JP4847341B2

JP4847341B2 - 抗菌性組成物

Info

Publication number: JP4847341B2
Application number: JP2006544171A
Authority: JP
Inventors: エリック・チャールズ・レイノルズ; スチュアート・ジョフリー・ダシュパー; リタ・アン・パオリーニ
Original assignee: ザ・ユニヴァーシティ・オブ・メルボーン
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2024-12-15
Also published as: CA2550581A1; WO2005058344A1; JP2007519622A; CA2550581C; ZA200605660B; EP1708735A4; NZ548218A; MXPA06007043A; AU2004298285B2; US8106152B2; AU2004298285A1; EP1708735A1; AU2010224414A1; AU2010224414B2; KR20070026372A; US20090246150A1

Description

本発明は、乳タンパク質カゼインから取得、化学的に合成、または組み換えＤＮＡ技術により産生させることができるペプチドと、二価陽イオンとを含む、新規な抗菌性組成物に関する。これらの組成物は、抗菌防腐剤として食品中に使用することができ、歯垢の抑制、ならびに、齲蝕および歯周病に関連する病原体の抑制のための口腔ケア製品（例えば、練り歯磨き、うがい薬、デンタルフロスなど）中に使用することができる。

非グリコシル化、リン酸化形態のウシのカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）である、カッパーシン（Kappacin）は、グラム陽性口腔細菌に対してもグラム陰性口腔細菌に対しても、ｉｎｖｉｔｒｏで抗菌活性を有する（Malkoski等：非特許文献１）。ＣＭＰは、牛のκ−カゼインから、Phe¹⁰⁵とMet¹⁰⁶との間のペプチド結合をキモシンで加水分解することにより遊離された、アミノ酸６４個のポリペプチドである。ＣＭＰは、κ−カゼインのＣ末端フラグメント（１０６−１６９）を含み、κ−カゼイン中に存在する翻訳後修飾部位を全て含んでいる。ＣＭＰは、多様にリン酸化およびグリコシル化されている（Pisano等（１９８４年）、SaitoおよびItoh（１９９２年）、Talbo等：非特許文献２）。ＣＭＰは、ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ質量分析法により決定されたように、Ser¹⁴⁹が完全にリン酸化されていて、Ser¹²⁷が部分的にリン酸化（１０％）されている（非特許文献２）。

さらに、κ−カゼインの変異体は、少なくとも６種あり、変異体Ａと変異体Ｂが最もよく知られている（CreamerおよびHarris：非特許文献３）。変異体Ａと変異体Ｂは、残基１３６および残基１４８で異なっていて、変異体Ａの親水性の残基Thr¹³⁶およびAsp¹⁴⁸が、変異体Ｂでは疎水性の残基Ile¹³⁶およびAla¹⁴⁸に置き換わっている。カッパーシンの抗菌活性部位は、合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)を使って決定された、残基１３８−１５８であることが示された。この合成ペプチドκ−カゼイン−Ａ(138-158)を使って、Ser¹⁴⁹のリン酸化が抗菌活性に不可欠であることが示された（非特許文献１）。ＣＭＰ変異体ＡのStreptococcus mutansに対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）は０．６８ｍｇ／ｍｌ（１００μＭ）であるのに対し、変異体Ｂはより活性が低くそのＭＩＣは１．０４ｍｇ／ｍｌ（１５４μＭ）であった（非特許文献１）。

カッパーシンが細菌の増殖を阻害するメカニズムはまだ明らかではない。カッパーシンは、わずかに酸性の発育ｐＨでS. mutansに対して最も有効であることが見いだされた。非グリコシル化κ−カゼイン−Ｂ(130-158)は、特にトリフルオロエタノール中で、両親媒性α−へリックスを形成することが提唱されている（Plowman：非特許文献４）。この特性は、カッパーシンが表面活性剤として働き、細胞膜中に細孔を形成すると仮定するとその抗菌活性を説明するのに役立つ。この作用機序は、これまでに単離された陽イオン性の抗菌性ペプチドの大部分について提唱されている。しかし、カッパーシンは陰イオン性ペプチドであり、より良く知られている陽イオン性の抗菌性ペプチドとシークエンス類似性を示さない。また、両親媒性のらせん構造を形成する傾向を有すると考えられることを除き、これらの陽イオン性ペプチドのその他の特徴をいずれも有していない。カッパーシンは、近年発見された陰イオン性の抗菌性ペプチド、特にenkelytinとは、いくつかの特徴を共有する。このペプチドは、カッパーシンと同様に、多数のグルタミル残基を含み、リン酸化が抗菌活性に不可欠である（Goumon：非特許文献５、Goumon（１９９８年）、Strub：非特許文献６）。静電的反発力を通して、または二価金属イオンの結合により、リン酸化がenkelytinのコンホーメーションを変化させることが提唱されている（Goumon（１９９８年）、Kieffer（１９９８年））が、リン酸化された形態のenkelytinの構造はまだ決定されていない。
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 2309-2315(2001). Peptides 22, 1093-1098 (2001). International Dairy Federation Special Issue 9702, pp. 110-123 (1997). Journal of Dairy Research 64, 377-397 (1997). European Journal of Biochemistry 235, 516-525 (1996). Journal of Biological Chemistry 271, 28533-28540 (1996).

カッパーシンを含む、負に帯電した抗菌性ペプチドが、どのようにして細菌細胞表面に作用するかはまだ明らかとなっていない。

本発明者等は、ｐＨおよび二価金属陽イオンがペプチドの抗菌活性および構造に及ぼす影響を研究した。本発明者等は、ペプチドと二価陽イオンとの間の相乗効果を明らかにすることができた。

したがって、本発明の最初の態様は、抗菌性組成物である。この組成物は、二価陽イオンおよびペプチドを含む抗菌性組成物であって、このペプチドが、非グリコシル化形態の約１００個未満、好ましくは約７０個未満のアミノ酸であり、下記配列：

およびこれらの配列の保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物である。

本発明の好ましい実施態様では、上記ペプチドは、下記配列：

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに好ましい実施態様では、上記ペプチドは、下記配列：

およびこれらの配列の保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

さらに好ましくは、上記ペプチドは、下記配列：

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに好適な実施態様では、上記ペプチドは、下記配列：

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

二価陽イオンは、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｓｎ^２＋、およびＭｎ^２＋からなる群から選択されることが好ましい。加えて、この二価陽イオンは、ＳｎＦ^＋およびＣｕＦ^＋などのようにフッ化物と会合していてもよい。しかし、現在のところ二価陽イオンはＣａ^２＋またはＺｎ^２＋が好ましい。

さらに好ましくは、二価陽イオンのペプチドに対するモル比は、０．５：１．０から１５．０：１．０の範囲であり、０．５：１．０から４．０：１．０の範囲が好適である。さらに好ましくは、二価陽イオンのペプチドに対するモル比は、１．０：１．０から４．０：１．０の範囲、好ましくは１．０：１．０から２．０：１．０の範囲である。

さらに好ましい実施態様では、組成物はさらに製薬品として許容できる担体を含む。このような組成物は、歯科用口腔内組成物、局所性または全身性に適用するための治療用抗感染組成物であってもよい。歯科用組成物または治療用組成物は、ゲル、液体、固体、粉体、クリーム、またはロゼンジ（口内錠）の形態とすることができる。また、治療用組成物は錠剤またはカプセルの形態であってもよい。

さらなる態様では、被験者の齲触または歯周病の治療または予防方法であって、そのような処置の必要のある被験者の歯または歯ぐきに本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。この組成物を局所的投与することが好ましい。

ペプチドの抗菌活性を引き起こすものは、ペプチドの物理的性質よりむしろペプチドの特異的な配列であるため、ペプチド配列におけるいわゆる保存的置換を、活性の実質的な喪失なしにすることができる。活性の実質的な喪失を引き起こさないこのような保存的置換は本発明に包含されると考えている。

保存的置換の概念は当業者に周知であるが、明確にするために保存的置換の例を以下に提示する。

本発明の組成物には多くの応用がある。例えば、抗菌防腐剤として食品中に使用することができ、歯垢の抑制、ならびに齲触および歯周病に関わる病原体の抑制のための口腔ケア製品（練り歯磨きおよび口内洗浄液）中に使用することができる。本発明の抗菌性組成物は、医薬の調製にも使用することができる（例えば、局所性または全身性の抗感染薬など）。

本明細書をとおして、用語「含む（comprise：comprises、comprisingなどの変形を含む）」は、記載された要素または整数あるいは一群の要素または整数を含むが、他の要素または整数あるいは一群の要素または整数を排除するものではない。

本発明は、二価陽イオンと少なくとも１種類のペプチドとを含む抗菌性組成物に関する。これらのペプチドは、当初はカゼイン、すなわちκ−カゼイン(106-169)（表１）から得た。

ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン(117-169) およびSer(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン(117-169) は、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む標準的なクロマトグラフィー方法を用いて、ウシのカゼインのトリプシン消化産物から精製することができる。
Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン(106-169) およびSer(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン(106-169) も、限外濾過法により乳漿タンパク質を除去すること、または酸沈殿の後続いてホスホペプチドを逆相ＨＰＬＣ精製することにより、チーズホエー（乳清）およびレンネットホエー（乳清）から調製することができる。このペプチドは、その他の種、例えばヤギ、ヒツジなどのカゼインから調製することができる。

ペプチドκ−カゼイン(106-169) は、チーズホエーまたはレンネットホエー中に、いくつかの異なる形態で存在する。このペプチドには、２個の主要な遺伝的変異体（ＡおよびＢ）があり、グリコシル化およびリン酸化による翻訳後修飾がされている。κ−カゼイノグリコペプチドまたはグリコマクロペプチドとして知られるこのグリコシル化形態は、Neeserにより、ぺプチドのトレオニン残基に結合したオリゴサッカライド鎖に基づく抗歯垢剤または抗齲触剤として記載されていた（米国特許第４，９９２，４２０号および第４，９９４，４４１号）。Neeserは、このグリコペプチドのオリゴサッカライド鎖が、歯垢を形成する口腔細菌に特異的に結合することにより、これらの細菌が唾液に覆われた歯のエナメル質上に付着することを阻害すると主張する。グリコシル化形態のκ−カゼイン(106-169) は、クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣ）により、または、選択的沈殿または限外濾過により、非グリコシル化形態から分離することができる。その非グリコシル化形態のκ−カゼイン(117-169) またはκ−カゼイン(106-169)だけが抗菌活性を示した。グリコシル化が抗菌活性を損なうため、グリコシル化形態またはアグリコシル化形態のκ−カゼイン(117-169) またはκ−カゼイン(106-169) を分離することが望ましく、この分離はクロマトグラフィー、選択的沈殿、または限外濾過により実現することができる。Ser(P)¹⁴⁹ のリン酸化、およびSer(P)¹⁴⁹ のリン酸化より程度の低いSer(P)¹²⁷のリン酸化は、抗菌活性に重要であり、２種の主要な遺伝的変異体（ＡおよびＢ）のリン酸化形態は同等の活性を有するようであった（表１）。Neeserの特許は、κ−カゼイン(106-169) の抗菌活性も、病原細菌の抑制のための非グリコシル化形態のペプチドの使用も開示していない。

本発明の特に好ましい実施態様では、抗菌性組成物を、齲触または歯周病の予防および／または治療を助けるために、練り歯磨きなどの歯磨剤、うがい薬、または口腔用製剤に組み入れる。ペプチドは、歯磨剤組成物の０．０１−５０重量％、好ましくは１−１０重量％を占めていてもよい。口腔用組成物には、投与される本発明の組成物の量がその口腔用組成物の０．０１−５０重量％、好ましくは０．１−１０重量％であることが好ましい。上記のペプチドを含有する本発明の口腔用組成物は、例えば、練り歯磨き、歯磨き粉および液体歯磨剤、うがい薬、トローチ、チューインガム、歯科用軟膏、歯肉マッサージクリーム、うがい錠、ロゼンジ、乳製品、およびその他の食料品などの、口腔に適用できる多様な形態に調製し使用することができる。本発明の口腔用組成物は、特定の口腔用組成物のタイプおよび形態によって、さらに付加的な周知の成分を含有していてもよい。

本発明の口腔用組成物の特に好ましい形態では、口腔用組成物は、例えばうがい薬または洗浄剤などのように、性質が実質的に液体である。このような調剤品では、媒体は、典型的には以下に記述するような湿潤剤を含んでいる、水−アルコール混合液である。

通例、水のアルコールに対する重量比は、約１：１から約２０：１の範囲である。このタイプの調剤品の水−アルコール混合液の総量は、典型的には調剤品の約７０から約９９．９重量％の範囲である。このアルコールは、典型的にはエタノールまたはイソプロパノールである。エタノールが好ましい。

このような液体および本発明のその他の調剤品のｐＨは、通常約４．５から約９の範囲であり、典型的には約５．５から約８の範囲である。このｐＨは、好ましくは約６から約８．０の範囲であり、７．４が好適である。このｐＨは、酸（例えば、クエン酸または安息香酸）または塩基（例えば、水酸化ナトリウム）で制御することができ、あるいは緩衝化（クエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどを用いた状態で）することができる。

本発明の他の望ましい形態の口腔用組成物は、例えば歯磨き粉、歯科用錠剤、あるいは練り歯磨き（歯科用クリーム）またはゲル状歯磨剤の形態の歯磨剤などのように、性質が実質的に固体またはペースト状である。このような固体またはペースト状の口腔用調剤品の媒体は、通常、歯科用製品として許容できる研磨剤を含有する。研磨剤の例として、水に不溶のメタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム二水和物、無水第二リン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、酸化アルミニウム三水和物、焼成アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびこれらの混合物が挙げられる。他の好適な研磨剤として、例えば、メラミン−、フェノール−、または尿素−ホルムアルデヒド類、あるいは、架橋されたポリエポキシド類またはポリエステル類などの、粒子状の熱硬化性樹脂が挙げられる。好ましい研磨剤として、粒子径が最大約５ミクロンであり、平均粒子径が最大約１．１ミクロンであり、かつ表面積が最大約５０，０００ｃｍ^２／ｇの結晶性シリカ、シリカゲルまたはコロイダルシリカ、および無定形アルカリ金属アルミノケイ酸錯体が挙げられる。

視覚的に透明なゲル形態を採用する場合、コロイダルシリカの研磨剤（例えば、登録商標SYLOIDのもとで市販されているSyloid 72およびSyloid 74、または、登録商標SANTOCELのもとで市販されているSantocel 100など）、アルカリ金属アルミノケイ酸錯体類が、特に有用である。これらの研磨剤は、歯磨剤に一般に使われるゲル化剤−液体（水および／または湿潤剤を含む）系の屈折率に近い屈折率を有するからである。

いわゆる「水に不溶の」研磨剤は、性質が陰イオン性であることが多く、少量の可溶性物質も含有している。したがって、不溶性のメタリン酸ナトリウムは、Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry, Volume 9,4th Edition, pp. 510-511に記載されている適切な方法のいずれでも調製することができる。Madrell's salt およびKurrol’s saltとして知られている不溶性のメタリン酸ナトリウムの形態が、さらに好適な材料の例である。これらのメタリン酸塩は、水にほんの微量だけ溶解性を示し、したがって、通例、不溶性のメタリン酸塩（ＩＭＰ）と称される。この中には、微量の水溶性のリン酸塩物質が不純物として、通常２から３重量％（例えば最高で４重量％など）存在する。

水溶性のリン酸塩物質（不溶性のメタリン酸塩の場合は水溶性のトリメタリン酸ナトリウムを含むと考えられている）の量は、必要であれば水で洗浄することにより減量または除去することができる。不溶性のアルカリ金属のメタリン酸塩は、典型的には、粒子径がたとえば３７ミクロンを超える成分がその物質の１％を超えないような粉末形態のものを採用する。

研磨剤は通常、固体またはペースト状の組成物中に重量濃度で約１０％から約９９％の濃度で存在する。研磨剤は、練り歯磨き中には約１０％から約７５％の量で、歯磨き粉中には約７０％から約９９％の量で存在することが好ましい。練り歯磨きにおいては、研磨剤が天然の珪藻である場合、研磨剤は通常約１０から３０重量％の量で存在する。他の研磨剤は、典型的には約３０から７５重量％の量で存在する。

練り歯磨き中には、液体の媒体は、水および湿潤剤を典型的には調剤品の約１０重量％から約８０重量％の範囲の量で含んでいてもよい。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、およびポリプロピレングリコールは、好適な湿潤剤／担体の例である。水、グリセリンおよびソルビトールの液体混合物も好都合である。屈折率が重要な考慮事項となる透明ジェル中には、約２．５〜３０重量％の水、０から約７０重量％のグリセリン、および約２０−８０重量％のソルビトールの液体混合物を採用することが好ましい。

練り歯磨き、クリーム、およびジェルは、典型的に、天然または合成の増粘剤またはゲル化剤を約０．１から約１０重量％、好ましくは約０．５から約５重量％の比率で含有する。好ましい増粘剤は、合成へクトライトである。合成へクトライトは、合成のコロイド状のマグネシウムアルカリ金属ケイ酸錯体粘土であり、例えばラポナイト（例えば、ＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）としてラポート社（Laporte Industries Limited）により市販されている。ラポナイトＤは、およその重量で、ＳｉＯ_２：５８．００％、ＭｇＯ：２５．４０％、Ｎａ_２Ｏ：３．０５％、Ｌｉ_２Ｏ：０．９８％、および多少の水と微量金属である。その真比重は２．５３であり、見掛けかさ密度は湿度８％で１．０ｇ／ｍｌである。

他の好適な増粘剤として、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントガム、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、Natrosolとして入手可能）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および例えば微細化Syloid（例えば244）などのコロイダルシリカが挙げられる。

可溶化剤として、例えば湿潤剤であるポリオール類、例えばプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、およびヘキシレングリコールなど、セロソルブ類、例えばメチルセロソルブ、およびエチルセロソルブなど、直鎖中に炭素原子を少なくとも約１２個含む植物性油脂類およびワックス類、例えばオリーブオイル、ヒマシ油、およびワセリンなど、ならびにエステル類、例えば酢酸アミル、酢酸エチル、および安息香酸ベンジルなど、が含まれていてもよい。

口腔用の調剤品は、従来どおり、適切なラベルを貼ったパッケージに入れて販売または別の方法で流通されるべきであることが理解されよう。したがって、口内洗浄液の瓶には、口内洗浄液またはうがい薬であることを実質上記載し、その使用のための指示を記載したラベルを貼り付ける。また、練り歯磨き、クリーム、およびジェルは、通常、練り歯磨き、クリーム、およびジェルであることを実質上記載したラベルを貼り付けた、押出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちした鉛またはプラスチック）、あるいは、他のスクイーズ容器（内容物を計量して出すためのポンプまたは加圧ディスペンサー）に入れる。

有機界面活性剤は、予防作用の増進を達成し、口腔内全体にわたる活性剤の徹底した完全な分散の達成を助け、さらに、美容上の期待により沿うインスタントな組成物を提供するために、本発明の組成物中に使われる。この有機界面活性物質は、陰イオン性、非イオン性、または両性（双極イオン性と両性イオン性どちら？）であって、本発明の抗菌性ペプチドを変性させない性質であることが好ましい。さらに、有機界面活性剤として、ペプチドを変性させずに組成物に洗浄および泡立ち特性を与える、洗浄力のある物質を採用することが好ましい。好ましい陰イオン界面活性剤の例として、高級脂肪酸のモノグリセリドモノ硫酸塩類の水溶性塩類、例えば水素添加したココナッツオイル脂肪酸のモノ硫酸化モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩類、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩類、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩類、１，２−ヒドロキシプロパンスルホン酸塩類の高級脂肪酸エステル類、および、低級脂肪族アミノカルボン酸化合物類の実質的に飽和の高級脂肪族アシルアミド類、例えばその脂肪酸基、アルキル基またはアシル基などに炭素原子を１２から１６個有する化合物、が挙げられる。最後に挙げたアミド類の例として、石鹸または類似の高級脂肪酸物質を実質的に含まない、Ｎ−ラウロイルサルコシン、および、Ｎ−ラウロイル、Ｎ−ミリストイル、またはＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウム、およびエタノールアミン塩が挙げられる。本発明の口腔用組成物中にこれらのサルコナイト(sarconite) 化合物類を使用することには、特に利点がある。これらの物質は、糖の分解に起因する口腔内の酸の形成の阻害に長期に渡る著しい効果を示すことに加え、酸液溶液中で歯のエナメル質の溶解性を多少減少させる影響を与えるからである。ペプチド類と共に使用するのに適した水溶性の非イオン性界面活性剤の例としては、エチレンオキシドと、反応性であることに加えて疎水性の長鎖（例えば、炭素原子約１２から２０個の脂肪族鎖）を有している種々の反応性水素含有化合物類との縮合生成物類（この縮合生成物類（「エトキサマー類(ethoxamer)」）は、親水性のポリオキシエチレン部分を含む）、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸類、脂肪アルコール類、脂肪族アミド類、多価アルコール類（例えばソルビタンモノステアリン酸塩）、およびポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック剤類）との縮合生成物類が挙げられる。

界面活性剤は、典型的には約０．１〜５重量％の量で存在する。注目すべきことには、この界面活性剤は本発明のペプチドの溶解を助ける可能性があり、それによって必要な可溶化をする湿潤剤の量を減少させる可能性がある。

本発明の口腔用組成物中には、種々の他の物質を組み入れることができる。他の物質として例えば、美白剤、防腐剤、シリコーン類、クロロフィル化合物類および／またはアンモニア処理した物質（例えば尿素、リン酸二アンモニウム、およびこれらの混合物など）が挙げられる。これらの補助剤は、それらが存在する場合には、所望の性質および特性に実質的に悪影響を及ぼさない量で調剤品中に組み込まれる。

いずれの適切な香味物質および甘味物質も使用することができる。好適な風味成分の例として、風味オイル、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、ササフラス、クローブ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン、およびオレンジのオイル、ならびにメチルサリチル酸が挙げられる。好適な甘味剤として、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリンなどが挙げられる。好ましくは、風味剤および甘味剤は、単独または共同で調剤品の約０．１％から５％以上までを占めてよい。

本発明の好ましい実施においては、本発明の口腔用組成物（例えば本発明の組成物を含有するうがい薬および歯磨剤など）は、例えば毎日、２日に１回、または３日に１回、または好ましくは１日に１から３回、ｐＨは約４．５から約９、通常約５．５から約８、好ましくは約６から約８で、少なくとも２週間から８週間までの間、またはさらに長く一生涯にわたって、定期的に歯ぐきおよび歯に適用することが好ましい。

本発明の組成物は、ロゼンジ（口内錠）またはチューインガムその他の製品に組み入れることができる。本発明の組成物は、例えば、暖かいガムベースにかき混ぜながら入れることにより、またはガムベース（その例証としてジェルトン、ゴムラテックス、ビニライト樹脂などが挙げられる）の外側の表面を、望ましくは従来の可塑剤または軟化剤、砂糖またはその他の甘味料、または例えばグルコース、ソルビトールなどと共に覆うことにより組み入れることができる。

別の実施態様では、本発明の組成物は、防腐剤として作用するように、食品中に、０．０１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、最も好ましくは１〜５重量％、特に２重量％で処方される。

本発明は、二価陽イオンとペプチドとを含む製薬組成物を含有し、製薬品として許容できる担体とともに記載される組成物を提供する。このような組成物は、歯科用口腔内組成物、局所性または全身性に適用するための治療用抗感染組成物からなる群から選択することができる。歯科用組成物または治療用組成物は、ゲル、液体、固体、粉体、クリーム、またはロゼンジ（口内錠）の形態とすることができる。また、治療用組成物は錠剤またはカプセルの形態であってもよい。

本発明は、齲触または歯周病の治療または予防方法であって、そのような処置の必要のある被験者の歯または歯ぐきに本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。この組成物を局所的投与することが好ましい。

本明細書は特にヒトでの適用に言及しているが、本発明は獣医学的目的にも有用であることが明確に理解されるであろう。したがって、いずれの観点においても、本発明は、例えばウシ、ヒツジ、馬類および家禽などの家畜類、例えば犬類および猫類などのコンパニオン・アニマル類、および動物園動物類に有用である。

本発明の本質がより明確に理解されるように、その好ましい態様を以下の限定されない実施例を参照して説明する。

〔材料と方法〕
〔カッパーシンの調製〕
塩酸カゼイン（Caseinate-HCl）（Bonlac Foods, Melbourne Australia）を、定常攪拌下、５０℃、ｐH８．０で徐々に脱イオン水に添加することにより溶解して、最終的に２１．５ｇ／Ｌの濃度とした。カゼイン酸塩が溶解すると直ちに温度を３７℃に低下させ、カゼインの沈殿を避けるため、１ＭＨＣｌを徐々に添加することによりｐＨを６．３に調整した。加水分解を開始させるために、レンネット（90% Chymosin EC 3.4. 23.4, 145 IMCU/ml, Single Strength, Chr. Hanson）を添加して最終的に１．２ＩＭＣＵ／ｇカゼインの濃度とし、この溶液を３７℃で１時間攪拌した。この溶液のｐＨを、１ＭＨＣｌおよび１ＭＮａＯＨの添加により６．３±０．２に保持した．トリクロロ酢酸を添加して最終的に４％の濃度とすることにより加水分解を停止させ、沈殿したタンパク質を遠心分離によりペレット化した（５０００ｇ、１５分、４℃）。カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含有する上清を、３０００Ｄａカットオフ膜（S10Y3, Amicon）を用いて透析濾過することにより濃縮した。その後、この物質を凍結乾燥した。この調剤品を、文献（Malkoskiら、２００１年）の記載に従って、Ｃ_１８カラムを使用し、９０％アセトニトリル／０．１体積％ＴＦＡで溶出する逆相ＨＰＬＣにより、グリコシル化形態のタンパク質類、非グリコシル化κ−カゼイン−Ａ(106-169)、および非グリコシル化κ−カゼイン−Ｂ(106-169)にさらに分画した。溶出液を主波長２１５ｎｍでモニターした。各分画の同定は、線形マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI MS; PerSeptive Biosystems, MA, USA）、およびＮ末端配列分析により、文献（Malkoski等、２００１年）の記載に従って行った。

〔固相ペプチド合成および精製〕
Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)およびSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)に対応したペプチドを、文献（Malkoski等、２００１年）の記載に従って、標準的な固相ペプチド合成プロトコルにより合成した。ペプチドを、Ｃ_１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、質量分析により文献（Malkoski等、２００１年）の記載に従って同定した。

〔抗浮遊細菌アッセイ〕
口腔内の日和見病原体であるStreptococcus mutans Ingbritt株を本研究の指標菌として使用した。抗菌アッセイは、文献（Malkoski等、２００１年）の記載に従い、９６ウェルプレートで実施し、細菌の増殖を４０時間にわたって継続的にモニターした。簡潔に説明すると、細菌を、酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）および１００ｍＭリン酸カリウムを含有するトッドヘヴィット培地（Todd Hewitt Broth）（３６．４ｇ／ｌ）中、ｐＨ６．３または７．２で培養した。この細菌の接種材料は、生育培地中の指数増殖細胞を希釈して、生存細胞を２．７×１０^４個／ｍｌとすることにより準備した。この細菌増殖アッセイでは、試験ウェル中にκ−カゼイン−Ａ(106-169)または κ−カゼイン−Ｂ(106-169)を２０μＭから１２０μＭまでの間の濃度で含有させた。これらのペプチドは、カッパーシン：二価金属イオンが１：１から１：４の比率となる範囲の亜鉛またはカルシウムイオンとの組合せでも試験した。合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)ペプチドおよび合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)ペプチドもこのアッセイで試験した。これらのプレートを３７℃でインキュベートし、ｉＥＭＳマイクロプレートリーダー（Labsystems, OY Research Technologies Division）を用いて６２０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定することにより増殖を測定した。

〔S. mutansのバイオフィルム増殖〕
一定膜厚フィルム培養槽（constant depth film fermenter）（CDFF: Wimmpenny, Cardiff University, UK）を、バイオフィルムの形成に用いた。このＣＤＦＦは、それぞれ直径４．５ｍｍのプラグ５個が入っているポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）槽１５個を含み、３ｒｐｍの一定速度で回転するステンレススチールのディスク１個を有する。このプラグを、スチールディスクの表面から０．４ｍｍ下方に設置した。一定のバイオフィルム膜厚０．４ｍｍを維持するために、内蔵スクレーパーを使用した。このスクレーパーはステンレススチールディスクがスクレーパーの下で回転するように取り付けられ、培養槽に対して押し下げることができるようにばね仕掛けで装着されている。このＣＤＦＦ内をＣＯ_２５％のＮ_２ガスを連続的に流すことにより嫌気性雰囲気に保った。このＣＤＦＦをＣＯ_２インキュベーター内に収容し、そのＣＯ_２インキュベーターを３７℃の定常的な培養温度を保つのに用いた。Todd Hewitt（酵母抽出物（８ｇ／ｌ）の培養液（ＴＨＹＥ））中のS. mutans Ingbritt株の指数増殖期のバッチ培養物（３５．４ｇ／ｌ）を使用して、流速３０ｍｌ／時で５時間ＣＤＦＦに植菌した。生育培地である、ショ糖０．１％（ｗ／ｖ）を含有するＴＨＹＥを、その後ＣＤＦＦに４０ｍｌ／時の一定の流速で供給した。

溶液による処理の前後の指定時刻に、プラグをＣＤＦＦから取り除き、浮遊細菌を除くために洗浄し、細菌の数を決定するための生菌数計測を行った。種々の溶液の細胞の生存度への影響を評価するために、ＣＤＦＦへの生育培地の添加を１０分間一時的に停止し、流速３０ｍｌ／時のその溶液で置換した。１０分後に生育培地の添加を再開した。ＣＤＦＦで試験した溶液を以下に挙げる。２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液、カッパーシン調剤品（上記）１０ｍｇ／ｍｌの２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液、カッパーシン調剤品（上記）１０ｍｇ／ｍｌおよびＺｎＣｌ_２２０ｍＭの２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液、ＺｎＣｌ_２２０ｍＭの２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液、ＺｎＣｌ_２２ｍＭの２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液、ならびに、ジグルコン酸クロルヘキシジンの０．０５％脱イオン水溶液。

〔二価金属陽イオンの結合アッセイ〕
１３５μＭから５４０μＭまでの間の指定した濃度のＣａＣｌ_２またはＺｎＣｌ_２を、攪拌下、１３５μＭの濃度の精製したκ−カゼイン−Ａ(106-169)水溶液と共にｐＨ７．３、３７℃で１時間インキュベートした。試料をその後、３０００Ｄａカットオフ濾過膜（YM3 Cellulose, Millipore Bedford Ma, USA）を通して遠心分離（１，０００ｇ、１０分）して、結合していない二価陽イオンを、結合した陽イオンを有するペプチドから分離した。その後、濾液およびもとの試料中のカルシウムイオンまたは亜鉛イオンの量を、４２２．７ｎｍおよび２１３．９ｎｍの吸光モードに設定した原子吸光分光計（Model 373 AAS, Perkin-Elmer）によりそれぞれ測定した。試料中の亜鉛またはカルシウム、および遊離の（結合していない）亜鉛またはカルシウムの総量は、標準曲線を参照して算出した。κ−カゼイン−Ａ(106-169)への結合量は、スキャッチャード分析により求めた。

〔構造決定〕
合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)の一次元^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚで作動するVarian Unity Inova spectrometer (Palo Alto, Ca. , USA)で得た。一連のスペクトルは、一定のｐＨ６．５で、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の濃度が０、５、１５、および３０体積％、ならびにもとのペプチド濃度が３ｍＭの条件で記録した。ｐＨは１ＭＨＣｌを滴加することにより調整した。スペクトルは、ＴＦＥ３０％およびＣａＣｌ_２３ｍＭの濃度で、最終的なペプチド濃度が２．３ｍＭとなる条件で記録した。スペクトルは全て、プローブ温度５℃で記録した。溶媒ピークの抑制は、ＷＥＴ−１Ｄ手順を用いて行った（Smallcombeら（１９９５年））。

〔臨床試験〕
被験者１０例を二重盲検法の交差研究のために募集した。被験者は、メルボルン大学の歯科学部に入学した大学生から募集した。このグループは、平均年齢２１歳の、女性６例および男性４例からなる。被験者は臨床試験開始前に診察され、いずれも良好な健康状態であり、回復していない齲触病変がなく、中等度から重度の歯肉炎の兆候がない歯群を持っていると判断された。これらの被験者は、臨床試験の開始前まで、抗菌性の薬剤を含有するいかなる歯磨剤も使用していなかった。メルボルン大学のヒト治験倫理委員会の承認を得た。

臨床試験の開始時に、被験者に、他の態様の口腔衛生習慣を一切中止して、割り当てられた口内洗浄溶液の使用だけに依存するように指示した。本研究では、４種類の溶液を口内洗浄溶液として試験した。溶液Ａは脱イオン水であり、溶液Ｂはカッパーシン調剤品の１％（ｗ／ｖ）脱イオン水溶液であり、溶液ＣはＺｎＣｌ_２２０ｍＭの脱イオン水溶液であり、溶液Ｄはカッパーシン調剤品１％（ｗ／ｖ）およびＺｎＣｌ_２２０ｍＭの脱イオン水溶液である。いずれの溶液のｐＨも、ＫＯＨを使用して６．９±０．１に調整した。被験者に、毎日３回洗浄するように指示した。すなわち、朝、昼、および晩に１５ｍｌの溶液で1分間洗浄するよう指示した。各試験のセッションは、４日間であり、試験の最終日に臨床評価を行った。SilnessおよびLoeのプラークインデックス（ＰＩ）を歯垢の評価のために用いた（SilnessおよびLoe（１９６４年））。各歯の表面（遠心面、頬側面、近心面、および舌側面）の歯肉部に、０−３のスコアを付与した。第三大臼歯を除き全ての歯に、試験の終結時にスコアを付与した。その後の各試験のセッションにおいて被験者らは、それぞれの通常の口腔衛生習慣を少なくとも７日間、次の試験前に取り戻した。データは、ノンパラメトリックなウィルコクソンの順位検定により分析した。

〔結果〕
〔κ−カゼイン(106-169)の遺伝的変異体の抗菌活性〕
カッパーシン（κ−カゼイン(106-169)）の主要な遺伝的変異体２種の相対的な抗菌活性の差異が、既に同定されているκ−カゼイン−Ａ(106-169)の活性部位中のアミノ酸配列の差異によるものであるか否かを調べるために、残基１３８−１５８の、Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)を合成し、その活性を試験した。合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)の純度を逆相ＨＰＬＣにより測定し、単一ピークを得た（図１）。このピークをマススペクトルにより分析すると、合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)の計算質量２２３５．４に対応する観測質量（ｍ／ｚ）２２３３．９Ｄａで単一のピークが観測された（図２）。マイクロプレート増殖アッセイにおいてS. mutansに対して発育ｐＨ６．２８で試験した合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)の、算出した最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、４４μＭであった。

〔カッパーシンの二価金属陽イオンとの相互作用〕
合成活性部位ペプチド[Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)およびSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)]も、精製した全長ぺプチドからなる遺伝的変異体類も、発育ｐＨ７．２０、３００μＭまでの濃度で試験した場合にはS. mutansの増殖を全く阻害しなかった。ｐＨ７．２、当量の濃度の抗菌性二価陽イオンＺｎ^２＋の存在下で、κ−カゼイン(106-169)の２種の遺伝的変異体の細菌増殖阻害活性を試験すると、相乗効果が観測された。（図３）。亜鉛イオンのみのＭＩＣは２００μＭであり、このことにより、カッパーシン：亜鉛が１：１を超える比で試験したときには、カッパーシンと亜鉛の相乗効果が打ち消された。興味深いことに、亜鉛イオンをカルシウムイオンに置き換えると、１：１の比で最高３００μＭまでの濃度においてκ−カゼイン−Ｂ(106-169)およびカルシウムでのS. mutansの増殖に対する影響が全く検出できなかったにもかかわらず、κ−カゼイン−Ａ(106-169)およびカルシウムイオンでは抗菌性効果が検出可能であった（表２）。

κ−カゼイン−Ａ(106-169)の生理活性に対するカルシウムの最適な比は、種々の比をマイクロプレート増殖アッセイにおいてS. mutansに対して試すことにより決定した。２：１の比が１：１の比より効果的であることが明らかとなった一方、カルシウム：カゼイン−Ａ(106-169)比を４：１にまで増加させても活性を高めなかった（図４）。

κ−カゼイン−Ａ(106-169)を用いた二価陽イオンＺｎ^２＋の結合アッセイのスキャッチャード分析により、このペプチドには亜鉛のための２個の結合部位が存在することが実証された（図５）。カルシウムの結合についても同様の結果を得た。

〔バイオフィルムとして培養されたStreptococcus mutansの生存度に対するカッパーシンおよび亜鉛の影響〕
ＣＤＦＦバイオフィルム培養槽へのインキュベーション後、S. mutansは１プラグあたり生存細胞５−６×１０^８個を含む安定なバイオフィルムを急速に形成した。２ｍＭトリスＨＣｌｐＨ６．０溶液を５ｍｌ添加しても、このバイオフィルム中のS. mutans生菌数計測にはほとんど影響が無かった。対照的に、カッパーシン調剤品１％（ｗ／ｖ）の２ｍＭトリスＨＣｌｐＨ６．０溶液を５ｍｌ添加すると、急速にS. mutans生存細胞数が低減する結果となり、添加の２時間後には生菌数の９９．５％の低減が見られた。カッパーシン添加後のS. mutansバイオフィルムの回復は遅く、添加の３日後に細菌数が前処理のレベルのまだ１３％未満であった。ＣＤＦＦ内のS. mutansの安定なバイオフィルムにＺｎＣｌ_２２ｍＭの２ｍＭトリスＨＣｌｐＨ６．０溶液を５ｍｌ添加すると、生菌数が約６０％減少した。生存細胞の数は、この処理からは急速に回復した。バイオフィルムにＺｎＣｌ_２２０ｍＭの溶液を同様に添加すると、生存細胞数が９２％に減少する結果となった。再び、生存細胞数の急速な回復が観測された。S. mutansバイオフィルムにカッパーシン：亜鉛（カッパーシン１％（ｗ．ｖ）、亜鉛２０ｍＭ）を添加すると、２時間で９６％の減少という、生存細胞数の急速な減少がもたらされた。しかし、カッパーシン：亜鉛処理の３日後には、バイオフィルム中の生存S. mutansの数は、前処理レベルの０．５％未満にまで減少した。さらに、バイオフィルム中のS. mutansの生存度は、それに続く１５日間にわたってカッパーシン：亜鉛処理から回復しなかった。カッパーシンおよびカッパーシン：亜鉛の比較有効性を試験するために、ジグルコン酸クロルヘキシジン０．０５％（ｗ／ｖ）の溶液をＣＤＦＦバイオフィルム培養槽のS. mutansに対して試験した。その結果、S. mutans細胞生存度は４８％に減少した。また、処理の３．５時間後には前処理の生存度と有意な差異がないという、細胞生存度の急速な回復が見られた。

〔構造解析〕
９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏ溶液中で記録された合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのアミド領域は、約δ８．１５からδ８．７５に領域が０．６ｐｐｍ領域が拡大しており、このアミドの共鳴が十分に分散されていないことを示している。これは「ランダムコイル」コンフォーメーションをとっているペプチドの特徴である。ＴＦＥを５体積％添加すると、一部の共鳴のケミカルシフトが変化し、一般的なピークのブロード化がみられた。ピークのブロード化は、水性溶液とＴＦＥミセルからなるより無極性の環境との２つの環境下でのペプチド分子の存在状態の化学交換の結果である。ペプチド分子は、２つの環境でのアミドの化学シフトの差異に比例した速度でその環境を交換する。より多くのＴＦＥを試料に添加するほど、ペプチドは無極性なＴＦＥ環境に選択的に親和し、水性相との交換速度が遅くなる。これらの変化は、アミドの化学シフトのさらなる変化およびＮＭＲ共鳴の一般的なシャープ化を伴う。しかし、化学シフトの幅はまだ相対的に小さく、約δ８．１５からδ８．７５の０．６ｐｐｍであり、ペプチドがまだ「ランダムコイル」コンフォーメーションをとっていることを示唆している。モル過剰量のカルシウムイオンを添加すると、アミド共鳴が約δ７．７５からδ９．０の１．２５ｐｐｍの幅、すなわちペプチド固有のコンフォーメーションに特徴的な幅を超えて拡大した。

〔臨床試験〕
市販のカッパーシンを富化したＣＭＰ製剤を、被験者１０例の二重盲検法、交差、小スケールの抗歯垢臨床試験に使用した。この製剤のＨＰＬＣ分析は、１０．０ｍｇ／ｍｌ溶液中には非グリコシル化κ−カゼイン−Ａ(106-169)４．４ｍｇ／ｌ、非グリコシル化κ−カゼイン−Ｂ(106-169)１．９ｍｇ／ｌ、およびグリコシル化κ−カゼイン(106-169)３．０ｍｇ／ｌが存在することを示した。グリコシル化κ−カゼイン(106-169)の理論平均分子量が７５００であることに基づくと、製剤中にはいずれかの形態のκ−カゼイン(106-169)が約１．３３ｍＭの濃度で存在しており、その結果Ｚｎ：ＣＭＰ比は約１５：１である。

口腔衛生の唯一の形態として水（対照）の口内洗浄液を使用して４日間経過した後では、SilnessおよびLoeの全口腔平均プラークインデックススコアは１７８．９±３３．５であり、臼歯のみを考慮した場合の平均プラークインデックススコアは８５．９±１４．４であった。対照である水と比較して、カッパーシン口内洗浄溶液は臼歯の平均プラークインデックススコアの７％を低減する結果となり、ＺｎＣｌ_２口内洗浄溶液は９％の低減をもたらし、一方亜鉛：カッパーシン処置は２１％の低減をもたらした（図６）。ＺｎＣｌ_２口内洗浄溶液は、臼歯のプラークインデックススコアを考慮してウィルコクソンの順位検定により判定したところ、水での処置と比較して有意に（Ｐ＜０．０５）歯垢の堆積を低減した。カッパーシン口内洗浄溶液には、対照である水との有意な差異が無かった。亜鉛：カッパーシン口内洗浄溶液は、他のいずれの処置と比較しても有意に（Ｐ＜０．０５）歯垢の堆積を低減した。

臼歯のプラークスコアの分布も、使用した口内洗浄液のタイプで変化した。水の口内洗浄液では２またはそれ以上のスコアを有する歯表面が７８％であったのに対し、亜鉛：カッパーシン口内洗浄溶液では、２またはそれ以上のプラークインデックススコアを有する表面が４７％だけであった（図７）。

〔考察〕
非グリコシル化、リン酸化形態のカゼイノマクロペプチド[κ−カゼイン(106-169)]（カッパーシン）は、グラム陽性口腔細菌に対してもグラム陰性口腔細菌に対しても、酸性ｐＨで抗菌活性を有することが明らかとなっていた。既知の６種の遺伝的変異体のうち、κ−カゼイン−Ａ(106-169)およびκ−カゼイン−Ｂ(106-169)が圧倒的に最も豊富な形態である。本発明者らは以前に、κ−カゼイン−Ａ(106-169)がκ−カゼイン−Ｂ(106-169)より高い抗菌活性を有していること、κ−カゼイン−Ａ(106-169)の抗菌活性を残基１３８−１５８に限局することができること、およびSer¹⁴⁹のリン酸化が活性に不可欠であることを明らかにした（Malkoskiら、国際公開第９９／２６９７１号公報（２００１年））。κ−カゼイン−Ｂ(106-169)の低い抗菌活性が残基１３８−１５８領域内の親水性アミノ酸から疎水性アミノ酸への置換（変異体ＡのAsp¹⁴⁸から変異体ＢのAla¹⁴⁸）に起因するかどうかを突き止めるため、合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)の活性を測定した。S. mutansに対するｐＨ６．２８での合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、４４μＭであった。これを、同一の条件下の合成Ser(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)のＭＩＣが２６μＭであったことを示す以前の研究と比較した。その結果、活性部位のアミノ酸配列の差異は、κ−カゼイン(106-169)遺伝的変異体ＡとＢとのS. mutansに対するｐＨ６．２８での活性の差異の全部とはいえないまでも大部分を説明しそうである。

中性ｐＨ（７．２０）では、非グリコシル化リン酸化κ−カゼイン(106-169)のいずれの遺伝的変異体も指標株S. mutansに対する抗菌活性が無かった（表２）。κ−カゼイン−Ａ(106-169)に二価金属陽イオンである亜鉛を１：１の比で加えると、S. mutansに対する抗菌効果が１６１μＭのＭＩＣで生じた。このＭＩＣは、亜鉛だけで観察される値より低い（表２、図３）。亜鉛とκ−カゼイン−Ｂ(106-169)との１：１の比の組合せでは、亜鉛だけの値より低いＭＩＣは得られなかったが、この組合せはサブ−ＭＩＣ濃度で、同一濃度の亜鉛だけまたはκ−カゼイン−Ｂ(106-169)だけでは検出されなかったある程度の阻害活性を有していた（図３）。亜鉛と合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ａ(138-158)との１：１の比の組合せは、亜鉛：κ−カゼイン−Ａ(106-169)で観察された値と同等のＭＩＣを有し、二価金属イオンがこのペプチド領域と相互作用する可能性を示唆した。中性でのこの増強された活性が、亜鉛の抗菌活性に起因するかどうか、またはペプチドのコンフォーメーションの変化に起因するかどうかを突き止めるために、抗菌活性が全くない二価金属陽イオンであるカルシウムをＣＭＰ由来のペプチドと共に試験した。κ−カゼイン−Ａ(106-169)にカルシウムを１：１の比で加えると、S. mutansに対する抗菌効果が２４８μＭのＭＩＣで生じた（表２）。カルシウムだけでは、最高で１ｍＭまでの濃度でS. mutansの増殖に全く影響を与えない。カルシウムとκ−カゼイン−Ｂ(106-169)の組合せによっては全く抗菌効果が検出できなかった（表２）。このことは、二価金属陽イオンの存在が、中性ｐＨでのκ−カゼイン−Ａ(106-169)の活性の増強をおそらくペプチドの構造の改変により助けていることを示唆している。二価金属陽イオンのκ−カゼイン−Ａ(106-169)に対する最も有効な比が２：１であることをカルシウムを用いて割り出した（図４）。この結果は、κ−カゼイン−Ａ(106-169)が選択的に二価金属陽イオン２個と結合することを示すスキャッチャード分析の結果と整合性がとれている（カルシウムまたは亜鉛いずれも、図５）。

ｉｎｖｉｖｏでは、口腔細菌は、硬組織（歯）に付着したバイオフィルムである歯垢として存在する。S. mutansを一定膜厚フィルム培養槽中、より厳密に口腔内の条件をシミュレートするため遊離のショ糖を含有する生育培地で、バイオフィルムとして増殖した。薬剤の抗菌活性を正確に決定するためには、バイオフィルムモデル（Wilson（１９９６年））で試験すべきである。この一定膜厚フィルム培養槽は、多数のバイオフィルムを再現可能な方法で作り出す精巧な手段を提供する。このバイオフィルムは抗菌剤の有効性の定量のために使用することができ、これにより抗歯垢活性の予測に役立つ結果が得られる（Hope and Wilson（２００３年）、Shuら（２００３年）、Wilson（１９９６年）、Wimpennyら（１９８９年））。このS. mutansバイオフィルムにカッパーシンまたはカッパーシン：亜鉛溶液を添加すると、生存細胞が劇的に減少した。興味深いことに、細菌細胞数の減少は長期間持続し、カッパーシンが浮遊細菌よりバイオフィルム細菌に対してより効果的に作用する可能性が示唆された。比較では、口内洗浄液への抗歯垢添加剤と認識されているクロルヘキシジンの０．０５％溶液は、S. mutansの生存度に対してカッパーシンより低い効果、およびより短い持続効果を示した。

カッパーシンは、それが負に帯電したアミノ酸を高い比率で含んでいるという点で特異な抗菌性ペプチドである。κ−カゼイン−Ａ(106-169)の等電点（Ｐｉ）は３．９であり、５から８のｐＨ範囲にわたって分子の電荷の変化がほとんどなく、約−７である。

合成ペプチドκ−カゼイン−Ａ(138-158)の構造解析により、このペプチドが例えば細菌細胞膜などの非極性な相と相互作用すること、および過剰のカルシウムイオンの存在下でこのペプチドがその環境下で特異的なコンフォーメーションをとることが示唆された。これらの結論は、カルシウム非存在下でのグリコシル化ＣＭＰおよび非グリコシル化ＣＭＰの構造を決定し、その構造が主としてランダムで柔軟であることを見出したSmithらの研究（２００２年）とも、ＣＭＰのこの領域がＴＦＥの存在下で両親媒性のα−へリックスを形成する傾向があることを見いだしたPlowmanの研究（１９９７年）とも、整合性がとれている。

カゼインから作られる市販のカッパーシン調剤品を、抗歯垢臨床試験に使用した。この調剤品では、非グリコシル化形態のＣＭＰ（カッパーシン）が乾燥重量の６３％を占めていて、このうち７０％が遺伝的変異体Ａであり３０％が遺伝的変異体Ｂである。カッパーシン−亜鉛配合口内洗浄液は、唯一の口腔衛生手段として用いた場合、カッパーシンだけまたは亜鉛だけを含む口内洗浄液よりも歯肉縁上の歯垢の抑制に有意に有効であり、相乗効果を示した。クエン酸亜鉛は、二重盲検交差試験で被験者の歯垢の堆積を５−８％有意に低減することが、Tureskyのプラークインデックスを用いて以前に明らかとなっていた（Addyら、１９８０年）。この研究では、塩化亜鉛口内洗浄液でも同様の結果が得られ、全口腔平均プラークインデックススコアおよび臼歯の平均プラークインデックススコアがそれぞれ６％および９％減少した。Giertsenら（１９８８年）は、塩化亜鉛を口内洗浄液として使用すると、対照である水と比較して歯垢の無い歯表面を９％有意に増加させることをSilnessおよびLoeのプラークインデックスを用いて明らかにした。カッパーシン口内洗浄液は水と比較して臼歯の歯肉縁上の歯垢を７％低減したが、この歯垢の低減は統計的に対照と異ならなかった。この研究では、SilnessおよびLoeのプラークインデックスは、歯の表面の全体にわたる歯垢の分布の変化より容易に観察できる、特に歯肉の縁に沿った歯垢の厚さの変化に用いた。その結果、試験継続期間が短く（５日）被験者の数が少ない理由で、このSilnessおよびLoeのプラークインデックスが最も適切なプラーク評価系であるとみなされた。また、無染色のプラークスコアが染色したスコアより、歯肉炎、乾燥歯垢重量および湿潤歯垢重量と大幅に高い相関があることも明らかになっていた（LoescheおよびGreen、１９７２年）。

亜鉛および錫の塩が抗菌活性および比較的高い安全プロファイルを有することはかなり以前から認識されてきた（Moranら、２０００年）。亜鉛は、活性チオール基を含む酵素との相互作用をとおして膜輸送および代謝過程（解糖を含む）を阻害することによりその抗菌活性を及ぼすと考えられてきた（CumminsおよびCreeth（１９９２年）、OppermanおよびRolla（１９８０年）、Oppermanら（１９８０年））。歯垢細菌中への亜鉛の吸着は、最初に細胞表面タンパク質との静電的な相互作用、次にそれに続いて起こる細胞内への輸送が伴う。歯垢阻害効果は、洗浄後にイオン類が歯垢中および口腔内に保持されることによる、歯垢微生物に対する長時間作用型の静菌性効果であると考えられている（Giertsenら、１９８８年）。亜鉛塩類は、練り歯磨きおよび口内洗浄液に、抗菌剤であるトリクロサン、クロルヘキシジン、およびサンギナリンとの組合せで使用されてきた。これらは相乗的な抗菌作用を有することが明らかになっている（Giertsenら（１９８８年）、Moranら（２０００年））。

カッパーシン−亜鉛を含有する口内洗浄液での処置は、臼歯のプラークインデックススコアの２１％の減少をもたらした（図６）。これらの結果は、クロルヘキシジン口内洗浄液と同程度である。クロルヘキシジンは、これまでに試験された最も有効な抗歯垢および抗歯肉炎化合物であると考えられている。しかし、歯および修復物の外因性の着色、味覚異常、ならびに舌の茶色の着色を含むクロルヘキシジンの使用の副作用が、長期間の使用を制限している（Elderidgeら、１９９８年）。

歯肉縁上の歯垢の長期間にわたる堆積は歯肉炎の進行および歯周炎の発生に関連すること、ならびに歯肉縁上の歯垢の抑制だけで歯肉炎を消散させるのに十分であることは一般に広く認められている（CorbetおよびDavies、１９９３年）。本研究の結果は、天然のペプチドであるカッパーシンと亜鉛イオンの組合せが、歯肉縁上の歯垢の抑制に有効な口内洗浄液を生み出す可能性を示している。

〔本発明の組成物を含む処方案〕
〔処方１〕
成分重量％
第二リン酸カルシウム二水和物５０．０
グリセロール２０．０
カルボキシルメチルセルロースナトリウム１．０
ラウリル硫酸ナトリウム１．５
ラウロイルサルコシンナトリウム０．５
香料１．０
サッカリンナトリウム０．１
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
デキストラナーゼ０．０１
本発明の組成物１．０
水バランス

〔処方２〕
成分重量％
第二リン酸カルシウム二水和物５０．０
ソルビトール１０．０
グリセロール１０．０
カルボキシルメチルセルロースナトリウム１．０
ラウリル硫酸ナトリウム１．５
ラウロイルサルコシンナトリウム０．５
香料１．０
サッカリンナトリウム０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム０．３
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
デキストラナーゼ０．０１
本発明の組成物２．０
水バランス

〔処方３〕
成分重量％
第二リン酸カルシウム二水和物５０．０
ソルビトール１０．０
グリセロール１０．０
カルボキシルメチルセルロースナトリウム１．０
ラウロイル酸ジエタノールアミド１．０
スクロースモノラウレート２．０
香料１．０
サッカリンナトリウム０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム０．３
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
デキストラナーゼ０．０１
本発明の組成物５．０
水バランス

〔処方４〕
成分重量％
ソルビトール１０，０
アイリッシュモス１．０
水酸化ナトリウム（５０％）１．０
Gantrez １９．０
水（脱イオン化）２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム０．７６
サッカリンナトリウム０．３
ピロリン酸塩２．０
水酸化アルミニウム４８．０
風味オイル０．９５
本発明の組成物１．０
水バランス

〔処方５〕
成分重量％
ポリアクリル酸ナトリウム５０．０
ソルビトール１０．０
グリセロール２０．０
サッカリンナトリウム０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム０．３
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
エタノール３．０
本発明の組成物２．０
リノール酸０．０５
水バランス

〔うがい薬の処方案〕
〔処方１〕
成分重量％
エタノール２０．０
香料１．０
サッカリンナトリウム０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム０．３
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
ラウロイル酸ジエタノールアミド０．３
本発明の組成物２．０
水バランス

〔処方２〕
成分重量％
Gantrez S-97 ２．５
グリセリン１０．０
風味オイル０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン０．０１
ラウロイル酸ジエタノールアミド０．２
本発明の組成物２．０
水バランス

〔ロゼンジの処方案〕
成分重量％
糖質７５〜８０
コーンシロップ１〜２０
風味オイル１〜２
ＮａＦ０．０１〜０．０５
本発明の組成物３．０
ステアリン酸マグネシウム１〜５
水バランス

〔歯肉マッサージクリームの処方案〕
成分重量％
白色ワセリン８．０
プロピレングリコール４．０
ステアリルアルコール８．０
ポリエチレングリコール４０００２５．０
ポリエチレングリコール４００３７．０
モノステアリン酸スクロース０．５
グルコン酸クロルヘキシジン０．１
本発明の組成物３．０
水バランス

〔チューインガムの処方案〕
成分重量％
ガムベース３０．０
炭酸カルシウム２．０
結晶ソルビトール５３．０
グリセリン０．５
風味オイル０．１
本発明の組成物２．０
水バランス

本明細書に記載の全ての刊行物を、参照により本明細書に取り込む。本明細書に含まれる文書の議論、言動、材料、装置、論文または同種のもののいずれも、単に本発明の解釈を提供する目的だけのものである。いずれかのまたは全てのこれらの事柄が、本発明の各特許請求項の優先日前に豪州またはほかの国に存在した、本発明に関連する従来技術基盤または当技術分野の一般的知識を形成すると解されるべきではない。

当業者により、大まかに記述した本発明の精神と適用範囲から逸脱することなく多くの変形および／または修正が、具体的な実施例に示したように本発明に加えられるであろうことが理解されるであろう。したがって、本明細書の実施例は、いすれの観点においても例証となるものであり限定的なものではない。

（参考文献）

図１は、精製したSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)のクロマトグラムを示す。精製したペプチド画分の試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析カラムにアプライした。精製したペプチドを、０−１００％緩衝溶液Ｂ（３０分）の直線的濃度勾配法でこのカラムから溶出した。流速は１ｍｌ／分とした。緩衝溶液Ａは、０．１％酢酸水；ｐＨ５．５（ＴＥＡ）であり、緩衝溶液Ｂは、６０％アセトニトリル含有０．１％酢酸水；ｐＨ５．５（ＴＥＡ）であった。図２は、ＲＰ−ＨＰＬＣの画分Ｂの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを使ったマススペクトル分析である。主ピークは、合成ペプチドSer(P)¹⁴⁹κ−カゼイン−Ｂ(138-158)に対応する２２３３．９ＤａのＭＷで観測された。スペクトルは、リニア・ネガティブモード、加速電圧２０ｋＶ、グリッド電圧９３％、およびパルス遅延時間１００ナノ秒で得た。図３は、κ−カゼイン−Ａ(106-169)[▲]、κ−カゼイン−Ｂ(106-169)[◇]、ＺｎＣｌ_２[×]、Ｚｎ：κ−カゼイン−Ｂ(106-169)（１：１比）[■]、およびＺｎ：κ−カゼイン−Ａ(106-169)（１：１比）[◆]の、ＴＨＹＥ中、ｐＨ７．２でのStreptococcus mutansの増殖に対する効果を示す。図４は、カルシウムイオン濃度が、ｐＨ７．２でS. mutansに対して試験された２５０μＭκ−カゼイン−Ａ(106-169)の増殖阻害活性に及ぼす影響を示す。ＣａＣｌ_２対照[◆]；Ｃａ：κ−カゼイン−Ａ(106-169)[▲]。κ−カゼイン−Ａ(106-169)は、このアッセイに添加する前に、１：０から１：４までの比で1時間、ＣａＣｌ_２でインキュベートした。図５は、亜鉛のκ−カゼイン−Ａ(106-169)への結合のスキャッチャード分析を示す。ＺｎＣｌ_２を精製したκ−カゼイン−Ａ(106-169)と共にｐＨ７．３、３７℃の水中で１時間インキュベートした。その後、試料を遠心分離機で分子量３０００のカットオフ濾過膜を通して分離した。亜鉛イオンの量は原子吸光分析により決定した。図６は、口腔衛生の唯一の形態として口内洗浄液に使用した場合に、カッパーシン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＺｎＣｌ_２（２０ｍＭ）、およびカッパーシン：ＺｎＣｌ_２が、臼歯の平均プラークインデックススコアに与える影響を示す。ａ＝対照となる水とは有意に異なる。ｂ＝他のいずれの処置とも有意に異なる。これらはウィルコクソンの順位検定を用いて決定した。図７は、臼歯のプラークインデックススコアの分布における口内洗浄液の効果を示す。

Claims

水性溶媒を含み、かつ、前記水性溶媒中に溶解した二価陽イオンおよびペプチドを含む抗菌性組成物であって、
前記二価陽イオンが、前記水性溶媒に添加されたものであり、添加した前記二価陽イオンの実質的に全てが前記水性溶媒中に溶解しており、
前記二価陽イオンがＣａ^２＋またはＺｎ^２＋であり、
前記ペプチドが、非グリコシル化形態の１００個未満のアミノ酸であり、下記配列：

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
前記ペプチドが、７０個未満のアミノ酸である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
前記ペプチドが、下記配列：

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗菌性組成物。
前記組成物における、前記二価陽イオンの前記ペプチドに対するモル比が０．５から１５．０：１．０の範囲である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が０．５：１．０から４．０：１．０の範囲である、請求項４に記載の抗菌性組成物。
前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が１．０：１．０から４．０：１．０の範囲である、請求項５に記載の抗菌性組成物。
前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が１．０：１．０から２．０：１．０の範囲である、請求項６に記載の抗菌性組成物。
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物および製薬上許容できる担体を含む抗菌性医薬組成物。
患者の齲触または歯周病を治療または予防するための医薬の調製における、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物の使用。