JP2015509715A - 齲歯のための置換療法 - Google Patents

齲歯のための置換療法 Download PDF

Info

Publication number
JP2015509715A
JP2015509715A JP2014558872A JP2014558872A JP2015509715A JP 2015509715 A JP2015509715 A JP 2015509715A JP 2014558872 A JP2014558872 A JP 2014558872A JP 2014558872 A JP2014558872 A JP 2014558872A JP 2015509715 A JP2015509715 A JP 2015509715A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
streptococcus mutans
strain
polynucleotide
recombinant
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2014558872A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6297506B2 (ja
JP2015509715A5 (ja
Inventor
ジェフリー・ディ・ヒルマン
ジェイムズ・レイフ・スミス
シャワンダ・アール・ウィルソン−スタンフォード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Texas A&M University System
Original Assignee
Texas A&M University System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Texas A&M University System filed Critical Texas A&M University System
Publication of JP2015509715A publication Critical patent/JP2015509715A/ja
Publication of JP2015509715A5 publication Critical patent/JP2015509715A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6297506B2 publication Critical patent/JP6297506B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/34—Shaped forms, e.g. sheets, not provided for in any other sub-group of this main group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G4/00—Chewing gum
    • A23G4/06—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G4/12—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins
    • A23G4/123—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins containing microorganisms, enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本発明は、口腔衛生の改善に使用できる、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株を提供する。

Description

優先権
本出願は、米国仮出願６１／６０３,６６１(２０１２年２月２７日出願)および米国仮出願６１／６０３,６９３(２０１２年２月２７日出願)の利益を主張し、この両者とも引用によりその全体を本明細書に包含させる。
発明の背景
齲歯は世界で最も蔓延している慢性感染症の一つである。米国で５〜９歳の小児の過半数に少なくとも１個の齲腔があるかまたは充填されており、１７歳までに、約８０％の若者が齲腔を持つに至っている。合衆国保健社会福祉省。Oral Health in America: A Report of the Surgeon General--Executive Summary. Rockville, MD: US Department of Health and Human Services, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 2000。
合衆国で齲歯の処置に対する年間の出費は、Dental, Oral and Craniofacial Data Resource Centerによると、４００億ドルと推定される。齲歯は、エナメル質および象牙質の脱塩により特徴付けられ、最終的には歯の破壊に至る。食事性糖質はしばしば齲歯の原因として誤解されるが、いずれにしても齲歯の直接の原因は、歯の表面上の糖を代謝する微生物により産生される乳酸である。研究により、約７００種の口内微生物のうち、実質的に全てのヒトで見られる細菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)が、齲歯の発生における主原因病原体であることが示されている。歯牙表面の歯垢に生息するストレプトコッカス・ミュータンスは、食事性糖質を乳酸に変換する炭水化物代謝によってエネルギーを得て、次に、生成する乳酸が、エナメル質および象牙質の脱塩を促進し、最終的に齲腔を形成する。鉱質が失われる速度は存在するストレプトコッカス・ミュータンスの菌数ならびに消費される糖の頻度および量を含む、数種の因子に依存する。
ストレプトコッカス・ミュータンスのような病原性菌株を非病原性のエフェクター株に置き換える細菌干渉を利用する治療レジメンが置換療法として知られる。置換療法が成功するためには、１)非病原性であること、２)病原性生物のコロニー形成または増殖を妨げるように微小環境を変えることおよび３)標的病原性生物による再感染を防止するためにリスクのある宿主に永続性にコロニー形成し、そして、病原菌が宿主の常在性細菌叢の一部である場合、病原性生物をリスクのある組織から積極的に追放するエフェクター株に要求される。
置換療法の原理の適用には、ストレプトコッカス・ミュータンスの非齲蝕原性エフェクター株、例えば、宿主の口腔で野生型ストレプトコッカス・ミュータンスに優勢に競合することができ、乳酸合成が欠損したストレプトコッカス・ミュータンス株を取得することが必要である。宿主の口腔で永続性にコロニー形成でき、積極的に野生型ストレプトコッカス・ミュータンスに優勢に競合し、齲歯の予防および／または処置における置換療法において使用するのに適するストレプトコッカス・ミュータンスの安定な、乳酸欠損、非齲蝕原性株が当該分野で必要とされる。
エフェクター株がヒト口腔で先制してコロニー形成し、常在性野生型株を積極的に取って代わる能力は、最初は、多数の表現型特性に依存する複雑な現象であると考えられていた。しかしながら、一表現型特性が必要な選択的優位性をもたらすことが発見された。天然に存在し、試験したミュータンス連鎖球菌の実質的に全ての他の株を殺すことができる、ＭＵ１１４０と呼ばれるランチビオティクスを産生するストレプトコッカス・ミュータンスのひとつの株がヒトから単離された。例えば、Hillman et al., Infect. Immun. 44:141 (1984)参照。検出可能なＭＵ１１４０を産生しないまたは約３倍多い量を産生する種々の変異株を単離した。該変異体をラットモデルで使用して、ランチビオティクス産生とコロニー形成能の相関を調べさせた。これらの株が宿主に先制してコロニー形成し、ストレプトコッカス・ミュータンスの常在性株を積極的に置き換える能力は、産生されるＭＵ１１４０が増加するに連れて、顕著に増加することが判明した。
ＭＵ１１４０産生とコロニー形成能の同じ相関がヒトでも見られ、そこでは、野生型親株への反復暴露が永続性コロニー形成の達成に必要であり(Hillman et al. J. Dent. Res. 66:1092 (1985))、一方、ＭＵ１１４０の３倍増加量を産生する株への１回暴露が十分であった(Hillman et al. J. Dent. Res. 66:1092 (1987))。後者の株は、ヒトの口内のストレプトコッカス・ミュータンスの常在性株に完全に置き換わるのに１年以上を要した。この間、齲歯に対する感受性は、常在性ストレプトコッカス・ミュータンスのレベルが閾値より下に下がるまで持続すると推定された。
齲歯の置換療法のためのエフェクター株のコロニー形成能をさらに高めるために、ＭＵ１１４０の産生量が増加するかまたは特異的活性が増加したこの分子の変種を産生する、ストレプトコッカス・ミュータンスの１個またはそれ以上の株を得ることが望まれる。このような株は、エフェクター株が常在性、乳酸産生株を排除し、それにより完全な有効性を発揮するのに必要な期間を短縮する。このような株はまたコロニー形成に対する自然抵抗性も圧倒し、現在は知られてはいないが、処置されている集団中のある個人には存在し得る可能性が高い。例えば、Hillman, Antonie van Leeuwenhoek 82: 361-366, 2002参照。
発明の概要
一つの態様において、本発明は、
(ａ)乳酸の発現が、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するような、乳酸合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異；
(ｂ)組み換えアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド；
(ｃ)式Ｉ
〔ここで、次の変異が存在する：Ｐｈｅ１Ｉｌｅ変異またはＰｈｅ１Ｇｌｙ変異；Ｔｒｐ４Ａｌａ変異；Ｄｈａ５Ａｌａ変異；Ａｒｇ１３Ａｓｐ変異；またはこれらの変異の２個以上の組み合わせ。〕
を含むランチビオティクスをコードする組み換えポリヌクレオチド
を含む、単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株を提供する。本株はさらにＴｒｐ４ｉｎｓＡｌａ変異またはΔＴｒｐ４変異を含み得る。次のアミノ酸置換も存在し得る：Ａｂｕ８ＡｌａまたはＤｈｂ１４ＡｌａまたはＡｂｕ８ＡｌａおよびＤｈｂ１４Ａｌａの両者。本株は、ＣｏｍＥ、ＣｏｍＣまたはＣｏｍＥおよびＣｏｍＣの両者の発現が、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するような、ＣｏｍＥ、ＣｏｍＣまたはＣｏｍＥおよびＣｏｍＣの両者の合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異を含み得る。本株は、さらに、Ｄ−アミノ酸の発現が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するような、Ｄ−アミノ酸合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異を含み得る。Ｄ−アミノ酸合成に関与するポリヌクレオチドはｄａｌまたはｄａｌのプロモーターであり得る。組み換えアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドは、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドまたはストレプトコッカス・ミュータンスアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドであり得る。
本発明の他の態様は、宿主に宿主の口腔にいる齲歯誘発ストレプトコッカス・ミュータンス宿主株の置換に有効な量で本発明の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株を経口投与することを含む、齲歯感受性宿主における齲歯の発生率または重症度を軽減する方法を提供する。単離した組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は洗口液、練り歯磨き、チューインガム、フロス、咀嚼錠、食品または飲料に含ませることができる。
本発明のさらに他の態様は、本発明の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株および薬学的に許容される担体を含む、齲歯の発生率または重症度を軽減するための医薬組成物を提供する。
それゆえに、本発明は、とりわけ、野生型ＭＵ１１４０ランチビオティクスと比較して、生物学的活性が改善された変異型ＭＵ１１４０ランチビオティクスの発現により、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスを積極的に優勢に競合することができる、安定な、乳酸欠損および非齲蝕原性のストレプトコッカス・ミュータンスの株を提供する。
図１Ａは野生型ＭＵ１１４０構造(配列番号１)を示す。図１ＢはＭＵ１１４０の変異部位(配列番号２)を示す。 図２は野生型ＭＵ１１４０ ｌａｎＡポリヌクレオチド配列と共に変異を強調した変異型ＭＵ１１４０ ｌａｎＡポリヌクレオチド配列の染色体ＤＮＡ配列を示す。 図３はＭＵ１１４０構造遺伝子のｌａｎＡの突然変異誘発に使用したプライマーを示す。 図４Ａ〜Ｂは、プレートアッセイの阻害帯の結果を示す。 図５は、野生型ＭＵ１１４０と比較したＭＵ１１４０の変異型を産生する株の生物活性の平均および標準偏差を示す。 図６は、野生型ＭＵ１１４０と比較した、ＭＵ１１４０の変異型(Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ)を産生する株の生物学的活性を示す。
発明の詳細な記載
ここで使用する単数表現は、文脈から明らかに異なる解釈が必要でない限り、複数も含む。
ストレプトコッカス・ミュータンスは、乳酸を産生しないかまたは実質的に少ない量の乳酸を産生するように組み換えにより操作できる。Hillman et al. J. Appl. Microbiol. 102:1209 (2007)。生存可能な乳酸欠損ストレプトコッカス・ミュータンス株は、組み換えアルコールデヒドロゲナーゼが発現されるように、組み換えアルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)をコードする核酸で株を形質転換し、組み換えＡＤＨ産生株が乳酸欠損となるように乳酸合成経路に変異を導入することにより産生できる。組み換えＡＤＨは、細菌中の代謝物の蓄積を阻害し、それゆえに乳酸欠損による何らかの致死性を回避する。さらに、ストレプトコッカス・ミュータンス株は、野生型ＭＵ１１４０ランチビオティクスより大きな生物学的活性を有する変異型ＭＵ１１４０ランチビオティクスを発現するように組み換え処理できる。これらの株は、宿主の口腔の齲歯誘発性の野生型の自然のストレプトコッカス・ミュータンス株を打ち負かし、置換する。
親ストレプトコッカス・ミュータンス株
任意のストレプトコッカス・ミュータンス株を、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の構築に使用できる。本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、口腔で通常コロニー形成する野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株を超える選択優位性を有する。選択優位性は、本株による口腔のコロニー形成を促進し、口腔にコロニー形成する常在株を置換する種々の特徴(例えば、抗菌化合物の産生、減少したまたは有利な相対的代謝要求、大きな相対的増殖率、代謝物スカベンジャーの産生)によりもたらされる。本発明の一つの態様において、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株によるコロニー形成は、他の、非ストレプトコッカス・ミュータンス株(例えば、齲蝕発生と無関係な正常細菌叢)によるコロニー形成を実質的に妨害しない。例えば、増強したランチビオティクス活性を有する変異型ＭＵ１１４０ランチビオティクスを産生するストレプトコッカス・ミュータンスの組み換え株での感染は、口腔内の他の常在微生物主に影響することなく、常在する齲蝕原性ストレプトコッカス・ミュータンス株を置換する。
組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株
組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、種々の核酸組み換え技術(すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡの操作を含む技術)のいずれかを使用して産生した天然に存在しないストレプトコッカス・ミュータンスの株である。一般に、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は乳酸産生に欠損を有し、組み換えアルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)ポリペチドを発現し、野生型ＭＵ１１４０より大きな生物学的活性を有する変異型ＭＵ１１４０ランチビオティクスの産生に十分な組み換えポリペチドを発現する。ストレプトコッカス・ミュータンスの組み換え株は、所望によりＣｏｍＥ、ＣｏｍＣまたはＣｏｍＥおよびＣｏｍＣの両者の発現が欠損していてよくおよび／または所望により特定の宿主の口腔または食餌に通常存在しない有機物質(例えば、Ｄ−アミノ酸)に栄養要求性であってもよい。
変異型ＭＵ１１４０
ＭＵ１１４０は、環ＢとＣの間の“ヒンジ領域”でねじれた、全体として蹄鉄様形態を有する。Smith et al. (2003) Biochem. 42:10372-10384。この形態は、アミノ末端ＡＢ環(脂質II結合ドメイン)を、カルボキシ末端と重なっているＣＤ環に向けて折りたたむ、ヒンジ領域における回転様モチーフの結果である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＭＵ１１４０の側方集合に重要であると考えられ、脂質IIの捕捉および隔離を可能とする。環ＡのＴｒｐ４のΨ角およびＤｈａ５のΦ角は、その柔軟性への寄与を補助する。さらにＳＡｌａ７(チオエーテル環に拘束されない残基)のΨ結合は３６０°回転し、環Ａが環Ｂに対して自由に回転することを可能にすることも決定された。この柔軟性は、脂質II結合中の環ＡおよびＢの指向性に重要であると考えられる。ヒンジ領域はまた潜在的酵素感受性アルギニンを残基１３に含む。ＭＵ１１４０の構造遺伝子(ｌａｎＡ)における変異を、次のアミノ酸変化の影響を決定するために作製した：Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ、ΔＴｒｐ４、Ｄｈａ５Ａｌａ、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ。図１Ｂ。
Ｔｒｐ４の欠失またはＴｒｐ４後へのＡｌａの挿入を有するＭＵ１１４０の変変異型は、標的株としてミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)株ＡＴＣＣ ２７２を使用した遅延拮抗アッセイにおいて野生型とほぼ同等な生物活性を示すことが判明した。Wilson-Sanford et al., (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:1381。このアッセイにおいて、活性を、阻止域の面積を計算して決定した。これらの結果は、環Ａの短縮または延伸はＭＵ１１４０活性に有益なまたは有害な影響を有さないことを示し、環Ａの構造における予期しない寛容性を示す。図５に示すとおり、Ｔｒｐ４Ａｌａ置換は、野生型と比較して、統計学的に有意な(ｐ＜.０５)生物活性の増強をもたらした。両アミノ酸が非荷電および疎水性であるため、生物活性の差異は、２個のアミノ酸のサイズの違いによるものであると推定された。Ｄｈａ５のＡｌａへの置換も、生物活性の統計学的に有意な(ｐ＜.０５)増強をもたらした。７位のＳＡｌａ後のアラニン挿入は、生物活性の有意な(ｐ＜.０５)減少をもたらした。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＳＡｌａ７が３６０°自由に回転し、環Ａが環Ｂに対して自由に回転することを可能にしていることが決定されたため、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａ変異は、脂質II結合中の環の配向を変え、おそらく分子のその基質である脂質IIに対する親和性に影響すると結論付けられる。Ａｒｇ１３Ａｓｐ置換は、野生型と比較して、生物活性の極めて有意な(ｐ＜.０５)上昇をもたらした。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、観察された効果は、溶解度向上の結果であり得る。図６に示すとおり、Ｐｈｅ１Ｉｌｅ置換およびＰｈｅ１Ｇｌｙ置換のいずれも、野生型と比較して、生物活性の統計学的に有意な(ｐ＜.０５)増強をもたらした。顕著であるのは、Ａｓｐ(ＧＡＴ／ＧＡＣ)からＡｒｇ(ＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＴ／ＣＧＣ／ＣＧＡ／ＣＧＧ)への置換またはＴｒｐ(ＴＧＧ)のＡｌａ(ＧＣＴ／ＧＣＴ／ＧＣＡ／ＧＣＧ)への置換またはＳｅｒ(ＡＧＴ／ＡＧＣ)のＡｌａ(ＧＣＴ／ＧＣＴ／ＧＣＡ／ＧＣＧ)への置換またはＰｈｅ(ＴＴＴ／ＴＴＣ)のＩｌｅ(ＡＴＴ／ＡＴＧ)またはＧｌｙ(ＧＧＴ／ＧＧＣ／ＣＣＡ／ＧＧＧ)への置換が全て、影響を受けるコドン中の１個以上のトランスバージョンを含み得る複数点突然変異を含むため、自然で起こるとは考えにくい。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、この増強の原因は、脂質II標的への結合親和性の増強またはリーダー配列の開裂の効率改善によるものであり得る。これらの部位特異的変化(Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ)の１個以上を含む変異型ＭＵ１１４０を産生するエフェクター株は、口腔にコロニー形成し、疾患原因、常在性ストレプトコッカス・ミュータンス株を積極的に置き換える能力の改善により、野生型ＭＵ１１４０を産生するエフェクター株より優れた能力を有する。
本発明のランチビオティクＭＵ１１４０の変異型は、翻訳後修飾を含むポリペチドである。翻訳後修飾は、翻訳された後のポリペチドの化学修飾である。ポリペチドは、アミド結合により共有結合した２個以上のアミノ酸のポリマーである。精製ポリペチドは、実質的に細胞性物質、他のタイプのポリペチド、化学前駆体、ポリペチド合成に使用した化学物質またはこれらの組み合わせが混在しないポリペチド調製物である。実質的に細胞性物質、培養培地、化学的前駆体、ポリペプチドの合成に使用した化学物質などが混在しないポリペチド調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％、１％未満または以下の他のポリペチド、培養培地、化学的前駆体および／または合成に使用した他の化学物質を含む。それゆえに、精製ポリペチドは約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上純粋である。精製ポリペチドは、７０％純度未満の未精製または半精製細胞抽出物またはポリペチド混合物を含まない。
野生型ＭＵ１１４０を図１Ａに示す。ＭＵ１１４０は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤで標識した４個の環を有する。これらの環の２個は、１個の環Ａ(Ａｌａ３−Ｓ−Ａｌａ７)および１個の環Ｃ(Ａｌａ１６−Ｓ−Ａｌａ２１)を含むランチオニン残基によって形成され、８位のα−アミノブチラート残基および１１位のＡｌａから成る環Ｂ(Ａｂｕ８−Ｓ−Ａｌａ１１)を形成するメチル−ランチオニン残基(Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ)が存在し、そして４番目の環Ｄは、チオエーテル結合によりアミノビニル基に結合した１９位のＡｌａ含んで形成される。
本発明の一つの態様は、図１Ｂ(配列番号２)に示す、ＭＵ１１４０の次の１個以上の変異型(ランチビオティクミュータシン(lantibiotic mutacin))を提供する。すなわち、本発明は、次の変異の１個以上を含む、野生型ＭＵ１１４０(配列番号１)の変異型を含む：
１. Ｐｈｅ１ＩｌｅまたはＰｈｅ１Ｇｌｙ；すなわち、１位のフェニルアラニンのイソロイシンまたはグリシンへの変換。
２. Ｔｒｐ４Ａｌａ；すなわち、４位のトリプトファンのアラニンへの変換。
３. Ｄｈａ５Ａｌａ；すなわち、５位の２,３−ジデヒドロアラニンのアラニンへの変換。
４. Ａｒｇ１３Ａｓｐ；すなわち、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変換。
本発明の一つの態様において、ランチビオティクＭＵ１１４０の変異型は、Ｐｈｅ１ＩｌｅまたはＰｈｅ１Ｇｌｙアミノ酸置換；Ｔｒｐ４Ａｌａアミノ酸置換；Ｄｈａ５Ａｌａアミノ酸置換；Ａｒｇ１３Ａｓｐアミノ酸置換；またはこれらの組み合わせを含む。本発明のＭＵ１１４０変異型は、一次アミノ酸配列に、例えば、４番目のトリプトファン残基の後にアラニンが挿入されたＴｒｐ４ｉｎｓＡｌａ；または４位のトリプトファンが欠失しているΔＴｒｐ４；またはこれらの変換の両者を含み得る。
ＭＵ１１４０ランチビオティクポリペチドの生物学的に活性な等価物は、１個以上の保存的アミノ酸多様性または他の小さな修飾を有し、生物学的活性を保持し得る。生物学的に活性な等価物は、対応するランチビオティクＭＵ１１４０と比較したとき、実質的に等しい機能を有する。本発明の一つの態様において、ランチビオティクミュータシンは、約１個、２個、３個、４個または５個またはそれ以下の保存的アミノ酸置換を有する。保存的置換は、アミノ酸を、ペプチド化学の当業者が、ポリペチドの二次構造および一般的性質が実質的に変化しないと予測する類似の性質を有する他のアミノ酸に置換するものである。一般に、次の群のアミノ酸が保存的変化を表す：(１)ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｄｈａ、ａｂｕ、ｄｈｂ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；(２)ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；(３)ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｇｌｙ、ｄｈａ、ａｂｕ、ｄｈｂ、ｐｈｅ；(４)ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および(５)ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。生物学的に活性な等価物ランチビオティクミュータシン類または他のランチビオティクポリペチドを、一般的に本発明の変異型ランチビオティクミュータシン配列の１個を修飾し、修飾ランチビオティクミュータシンの特性を、生物学的等価物であるか否か決定されるように評価することにより同定できる。ランチビオティクスは、阻止域アッセイのようなアッセイにおいて、本発明のランチビオティクミュータシンと実質的に同様に反応するならば、例えば元のランチビオティクミュータシンの活性の９０〜１１０％を有するならば、生物学的等価物である。
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、機能的変異型ＭＵ１１４０を発現するポリヌクレオチドを含む。変異型ＭＵ１１４０の生物学的活性は、例えば、阻止域アッセイを使用してアッセイできる(実施例２参照)。組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、野生型、齲蝕原性ストレプトコッカス・ミュータンスを置き換え、宿主の口腔から実質的に排除するのに十分な変異型ＭＵ１１４０を産生する(例えば、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス数を約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少させる(または約５％〜約１００％の間の何れかの範囲))。
本発明のランチビオティクスは、ランチビオティクスが自然には通常結合していないアミノ酸配列、すなわち、異種アミノ酸配列と共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。異種アミノ酸配列は、非ストレプトコッカス・ミュータンス生物、合成配列または本発明のランチビオティクスのカルボキシまたはアミノ末端に通常位置しないストレプトコッカス・ミュータンス配列由来であり得る。さらに、本発明のランチビオティクスは、指示薬のようなアミノ酸以外の化合物または分子と共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。本発明のランチビオティクスは、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通型ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはこれらの組み合わせと共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。ポリペチドはまた精製を容易にする部分(例えば、親和性タグ、例えば６−ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ブドウ球菌プロテインＡまたはｃｏｍ)またはポリペチド安定性を促進する部分(例えば、ポリエチレングリコール；アミノ末端保護基、例えばアセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル；カルボキシル末端保護基、例えばアミド、メチルアミドおよびエチルアミド)である部分(すなわち、ポリペチドまたは他の化合物であり得る官能基)と結合できる。本発明の一つの態様において、タンパク質精製リガンドは、本発明のポリペプチドの、例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端の１個以上のアミノ酸残基であり得る。アミノ酸スペーサーは、天然で本発明のポリペプチドと結合しないアミノ酸の配列である。アミノ酸スペーサーは、約１個、５個、１０個、２０個、１００個または１,０００個のアミノ酸から成り得る。
所望により、本発明のランチビオティクスは、異種アミノ酸配列を含み得る融合タンパク質の一部であり得る。異種アミノ酸配列は、本発明のランチビオティクスのＣ末端またはＮ末端に存在し、融合タンパク質を形成し得る。１個以上の本発明のランチビオティクスが融合タンパク質に存在し得る。本発明のランチビオティクスのフラグメントが本発明の融合タンパク質に存在し得る。本発明の融合タンパク質は１個以上の本発明のランチビオティクス、そのフラグメントまたはこれらの組み合わせを含み得る。
本発明の一つの態様において、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株はＡＴＣＣ ５５６７６(特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約(ブダペスト条約)の下寄託)であり、これは、ここに記載する変異型ＭＵ１１４０を発現するように遺伝子操作されている。
野生型ＭＵ１１４０ランチビオティクスと比較して増強した生物学的活性を有する変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスの産生は、それゆえに宿主の口腔に存在する非ＭＵ１１４０産生ストレプトコッカス・ミュータンス株を超える選択優位性を有するストレプトコッカス・ミュータンスを提供する。変異型ＭＵ１１４０は、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株により発現されたとき、常在性、ＭＵ１１４０感受性ストレプトコッカス・ミュータンス株を排除し、それゆえにＭＵ１１４０感受性株のコロニー形成を阻害し、口腔の組み換えストレプトコッカス・ミュータンスコロニー形成を促進する。野生型の、天然ストレプトコッカス・ミュータンスが口腔から排除されるため、齲歯の発生率および／または重症度は低下する。
本発明の一つの態様において、エフェクター株はさらにｌａｎＢ、ｌａｎＣ、ｌａｎＥ、ｌａｎＦ、ｌａｎＧ、ｌａｎＫ、ｌａｎＭ、ｌａｎＰ、ｌａｎＲ、ｌａｎＴまたこれらのストレプトコッカス・ミュータンスポリペチドの２個以上の組み合わせを発現できる。
乳酸発現欠損
“乳酸欠損”または“乳酸産生の欠損”は、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株が、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスと比較して産生する乳酸の量が実質的に減少していることを意味する。乳酸の実質的に減少した量は、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株(例えばストレプトコッカス・ミュータンス株ＵＡ１５９(ＡＴＣＣ ７００６１０))またはストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)(例えばストレプトコッカス・ソブリナス株ＳＬ１(ＡＴＣＣ ３３４７８))、ストレプトコッカス・ラッタス(Streptococcus rattus)(例えば、ストレプトコッカス・ラッタス株ＦＡ１(ＡＴＣＣ １９６４５))、ストレプトコッカス・クリセツス(Streptococcus cricetus)(ストレプトコッカス・クリセツス株ＨＳ６(ＡＴＣＣ １９６４２))およびストレプトコッカス・フェルス(Streptococcus ferus)(ストレプトコッカス・フェルス株８Ｓ１))を含む、ミュータンス連鎖球菌群に属する他の種により産生される乳酸より約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％(または約４０％〜約１００％の間の任意の範囲)少ない。本発明の一つの態様において、乳酸欠損ストレプトコッカス・ミュータンスエフェクター株は検出可能な乳酸を産生しない。乳酸発現は、例えば、Hillman et al., Infect. Immun. 62:60 (1994); Hillman et al., Infect. Immun. 64:4319 (1996); Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295に記載に従って検出できる。
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、乳酸合成経路の非機能化、不活性化、部分的非機能化または部分的不活性化された調節領域、翻訳シグナル、転写シグナルまたは構造配列の結果として乳酸欠損となる。調節領域、翻訳シグナルおよび転写シグナルは、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ＣＡＡＴボックス、ＣＣＡＡＴボックス、プリブノーボックス、ＴＡＴＡボックスなどを含む。非機能化または不活性化は、ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質の知られている野生型機能または活性が除去されているかまたは野生型ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質と比較して約８０％、９０％、９５または１００％(または約８０％〜約１００％の間の何れかの範囲)まで高度に低減されていることを意味する。部分的非機能化または部分的不活性化は、ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質の知られている野生型機能または活性が、野生型ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質と比較して、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７９％(または約２０％〜約７９％の間の何れかの範囲)まで部分的に低減されていることを意味する。
ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質を非機能化または部分的非機能化する不活性化または部分的不活性化は、例えば乳酸合成経路に関与するポリヌクレオチドにおける変異(の取り込み例えば、点突然変異、フレームシフト突然変異、置換、欠失(一部または完全なシグナル、領域または構造ポリヌクレオチドの)、中断および／または挿入)のような方法により達成できる。乳酸合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異は、乳酸の発現量が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上低減するように、乳酸の発現に影響し得る。
例えば、乳酸発現の不活性化または部分的不活性化は、例えば、部分的または完全なｌｄｈ構造ポリヌクレオチドまたは部分的または完全なｌｄｈプロモーターの欠失による、乳酸デヒドロゲナーゼ(ｌｄｈ)遺伝子の不活化または部分的不活化により達成できる。また、乳酸発現の不活性化または部分的不活性化は、炭水化物輸送に関与する酵素の遺伝子、例えば、ホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系(ｐｔｓ)遺伝子の不活化または部分的不活化により、部分的または完全なｐｔｓ構造ポリヌクレオチドまたは部分的または完全なｐｔｓプロモーターの削除により達成できる。例えば、Cvitkovitch et al., J. Bacteriol. 177:5704 (1995)参照。乳酸発現の不活性化または部分的不活性化は、細胞内および細胞外多糖貯蔵に関与する酵素をコードする遺伝子、例えば、グリコーゲンシンターゼ(ｇｌｇＡ)遺伝子(例えば、Spatafora et al., Infect. Immun. 63:2556 (1995)参照)およびフルクトシルトランスフェラーゼ(ｆｔｆ)遺伝子(例えば、Schroeder et al., Infect. Immun. 57:3560 (1989)参照)の不活化または部分的不活化により、部分的または完全なｇｌｇＡまたはｆｔｆ構造ポリヌクレオチドまたは部分的または完全なｇｌｇＡまたはｆｔｆプロモーターの欠失により達成できる。
乳酸合成経路における１個以上の欠損は突然変異誘発(すなわち、ストレプトコッカス・ミュータンスの変異原への暴露)、自然発生変異体の選択または組み換え技術を使用した遺伝子操作により導入できる。これらの技術は当分野で周知である(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照)。本発明の一つの態様において、乳酸合成経路欠損は、組み換え技術を使用して、例えば、欠損ｌｄｈ構造遺伝子の細菌への導入と続く野生型ｌｄｈを欠損ｌｄｈに置き換えるための部位特異的組み換えにより導入する。ストレプトコッカス・ミュータンスｌｄｈ遺伝子はクローン化され、そのヌクレオチド配列は決定されており(GenBank accession number M72545)、組み換えｌｄｈ遺伝子はエシェリキア・コリ(Escherichia coli)で発現されている(Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295; Duncan et al., 1991, Infect. Immun., 59:3930-3934)。Hillman et al. は、ｌｄｈの本質的に完全な読み取り枠をストレプトコッカス・ミュータンス株から欠失させた(J. Appl. Microbiol. 102:1209 (2007))。
アルコールデヒドロゲナーゼ産生
乳酸合成における欠損がストレプトコッカス・ミュータンスにとって致死的であるため、組み換え、乳酸欠損ストレプトコッカス・ミュータンス株における欠損は、組み換えアルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)の産生により補填されなければならない。例えば、Hillman et al., Infect. Immun. 64:4319 (1996)参照。組み換えＡＤＨの産生は、蓄積すれば乳酸欠損ストレプトコッカス・ミュータンスの死の原因となる代謝物、例えば、ピルベートの蓄積を阻止する。
ストレプトコッカス・ミュータンス株は、ザイモモナス・モビリスからの組み換えアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＢ、アルコールデヒドロゲナーゼIIまたは鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、GenBank Accession No. M15394; Conway et al., 1987, J. Bacteriol., 169:2591-2597参照)、ストレプトコッカス・ラッタスからのアルコールデヒドロゲナーゼ、コメンサリバクター・インテスティニ(Commensalibacter intestini)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、アゾトバクター・ビネランジイ(Azotobacter vinelandii)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、腸内細菌科細菌(Enterobacteriaceae bacterium)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、ディケヤー・ゼアエ(Dickeya zeae)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、ロドフェラックス・フェリレデューセンス(Rhodoferax ferriredcuens)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、シュードモナス・ブラッシカセアルム(Pseudomonas brassicacearum)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)からのアルコールデヒドロゲナーゼII、ディケヤー・ダダンティ(Dickeya dadantii)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シトロバクター・ローデンチウム(Citrobacter rodenitium)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シュワネラ・プトレファシエンス(Shewanella putrefaciens)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、ビブリオ・ニグリパルクリチュード(Vibrio nigripulchritudo)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シュードモナス・サバスタノイ(Pseudomonas savastanoi)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、フォトバクテリウム・ダムセラ(Photobacterium damselae)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、ゼノラブダス・ネマトフィラ(Xenorhabdus nematophila)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、ゼノラブダス・ボビエニイ(Xenorhabdus bovienii)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シュードモナス・エントモフィラ(Pseudomonas entomophila)からのアルコールデヒドロゲナーゼII、シュワネラ・ビオラセア(Shewanella vilacea)からのアルコールデヒドロゲナーゼII、ビブリオ・シナロエンシス(Vibrio sinaloensis)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、シュワネラ・ペアレアナ(Shewanella pealeana)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、ビブリオ・アンガスタム(Vibrio angustum)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、エドワージエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、サルモネラ・ボンゴール(Salmonella bongori,)からのアルコールデヒドロゲナーゼ、エンテロバクター・アズブリエ(Enterobacter asburiae)からの鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼ、エシェリキア・コリからのアルコールデヒドロゲナーゼ、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)からのアルコールデヒドロゲナーゼ４、ビブリオ・スプレンディダス(Vibrio splendidus)からのアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように遺伝子操作できる。本発明の一つの態様において、細菌アルコールデヒドロゲナーゼまたは鉄含有アルコールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、ザイモモナス・モビリスアルコールデヒドロゲナーゼＢと少なくとも約６０％、６５％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％(または約６５％〜１００％の間の何れかの範囲)相同性を有する。
さらに、ＡＤＨコード化ポリヌクレオチドは、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスａｄｈ遺伝子と組み合わせたＡＤＨコード化ポリヌクレオチドの導入がストレプトコッカス・ミュータンスゲノム中でＡＤＨコード化ポリヌクレオチドの複数コピーを提供するようにして、ストレプトコッカス・ミュータンス由来とすることができる。あるいは、組み換えＡＤＨポリヌクレオチドは、ＡＤＨ産生を上方制御するように、ストレプトコッカス・ミュータンスａｄｈ遺伝子の制御機構に変異を導入することにより構築できる(例えば、ａｄｈ遺伝子の転写を増加させるａｄｈプロモーターの変異)。
ａｄｈポリヌクレオチドは、本発明のストレプトコッカス・ミュータンス株に周知組み換え技術、例えば、ＡＤＨポリペチドをコードするポリヌクレオチドでのストレプトコッカス・ミュータンス株の形質転換により導入できる。形質転換または形質転換するは、ストレプトコッカス・ミュータンスが、非野生型核酸配列を、そのゲノムに統合されて有するか、または複数世代にわたり維持されるプラスミドとしてこれを有することを意味する。ａｄｈポリヌクレオチドは、本発明のストレプトコッカス・ミュータンス株が乳酸発現の不活性化に関わらず生存可能であるように、機能的ＡＤＨポリペチドを発現する。
例えば、ＡＤＨをコードするポリヌクレオチドの同定、クローニング、安定な形質転換および発現のための方法は当分野で日常的であり、周知である(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照)。例えば、ＡＤＨをコードするポリヌクレオチドの単離は、ゲノムＤＮＡまたは本遺伝子の既存のクローンからの分子のＰＣＲ増幅により実施できる。組み換えＡＤＨの発現は、ａｄｈ構造ポリヌクレオチドを、ストレプトコッカス・ミュータンスでの発現を促進するプロモーター(例えば、ｓｐａＰまたは野生型ｌｄｈプロモーター)と操作可能に結合することにより達成できる。
機能的ＡＤＨの産生は、例えば、当分野で周知である慣用のＡＤＨ活性アッセイ(例えば、エタノールのＮＡＤ依存的酸化のアッセイ)によりアッセイできる(Neal et al., 1986, Eur. J. Biochem., 154:119-124)。Hillman et al. は、機能的、組み換えＡＤＨを発現するストレプトコッカス・ミュータンスの株を構築した。例えば、Hillman et al., Infect. Immun. 68:543 (2000)参照。
栄養素要求性
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、所望により、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株による口腔コロニー形成が制御できるように、宿主の口腔または食餌に通常存在しない有機物質に対する栄養要求性であるように遺伝子操作できる。すなわち、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、所望により増殖に必要とする特定の有機化合物を合成できないように、遺伝子操作できる。例えば、本発明の株は、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニンの栄養要求株である。これにより、栄養要求性株のコロニー形成は、口腔内の有機物質の量の制御により調節できる。例えば、コロニー形成は、有機化合物を定期的に口腔に提供することにより促進でき、口腔への有機物質の投与の保留によりコロニー形成を停止できる。
例えば、Ｄ−アラニンは、痕跡量を超えては哺乳動物の口腔または食餌で通常産生されないかまたは存在しない。それゆえに、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンスがＤ−アラニンに栄養要求性であるならば、Ｄ−アラニンが口腔内での本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンスのコロニー形成維持のために、哺乳動物の口腔に定期的に送達することが必要である。Ｄ−アラニンを口腔に送達しなければ、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は最終的に死滅する。
本発明の一つの態様において、組み換えストレプトコッカス・ミュータンスは、アラニンラセマーゼ欠損である。アラニンラセマーゼはＤ−アラニン代謝に必要である。“アラニンラセマーゼ欠損”または“アラニンラセマーゼ産生の欠損”は、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株が産生するアラニンラセマーゼの量が、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスに比して実質的に減少していることを意味する。アラニンラセマーゼの実質的に減少した量は、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株が産生するより約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％(または約４０％〜約１００％の間の何れかの範囲)未満のアラニンラセマーゼである。本発明の一つの態様において、アラニンラセマーゼ欠損組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は検出可能なアラニンラセマーゼを産生しない。アラニンラセマーゼは、例えば、Wantanabe et al., J. Biochem. 126:781 (1999)に記載のとおりアッセイできる。
ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質を非機能化または部分的非機能化する不活性化または部分的不活性化は、アラニンラセマーゼ合成に関与する遺伝子における変異導入(例えば、点突然変異、フレームシフト突然変異、置換、欠失(一部または完全なシグナル、領域または構造ポリヌクレオチド)、中断および／または挿入のような方法により達成できる。アラニンラセマーゼ合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異は、アラニンラセマーゼの発現量が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減少させるように、アラニンラセマーゼの発現に影響し得る。
例えば、アラニンラセマーゼ発現の不活性化または一部不活性化は、例えば、ｄａｌ構造ポリヌクレオチドの一部または全てまたは一部または完全なｄａｌプロモーターの欠失によりｄａｌ遺伝子を不活化または一部不活化することにより達成できる。
細菌栄養要求株は、当分野で周知の種々の技術、例えば化学的突然変異誘発、自然発生変異体の選択および／または組み換え技術(例えば、トランスポゾン突然変異誘発、欠損または非機能的遺伝子との組み換えによる置換)により産生できる。例えば、Ｄ−アラニン栄養要求性ストレプトコッカス・ミュータンス株は、アラニンラセマーゼをコードする遺伝子(ｄａｌ)、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する酵素に欠損を導入することにより産生できる。このような株は産生されている。例えば、Hillman et al., J. Appl. Microbiol. 102: 1209-1219 (2007)参照。
ＣｏｍＥ欠損
所望により、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は不活性化または非機能化ｃｏｍＥ遺伝子を含み得る。不活性化または非機能化ｃｏｍＥ遺伝子を有する株は、ＣｏｍＥが環境的ＤＮＡ取り込みに重要であるため、形質転換を受けにくい。さらに、ｃｏｍＥは補完され得ない。
“ＣｏｍＥ欠損”または“ＣｏｍＥ産生における欠失”は、組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の産生するＣｏｍＥタンパク質の量が野生型ストレプトコッカス・ミュータンスに比して実質的に減少していることを意味する。ＣｏｍＥの実質的に減少した量は、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株により産生されるＣｏｍＥタンパク質より約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５または１００％(または約４０％〜約１００％の間の何れかの範囲)少ない。本発明の一つの態様において、ＣｏｍＥ欠損組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は検出可能なＣｏｍＥタンパク質を産生しない。ＣｏｍＥ発現は、例えば、Chen & Gotschlich, J. Bact. 183:3160 (2001)に記載のとおりアッセイできる。
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は、ＣｏｍＥ合成における非機能化、不活性化、部分的非機能化または部分的不活性化調節領域、翻訳シグナル、転写シグナルまたは構造配列の結果ＣｏｍＥ欠損であり得る。
ポリヌクレオチド、遺伝子、ポリペチドまたはタンパク質を非機能的または一部機能的にする不活性化または部分的不活性化は、例えば、ＣｏｍＥ合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異導入(例えば、点突然変異、フレームシフト突然変異、置換、欠失(一部または完全なシグナル、領域または構造ポリヌクレオチド)、中断および／または挿入)のような方法を含む。ＣｏｍＥ合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異は、ＣｏｍＥの発現量が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上減少するように、ＣｏｍＥの発現に影響し得る。
例えば、ＣｏｍＥ発現の不活性化または部分的不活性化は、例えば、部分的または完全なｃｏｍＥ構造遺伝子または部分的または完全なｃｏｍＥプロモーターの欠失による、ｃｏｍＥ遺伝子の不活化または部分的不活化により達成できる。ＤＮＡ取り込みに関与する他の遺伝子、例えばｃｏｍＡ、ｃｏｍＢ、ｃｏｍＣおよびｃｏｍＤもこれに加えてまたはこれとは別に不活性化または部分的不活性化をし得る。
ＣｏｍＥ合成における欠損は、突然変異誘発(すなわち、細菌の変異原への暴露)、自然発症変異体の選択または組み換え技術を使用する遺伝子操作により達成できる。変異ｃｏｍＥ遺伝子を有するストレプトコッカス・ミュータンス株は産生されている。例えば、Hillman et al., J. Appl. Microbiol. 102: 1209-1219 (2007)参照。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、全体より少ない微生物ゲノムを含み、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＲＮＡまたはＤＮＡまたはこれらの組み合わせであり得る。ポリヌクレオチドは、他の成分、例えばタンパク質、脂質および他のポリヌクレオチドがないように精製できる。例えば、ポリヌクレオチドは５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％精製され得る。ゲノムＤＮＡ制限消化を含む、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーまたはゲル切片内の数百から数百万の他の核酸分子の中に存在する核酸分子は、単離されたポリヌクレオチドとは見なされない。
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のポリペチド(例えば、ＭＵ１１４０ポリペチド、ＡＤＨポリペチド、ＣｏｍＥポリペチド、Ｄ−アミノ酸合成ポリペチドおよび乳酸合成ポリペチド)をコードする。本発明の一つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２０〜２７に示す変異体ミュータシン１１４０ポリペチド、これらの組み合わせまたはそのフラグメントをコードする。本発明の一つの態様において、エフェクターは、さらにｌａｎＢ、ｌａｎＣ、ｌａｎＥ、ｌａｎＦ、ｌａｎＧ、ｌａｎＫ、ｌａｎＭ、ｌａｎＰ、ｌａｎＲ、ｌａｎＴまたはこれらのストレプトコッカス・ミュータンスポリヌクレオチドの２個以上の組み合わせを発現できる。
本発明のポリヌクレオチドは、約６００、５００、４００、３００、２００、１００、６６、６０、５０、４５、３０、１５未満(または約６００〜１５の間の任意の範囲)の連続ポリヌクレオチドから成り得る。精製ポリヌクレオチドは付加的異種性ヌクレオチドおよび／または付加的相同ポリヌクレオチドを含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、他のヌクレオチド配列、例えばリンカー、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通型ドメインまたはタンパク質精製に有用なリガンド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグおよびブドウ球菌プロテインＡをコードする配列を含み得る。本発明の一つの態様は、配列番号２０〜２７をコードする少なくとも約６、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、６６または以上の連続ヌクレオチドを含む精製ポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは単離できる。単離されたポリヌクレオチドは、天然で結合している５’および３’フランキングゲノム配列の一方または両方と直接連続していない天然に存在するポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、任意の長さの組み換えＤＮＡ分子であり得る。単離ポリヌクレオチドはまた天然に存在しない核酸分子を含む。本発明のポリヌクレオチドは、完全長ポリペチド、ポリペチドフラグメントおよび変異型または融合ポリペチドをコードできる。
本発明のポリペチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％または約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である相同ヌクレオチド配列およびその相補体もまた本発明のポリヌクレオチドである。縮重ヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするが、遺伝暗号の縮重により核酸配列があるポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチドである。
配列同一性パーセントは当分野で認識された意味を有し、２個のポリペチドまたはポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定する多数の方法がある。例えば、Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)参照。ポリヌクレオチドまたはポリペチドを整列させる方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux et al. (1984) Nuc. Acids Res. 12:387)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al. (1990) J. Molec. Biol. 215:403)およびＢｅｓｔｆｉｔプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)を含むコンピュータープログラムに分類され、これは、Smith and Waterman ((1981) Adv. App. Math., 2:482-489)の局所相同性アルゴリズムを用いる。例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるコンピュータープログラムＡＬＩＧＮを、ギャップ開始ペナルティ−１２およびギャップ伸長ペナルティ−２を用いるアフィンギャップサーチと共に使用できる。
特定の配列が、対照配列と、例えば、約９５％同一であるか否かを決定するためにいずれかの配列整列プログラムを使用するとき、同一性パーセンテージを、対照ポリヌクレオチドの完全長にわたり計算し、対照ポリヌクレオチドの総ヌクレオチド数の５％までの同一性におけるギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、細菌サンプルに存在する核酸配列から単離できる。ポリヌクレオチドはまた実験室で、例えば、自動合成装置を使用しても合成できる。増幅法、例えばＰＣＲを使用して、ポリペチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからポリヌクレオチドを増幅できる。
本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在するポリペチドのコーディング配列を含んでよくまたは天然には存在しない改変された配列をコードしてよい。所望により、ポリヌクレオチドを、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサーまたは宿主細胞における本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動する他の調節エレメントを含む発現調節エレメントを含む発現ベクターにクローン化できる。発現ベクターは、例えば、プラスミドであり得る。ミニ染色体、例えばＭＣおよびＭＣ１、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド(ファージラムダｃｏｓ部位が挿入されているプラスミド)およびレプリコン(細胞におけるそれ自体の制御下に複製できる遺伝要素)も使用できる。
発現制御配列に操作可能に結合するポリヌクレオチドを製造する宿主細胞内でそれらを発現するための方法は、当分野で周知である。例えば、米国特許番号４,３６６,２４６参照。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を指示する１種以上の発現調節エレメントに隣接してまたは近位に位置するとき、操作可能に結合している。
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンスを含む組成物
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株は：１)乳酸欠損および２)組み換えＡＤＨ産生、３)変異型ＭＵ１１４０産生、４)所望により、特異的有機物質(例えば、Ｄ−アミノ酸例えばＤ−アラニン)に対する栄養素要求性、５)所望により、ＣｏｍＥ発現における欠損またはこれらの組み合わせを特徴とし得る。
本発明の組成物は、ここに記載する組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の１種以上の株および薬学的に許容されるまたは栄養学的に許容される担体を含む。担体は、投与する対象の部位と生理学的に適合性である。担体は、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤または粉末形態への製剤のために、固形の乾燥物質を含み得る。担体はまた液体、ゲルおよびチューインガム形態への製剤のために液体またはゲルベースの物質を含み得る。担体の組成物は、本発明の菌種の治療活性を顕著に妨害しない限り、変わり得る。
組成物は、種々の方法で経口投与に適するように、例えば固体、半固体、液体(例えば、粘性液体、ペースト、ゲルまたは溶液)、乾燥塊、歯磨剤、洗口液、含嗽液、液体懸濁液、飲料、局所剤、粉末化食品サプリメント、ペースト、ゲル、固体食品、含嗽液、加工食品、ウェーハ、ロゼンジ、チューインガムなどに製剤できる。他の製剤は当業者には容易に明らかである。本発明の組成物は栄養素補給成分を含んでよく、周知のとおり、ビタミン、鉱質、必須および非必須アミノ酸、炭水化物、脂質、食糧、栄養補助食品などを含む、任意の種々の栄養剤のいずれも含み得る。
本発明の組成物は、天然または合成風味剤および食用着色剤を含んでよく、これらの全ては本発明の菌種の生存能維持に適合する。
本発明の組成物は、組成物を歯または口に接着する接着剤として作用できる１種以上のゲル化剤を含み得る。ゲル化剤の濃度は組成物の重量の約２％、４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％より大きくまたは約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％より少ない。
本発明で有用で適切なゲル化剤および接着剤は、例えば、シリコン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアルキルビニルエーテル−マレイン酸コポリマー(ＰＶＭ／ＭＡコポリマー)、例えば、Gantrez AN 119、139およびS-97、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポロクサマー４０７(Pluronic)、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテートコポリマー(ＰＶＰ／ＶＡコポリマー)、例えばLuviskol VAおよびPlasdone S PVP/VA、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ、例えば、Ｋ−１５〜Ｋ−１２０)、ポリクオタニウム−１１(Gafquat 755N)、ポリクオタニウム−３９(Merquat plus 3330)、カルボマーまたはカルボキシポリメチレン(Carbopol)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、カルボキシメチルセルロース、ゼラチンおよびアルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウム、天然ゴム、例えばカラヤゴム、キサンタンゴム、グァーガム、アラビアゴム、トラガカントゴムおよびこれらの混合物を含む。
湿潤剤または可塑剤は本発明の組成物に存在し得る。湿潤剤または可塑剤は、例えば、グリセリン、グリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールおよび他の可食多価アルコールを含む。湿潤剤または可塑剤は、組成物の重量の約１％〜約９９％、約１０％〜約９５％または約５０％〜約８０％(または１％〜９９％の間の任意の範囲)で存在し得る。
本発明の細菌は、例えば、発酵槽で製造できる。細菌を発酵槽から採取してよく、例えば、濃縮してよい。本発明の細菌は、例えば、脱水、空気乾燥、凍結乾燥、凍結および噴霧乾燥の使用により製造できる。細菌をまたマイクロカプセル化(例えば、米国特許番号６,２５１,４７８)または保護的物質、例えば、例えば、脂質物質、例えばトリアシルグリセロール、蝋、有機エステル、ダイズ油、綿実油、パーム核油および長鎖脂肪酸とアルコールのエステルの使用により製造できる。本発明の一つの態様において、被覆またはカプセル化された本発明の細菌は、宿主の口腔で放出される。
齲腔の処置および予防方法
本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンスは、治療有効量で本発明の組成物に存在できる。治療有効は、齲腔の予防または数または発生率の数が少ない(例えば、本組成物を投与されなかったコントロールより５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％少ない齲腔)および／または重症度が低い(例えば、本組成物を投与されなかったコントロールより５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％重症度が低い齲腔)に有効であることを意味する。
本発明の組成物の治療有効量または投与量は、合理的な医学／歯学の判断の範囲内で、齲蝕を予防するおよび／または齲蝕数を減らすおよび／または齲蝕重症度を軽減するのに十分高いが、重篤得な副作用を避けるのに十分に低い(合理的利益／危険比で)量である。本発明の組成物の治療有効量または投与量は、処置する特定の状態、処置する患者の年齢および身体状態、状態の重症度、処置期間、現在の治療の性質、用いる源の特異的形態および組成物を適用する特定の媒体により変わり得る。
本発明の組成物を、齲腔の処置および／または予防のために、宿主の口腔に治療有効量で適用できる。本発明の組成物は嚥下してよくまたは消化管に実質的に送達されないように口腔の周りを濯いだ後吐き出してよい。すなわち、約１０％、５％、４％、３％、２％または１％、０.５％または０.１％未満(または約１０〜０.１％の間の何れかの範囲または値)の送達された細菌が消化管に送達される。処置は、齲腔の量または強度(またはこれらの組み合わせ)の減少の誘発を含む意味である。
予防は、持続的に(本発明の細菌が対象口腔で十分な数残っている限り)または一時的に(例えば、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上)、宿主が本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の１種以上に曝された後に、齲歯が実質的に起こらないことを意味する。本発明の菌種は、少なくとも口腔の一過性または常在性細菌叢を形成し、有益な予防および／または治療効果を発揮できる。
処置は、小齲蝕性病巣が再石灰化し得るように、さらに大齲蝕性病巣への進行が停止または遅延するように、宿主の口腔における野生型ストレプトコッカス・ミュータンスの菌量を低減させることを意味する。口腔の野生型ストレプトコッカス・ミュータンスの菌量は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％(または約１０〜１００％の間の何れかの範囲)低減させることができる。
本発明の一つの態様において、予防は、対象集団における予防を意味する。すなわち、対象集団において、処置は、処置を受けなかった対照集団と比較して、対象の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上において齲歯を予防できる。
本発明の一つの態様において、組成物は、１種以上の本発明の単離組み換え株を１種以上の単離ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)株および／または１種以上の単離ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)株と共に含み得る。
ストレプトコッカス・オラリス(以前はストレプトコッカス・サングイス(Streptococcus sanguis)タイプII)およびストレプトコッカス・ウベリスは、歯周細菌叢を形成する微生物の、正常で、健康なバランスを維持するのに重要な因子である。Socransky et al., Oral Microbiol. Immunol. 3:1-7 (1988); Hillman and Shivers, Arch. Oral. Biol., 33:395-401 (1988); Hillman, et al., Arch. Oral. Biol., 30:791-795 (1985)参照。ストレプトコッカス・オラリスは過酸化水素を産生し、これは歯周病原体、例えばアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(Ａａ)、バクテロイデス・フォーサイス(Bacteroides forsythus)およびプレボテラ・インテルメディア(P. intermedia)を阻害し得る。それゆえに、ストレプトコッカス・オラリスおよびストレプトコッカス・ウベリスは口腔衛生維持に有用であり得る。本発明の組成物は、ストレプトコッカス・オラリスの１種以上の単離株、例えば、ＡＴＣＣ ３５０３７、ＡＴＣＣ ５５２２９、ＡＴＣＣ ７００２３３、ＡＴＣＣ ７００２３４およびＡＴＣＣ ９８１１を含み得る。ストレプトコッカス・オラリスの他の株はＫＪ３およびＫＪ３ｓｍを含む。ＫＪ３ｓｍは、ストレプトマイシンに耐性であるＫＪ３の天然に存在する遺伝子変異体である。ストレプトマイシン耐性は、細菌の容易な単離のマーカーとなるために、有利である。さらに、ストレプトマイシン耐性株はわずかに弱毒であり、口腔で野生型株ほど長く生存できない。この特性は、動物の口腔において細菌を永続的にコロニー化させないことを最終目的とするとき有用である。
歯垢中のストレプトコッカス・ウベリスは、特に、歯周病原体、例えばポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、カンピロバクター・レクタ(Campylocbacter recta)およびエイケネラ・コローデンス(Eikenella corrodens)のコロニー形成を阻害することにより、歯周衛生と相関することが判明している。本発明の組成物は、ストレプトコッカス・ウベリスの１種以上の単離株、例えば、ＡＴＣＣ １３３８６、ＡＴＣＣ １３３８７、ＡＴＣＣ １９４３５、ＡＴＣＣ ２７９５８、ＡＴＣＣ ３５６４８、ＡＴＣＣ ７００４０７、ＡＴＣＣ ９９２７、株ＫＪ２または株ＫＪ２ｓｍを含み得る。ＫＪ２ｓｍは、ＫＪ２の天然に存在する遺伝子変異体である。これはストレプトマイシン耐性であり、ストレプトコッカス・オラリスのストレプトマイシン耐性株と同様の利点を提供する。ストレプトコッカス・オラリスの１種以上の単離株またはストレプトコッカス・ウベリスの１種以上の単離株または両者を本発明の組成物および方法に使用できる。これらの本発明の組成物によるさらなる口腔ケアの利益は、例えば、対象への歯周炎、口内細菌感染および疾患、口腔内の創傷、カンジダまたは真菌異常増殖、口臭または口内乾燥誘発、齲歯および関連歯周病の処置および／または予防、創傷治癒の促進、歯の白化またはこれらの組み合わせを含む。
本発明の一つの態様は、処置を必要とする対象の口腔に本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の１種以上を含む組成物を投与することを含む、齲歯の処置方法を提供する。ここで、対象は１個以上の齲歯を有する。
本発明の一つの態様は、健常な対象における齲歯の予防のために提供される。本発明の他の態様は、健常な対象と比較して齲歯に対する感受性が増加ている対象における齲歯の処置および／または予防方法を提供する。両態様において、本方法は、対象の口腔に組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の１種以上を含む組成物を投与するものである。
対象は、健常な宿主よりも齲歯を発症する可能性が高いとき、齲歯に対する感受性が増加している。このような宿主は、例えば、唾液生産量が減少している(例えば、頭頸部の放射線療法を受けている患者、シェーグレン症候群、糖尿病、胃食道逆流性疾患、尿崩症またはサルコイドーシスを有する患者、抗ヒスタミン剤および抗鬱剤または“ドライマウス”を起こす他の薬物を摂取している患者)、喫煙者、無煙タバコ使用者、遺伝的素因を有する患者(Shuler, J. Dent. Ed. 65:1038 (2001))または乳児(０〜２歳または６ヶ月〜２歳)、小児(３〜１８歳)または高齢者(６５歳以上)である。
本発明はまた、対象における齲歯の原因となり得る細菌の量を減少させる方法を提供する。本方法は、本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の１種以上を含む組成物を、齲歯の原因となり得る細菌を１株以上または１種以上有する対象の口腔に投与することを含む。本組成物は、１回のみの投与でも、定常に投与しもよい。対象における齲歯の原因となり得る１株以上または１種以上の細菌の数を減らす。減少は総菌数の約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または１００％(または約５％〜約１００％の間の何れかの範囲)の減少であり得る。
所望により、本発明の組成物の投与前に、齲歯の原因となり得る１種以上の細菌を、当分野で知られる何れかの検出／定量法を使用して検出および／または定量してよい。齲歯を起こす細菌の検出方法は当業者に知られている。所望により、本発明の組成物の投与前に、１個以上の齲歯を、当分野で知られる何れかの方法を使用して対象において診断し得る。
本発明の他の態様は、対象における齲歯の予防方法を提供する。本方法は、特定のタイプの対象の齲歯の予防のための治療有効投与量範囲に関するデータを得て、特定のタイプの対象のための組み換えストレプトコッカス・ミュータンスの有効投与量範囲を決定することを含む。特定のタイプの対象は、例えば、唾液生産量が減少した対象(例えば、頭頸部に放射線療法を受けている患者、シェーグレン症候群、糖尿病、胃食道逆流性疾患、尿崩症またはサルコイドーシスを有する患者、抗ヒスタミン剤および抗鬱剤または“ドライマウス”を起こす他の薬物を使用している患者)、喫煙者、無煙タバコ使用者、遺伝的素因を有する患者または乳児(０〜２歳または６ヶ月〜２歳)、小児(３〜１８歳)または高齢者(６５歳以上)であり得る。１種以上の本発明の組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株の、特定のタイプの対象のために決定した治療有効投与量範囲を、特定のタイプの対象の口腔に投与し得る。
組成物を、宿主または対象、例えば哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギまたはウサギを含む動物の口腔に投与できる。
本発明の組成物を、例えば、食品、水、歯磨剤、ゲル剤、ペースト剤、エマルジョン剤、エアロゾルスプレー剤、チューインガム、ロゼンジ剤、錠剤、カプセル剤または液体懸濁液で経口投与する。細菌は、食品、水、ゲルまたは他の担体に既に製剤されていても、消費前に使用者により担体(例えば、食品、水、歯磨剤、ゲル剤、ペースト剤、エマルジョン剤、エアロゾルスプレー剤または液体懸濁液)に添加する組成物(例えば、粉末、錠剤またはカプセル剤)であってもよい。
本発明の一つの態様は、対象の口腔に本発明の組成物を投与することを含む、対象の口腔に治療的に有効な細菌で非永続性にコロニー形成させる方法を提供する。本発明の一つの態様において、投与する菌種は口腔に永続性にコロニー形成せず、むしろ本株は細菌投与後口腔内に約１日、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、約３ヶ月または約１２ヶ月存在する。
本発明の他の態様において、ストレプトコッカス・ミュータンスの組み換え株は、長期間、例えば、２週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、５年または以上または宿主が生きている限り宿主の口腔に永続性にコロニー形成する。
本発明の組成物は、生存可能細菌の約１×１０３、１×１０５、１×１０７、１×１０８ 、１×１０９または１×１０１１ＣＦＵ(または約１×１０３〜約１×１０１１の間の何れかの範囲または値)の投与量で投与できる。本発明の組成物の投与量を１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、週に２回、毎週、２週毎、毎月または毎年投与する。本発明の組成物の１日あたり、１、２またはそれ以上の投与量を、約１日、約１週間、約２週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約１年またはそれ以上投与できる。本発明の一つの態様において、本発明の組成物を、１回投与し、長期間有効である。
本発明の組成物は、細菌株を、組成物重量の約０.０１％〜約５０％または約０.１％〜約２５％または約１.０％〜約１０％または０.０１％〜５０％の間の何れかの範囲または値の濃度で含み得る。
本発明のキットは、本発明の組成物の単投与量、１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月分を含み得る。本発明の組成物を包装し、さらに、複数の包装した組成物を貯蔵容器または外装または段ボール箱に入れてよい。１種以上のストレプトコッカス・ミュータンスの株が栄養要求性であるとき、キットは細菌栄養要求体維持量の有機物質、例えば、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニンを含む組成物を含み得る。
本発明の組成物が、有機物質に栄養要求性である１種以上のストレプトコッカス・ミュータンスの株を含むとき、細菌栄養要求体維持量の有機物質を、口腔で組み換えストレプトコッカス・ミュータンスを維持するために宿主に投与してよい。“細菌栄養要求体維持量”は、口腔での組み換えストレプトコッカス・ミュータンス栄養要求体の生存能の維持に十分な有機物質の量である。例えば、組み換えストレプトコッカス・ミュータンスがＤ−アラニンに栄養要求性であるとき、Ｄ−アラニン細菌栄養要求体維持量は、宿主の口腔でＤ−アラニン栄養要求性株が生存するのに十分なＤ−アラニンの量である。一般に、Ｄ−アラニンのＤ−アラニン細菌栄養要求体維持量の単投与量は、約１mg、５mg、１０mg、２０mg、２５mg、５０mg、７５mgまたは１００mg(または約１〜約１００mgの間の何れかの範囲)を含む。溶液の形態の組成物中のＤ−アラニンの濃度は、約０.０１mg／ml、１mg／ml、１０mg／ml、２５mg／ml、５０mg／ml、７５mg／ml、１００mg／mlまたは１６７mg／mlである(後者は、２５℃の水中でのＤ−アラニンの飽和溶液である)(または約０.０１〜約１６７mg／mlの間の何れかの範囲)。組成物中のＤ−アラニンの濃度は使用する担体およびその特異的担体におけるＤ−アラニンの飽和点により異なり得る。
口腔で栄養要求性、組み換えストレプトコッカス・ミュータンスの維持に必要な有機物質、例えば、Ｄ−アラニンは、洗口液、チューインガム、デンタルフロス、練り歯磨き、咀嚼錠、食品、飲料または宿主の口腔への経口投与に適切な任意の他の製剤として製剤できる。有機物質(例えば、Ｄ−アラニン)に加えて、本組成物は、さらに組成物に包含される有機物質の有効性を損なうことなく、風味剤、着色剤、芳香剤または組成物の嗜好性を高めるおよび／または患者のコンプライアンスを高める他の化合物を含み得る。
本明細書のいずれかの場所で引用する全ての特許、特許出願および他の科学的または技術的論文は、その全体を引用により本明細書に包含させる。ここで説明的に記載した本発明は、適宜上、ここに特に開示していない何らかの１種以上の要素、１種以上の制限の非存在下で実施できる。それゆえに、例えば、用語“含む”、“本質的にから成る”および“から成る”の用語のいずれ場合も、その通常の意味を残しながら、他の２個の用語と置き換えることが可能である。用いている用語および表現は、限定ではなく、説明用の用語として使用し、このような用語および表現の使用が、示したまたは記載した特性の何らかの等価物またはその一部を除外することを意図せず、請求する本発明の範囲内で種々の修飾が可能であることを認識すべきである。それゆえに、本発明は種々の態様、任意的特性により具体的に開示しているが、ここで開示した概念の修飾および変更が当業者により再分類されてよく、このような修飾および変更は明細書および添付する特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
さらに、本発明の特性または観点がマーカッシュグループまたは他の選択肢の群により記載されているとき、当業者は、本発明が、またマーカッシュグループまたは他の群の各メンバーまたはメンバーのサブグループによっても記載されることを認識する。
以下の記載は、例示の目的でのみ提供し、上記の広い観点で記載した本発明の範囲を制限することを意図しない。
実施例１：ＭＵ１１４０の突然変異誘発
ストレプトコッカス・ミュータンスゲノムデータベースおよびｌａｎ遺伝子クラスター、GenBank/EMBL accession number(AF051560)を、突然変異誘発および配列決定作業用のプライマーの設計に使用した。野生型ＭＵ１１４０構造遺伝子(ｌａｎＡ)の読み取り枠(ＯＲＦ)に加えて５’および３’フランキングＤＮＡ５００塩基対(ｂｐ)をｐＶＡ８９１プラスミドにクローン化してｐ１９０を作製した。ｐ１９０のクローン化インサートは、ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２のプライマー配列を使用したストレプトコッカス・ミュータンス株ＪＨ１１４０(ＡＴＣＣ ５５６７６)の染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅に由来した(図３参照)。試薬および培地はFisher Scientificから購入し、酵素はNew England BioLabs(Ipswich, MA)から購入した。
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)
変異(図１Ｂ参照)を、ＭＵ１１４０の構造遺伝子であるｌａｎＡのプロペプチド領域に導入し、ＭＵ１１４０の変異型を製造した。図２参照。ｐ１９０プラスミド(J.D. Hillman、未発表)を鋳型として使用し、部位特異的変異を２段階ＰＣＲを使用して導入した。第一段階で、上流および下流外部プライマー(ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２)を適当な内部プライマー(例えば、ＳＲＷｌａｎＡ＿１／Ｔｒｐ４Ａｌａ＿２およびＳＲＷｌａｎＡ＿２／Ｔｒｐ４Ａｌａ＿１)(図３)と対形成させ、その一方は、野生型配列に対して改変した塩基配列を含むように合成した。この段階により、２個のフラグメントが産生され、５’フランキングＤＮＡおよびｌａｎＡの一部を含む一つは、部位特異的塩基変化を含んだ。第二のフラグメントはｌａｎＡの残りと３’フランキングＤＮＡを含んだ。ＭＵ１１４０変異型の製造に使用したプライマーは図３に見られる。２個のフラグメントを次いで等量で混合し、２個の外部プライマー、ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を使用する第二ラウンドのＰＣＲに付して、最終アンプリコンを得た。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼを０.４μmolの各プライマー、５０ngの鋳型ＤＮＡ、０.０１６mM ｄＮＴＰおよび１単位のＤＮＡポリメラーゼを１Ｘポリメラーゼ緩衝液に含む、５０μLの最終体積中で使用して行った。各フラグメントの増幅条件は次のとおりであった：９５℃で１分余熱、続いて２７サイクルインキュベーションと変性(９５℃)を３０秒、アニーリング(５６℃)を３０秒および伸張(７２℃)を２分、続いて最終伸張(７２℃)を１０分。両フラグメントを５０：５０で合わせ、２個の外部プライマーＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を、上記と同じ増幅条件下で使用して増幅した。
最終ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にキットの指示に従いライゲートし、標準的方法を使用してＤＨ５α−Ｔ１(登録商標)細胞(Invitrogen)に形質転換し、５０μg／mLのアンピシリンおよび４０μLのＸ−ｇａｌ(４０mg／mL)を含むＬＢプレートに広げた。ブルー・ホワイトスクリーニングをインサートを含むコロニーの同定に使用した。各コロニーからのプラスミドＤＮＡをPureYield Plasmid Miniprep System(Promega, Madison, WI)を製造社の指示に従い使用して精製した。精製プラスミドを、ＥｃｏＲＩを使用して制限消化し、アガロースゲル電気泳動により試験して、適正なサイズのクローン化インサート(〜１１００bp)を有するものを同定した。適正なサイズのインサートを含むプラスミドを、M13 Forward(-20)プライマー、５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’(配列番号２８)を使用して配列決定して、ヌクレオチド塩基の適切な挿入、欠失または置換を確認した。
組み換え
制限酵素消化を、確認された変異を担持するコロニーからの精製プラスミドで行った。インサートをＴＯＰＯプラスミドから電気泳動により分離し、ゲルから切り取り、Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA)を使用して精製した。次いで、精製インサートをストレプトコッカス・ミュータンス自殺ベクターであるｐＶＡ８９１に、３：１インサート：ベクター比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを１６℃で一夜使用してライゲートした。次いで、得られたプラスミドを標準法を使用してＤＨ５α細胞に形質転換し、３００μg／mLのエリスロマイシンを含むＬＢプレートに広げた。インキュベーション後に生じるコロニーを分析して、上記のとおり適切なインサートサイズおよび配列を決定した。
確認したインサートを含む精製ｐＶＡ８９１ ＤＮＡを、ストレプトコッカス・ミュータンス株ＪＨ１１４０(ＡＴＣＣ ５５６７６)に次のとおり形質転換した：ストレプトコッカス・ミュータンスを一夜増殖させ、新鮮ＴＨｙｅｘブロス(３０ｇ／Ｌ ＴＨＢ、３ｇ／Ｌ 酵母抽出物)で１：１５希釈し、２００μLの希釈細胞を９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。２μLのコンピテンス刺激ペプチド(ＣＳＰ、０.１μg／mL；例えば、Li et al., J. Bacteriol. 183:897 (2001)参照)を添加し、プレートをさらに６時間インキュベートした。Li et al., (2002) J. Bacteriol. 184:2699参照。次いで５０μLの細胞を予め温めた３００μg／mLのエリスロマイシンを含むＴＨｙｅｘ寒天プレート(３０ｇ／Ｌ ＴＨＢ、３ｇ／Ｌ 酵母抽出物および１５ｇ／Ｌの栄養寒天)に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、標準クロロホルム／フェノール抽出方法を使用して生じたクローンから抽出し、ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し、ＰＣＲは、Hillman et al., (2000) Infect. Immun. 68:543-549により先に記載されたとおり、ベクターＤＮＡにより分けられたｌａｎＡ遺伝子の１個の野生型および１個の変異コピーを有すると過程されるヘテロ二倍体クローンを同定するためにＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を使用した。
変異体構築物の遺伝的同一性確認
望むｌａｎＡ変異を含むクローンを、次のとおりヘテロディプロイド状態の自然的分割により得た：数個の確認したヘテロディプロイドを、一夜、エリスロマイシンを含まない２０mL ＴＨｙｅｘブロスで増殖させた。培養物を継代培養し(新鮮媒体に１：２０希釈)、再び飽和するまで一夜増殖させた。次いで培養物を１００,０００倍希釈し、大ＴＨｙｅｘ寒天プレートに広げ、３７℃で４８時間インキュベートした。得られたコロニーは、エリスロマイシン含有または非含有培地上にレプリカパッチし、ｐＶＡ８９１プラスミド(エリスロマイシン耐性遺伝子発現)の除去および野生型または変異ｌａｎＡ遺伝子が起きている自然的組み換えを同定した。レプリカプレーティング技術により同定したエリスロマイシン感受性コロニーを、エリスロマイシン含有および非含有培地で再試験した。エリスロマイシン感受性クローンのｌａｎＡ領域を上記のとおりＰＣＲで増幅した。産生したアンプリコンを配列決定して、修飾ｌａｎＡ遺伝子のみを有するクローンを同定した。ＢＬＡＳＴ配列分析を使用して、ｌａｎＡの野生型配列と疑わしい変異体のｌａｎＡを比較した(図２)。産生した変異体は：Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ、ΔＴｒｐ４、Ｄｈａ５Ａｌａ、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐであった。
実施例２：変異体の生物活性
親ストレプトコッカス・ミュータンス株、ＪＨ１１４０(ＡＴＣＣ ５５６７６)および変異体を、０.８のＯＤ６００まで増殖させ、０.２のＯＤ６００まで希釈した。培養物のサンプル(２μL)を、予め温めたＴＨｙｅｘ寒天プレート(１５０×１５mm)に３箇所スポットし、空気乾燥した。このアッセイを、各サンプルが阻害帯の比較のために同じコロニーサイズを有することを確認する補助として行った。プレートを２４時間、３７℃でインキュベートし、５５℃のオーブンに３０分入れて細菌を殺し、ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ２７２インディケーター株を融解したトップ寒天に重層した。細菌を熱殺菌することにより、更なる抗微生物化合物産生を阻止した。ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ ２７２を０.４〜０.８のＯＤ６００ｎｍまで増殖し、０.２のＯＤ６００ｎｍに希釈した。次いで、４００μlのこれらの細胞を１０mlの融解したトップ寒天に添加した(４２℃)(３０ｇ／Ｌ トッドヘヴィットブロスおよび７.５ｇ／Ｌ 栄養寒天)。標準化懸濁液を含む全１０mLのトップ寒天を、約５０mLのＴＨｙｅｘ寒天を含むプレートに添加した。プレートを固化させ、倒置し、一夜、３７℃でインキュベートした。各阻止円半径を、コロニーの端から円の最も遠い部分まで測定した(mm)。阻止域の面積を各円で計算し、野生型(ｎ＝１０)の平均域面積と比較した。
図４は、野生型ＭＵ１１４０と比較したＭＵ１１４０の変異型を産生する株の生物活性を説明する。結果を図５に要約し、これは、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａおよびΔＴｒｐ４を産生する株が、野生型と有意差がない阻止域を形成することを示した(ステューデントのｔ検定、ｐ＞.０５)。Ａｒｇ１３Ａｓｐを産生する株は、野生型より２.５７倍の量の最大阻止域面積を有した(ｐ＜.００１)。Ｔｒｐ４ＡｌａおよびＤｈａ５Ａｌａを産生する株は、野生型と比較して、それぞれ有意な(ｐ＜.００１)２.１２倍および１.８７倍増加をもたらした。Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａを産生する株は最小阻止域面積を有し、これは、野生型と比較して、阻止域面積の有意な(ｐ＜.００１)２倍減少を示した。図６は、野生型ＭＵ１１４０と比較した他のＭＵ１１４０の変異型(Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ)を産生する株の生物学的活性を示す。Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙを産生する株は、それぞれ野生型と比較して、有意な(ｐ＜.００１)１.８２倍および１.５７倍増加をもたらした。
ナイシンおよびある他のランチビオティクスの構造遺伝子を使用した部位特異的突然変異誘発の多くの試験があり(Chatterjee et al. (2005) Chem. Rev. 105:633によりレビュー)、これらの分子の活性における特定のアミノ酸の重要性を分析した。これらの変異が生物活性を増加させることは稀であった。
最も興味深い結果は、Ａｒｇ１３Ａｓｐ変異体で得られた。この変異は、野生型と比較して、生物活性の予期しない、高度に有意な増加をもたらした。これは、ヒンジ領域での正電荷を有する残基の、負電荷を有する残基の置換を有した。この知見は、正電荷が抗生物質と標的細胞膜に存在する負電荷を有する脂質の間の相互作用を助けるため、ランチビオティクスの負電荷が生物活性を減少させるはずであるという従来の考えに反した。この変異はまた化合物からトリプシン開裂可能部位を除去し、それにより酵素加水分解に対しより安定とした。さらに、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐは、自然には起こりそうにないトランスバージョン変異である。
ここに記載するＭＵ１１４０への変異は、それゆえに先行技術および野生型ＭＵ１１４０と比較して、非常に改良された生物学的および構造特徴を有する変異型ＭＵ１１４０分子をもたらすとの結果から、予測も予期も不可能であった。活性を増加する変異は、ストレプトコッカス・ミュータンスエフェクター株のコロニー形成能改善の観点から重要である。ストレプトコッカス・ミュータンス株が齧歯類およびヒト口腔でコロニー形成する能力は、産生されるＭＵ１１４０の量および／または活性に相関することが先に示されていた。さらに、ストレプトコッカス・ミュータンス株が齧歯類およびヒト口腔で常在性ストレプトコッカス・ミュータンスの株を積極的に追放する能力は、産生されるＭＵ１１４０の量および／または活性に相関することが先に示されていた。例えば、Hillman et al., Infect. Immun. 44:141 (1984); Hillman et al., J. Dent. Res. 66:1092 (1987)参照。それゆえに、ここに記載する変異型ＭＵ１１４０を発現する本発明のストレプトコッカス・ミュータンスエフェクター株は、本発明の変異型ＭＵ１１４０を発現しないストレプトコッカス・ミュータンス株と非悪して、予期されない、改善された特徴を有する。すなわち、変異型ＭＵ１１４０を発現するストレプトコッカス・ミュータンスエフェクター株は、ここに記載する変異型ＭＵ１１４０を発現しないストレプトコッカス・ミュータンスエフェクター株と比較して、宿主の口腔でコロニー形成し、野生型ストレプトコッカス・ミュータンスを積極的に打ち負かし、置換する改善された能力を有する。
実施例３：最小阻止濃度
野生型ミュータシン１１４０、Ｆ１Ｉ変異を有するミュータシン１１４０、Ｗ４Ａ変異を有するミュータシン１１４０およびＲ１３Ｄ変異を有するミュータシン１１４０を、約９０％純度まで精製した(ＨＰＬＣで測定)。ＭＵ１１４０およびＭＵ１１４０の変異型の最小阻止濃度(ＭＩＣ)を数種の細菌に対して決定した。ＭＩＣは、２４時間インキュベーション後に、微生物の可視増殖を阻害するＭＵ１１４０の最低濃度である。ＭＩＣが低いほど、阻害活性が大きいことを示す。最小阻止濃度(ＭＩＣ)のための抗微生物剤および細菌接種材料の調製を、Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) M07-8Aに記載の方法に従い、わずかにいくつか改変して行った。ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９を、細菌を均一に分散させるために振盪させたインキュベーター一夜試験した。クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)ＵＫ１を嫌気性チャンバーで３７℃で試験した。使用した培地はＨｙｅｘであった。結果を表１に示す。
ＭＩＣは、各変異体で各生物で必ずしも下がらないが、各変異体は、例えば、他の有利な特性の中で、製造が容易であり、輸送が容易であり、良好な貯蔵安定性を有し、良好な血清安定性を有しまたは良好なタンパク分解性安定性を有し得るため、野生型ＭＵ１１４０を超える利点をなお有し得る。

Claims (10)

  1. (ａ)乳酸の発現が、野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するような、乳酸合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異；
    (ｂ)組み換えアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド；
    (ｃ)式Ｉ
    〔ここで、次の変異が存在する：Ｐｈｅ１Ｉｌｅ変異またはＰｈｅ１Ｇｌｙ変異；Ｔｒｐ４Ａｌａ変異；Ｄｈａ５Ａｌａ変異；Ａｒｇ１３Ａｓｐ変異；またはこれらの変異の２個以上の組み合わせ。〕
    を含むランチビオティクスをコードする組み換えポリヌクレオチド
    を含む単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  2. 式Ｉを含むミュータシンがさらにＴｒｐ４ｉｎｓＡｌａ変異またはΔＴｒｐ４変異を含む、請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  3. 式Ｉを含むランチビオティクスに、Ａｂｕ８ＡｌａまたはＤｈｂ１４Ａｌａ、またはＡｂｕ８ＡｌａおよびＤｈｂ１４Ａｌａの両者のアミノ酸置換が存在する、請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  4. ＣｏｍＥ、ＣｏｍＣ、またはＣｏｍＥおよびＣｏｍＣの両者の発現が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するようなＣｏｍＥ、ＣｏｍＣ、またはＣｏｍＥおよびＣｏｍＣ両者の合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  5. Ｄ−アミノ酸の発現が野生型ストレプトコッカス・ミュータンス株と比較して約８０％またはそれ以上減少するようなＤ−アミノ酸合成に関与するポリヌクレオチドにおける変異をさらに含む、請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  6. ポリヌクレオチドがｄａｌまたはｄａｌのプロモーターである、請求項５に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  7. 組み換えアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドがザイモモナス・モビリスアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドまたはストレプトコッカス・ミュータンスアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
  8. 請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株を、宿主の口腔にいる齲歯誘発ストレプトコッカス・ミュータンス宿主株の置換に有効な量で宿主に経口投与することを含む、齲歯感受性宿主における齲歯の発生率または重症度を軽減する方法。
  9. 単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株が洗口液、練り歯磨き、チューインガム、フロス、咀嚼錠、食品または飲料に含まれる、請求項８に記載の方法。
  10. 請求項１に記載の単離された組み換えストレプトコッカス・ミュータンス株および薬学的に許容される担体を含む、齲歯の発生率または重症度を軽減するための医薬組成物。
JP2014558872A 2012-02-27 2013-02-22 齲歯のための置換療法 Expired - Fee Related JP6297506B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261603661P 2012-02-27 2012-02-27
US201261603693P 2012-02-27 2012-02-27
US61/603,661 2012-02-27
US61/603,693 2012-02-27
PCT/US2013/027340 WO2013130351A1 (en) 2012-02-27 2013-02-22 Replacement therapy for dental caries

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015509715A true JP2015509715A (ja) 2015-04-02
JP2015509715A5 JP2015509715A5 (ja) 2016-04-07
JP6297506B2 JP6297506B2 (ja) 2018-03-20

Family

ID=49083172

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014558872A Expired - Fee Related JP6297506B2 (ja) 2012-02-27 2013-02-22 齲歯のための置換療法
JP2014558870A Active JP6309902B2 (ja) 2012-02-27 2013-02-22 ランチビオティクスｍｕ１１４０および改善された薬理学的特性および構造的特徴を有する他のランチビオティクスの変異体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014558870A Active JP6309902B2 (ja) 2012-02-27 2013-02-22 ランチビオティクスｍｕ１１４０および改善された薬理学的特性および構造的特徴を有する他のランチビオティクスの変異体

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9963488B2 (ja)
EP (3) EP2833902A4 (ja)
JP (2) JP6297506B2 (ja)
CN (2) CN104321338B (ja)
AU (2) AU2013226402B2 (ja)
BR (2) BR112014020659A2 (ja)
CA (2) CA2865405C (ja)
HK (2) HK1205458A1 (ja)
MX (2) MX358060B (ja)
WO (2) WO2013130349A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019529344A (ja) * 2016-07-15 2019-10-17 イントレキソン コーポレーション ランチビオティックバリアントおよびその使用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10577399B2 (en) 2016-10-28 2020-03-03 The Texas A&M University System Modified lantibiotics and methods of making and using the modified lantibiotics
JPWO2020090045A1 (ja) * 2018-10-31 2021-10-14 株式会社村田製作所 抗グラム陰性菌化合物
CA3128389A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Fraunhofer Usa, Inc. Novel antimicrobial lantibiotic peptide and uses thereof
CN118490568B (zh) * 2024-07-16 2024-10-18 南昌怀特科技有限公司 一种用于牙齿美白的抑菌凝胶及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11500604A (ja) * 1994-11-19 1999-01-19 インスティテュート オブ フード リサーチ 変性ニシンの製造
JP2002504825A (ja) * 1997-06-10 2002-02-12 ユニバーシティ オブ フロリダ 新規な抗菌性ポリペプチド及び使用方法
WO2009135945A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 University College Cork-National University Of Ireland, Cork Nisin derivatives and the use thereof
WO2010117652A1 (en) * 2009-03-28 2010-10-14 Oragenics, Inc. Differentially protected orthogonal lanthionine technology

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US5516682A (en) 1988-07-05 1996-05-14 University Of Maryland Subtilin variant of enhanced stability and activity
US20060198793A1 (en) 1997-06-10 2006-09-07 University Of Florida Research Foundation Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use
US6964760B2 (en) * 1997-06-10 2005-11-15 University Of Florida Research Foundation Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use
US6251478B1 (en) 1999-12-22 2001-06-26 Balchem Corporation Sensitive substance encapsulation
US7226590B2 (en) * 2002-02-22 2007-06-05 Blis Technologies Limited Antimicrobial composition
AU2006279749B2 (en) 2005-08-12 2012-12-20 Oragenics, Inc. Differentially protected orthogonal lanthionine technology
US7576054B2 (en) 2005-10-11 2009-08-18 Biosynexus Incorporated Compositions and methods for treating bacteria
US20110150917A1 (en) * 2007-06-12 2011-06-23 The University Of British Columbia Small Cationic Antimicrobial Peptides
JP2010534063A (ja) 2007-07-20 2010-11-04 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ランチビオティックス及びこれらの使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11500604A (ja) * 1994-11-19 1999-01-19 インスティテュート オブ フード リサーチ 変性ニシンの製造
JP2002504825A (ja) * 1997-06-10 2002-02-12 ユニバーシティ オブ フロリダ 新規な抗菌性ポリペプチド及び使用方法
JP2009028050A (ja) * 1997-06-10 2009-02-12 Univ Of Florida 新規な抗菌性ポリペプチド及び使用方法
WO2009135945A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 University College Cork-National University Of Ireland, Cork Nisin derivatives and the use thereof
WO2010117652A1 (en) * 2009-03-28 2010-10-14 Oragenics, Inc. Differentially protected orthogonal lanthionine technology

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INFECTION AND IMMUNITY, vol. 68, no. 2, JPN6016048466, 2000, pages 543 - 549 *
INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL PEDIATRIC DENTISTRY, vol. 3, no. 3, JPN6016048464, 2010, pages 125 - 137 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019529344A (ja) * 2016-07-15 2019-10-17 イントレキソン コーポレーション ランチビオティックバリアントおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2820036A1 (en) 2015-01-07
CA2865405A1 (en) 2013-09-06
AU2013226402B2 (en) 2017-05-18
EP2833902A4 (en) 2016-04-06
AU2013226402A1 (en) 2014-08-21
WO2013130349A1 (en) 2013-09-06
CN104302307A (zh) 2015-01-21
EP2833902A1 (en) 2015-02-11
MX358060B (es) 2018-08-03
CN104321338A (zh) 2015-01-28
EP2820036B1 (en) 2018-06-06
MX369443B (es) 2019-11-08
JP6297506B2 (ja) 2018-03-20
JP6309902B2 (ja) 2018-04-11
CA2865395A1 (en) 2013-09-06
MX2014010151A (es) 2015-01-14
WO2013130351A1 (en) 2013-09-06
MX2014010143A (es) 2015-04-08
US9260488B2 (en) 2016-02-16
US20150125503A1 (en) 2015-05-07
BR112014020656A2 (pt) 2017-06-27
HK1205458A1 (en) 2015-12-18
CA2865405C (en) 2021-11-16
CN104321338B (zh) 2018-10-19
JP2015509945A (ja) 2015-04-02
WO2013130349A8 (en) 2014-01-09
EP3219325B1 (en) 2019-11-06
CN104302307B (zh) 2018-10-26
AU2013226404A1 (en) 2014-08-21
US9963488B2 (en) 2018-05-08
BR112014020659A2 (pt) 2017-06-27
US20150044146A1 (en) 2015-02-12
EP2820036A4 (en) 2016-01-20
HK1205519A1 (en) 2015-12-18
EP3219325A1 (en) 2017-09-20
AU2013226404B2 (en) 2017-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Krzyściak et al. The virulence of Streptococcus mutans and the ability to form biofilms
JP6297506B2 (ja) 齲歯のための置換療法
JP5969764B2 (ja) 乳酸菌の配合物並びに感染症および炎症の予防および／または処置のためのその使用
US8444998B2 (en) Probiotic strain and antimicrobial peptide derived therefrom
Todorov et al. Bacteriocin production and resistance to drugs are advantageous features for Lactobacillus acidophilus La-14, a potential probiotic strain
JP2010513350A (ja) ミュータンス・ストレプトコッキィによって引き起こされる齲蝕を予防および／または治療するための使用および方法
JPWO2013021957A1 (ja) 口腔内疾患の予防又は治療剤
US7087228B2 (en) Preventing tooth decay and infective endocarditis using natural oligopeptides
EP0610322A1 (fr) Genes d'helicobacter pylori necessaires pour la regulation et la maturation de l'urease et leur utilisation
Ikeda et al. Purification and certain properties of a bacteriocin from Streptococcus mutans
ES2205038T3 (es) Terapia de reemplazo para la caries dental.
WO2022016266A1 (en) Probiotic for oral health
EP0560968A1 (en) VACCINE FOR -i(NEISSERIA MENINGITIDIS) INFECTIONS.
WO1990011349A1 (fr) Vaccins contre les bacteries septicemiques
Hacker et al. Influence of cloned Escherichia coli hemolysin genes, S-fimbriae and serum resistance on pathogenicity in different animal models
US9127045B2 (en) Method of inhibiting bacterial growth and biofilm formation with natural quorum sensing peptides
JP5209166B2 (ja) ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）リコンビナントタンパク質と末端切断物
WO2012001347A1 (en) Products with oral health benefits
CA2165393C (fr) Vaccin de type acellulaire anti-bordetella
KR102584256B1 (ko) 수퍼옥시드 디스뮤타제 및/또는 바실러스 균주 포자를 포함하는 조성물 및 이의 구강 건강 개선용 용도
JP4847341B2 (ja) 抗菌性組成物
WO2000066616A1 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING DENTAL CARIES, AND RECOMBINANT SmaA POLYPEPTIDES USEFUL FOR SAME
WO2015109390A1 (en) Compositions and methods for reducing caries-causing oral bacteria
Modi Various Approaches for Prevention of Dental Caries with Emphasis on Probiotics A Review.
Sonawane et al. Probiotics: The Nano Soldiers for Periodontium

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160215

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160215

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170317

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20170704

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171026

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20171107

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180130

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180221

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6297506

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees