroit、USA）１００ｍｌ中で、３０℃で１４時間プレ
インキュベートした。次いで、０.９％（Ｗ／Ｖ）濃度
の塩化ナトリウム溶液で、細胞を１回洗浄し、ＣｇＸＩ
Ｉ培地６０ｍｌにこの懸濁液を接種したところ、ＯＤ
600（６００ｎｍでの光学濃度）は０.５であった。培地
は、Keilhauer等の培地（Journal of Bacteriology（19
93）175：5593〜5603）と同一であるが、カナマイシン
５０μｇ／ｍｌを付加的に含有している。いずれの株も
３０℃で７２時間培養した。０、２４、４８および７２
時間後のサンプルを採取し、細胞を速やかに遠心分離し
た（Heraeus社（Osterode、Germany）製Biofuge pico
により、１３０００ＲＰＭで５分間）。
【００６３】培養上清中の細胞外アミノ酸濃度の定量的
測定を、逆相ＨＰＬＣ（Lindeoth等、Analytical chemi
stry（1979）51：1167〜1174）により実施した。蛍光検
出器（Ｇ１３２１Ａ）の装備されたＨＰ１１００シリー
ズのＨＰＬＣ装置（Hewlett-Packard、Waldbronn、Germ
any）を使用した；このシステムの作動およびデータ評
価を、ＨＰーＣｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ（Hewlett-Pack
ard）を用いて実施した。分析するアミノ酸溶液１μｌ
を、自動予備カラム誘導工程（automatic preliminary
column derivatisaton step）中でｏ−フタルアルデヒ
ド／２−メルカプトエタノール試薬（Pierce Europe B
V、Oud-Beijerland、Netherlands）２０μｌと混合し
た。
測定を、逆相ＨＰＬＣ（Lindeoth等、Analytical chemi
stry（1979）51：1167〜1174）により実施した。蛍光検
出器（Ｇ１３２１Ａ）の装備されたＨＰ１１００シリー
ズのＨＰＬＣ装置（Hewlett-Packard、Waldbronn、Germ
any）を使用した；このシステムの作動およびデータ評
価を、ＨＰーＣｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ（Hewlett-Pack
ard）を用いて実施した。分析するアミノ酸溶液１μｌ
を、自動予備カラム誘導工程（automatic preliminary
column derivatisaton step）中でｏ−フタルアルデヒ
ド／２−メルカプトエタノール試薬（Pierce Europe B
V、Oud-Beijerland、Netherlands）２０μｌと混合し
た。
【００６４】得られた蛍光を発するチオ置換イソインド
ール（Jones等、Journal of Chromatography（1983）26
6：471〜482）を、連結した予備カラム（４０×４ｍｍ
Hypersil ODS 5）と主カラム（Hypersil ODS 5、いずれ
のカラムもＣＳ−Chromatographie Service GmbH社製、
Langerwehe、Germany）の中で、非極性相（メタノー
ル）の量を経時的に増加させながら懸濁した。極性溶離
液は酢酸ナトリウム（０.１molar、ｐＨ７.２）であっ
た；流速は０.８ｍｌ／分であった。誘導されたアミノ
酸の蛍光検出を、励起波長２３０ｎｍおよび放射波長４
５０ｎｍで実施した。アミノ酸濃度を、外標準および付
加的な内標準であるアスパラギンと比較して算出した。
ール（Jones等、Journal of Chromatography（1983）26
6：471〜482）を、連結した予備カラム（４０×４ｍｍ
Hypersil ODS 5）と主カラム（Hypersil ODS 5、いずれ
のカラムもＣＳ−Chromatographie Service GmbH社製、
Langerwehe、Germany）の中で、非極性相（メタノー
ル）の量を経時的に増加させながら懸濁した。極性溶離
液は酢酸ナトリウム（０.１molar、ｐＨ７.２）であっ
た；流速は０.８ｍｌ／分であった。誘導されたアミノ
酸の蛍光検出を、励起波長２３０ｎｍおよび放射波長４
５０ｎｍで実施した。アミノ酸濃度を、外標準および付
加的な内標準であるアスパラギンと比較して算出した。
【００６５】結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】例６ ベクターｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥの製造 １. ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２の構築 エシェリキア コリ グルタミカム シャトルベクター
ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２を、従来技術に従って構築し
た。
ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２を、従来技術に従って構築し
た。
【００６８】ベクターは、複製エフェクターｐｅｒ（Ｕ
Ｓ−Ａ−５１７５１０８；Nesvera等、Journal of Bact
eriology 179、1525〜15322（1997））を有するプラス
ミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐ、プラスミドｐＡＧ１
（ＵＳ−Ａ−５１５８８９１；登録番号ＡＦ１２１００
０としてNational Center for Biotechnology Informat
ion（NCBI、Bethesda、MD、USA）で保存管理される）テ
トラサイクリン耐性−付与ｔｅｔＡ（Ｚ）遺伝子、プラ
スミドｐＭＢ１（Sutcliffe、Cold Spring Harbor Symp
osium on Quantitative Biology 43、77〜90（1979））
の複製領域ｏｒｉＶ、ｌａｃプロモーターと多クローニ
ング部位とを有するｌａｃＺα遺伝子、ｍｃｓ（Norran
der等、Gene 26、101〜106（1983））およびプラスミド
ＲＰ４（Simon等、（1983）Bio/Technology 1：784〜79
1）のｍｏｂ領域を含む。
Ｓ−Ａ−５１７５１０８；Nesvera等、Journal of Bact
eriology 179、1525〜15322（1997））を有するプラス
ミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐ、プラスミドｐＡＧ１
（ＵＳ−Ａ−５１５８８９１；登録番号ＡＦ１２１００
０としてNational Center for Biotechnology Informat
ion（NCBI、Bethesda、MD、USA）で保存管理される）テ
トラサイクリン耐性−付与ｔｅｔＡ（Ｚ）遺伝子、プラ
スミドｐＭＢ１（Sutcliffe、Cold Spring Harbor Symp
osium on Quantitative Biology 43、77〜90（1979））
の複製領域ｏｒｉＶ、ｌａｃプロモーターと多クローニ
ング部位とを有するｌａｃＺα遺伝子、ｍｃｓ（Norran
der等、Gene 26、101〜106（1983））およびプラスミド
ＲＰ４（Simon等、（1983）Bio/Technology 1：784〜79
1）のｍｏｂ領域を含む。
【００６９】構築されたベクターをエシェリキア コリ
ＤＨ５α株（Hanahan、DNA colning、A practical ap
proach vol.I IRL-Press、Oxford、Washington DC、US
A、1985）に形質転換させた。プラスミドを有する細胞
の選択を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌを補足したＬＢ
寒天培地（Sambrook等、Molecular cloning: a laborat
ory manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor laboratory P
ress、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA、1989）上で形
質転換バッチを培養することにより実施した。プラスミ
ドＤＮＡを、Qiagen社製QIAprep Spin Miniprep Kitを
使用して、形質転換体から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限により、アガロース
ゲル電気泳動（０.８％）で確認した。
ＤＨ５α株（Hanahan、DNA colning、A practical ap
proach vol.I IRL-Press、Oxford、Washington DC、US
A、1985）に形質転換させた。プラスミドを有する細胞
の選択を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌを補足したＬＢ
寒天培地（Sambrook等、Molecular cloning: a laborat
ory manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor laboratory P
ress、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA、1989）上で形
質転換バッチを培養することにより実施した。プラスミ
ドＤＮＡを、Qiagen社製QIAprep Spin Miniprep Kitを
使用して、形質転換体から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限により、アガロース
ゲル電気泳動（０.８％）で確認した。
【００７０】プラスミドをｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２と
し、図３に示す。
し、図３に示す。
【００７１】２. ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥの
構築 例２に記載したコリネバクテリウム グルタミカム Ａ
ＴＣＣ１３０３２由来のｔｈｒＥ遺伝子を、ベクターｐ
ＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２中に発現させるためにクローン化
した。この際、ｔｈｒＥ遺伝子を含む１８８１ｂｐ長さ
のＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａｌを用
いてプラスミドｐＵＣ１８ｔｈｒＥから切り出した。得
られたＤＮＡ断片を、予めＳａｃＩおよびＸｂａＩで直
鎖にし、脱リン酸化したベクターｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ
２中で結合させた。エシェリキアコリＤＨ５αｍｃｒ株
（Grant等、Proceedings of the National Academy ofs
ciences of the United States of America USA（199
0）87：4645~4649）を、完全に結合しているバッチを用
いて形質転換した。形質転換体を、そのテトラサイクリ
ン耐性を利用して、テトラサイクリン５μｇ／ｍｌを含
有するＬＢ寒天培地プレート上で同定した。プラスミド
を、２個の形質転換体から製造し、挿入部である１８８
１ｂｐのＳｃａＩ／ＸｂａＩ断片の存在を、制限分析に
より確認した。このようにして得られたプラスミドをｐ
ＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥ（図４）とする。
構築 例２に記載したコリネバクテリウム グルタミカム Ａ
ＴＣＣ１３０３２由来のｔｈｒＥ遺伝子を、ベクターｐ
ＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２中に発現させるためにクローン化
した。この際、ｔｈｒＥ遺伝子を含む１８８１ｂｐ長さ
のＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａｌを用
いてプラスミドｐＵＣ１８ｔｈｒＥから切り出した。得
られたＤＮＡ断片を、予めＳａｃＩおよびＸｂａＩで直
鎖にし、脱リン酸化したベクターｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ
２中で結合させた。エシェリキアコリＤＨ５αｍｃｒ株
（Grant等、Proceedings of the National Academy ofs
ciences of the United States of America USA（199
0）87：4645~4649）を、完全に結合しているバッチを用
いて形質転換した。形質転換体を、そのテトラサイクリ
ン耐性を利用して、テトラサイクリン５μｇ／ｍｌを含
有するＬＢ寒天培地プレート上で同定した。プラスミド
を、２個の形質転換体から製造し、挿入部である１８８
１ｂｐのＳｃａＩ／ＸｂａＩ断片の存在を、制限分析に
より確認した。このようにして得られたプラスミドをｐ
ＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥ（図４）とする。
【００７２】プラスミドｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２および
ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥを、エレクトロポレー
ション（Haynes等、FEMS Microbiology Letters（198
9）61：329〜334）により、スレオニン形成コリネバク
テリウム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１７
株（Reinscheid等、Applied and Environmental Microb
iology（1994）60：126〜132）中に導入した。形質転換
体を、そのテトラサイクリン耐性およびカナマイシン耐
性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌおよびテト
ラサイクリン５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳ寒天培
地プレート（Liebl等、FEMS Microbiology Letters（19
89）65：299〜304）上で同定した。このようにして、コ
リネバクテリウム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−
ＤＲ１７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２株およびＭＨ２０−
２２Ｂ−ＤＲ１７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥを
得た。
ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥを、エレクトロポレー
ション（Haynes等、FEMS Microbiology Letters（198
9）61：329〜334）により、スレオニン形成コリネバク
テリウム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１７
株（Reinscheid等、Applied and Environmental Microb
iology（1994）60：126〜132）中に導入した。形質転換
体を、そのテトラサイクリン耐性およびカナマイシン耐
性を利用して、カナマイシン１５μｇ／ｍｌおよびテト
ラサイクリン５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳ寒天培
地プレート（Liebl等、FEMS Microbiology Letters（19
89）65：299〜304）上で同定した。このようにして、コ
リネバクテリウム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−
ＤＲ１７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２株およびＭＨ２０−
２２Ｂ−ＤＲ１７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥを
得た。
【００７３】例７ コリネバクテリウム グルタミカムによるＬ−スレオニ
ンの製造 そのスレオニン形成を調べるために、コリネバクテリウ
ム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１７／ｐＥ
Ｃ−Ｔ１８ｍｏｂ２株およびＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１
７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥ株を、カナマイシ
ン２５μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリン５μｇ／ｍｌ
を含有する脳−心臓浸出物培地（DifcoLaboratories、D
etroit、USA）１００ｍｌ中で、３０℃で１４時間プレ
インキュベートした。次いで、細胞を０.９％（Ｗ／
Ｖ）濃度の塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、ＣｇＸＩ
Ｉ培地６０ｍｌにこの懸濁液を接種したところ、ＯＤ
600（６００ｎｍでの光学濃度）は、０.５であった。培
地は、Keilhauer等の記載（Journal of Bacteriology
（1993）175：5593〜5603）と同一であるが、付加的
に、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリ
ン５μｇ／ｍｌを含有する。いずれの株も３０℃で７２
時間培養した。０、２４、４８および７２時間後にサン
プルを採取し、細胞を速やかに遠心分離した（Heraus
（Osterode、Germany）社製Biofuge pico centrifugeを
用いて１３００ＲＰＭで５分間）。
ンの製造 そのスレオニン形成を調べるために、コリネバクテリウ
ム グルタミカム ＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１７／ｐＥ
Ｃ−Ｔ１８ｍｏｂ２株およびＭＨ２０−２２Ｂ−ＤＲ１
７／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥ株を、カナマイシ
ン２５μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリン５μｇ／ｍｌ
を含有する脳−心臓浸出物培地（DifcoLaboratories、D
etroit、USA）１００ｍｌ中で、３０℃で１４時間プレ
インキュベートした。次いで、細胞を０.９％（Ｗ／
Ｖ）濃度の塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、ＣｇＸＩ
Ｉ培地６０ｍｌにこの懸濁液を接種したところ、ＯＤ
600（６００ｎｍでの光学濃度）は、０.５であった。培
地は、Keilhauer等の記載（Journal of Bacteriology
（1993）175：5593〜5603）と同一であるが、付加的
に、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリ
ン５μｇ／ｍｌを含有する。いずれの株も３０℃で７２
時間培養した。０、２４、４８および７２時間後にサン
プルを採取し、細胞を速やかに遠心分離した（Heraus
（Osterode、Germany）社製Biofuge pico centrifugeを
用いて１３００ＲＰＭで５分間）。
【００７４】培養上清の細胞外アミノ酸の濃度の定量的
測定を、ブレビバクテリウム フラバムに関して例５に
前記したのと同様に、逆相ＨＰＬＣ（Lindroth等、Anal
ytical chemistry（1979）51：1167〜1174）を用いて実
施した。アミノ酸濃度を、外標準および内標準であるア
スパラギンと比較して算出した。
測定を、ブレビバクテリウム フラバムに関して例５に
前記したのと同様に、逆相ＨＰＬＣ（Lindroth等、Anal
ytical chemistry（1979）51：1167〜1174）を用いて実
施した。アミノ酸濃度を、外標準および内標準であるア
スパラギンと比較して算出した。
【００７５】結果を表３に示す。
【００７６】
【表３】 配列表
【００７７】
【外３】
【００７８】
【外４】
【００７９】
【外５】
【００８０】
【外６】
【００８１】
【外７】
【００８２】
【外８】
【００８３】
【外９】
【００８４】
【外１０】
【００８５】
【外１１】
【図１】トランスポゾンＴｎ５５３１を有するプラスミ
ドｐＣＧＬ００４０の遺伝子地図である。トランスポゾ
ンは、塗りつぶされていない矢印で表される。
ドｐＣＧＬ００４０の遺伝子地図である。トランスポゾ
ンは、塗りつぶされていない矢印で表される。
【図２】ｔｈｒＥ遺伝子を含有する、プラスミドｐＺ１
ｔｈｒＥの遺伝子地図である。
ｔｈｒＥの遺伝子地図である。
【図３】プラスミドｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２の遺伝子地
図である。
図である。
【図４】ｔｈｒＥ遺伝子を含有する、プラスミドｐＥＣ
−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥの遺伝子地図である。
−Ｔ１８ｍｏｂ２ｔｈｒＥの遺伝子地図である。
長さのデータはおおよその値である。使用される略号お
よび記号は以下の意味を有する。 ・ａｍｐ アンピシリン耐性遺伝子 ・ｋａｎ カナマイシン耐性遺伝子 ・｀ａｍｐ アンピシリン耐性遺伝子
の３｀部分 ・ｏｒｉＢＲ３２２ プラスミドｐＢＲ３２２
の複製領域 ・ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺
伝子 ・ｏｒｉＶ プラスミドにコードされ
たE.Coli由来の複製領域 ・ＰＲ４ｍｏｂ プラスミドの可動性に必
要なｍｏｂ領域 ・ｒｅｐ プラスミドにコードされ
たC.glutamicumプラスミドｐＧＡ１由来の複製領域 ・ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ β−ガラクトシダーゼ遺
伝子のｌａｃＺα遺伝子断片（Ｎ−末端） 制限酵素の略号は、以下の意味を有する。 ・ＢａｍＨＩ Bacillus Amyloliquefaciens由来の
制限エンドヌクレアーゼ ・ＢｇｌＩＩ Bacillus flobigii由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＥｃｏＲＩ Escherichia coli由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＥｃｏＲＶ Escherichia coli由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＨｉｎｄＩＩＩ Haemophilus influenzae由来の制限
エンドヌクレアーゼ ・ＫｐｎＩ Klebsiell pneumoniae由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＰｓｔＩ Providencia stuartii由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＰｖｕＩ Proteus bulgaris由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＳａｃＩ Streptomyces achromgenes由来の制
限エンドヌクレアーゼ ・ＳａｌＩ Streptomyces albus由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＳｍａＩ Serratia marcescens由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＸｂａｌＩ Xanthomonas badrii由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＸｈｏＩ Xanthomonas holcicola由来の制限
エンドヌクレアーゼ
よび記号は以下の意味を有する。 ・ａｍｐ アンピシリン耐性遺伝子 ・ｋａｎ カナマイシン耐性遺伝子 ・｀ａｍｐ アンピシリン耐性遺伝子
の３｀部分 ・ｏｒｉＢＲ３２２ プラスミドｐＢＲ３２２
の複製領域 ・ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺
伝子 ・ｏｒｉＶ プラスミドにコードされ
たE.Coli由来の複製領域 ・ＰＲ４ｍｏｂ プラスミドの可動性に必
要なｍｏｂ領域 ・ｒｅｐ プラスミドにコードされ
たC.glutamicumプラスミドｐＧＡ１由来の複製領域 ・ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ β−ガラクトシダーゼ遺
伝子のｌａｃＺα遺伝子断片（Ｎ−末端） 制限酵素の略号は、以下の意味を有する。 ・ＢａｍＨＩ Bacillus Amyloliquefaciens由来の
制限エンドヌクレアーゼ ・ＢｇｌＩＩ Bacillus flobigii由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＥｃｏＲＩ Escherichia coli由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＥｃｏＲＶ Escherichia coli由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＨｉｎｄＩＩＩ Haemophilus influenzae由来の制限
エンドヌクレアーゼ ・ＫｐｎＩ Klebsiell pneumoniae由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＰｓｔＩ Providencia stuartii由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＰｖｕＩ Proteus bulgaris由来の制限エンド
ヌクレアーゼ ・ＳａｃＩ Streptomyces achromgenes由来の制
限エンドヌクレアーゼ ・ＳａｌＩ Streptomyces albus由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＳｍａＩ Serratia marcescens由来の制限エ
ンドヌクレアーゼ ・ＸｂａｌＩ Xanthomonas badrii由来の制限エン
ドヌクレアーゼ ・ＸｈｏＩ Xanthomonas holcicola由来の制限
エンドヌクレアーゼ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｘ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (71)出願人 599000142 フォルシュングスツェントルム ユーリッ ヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレン クテル ハフツング ドイツ連邦共和国ユーリッヒ （番地な し) (72)発明者 ペトラ ツィーグラー ドイツ連邦共和国 アーヘン アダルベル トシュトラーセ 63 (72)発明者 ローター エッゲリング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ エルゼン カンプ ６ (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 ゲオルク ティーアバッハ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト グン ストシュトラーセ 21
Claims (15)
- 【請求項１】 ｔｈｒＥ遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列を少なくとも１つ含有する、コリネバクテリウム
に由来しかつコリネフォルム微生物中で複製可能な、有
利な組み換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 （ｉ）ｔｈｒＥ遺伝子をコードする、配
列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）遺伝暗号の変性領域内の、配列（ｉ）に相当す
る、少なくとも１つの配列、または（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリダイズ
する少なくとも１つの配列、および／または場合により
（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異を有する、
請求項１記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２および配列番号４に示され
る、請求項１または２記載のヌクレオチド配列に由来す
る、タンパク質のアミノ酸配列。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の複製可能なＤＮ
Ａを１つ以上導入することにより形質転換される、特に
コリネバクテリウム属の、コリネフォルム微生物。 - 【請求項５】 番号ＤＳＭ１２８４０で寄託された、コ
リネバクテリウムグルタミカム ＤＭ３６８−２ ｐＺ
１ｔｈｒＥ。 - 【請求項６】 バクテリアを使用し、その中でｔｈｒＥ
遺伝子をコードするヌクレオチド配列を増幅、特に過剰
発現させる、コリネフォルムバクテリアの発酵を利用し
たＬ−スレオニンの製法。 - 【請求項７】 バクテリアを使用し、付加的にスレオニ
ン生合成経路に関する１つ以上の遺伝子を増幅する、請
求項６記載の製法。 - 【請求項８】 プラスミドベクターを用いて形質転換し
た株を使用し、該プラスミドベクターがｔｈｒＥ遺伝子
をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項６また
は７記載の製法。 - 【請求項９】 別の代謝産物または代謝拮抗物質への耐
性を示す突然変異を有する微生物中で、ｔｈｒＥ遺伝子
を過剰発現させる、請求項６から８までのいずれか１項
記載の製法。 - 【請求項１０】 過剰発現を実現するために、微生物を
様々な培地で発酵させかつ／または発酵条件を変更す
る、請求項６から９までのいずれか１項記載の製法。 - 【請求項１１】 スレオニンの形成を抑制する代謝経路
が部分的であるにせよ遮断されている微生物を使用す
る、請求項６から１０までのいずれか１項記載の製法。 - 【請求項１２】 ｔｈｒＥ遺伝子に加え、スレオニン形
成の代謝経路に関する残りの遺伝子を、個々にまたはい
っしょに増幅した（過剰発現させた）微生物を使用す
る、請求項６から１１までのいずれか１項記載の製法。 - 【請求項１３】 以下の工程： ａ）請求項６から１２までのいずれか１項記載の微生物
の発酵において、少なくともｔｈｒＥ遺伝子を増幅（過
剰発現）し、場合により別の遺伝子もいっしょに増幅
し、 ｂ）培地中または微生物の細胞中のＬ−スレオニンを増
加させ、 ｃ）Ｌ−スレオニンを単離する、を実施することから成
る、Ｌ−スレオニンの製法。 - 【請求項１４】 コリネバクテリウム属に属する微生物
を使用する、請求項６から１３までのいずれか１項記載
の製法。 - 【請求項１５】 スレオニン含有オリゴペプチドを含む
栄養培地で増殖しないかまたはわずかにしか増殖しない
ｔｈｒＥ遺伝子欠損突然変異体、有利にコリネフォルム
バクテリアを指示株として獲得し、 ａ）遺伝子バンクの構築後にｔｈｒＥ遺伝子を同定し、
単離するか、または ｂ）トランスポゾン突然変異誘発の場合には、有利に抗
生物質への耐性を示すトランスポゾンを選択し、それに
よりｔｈｒＥ遺伝子が獲得される、ことから成る、ｔｈ
ｒＥ遺伝子の単離方法。
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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