SK62297A3

SK62297A3 - Production of variant nisin

Info

Publication number: SK62297A3
Application number: SK622-97A
Authority: SK
Inventors: Michael J Gasson; Helen M Dodd
Original assignee: Inst Of Food Research
Priority date: 1994-11-19
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1997-12-10
Also published as: CA2205204A1; KR970707290A; HUT77421A; CN1085249C; CZ152197A3; ATE292686T1; BR9510454A; JPH11500604A; FI972100A0; DE69534133T2; NO972277L; EP0793727A1; NO972277D0; GB9423404D0; PL320328A1; CN1171134A; AU708788B2; US6448034B1; EP0793727B1; AU3876195A

Description

Bunka, ktorá je schopná produkovať variantný nizín, neobsahuje prirodzený nisA gén, ale variantný nisA gén, ktorý má v zoskupení génov rovnaké vzťahy ako prirodzený nisA gén a ďalej obsahuje gény na modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť proti nizínu. Výhodne bunka obsahuje variantný nisA gén v chromozomálnom umiest-není uvedeného prirodzeného nisA génu. Sú opísané spôsoby na vytváranie buniek a spôsoby na produkciu nizínu, hlavne variantného nizínu.

SPÔSOB PRODUKCIE VARIANTNÉHO NIZÍNU

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka vylepšených metód a bakteriálnych kmeňov pre produkciu nizínu, hlavne proteínom - spracovaného nizínu.

Doterajší stav techniky

Nizín je vysoko modifikované peptidové antibio.ikum produkované, napríklad, istými kmeňmi Lactococcus lactis. Je veľmi dôležitý pre potravinársky priemysel vzhľadom k svojej účinnej antimikrobiálnej aktivite proti širokému spektru gram - pozitívnych mikroorganizmov vrátane mnohých kaziacich baktérií a potravinových patogénov, napríklad Listeria, Clostridium a Bacillus species (pozri Fowler a Gasson (1990) vo Food Preservatives (vyd. N. J. Russel a G. W. Goulds), str. 135 - 152, Blackie and Sons, Glasgow, UK).

Chemická štruktúra nizínu je dobre stanovená (obrázok 1). Je členom rodiny antibiotík nazývaných lantibiotiká. Tieto nezvyčajné polycyklické peptidy majú štrukturálne vlastnosti dehydro-zvyškov a medzireťazcové sulfidové mostíky vytvárajúce lantionínové a β-metyllantionínové kruhy. Atypické zvyšky sú vložené posttranslačnou modifikáciou aminokyselín serínu, treonínu a cysteinu v primárnej sekvencii prekurzorového pepťiu (lantibiotiká sú predmetom nedávnej rozsiahlej správy Junga (1991) v Nisins and hovel Lantibiotics (vyd. Jury, G. a Sahl, H. - S.), str. 1 - 34, ESCOM, Leiden, Holandsko). Biosyntéza nizínu tak vyžaduje gény ako pre inaktiváciu prekurzoru nizínu, známeho ako prenizin (nisA), tak tiež pre modifikáciu enzýmov zodpovedných za maturáciu nizínu. Maturovaná molekula nizínu je založená na sekvencii 34 aminokyselín. Proteín kódovaný nisA. obsahuje 23 aminokyselinovú N-terminálnu signálnu sekvenciu, ktorá je štepená počas sekrécie nizínu. Konverzia prenizínu, kódovaného nisA, na zrelý nizín vyžaduje štepenie leadera a modifikáciu jednotlivých aminokyselín. NisA gén bol klonovaný a charakterizovaný a ukázalo sa, že má chromozomálne umiestnenie (pozri Dodd et al. (1990), J. Gen. Microbiol., 136, 555 - 566). Množstvo ďalších génov vyžadovaných v enzymatickej modifikácii prenizínu, translokácii a odolnosti voči nizínu je kódované nizín produkujúcimi kmeňmi (Kuipers et al. (1993), Eur. J. Biochem. 216, 281 - 291, Engelke et al. (1994), Appl. Environ. Microbiol. 60, 814 - 825).

Zavedené techniky proteínového spracovania môžu byť použité pre zavedenie zmien aminokyselinovej sekvencie nizínu. Toto vyžaduje modifikovanie kódujúceho regiónu štrukturálneho génu pre nizín, nisA, napríklad miestne riadenou alebo náhodnou mutagenézou. Expresia týchto zmien je komplikovaná faktom, že nizín je posttranslačne modifikovaný.

Variantné nizíny môžu byť konštruované expresiou variantných nisA génov v hostiteľských kmeňoch, ktoré kódujú nevyhnutný maturačný systém, a tým spracovanie modifikovaného prekurzorového peptidu. Jedným prístupom je transformácia nizín produkujúcich kmeňov rekombinantným plazmidom kódujúcim variantný nisA gén. Na takomto pozadí sú maturačné enzýmy hostiteľa schopné spracovať ako rezidentný prenizín, tak jeho plazmidom kódovaný variant. Stratégia tohto typu bola popísaná pre kmene nesúce divoký typ nizínových transpozónov (Kuipers et al. (1991) v Nisins and novel Lantibiotics (vyd. Jung, G. a Sahl, H.-S.), str. 250 - 259, ESCOM, Leiden, Holandsko). Avšak nevýhodou tohto systému je to, že ako nizíny hostiteľa, tak spracované varianty sú syntetizované spoločne, čo spôsobuje nevyhnutnosť komplexných chemických separačných postupov pred analýzou vlastností nového peptidu. Takéto postupy môžu byť hlavne nežiaduce pre priemyselný rozsah produkcie variantného nizínu.

WO 93/20213 popisuje proces pre produkciu variantného nizínu z Lactococcus za absencie prirodzeného nizínu, v ktorom je z plazmidu pochádzajúci variantný nisA gén (ktorý kóduje variantný nizín) zavedený do kmeňa Lactococcus, ktorý nesecernuje svoj prirodzený nisA nizín (pretože nisA gén bol aktivovaný), ale je schopný expresie génov pre modifikáciu nizínu, odolnosti voči nizínu a translokáciu z bunky.

WO 92/18633 popisuje na plazmide založený systém pre expresiu variantných nižínov ž nisZ génu (alebo jeho mutantu) kmeňov Lactococcus, ktoré neprodukujú prirodzený nisA nizín.

Neočakávane sme zistili, že pri nahradení prirodzenej, chromozomálnej kópie nisA génu (alebo aspoň jeho časti) variantným nisA génom (alebo jeho častí) môžeme produkovať prekvapujúco vysoké hladiny nizínu, hlavne variantného nizínu, z Lactococcus. Tak predkladaný vynález poskytuje zlepšenú metódu a organizmy pre produkciu variantných nizínov s väčšou účinnosťou.

Jeden aspekt vynálezu poskytuje metódu na v robu buniek, ktoré neobsahujú prirodzený nisA gén, ale exprivujú nizín, ktorý obsahuje krok poskytnutia buniek s variantným nisA génom a gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu, kde variantný nisA gén má rovnaké vzťahy ako prirodzený nisA gén na zoskupenie génov obsahujúcemu prirodzený nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu.

Poskytnutím buniek s variantným nisA génom gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu sa myslí inzercia variantného nisA génu do bunky, ktorá už obsahuje gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu, rovnako ako inzercia do bunky - v rovnakej dobe - variantného nisA génu do bunky, plus génov pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu.

Zoskupenie génov, obsahujúce gény kódujúce pre-nizín A (ktorý je spracovaný za tvorby nizínu A) a génov pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu z Lactococcus lactis (nisABTCIPRK) sú popísané v Kuipers et al., (1993) Eur. J. Biochem. 216, 281 - 291, Engelke et al. (1994), Appl. Environ. Microbiol. 60, 814 - 825, čo je tu uvedené ako odkaz.

NisA gén je gén, ktorý kóduje pre-nizín (pre-nizín obsahuje 23 aminokyselín Nterminálnej signálnej sekvencie, ktoré sú odštepené v priebehu sekrécie); o nisB a C sa usudzuje, že sa vyžadujú v reakciách, ktoré modifikujú pre-nizín tvorený priamo z expresie nisA génu; nisT je podobný transportnej ATP-áze a vyžaduje sa v translokácii nizínu z bunky; nisP sa vyžaduje v extracelulárnom spracovaní plne zrelého prekurzora nizínu; nisR a K kódujú regulačné proteíny vyžadované v génovej expresii a nisl sa vyžaduje v odolnosti voči nizínu. Nukleotidová sekvencia nisABTCIPRK zoskupenia génov je ukázaná na obrázku 7 a 8.

Preferovane obsadzuje variantný nisA gén rovnakú pozíciu v zoskupení génov ako prirodzený nisA gén. Preferuje sa, aby bunkou bola lactococcová bunka, najviac preferovaná je bunka Lactococcus lactis. Vhodné bunky, hlavne Lactococcus bunky, sú odborníkom ľahko dostupné. Samozrejme sa požaduje, aby to boli nizin produkujúce bunky, preferovane nizín produkujúce, maturujúce a secernujúce bunky, ale môžu sa použiť akékoľve.. bunky. Napríklad prirodzene sa vyskytujúci nizín produkujúci kmeň NCFB894, ako je uložený v National Collection of Food Bacteria v Inštitúte of Food Research, Norwich Laboratory, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UA, UK (a ako je popísaný v Gasson (1984) FEMS Microbial Lett. 21, 7 - 10) je vhodnou Lactococcus bunkou pre použitie v metóde podľa vynálezu.

Prirodzeným nisA nizinom sa myslí peptidové antibiotikum produkované niektorými prirodzene sa vyskytujúcimi nizín produkujúcimi kmeňmi baktérií. Zrelá molekula je založená na sekvencii aminokyselín kódovanej génom nisA. Chemická štruktúra prirodzeného nisA nizínu je ukázaná na obrázku 1.

Termínom prirodzený nisA nizín sa tiež myslia iné prirodzene sa vyskytujúce nizíny, ktoré sú založené na, ale odlišujúce sa od, nisA nizínu ukázaného na obrázku 1. Napríklad sem zahrňujeme nizín Z, ktorý má rovnakú chemickú štruktúru ako nisA nizín ukázaný na obrázku 1 s výnimkou histidínu v pozícii 27, ktorý je nahradený asparagínom. U génu, ktorý kóduje nizín Z, sa našla iba jedna nukleotidová substitúcia pri porovnaní s nisA génom, ktorý kóduje nizín A ukázaný na obrázku 1.

Zvýšenou hladinou jeho prirodzeného nisA nizíriu v porovnaní s prirodzenou hladinou sa myslí, že bunka modifikovaná podľa vynálezu produkuje aspoň o 5 % viac, lepšie o 10 % viac a najlepšie o 50 % viac a úplne najlepšie >100 % viac prirodzeného nisA nizínu ako nemodifikovaná bunka, ak sú kultivované za rovnakých kultivačných podmienok.

Variantným nizínom sa myslí proteínovo spracovaný variant prirodzeného nisA nizínu, v ktorom boli vykonané zmeny aminokyselinovej sekvencie v dôsledku miestne riadenej alebo náhodnej mutagenézy nisA génu. Vhodne, jedna alebo viacero chybných mutácií je vložené do proteín kódujúceho regiónu, čo vedie k substitúcii jednej alebo viacerých aminokyselín za iné. Alternatívne nezmyselná mutácia môže byť zavedená, takže je produkovaný skrátený nizín. V tomto prípade si nizín stále uchováva antibiotickú aktivitu. Ako ďalšia alternatíva môže byť vykonaná delécia a/alebo inzercia nisA génu, ak si výsledný nizín uchováva antibiotic .ú aktivitu.

Miestne riadená mutagenéza nisA génu môže byť vykonaná, napríklad oligonukleotidmi riadenou technikou mutagenézy podľa Zoller a Smith (1984), DNA 3, 479 - 480, kde sú použité chybne spárované oligonukleotidové priméry pre zavedenie mutácie. Je vhodné použiť metódu pre zlepšenie výnosu mutantov, napríklad dut-ung metódu), ktorú popísal Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 - 492. Alternatívne môže byť použitá polymerázová reťazová reakcia (PCR) pre generovanie mutantov za použitia chybne spárovaných oligonukleotidov (Saiki et al. (1988), Science 239, 487 - 491). Náhodné mutanty nisA génu môžu byť vyrobené chemicky napríklad s použitím hydrogénsiričitanu sodného alebo hydroxylamínu ako mutagénu. Alternatívne, náhodné mutácie môžu byť vložené do nisA génu za použitia enzymatickej chybnej inkorporácie za použitia DNA polymerázy ; relatívne nízkou správnosťou, napríklad AMV reverznej transkriptázy alebo Taq DNA polymerázy alebo za použitia zmesi oligonukleotidov, v priebehu syntézy, pre inkorporovanie malého množstva každej odlišnej bázy v každej pozícii. Tieto metódy sú v odbore dobre známe.

Variantným nisA génom sa myslia fragmenty nisA génu, kde sa uvedené fragmenty odlišujú v porovnaní s 'ekvivalentnou časťou prirodzeného nisA génu.

Variantným nisA génom špecificky sa myslia gény, v ktorých je promótorový región prirodzeného nisA génu nahradený iným (heterológnym) promótorom, preferovane takým, o ktorom je známe, že je silnejším promótorom ako je prirodzený promótor nisA génu. Príkladmi vhodných promótorov sú indukovateľný lacA promótor (van Rooijen et al. (1992), J. Bacteriol. 179, 2273 - 2280) a T7 promótor (Wells et al. (1993), Mol. Microbiol. 5, 1155 - 1162), obidve sú tu uvedené ako odkaz.

Termínom variantný nisA gén sú tiež mienené gény, v ktorých je modifikovaný väzobný región pre ribozómy, preferovane kvôli vylepšeniu účinnosti iniciácie translácie nisA kódujúceho regiónu.

Tiež zahrnuté v termíne variantný nisA gén sú gény, ktoré majú silentné mutácie v kódujúcom regióne, to znamená gény, v ktorých je jeden alebo viacero kodónov zamenených za ich synonymá, ale kde je týmito kódovaný prirodzený nisA nizín. Účinnosť translácie môže byť zlepšená za použitia takýchto variantov nizín kódujúcich regiónov. Tiež sem zahrňujeme gény, ktoré obsahujú heterológne promótory pre riadenie transkripcie variantného kódujúceho regiónu, to znamená, promótory odlišné od promótora prirodzeného nisA génu.

Vo všetkých prípadoch sa preferuje, aby kombinácia promótora, ribozomálneho väzobného miesta a kódujúceho regiónu dávala optimálnu expresiu nizínu kódovaného kódujúcim regiónom.

Variantné nížiny, ktoré majú zlepšené vlastnosti v porovnaní s prirodzeným nisA nizínom, sú preferované pri pridaní do potravín, napríklad tie variantné niziny, ktoré majú silnejšiu antimikrobiálnu aktivitu alebo ktoré majú vyššiu rezistenciu na hydrolýzu alebo degradáciu. Variantné niziny sú popisované vo WO 93/20213 a WO 92/18633 (tu uvedené ako odkaz) a v príkladoch ilustrujúcich tento vynález.

Preferované vyhotovenie vynálezu poskytuje metódu na výrobu buniek, ktoré buď (a) neexprivujú svoj prirodzený nisA nizín, ale exprivujú variantný nizín, alebo (b) exprivujú zvýšené hladiny svojho prirodzeného nisA nizínu vzhľadom k prirodzenej hladine a, v každom prípade, sú schopné expresie génov pre modifikáciu nizínu a odolnosť voči nizínu, kde táto metóda obsahuje krok substitúcie variantného nisA génu alebo jeho časti za prirodzený, chromozomálny nisA gén alebo jeho časť v chromozomálnom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu.

Variantný nisA gén alebo jeho časť môže byť substituovaný za prirodzený, chromozomálny nisA gén alebo jeho časť v chromozomálnom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu v jednom kroku nahradenia génu. Výhodne, plazmid obsahujúci variantný nisA gén alebo jeho časť je zavedený do hostiteľskej bunky obsahujúcej chromozomálnu kópiu prirodzeného nisA génu (a výhodne génov pre modifikáciu nizínu, odolnosť voči nizínu a translokáciu nizínu z bunky). Dvojitá skrížená rekombinácia môže viesť k tomu, že prirodzený nisA gén alebo jeho časť je nahradený variantným nisA génom alebo jeho časťou. Vzniknutá bunka bude obsahovať chromozomálnu kópiu variantného nisA génu, a preto bude produkovať variantný nizín, pretože variantný nisA gén obsahuje kódujúci región, ktorý bol modifikovaný.

Nie je nevyhnutné, aby bol nahradený celý nisA gén. Lepšie je, aby bola nahradená časť nisA génu, ktorá kóduje aminokyselinovú zmenu prítomnú vo variantnom nizíne alebo ktorá obsahuje heterológny promótor.

NisA gén a iné gény nevyhnutné pre biosyntézu nizínu, maturáciu a sekréciu sú prirodzene umiestnené na transpozóne, ktorý je časťou chromozónu. Tak chromozomálne umiestnenie označuje prítomnosť nisA génu v chromozomálnej DNA vo vnútri zoskupenia génov pre nizín (nisABTCIPRK) skôr ako pozíciu zoskupenia génov vzhľadom k iným genetickým markérom na chromozóme.

Je dobre známe, že homológna rekombinácia vyskytujúca sa v Lactococcus je veľmi neúčinná a nepredvídateľná a, hoci vyššie popísaná priama, jednokroková metóda je vykonateľná, viac sa preferuje, ak je nahradenie génu vykonané nepriamym, dvojkrokovým procesom, pri ktorom je možná selekcia požadovaných rekombinantov ako bude teraz popísané:

Ďalšia preferovaná metóda obsahuje kroky (1) substitúciu counterselektovateľného nisA génu alebo jeho časti za prirodzený, chromozomálny nisA gén alebo jeho časť v chromozomálnom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu a (2) substitúciu variantného nisA génu alebo jeho časti za značkovací - selektovateľný nisA gén alebo jeho časť v chromozomálnom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu.

Značkovacím - selektovateľným nisA génom sa mien;, že nisA gén je modifikovaný tak, že je ľahko odlíšiteľný od prirodzeného nisA génu alebo od variantného nisA génu.

Vhodne, značkovací - selektovateľný nisA gén je nisA gén, v ktorom bol inzerovaný gén antibiotickej rezistencie (ako je gén rezistencie na erytromycín) alebo je to nisA gén, v ktorom boli niektoré alebo všetky regióny deletované. Preferuje sa, ale nie je to nevyhnutné, aby značkovací - selektovateľný nisA neexprivoval nizín.

Nie je nevyhnutné, aby bol nahradený celý nisA gén. Lepšie je, aby bola nahradená časť nisA génu obsahujúca značkovací - selektovateľný markér.

V týchto príkladoch môže byť značkovací - selektovateľný nisA gén odlíšený od prirodzeného alebo variantného nisA génu pomocnú rezistencie na antibiotiká značkovacieho - selektovateľného génu a/alebo odlišnosťou veľkosti.

Tak je relatívne ľahké určiť, či bol dosiahnutý krok 1 preferovanej metódy, pretože vzniknutá bunka, napríklad získa antibiotickú rezistenciu alebo, ak mal značkovací selektovateľný nisA gén deléciu, budú špecifické fragmenty bunečnej chromozomálnej DNA chýbať alebo budú redukovanej dĺžky.

To, že špecifické fragmenty bunečnej chromozomálnej DNA chýbajú alebo sú redukovanej dĺžky môže byť ľahko určené známymi molekulárnymi technikami ako je Southern blotting, polymerázová reťazová reakcia (PCR) alebo analýza polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP).

Podobne je relatívne ľahké určiť, či sa dosiahol krok 2 preferovanej metódy, pretože vzniknutá bunka napríklad stratí antibiotickú rezistenciu alebo získa fragment chromozomálnej DNA.

Zvyčajne v tomto preferovanom vyhotovení je se.ekcia asociovaná s krokom 2. Napríklad sa preferuje, aby značkovací - selektovateľný gén v kroku 1 obsahoval deléciu celého alebo časti nisA kódujúceho regiónu (delta nisA) a aby v kroku 2 bolo vybrané správne nahradenie variantným nisA génom. Tak v preferovanej metóde Lactococcus lactis kmeň, obsahujúci ^AnisA gén (vyrobený v kroku 1) je použitý v kroku 2. Termosenzitívny prenosový vektor (replikácia permisívna pri nízkej teplote, ale nie pri vysokej teplote) je použitý pre zavedenie variantného nisA génu na chromozóm ^AnisA kmeňa. Napríklad ^AnisA kmeň je transformovaný plazmidom obsahujúcim variantný nisA gén a gén pre antibiotickú rezistenciu a bunka je inkubovaná pri permisívnej teplote za prítomnosti antibiotika. Bunka je potom prenesená do nepermisívnej teploty za prítomnosti antibiotika a jednotlivé kríženie vedie k integrácii plazmidu do chromozómu v mieste plazmid/chromozóm homológie (t.j. v spoločných regiónoch ^AnisA a variantného nisA génu).

Bunka je potom transferovaná do nepermisívnej teploty kvôli umožneniu replikácie plazmidu. Rekombinácia medzi dvoma homológnymi sekvenciami obklopujúcimi integrovaný plazmid vedie k jeho excízii z chromozómu. Druhé prebiehajúce kríženie vedie k tomu, že ako sekvencie pochádzajúce z plazmidu (t.j. variantného nisA génu), tak pôvodné sekvencie t.j. značkovacieho selektovateľného nisA génu) sú uchované na chromozóme. Ako bolo uvedené vyššie, variantný nisA gén a značkovací - selektovateľný nisA gén môžu byť rozlíšené a sú vybrané bunky obsahujúce variantný nisA gén.

Bunky sú zbavené plazmidu kultiváciou za absencie antibiotika.

V tejto preferovanej metóde je celý nisA gén a susediaca sekvencia účinne nahradený identickými sekvenciami, s výnimkou špecificky inkorporovaných mutácií. Veľkosť fragmentu plazmidovej DNA, obsahujúceho variantný nisA gén, je obmedzená požiadavkou na homológiu sekvencií (ako na plazmide, tak na chromozóme), cez ktoré je rekombinácia vykonaná, aby priniesla integráciu plazmidu a následne nahradenie génu. Je tu preferovaná vektorová konštrukcia, ktorá má približne 1 kb homológnej susediacej sekvencie k akejkoľvek alterácii sekvencie. Napríklad, náš vektor pre génovú náhradu má približne 800 bp na strane nisA génu a 1200 )p na druhej strane. Pri redukcii veľkosti možno očakávať redukciu incidencie homológnych rekombinácií, a tým šance na detekovanie génového nahradenia. Obrázok 10 ilustruje rekombinácie, ktoré sa vyskytujú počas preferovanej metódy.

Metóda podľa vynálezu vedie k bunkám, ktoré produkujú variantný nizín z chromozomálnych kópií variantného nisA génu alebo prirodzený nisA nizín z chromozomálnej kópie variantného nisA génu. Ako bolo uvedené vyššie, najviac sa preferuje, ak má variantný nizín antibiotickú aktivitu. Tak bunky budú vykazovať Nis⁺ fenotyp, pretože bunky produkujú nizín (variantný alebo prirodzený).

Určili sme, že tieto nizín produkujúce bunky nevyhnutne musia byť odolné na nizín v tých hladinách, v ktorých tieto produkujú tento antimikrobiálny peptid. Tak v ďalšom preferovanom vyhotovení metóda obsahuje ďalší krok selekcie tých buniek, ktoré sú odlišné voči nizínu, aspoň pri hladine 1000 U/ml.

Hoci sa preferuje, aby bunky produkované podľa metódy exprivovali variantný nizín, metóda tiež zahrňuje výrobu buniek, ktoré môžu exprivovať prirodzený nisA vo vysokých hladinách vďaka silnému, heterológnemu promótoru.

V menej preferovanom vyhotovení zoskupenia génov obsahuje variantný nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu a odolnosť voči nizhu a toto zoskupenie je umiestnené na autonómne sa replikujúcom DNA elemente. Zvyčajne je týmto autonómne sa replikujúcim elementom plazmid. Hostiteľskou bunkou pre plazmid je bunka, ktorá neexprivuje prirodzený nisA nizín. Napríklad Lactococcus bunka, v ktorej nie sú prítomné prirodzené gény pre nizín alebo kde je nisA gén inaktivovaný.

Klonovanie celého zoskupenia génov pre nizín na plazmid vyžaduje integráciu veľkého segmentu (= 11 kb) DNA. Táto stratégia má výhodu v umožnení alterácie množstva kópií, a tak dávky génu a tiež môže uľahčiť transfer nizínových determinantov do spektra alternatívnych pozadí hostiteľa. Existujú dva preferované typy replikónov (ktoré využívajú odlišné spôsoby replikácie), ktoré môžu byť využité ako vhodné vektory: kruhové plazmidy (napríklad pTG262, Dodd et al. (1990), J. Gen. Microbiol. 136, 555 - 566) alebo theta typ plazmidov (napríklad plL253, vysoké množstvá kópií a plL277, nízke množstvá kópii, Šimon and Chopin (1988), Biochimie 70, 559 - 566). Obidve správy sú tu uvedené ako odkazy. Pokiaľ metóda podľa vynálezu využíva lactococcové bunky, preferuje sa, aby plazmid bol prenosový plazmid, čo je plazmid, ktorý sa môže replikovať v lactococcových bunkách a môže sa tiež replikovať v iných hostiteľských bunkách ako je Escherichia coli.

Sú vyvinuté rôzne metódy pre operatívne nadviazanie DNA na vektory prostredníctvom ich komplementárnych lepivých koncov. Napríklad komplementárne hbmopolymérové úseky môžu byť pridané k DNA segmentu, ktorý má byť inzerovaný na vektorovú DNA. Vektor a DNA segment sú potom spojené vodíkovou väzbou medzi komplementárnymi homopolymérovými koncami za tvorby rekombinantných DNA molekúl.

Syntetické linkéry, obsahujúce jedno alebo viacero reštrikčných miest, poskytujú alternatívnu metódu pre pripojenie DNA segmentov na vektor. DNA segment, generovaný trávením reštrikčnou endonukleázou, ako bolo popísané skôr, je ošetrený bakteriofágovou T4 DNA polymerázou alebo E. coli DNA polymerázou I, enzýmy, ktoré odstraňujú presahujúce, 3'-jednoreťazcové konce pomocou svojej 3'-5'-exonukleolytickej aktivity a vypĺňajú prerušené 3'-konce pomocou svojej polymerizujúcej aktivity.

Kombinácia týchto aktivít preto generuje tupo zakončené DNA segmenty. Tupo zakončené segmenty sú potom inkubované s veľkým molárnym prebytkom linkér molekúl za prítomnosti enzýmu, ktorý je schopný katalyzovať ligáciu tupo zakončených DNA molekúl, ako je bakteriofágová T4 DNA ligáza. Tak produktom reakcie sú DNA segmenty nesúce polymerické linkérové sekvencie na svojich koncoch. Tieto DNA segmenty sú potom štepené vhodným reštrikčným enzýmom a ligované do expresného vektora, ktorý bol štepený enzýmom, ktorý produkuje konce kompatibilné s koncami DNA segmentu.

Syntetické linkéry obsahujúce množstvo miest pre reštrikčné endonukleázy sú komerčne dostupné z množstva zdrojov vrátane International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA.

Žiaducim spôsobom pre modifikáciu DNA kódujúci polypeptid podľa vynálezu je použitie polymerázovej reťazovej reakcie ako ju popísal Saiki et al. (1988), Science239, 487-491.

V tejto metóde je DNA, ktorá má byť enzymaticky amplifikovaná, obklopená dvoma špecifickými oligonukleotidovými primérmi, ktoré samotné budú inkorporované do amplifikovanej DNA. Uvedené špecifické priméry môžu obsahovať rozpoznávacie miesta pre reštrikčnú endonukleázu, ktoré môžu byť použité pre klonovanie do expresných vektorov za použitia metódy známej v odbore.

Druhý aspekt vynálezu poskytuje bunky, ktoré neobsahujú prirodzený nisA gén, ale exprivujú nizín, ktoré obsahujú variantný nisA gén, kde variantný nisA gén má rovnaké vzťahy ako prirodzený nisA gén ku génovému zoskupeniu, obsahujúcemu prirodzený nisA gén a gény pre modifikáciu nížinu, sekréciu a odolnosť voči nížinu.

V najviac preferovanom vyhotovení je prirodzený, chromozomálny nisA gén alebo jeho časť, neprítomný a bunka obsahuje variantný nisA gén alebo jeho časť v chromozomálnom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu.

Preferovanou bunkou je Lactococcus, lepšie Lactococcus lactis.

Preferuje sa, aby bunky exprivovali variantný nizi.i, hoci bunky, ktoré exprivujú zvýšené hladiny prirodzeného nisA nizínu, tiež tvoria časť vynálezu.

Bežne variantný nisA gén obsahuje transkripčné a translačné kontrolné sekvencie, ktoré umožňujú bunke buď exprivovať variantný nizín alebo v prípade prirodzeného nisA nizínu umožňujú bunke exprivovať tento vo zvýšenej úrovni. Tak v jednom vyhotovení bunka obsahuje variantný nisA gén skladajúci sa z heterológneho promótora, ktorý riadi expresiu nizín kódujúceho regiónu (ktorý môže exprivovať prirodzený nisA nizín alebo variantný nizín).

V menej preferovanom vyhotovení bunka obsahuje autonómne sa replikujúci DNA element nesúci variantný nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu a odolnosť voči nizínu. V tomto prípade nebude bunka mať aktívny chromozomálny nisA gén a preferovane žiadne chromozomálne gény pre nizín.

Tretí aspekt vynálezu poskytuje proces pre produkciu nizínu, ktorý obsahuje kultiváciu buniek, ako je popísané v treťom aspekte vynálezu, a získanie nizínu tu produkovaného.

Výhodne je nizínom variantný nizín.

Preferuje sa, ak bunky sú bunkami podľa najviac preferovaného vyhotovenia.

Zistili sme, že pri použití buniek podľa najviac preferovaného vyhotovenia môžeme produkovať neočakávane vysoký výnos nizínu, hlavne v porovnaní so známymi procesmi, ktoré využívajú plazmidové nisA gény pre expresiu nizínu (za absencie plazmidových génov odolnosti voči nizínu, modifikácie a sekrécie). Ďalšie podrobnosti tohto prekví^- čujúceho účinku sú dané v príkladoch. Avšak v tomto bode je dôležité si uvedomiť, že v prípade nizínu variantného ako v tom, že dehydroalanín 5 je nahradený alanínom, tak dehyďroalanín 33 je nahradený alanínom (tento je známy ako nizinA/Dha 5A, Dha 33A), bunky podľa predkladaného vynálezu, v ktorých je prirodzený nisA gén nahradený variantným nisA génom, produkujú viac ako stonásobok nizínu v porovnaní s predchádzajúcimi bunkami, v ktorých bol rovnaký variantný nizín (nizinA/Dha 5A, Dha 33A) kódovaný plazmidom. Naviac, všetky variantné niziny, ktoré boli testované, dávali vyšší výnos z buniek podľa predkladaného vynálezu v porovnaní so skoršími bunkami obsahujúcimi gén pre variantný nizín na plazmide.

Ďalšie výhody oproti predchádzajúcim metódam a bunkám sú získané za použitia buniek najviac preferovaného vyhotovenia pre produkciu nizínu. Napríklad, pretože bunky neobsahujú plazmid, tak tu nie je požiadavka pre antibiotickú selekciu počas kultivácie a strata plazmidov počas kultivácie nie je problém.

Tak je pre stabilitu výhodné, že gén pre variantný nizíri je integrovaný vo vnútri bakteriálneho chromozónu, i keď ako časť nizínového transpozónu Tn5301. Tento ďalší je extrémne stabilný a skutočne sme zistili, že je ťažké ho úmyselne eliminovať. Laboratórna selekcia pre plazmidový markér bráni, aby sa toto stalo problémom, ale pre priemyselné použitie to môže byť nevýhodou. Môže byť preto nežiaduce pridávať antibiotiká k fermentácii.

V menej preferovanom vyhotovení je variantný nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu a gény pre odolnosť voči nizínu nesený na autonómne sa replikujúcom elemente, ako je plazmid. V tomto vyhotovení je jasné, že plazmidová selekcia sa požaduje v priebehu kultivácie buniek.

Najviac preferovaným vyhotovením tretieho aspektu vynálezu je to, kde sú bunky kultivované za prítomnosti nisA nizínu alebo variantného nizínu, ktorý môže indukovať expresiu nizínu. Nizín A, kde lle30 je nahradený Trp (I30W), je príklad variantu, ktorý v dôsledku svojej mutácie nefunguje správne ako induktor svojej vlastnej biosyntézy. Pridaním sub-inhibičných koncentrácií nizínu do kultivačného média v priebehu fermentácie sú produkované vysoké hladiny variantného nizínu. Akékoľvek varianty, ktoré sú menej účinné ako indukčné agens, majú prospech z inklúzie nizínu do kultivačného média (t.j. krok nizínovej indukcie v purifikačnej procedúre). Veľkosť indukcie sa odlišuje v závislosti od počiatočnej indukčnej kapacity akéhokoľvek jednotlivého variantu (u I30W produkcia nizínu A sa viac ako zdvojnásobí v dôsledku indukcie). Indukcia môže byť rutinne obsiahnutá v metóde ako prostriedok pre maximalizáciu úrovne produkcie. Akékoľvek obsahy vzhľadom ku kontaminácii divokým typom molekuly sú minimálne, pretože koncentrácia nizínu potrebná pre indukciu je zanedbateľná vzhľadom k množstvu variantného nizínu, ktorý je purifikovaný. Zvyčajne nisA nizín je minimálne množstvo, ktoré poskytuje maximálnu indukciu produkcie nizínu. Toto množstvo môže byť odborníkom určené empiricky. Vhodné koncentrácie nisA nizínu v tomto vyhotovení sú od 1 nM do 500 nM, výhodne 10 nM až 250 nM, ešte lepšie 50 nM až 150 nM a najlepšie 100 nM.

Krok HPLC s reverznou fázou v akejkoľvek purifikácii potvrdí separáciu akéhokoľvek nisA nizínu od variantných nizínov.

Štvrtý aspekt vynález poskytuje nizín produkovaný spôsobom podľa vynálezu.

Prítomnosť nenasýtených mastných kyselín v lantibiotikách vrátane nizínu a úloha, ktorú hrajú v biologických vlastnostiach týchto komplexov molekúl je najmä v záujme analýz štruktúra/funkcia. Bolo navrhnuté že reaktívne nenasýtené väzby, ktoré charakterizujú dehydroaminokyseliny, majú kľúčovú úlohu v antimikrobiálnej aktivite subtilínu, lantibiotika, používaného proti rastu bakteriálnych spór. Tieto rezíduá tiež priťahujú pozornosť ako možný zdroj molekulárnej nestability. Je dlho známe, že antimikrobiálna aktivita komerčných vzoriek prirodzeného nisA nizínu sa zhoršuje pri skladovaní a že množstvo chemických zložiek sa nachádza v takýchto vzorkách. Berridge et al. (1952) a Chán et al. (1989) demonštrovali, že sa vyskytuje špecifické štepenie dehydroalanínových zvyškov v zrelej molekule. Štepenie v Dha5 vedie k otvoreniu prvého lantionínového kruhu nizínu a je spojené so stratou antimikrobiálnej aktivity. Oproti tomu degradačné produkty vzniknuté ako výsledok štepenia v Dha33 si uchovávali v podstate divoký typ aktivity (Chán et al., 1989).

Vo WO 93/20213 popisujeme konštrukciu L. lactis derivátov exprivujúcich nizinA/Dha5A, nizínA/Dha33A a nizínA/Dha5A, Dha33A. V tejto práci tiež demonštrujeme, že tieto spracované nizíny si uchovávajú svoju antimikrobiálnu aktivitu proti senzitívnym indikátorovým kmeňom. Stručne, ako je popísané v príkladoch, tieto nizíny môžu byť produkované účinnejšie predkladaným procesom. Avšak predkladaný proces môže tiež byť použitý pre produkciu akýchkoľvek ďalších variantných nizínov, ktoré majú iné, vylepšené vlastnosti, rovnako ako sú kódované variantným nisA génom.

Piaty aspekt vynálezu poskytuje použitie nizínu produkovaného podľa procesu podľa vynálezu ako antimikrobiálny agens. Schopnosť nizínu inhibovať rast baktérii kaziacich potraviny a potravinových patogénov viedla k jeho širokému použitiu ako prirodzeného prezervatívu v istých potravinových produktoch, hlavne mliečnych produktov, ako sú mäkké syry. Variantné nizíny sa tiež používajú.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Vynález bude teraz popísaný detailnejšie s odkazom na nasledujúce obrázky a príklady, kde:

Obrázok 1 ukazuje molekulárnu štruktúru prirodzeného nizínu A. Zmeny, ktoré boli vykonané na sekvencii v dôsledku proteínového spracovania, sú ukázané šípkou.

Obrázok 2 ukazuje diagramaticky niektoré rekombinantné plazmidy konštruované a používané v tejto práci.

Obrázok 3 ukazuje diagramaticky značkovacie selektovateľné nisA gény, kde je buď inzerovaný gén rezistencie na erytromycín alebo bola vykonaná delécia posunom rámčeka (nisA-fs). Sekvencie sú ukázané v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 12 až 17.

Obrázok 4 ukazuje nukleotidovú sekvenciu aspoň časti prirodzeného nisA génu a expresné signály ukazujú zmeny zavedené PCR - sprostredkovanou miestne riadenou mutagenézou. BamHI a Bglll miesta obklopujúce nisA boli zapracované do plazmidu pFI740 (obrázok 2d). Substitúcia Ser 5 a Ser 33 kodónov za kodóny pre alanín vo variantných nisA génoch je ukázaná nad sekvenciou. Ukázané sekvencie sú v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 18 a

19.

Obrázok 5 ukazuje agarózovú gelovú elektroforézu PCR fragmentov generovaných primérmi P39 a P40. PCR reakcie boli vykonané na kolóniách: dráha 3, FI5876, 4, FI7990, 5-10, FI7990 (pG hostiteľa 6 cerivát) po procedúre génovej náhrady. Štandardy veľkostí: - dráha 1 a 12, lambda DNA trávená Bgll, 2 a 11, lambda DNA trávená Hindlll.

Obrázok 6 ukazuje platňový difúzny biotest. 150 pl vzoriek buniek zbavených extraktov z kmeňov; 4, FI5876, 5, FI7990, 7, FI8198, 8, FI8199 bolo zavedených do jamiek v MRS agare osídlenom indikátorovým kmeňom Lactobacillus helveticus CH-1. Platne neboli inkubované cez noc pri 42 °C. Štandardy obsiahnuté v testovacej platni sú: -1,50; 2,100; 3,200; 9,300; 10,400 U/ml.

Obrázok 7 ukazuje sekvencie nisA, nisB, nisT, nisC a nisl génov Tn5276 L. lactis NIZO R5, a je prevzatý od Kuipers et al. (1993), Eur. Journal Biochem. 216, 281 - 291. Putatívno ribozómové väzobné miesta (RBS) a invertované repeaty ( >) sú ukázané, ako je transkripčné iniciačné miesto nisA génu a jeho predchádzajúce autentické sekvencie. Umiestnenie reštrikčných miest sú nasledujúce: Accl, 6383 - 6388, Beli, 2914 - 2919, EcoRI, 3461 - 3466, EcoRV,. 1805 - 1810, Haelll, 6509 - 6512, Ncol, 6218 - 6223, Ndel, 4518 - 4523, Pstl, 7418 - 7423, Sstl 283 - 288, 1547 - 1552 a 2463 - 2468.

Obrázok 8 ukazuje nukleotidovú sekvenciu klonovaného 5,0 kb regiónu downstream od nisC s otvorenými čítacími rámčekmi nisl, nisP, nisR a nisK, a je prevzatý z Engelke et al. (1994), Appl. Environ. Microbiol. 60, 814 - 825. Možné ribozomálne väzobné miesta (RBS), reštrikčné miesta a invertované repeaty sú podčiarknuté. Otvorené čítacie rámčeky sú označené jednopismenovým kódom. Šipky ukazujú putätívne signálne peptidové štepiace miesta Nisl a NisP; putatívna membránová kotviaca sekvencia je podčiarknutá. Konzervované, funkčné a aktívne miesta aminokyselín sú písané tučným písmom a označené hviezdičkou.

Obrázok 9 ilustruje vektor pre nahradenie génu. Veľkosť klonovaných fragmentov, ktoré vytvárajú nisA kazetu a susediace sekvencie, sú dané v pároch báz.

Obrázok 10 popisuje názorne protokol náhrady génu.

Obrázok 11 ukazuje dvojreťazcovú nukleotidovú sekvenciu nisA génu a aminokyselinovú sekvenciu pre-nizínu. -35 a -10 regióny a transkripčné iniciačné miesto sú ukázané spolu s miestom pre reštrikčný enzým použitý v nisA kazete (pozri obrázok 2) nad DNA sekvenciou. Je ukázané umiestnenie primérov (5'-koniec) využitých v amplifikácii kazety fragmentov a PCR sprostredkovanej mutagenézy, nad a pod sekvenciou, ako horizontálne Čierne šipky ukazujúce smer DNA syntézy. Špecifická aminokyselinová substitúcia, ako výsledok mutagenézy, je ukázaná pod sekvenciou pre-nizínu.

Obrázok 12 je reprezentácia organizácie nis génov.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcia Lactococcových buniek, v ktorých je prirodzený chromozomálny nisA gén nahradený variantným nisA génom

Metódy

Mikrobiologické techniky a použité kmene. Lactococcové kmene použité v tejto štúdii a ich pôvod sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1 Lactococcové kmene použité v tejto štúdii

Kmeň	nisA	Odolnosť (U/mlx10³)	Odkaz
mutácia	Aktivita
MG1614	-	-	0.01	Gasson (1983) J. Bacteriol. 154, 1 -9
FI5876	divoký	+	>1	Dodd et al. (1990),
	typ			J. Gen. Microbiol. 136, 555-566; Horn et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 228, 129- 135
FI1847	nisA-(fs)	-	0.5-0.75	táto práca
FI7990	^AnisA	-	0.25-0.5	táto práca
FI8070	nisA/S5A)	+	>1	táto práca
FI8198	nisA/S33A	+	>1	táto práca
FI8199	nisA/S5A
	S33A	+	>1	táto práca
FI7893	nisA	+	>1	táto práca
FI8003	nisA		0.25-0.5	táto práca

Ak nie je stanovené inak, boli kultúry kultivované pri 30 °C v M17 médiu (Terzaghi a Sandine (1975), Appl. Environm. Microbiol. 29, 807 - 813) doplneného 0,5 % (hmotnosť/objem) glukózy (GM17 médium). Vykonalo sa vyšetrenie kmeňov na rezistenciu na antibiotiká pri naši dujúcich hladinách: erytromycín (Em^ 5 pg/ml; streptomycín (Sm¹) 200 pg/ml.

Escherichia coli MC1022 (Casadaban a Cohen (1980), J. Mol. Biol. 138, 179 - 207) bola hostiteľským kmeňom pre konštrukciu a molekulárnu analýzu rekombinantných plazmidov odvodených od vektorov pMTL23p (Chambers et al. (1988), Gene 68, 139 - 149), pGEM-3Z (Promega), pCRTM|| (invitrogen) a pG+host6 (Appligene). Rekombinantné plazmidy použité a konštruované v priebehu tejto štúdie, sú ukázané na obrázku 2. E. coli kultúry boli propagované pri 37 °C v L bujóne (Lennox (1955), Virology 9, 190 - 206). Selekcia pre rezistenciu na ampicilín (Ap^r) bola vykonaná pri 100 pg/ml, chloramfenikol (01719 pri 15 pg/ml a erytromycín (Em9 pri 400 pg/ml.

Aktivita nizínu v kmeňoch Lactococcus bola testovaná ako nepriamymi, tak priamymi prostriedkami. Difúzne biotesty na platni boli vykonané ako bolo popísané prv (Dodd et al. (1992), Appl. Environm. Microbiol. 58, 3683 - 3693). Kolónie kultivované na povrchu GM17 platne boli priamo testované vypláchnutím chloroformom na 12 minút a prekrytím agarom osídleným nizín senzitívnym L. lactis kmeňom MG161. Platne boli inkubované cez noc a bola meraná veľkosť zón okolo kolónií v porovnaní so zónami kontrol. Odolnosť voči nizínu bola určená očkovaním kultúr na sériu GMT⁷ agarových platní obsahujúcich zvýšenú koncentráciu nizínu a hodnotením stupňa rastu pri rôznych hladinách nizínu. Kontrolné kultúry (FI5876, pozitívne) a MG1614 (negatívne) boli obsiahnuté na každej platni.

Molekulárne techniky

Celková DNA, plazmidová DNA boli vykonané ako popisuje Dodd et al. (1990), J. Gen. Microbiol. 136, 555 - 566 a Horn et al. (1991), Mol. Gen Genet., 228, 129 - 135. Reštrikčné enzýmy a iné DNA modifikujúce enzýmy z rôznych zdrojov boli použité podľa odporučenia dodávateľa. Rekombinantné plazmidy boli znova získané transformáciou E. coli ako bolo popísané prv (Dodd et al., vyššie) alebo elektroporáciou L. lactis podľa Holo a Nes (1989), Appl. Environ. Microbiol. 55, 3119 - 2123 s modifikáciou podľa Dodd et al. (1992) vyššie. Podmienky použité pre polymerázovú reťazovú reakciu ^DCR) boli tie, ktoré popisuje Horn et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 228, 129 - 135. Priméry boli syntetizované na Applied Biosystems DNA syntetizéri (model 381 A) a sú uvedené v tabuľke 2. Fragmenty generované pre konštrukciu vektorov pre génovú náhradu boli amplifikované za použitia Dynozym (Flowgen) a klonované do pCR™ll pred potvrdením nukleotidovej sekvencie. Pre rutinné PCR vyšetrovanie rekombinantných klonov bola použitá AmpliTaq-DNA polymeráza (Perkin Elmer). Priame určenie nukleotidovej sekvencie purifikovaných PCR generovaných templátov bolo vykonané na Applied Biosystems DNA sekvenátore (model 373A) za použitia výrobcovho Taq'Dydeoxy'terminátorový cyklus sekvenčného kitu.

Tabuľka 2 Priméry použité v tejto štúdii

P13	(SEQ ID	No	1)	5·-ÄACGGATCCGATTAAATTCTGAAGTTTG-3· BamHI
.P17	(SEQ	ID	No	2)	5 ' -TCAGAGCTCCTGTTTTACAACCGGGTGTACATA
GTGCAAT-3	f
P18	(SEQ	ID	No	3)	5·-TAGTATTCACGTAGCTAAATAACC-3·
P19	(SEQ	ID	No	4)	5·-TTGGTTATTTAGCTACGTGAATAC—3'
P25	(SEQ	ID	No	6)	5'-AATCGGATCCGTTTATTATGCTCGC-3'
			BamHI
P26	(SEQ	ID	No	6)	S'-ATAGTTGACGAATATTTAATAATTTT-3 '
			.BincII
P27	(SEQ	ID	No	7)	5·-CTTGGTCGACACCATATTTT-3'
			Sali
P28	(SEQ	ID	No	8)	5'-GTTAGATCTGACATGGATAC-3'
			BglTI
P32	(SEQ	ID	No	9)	S·-CCATGTCAGATCTAACAAAATAC-3'
			BglII
P39	(SEQ	ID	No	10	)5'-GACTTTCCATTATGCTTGGATTTTT-3’
P40	(SEQ	ID	No	11)5'-GCTCCTATGCCAAATGTAGAATC-3'

Konštrukcia nahradzovacích vektorov nisA génu

Termosenzitívny prenosový vektor pG+host6 bol využitý pre vykonanie génového prenosu. Homológna plazmidová DNA pochádzajúca z pF1172 (Dodd et al. (1990) vyššie), ktorá obsahuje 2,1 kb región FI5876 chromozónu (obr. 2a) vrátane nisA génu. Celý fragment bol subklonovaný do pG+host6 za generovania nisA gén nahradzovacieho vektora pFI690 (obr. 2b). Následná manipulácia s týmto regiónom, vedúca k inaktivácii alebo mutagenéze nisA gén (pozri nižšie) bola vykonaná ako v pGEM-3Z, tak pMTL23P. Konečným krokom v konštrukcii každého gén nahradzujúceho vektoru bolo klonovanie 2,1 kb fragment do pG-host6. Deriváty pGH+host6 boli zavedené do E. coli a plazmidová DNA, z toho hostiteľa, bola použitá pre transformáciu L. lactis FI7990 (tabuľka 1).

nisA mutácia posunu rámčeka - nisA-(fs)

Inzerčná inaktivácia nisA génu, klonovaním Em^r génu do niekoľkých vnútorných Sací miest bola popísaná prv (Dodd et al. (1992), vyššie). V tomto plazmide je Em^r gén obklopený krátkym mnohotným klonujúcim miestom (obr. 3) Trávenie reštrikčným enzýmom Smal, po ktorom nasledovala ligácia pre recirkularizáciu vektorových sekvencií, viedlo k delécii Em^r génu. Reziduálne sekvencie z mnohotného klonovacieho miesta nechali 20 bp inzerciu vo vnútri Sací miesta a spôsobili výskyt mutácie posunu rámčeka v kodóne 16 nisA génu. Prvých 38 aminokyselín kódovaných týmto mutovaným génom (označeným nisA-(fs) je neovplyvnených. Avšak predpokladaný translačný produkt bude skrátený prenizín (45 zvyškov), obsahujúci na nizinovej aminokyselinovej sekvencií RYPTOGEL na svojom COOH - konci (obr. 3). nisA-(fs) mutácia bola subklonovaná do pG+host6 za generovania génnahradzujúceho vektoru pFI674 (obr. 2c).

nisA delécia - AnisA

Inaktivácia nisA génu bola tiež dosiahnutá deléciou kódujúceho regiónu. Aby sa delécia obmedzila iba na nisA, bolo nevyhnutné zapracovať ďalšie reštrikčné enzýmové miesta na každú stranu génu. Boli projektované priméry, pre PCR amplifikáciu, ktoré inkorporovali BamHI miesto (P13. tabuľka 2) 80 bp upstream od začiatku nisA a Bglll miesto (P32, tabuľka 2) 25 bp za stop kodón, v dôsledku 2 bp zmien v každom prípade. Susediace fragmenty (ukázané na obr. 2d) boli tiež generované za použitia PCR amplifikácie. Priméry P26 a P25 boli využité pre amplifikáciu upstream 211 bp Hincll/BamHI fragment a priméry P28 a P27 boli využité pre amplifikáciu downstream 1,1 kb Bglll/Sall fragmentu (tabuľka 2). Templáty použité pre túto PCR reakciu boli pFI172 DNA. Vzniknutý plazmid (pFI740) obsahoval intaktný nisA gén obklopený zapracovanými BamHI a Bglll miestami, všetko obsiahnuté v 2,1 kb sekvencie homológnej k chromozómu (obrázok 2d). Trávenie pFI740 týmito dvoma enzýmami, po ktorom nasledovala ligácia ich kompatibilných koncov, viedlo ku generovaniu plazmidu pFI751, v ktorom bol deletovaný nisA gén a bol označený ^AnisA (obrázok 2e). PCR amplifikácia tejto časti plazmidu a analýza nukleotidovej sekvencie regiónu preklenujúceho deléciu v amplifikovanom fragmente potvrdila, že prebehla fúzia BamHI a Bglll miest.

nisA miestne špecifické mutácie

Konštrukcia plazmidu pFI877 (obrázok 2f) umožnila použitie stratégie kazetovej mutagenézy pre zavedenie miestne špecifických mutácií do nisA génu. Tento pGEM-3Z derivát obsahuje ekvivalentné sekvencie ako pFI690 (obrázok 2b), ale obsahuje zapracované Bglll miesta downstream nisA v pFI740 (obrázok 2d). V pFI877 je Hincll/Sacl fragment kódujúci aminoterminálny región nisA a upstream expresné signály nahradený PCR generovaným fragmentom pFI740, ktorý obsahuje zapracované BamHI miesto. Tak jediným rozdielom medzi sekvenciou v pFI87 a ekvivalentnou chromozomálnou sekvenciou divokého typu je prítomnosť ďalšieho Bglll miesta downstream od nisA génu. Konštrukcia tejto nisA kazety je taká, že miestne špecifická mutácia môže byť ľahko zavedená do génu. PCR sprostredkovaná mutagenéza bola použitá pre amplifikáciu buď Hincll/Sacl alebo Sacl/Bglll fragmentov obsahujúcich amino alebo COOH terminálne regióny nisA génu, v príslušnom poradí. Tieto fragmenty, obsahujúce špecifickú mutáciu, boli potom substituované za divoký typ fragmentu pFI877. Mutácie boli inkorporované buď do primérov použitých na amplifikáciu fragmentov kazety alebo, ak bolo požadované miesto mutácie vnútorné, bola použitá technika spojenej presahujúcej extenzie (Ho et al. (1989), Gene 77, 51 - 5S) so špecifickými mutáciami inkorporovanými do dvoch komplementárnych primérov prekleňujúcich miesto mutácie (Dodd et al. (1992), vyššie).

Protokol nahradenia génu

L. lactis FI7990 transformanty obsahujúce deriváty pG+host6 boli udržiavané pri 28 °C a kultivované cez noc pri tejto teplote v GM17 obsahujúcom Em v 5 pg/ml (GM17-Em). Približne 10⁵ buniek bolo použitých pre inokuláciu 100 ml čerstvého, predhriateho GM17-Em a kultúry boli inkubované pri 28 °C po 4 hodiny. Inkubácia pokračovala cez noc pri zvýšenej teplote 37 °C. Táto teplota je nepermisívna pre pG-host6 replikáciu (Biswas et al. (1993), J. Bacteriol. 175, 3628 - 3635) a prítomnosť Em v kultivačnom médiu zaisťuje selekciu tých bunečných línií, v ktorých jednotlivé kríženia viedli k integrácii derivátu do chromozómu v mieste plazmid/chromozóm homológia (Leenhouts et al. (1989), Appl. Environ. Microbiol. 55, 394 - 400; (Leenhouts et al. (1990), Appl. Environm. Microbiol. 56, 2726 - 2735; Chopin et al. (1989), Appl. Environm. Microbiol. 55, 1769 - 1774). Predhriate GM17 (bez Em) bolo inokulované približne 10^ bunkami z kultúry cez noc a bolo inkubované pri 28 °C. Pri tejto teplote je možná replikáciá plazmidu a rekombinácia medzi homológnymi susediacimi sekvenciami integrovaného plazmidu, čo vedie k jeho excízii z chromozónu. V závislosti od výskytu druhého kríženia budú na chromozóme zachované buď sekvencie pochádzajúce z integrovaného plazmidu alebo pôvodné sekvencie. Dĺžky DNA homológie sú ukázané na obrázku 9. Tieto sekvencie pochádzajúce z Accl/Sall fragmentu vytvárajú časť Sali fragmentu, ktorý je klonovaný a sekvencovaný v plazmide pF1172 (Dodd et al. (1990), J. Gen. Microbiol. 136, 555 - 566).

Kultúry boli riedené a šírené pre jednotlivé kolónie na GM17 agarových platniach. Aby boli ošetrené bunky plazmidu, boli platne ii.Kubované pri 37 °C. Kolónie (približne 50) boli vyšetrované na stratu pG+host6 derivátu prenesením na GM17 platne obsahujúce Em (5 pg/ml). Za použitia tejto techniky na prerušenie nisA génu boli kolónie tiež vyšetrované na stratu nizínovej aktivity a PCR analýza relevantného regiónu chromozómu bola použitá pre potvrdenie akýchkoľvek zmien na molekulárnej úrovni.

Protokol nahradenia génu je názorne ilustrovaný na obrázku 10.

Výsledky

Inaktivácia chromozomálne kódovaného FI5876 nisA génu

Pre identifikáciu bunečných línií, ktoré získali variantné nisA gény, bolo vhodné najprv konštruovať Nis hostiteľské kmene, inaktiváciou vlastného nisA génu. Dobre charakterizovaný nizín produkujúci kmeň L. lactis FI5876 bol selektovaný pre tento účel (Dodd et al. (1990), vyššie, Hom et al. (1991), vyššie). Gény pre biosyntézu nizínu z tohto kmeňa boli klonované a sekvencované (Dodd et al. (1992), vyššie).

Génové nahradenie bolo použité na substitúciu divokého typu nisA génu u FI5876 plazmidom pFI674 kódovaným nisA-(fs) génom (obr. 2d, 3). Z päťdesiatich vyšetrovaných kolónií bolo päť Em^s a Nis^-, čo naznačuje, že v týchto FI5876 derivátoch prebehla náhrada génu. Naviac tento výsledok naznačuje, že tento modifikovaný nisA gén bol defektný a neexprivoval prekurzorovú molekulu, ktorá by mohla vyzrieť do aktívnej formy. Jeden z Nis kmeňov, označený FI7847, bol analyzovaný ďalej. Na testovanie systému bolo demonštrované, že nisA-(fs) mutácia v FI7847 môže byť revertovaná späť na divoký typ vykonaním ekvivalentného experimentu za použitia nisA génového nahradzovacieho vektoru pFI690 (obr. 2b). Znovuzískanie produkcie nizínu u vzniknutého kmeňa s nahradeným génom, Fl 17898, indikovalo, že Nis^- fenotyp vykazovaný FI7847 bol jedinou príčinou narušenia nisA génu. Iné determinanty biosyntézy nizínu sa zdali byť nepoškodené prešmykom nisA génov.

Alternatívnym prístupom bolo generovanie Nis hostiteľa deléciou celého chromozomálneho nisA génu u FI5876. Plazmid pFI751 (obr. 2e) bol konštruovaný za týmto účelom a génová náhrada bola použitá pre inkorporáciu približne 300 bp delécie ^AnisA (obr. 4) na miesto nisA. Nís kmene boli znova získané v asi rovnakej frekvencii, aká bola zistená pre nisA-(fs) génovú náhradu. V tomto prípade mohli byť ^AnisA obsahujúce kmene ľahko rozlíšené od rodičovských kmeňov PCR analýzou. Priméry p39 a P40 (tabuľka 2, obr. 2a) amplifikovali 1,8 kb fragment v týchto kmeňoch s génovou náhradou (obr. 5, dráha 4) v porovnaní s 2,1 kb fragmentom generovaným z ekvivalentného regiónu FI5876, kódujúceho divoký typ nisA (obr. 5, dráha 3). V jednom z Nis kmeňov, označenom FI7990, potvrdila analýza nukleotidov sekvencie PCR generovaného 1,8 kb fragmentu, že ^AnisA bol inkorporovaný do správneho regiónu chromozómu. Systém bola znova testovaný a ukázalo sa, že produkcia nizínu môže byť obnovená vo FI7990 derivovaných kmeňoch nahradením génu s pFI690 (obr. 2b). PCR analýza týchto Nis^- kmeňov ukázala, že ^AnisA mutácia (1,8 kb fragment) bola nahradená divokým typom nisA géru (2,1 kb fragment). Pretože tento systém bol výhodný kvôli schopnosti ľahkej identifikácie génovej náhrady na podklade PCR analýzy (pozri obr. 5), bola ďalšia charakterizácia a konštrukcia mutantov vykonaná za použitia FI7990 ako hostiteľského kmeňa.

Odolnosť voči nizínu

Účinok narušenia nisA génu na odolnosť hostiteľského kmeňa voči nizínu bola popísaná prv (Dodd et al. (1992), vyššie), ako sa očakávalo, obidva FI7847 (nisA-(fs) a FI7990 (^AnisA) vykazovali redukovanú odolnosť voči nizínu (tabuľka 1). nisA deletovaný kmeň FI7990 bol senzitívny na nizín v koncentráciách medzi 250 a 500 U/ml v porovnaní s rodičovským kmeňom, ktorý pokračoval v raste za prítomnosti nizínu viac ako 1000 U/ml. Zaujímavé, je, že FI7847, kódujúci skrátený nisA gén, vykazoval strednú hladinu odolnosti voči nizínu (horná hranica medzi 500 a 750 U/ml s pokračc /aním slabého rastu do 1000 U/ml, tabuľka 1).

Možným vysvetlením pre rozdiel týchto dvoch Nís^- kmeňov v senzitivite na nizín vychádza zo štúdií génových nahradení vyžadujúcich vektor pFI740 (obr. 2d). Kmeň FI8003, generovaný substitúciou defektného nisA génu intaktným plazmidom pFI740 kódovaných nisA, mal Nís^- fenotyp. Tento výsledok kontrastuje s výsledkom ekvivalentného experimentu náhrady génu, využívajúceho pFI90 (obr. 2b), v ktorom bol získaný Nis⁺ fenotyp (pozri vyššie). Jediným rozdielom medzi dvoma využitými sekvenciami je to, že pFI740 má ďalšie BamHI miesto inkorporované 80 bp upstream ATG štart kodónu nisA a Bglll miesto hneď downstream kódujúceho regiónu (obr. 4). Výskum týchto sekvencií ukázal, že BamHI miesto presahuje navrhnutý -35 región promótora identifikovaného Kuipers et al. (1993), Eur. J. Biochem. 216, 231 - 291. Jedna zmena párov báz zavedená v dôsledku BamHI miesta spôsobila konvertovanie -35 sekvencie z CTGATT na CCGATT (obr. 4).

Tieto výsledky naznačujú, že u pFI740 bol prirodzený nisA promótor narušený, a preto tieto kmene, ako FI8003, ktoré génovou náhradou inkorporovali BamHI miesto, tiež získali defektný promótor. Zvýšená senzitivita na nizín u týchto kmeňov (približne 50 % divokého typu), navzdory intaktnému nisA génu, napovedá, že tieto potenciálne promótorové aktívne sekvencie majú úlohu v odolnosti voči nizínu.

Preferovaný protokol využíva odolnosť voči nizínu ako prostriedok priamej selekcie Nis⁺ kmeňov, u ktorých prebehlo nahradenie génov a spočíva vo fakte, že inaktivácia nisA promótora u FI7990 vedie k dostatočne vysokej senzitivite na nizín, takže rodičovské kmene nemôžu rásť na selektívnych platniach. Nis^- kmene, ktoré si zachovali upstream promótorové sekvencie (napr. FI7847), boli nevhodné pre tento postup, pretože rástli na hladinách nizínu, ktoré boli pokladané za optimálne pre selekciu znova nadobudnutých Nis⁺, t.j. 500 U/ml (tabuľka 1).

Génová náhrada - identifikácia variantnej nisA kódujúcich kmeňov

Z predchádzajúcich experimentov génovej náhrady vykonaných v konštrukcii a testovanie Nis’1 kmeňov FI7847 a FI7990 bolo známe, že substitúcia chromozomálnych sekvencií pre ekvivalentný homológny región, vykonaná pG+host6 derivátom sa vyskytovala v nízkej frekvencii. U následného obnovenia intaktného nisA génu u týchto hostiteľov génovou náhradou sa očakávalo, že povedie k znovuzískaniu nizínovej aktivity. Žiaden Nis⁺ kmeň v populácii by potom nemal selektívnu výhodu pred Nis^- rodičmi. Avšak počiatočné pokusy o obnovenie aktivácie nisA génu viedli u väčšiny vyšetrovaných kolónií k zachovaniu defektnej nisA rodičovskej sekvencie.

Obnovenie Nis⁺ fenotypu je nevyhnutné pre funkčné mechanizmy odolnosti voči nizínu a vyžaduje expresiu nisA génu. Protokol génovej náhrady, využitý pre konštrukciu FI7847 a FI7990 bol modifikovaný kvôli uľahčeniu identifikácie derivátov, ktoré získali nisA alebo variantné nisA gény, ktoré viedli k produkcii nizínu. Získanie Nis⁺ kolónií závisí od našej interpretácie, že tieto bunky musia tiež nevyhnutne byť odolné voči nizínu v hladine, v ktorej produkujú tento antimikrobiálny peptid. V modifikovanom protokole génovej náhrady zahrňoval konečný krok pridanie nizínu na GM'7 agarové platne, v hladine 500 U/ml. Kolónie odolné voči nizínu, ktoré rástli v tomto médiu, boli vyšetrované na Em^r a testované na produkciu nizínu. PCR analýza bola tiež použitá na určenie organizácie genómových sekvencií. Obrázok 5 ukazuje fragmenty generované PCR (za použitia primérov P39 a P49, obr. 2a) zo šiestich kolónii, ktoré prešli procedúrou génovej náhrady. U všetkých bolo zistené, že získali funkčnú kópiu nisA génu (v tomto prípade nisA/S5A) ako je ukázané 300 bp zväčšením veľkosti PCR fragmentu. Tento postup bol pokladaný za veľmi spoľahlivý prostriedok pre identifikáciu Nis⁺ derivátov FI7990, pretože tento hostiteľský kmeň bol samotný senzitívny na hladinu nizínu využitú v selekčných platniach. U väčšiny kolónií (približne 90 %) vyšetrovaných týmto spôsobom sa zistilo, že podľahli génovej náhrade a že exprivujú funkčný nisA gén alebo variant na mieste chromozomálnej lézie ^AnisA. Táto stratégia bola úspešne použitá pre selekciu niekoľkých derivátov FI7990, ktoré sú teraz exkluzívne exprivujúce pracovné nizíny namiesto nizínu A.

Ako bolo popísané vyššie, vyžaduje protokol integráciu termosenzitivneho plazmidu, pG+host6 do chromozómu, po ktorom nasleduje excízia. Za predpokladu, že sa kríženie vyskytuje s rovnakou frekvenciou medzi homológnymi sekvenciami na každej strane mutácie, možno predpokladať, že počet buniek nesúcich teraz mutáciu, bude rovnaký ako počet buniek identických s rodičovským kmeňom. Nebolo preukázané, že je to pravda a väčšina vyšetrovaných kolónií si uchovala genetickú organizáciu rodičovského kmeňa FI7990. Dôvod pre to nie je jasný, ale predpokladá sa, že okamžitý účinok integrácie funkčného nisA génu je škodlivý pre hostiteľskú bunku. Bolo popísané, že expresia nisA génu predchádza expresii susedného nisB génu o 30 minút (Engelke et al. (1994), vyššie) a transkripcia ďalších determinantov v zoskupení génov pre nizín môže byť podobne oddialená s ohľadom na produkciu prenizínu. Tieto kmene, ktoré získali nisA gén génovou náhradou, nemusia byť plne odolné voči antimikrobiálnym účinkom molekuly nizínu. Takéto kmene nebudú životaschopné. Avšak boli sme schopní obnoviť Nis⁺fenotyp génovou náhradou, v ktorom bola produkcia nizínu oddialená, čo dovoľovalo vznik plnej odolnosti voči nizinu.

Konverzia Dha na Ala zvyšky

Dehydroalanínové (Dha) zvyšky v polohách 5 a 33 (obr. 1) boli najprv zamerané pre zapracovanie zmien v nizínovej molekule. Cieľom bolo substituovať serínové zvyšky, z ktorých sú Dha odvodené, za alaníny, ktoré neobsahujú potenciálne nestabilné nenasýtené vedľajšie reťazce. Mutácia v nisA, S5A bola generovaná PCR za použitia primérov P26 a P17 (tabuľka 2). Amplifikácia viedla k 40 bp Hincll/Sacl fragmentu obsahujúcemu aminoterminálny koniec nisA a obsahujúci substitúciu Ser kodónu (koordináta 173, obr. 4) za CGT, ktorý určuje alanín. 90 bp Sacl/Bglll fragment obsahujúci

COOH terminálny koniec nisA bol generovaný PCR za použitia primérov P10 a P32 (tabuľka 2) a obsahoval krok zostrihnutia presahujúcich predĺžení s primérmi 18 a 19 (tabuľka 2). Tento ďalší pár komplementárnych primérov obsahoval alaninový kodón, CGT, na mieste serínového kodónu v koordináte 257 (obr. 4). Subklonovanie týchto PCR generovaných fragmentov, buď separátne alebo spoločne, do vhodného vektora pre génovú náhradu viedlo k neprerušovanému kódujúcemu regiónu určujúcemu buď nisA/S5A, nisA/S33A alebo nisA/S5A, S33A génu. Transformácia FI7990 plazmidovou DNA nasledovaná procedúrou génovej náhrady vytvorila množstvo kolónií, kde väčšina z nich bola Em^s a Nis⁺. Relevantný región chromozómu bol skúmaný PCR za použitia kombinácie primérov P39 a P40 a v kažJom prípade 300 bp fragment, porovnaný s FI7990 (pozri obr. 5) indikoval, že prebehla génová náhrada. Analýza nukleotidovej sekvencie PCR generovaných fragmentov potvrdila, že v každom prípade tri varianty nisA génu boli inkorporované do chromozómu na mieste ^AnisA lézie. Reprezentanti každého kmeňa s náhradou génu, FI8070 (nisA/S5A), FI8189 (nisA/S33A) a FI8199 (nisA/S5A, S33A) boli charakterizované ďalej.

Expresia všetkých troch mutovaných nisA génov viedla k produkcii aktívnej molekuly, ako bolo určené priamo prekrytím kolónií. Difúzny biotest na platni na bunečný extrakt ukázal, že hladiny antimikrobiálnej aktivity proti Lactobacillus helveticus boli porovnateľné s hladinami rodičovského kmeňa FI5876 (obr. 6).FI8070, kódujúce nisA/S5A, generoval zónu inhibicie rovnakej veľkosti, ako bola zóna inhibicie rodičovského kmeňa FI5F76. Toto naznačuje, že mutácia vo variantnom nizíne (nizín A/Dha5A) neovplyvňuje signifikantne jeho antimikrobiálne vlastnosti voči tomuto indikátorovému organizmu. U bunečného extraktu z FI8198 (produkujúci variantný nizín A/Dha33A) bolo v súlade s tým zistené, že produkuje zónu inhibicie väčšiu ako rodičovský kmeň (obr. 6). Toto zodpovedá asi 50 % zvýšeniu hladín nizínu A, za podmienok tu použitých (tabuľka 1). Vyššia hladina produkcie nebola nájdená u extraktu z FI8199, produkujúceho dvojito mutantný nizín A/Dha5A, Dha33A. Inhibíčný účinok tohto nizínového variantu bol zhodný s účinkom nizínu A obsahujúceho jednu mutáciu a tiež divokým typom molekuly (tabuľka 1). Vo všetkých prípadoch bol výnos jednotlivých variantov nizínu vyšší, keď bola použitá stratégia génovej náhrady, ako keď bol využitý zhodný plazmidom kódovaný gén v plazmidovom komplementačnom systéme (tabuľka 3, Dodd et al. (1992) (1993), vyššie).

Tabuľka 3 Porovnanie nizínovej aktivity z Lactococcových expresných systémov

Variant nizínu	Nizínová aktivita³komplementácia^b	(% divokého typu) génová náhrada⁰
nizín A (divoký typ)	50	100
nizín A (Dha5A)	25	100
nizín A (Dha33A)	10	150
nizín A (Dha5A, Dha33)	<ld	100

^a určené z difúzneho biotestu na platni ^b antimikrobiálna aktivita dosiahnutá plazmidom kódovanými nisA génmi komplementujúcimi nisA deficienciu v hostiteľskom kmeni FI7332 ^c antimikrobiálna aktivita dosiahnutá génovou náhradou. Funkčný nisA gén inkorporovaný v chromozóme v FI7990 v mieste nisA delécie d aktivita bola pod úrovňou detekcie v bioteste

Systém tu vyvinutý produkuje variantné nizíny s výnosom ekvivalentným výnosu nizínA produkujúcich rodičovských kmeňov FI5876 (tabuľka 1). V prípade divokého typu nisA génu je výnos o asi 50 % vyšší ako prv dosiahnuté hladiny nizínu za použitia analogických prístupov plazmidovej komplementácie (Dodd et al. (1992) (1993), vyššie). Ďalšie porovnanie týchto dvoch systémov ukazuje, že rozdiel medzi úrovňou produkcie je prekvapujúco viac zreteľný pre nizínové varianty (tabuľka 3). Prístup génovej náhrady zvyšuje výnos nizínu A/Dha5A približne 4-krát a nizínu A/Dha33A viac ako desaťkrát. Zvýšená účinnosť produkcie dvojito mutantného nizínu A/Dha5A, Dha33A je prekvapujúca (tabuľka 3). Pokiaľ je gén, ktorý špecifikuje tento variantný nizín kódovaný plazmidom a použitý ku komplementácii nisA deficiencie hostiteľských kmeňov, je antimikrobiálna aktivita d legovaná iba vo senzitívnejšom teste prevrstvenia kolónií. Bunečné extrakty z tohto kmeňa nevykazujú akúkoľvek aktivitu v difúznych biotestoch na platni (tabuľka 3). Avšak, ak je gén inkorporovaný do chromozómu za použitia stratégie génovej náhrady, je hladina aktivity ekvivalentná hladine nizín A reprezentujúcej zvýšenie produkcie o viac ako 100 %. Toto neočakávané zistenie je vo vzťahu s nasledujúcimi chemickými a biochemickými analýzami spracovaných molekúl. Značné množstvo purifikovaných peptidov sa vyžaduje kvôli plnej charakterizácii nových nizínov a pre produkciu vhodného množstva pre uspokojenie trhu potravinových ochranných prostriedkov a u tu popísaného systému sa zdá, že je relatívne vysoké množstvo dosiahnuté.

Produkovali sme množstvo kmeňov produkujúcich variantný nizín za použitia metodológie popísanej v tomto príklade. Tieto sú popísané v tabuľke 4. Vhodné oligonukleotidové priméry pre vyhotovenie špecifických mutácií boli projektované zo sekvencie danej na obrázku 4 a ako ukazuje obrázok 11.

Vhodné oligonukleotidové priméry pre vyhotovenie špecifických mutácií boli projektované zo sekvencie danej na obrázku 4 a ako ukazuje obrázok 11.

Tabuľka 4 Kmene produkujúce nizín generované génovou náhradou

Kmeň číslo	nisA mutácia (% wt)	Aktivita³	MIC^b(pg mľ¹
MG1614
FI5876	wt	100	0.13
FI7990	^AnisA	-	-
FI8070	S5A	100	0.25
FI8198	S33A	150	0.25
FI8199	S5A.S33A	100	1.00
FI8167	H27W	<1	nd^c
FI8122	S5A.H27W	10	nd
FI8307	II27K	100	0.13
FI8328	H31K	25	nd
FI8330	H27K.H31K	10	nd
FI8256	K12L	10	0.13
FI8290	^ΛΜ21	<1	nd
FI8289	I30W	<1	0.16

^a Antimikrobiálna aktivita v supernatantoch kultúry určená v difúznom bioteste na platni b Minimálne inhibičné koncentrácie (MIC) boli určené vzhľadom k senzitívnemu L. lactis kmeňu MG1614, nd, nie je určené.

Za niektorých okolností sa požaduje pridať nisA nizín ako induktor. Tabuľka 5 ukazuje výsledky použitia rôznych indukujúcich agens.

Tabuľka 5

Kmeň	Indukujúci agens (variant nizínu)	Indukcia 100 ng mM 1 mg mM	MIC mg mM
MG1614		2	4
FI5876	-	94	100	-
FI7847	-	3	3	-
FI7847	A (divoký typ)	104	104	0.13
FI7847	Dha5A	114	107	0.25
FI7847	Dha33A	17	101	0.25
FI7847	Dha5,33A	34	106	1.00
FI7847	H27K	86	nl	0.13
FI7847	K12L	81	nt	0.13
FI7847	I30W	41	nt	0.16

Príklad 2

Purifikácia variantného nizínu

Kmeň FI8070 (nisA/S5A) je kultivovaný a variantný nizín (v ktorom je Dha5 nahradený alanínom) je secernovaný do kultivačného média.

Variantný nizín je purifikovaný na základe metód popísaných Mulders et al. (1991), Eur. J Biochem., 201, 581 - 584. 1 liter kultúry bol inkubovaný pri 30 °C po 16 hodín. pH kultúr bolo redukované na 2 - 3 HCI pred centrifugáciou pri 10 000 rpm po 10 minút. Buniek zbavené supernatanty boli odobrané a pH bolo zvýšené na 5 - 6 10 mM NaOH. Ku každým 10 ml supernatantu bolo pridaných 0,99 g (NH4)2SO4· Tento roztok bol potom filtrovaný (Millipore, 0,45 pm) pred behom na Fractogel TSK Butyl kolóne, objem lôžka 5 x 20 cm, najprv ekvilibrovaná 0,8 M (NH4)2SO4- Kolóna bola premytá asi 1 litrom 0,8 M (NH4)2SO4, kým sa absorbancia pri 220 neznížila pod 0,5. Naviazaný nizín bol redukovaný 5 mM HCI a 10 ml frakcie boli testované na nizínovú aktivitu. Aktívne frakcie boli zhromaždené a sušené vymrazením. í everzná fáza HPLC bola vykonaná na resuspendovaných vzorkách za použitia pBondapak C^g kolóny 3,9 x 300 mm pri izbovej teplote, použitými rozpúšťadlami boli 0,06 % (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej a 0,06 % (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej v 90 % (objem/objem) vodnom acetonitrile. Absorbancia bola meraná pri 220 nm.

Príklad 3

Pridanie variantného nizínu do syru

Variantný nizín produkovaný kmeňom FI8070 (v ktorom je Dha5 nahradený alanínom) je pridaný v koncentrácii 12,5 mg na kg k nátierke z mäkkého syru, aby zabránil rastu jedlo kaziacich alebo patogénnych baktérií.

Claims

1. Spôsob na výrobu buniek, ktoré neobsahujú prirodzený nisA gén, ale exprivujú nizín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok poskytnutia buniek s variantným nisA génom v zoskupení génov obsahujúcom tiež gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu, kde variantný nisA gén má rovnaké vzťahy ako prirodzený nisA gén k zoskupeniu génov obsahujúcemu prirodzený nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že variantný nisA gén kóduje variantný nizín.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že variantný nisA gén obsahuje regulačný región iný ako regulačný región prirodzeného nisA génu a nizín kódujúci región.

4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje substitúciu variantného nisA génu za prirodzený, chromozomálny nisA gén v chromozomálnom mieste uvedeného prirodzeného nisA génu.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že poskytuje zoskupenie génov obsahujúce variantný nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu a odolnosť voči nizínu na autonómne sa rcplikujúcom DNA elemente.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že bunkou je Lactococcus.

7. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky 1) substitúcia značkovacieho selektovateľného nisA génu za prirodzený,

I chromozomálny nisA gén v chromozomálnom mieste uvedeného prirodzeného nisA génu a 2) substitúcia variantného nisA génu za značkovací selektovateľný nisA gén v chromozomálnom mieste uvedeného prirodzeného nisA génu.

8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje následný krok selekcie buniek, ktoré sú odolné voči nizínu.

9. Spôsob podľa nároku 7 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že značkovací selektovateľný nisA gén obsahuje gén pre rezistenciu na antibiotiká.

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok selekcie buniek, ktoré sú senzitívne na uvedené antibiotiká.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že variantný nisA gén obsahuje modifikáciu k transkripčnej alebo translačnej kontrolnej sekvencií prirodzeného nisA génu a v dôsledku tohto bunka exprivuje zvýšené hladiny svojho prirodzeného nisA nizínu v porovnaní s prirodzenou hladinou.

12. Bunka získateľná spôsobom podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

13. Bunka, ktorá neobsahuje prirodzený nisA gén, ale exprivuje nizín, kde táto bunka obsahuje variantný nisA gén v zoskupení génov obsahujúcom tiež gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu, kde variantný nisA gén má rovnaké pozičné vzťahy ako prirodzený nisA gén v zoskupení génov obsahujúcom prirodzený nisA gén a gény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu.

14. Bunka podľa nároku 13, kde variantný nisA gén kóduje variantný nizín.

15. Bunka podľa nároku 13 alebo 14, kde variantný nisA gén obsahuje regulačný región iný ako regulačný región prirodzeného nisA génu a nizín kódujúci región.

16. Bunka podľa ktoréhokoľvek nároku 13 až 15, kde je prirodzený chromožomálny nisA gén alebo jeho časť neprítomný a bunka obsahuje variantný nisA gén v chromozómovom umiestnení uvedeného prirodzeného nisA génu.

17. Bunka podľa ktoréhokoľvek nároku 13 až 15, obsahujúca autonómne sa replikujúci DNA element nesúci variantný nisA gén a fény pre modifikáciu nizínu, sekréciu a odolnosť voči nizínu.

18. Bunka podľa ktoréhokoľvek nároku 13 až 17, ktorou je Lactococcus.

19. Bunka podľa ktoréhokoľvek nároku 13 až 18, ktorá je odolná voči nizínu.

20. Bunka podľa ktoréhokoľvek nároku 13 až 19, kde variantný nisA gén obsahuje modifikáciu k transkripčnej alebo translačnej kontrolnej sekvencii prirodzeného nisA génu a v dôsledku tohto bunka exprivuje zvýšené hladiny svojho prirodzeného nisA nizínu v.porovnaní s prirodzenou hladinou.

21. Spôsob pre produkciu nizínu zahrňujúci kultiváciu buniek podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 20 a získanie nizínu takto produkovaného.

22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že nizín je variantný nizín.