SK13042000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thre a spôsob fermentačnej výroby l-treonínu použitím koryneformných baktérií - Google Patents

Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thre a spôsob fermentačnej výroby l-treonínu použitím koryneformných baktérií Download PDF

Info

Publication number
SK13042000A3
SK13042000A3 SK1304-2000A SK13042000A SK13042000A3 SK 13042000 A3 SK13042000 A3 SK 13042000A3 SK 13042000 A SK13042000 A SK 13042000A SK 13042000 A3 SK13042000 A3 SK 13042000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
leu
gly
gene
wall
Prior art date
Application number
SK1304-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Petra Ziegler
Lothar Eggeling
Hermann Sahm
Georg Thierbach
Original Assignee
Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Forschungszentrum J�Lich Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa-h�ls aktiengesellschaft, Forschungszentrum J�Lich Gmbh filed Critical Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Publication of SK13042000A3 publication Critical patent/SK13042000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Description

Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thrE a spôsob fermentačnej výroby L-treonínu použitím koryneformných baktérií
Oblasť techniky
Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie kódujúce gén thrE a spôsob fermentačnej výroby L-treonínu použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje gén thrE.
Doterajší stav techniky
L-Treonín sa používa vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.
Je známe, že L-treonín sa môže vyrábať fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Cozynebacterium. glutamicum. Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobu sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získavajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad treonínový analóg kyselina a-amino-p-hydroxyvalérová (AHV), alebo sú auxotrofné pre regulačné významné aminokyseliny a produkujú ···· • · · • •‘‘O ·· • · · · · · • · · · · • to · · · >·· toto·· ··
L-treonín.
Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich treonín tým, že sa jednotlivé gény biosyntézy L-treonínu amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu L-treonínu.
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu L-treonínu.
Podstata vynálezu
L-Treonín sa používa vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby L-treonínu.
Predmetom vynálezu je prednostne rekombinantné DNA, replikovateľná v koryneformných mikroorganizmoch, pochádzajúca z Corynebacterium, ktorá obsahuje aspoň nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje gén thrE, znázornený v SEQ-ID-No.'1 a SEQ-ID-No. 3.
Predmetom vynálezu je aj replikovateľná DNA podľa nároku 1 s:
(i) nukleotidovými sekvenciami znázornenými v SEQ-ID-No. 1 alebo SEQ-ID-No. 3, ktoré kódujú gén thrE, alebo (ii) aspoň jednou sekvenciou, ktorá zodpovedá sekvenciám (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo <· ·*·*-• ···· ·· ······ .·· ···· ·· · (iii) aspoň jednou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvenciám (i) alebo (ii), a/alebo poprípade (iv) funkčne neutrálnymi mutáciami so zmyslom v (i) .
Predmetom vynálezu sú taktiež koryneformné mikroorganizmy, najmä rodu Corynebactéri um, transformované zavedením uvedenej replikovatelnej DNA.
Vynález sa napokon týka spôsobu fermentačnej výroby L-treonír.u použitím koryneformných baktérií, ktoré najmä už produkujú L-treonín a v ktorých sa zosilňuje(ú), najmä nadmerne exprimuje(ú), nukleotidová(é) sekvencie(e) kódujúca (e) gén thrE.
Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, tým, že sa napríklad zvýši počet kópií génu, poprípade génov, použije sa silný promótor alebo sa použije gén, ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu vytvárať L-treonín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
• ···· '·· <>
·· « ···· ··· • ··· · · · · · • · · · · · · ··· ··· · ·· ··· ·· * ··
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú najmä známe kmene divého typu
Corynebacterium
Corynebacterium
Corynebacterium
Corynebacterium
Corynebacterium
Brevibacterium
Brevibacterium
Brevibacterium glutamicum ATCC13032, acetoglutamicum ATCC15806, acetoacidophilum ATCC13870, melassecola ATCC17965, thermoaminogenes FERM BP-1539, flavum ATCC14067, lactofermentum ATCC13869 a divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-treonín, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum ATCC21649, Brevibacterium flavum BB69,
Brevibacterium flavum DSM5399, Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269 a Brevibacterium lactofermentum TBB-10.
Vynálezcom sa podarilo izolovať gén thrE z Corynebacterium glutamicum. Na izoláciu génu thrE sa najskôr vytvorí mutant C. glutamicum s defektom v géne thrE. Na to sa vhodný východiskový kmeň, ako napríklad ATCC14752 alebo ATCC13032 podrobí procesu mutagenézy.
Klasickým procesom mutagenézy je spracovanie chemikáliami, ako je napríklad N-metyl-N-nitro-N-nitrózoguanidín, alebo UV-žiarením. Také spôsoby vyvolania mutácie sú všeobecne známe a môžu sa medzi iným nájsť v Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold • ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · · · ·· • ··· · · · · · · • · · · · ···· · • ····· · · · ······ ··· ···· · · · · ·
Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) alebo v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).
Iným procesom mutagenézy je metóda transpozónovej mutagenézy, pri ktorej sa využíva vlastnosť transpozónu skočiť do sekvencií DNA, a tým narušiť funkciu daného génu, poprípade ju blokovať. Transpozónové koryneformné baktérie sú v odbornom svete známe. Tak sa z kmeňa Corynebacterium xerosis M82B izoloval transpozón rezistencie na erytromycín Tn5432 (Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168179) a transpozón rezistencie na chloramfenikol Tn5546.
Iným transpozónom je transpozón Tn5531, ktorý sa opisuje v Ankri et al. (Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419) a príkladne sa použil v predloženom vynáleze. Transpozón Tn5531 obsahuje gén rezistencie na kanamycín aph3 a môže sa poskytnúť vo forme plazmidového vektora pCGL0040, ktorý je znázornený na obrázku 1. Nukleotidová sekvencia transpozónu Tr.5531 je volne k dispozícii pod prírastkovým číslom (accession number) U53587 v National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) .
Po uskutočnení mutagenézy, najmä transpozónovej mutagenézy sa vyhľadá mutant s defektom v géne thrE. Mutant s defektom v géne thrE sa spozná podlá toho, že ukazuje dobrý rast na minimálnom agare, ale zlý rast ukazuje na minimálnom agare, ktorý bol doplnený oligopeptidmi obsahujúcimi treonín, ako je napríklad tripeptid treonyl-treonyltreonín.
Príkladom takého mutantu je kmeň ATCC14752AilvAthrE::Tn5531.
• • · ···· • ·· • • • · • • • • • ·
• ··· • • • • •
• • ·· • • •
1 · · • · · • • · ·
Kmeň vytvorený opísaným spôsobom sa potom môže použiť na izoláciu a klonovanie génu thrE.
Na to sa založí génová banka záujmovej baktérie. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfíihrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Velmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založil Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v )v-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Pre predložený vynález sú vhodné také vektory, ktoré sa replikujú v koryneformným baktériách, najmä v Corynebačterium glutamicum. Také vektory sú známe z doterajšieho stavu techniky; ako príklad možno uviesť plazmidový vektor pZl, ktorý sa opisuje v Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Génová banka získaná opísaným spôsobom sa následne prenesie pomocou transformácie alebo elektroporácie do indikačného kmeňa s defektom v géne thrE a vyhľadajú sa také transformanty, ktoré majú schopnosť rásť na minimálnom agare v prítomnosti oligopeptidov obsahujúcich treonín. Klonovaný fragment DNA sa môže následne podrobiť sekvenčnej analýze.
Pri použití mutantu koryneformnej baktérie získaného pomocou mutagenézy Tn5531,ako napríklad kmeňa • ···· ·· ·· ·· • · a ···· ··· e*·· ·· · t ·
Ί « · a · · · * a· aaa· ·· ·
ATCC14752AilvAthrE::Tn5531, sa môže alela thrE::Tn5531 priamo využitím génu rezistencie na kanamycín aph3, ktorý sa v nej nachádza, klonovať a izolovať. Na to sa používajú známe klonovacie vektory, ako napríklad pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 a Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103-119). Ako hostitelia na klonovanie sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú defektné vzhľadom na reštrikciu a rekombináciu. Príkladom toho je kmeň DH5amcr, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Selekcia transformantov nastáva v prítomnosti kanamycínu. Plazmid DNA získaných transformantov sa následne sekvencuje. Na to sa môže použiť dideoxy-metóda štiepenia reťazca opísaná v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74:54635467)). Takto sa získajú sekvencie génu thrE proti smeru a v smere inzerčného miesta Tn5531. Získané nukleotidové sekvencie sa analyzujú pomocou komerčne dostupných programov sekvenčnej analýzy, ako je napríklad programový balík Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR,
Madison, USA) alebo programový balík HUSÁR (Release 4.0,
EMBL, Heidelberg, Nemecko), a pospájali.
Týmto spôsobom sa získala nová sekvencia DNA C. glutamicum, kódujúca gén thrE, ktorá je ako SEQ ID NO 1 súčasťou t
predloženého vynálezu. Ďalej sa z existujúcej sekvencie DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušného proteínu pomocou vyššie opísaných metód. V SEQ ID NO 2 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia génového produktu thrE.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SEQ ID NO 1 • ·»·· ·· ·· ·· ··· ···· · · · • ·· · · · · « ··· ··· ·· ···· ·· v dôsledku degenerovateľnosti genetického kódu, sú taktiež súčasťou vynálezu. Rovnako sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa hybridizujú s SEQ ID NO 1 alebo časťami SEQ ID NO 1. V odbornom svete sú ďalej známe konzervatívne výmeny aminokyselín, ako napríklad výmena glycínu za alanín alebo kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú v proteínoch, ako „mutácie so zmyslom (sense mutations), ktoré nevedú k žiadnej zásadnej zmene aktivity proteínu, t. zn. sú funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny na N-konci a/alebo C-konci proteínu nemôžu jeho funkciu podstatne poškodzovať alebo ju môžu dokonca stabilizovať. Údaje k tomu nájde odborník medzi iným v Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), v O'Regan et al. (Gene 77:237251 (1989)), v Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), v Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré vyplývajú príslušným spôsobom z SEQ ID NO 2, sú taktiež súčasťou vynálezu.
Využitím nukleotidovéj sekvencie znázornenej v SEQ-IDNo. 1 sa môžu syntetizovať vhodné primery a tieto sa potom používajú na amplifikáciu génov thrE rôznych koryneformných baktérií a kmeňov pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) . Návody na to nájde odborník medzi iným napríklad v príručke od Gaita: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, Veľká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994). Alternatívne sa môže nukleotidová sekvencia znázornená v SEQ-ID-No. 1 alebo jej časti použiť ako sonda na vyhľadávanie génov thrE v génových bankách najmä koryneformných baktérií. Návody na to nájde odborník medzi iným napríklad v príručke „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl et al. (International Journal of • · • · · · · • · · • ··· • « · · • · ····
Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Týmto spôsobom amplifikované fragmenty DNA obsahujúce gén thrE sa následne klonujú a sekvencujú.
P
Týmto spôsobom sa získala sekvencia DNA génu thrE kmeňa ATCC13032 znázornená v SEQ-ID-No. 3, ktorá je taktiež súčasťou predloženého vynálezu. V SEQ-ID-No. 4 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia.
Predmetom vynálezu je aj spôsob izolácie génu thrE, vyznačujúci sa tým, že ako indikačné kmene sa získajú mutanty najmä koryneformných baktérií, defektné v géne thrE, ktoré rastú len nepatrne alebo nerastú na živnom médiu obsahujúcom oligopeptid obsahujúci treonín a
a) gén thrE sa po založení génovej banky identifikuje a izoluje, alebo
b) v prípade transpozónovej mutácie sa selektuje transpozón obsahujúci prednostne rezistenciu na antibiotiká, a tak sa získa gén thrE.
Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie produkujú treonín po zvýšenej expresii génu thrE zlepšeným spôsobom.
Na dosiahnutie nadmernej expresie sa môže zvýšiť počet kópií príslušných génov alebo sa môže mutovať promótorová a regulačná oblasť alebo miesto naviazania ribozómov, ktoré sa nachádza proti smeru štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-treonínu. Opatreniami na predĺženie trvanlivosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje. Ďalej sa enzýmová aktivita tak10 • ···· · ·· ·· ··· · · · · ··· ···· ·· · · · « ···· ····
9 9 9 9 9 9
999 999 99 9999 99 9 tiež zosilňuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť integrované a amplifikované v chromozóme. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť nadmerná expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou uskutočnenia kultivácie.
Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v US patente 4,601,893, vo Schwarzer a Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), v Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), v Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie .
Príkladom plazmidu, pomocou ktorého sa môže nadmerne exprimovať gén thrE, je pZlthrE (obrázok 2), ktorý sa nachádza v kmeni DM368-2 pZlthrE. Plazmid pZlthrE je kyvadlový vektor C. glutamicum - E. coli spočívajúci na plazmide pZl, ktorý je opísaný v Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Rovnako sa môžu použiť iné plazmidové vektory replikovatelné v C. glutamicum, ako napríklad pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) alebo pZ8-l (EP-B- 0 375 889).
• ··· · · ·· ·· · ··· · · · · «··· • ··· 9 e · · 9 9
9 9 9 9 · · · · · • · . · · 9 9 9 9
999999 99 9999 99 999
Prídavné môže byť pre produkciu L-treonínu výhodné okrem nového génu thrE nadmerne exprimovať jeden alebo viac enzýmov známej biosyntetickej dráhy treonínu alebo enzýmy anaplerotického metabolizmu alebo enzýmy citrátového cyklu. Takto sa napríklad môže nadmerne exprimovať:
• súčasne gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) alebo alela homdr kódujúca „feed back rezistentnú homoseríndehydrogenázu (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)) alebo • súčasne gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (DE-A-19 831 609) alebo • súčasne gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395 - 403 (1998)) .
Ďalej môže byť pre produkciu L-treonínu výhodné okrem nadmernej expresie génu thrE vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie, ako napríklad treoníndehydrogenázu (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, v: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (vyd.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982 a Bell a Turner, Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)).
Mikroorganizmy vytvorené podľa vynálezu sa môžu na účely produkcie L-treonínu kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom batch (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom fed batch (prítokový systém) alebo spôsobom repeated fed batch (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici od Chmiela
• · · • · · • · • · • · ···· ·· (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv'Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) alebo v učebnici od Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza, oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej, mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, máčacia voda, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydrogénfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné soli obsahujúce sodík. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu dodatočne k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené používané suroviny sa • · • · • · · • ··· • , · · · ·· ···· môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 ’C až 45 ’C a najmä približne 25 °Caž 40 °C. Kultúra sa udržiava tak dlho, kým sa nevytvorí maximum L-treonínu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.
Analýza L-treonínu sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) alebo sa môže uskutočňovať pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC), ako sa opisuje v Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 11671174) .
Nasledovné mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa budapeštianskej zmluvy:
• kmeň Brevibacterium flavum DM368-2 pZlthrE ako DSM 12840, • ·
• • · ···· • • • é • ·· • · • · • • ·
• ··· • • • • •
• • · • • • • •
·· ···· ·· •
kmeň Escherichia coli GM2929pCGL0040 ako DSM 12839.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.
Izolácia plazmidovej DNA z Escherichia coli a všetky techniky na reštrikciu, spracovanie Klenowovou a alkalickou fosfatázou sa uskutočnili podľa Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Transformácia Escherichia coli sa uskutočnila, pokiaľ sa neopisuje inak, podľa Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).
Príklad 1
Klonovanie a sekvencovanie génu thrE Corynebacterium glutamicum ATCC14752
1. Transpozónová mutagenéza a výber mutantov
Kmeň Corynebacterium glutamicum ATCC14752Ailv sa podrobil mutagenéze transpozónom Tn5531, ktorého sekvencia je uložená v nukleotidovej databanke National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) pod prírastkovým číslom U53587. Vloženie delécie do génu ilvA Corynebacterium glutamicum ATCC14752 sa uskutočnilo systémom na génovú výmenu opísaným v Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73)). Navyše sa na deléciu použil inaktivačný vektor • ···· ·· ·· ·· ··· ···· · · · • ··· · · · · · • ·.'··· ·· pK19mobsacBAilvA (Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979), ktorý skonštruoval Sahm et al. Najskôr sa transformoval kmeň Escheríchia coli SCS110 defektný vzhladom na metylázu (Jerpseth a Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) od firmy Stratagen (Heidelberg, Nemecko) pomocou 200 ng vektora pK19mobsacBAilvA. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 pg/mL kanamycínu. Z jedného transformantu sa preparoval plazmid pK19mobsacBAilvA. Elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329—334) sa tento inaktivačný plazmid potom vložil do kmeňa Corynebacterium glutamicum ATCC14752. Klony, pri ktorých bol inaktivačný vektor integrovaný v genóme, sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 pg/mL kanamycínu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Aby sa uskutočnila selekcia na excíziu vektora, naniesli sa na platne klony rezistentné na kanamycín na médium LBG obsahujúce sacharózu (médium LB s 15 g/L agaru, 2 % glukózy a 10 % sacharózy). Získali sa pritom kolónie, ktoré znova stratili tento vektor pomocou druhej rekombinantnej udalosti (Jäger et al.;
Journal of Bacteriology (1992) 174: 5462-5465). Preočkovaním na platne s minimálnym médiom (médium CGXII s 15 g/L agaru (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 55955603) s 300 mg/L L-izoleucínu a bez neho, poprípade s 50 pg/mL kanamycínu a bez neho, sa izolovalo šesť klonov, ktoré boli excíziou vektora senzitívne na kanamycín a auxotrofné pre izoleucín a pri ktorých bol teraz v genóme neúplný gén ilvA (alela Ailv). Jeden z týchto klonov sa označil ako kmeň ATCC14752AilvA a použil na transpozónovú mutagenézu.
···· ‘ -IV • · · · · ··· · · · ·’ · · · ··· ·· ···· ·· ·· • · · • · • · · ·· ···
Z metylázovo-defektného kmeňa E. coli GM2929pCGL0040 (E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) sa izoloval plazmid pCGL0040, ktorý obsahoval zložený transpozón Tn5531 (Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). Kmeň Corynebacterium glutamicum ATCC14752AilvA sa elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) transformoval plazmidom pCGL0040. Klony, pri ktorých bol transpozón Tn5531 integrovaný do genómu, sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 pg/mL kanamycinu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Týmto spôsobom sa získalo 2000 klonov, ktoré sa preskúšali na spomalený rast v prítomnosti treonyl-treonyl-treonínu. Na to sa všetky klony jednotlivo preniesli na agarové platne s minimálnym médiom CGXII s 2 mM treonyl-treonyl-treonínu a bez neho. Médium bolo totožné s médiom CGXII opísaným v Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603), obsahovalo však prídavné 25 pg/mL kanamycinu, 300 mg/L Lizoleucínu a 15 g/L agaru. Zloženie média opísaného Keilhauerom et al. je uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Zloženie média CGXII
Zložka Koncentrácia
(NH4)2SO4 20 g/L
Močovina 5 g/L
kh2po4 1 g/L
k2hpo4 1 g/L
MgSO4.7H2O 0,25 g/L
Kyselina 3-morfolinopropán- sulfónová 42 g/L
CaCl2 10 mg/L
··· ···· ···· • ··· · · · · · · • ·»··· ··· ··· ··· ·· ···· ·· ···
FeSO4.7H2O 10 mg/L
MnSO4.H2O 10 mg/L
ZnSO4.7H2O 1 mg/L
CuSO4 0,2 mg/1
NiCl2.6H2O 0,02 mg/L
Biotin 0,2 mg/L
Glukóza 40 g/L
Kyselina protokatechová 30 mg/L
Agarové platne sa inkubovali pri 30 °C a rast sa kontroloval po 12, 18 a 24 hodinách. Získal sa jeden transpozónový mutant, ktorý rástol bez treonyl-treonyl-treonínu porovnateľne s východiskovým kmeňom Corynebacterium glutamicum ATCC14752AilvA, ale v prítomnosti 2 mM treonyltreonyl-treonínu prejavoval spomalený rast. Tento sa označil ako ATCC14752AilvAthrE::Tn5531.
2. Klonovanie a sekvencovanie inzerčného miesta Tn5531 v ATCC14752AilvAthrE::Tn5531
Aby sa klonovalo inzerčné miesto ležiace proti smeru transpozónu Tn5531 v mutante opísanom v príklade 1.1, izolovala sa najskôr chromozómová DNA tohto mutantného kmeňa tak, ako sa opisuje v Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) a 400 ng z nej sa štiepilo reštrikčnou endonukleázou EcoRI. Celá reštrikčná násada sa ligovala do vektora pUC18 taktiež linearizovaného pomocou EcoRI (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106) od firmy Roche Diagnostics (Mannheim, Nemecko). Pomocou celkovej ligačnej násady sa kmeň E. coli DH5amcr E. coli (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval elektroporáciou (Dower et al., Nucleic Acid Research
-· ·· • ···· • «·· — —*·· ·· ·
• · · · • • • • • · •
• · •
• •. • · • • • •
·· ·· · · ·· ···
(1988) 16: 6127-6145). Transformanty, pri ktorých boli vo vektore pUC18 klonované inzerčné miesta transpozónu Tn5531, sa identifikovali na základe svojej rezistencie na karbenicilín a kanamycín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 gg/mL karbenicilínu a 25 gg/mL kanamycinu. Z troch transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa stanovili veľkosti klonovaných inzertov. Nukleotidové sekvencia inzerčného miesta na jednom z plazmidov s inzertom s veľkosťou približne 5,7 kb sa stanovila podľa dideoxymetódy prerušenia reťazca od Sangera et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Na to sa 2,2 kb inzertu sekvencovalo vychádzajúc z nasledovného oligonukleotidového primeru: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'.
Na identifikáciu inzerčného miesta ležiaceho v smere transpozónu sa chromozómová DNA mutantu štiepila reštrikčnou endonukleázou Xbaľ a ligovala do vektora pUC18 linearizovaného pomocou Xbaľ. Ďalšie klonovanie sa uskutočnilo tak, ako sa opisuje vyššie. Nukleotidové sekvencia inzerčného miesta v jednom plazmide s inzertom s veľkosťou približne 8,5 kb sa stanovila podľa dideoxy-metódy prerušenia reťazca od Sangera et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Na to sa 0,65 kb inzertu sekvencovalo vychádzajúc z nasledovného oligonukleotidového primeru: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.
Získané nukleotidové sekvencie sa analyzovali pomocou programového balíka Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA a pospájali. Táto nukleotidová sekvencia je znázornená ako SEQ ID NO 1. Analýza poskytla identifikáciu otvoreného čítacieho rastra s dĺžkou
• • r·· — nr·“ ·· ·· ·
·· • • • • · • • ··
• ··· • 9 • • •
9 ·. • ·· • • 99 · · • • ·· ··
1467 bp. Príslušný gén sa označil ako gén thrE. Príslušný génový produkt obsahuje 489 aminokyselín a je znázornený ako SEQ ID N02.
Príklad 2
Klonovanie a sekvencovanie génu thrE z Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Gén thrE sa klonoval do klonovacieho vektora pUC18 E. coli (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). Klonovanie sa uskutočňovalo v dvoch krokoch. Najskôr sa polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikoval gén z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 prostredníctvom nasledovného oligonukleotidového primeru odvodeného zo SEQ ID NO 1.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3' thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'
PCR reakcia sa uskutočňovala v 30 cykloch v prítomnosti . 200 μΜ deoxynukleotid-trifosfátov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) po 1 μΜ príslušného oligonukleotidu, 100 ng chromozómovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 objemu 10násobku reakčného tlmivého roztoku a 2,6 jednotiek tepelne stabilnej zmesi Taq-/Pwo-DNA-polymerázy (Expand High Fidelity PCR System od firmy Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) v Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Water• ···· «· ·· · · · · · · • ··· · · · · · • !*·!·* *·· ··· ·· ·· ···· ·· · ·· town, USA) za nasledovných podmienok: 30 sekúnd pri 94 °C, sekúnd pri 58 °C a 2 minúty pri 72 °C.
Amplifikovaný fragment s veľkosťou približne 1,9 kb sa potom následne ligoval pomocou SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) podlá údajov výrobcu do štiepneho miesta Smal vektora pUC18. Pomocou celkovej ligačnej násady sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of he United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na karbenicilín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 pg/mL karbenicilínu. Z 8 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúšali na prítomnosť 1,9 kb PCR-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa ďalej označoval ako pUC18thrE.
Nukleotidové sekvencia PCR-fragmentu s veľkosťou 1,9 kb v plazmide pUC18thrE sa stanovila podľa dideoxy-metódou prerušenia reťazca od Sangera et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Na to sa celý inzert pUC18thrE sekvencoval pomocou nasledovného primeru od firmy Roche Diagnostics (Mannheim, Nemecko).
Universalprimer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverseprimer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3' • ···· ·· ·· ··· ···· ··· • ··· · · · · · ··
Nukleotidová sekvencia je znázornená ako SEQ ID NO 3. Získaná nukleotidová sekvencia sa analyzovala pomocou programového balíka Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). Analýza poskytla identifikáciu otvoreného čítacieho rastra s dĺžkou 1467 bp, ktorý sa označil ako gén thrE. Tento kóduje polypeptid so 489 aminokyselinami, ktorý je znázornený ako SEQ ID NO 4.
Príklad 3
Expresia génu thrE v Corynebacterium glutamicum
Gén thrE opísaný v príklade 2 z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 sa na expresiu klonoval do vektora pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Na to sa z plazmidu pUC18thrE pomocou reštrikčných enzýmov Sací a Xbal vyštiepil fragment DNA s veľkosťou 1881 bp, obsahujúci gén thrE. 5'- a 3'-koniec tohto fragmentu sa spracoval Klenowovým enzýmom. Výsledný fragment DNA sa ligoval s defosforylovaným vektorom pZl, predtým linearizovaným pomocou Seal. Pomocou celkovej ligačnej násady sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 pg/mL kanamycínu. Z 2 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúšali na prítomnosť 1881 bp Scal/Xbal-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa označil ako pZlthrE (obrázok 2).
Elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) sa plazmidy pZl a pZlthrE vlo··· · · · · · · · • ··· · · · · · • · ·* · · · · ··· ··· ·· ···· ·· · žili do kmeňa Brevibacterium flavum DM368-2. Kmeň DM368-2 je opísaný v EP-B-0 385 940 a uložený ako DSM5399. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 gg/mL kanamycínu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989)
65: 299-304). Týmto spôsobom vznikli kmene Brevibacterium flavum DM368-2 pZl a DM368-2 pZlthrE.
Príklad 5
Príprava L-treonínu pomocou Brevibacterium flavum
Na overenie svojej tvorby treonínu sa kmene B. flavum DM368-2 pZl a DM368-2 pZlthrE 14 hodín pri 30 °C predbežne kultivovali v 100 mL média Brain Heart Infusion s 50 gg kanamycínu na 1 mL (Difco Laboratories, Detroit, USA). Následne sa bunky jedenkrát premyli 0,9% (w/v (hmotnosť/objem)) roztokom chloridu sodného a touto suspenziou sa naočkovalo 60 mL média CgXII tak, aby Οϋβοο /optická hustota pri 600 nm) bola 0,5. Médium bolo identické s médiom opísaným v Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), obsahovalo však prídavné 50 pg na mL. Kultivácia obidvoch kmeňov sa uskutočňovala 72 hodín pri 30 °C. Po 0, 24, 48 a 72 hodinách sa vždy odobrali vzorky a bunky sa krátko odstreďovali (5 minút pri 13 000 otáčok za minútu pomocou Biofuge pico od firmy Heraeus, Osterode, Nemecko).
Kvantitatívne stanovenie extracelulárnych koncentrácií aminokyseliny v supernatante z kultivácie sa uskutočňovalo pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC) (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 11671174) . Použil sa prístroj HPLC série HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Nemecko) s pripojeným fluorescenčným de···· ·· ·· • f · · · · · ··· 1 · · · · tektorom (G1321A) ; riadenie systému a vyhodnotenie údajov sa uskutočnilo pomocou HP-Chem-Station (Hewlett-Packard). 1 μΣ analyzovaného roztoku aminokyseliny sa zmiešal v automatickej derivatizácii v predkolóne s 20 pL hotového činidla orto-ftalaldehyd/2-merkaptoetanol (Pierce Európe BV, OudBeijerland, Holandsko). Pritom vzniknuté fluoreskujúce tiosubstituované izoindoly (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) sa delili v kombinovanej predkolóne (40x4 mm Hypersil ODS 5) a hlavnej kolóne, obidve kolóny od firmy CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Nemecko) s gradientovým programom s pribúdajúcou nepolárnou fázou (metanoi). Polárnym eluentom bol acetát sodný (O,1M, pH 7,2); prietok bol 0,8 mL za minútu. Fluorescenčná detekcia derivátizovaných aminokyselín sa uskutočňovala pri excitačnej vlnovej dĺžke 230 nm a emisnej vlnovej dĺžke 450 nm. Koncentrácie aminokyseliny sa vypočítali porovnaním s externým štandardom a asparagínom ako doplnkovým interným štandardom.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.
Tabulka 2
Kmeň 0 hod. L-Treonín (g/L) 72 hod.
24 hod. 48 hod.
DM368-2 pZl 0 0,46 1,27 1,50
DM368-2 pZlthrE 0 0, 68 1,71 2,04
Priložené sú nasledovné obrázky:
Príklad 6
Príprava vektora pEC-T18mob2thrE ···· ·· ·· ·· • · · · » · · ··· · · · · · • ·’ · · · ·
1. Konštrukcia pEC-T18mob2
Podľa doterajšieho stavu techniky sa skonštruoval kyvadlový vektor pEC-T18mob2 E. coli - C. glutamicum.
Vektor obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl vrátane replikačného efektora per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén tetA(Z) plazmidu pAGl sprostredkovávajúci rezistenciu voči tetracyklínu (US-A- 5,158,891; zápis do génovej banky v National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) s prírastkovým číslom AF121000), replikačnú oblasť oriV plazmidu pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Qunatitative Biology 43, 77-90 (1979)), frgment génu lacZa vrátane promótora lac a viacnásobného klonovacieho štipneho miesta (multiple cloning site, mcs) (Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)) a oblasť reg plazmidu RP4 (Šimon et al., (1983) Bio/Technology 1:784791) .
Skonštruovaný vektor sa transformoval do kmeňa E. coli DH5a (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. zv. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočňovala rozotretím transformačnej násady na agar LB (Sambrook et al., Molecular · cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1989), ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Plamzidová DNA sa izolovala z transformantu pomocou QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a preskúmala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a HindlII následnou elektroforézou na agarózovom géli (0,8%) .
···· ·· ·· ·· • · · · · 0 · ··· · · · · · • ·’* · · · ··· ·· ···· ··
Plazmid sa nazval pEC-T18mob2 a je znázornený na obrázku 3.
2. Konštrukcia pEC-T18mob2thrE
Gén thrE opísaný v príklade 2 z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 sa na expresiu klonoval do vektora pECT18mob2. Na to sa z plazmidu pUC18thrE pomocou reštrikčných enzýmov Sací a Xbal vyštiepil fragment DNA s veľkosťou 1881 bp, obsahujúci gén thrE. Výsledný fragment DNA sa ligoval do defosforylovaného vektora pEC-T18mob2, predtým linearizovaného pomocou Seal a Xbal. Pomocou celkovej ligačnej násady sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na tetracyklín na agarových platniach LB obsahujúcich 5 pig/mL tetracyklínu. Z 2 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúmali na prítomnosť 1881 bp Scaľ/Xbal-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa označil ako pEC-T18mob2thrE (obrázok 4).
Elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) sa plazmidy pEC-Tl8mob2 a pECT18mob2zhrE vložili do kmeňa Corynebacterium glutamicum MH20-22B-DR17, produkujúceho treonín (Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology (1994) 60: 126-132). Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na tetracyklín a kanamycín na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 pg/mL kanamycínu a 5 pg/mL tetracyklínu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299304). Týmto spôsobom vznikli kmene Corynebacterium gluta• ···· ·· ··“·· · ··· ···· · · ·· t ··· · · · · · j • · ···· · · · ·· ··· ·· ···· ·· ··· micum MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 a MH20-22B-DR17/pECT18mob2thrE.
Príklad 7
Príprava L-treonínu pomocou Corynebacterium glutamicum
Na overenie svojej tvorby treonínu sa kmene C. glutamicum MH20-22B-DR17/pEC-T18mob2 a MH20-22B-DR17/pECT18mob2thrE 14 hodín pri 30 °C predbežne kultivovali v 100 mL média Brain Heart Infusion s 25 pg kanamycínu na 1 mL a 5 pg tetracyklínu na 1 mL (Difco Laboratories, Detroit, USA). Následne sa bunky jedenkrát premyli 0,9% (w/v (hmotnosť/objem) ) roztokom chloridu sodného a touto suspenziou sa naočkovalo 60 mL média CgXII tak, aby ODg00 (optická hustota pri 600 nm) bola 0,5. Médium bolo identické s médiom opísaným v Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), obsahovalo však prídavné 25 pg kanamycínu a 5 pg tetracyklínu na mL. Kultivácia obidvoch kmeňov sa uskutočňovala 72 hodín pri 30 °C. Po 0, 24, 48 a 72 hodinách sa vždy odobrali vzorky a bunky sa krátko odstreďovali (5 minút pri 13 000 otáčok za minútu pomocou Biofuge pico od firmy Heraeus, Osterode, Nemecko).
Kvantitatívne stanovenie extracelulárnych koncentrácií aminokyseliny v kultivačnom supernatante sa uskutočňovalo tak, ako sa už opísalo v príklade 5 pre Brevibacterium flavum, pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC) (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 11671174). Koncentrácie aminokyseliny sa vypočítali porovnaním s externým štandardom a asparagínom ako doplnkovým interným štandardom.
• • · • ··*· • ··· • · • · • · • · • · •
• • « *· a •
·· ····
• · • · · • · • · ·· ···
Výsledky sú uvedené v tabulke 3.
Tabuľka 3
Kmeň L-Treonín (g/L)
0 hod. 24 hod. 48 hod. 72 hod.
MH20-22B-DR17/ pEC-T18mob2 0 3,42 5,82 5,78
MH20-22B-DR17/ pEC-T18mob2thrE 0 4,16 7,53 8,05
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložené sú nasledovné obrázky:
• Obrázok 1: Mapa plazmidu pCGL0040 obsahujúceho transpozón Tn5531. Transpozón je označený ako nešrafovaná šípka.
• Obrázok 2: Mapa plazmidu pZlthrE obsahujúceho gén thrE.
• Obrázok 3: Mapa plazmidu pEC-T18mob2.
• Obrázok 4: Mapa plazmidu pEC-T18mob2thrE obsahujúceho gén thrE.
Údaje pre dĺžky treba chápať ako približné údaje. Použité skratky a označenia majú nasledovný význam:
• Amp: gén rezistencie na ampicilín • Kan: gén rezistencie na kanamycín • 'amp: 3'-časť génu rezistencie na ampicilín • oriBR322: replikačná oblasť plazmidu pBR322 • Tet: gén rezistencie na tetracyklín ···· ··· ··· ··· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • I · · · * ·· ···· ·· * • oriV: plazmidom kódovaný počiatok replikácie E.coli • RP4mob: oblasť mop na mobilizáciu plazmidu • rep: plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl C. glutamicum • per: gén na kontrolu počtu kópií z pGAl • lacZ-alfa: génový fragment lacZa (N-koniec) génu β-galaktozidázy
Skratky pre reštrikčné enzýmy majú nasledovný význam:
• BamHI: reštrikčná endonukleáza z Bacillus amyloliguefaciens • BglII: reštrikčná endonukleáza z Bacillus globigii • EcoRI: reštrikčná endonukleáza z Escherichia coli • EcoRV: reštrikčná endonukleáza z Escherichia coli • HindlII: reštrikčná endonukleáza z Haemophilus influenzae • KpnI: reštrikčná endonukleáza z Klebsiella pneumoniae • PstI: reštrikčná endonukleáza z Providencia stuartii • Pvul: reštrikčná endonukleáza z Proteus vulgaris • Sací: reštrikčná endonukleáza zo Streptomyces achromogenes • Sali: reštrikčná endonukleáza zo Streptomyces albus • Smal: reštrikčná endonukleáza zo Serratia marcescens • Xbal: reštrikčná endonukleáza zo Xanthomonas badrii • Xhol: reštrikčná endonukleáza zo Xanthomonas holcicola ···· ·· ·· ··· ···· · · • ··« · · · · · • ·«·· · · · · ··«!··· ··· ··· ·· ··· ··
SEKVENČNÝ PROTOKOL <110> Degussa-Hills AG
Forschungszentrum-Jillich GmbH <120> Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thrE a spôsob fermentačnej výroby L-treonínu použitím koryneformných baktérií <130> 990079 BT <140>
<141>
<160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2817 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC14752 <22O>
<221> CDS <222> (398)..(1864) <223> thrE-Gen <400> 1 aatgaaataa tcccctcacc aactggcgac attcaaacac cgtttcattt ccaaacatcg 60 agccaaggga aaagaaagcc cctaagcccc gtgttattaa atggagactc tttggagacc 120 tcaagccaaa aaggggcatt ttcattaaga aaatacccct ttgacctggt gttattgagc 180 tggagaagag acttgaactc tcaacctacg cattacaagt gcgttgcgct gccaattgcg 240 ccactccagc accgcagatg ctgatgatca acaactacga atacgtatct tagcgtatgt 300 gtacatcaca atggaattcg gggctagagt atctggtgaa ccgtgcataa acgacctgtg 360 attggactct ttttccttgc aaaatgtttt ccagcgg atg ttg agt ttt gcg acc 415 Met Leu Ser Phe Ala Thr
5
ctt Leu cgt Arg ggc cgc att íle tca aca Ser Thr gtt gac Val Asp 15 get gca aaa gcc gca cct Pro ccg Pro 463
Gly Arg 10 Ala Ala Lys Ala Ala 20
cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg gcc 511
Pro Ser Pro Leu Ala Pro íle Asp Leu Thr Asp His Ser Gin Val Ala
25 30 35
ggt gtg atg aat ttg get gcg aga att ggc gat att ttg ctt tet tca 559
Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg íle Gly Asp íle Leu Leu Ser Ser
40 45 50
ggt acg tca aac agt gat acc aag gtg caa gtt ega gcg gtg acc tet. 607
Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gin Val Arg Ala Val Thr Ser
55 60 65 70
gcg tat ggc ctg tac tat acg cat gtg gat atc acg ttg aat acg atc 655
Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp íle Thr Leu Asn Thr íle
75 80 85
• ···· • · ·· ··
• · • • · • · • · ·
• ··» • · • • ·
• • · •. · • • · ·
• • • · · • • ·
• · ···· ·· ·
acc atc ttc acc aac atc ggt gtg Val gag Glu 95 agg aag atg ccg gtc aac gtg 703
Thr íle Phe Thr 90 Asn íle Gly Arg Lys Met Pro Val 100 Asn Val
ttt cat gtt gtg ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct gag 751
Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser Glu
105 110 115
gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag get ggt get acc ccg cct gag 799
Val Asp Arg Leu íle Arg Ser íle Gin Ala Gly Ala Thr Pro Pro Glu
120 125 130
gtt gcc gag aaa att ctg gac gag ttg gag caa tcg cct gcg tct tat 847
Val Ala Glu Lys íle Leu Asp Glu Leu Glu Gin Ser Pro Ala Ser Tyr
135 140 145 150
ggt ttc CCC gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggc get gtt 895
Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala Val
155 160 165
get gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att get ttt att 943
Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gin Val Ser Leu íle Ala Phe íle
170 175 180
acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag ggt 991
Thr Ala Phe Thr íle íle Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys Gly
185 190 195
ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg ctg 1039
Leu Pro Thr Phe Phe Gin Asn Val Val Gly Gly Phe íle Ala Thr Leu
200 205 210
cct gca tcg att get tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag atc 1087
Pro Ala Ser íle Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gin Phe Gly Leu Glu íle
215 220 225 230
aaa ccg age cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca ggt 1135
Lys Pro Ser Gin íle íle Ala Ser Gly íle Val Val Leu Leu Ala Gly
235 240 245
ttg aca ctt gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc get ccg gtg 1183
Leu Thr Leu Val Gin Ser Leu Gin Asp Gly íle Thr Gly Ala Pro Val
250 255 260
aca gca agt gca ega ttt ttt gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc att 1231
Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly íle
265 270 275
gtt get ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat gtc 1279
Val Ala Gly Val Gly Leu Gly íle Gin Leu Ser Glu íle Leu His Val
280 285 290
atg ttg cct gcc atg gag tcc get gca gca cct aat tat tcg tct aca 1327
Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser Thr
295 300 305 310
ttc gcc ege att atc get ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca gtg 1375
Phe Ala Arg íle íle Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala Val
315 320 325
ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act gcg 1423
Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val íle íle Ala Gly Leu Thr Ala
330 335 340
9999 99 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 999
9 9 9,· ·· 9 ·
9 9*99 9 9
999 ··· ·· ···· ··
ctg atg ggt Leu Met Gly tet Ser gcg Ala ttt Phe tat Tyr tac ctc ttc gtt gtt Val tat Tyr 355 tta Leu ggc Gly ccc Pro 1471
Tyr 350 Leu Phe Val
345
gtc tet gcc get gcg att get gca aca gca gtt ggt ttc act ggt ggt 1519
Val Ser Ala Ala Ala íle Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly Gly
360 365 370
ttg ctt gcc cgt ega ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att gcc 1567
Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu íle Pro Pro Leu íle Val Ala íle Ala
375 380 385 390
ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac ege gga atg tac 1615
Gly íle Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala íle Tyr Arg Gly Met Tyr
395 400 405
gcc acc ttg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg gtt 1663
Ala Thr Leu Asn Asp Gin Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn íle Ala Val
410 415 420
get tta gcc act get tca tca ctt gcc get ggc gtg gtt ttg ggt gag 1711
Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly Glu
425 430 435
tgg att gcc ege agg cta cgt cgt cca cca ege ttc aac cca tac cgt 1759
Trp íle Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr Arg
440 445 450
gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa get gag cag 1807
Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gin Glu Glu Ala Glu Gin
455 460 465 470
aat cag ege cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat caa aga ttc ggt 1855
Asn Gin Arg Arg Gin Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gin Arg Phe Gly
475 480 485
aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg 1904
Asn Lys Arg
tagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1964
gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggtgcc 2024
cgcaggattg ttgccaccta ttctaaggac ttcttcgacg gcgtcacttt gatgtgcatg 2084
ctcggcgttg aacctcaggg cctgcgttac accaaggtcg cttctgaaca cgaggaagct 2144
cagccaaaga aggctacaaa gcggactcgt aaggcaccag ctaagaaggc tgctgctaag 2204
aaaacgacca agaagaccac taagaaaact actaaaaaga ccaccgcaaa gaagaccaca 2264
aagaagtctc aagccggatc ttatatggat gattccaata gctttgtagt tgttgctaac 2324
cgtctgccag tggatatgac tgtccaccca gatggtagct atageatete ccccagcccc 2384
ggtggccttg tcacggggct ttcccccgtt ctggaacaac atcgtggatg ttgggtcgga 2444
tggcctggaa ctgtagatgt tgcacccgaa ccatttcgaa cagatacggg tgttttgctg 2504
caccctgttg tcctcactgc aagtgactat gaaggcttct acgagggctt ttcaaacgca 2564
acgctgtggc ctcttttcca cgatttgatt gttactccgg tgtacaacac cgattggtgg 2624
catgcgtttc gggaagtaaa cctcaagttc gctgaagccg tgagccaagt ggcggcacac 2684
·· ·· » · · · r · · ·· ····
3Ä ggtgccactg tgtgggtgca ggactatcag ctgttgctgg ttcctggcat tttgcgccag 2744 atgcgccctg atttgaagat cggtttcttc ctccacattc ccttcccttc ccctgatctg 2804 ttccgtcagc tgc 2817 <210> 2 <211> 489 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC14752 <400> 2
Met 1 Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg íle Ser Thr Val Asp 15 Ala
5 10
Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro íle Asp Leu Thr
20 25 30
Asp His Ser Gin Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg íle Gly
35 40 45
Asp íle Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gin
50 55 60
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp
65 70 75 80
íle Thr Leu Asn Thr íle Thr íle Phe Thr Asn íle Gly Val Glu Arg
85 90 95
Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn
100 105 110
Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu íle Arg Ser íle Gin Ala
115 120 125
Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys íle Leu Asp Glu Leu Glu
130 135 140
Gin Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala
145 150 155 160
Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gin Val
165 170 175
Ser Leu íle Ala Phe íle Thr Ala Phe Thr íle íle Ala Thr Thr Ser
180 185 190
Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gin Asn Val Val Gly
195 200 205
Gly Phe íle Ala Thr Leu Pro Ala Ser íle Ala Tyr Ser Leu Ala Leu
210 215 220
Gin Phe Gly Leu Glu íle Lys Pro Ser Gin íle íle Ala Ser Gly íle
225 230 235 240.
Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gin Ser Leu Gin Asp Gly
245 250 255
íle Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu
260 265 270
• ···· · · · ··· · · · · · ···,· · · · · • · · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· · ·· ···· ·· ··
Leu Phe Thr 275 Gly Gly íle Val Ala Gly Val Gly Leu Gly íle Gin Leu
280 285
Ser Glu íle Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala
290 295 300
Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg íle íle Ala Gly Gly Val Thr
305 310 315 320
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val íle
325 330 335
íle Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe
340 345 350
Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala íle Ala Ala Thr Ala
355 360 365
Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu íle Pro Pro
370 375 380
Leu íle Val Ala íle Ala Gly íle Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala
385 390 395 4 00
íle Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gin Thr Leu Met Gly
405 410 415
Phe Thr Asn íle Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala
420 425 430
Gly Val Val Leu Gly Glu Trp íle Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro
435 440 445
Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe
450 455 460
Gin Glu Glu Ala Glu Gin Asn Gin Arg Arg Gin Arg Lys Arg Pro Lys
465 470 475 480
Thr Asn Gin Arg Phe Gly Asn Lys Arg
485
<210> 3 <211> 1909 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>
<221> CDS <222> (280)..(1746) <223> thrE-Gen <400> 3 agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccccc ctttgacctg gtgttattga 60 gctggagaag agacttgaac tctcaaccta cgcattacaa gtgcgttgcg ctgccaattg 120 cgccactcca gcaccgcaga tgctgatgat caacaactac gaatacgtat cttagcgtat 180 gtgtacatca caatggaatt cggggctaga gtatctggtg aaccgtgcat aaacgacctg 240 • φφφφ ·· ·· ·· ··· φφφφ ··· • φφφ · · · φ · • · · ·, · · · · · φ φ φ · φ φ φ · ··· ··· ·· φφφφ ·· ·
3*r tgattggact ctttttcctt gcaaaatgtt ttccagcgg atg ttg agt ttt gcg 294 Met Leu Ser Phe Ala
5
acc ctt cgt Arg ggc Gly cgc att tca Ser aca Thr gtt Val gac get gca aaa gcc gca cct Pro 342
Thr Leu Arg 10 íle Asp 15 Ala Ala Lys Ala Ala 20
ccg cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg 390
Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro íle Asp Leu Thr Asp His Ser Gin Val
25 30 35
gcc ggt gtg atg aat ttg get gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct 438
Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg íle Gly Asp íle Leu Leu Ser
40 45 50
tca ggt acg tca aat agt gac acc aag gta caa gtt ega gca gtg acc 486
Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gin Val Arg Ala Val Thr
55 60 65
tct gcg tac ggt ttg tac tac acg cac gtg gat atc acg ttg aat acg 534
Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp íle Thr Leu Asn Thr
70 75 80 85
atc acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac 582
íle Thr íle Phe Thr Asn íle Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn
90 95 100
gtg ttt cat gtt gta ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct 630
Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser
105 110 115
gag gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag get ggt gcg acc ccg cct 678
Glu Val Asp Arg Leu íle Arg Ser íle Gin Ala Gly Ala Thr Pro Pro
120 125 130
gag gtt gcc gag aaa atc ctg gac gag ttg gag caa tcc cct gcg tct 726
Glu Val Ala Glu Lys íle Leu Asp Glu Leu Glu Gin Ser Pro Ala Ser
135 140 145
tat ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggt get 774
Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala
150 155 160 165
• gtt Val get gtg Ala Val ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att íle get Ala 180 ttt Phe 822
Leu Leu 170 Gly Gly Gly Trp Gin 175 Val Ser Leu
• att acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag 870
íle Thr Ala Phe Thr íle íle Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys
185 190 195
ggt ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg 918
Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gin Asn Val Val Gly Gly Phe íle Ala Thr
200 205 210
ctg cct gca tcg att get tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag 966
Leu Pro Ala Ser íle Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gin Phe Gly Leu Glu
215 220 225
atc aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca 1014
íle Lys Pro Ser Gin íle íle Ala Ser Gly íle Val Val Leu Leu Ala
230 235 240 245
• ···· ·· ·· ·· ··· ···· · · • ··· · · · · · • ···,· · · · · • · · · · · · · ··· ··· ·· ···· ··
35'
ggt Gly ttg Leu aca Thr ctc gtg caa Leu Val Gin 250 tet Ser ctg cag gac ggc atc acg ggc get ccg Pro 1062
Leu Gin Asp 255 Gly íle Thr Gly Ala 260
gtg aca gca agt gca ega ttt ttc gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc 1110
Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly
265 270 275
att gtt get ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tet gaa atc ttg cat 1158
íle Val Ala Gly Val Gly Leu Gly íle Gin Leu Ser Glu íle Leu His
280 285 290
gtc atg ttg cct gcc atg gag tcc get gca gca cct aat tat tcg tet 1206
Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser
• 295 300 305
aca ttc gcc cgc att atc get ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca 1254
Thr Phe Ala Arg íle íle Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala
310 315 320 325
gtg ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act 1302
Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val íle íle Ala Gly Leu Thr
330 335 340
gcg ctg atg ggt tet gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc 1350
Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly
345 350 355
ccc gtc tet gcc get gcg att get gca aca gca gtt ggt ttc act ggt 1398
Pro Val Ser Ala Ala Ala íle Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly
360 365 370
ggt ttg ctt gcc cgt ega ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att 1446
Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu íle Pro Pro Leu Íle Val Ala íle
375 380 385
gcc ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg 1494
Ala Gly íle Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala íle Tyr Arg Gly Met
390 395 400 405
tac gcc acc ctg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg 1542
Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gin Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn íle Ala
410 415 420
gtt get tta gcc act get tca tca ctt gcc get ggc gtg gtt ttg ggt 1590
Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly
• 425 430 435
gag tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac 1638
• Glu Trp íle Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr
440 445 4 50
cgt gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa get gag 1686
Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gin Glu Glu Ala Glu
455 460 465 cag aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat cag aga ttc 1734
Gin Asn Gin Arg Arg Gin Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gin Arg Phe
470 475 480 485 ggt aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg 1786
Gly Asn Lys Arg tagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1846 ·· ·· ·· ··· · · · · ··· • ··· · · · · · • ··· · ··· · • · · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· · ···· gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggggta 1906 ccg 1909 <210> 4 <211> 489 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 4
Met 1 Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg íle Ser Thr Val Asp 15 Ala
5 10
Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro íle Asp Leu Thr
20 25 30
Asp His Ser Gin Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg íle Gly
35 40 45
Asp íle Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gin
50 55 60
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp
65 70 75 80
íle Thr Leu Asn Thr íle Thr íle Phe Thr Asn íle Gly Val Glu Arg
85 90 95
Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn
100 105 110
Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu íle Arg Ser íle Gin Ala
115 120 125
Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys íle Leu Asp Glu Leu Glu
130 135 140
Gin Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala
145 150 155 160
Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gin Val
165 170 175
Ser Leu íle Ala Phe íle Thr Ala Phe Thr íle íle Ala Thr Thr Ser
180 185 190
Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gin Asn Val Val Gly
195 200 205
Gly Phe íle Ala Thr Leu Pro Ala Ser íle Ala Tyr Ser Leu Ala Leu
210 215 220
Gin Phe Gly Leu Glu íle Lys Pro Ser Gin íle íle Ala Ser Gly íle
225 230 235 240
Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gin Ser Leu Gin Asp Gly
245 250 255 e
íle Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu
260 265 270
Leu Phe Thr Gly Gly íle Val Ala Gly Val Gly Leu Gly íle Gin Leu
275 280 285
·· ·· ···· ··· ·· · • · · · · · ·· • · · · · · • · · · . · ···· · • · ·:·· · · · «·· ··· ·· ···· ·· ···
Ser Glu 290 íle Leu His Val Met 295 Leu Pro Ala Met Glu 300 Ser Ala Ala Ala
Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg íle íle Ala Gly Gly Val Thr
305 310 315 320
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val íle
325 330 335
íle Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe
340 345 350
Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala íle Ala Ala Thr Ala
355 360 365
Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu íle Pro Pro
370 375 380
Leu íle Val Ala íle Ala Gly íle Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala
385 390 395 400
íle Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gin Thr Leu Met Gly
405 410 415
Phe Thr Asn íle Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala
420 425 4 30
Gly Val Val Leu Gly Glu Trp íle Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro
435 440 445
Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe
450 455 4 60
Gin Glu Glu Ala Glu Gin Asn Gin Arg Arg Gin Arg Lys Arg Pro Lys
465 470 475 480
Thr Asn Gin Arg Phe Gly Asn Lys Arg
485

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA replikovateľná v koryneformných mikroorganizmoch, prednostne rekombinantné, pochádzajúca z Corynebacterium, ktorá obsahuje aspoň jednu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje gén thrE.
  2. 2. Replikovateľná DNA podľa nároku 1 s (i) nukleotidovými sekvenciami znázornenými v SEQ-ID-No. 1 alebo SEQ-ID-No. 3, ktoré kódujú gén thrE, alebo (ii) aspoň jednou sekvenciou, ktorá zodpovedá sekvenciám (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a/alebo poprípade (iv) funkčne neutrálnymi mutáciami so zmyslom v (i) .
  3. 3. Aminokyselinové sekvencia proteínu odvodená z nukleotidových sekvencii podľa nároku 1 alebo 2, znázornená v SEQ-ID-No. 2 a SEQ-ID-No. 4.
  4. 4. Koryneformné mikroorganizmy, najmä rodu Corynebacterium, transformované zavedením jednej alebo viacerých replikovateľných DNA podľa jedného z nárokov 1 alebo 2.
  5. 5. Corynebacterium glutamicum DM368-2 pZlthrE uložený pod číslom DSM 12840.
    ···· • · ·· ·· • e · · · · · • ··· · · · • · · · .· · • · · 1 · · ······ ·· · · · · ·· ·
  6. 6. Spôsob výroby L-treonínu fermentáciou koryneformných baktérií, vyznačujúci sa tým, že sa použijú baktérie, v ktorých sa zosilňujú, najmä nadmerne exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén thrE.
  7. 7. Spôsob podlá nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňuje jeden alebo viac génov biosyntetickej dráhy L-treonínu.
  8. 8. Spôsob podlá nárokov 6a 7, vyznačujúci sa t ý m , že sa používa kmeň transformovaný plazmidovým vektorom a tento plazmidový vektor nesie nukleotidovú sekvenciu kódujúcu gén thrE.
  9. 9. Spôsob podlá nárokov 6 až 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa nadmerne exprimuje gén thrE v mikroorganizmoch, ktoré vykazujú ďalšie mutácie rezistencie voči metaboJitom, poprípade antimetabolitom.
  10. 10. Spôsob podľa nárokov 6 až 9, vyznačujúci sa t ý m , že na dosiahnutie nadmernej expresie sa mikroorganizmy fermentujú v zmenených kultivačných médiách a/alebo sa mení uskutočnenie fermentácie.
  11. 11. Spôsob podlá nárokov 6 až 10, vyznačuj úci sa t ý m , že sa používajú mikroorganizmy, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu treonínu.
  12. 12. Spôsob podľa nárokov 6 až 11, vyznačujúci sa t ý m , že sa používajú mikroorganizmy, v ktorých sa prídavné ku génu thrE jednotlivo alebo spoločne zosilňujú
    • ···· • · ·· • · • · • • · • · • · · • ··· • · • • · • • • · · • • · · • • • *· • • · ·· ···· ·· ·
    (nadmerne exprimujú) ostatné gény metabolickej dráhy tvorby treonínu.
  13. 13. Spôsob výroby L-treonínu , vyznačuj úci sa t ý m , že sa uskutočňujú nasledovné kroky:
    a) fermentácia mikroorganizmov podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, v ktorých sa zosilňuje (nadmerne exprimuje) aspoň gén thrE, poprípade v kombinácii s ďalšími génmi,
    b) koncentrovanie L-treonínu v médiu alebo v bunkách mikroorganizmov a
    c) izolácia L-treonínu.
  14. 14. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium.
  15. 15. Spôsob izolácie génu thrE, vyznačuj úci sa t ý m , že sa ako indikačné kmene získajú mutanty s defektom v géne thrE, prednostne koryneformné baktérie, ktoré len veľmi nepatrne rastú alebo nerastú na živnom médiu obsahujúcom oligopeptid obsahujúci treonín a
    a) identifikuje a izoluje sa gén thrE po založení génovej banky alebo
    b) v prípade transpozónovej mutagenézy sa uskutoční selekcia na transpozón prednostne obsahujúci rezistenciu na antibiotiká, a tak sa získa gén thrE.
SK1304-2000A 1999-09-01 2000-08-28 Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thre a spôsob fermentačnej výroby l-treonínu použitím koryneformných baktérií SK13042000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19941478A DE19941478A1 (de) 1999-09-01 1999-09-01 Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK13042000A3 true SK13042000A3 (sk) 2001-11-06

Family

ID=7920306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1304-2000A SK13042000A3 (sk) 1999-09-01 2000-08-28 Nukleotidové sekvencie kódujúce gén thre a spôsob fermentačnej výroby l-treonínu použitím koryneformných baktérií

Country Status (17)

Country Link
US (4) US6410705B1 (sk)
EP (1) EP1085091B1 (sk)
JP (1) JP2001095592A (sk)
KR (1) KR20010070044A (sk)
CN (1) CN1291651A (sk)
AT (1) ATE245700T1 (sk)
AU (1) AU5502400A (sk)
BR (1) BR0003943A (sk)
CA (1) CA2315978A1 (sk)
DE (2) DE19941478A1 (sk)
ES (1) ES2203384T3 (sk)
HU (1) HUP0003445A2 (sk)
ID (1) ID27099A (sk)
MX (1) MXPA00008459A (sk)
RU (1) RU2000122755A (sk)
SK (1) SK13042000A3 (sk)
ZA (1) ZA200004560B (sk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999018228A2 (de) * 1997-10-04 1999-04-15 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US6797509B1 (en) 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
DE10044831A1 (de) * 2000-03-01 2002-04-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter Mikroorganismus
US20050112733A1 (en) * 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US20030175911A1 (en) * 2000-03-20 2003-09-18 Stephen Hans Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
WO2001092545A1 (en) * 2000-05-27 2001-12-06 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-threonine
WO2002006459A1 (en) * 2000-07-18 2002-01-24 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-threonine
US6630332B2 (en) 2000-07-18 2003-10-07 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of L-threonine
EP1313838A2 (en) * 2000-08-31 2003-05-28 Degussa AG Fermentation process for the preparation of l-threonine
US6562601B2 (en) 2000-08-31 2003-05-13 Degussa Ag Fermentation process for the preparation of L-threonine
WO2002061093A1 (en) * 2001-01-30 2002-08-08 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the otsa gene of c. glutamicum
DE10117816A1 (de) * 2001-04-10 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US7049106B2 (en) 2001-04-10 2006-05-23 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria with an attenuated mqo gene
KR100547882B1 (ko) 2002-02-26 2006-02-01 삼성전자주식회사 안테나 선택 다이버시티를 지원하는 이동통신시스템에서순방향 채널 상태 정보를 송수신하는 방법 및 장치
KR100786987B1 (ko) * 2004-01-30 2007-12-18 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 ｌ-아미노산 생산 방법
US20070092951A1 (en) * 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
KR100838035B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838038B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) * 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
KR101294935B1 (ko) 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
CN108314712A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 中国科学院微生物研究所 L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用
CN108314713A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 中国科学院微生物研究所 L-苏氨酸转运蛋白ThrG及其编码基因与应用
WO2021048353A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Evonik Operations Gmbh Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine
CN114277069B (zh) * 2021-12-20 2024-02-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 制备l-缬氨酸的方法及其所用生物材料

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4517512A (en) 1982-05-24 1985-05-14 Micro Component Technology, Inc. Integrated circuit test apparatus test head
US6649379B1 (en) 1987-06-12 2003-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and deregulated enzyme for threonine production
WO1988009819A2 (en) 1987-06-12 1988-12-15 Massachusetts Institute Of Technology C. glutamicum threonine biosynthetic pathway
DE3737729A1 (de) 1987-11-06 1989-05-18 Degussa Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen
DE69219775T3 (de) 1992-10-14 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin
JP3966583B2 (ja) 1997-06-23 2007-08-29 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE19831609B4 (de) 1997-10-04 2009-11-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
CA2383865A1 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
TR200607441T2 (tr) 1999-06-25 2007-02-21 Basf Aktiengesellschaft Membran sentezi ve membran nakli dahilinde corynemacterium glutamicum kodlayan proteinler.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2315978A1 (en) 2001-03-01
EP1085091A1 (de) 2001-03-21
US6913909B2 (en) 2005-07-05
MXPA00008459A (es) 2004-09-10
DE19941478A1 (de) 2001-03-08
US20030049802A1 (en) 2003-03-13
CN1291651A (zh) 2001-04-18
JP2001095592A (ja) 2001-04-10
US6410705B1 (en) 2002-06-25
HUP0003445A2 (en) 2002-10-28
US20020107378A1 (en) 2002-08-08
US20020146781A1 (en) 2002-10-10
AU5502400A (en) 2002-01-03
ATE245700T1 (de) 2003-08-15
HU0003445D0 (en) 2000-08-31
ZA200004560B (en) 2001-03-01
ID27099A (id) 2001-03-01
KR20010070044A (ko) 2001-07-25
ES2203384T3 (es) 2004-04-16
DE50002971D1 (de) 2003-08-28
RU2000122755A (ru) 2002-12-27
EP1085091B1 (de) 2003-07-23
BR0003943A (pt) 2001-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6913909B2 (en) Nucleotide sequences coding for the thrE gene and process for the enzymatic production of L-threonine using coryneform bacteria
US6613545B1 (en) Nucleotide sequences coding for the export of branched chain amino acids, process for the isolation thereof and use thereof
US20020127663A1 (en) Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene
SK10202000A3 (sk) Koryneformn baktrie produkujce l-lyzn a spsob vroby lyznu
SK18352000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2
SK14582000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén eno
US6783967B2 (en) Nucleotide sequences which code for the rpoB gene
US20020155557A1 (en) Nucleotide sequences which code for the rpsL gene
SK7442000A3 (en) Method for the fermentative preparation of l-amino acids and nucleotide sequences coding for the accda gene
US20020119549A1 (en) Nucleotide sequences which code for the RPSL gene
US20020168731A1 (en) New nucleotide sequences coding for the thrE gene and process for the enzymatic production of L-threonine using coryneform bacteria
US20020111468A1 (en) Nucleotide sequences coding for the sigD gene
US20020031810A1 (en) Nucleotide sequences coding for the lipA gene
US20030166884A1 (en) Nucleotide sequences which code for the rpoB gene
SK17372000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka
US20020155551A1 (en) Process for the fermentative preparation of L-threonine
US20020107379A1 (en) Nucleotide sequences coding for the thyA gene
SK17362000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfk
MXPA00009770A (es) Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen irp.
US20020137912A1 (en) Nucleotide sequences which code for the cstA gene
SK4252001A3 (en) Nucleotide sequences which code for the rp1k gene