KR20010070044A - ｔｈｒＥ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및코리네형 박테리아를 사용하는 Ｌ-트레오닌의 효소적 생산방법 - Google Patents

ｔｈｒＥ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및코리네형 박테리아를 사용하는 Ｌ-트레오닌의 효소적 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 유래하며, 코리네형 미생물내에서 복제가능하고, thrE 유전자를 암호화화는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 재조합 DNA, 및
a) 임의로 추가 유전자와 함께, 적어도 thrE 유전자가 증폭(과발현)된 미생물을 발효시키는 단계;
b) 배지 또는 미생물의 세포중에서 L-트레오닌을 농축시키는 단계; 및
c) L-트레오닌을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-트레오닌의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

ｔｈｒＥ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 코리네형 박테리아를 사용하는 Ｌ-트레오닌의 효소적 생산 방법{Nucleotide sequences coding for the thrE gene and process for the enzymatic production of L-threonine using coryneform bacteria}
본 발명은 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 코리네형 박테리아를 사용하여 L-트레오닌을 효소적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-트레오닌은 동물 사료, 사람의 의약품 및 약제 산업에 사용된다.
공지된 바와 같이, L-트레오닌은 코리네박테리아 균주, 특히 코리네박테리움글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생성될 수 있다. 이들의 지대한 중요성 때문에, 상기 제조 방법을 개선하기 위한 시도가 계속적으로 행해지고 있다. 상기 방법에 대한 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효중의 당의 농도), 제조 형태에 대한 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피), 또는 미생물 자체의 고유 생산성 특징과 관련된 수단에 관한 것이다.
돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이체 선택법을 사용하여 이들 미생물의 생산성을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법하에서, 항대사물질(예: 트레오닌 동족체 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV))에 내성을 갖거나, 또는 중요한 조절 아미노산에 대한 영양요구성이며, L-트레오닌을 생성하는 균주가 수득된다.
각각의 트레오닌 생합성 유전자를 증폭시키고 L-트레오닌 생성에 미치는 효과를 연구하여 L-트레오닌 생산-코리네박테리움 균주를 개량하기 위하여, 수 년간 현재의 재조합 DNA 기술이 사용되어 왔다.
본원의 발명자들이 이루고자 하는 목적은 L-트레오닌의 효소적 생산을 개선하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.
도 1은 트랜스포손 Tn5531을 포함하는 플라스미드 pCGL0040의 지도이다. 트랜스포손은 음영이 없는 화살표로서 특징지워질 수 있다.
도 2는 thrE 유전자를 포함하는 플라스미드 pZ1thrE의 지도이다.
도 3은 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도이다.
도 4는 thrE 유전자를 포함하는 플라스미드 pEC-T18mob2thrE의 지도이다.
길이 데이타는 대략적인 것으로 간주된다. 사용된 약어 및 참조는 다음의 의미를 갖는다:
· amp: 앰피실린 내성 유전자.
· kan: 카나마이신 내성 유전자.
· 'amp: 앰피실린 내성 유전자의 3' 부분.
· oriBR322: 플라스미드 pBR322의 복제 영역.
· tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자.
· oriV: 이. 콜라이의 플라스미드-암호화 복제원.
· PR4mob: 플라스미드의 이동을 위한 mob 영역.
· rep: 코리네박테리움 글루타미쿰 플라스미드 pGA1으로 부터 기원하는 플라스미드-암호화 복제원.
· per: pGA1으로 부터 기원하는, 복사체 수를 조절하는 유전자.
· lacZ-알파: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편(N-말단).
제한 효소에 대한 약어는 다음의 의미를 갖는다:
· BamHI: 바실루스 아미롤리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· Bg1II: 바실루스 글로비기(Bacillus globigii)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· EcoRI: 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· EcoRV: 에스체리키라 콜라이로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· HindIII: 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· KpnI: 클레브시엘라 프네우모니아에(Klebsiella pneumoniae)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· PstI: 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· PvuI: 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· SacI: 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· SalI: 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· SmaI: 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· XbaI: 크산토모나스 바드리(Xanthomonas badrii)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
· XhoI: 크산토모나스 홀시콜라(Xanthomonas holcicola)로 부터 기원하는 제한 엔도뉴클리아제.
L-트레오닌은 동물의 사료, 사람의 의약품 및 약제 산업에서 사용된다. 따라서, L-트레오닌의 제법을 개선한 새로운 방법을 제공하는 것은 일반적으로 중요하다.
본 발명의 목적은 바람직하게는 코리네박테리움으로 부터 유래되고, 코리네형 미생물내에서 복제가능하며, 서열 1 및 서열 2에 도시된 thrE 유전자를 암호화화는 뉴클레오티드 서열을 반드시 포함하는 재조합 DNA이다.
또한, 본 발명의 목적은,
(i) thrE 유전자를 암호화하는 서열 1 또는 서열 3에 도시된 뉴클레오티드 서열,
(ii) 유전암호의 축퇴성 범위내에서 상기 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열,
(iii) 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및/또는 임의로
(iv) 상기 서열 (i)중의 작용상 중성인 센스 돌연변이를 포함하는 특허청구범위 제1항에 따른 복제가능한 DNA을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 위에서 언급한 복제가능한 DNA의 도입에 의해 형질전환된, 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물을 제공하는 것이다.
최종적으로, 본 발명은, 특히 이미 L-트레오닌을 생산하며 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현되어진 코리네형 박테리아를 사용하여 L-트레오닌을 효소적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본원중에서, "증폭"이란 용어는, 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 고활성의 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 필요한 경우 이들 수단을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명이 제공하자고 하는 미생물은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로 부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 L-트레오닌을 생산할 수 있다. 이러한 미생물의 대표적 예는 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아이다. 코리네박테리움 속중에서도, 특히 L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종중에서 적합한 균주로는 특히, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(acetoglutamicum) ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 멜라스세콜라(melassecola) ATCC 17965, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 및 브레비박테리움 디바리카툼(divaricatum) ATCC 14020과 같은 공지된 야생형 균주 및 이로 부터 수득된 L-트레오닌-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21649, 브레비박테리움 플라붐 BB69, 브레비박테리움 플라붐 DSM 5399, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-BP 269, 브레비박테리움 락토페르멘툼 TBB-10가있다.
본 발명에 이르러, 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰의 thrE 유전자를 성공적으로 분리해 낼 수 있었다. thrE 유전자를 분리하기 위해서는, 최우선적으로 thrE 유전자에 결함이 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 돌연변이체를 생산한다. 이를 위하여, 예컨대 ATCC 14752 또는 ATCC 13032와 같은 적당한 출발 균주를 돌연변이 유발법으로 처리한다.
통상의 돌연변이 유발법에는 화합물, 예를 들면 N-메틸-N-니트로소구아니딘에 의한 처리, 또는 UV 조사가 포함된다. 돌연변이를 일으키는 이러한 방법은 일반적으로 공지되어 있으며, 특히 문헌[Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)] 또는 편람["Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washing D.C., USA, 1981)]을 참조한다.
또 다른 돌연변이 유발법으로는, DNA 서열내에서 "점프"하는 트랜스포손(transposon)의 특성을 이용하여 관련 유전자의 기능을 방해하거나 차단하는 트랜스포손 돌연변이 유발법이 있다. 코리네형 박테리아의 트랜스포손는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 에리트로마이신 내성 트랜스포손 Tn5432[참조 문헌: Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179] 또는 클로로암페니콜 내성 트랜스포손 Tn5546이 코리네박테리움 세로시스(xerosis) 균주 M82B로 분리되었다.
또 다른 트랜스포손으로는, 문헌[Ankri et al., Journal of Bacteriology(1996) 178: 4412-4419]에 기술되어 있으며, 예컨대 본 발명에서 사용되는 트랜스포손 Tn5531이 있다. 트랜스포손 Tn5531은 aph3 카나마이신 내성 유전자를 포함하며, 예를 들면 도 1에 도시된 플라스미드 벡터 pCGL0040의 형태로 전달될 수 있다. 트랜스포손 Tn5531의 뉴클레오티드 서열은 미국 미들랜드 베데스다에 소재하는 기탁기관[National Center for Biotechnology Information(NCBI)]으로 부터 수탁번호 제U53587호하에 무료로 입수될 수 있다.
돌연변이유발, 바람직하게는 트랜스포손 돌연변이유발을 수행한 후, thrE 유전자에 결함이 있는 돌연변이체를 찾아낸다. thrE 유전자에 결함이 있는 돌연변이체가 최소 아가상에서는 양호한 성장을 보이지만, 트레오닌-포함 올리고펩티드, 예를 들면 트리펩티드인 트레오닐-트레오닐-트레오닌이 보충된 최소 아가상에서는 불량한 성장을 보인다는 사실을 토대로 이 돌연변이체를 식별할 수 있다.
이러한 돌연변이체의 예로는 균주 ATCC 14752△ilvAthrE::Tn5531이 있다.
기술된 방법으로 생성된 균주를 사용하여 thrE 유전자를 분리하여 클로닝할 수 있다.
이를 위하여, 목적하는 박테리아의 유전자 뱅크를 확립한다. 유전자 뱅크의 확립은 일반적으로 공지된 교과서 및 매뉴얼에 기재되어 있다. 예로서, 교과서[Winnacker: Gene und Klone, eine Einfuhrung in die Gentechnology (Gene and Clone, An Introduction to Gene Technology)(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 매뉴얼[Sambrook et al., : Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]를 언급할 수 있다. 매우익히 공지된 유전자 뱅크는 문헌[Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 기술된 바와 같이 λ-벡터중에 확립된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 뱅크이다. 문헌[Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]에는, 코스미드 벡터 SuperCos I[참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164]의 도움으로, 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]중에 확립된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 뱅크가 기술되어 있다. 본 발명의 경우, 코리네형 박테리아, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제하는 이들 벡터가 적합하다. 이러한 벡터는 종래의 기술에 공지되어 있으며; 예로서 플라스미드 벡터 pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]가 언급될 수 있다. 이어서, 상기 방법으로 수득된 유전자 뱅크를 형질전환 또는 전기천공으로 thrE 유전자에 결함이 있는 지표 균주에 도입하고, 트레오닌-포함 올리고펩티드의 존재하의 최소 아가상에서 성장할 수 있는 형질전환체를 찾아낸다. 이어서, 클로닝된 DNA 단편의 서열을 분석한다.
Tn5531 돌연변이유발에 의해 생성된 코리네형 박테리아의 돌연변이체, 예를 들면 균주 ATCC 14752△ilvAthrE::Tn5531를 사용하는 경우, Tn5531중에 포함된 카나미이신 내성 유전자 aph3을 사용하여 thrE::Tn5531 대립형질유전자를 직접 클로닝하여 분리할 수 있다. 이를 위하여, 공지된 클로닝 벡터, 예를 들면 pUC18[Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 and Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119]을 사용한다. 내성-결함 및 재조합체-결함 둘다에 모두해당하는 이. 콜라이 균주가 클로닝 숙주로서 특히 적합하다. 예로는 문헌[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 기술된 균주 DH5αmcr이 있다. 형질전환체에 대한 선별은 카나마이신의 존재하에서 수행한다. 이어서, 수득된 형질전환체의 플라스미드 DNA의 서열을 분석한다. 이를 위하여, 상거 등(Sanger et al.)에 의해 기술된 디데옥시 쇄 종결법을 사용할 수 있다[참조문헌: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1997) 74: 5463-5467]. 이로써, Tn5531 삽입 부위의 상부 및 하부상의 thrE 유전자 서열이 수득된다. 이어서, 시판되는 서열 분석 프로그램, 예를 들면 프로그램 패키지 Lasergene[제조원: 미국 매디슨에 소재하는 윈도우용 생물컴퓨터처리 소프트웨어 회사인, DNASTAR] 또는 프로그램 패키지 HUSAR[Release 4.0, 제조원: 독일 하이델베르크에 소재하는 EMBL]를 사용하여, 수득된 상기 뉴클레오티드 서열을 분석하여 조합한다.
이러한 방법을 통해, thrE 유전자를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 신규 DNA 서열이 수득되었으며, 이는 본 발명을 구성하는 일부로서 서열 1로 제시되어 있다. 상응하는 아미노산 서열도 역시 전술한 방법을 사용하여 본 DNA 서열로 부터 유도할 수 있다. thrE 유전자 생성물의 수득된 아미노산 서열은 서열 2에 제시되어 있다.
유전 암호의 축퇴성에 기해 서열 1로 부터 생성되는 암호화 DNA 서열도 마찬가지로 본 발명을 구성하는 일부이다. 동일한 방법으로, 서열 1 또는 서열 1의 부분과 하이브리드화하는 DNA 서열은 본 발명을 구성하는 일부이다. 게다가, 보존성아미노산의 교체, 예를 들면 단백질에서 알라닌에 의한 글리신의 교체 또는 글루타민에 의한 아스파르트산의 교체는 당업계에서 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 작용상 중성인 센스 돌연변이로서 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N- 및/또는 C-말단에서의 변화가 실질적으로 이의 기능에 영향을 주지 않으며, 심지어 이를 안정화시킬 수 도 있다는 사실이 공지되어 있다. 당업자는 이의 상세한 내용을 특히 문헌[Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77:237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3:240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)] 및 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교과서에서 찾아 볼 수 있다. 서열 2로 부터 상응하는 방법으로 제조된 아미노산 서열도 마찬가지로 본 발명을 구성하는 일부이다.
서열 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 적당한 프라이머를 합성할 수 있고, 이어서 이들을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 각종 코리네형 박테리아 및 균주의 thrE 유전자를 증폭시킬 수 있다. 당업자는 이의 상세한 내용을, 예를 들면 매뉴얼[Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 문헌[Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾아 볼 수 있다. 달리, 서열 1에 도시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분을 프로브로서 사용하여 특히 코리네형 박테리아의 유전자 뱅크에서 thrE 유전자를 찾아볼 수 있다. 당업자는 이의 상세한 내용을, 예를 들면 독일 만하임에 소재하는 베링거 만하임게엠베하에 의해 발행된 매뉴얼[The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (1993)] 및 문헌[Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 찾아볼 수 있다. 이 후, 상기 방법으로 증폭된 thrE 유전자-함유 DNA 단편을 클로닝하여 이의 서열을 분석한다.
서열 3에 도시된 균주 ATCC 13032의 thrE 유전자의 DNA 서열은 상기와 같은 방법으로 수득되며, 이도 역시 본 발명을 구성하는 일부이다. 수득된 아미노산 성열은 서열 4에 도시되어 있다.
또한, 본 발명은, 트레오닌-포함 올리고펩티드를 함유하는 영양 배지상에서 성장하지 못하거나 단지 겨우 성장하는, thrE 유전자에 결함이 있는 바람직하게는 코리네형 박테리아의 돌연변이체를 지표 균주로서 수득하고, a) 유전자 뱅크를 확립한 후, thrE 유전자를 동정 및 분리하거나, 또는 b) 트랜스포손 돌연변이 유발법의 경우, 바람직하게는 항생제 내성을 갖는 트랜스포손을 선별하여, 이로 부터 thrE 유전자를 수득하는 것을 특징으로 하여, thrE 유전자를 분리하는 방법을 제공한다.
본원의 발명자들은 상기 사실로 부터, thrE 유전자의 과발현 후 코리네형 박테리아가 L-트레오닌을 개선된 양상으로 생산한다는 것을 발견하였다.
과발현을 달성하기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자 상부에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방법으로 작용한다. 추가로, 유도성 프로모터를 사용하여 효소적 L-트레오닌 생산과정중에 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 향상될 수 있다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성을 증가시킬 수 있다. 유전자 작제물은 상이한 복사체 수의 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 달리, 관련 유전자의 과발현은 배양 배지의 조성 및 배양 조건을 변화시킴으로써 성취될 수 있다.
당업자는 이의 상세한 내용을 특히 문헌[Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 명세서 EPS 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 WO 96/15246; Malumbers et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 공개 공보 명세서 JP-A-10-229891; Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Review 60: 512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학에 관한 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.
thrE 유전자를 과발현시킬 수 있는 수단인 플라스미드의 예로는 균주 DM368-2 pZ1thrE내에 함유된 pZ1thrE이 있다. 플라스미드 pZ1thrE는, 플라스미드 pZ1[참조: Mankel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]를 기초로 한 코리네박테리움 글루타미쿰-이. 콜라이 왕복 벡터이다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제가능한 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pEKEx1[Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pZ8-1[EP-B- 0 375 889]를 동일한 방법으로 사용할 수 있다.
또한, L-트레오닌의 생산에 있어서, 신규 thrE 유전자외에, 공지된 트레오닌 생합성 경로의 효소, 보전 대사의 효소 또는 시트르산 사이클의 효소중의 하나 이상을 과발현시키는 것이 유리할 수 있다. 하기 유전자는 예를 들면 동시에 과발현될 수 있다:
· 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1998)] 또는 피드백-내성 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 homdr대립형질 유전자[Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)] ,
· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자 [DE-A-19 831 609], 또는
· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)].
또한 L-트레오닌의 생산에 있어서, thrE 유전자를 과발현시키는 것외에, 바람직하지 않은 2차 반응, 예를 들면 트레오닌-데하이드로게나제 반응을 차단시키는 것이 유리할 수 있다[Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms": Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982 and Bell and Turner,Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)].
본 발명에 따라 생산된 미생물을 배치 공정(배치 배양), 또는 공급 배치(공급 공정)나 반복적 공급 배치 공정(반복적 공급 공정)에서 연속적 또는 배치식으로 배양하여 L-트레오닌을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법은 교과서[Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 요약되어 있다.
사용되는 배양 배지는 적당한 방법으로 각각의 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 탄소원에는 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 오일과 지방(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(아세트산)이포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원에는 질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분, 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 포함된다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원에는 인산, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 염이 포함된다. 또한, 배양배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 또한, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 공급 물질들은 상기 배지에 단일 배치 형태로 가해지거나, 또는 배양중에 적당히 공급될 수 있다.
배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물, 예를 들면 수산화물, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적당히 가할 수 있디. 소포제, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르을 사용하여 발포 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 공급하여 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. L-트레오닌의 최대량이 생성될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10 시간 내지 160 시간내에 달성될 수 있다.
L-트레오닌의 분석을, 음이온 교환 크로마토그래피에 이은, 닌하이드린 유도화[참조 문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)]를 통해 수행하거나, 또는 역상 HPLC[참조 문헌: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]을 통해 수행한다.
하기 미생물은 부다페스트 조약하에 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ)]에 기탁되었다:
·브레비박테리움 플라붐 균주 DSM368-2 pZ1thrE(수탁번호: DSM 12840)
·에스체리키아 콜라이 균주 GM2929pCGL0040(수탁번호: DSM 12839).
실시예
본 발명은 이후 실시예의 내용을 통해 더욱 상세히 기술될 것이다.
에스체리키아 콜라이로 부터 플라스미드 DNA의 분리를 비롯하여, 제한분석, 클레노우(Klenow), 및 알카린 포스파타제 처리 기술은 모두 문헌[Sambrook et al., Molecualr cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 따라 수행한다. 달리 특별한 언급이 없는한, 에스체리키아 콜라이의 형질전환은 문헌[Chung et al., Proceedings the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175]에 따라 수행한다.
실시예 1
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14752의 thrE 유전자의 클로링 및 서열분석
1.트랜스포손 돌연변이 유발 및 돌연변이체의 선별
트랜스포손 Tn5531[이의 서열은 미국 베데스다에 소재하는 기탁기관(the Nucleotide Databank of the National Center for Biotechnology Information)에 수탁번호 제U53587호하에 기탁되었다]을 이용하여, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14752△ilvA에 돌연변이를 유발시킨다. 문헌[Schafer et al., Gene(1994) 145: 69-73]에 기술된 유전자 교환 시스템을 이용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14752의 ilvA 유전자에 결실을 도입한다. 이를 위하여, 삼(Sahm) 등에 의해 작제된 불활성 벡터 pK19mobsacB△ilvA[Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979]을 사용하여 결실을 유발한다. 200ng의 벡터 pK19mobsacB△ilvA를 사용하여, 독일 하이델베르크에 소재하는 슈트라타겐(Stratagene)으로 부터 제공되는 메틸라제-결함 에스체리키아 콜라이 균주 SCS110[Jerpseth and Krets, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)]를 최우선적으로 형질전환시킨다. 형질전환체를 카나마이신 50㎍/mL을 함유하는 LB-아가 플레이트상에서 이들의 카나마이신 내성을 이용하여 동정한다. 플라스미드 pK19mobsacB△ilvA를 상기 형질전환체중의 하나로 부터 수득한다. 이어서, 이 불활성 플라스미드를 전기천공[참조: Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 통해 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14752에 도입시킨다. 당해 불활성 플라스미드가 게놈내에 통합된 상태로 존재하는 클론을 이들의 카나마이신 내성을 이용하여 카나마이신 15㎍/mL을 함유하는 LBHIS-아가 플레이트[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]상에서 동정한다. 당해 벡터를 적출하기 위하여, 카나마이신-내성 클론을 슈크로즈-함유 LBG-배지[아가 15g/l, 글루코즈 2%, 슈크로즈 10%를 포함하는 LB-배지]상에 플레이팅시킨다. 제2 재조합 현상을 통해 벡터를 상실한 콜로니가 이러한 방법에 의해 수득된다[Jager et al., Journal of Bacteriology (1992) 174: 5432-5465]. L-이소류신 300mg/L 및/또는 카나마이신 50㎍/mL을 함유하거나 함유하지 않는, 최소 배지 플레이트[아가 15g/L을 함유하는 CGXII-배지 (Keihauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)]상의 이종접종을 통해, 당해 벡터가 적출된 카나마이신 민감성 및 이소류신 영양요구성인, 게놈내에 단지 불완전한 ilvA-Gen(△ilvA 대립형질 유전자)만이 존재하는 6개의 클론을 분리한다. 균주 ATCC14752△ilvA로 지칭되는 이들 클론중의 하나를 트랜스포손 돌연변이유발에 사용한다.
조립된 트랜스포손 Tn5531[Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419]을 포함하는 플라스미드 pCGL0040를 메틸라제-결함 이. 콜라이 균주 GM2929pCGL0040[E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12]으로부터 분리한다. 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752△ilvA를 전기천공[Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여 플라스미드 pCGL0040로 형질전환시킨다. 트랜스포손 Tn5531이 게놈내에 통합된 클론을 이들의 카나마이신 내성을 이용하여 카나마이신 15㎍/mL을 함유하는 LBHIS-아가 플레이트[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]상에서 동정한다. 이러한 방법을 통해, 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 존재하에 성장 지체가 확인된 2000개 클론을 수득한다. 이를 위하여, 모든 클론을 2mM 트레오닐-트레오닐-트레오닌을 함유하거나 함유하지 않는 CGXII 최소 배지 아가 플레이트에 각각 옮긴다. 당해 배지는 문헌[Keihauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기술된 배지 CGXII와 동일하지만, 추가로 카나마이신 25㎍/mL, L-이소류신 300mg/L 및 아가 15g/L을 포함한다. 카이하우어등(Keihauer et al.)에 의해 기술된 배지의 조성은 표 1에 제시된다.
배지 CGXII의 조성
성분 농도
(NH4)2SO4 20g/L
우레아 5g/L
KH2PO4 1g/L
K2HPO4 1g/L
MgSO4x 7 H2O 0.25g/L
3-모르폴리노프로판설폰산 42g/L
CaCl2 10mg/L
FeSO4x 7 H2O 10mg/L
MnSO4x H2O 10mg/L
ZnSO4x 7 H2O 1mg/L
CuSO4 0.2mg/L
NiCl2x 6 H2O 0.02mg/L
비오틴 0.2mg/L
글루코즈 40g/L
프로토카쿠산 30mg/L
상기 아가 플레이트를 30℃에서 항온처리하고, 12, 18 및 24 시간 후에 성장을 조사한다. 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 부재하에서는 초기 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752△ilvA에 필적하게 성장하지만, 2mM 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 존재하에서는 성장 지체를 보이는 트랜스포손 돌연변이체를 수득한다. 이를 ATCC14752△ilvA::Tn5531로 지명한다.
2.ATCC14752△ilvAthrE::Tn5531중의 Tn5531의 삽입 부위의 클로닝 및 서열분석
실시예 1.1에 기술된 돌연변이체중에서 트랜스포손 Tn5531의 상부에 위치한 삽입 부위를 클로닝하기 위하여, 이 돌연변이체 균주의 염색체 DNA를 최우선적으로문헌[Schwarzer et al., Bio/Technology (1990) 9: 84-87]에 기술된 바와 같이 분리하고, 400ng의 이 염색체 DNA를 제한 엔도뉴클리아제 EcoRI으로 절단한다. 완전한 제한 삽입체를, 독일 만하임에 소재하는 Roche Diagnostics으로 부터 제공된 EcoRI(Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106)에 의해 마찬가지로 선형화된 벡터 pUC18와 결합시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 전기천공을 사용하여 완전 결합 삽입체로 형질전환시킨다[Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145]. 트랜스포손 Tn5531의 삽입 부위가 벡터 pUC18상에 클로닝되어 존재하는 형질전환체를 카베니실린 50㎍/mL 및 카나마이신 25㎍/mL을 함유하는 LB-아가 플레이트상에서 이들의 카베니실린 내성 및 카나마이신 내성을 이용하여 동정한다. 당해 플라스미드를 3개의 형질전환체로 부터 수득하고, 클로닝된 삽입체의 크기를 제한 분석에 의해 측정한다. 상기 플라스미드중 하나에 존재하는 삽입 부위의 뉴클레오티드 서열을, 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]에 기재된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 약 5.7kb의 대형 삽입체로 결정한다. 이를 위하여, 2.2kb의 삽입체를 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3')로 부터 출발하여 서열분석한다.
트랜스포손 하부에 위치한 삽입 부위를 동정하기 위하여, 돌연변이체의 염색체 DNA를 제한 엔도뉴클리아제 XbaI으로 절단하고, XbaI으로 선형화된 벡터pUC18내에 결합시킨다. 추가로, 상기한 바와 같이 클로닝을 수행한다. 상기 플라스미드중 하나에 존재하는 삽입 부위의 뉴클레오티드 서열을, 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]에 기재된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 약 8.5kb의 대형 삽입체로 결정한다. 이를 위하여, 0.65kb의 삽입체를 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3')로 부터 출발하여 서열분석한다.
수득된 뉴클레오티드 서열을 프로그램 패키지 Lasergene[미국 매디슨에 소재하는 윈도우용 생물컴퓨터처리 소프트웨어 회사인 DNASTAR]을 사용하여, 분석 및 조립한다. 이 뉴클레오티드 서열은 서열 1로서 제시된다. 이 분석에 의해 1467bp 길이의 개방형 판독 프레임이 동정된다. 상응하는 유전자는 thrE 유전자로 지명된다. 관련 유전자 생성물은 489개의 아미노산을 포함하며, 이는 서열 2로서 제시된다.
실시예 2
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 유전자 thrE의 클로닝 및 서열분석
유전자 thrE를 이. 콜라이 클로닝 벡터 pUC18[Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany]내에서 클로닝한다. 당해 클로닝을 두 단계로 수행한다. 최우선적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 유전자를, 서열 1로 부터 유도된 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨다:
ThrE-정방향:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT ATT G-3'
thrE-역방향:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'
PCR 반응을, 다음 조건(94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 2분)하의 열순환기(PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA)내에서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200μM, 각 사이클의 경우, 상응하는 올리고뉴클레오티드 1μM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 염색체 DNA 100ng, 10배 반응 완충액 1/10 용량, 및 열-안정성 Taq-/Pwo-DNA 폴리머라제 혼합물(EXpand High Fidelity PCR System; 제조원: 독일 만하임에 소재하는 Roche Diagnostics)의 2.6단위의 존재하에서 30 사이클을 수행한다.
이어서, 증폭된 약 1.9kb의 대형 단편을 제조자의 지침에 따라 SureClone Ligation Kit(제조원: 스웨덴 압살라에 소재하는 Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여, 벡터 pUC18의 SmaI 절단 부위내에 결합시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 온전한 결합 삽입체로 형질전환시킨다. 형질전환체를 카베니실린 50㎍/mL을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 이들의 카베니실린 내성을 기준으로 하여 동정한다. 당해 플라스미드를 8개의 형질전환체로 부터 수득하여, 삽입체인 1.9kb PCR 단편의 존재여부에 대해 제한분석 시험을 수행한다. 생성된 플라스미드를 이후 pUC18thrE로 지명한다.
플라스미드 pUC18thrE내의 1.9kb PCR 단편의 뉴클레오티드 서열을, 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]에 기재된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 결정한다. 이를 위하여, pUC18thrE의 완전한 삽입체를 하기 프라이머(제조원: 독일 만하임에 소재하는 Roche Diagnostics)를 사용하여 서열분석한다:
만능 프라이머:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
역방향 프라이머:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'.
상기 뉴클레오티드 서열은 서열 3으로서 제시된다. 포함된 뉴클레오티드 서열을 프로그램 패키지 Lasergene[제조원: 미국 매디슨에 소재하는 윈도우용 생물컴퓨터처리 소프트웨어 회사인 DNASTAR]를 사용하여 분석한다. 이러한 분석에 의해 1467bp 길이의 개방형 판독 프래임이 동정되었으며, 이를 thrE 유전자로 지명한다. 489개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화화는 유전자는 서열 4로서 제시된다.
실시예 3
코리네박테리움 글루타미쿰에서의 thrE 유전자의 발현
실시예 2에 기술된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 thrE 유전자를 벡터 pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology(1989) 64: 549-554]에서 발현시키기 위해 클로닝한다. 이를 위하여, thrE 유전자를 포함하는 1881bp의 대형 DNA 단편을 제한효소 SacI 및 XbaI을 사용하여 플라스미드 pUC18thrE로 부터 잘라낸다. 이 단편의 5'- 및 3'-말단을 클레노우 효소로 처리한다. 생성된 DNA 단편을, 미리 ScaI으로 선형화 및 탈인산화시킨 벡터 pZ1내에 결합시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참조: Grant et al., Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 온전한 결합 삽입체로 형질전환시킨다. 형질전환체를 카나마이신 50㎍/mL을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 이들의 카나마이신 내성을 기준으로 하여 동정한다. 당해 플라스미드를 2개의 형질전환체로 부터 수득하여, 제한 분석 에 의해 삽입체인 1881 bp의 ScaI/XbaI 단편의 존재여부에 대해 확인한다. 이러한 방법으로 생성된 재조합 플라스미드를 pZ1thrE로 지명한다(도 2).
플라스미드 pZ1 및 pZ1thrE를 전기천공[참조: Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여, 트레오닌-생성 균주인 브레비박테리움 플라붐 DM368-2내로 도입한다. 균주 DM368-2는 EP-B-0 385 940에 기술되어 있고, DSM5399로서 기탁되어 있다. 형질전환체를 이들의 카나마이신 내성을 기준으로 하여 카나마이신 15㎍/mL을 함유하는 LBHIS-아가 플레이트[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]상에서 동정한다. 이러한 방법으로 브레비박테리움 플라붐 DM368-2 pZ1 및 DM368-2 pZ1thrE를 수득한다.
실시예 5
브레비박테리움 플라붐을 이용한 L-트레오닌의 제조
트레오닌 생성을 조사하기 위하여, 균주 브레비박테리움 플라붐 DM368-2 pZ1 및 DM368-2 pZ1thrE을, 카나마이신 50㎍/mL을 포함하는 브레인 하트(brain heart) 주입 배지(제조원: 미국 디트로이트에 소재하는 Difco Laboratories) 100ml중에서 14시간 동안 30℃에서 예비배양한다. 이어서, 상기 세포를 0.9%(w/v)의 염화나트륨 용액으로 1회 세척하고, OD600(600nm에서의 광학 밀도)가 0.5가 되도록 60mL 분획의 CgXII 배지에 상기 현탁액을 접종한다. 당해 배지는 문헌[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기재된 배지와 동일하지만, 추가로 카나마이신 50㎍/mL을 포함한다. 두 균주 모두를 30℃에서 72시간에 걸쳐 배양한다. 샘플을 0, 24, 48 및 72시간 후 취하고, 세포를 신속히 원심분리한다[독일 오스테로데에 소재하는 Heraeus로 부터 제공되는 Biofuge pico로 13000 RPM에서 5분간 수행].
배지 상층액으로 부터의 세포외 아미노산 농도의 정량적 측정을 역상 HPLC[Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174]을 사용하여 수행한다. 형광 검출기(G1321A)가 장착된 HP1100 시리즈[제조원: 독일 발트브론에 소재하는 Hewlett-Packard]의 HPLC 장치를 사용하며; 당해 시스템의 작동 및 데이타의 평가는 HP-Chem-Station(Hewlett-Packard)을 사용하여 수행한다. 분석할 아미노산 1μL을 o-프탈알데히드/2-머캅토에탄올 시약(제조원: 네덜란드 오우트-바이체르란트에 소재하는 Pierce Europe BV)과 함께 자동 예비 칼럼 유도화 단계에서 혼합한다.
생성된 형광성 티오-치환된 이소인돌[참조: Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482]을 배합 예비 칼럼(40x4mm Hypersil ODS 5) 및 주 칼럼(Hypersil ODS 5)[두 칼럼 모두 독일 란게르베헤에 소재하는 CS-Chromatographie Service GmbH에서 구입가능]에서, 점차 증가하는 비극성 상(메탄올)을 사용한 구배 프로그램을 이용하여 분리한다. 극성 용출제는 아세트산나트륨(0.1 몰, pH 7.2)이고, 유속은 분당 0.8mL이다. 유도화된 아미노산의 형광성 검출을 230nm의 여기 파장 및 450nm의 방출 파장에서 수행한다. 아미노산 농도를 외부 표준 및 추가 내부 표준인 아스파라긴의 비교를 통해 계산한다.
이 결과는 표 2에 제시된다.
균주 L-트레오닌 (g/L)
0 시간 24시간 48시간 72시간
DM368-2 pZ1 0 0.46 1.27 1.50
DM368-2 pZ1thrE 0 0.68 1.71 2.04
하기 도면이 포함된다:
실시예 6
벡터 pEC-T18mob2thrE의 제조
1.벡터 pEC-T18mob2의 작제
이. 콜라이-글루타미쿰 왕복 벡터 pEC-T18mob2를 종래의 기술에 따라 제조한다.
당해 벡터는, 복제 효과인자 per를 포함하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역rep[참조: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-15322 (1997)], 테트라사이클린 내성을 부여하는 플라스미드 pAG1의 tetA(Z) 유전자[US-A-5,158,891; 미국 미들랜드주의 베데스다에 소재하는 기탁기관(National Center for Biotechnology Information(NCBI))의 유전자 뱅크에 수탁번호 제AF121000호하에 기탁], 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참조: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터 및 다중 클로닝 부위인 mcs를 포함하는 lacZα 유전자[참조: Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)], 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조: Simon et al., (1983) Bio/Technology 1:784-791]을 포함한다.
작제된 벡터로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다[참조: Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985)]. 플라스미드-수반 세포를, 테트라사이클린 5mg/l을 보충한 LB 아가[참조: Sambrook et al., Molecular cloning: a Laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., U.S.A, 1989]상에 형질전환 배치를 플레이팅시키는 방법으로 선별한다. 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep Kit(제조원: Qiagen)를 사용하여 형질전환체로 부터 분리하고, 제한 효소 EcoRI 및 HindIII에 의한 제한절단에 이은 아가로즈 겔 전기영동(0.8%)으로 확인한다.
당해 플라스미드를 pEC-T18mob2로 명명하였으며, 이는 도 3에 도시되어 있다.
2.pEC-T18mob2thrE의 작제
실시예 2에 기술된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 thrE 유전자를 벡터 pEC-T18mob2내에 클로닝하여 발현시킨다. 이를 위하여, thrE 유전자를 포함하는 1881bp 길이의 대형 DNA 단편을 제한 효소 SacI 및 XbaI를 사용하여 플라스미드 pUC18thrE로 부터 잘라낸다. 생성된 DNA 단편을, 미리 SacI 및 XbaI로 선형화 및 탈인산화한 벡터 pEC-T18mob2내로 결합시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 온전한 결합 배치로 형질전환시킨다. 형질전환체를 이들의 테트라사아클린 내성을 기준으로 하여 테트라사이클린 5㎍/mL을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 동정한다. 당해 플라스미드를 2개의 형질전환체로 부터 수득하여, 제한 분석을 이용하여 삽입체인 1881 bp의 ScaI/XbaI 단편의 존재여부에 대해 확인한다. 이러한 방법으로 수득된 재조합 플라스미드를 pEC-T18mob2thrE로 지명한다(도 4).
플라스미드 pEC-T18mob2 및 pEC-T18mob2thrE를 전기천공[참조: Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여, 트레오닌-생성 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B-DR17[참조: Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology (1994) 60: 126-132]내로 도입한다. 형질전환체를 이들의 테트라사아클린 내성 및 카나마이신 내성을 기준으로 하여 카나마이신 15㎍/mL 및 테트라사이클린 5㎍/mL을 함유하는 LBHIS 아가 플레이트[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]상에서 동정한다. 이러한방법으로, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 및 MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2thrE를 수득한다.
실시예 7
코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 L-트레오닌의 제조
트레오닌 생성을 조사하기 위하여, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 및 MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2thrE를, 카나마이신 25㎍/mL 및 테트라사이클린 5㎍/mL을 함유하는 브레인 하트(brain heart) 주입 배지(제조원: 미국 디트로이트에 소재하는 Difco Laboratories) 100ml중에서 14시간 동안 30℃에서 예비배양한다. 이어서, 상기 세포를 0.9%(w/v)의 염화나트륨 용액으로 1회 세척하고, OD600(600nm에서의 광학 밀도)가 0.5가 되도록 60mL 분획의 CgXII 배지에 상기 현탁액을 접종한다. 당해 배지는 문헌[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기재된 배지와 동일하지만, 추가로 카나마이신 25㎍/mL 및 테트라사이클린 5㎍/mL를 포함한다. 두 균주 모두를 30℃에서 72시간에 걸쳐 배양한다. 샘플을 0, 24, 48 및 72시간 후 취하고, 세포를 신속히 원심분리한다[독일 오스테로데에 소재하는 Heraeus로 부터 제공되는 Biofuge pico로 13000 RPM에서 5분간 수행].
배지 상층액으로 부터의 세포외 아미노산 농도의 정량적 측정을, 브레비박테리움 플라붐에 대해 실시예 5에 이미 기술한 바와 같이, 역상 HPLC[참조: Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174]을 사용하여 수행한다. 아미노산 농도를 외부 표준 및 추가 내부 표준인 아스파라긴의 비교를 통해 계산한다.
이 결과는 표 3에 제시된다.
균주 L-트레오닌 (g/L)
0 시간 24시간 48시간 72시간
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 0 3.42 5.82 5.78
MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2thrE 0 4.168 7.53 8.05
본 발명에 의해 동물의 사료, 사람의 의약품 및 약제 산업에서 유용하게 사용되는 L-트레오닌을 효소적으로 생산하는 방법을 개선한 새로운 수단이 제공된다

Claims (15)

  1. 코리네박테리움으로 부터 유래하며, 코리네형 미생물내에서 복제가능하고, thrE 유전자를 암호화화는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 재조합 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) thrE 유전자를 암호화하는, 서열 1 또는 서열 3에 도시된 뉴클레오티드 서열,
    (ii) 유전 암호의 축퇴성 범위내에서 상기 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열,
    (iii) 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및/또는 임의로
    (iv) 상기 서열 (i)중의 작용상 중성인 센스 돌연변이를 포함하는, 복제가능한 재조합 DNA.
  3. 서열 2 및 서열 4에 도시된, 제1항 또는 제2항에 따른 뉴클레오티드 서열로 부터 유도되는 단백질의 아미노산 서열.
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 복제가능한 DNA를 도입함으로써 형질전환된 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물.
  5. 수탁번호 제DSM 12840호하에 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 DM368-2 pZ1thrE.
  6. thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현된 박테리아를 사용함을 특징으로 하는, 코리네형 박테리아의 발효에 의한 L-트레오닌의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로의 하나 이상의 유전자가 추가로 증폭된 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 또는 제8항에 있어서, thrE 유전자가, 대사물질 또는 항대사물질 내성 돌연변이를 추가로 포함하는 미생물에서 과발현됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항 내지 제9항중의 어느 한 항에 있어서, 과발현을 달성하기 위하여, 미생물을 변형된 배양 배지에서 발효시키거나 발효 조건을 변경하거나, 또는 이 둘모두를 수행함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항 내지 제10항중의 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 차단되어진 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제6항 내지 제11항중의 어느 한 항에 있어서, thrE 유전자에 추가하여, 트레오닌 생성을 위한 대사 경로의 나머지 유전자가 각각 또는 함께 증폭(과발현)됨을 특징으로 하는 방법.
  13. a) 임의로 추가 유전자와 함께, 적어도 thrE 유전자가 증폭(과발현)된, 제6항 내지 제12항중의 어느 한 항에 따른 미생물을 발효시키는 단계;
    b) 배지 또는 미생물의 세포중에서 L-트레오닌을 농축시키는 단계; 및
    c) L-트레오닌을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-트레오닌의 생산 방법.
  14. 제6항 내지 제13항중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 속의 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  15. 트레오닌-포함 올리고펩티드를 함유하는 영양 배지상에서 성장하지 못하거나단지 겨우 성장하는, thrE 유전자에 결함이 있는 바람직하게는 코리네형 박테리아의 돌연변이체를 지표 균주로서 수득하고, a) 유전자 뱅크를 확립한 후, thrE 유전자를 동정 및 분리하거나, 또는 b) 트랜스포손 돌연변이 유발법의 경우, 바람직하게는 항생제 내성을 갖는 트랜스포손을 선별하여, 이로 부터 thrE 유전자를 수득함을 특징으로 하는, thrE 유전자의 분리 방법.
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