JP2007519622A - 抗菌性組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 2309-2315(2001). Peptides 22, 1093-1098 (2001). International Dairy Federation Special Issue 9702, pp. 110-123 (1997). Journal of Dairy Research 64, 377-397 (1997). European Journal of Biochemistry 235, 516-525 (1996). Journal of Biological Chemistry 271, 28533-28540 (1996).
Ser(P)149κ−カゼイン(106-169) およびSer(P)127, Ser(P)149κ−カゼイン(106-169) も、限外濾過法により乳漿タンパク質を除去すること、または酸沈殿の後続いてホスホペプチドを逆相HPLC精製することにより、チーズホエー(乳清)およびレンネットホエー(乳清)から調製することができる。このペプチドは、その他の種、例えばヤギ、ヒツジなどのカゼインから調製することができる。
〔カッパーシンの調製〕
塩酸カゼイン(Caseinate-HCl)(Bonlac Foods, Melbourne Australia)を、定常攪拌下、50℃、pH8.0で徐々に脱イオン水に添加することにより溶解して、最終的に21.5g/Lの濃度とした。カゼイン酸塩が溶解すると直ちに温度を37℃に低下させ、カゼインの沈殿を避けるため、1MHClを徐々に添加することによりpHを6.3に調整した。加水分解を開始させるために、レンネット(90% Chymosin EC 3.4. 23.4, 145 IMCU/ml, Single Strength, Chr. Hanson)を添加して最終的に1.2IMCU/gカゼインの濃度とし、この溶液を37℃で1時間攪拌した。この溶液のpHを、1MHClおよび1MNaOHの添加により6.3±0.2に保持した.トリクロロ酢酸を添加して最終的に4%の濃度とすることにより加水分解を停止させ、沈殿したタンパク質を遠心分離によりペレット化した(5000g、15分、4℃)。カゼイノマクロペプチド(CMP)を含有する上清を、3000Daカットオフ膜(S10Y3, Amicon)を用いて透析濾過することにより濃縮した。その後、この物質を凍結乾燥した。この調剤品を、文献(Malkoskiら、2001年)の記載に従って、C18カラムを使用し、90%アセトニトリル/0.1体積%TFAで溶出する逆相HPLCにより、グリコシル化形態のタンパク質類、非グリコシル化κ−カゼイン−A(106-169)、および非グリコシル化κ−カゼイン−B(106-169)にさらに分画した。溶出液を主波長215nmでモニターした。各分画の同定は、線形マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI MS; PerSeptive Biosystems, MA, USA)、およびN末端配列分析により、文献(Malkoski等、2001年)の記載に従って行った。
Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)およびSer(P)149κ−カゼイン−B(138-158)に対応したペプチドを、文献(Malkoski等、2001年)の記載に従って、標準的な固相ペプチド合成プロトコルにより合成した。ペプチドを、C18カラムを用いた逆相HPLCにより精製し、質量分析により文献(Malkoski等、2001年)の記載に従って同定した。
口腔内の日和見病原体であるStreptococcus mutans Ingbritt株を本研究の指標菌として使用した。抗菌アッセイは、文献(Malkoski等、2001年)の記載に従い、96ウェルプレートで実施し、細菌の増殖を40時間にわたって継続的にモニターした。簡潔に説明すると、細菌を、酵母抽出物(5.0g/l)および100mMリン酸カリウムを含有するトッドヘヴィット培地(Todd Hewitt Broth)(36.4g/l)中、pH6.3または7.2で培養した。この細菌の接種材料は、生育培地中の指数増殖細胞を希釈して、生存細胞を2.7×104個/mlとすることにより準備した。この細菌増殖アッセイでは、試験ウェル中にκ−カゼイン−A(106-169)または κ−カゼイン−B(106-169)を20μMから120μMまでの間の濃度で含有させた。これらのペプチドは、カッパーシン:二価金属イオンが1:1から1:4の比率となる範囲の亜鉛またはカルシウムイオンとの組合せでも試験した。合成Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)ペプチドおよび合成Ser(P)149κ−カゼイン−B(138-158)ペプチドもこのアッセイで試験した。これらのプレートを37℃でインキュベートし、iEMSマイクロプレートリーダー(Labsystems, OY Research Technologies Division)を用いて620nmでの吸光度(OD)を測定することにより増殖を測定した。
一定膜厚フィルム培養槽(constant depth film fermenter)(CDFF: Wimmpenny, Cardiff University, UK)を、バイオフィルムの形成に用いた。このCDFFは、それぞれ直径4.5mmのプラグ5個が入っているポリテトラフルオロエチレン(PTFE)槽15個を含み、3rpmの一定速度で回転するステンレススチールのディスク1個を有する。このプラグを、スチールディスクの表面から0.4mm下方に設置した。一定のバイオフィルム膜厚0.4mmを維持するために、内蔵スクレーパーを使用した。このスクレーパーはステンレススチールディスクがスクレーパーの下で回転するように取り付けられ、培養槽に対して押し下げることができるようにばね仕掛けで装着されている。このCDFF内をCO25%のN2ガスを連続的に流すことにより嫌気性雰囲気に保った。このCDFFをCO2インキュベーター内に収容し、そのCO2インキュベーターを37℃の定常的な培養温度を保つのに用いた。Todd Hewitt(酵母抽出物(8g/l)の培養液(THYE))中のS. mutans Ingbritt株の指数増殖期のバッチ培養物(35.4g/l)を使用して、流速30ml/時で5時間CDFFに植菌した。生育培地である、ショ糖0.1%(w/v)を含有するTHYEを、その後CDFFに40ml/時の一定の流速で供給した。
135μMから540μMまでの間の指定した濃度のCaCl2またはZnCl2を、攪拌下、135μMの濃度の精製したκ−カゼイン−A(106-169)水溶液と共にpH7.3、37℃で1時間インキュベートした。試料をその後、3000Daカットオフ濾過膜(YM3 Cellulose, Millipore Bedford Ma, USA)を通して遠心分離(1,000g、10分)して、結合していない二価陽イオンを、結合した陽イオンを有するペプチドから分離した。その後、濾液およびもとの試料中のカルシウムイオンまたは亜鉛イオンの量を、422.7nmおよび213.9nmの吸光モードに設定した原子吸光分光計(Model 373 AAS, Perkin-Elmer)によりそれぞれ測定した。試料中の亜鉛またはカルシウム、および遊離の(結合していない)亜鉛またはカルシウムの総量は、標準曲線を参照して算出した。κ−カゼイン−A(106-169)への結合量は、スキャッチャード分析により求めた。
合成Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)の一次元1H−NMRスペクトルは、600MHzで作動するVarian Unity Inova spectrometer (Palo Alto, Ca. , USA)で得た。一連のスペクトルは、一定のpH6.5で、トリフルオロエタノール(TFE)の濃度が0、5、15、および30体積%、ならびにもとのペプチド濃度が3mMの条件で記録した。pHは1MHClを滴加することにより調整した。スペクトルは、TFE30%およびCaCl23mMの濃度で、最終的なペプチド濃度が2.3mMとなる条件で記録した。スペクトルは全て、プローブ温度5℃で記録した。溶媒ピークの抑制は、WET−1D手順を用いて行った(Smallcombeら(1995年))。
被験者10例を二重盲検法の交差研究のために募集した。被験者は、メルボルン大学の歯科学部に入学した大学生から募集した。このグループは、平均年齢21歳の、女性6例および男性4例からなる。被験者は臨床試験開始前に診察され、いずれも良好な健康状態であり、回復していない齲触病変がなく、中等度から重度の歯肉炎の兆候がない歯群を持っていると判断された。これらの被験者は、臨床試験の開始前まで、抗菌性の薬剤を含有するいかなる歯磨剤も使用していなかった。メルボルン大学のヒト治験倫理委員会の承認を得た。
〔κ−カゼイン(106-169)の遺伝的変異体の抗菌活性〕
カッパーシン(κ−カゼイン(106-169))の主要な遺伝的変異体2種の相対的な抗菌活性の差異が、既に同定されているκ−カゼイン−A(106-169)の活性部位中のアミノ酸配列の差異によるものであるか否かを調べるために、残基138−158の、Ser(P)149κ−カゼイン−B(138-158)を合成し、その活性を試験した。合成Ser(P)149κ−カゼイン−B(138-158)の純度を逆相HPLCにより測定し、単一ピークを得た(図1)。このピークをマススペクトルにより分析すると、合成ペプチドSer(P)149κ−カゼイン−B(138-158)の計算質量2235.4に対応する観測質量(m/z)2233.9Daで単一のピークが観測された(図2)。マイクロプレート増殖アッセイにおいてS. mutansに対して発育pH6.28で試験した合成ペプチドSer(P)149κ−カゼイン−B(138-158)の、算出した最小阻害濃度(MIC)は、44μMであった。
合成活性部位ペプチド[Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)およびSer(P)149κ−カゼイン−B(138-158)]も、精製した全長ぺプチドからなる遺伝的変異体類も、発育pH7.20、300μMまでの濃度で試験した場合にはS. mutansの増殖を全く阻害しなかった。pH7.2、当量の濃度の抗菌性二価陽イオンZn2+の存在下で、κ−カゼイン(106-169)の2種の遺伝的変異体の細菌増殖阻害活性を試験すると、相乗効果が観測された。(図3)。亜鉛イオンのみのMICは200μMであり、このことにより、カッパーシン:亜鉛が1:1を超える比で試験したときには、カッパーシンと亜鉛の相乗効果が打ち消された。興味深いことに、亜鉛イオンをカルシウムイオンに置き換えると、1:1の比で最高300μMまでの濃度においてκ−カゼイン−B(106-169)およびカルシウムでのS. mutansの増殖に対する影響が全く検出できなかったにもかかわらず、κ−カゼイン−A(106-169)およびカルシウムイオンでは抗菌性効果が検出可能であった(表2)。
CDFFバイオフィルム培養槽へのインキュベーション後、S. mutansは1プラグあたり生存細胞5−6×108個を含む安定なバイオフィルムを急速に形成した。2mMトリスHClpH6.0溶液を5ml添加しても、このバイオフィルム中のS. mutans生菌数計測にはほとんど影響が無かった。対照的に、カッパーシン調剤品1%(w/v)の2mMトリスHClpH6.0溶液を5ml添加すると、急速にS. mutans生存細胞数が低減する結果となり、添加の2時間後には生菌数の99.5%の低減が見られた。カッパーシン添加後のS. mutansバイオフィルムの回復は遅く、添加の3日後に細菌数が前処理のレベルのまだ13%未満であった。CDFF内のS. mutansの安定なバイオフィルムにZnCl22mMの2mMトリスHClpH6.0溶液を5ml添加すると、生菌数が約60%減少した。生存細胞の数は、この処理からは急速に回復した。バイオフィルムにZnCl220mMの溶液を同様に添加すると、生存細胞数が92%に減少する結果となった。再び、生存細胞数の急速な回復が観測された。S. mutansバイオフィルムにカッパーシン:亜鉛(カッパーシン1%(w.v)、亜鉛20mM)を添加すると、2時間で96%の減少という、生存細胞数の急速な減少がもたらされた。しかし、カッパーシン:亜鉛処理の3日後には、バイオフィルム中の生存S. mutansの数は、前処理レベルの0.5%未満にまで減少した。さらに、バイオフィルム中のS. mutansの生存度は、それに続く15日間にわたってカッパーシン:亜鉛処理から回復しなかった。カッパーシンおよびカッパーシン:亜鉛の比較有効性を試験するために、ジグルコン酸クロルヘキシジン0.05%(w/v)の溶液をCDFFバイオフィルム培養槽のS. mutansに対して試験した。その結果、S. mutans細胞生存度は48%に減少した。また、処理の3.5時間後には前処理の生存度と有意な差異がないという、細胞生存度の急速な回復が見られた。
90%H2O/10%D2O溶液中で記録された合成Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)の1H−NMRスペクトルのアミド領域は、約δ8.15からδ8.75に領域が0.6ppm領域が拡大しており、このアミドの共鳴が十分に分散されていないことを示している。これは「ランダムコイル」コンフォーメーションをとっているペプチドの特徴である。TFEを5体積%添加すると、一部の共鳴のケミカルシフトが変化し、一般的なピークのブロード化がみられた。ピークのブロード化は、水性溶液とTFEミセルからなるより無極性の環境との2つの環境下でのペプチド分子の存在状態の化学交換の結果である。ペプチド分子は、2つの環境でのアミドの化学シフトの差異に比例した速度でその環境を交換する。より多くのTFEを試料に添加するほど、ペプチドは無極性なTFE環境に選択的に親和し、水性相との交換速度が遅くなる。これらの変化は、アミドの化学シフトのさらなる変化およびNMR共鳴の一般的なシャープ化を伴う。しかし、化学シフトの幅はまだ相対的に小さく、約δ8.15からδ8.75の0.6ppmであり、ペプチドがまだ「ランダムコイル」コンフォーメーションをとっていることを示唆している。モル過剰量のカルシウムイオンを添加すると、アミド共鳴が約δ7.75からδ9.0の1.25ppmの幅、すなわちペプチド固有のコンフォーメーションに特徴的な幅を超えて拡大した。
市販のカッパーシンを富化したCMP製剤を、被験者10例の二重盲検法、交差、小スケールの抗歯垢臨床試験に使用した。この製剤のHPLC分析は、10.0mg/ml溶液中には非グリコシル化κ−カゼイン−A(106-169)4.4mg/l、非グリコシル化κ−カゼイン−B(106-169)1.9mg/l、およびグリコシル化κ−カゼイン(106-169)3.0mg/lが存在することを示した。グリコシル化κ−カゼイン(106-169)の理論平均分子量が7500であることに基づくと、製剤中にはいずれかの形態のκ−カゼイン(106-169)が約1.33mMの濃度で存在しており、その結果Zn:CMP比は約15:1である。
非グリコシル化、リン酸化形態のカゼイノマクロペプチド[κ−カゼイン(106-169)](カッパーシン)は、グラム陽性口腔細菌に対してもグラム陰性口腔細菌に対しても、酸性pHで抗菌活性を有することが明らかとなっていた。既知の6種の遺伝的変異体のうち、κ−カゼイン−A(106-169)およびκ−カゼイン−B(106-169)が圧倒的に最も豊富な形態である。本発明者らは以前に、κ−カゼイン−A(106-169)がκ−カゼイン−B(106-169)より高い抗菌活性を有していること、κ−カゼイン−A(106-169)の抗菌活性を残基138−158に限局することができること、およびSer149のリン酸化が活性に不可欠であることを明らかにした(Malkoskiら、国際公開第99/26971号公報(2001年))。κ−カゼイン−B(106-169)の低い抗菌活性が残基138−158領域内の親水性アミノ酸から疎水性アミノ酸への置換(変異体AのAsp148から変異体BのAla148)に起因するかどうかを突き止めるため、合成ペプチドSer(P)149κ−カゼイン−B(138-158)の活性を測定した。S. mutansに対するpH6.28での合成Ser(P)149κ−カゼイン−B(138-158)の最小阻害濃度(MIC)は、44μMであった。これを、同一の条件下の合成Ser(P)149κ−カゼイン−A(138-158)のMICが26μMであったことを示す以前の研究と比較した。その結果、活性部位のアミノ酸配列の差異は、κ−カゼイン(106-169)遺伝的変異体AとBとのS. mutansに対するpH6.28での活性の差異の全部とはいえないまでも大部分を説明しそうである。
〔処方1〕
成分 重量%
第二リン酸カルシウム二水和物 50.0
グリセロール 20.0
カルボキシルメチルセルロースナトリウム 1.0
ラウリル硫酸ナトリウム 1.5
ラウロイルサルコシンナトリウム 0.5
香料 1.0
サッカリンナトリウム 0.1
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
デキストラナーゼ 0.01
本発明の組成物 1.0
水 バランス
成分 重量%
第二リン酸カルシウム二水和物 50.0
ソルビトール 10.0
グリセロール 10.0
カルボキシルメチルセルロースナトリウム 1.0
ラウリル硫酸ナトリウム 1.5
ラウロイルサルコシンナトリウム 0.5
香料 1.0
サッカリンナトリウム 0.1
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
デキストラナーゼ 0.01
本発明の組成物 2.0
水 バランス
成分 重量%
第二リン酸カルシウム二水和物 50.0
ソルビトール 10.0
グリセロール 10.0
カルボキシルメチルセルロースナトリウム 1.0
ラウロイル酸ジエタノールアミド 1.0
スクロースモノラウレート 2.0
香料 1.0
サッカリンナトリウム 0.1
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
デキストラナーゼ 0.01
本発明の組成物 5.0
水 バランス
成分 重量%
ソルビトール 10,0
アイリッシュモス 1.0
水酸化ナトリウム(50%) 1.0
Gantrez 19.0
水(脱イオン化) 2.69
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.76
サッカリンナトリウム 0.3
ピロリン酸塩 2.0
水酸化アルミニウム 48.0
風味オイル 0.95
本発明の組成物 1.0
水 バランス
成分 重量%
ポリアクリル酸ナトリウム 50.0
ソルビトール 10.0
グリセロール 20.0
サッカリンナトリウム 0.1
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
エタノール 3.0
本発明の組成物 2.0
リノール酸 0.05
水 バランス
〔処方1〕
成分 重量%
エタノール 20.0
香料 1.0
サッカリンナトリウム 0.1
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
ラウロイル酸ジエタノールアミド 0.3
本発明の組成物 2.0
水 バランス
成分 重量%
Gantrez S-97 2.5
グリセリン 10.0
風味オイル 0.4
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.05
グルコン酸クロルヘキシジン 0.01
ラウロイル酸ジエタノールアミド 0.2
本発明の組成物 2.0
水 バランス
成分 重量%
糖質 75〜80
コーンシロップ 1〜20
風味オイル 1〜2
NaF 0.01〜0.05
本発明の組成物 3.0
ステアリン酸マグネシウム 1〜5
水 バランス
成分 重量%
白色ワセリン 8.0
プロピレングリコール 4.0
ステアリルアルコール 8.0
ポリエチレングリコール4000 25.0
ポリエチレングリコール400 37.0
モノステアリン酸スクロース 0.5
グルコン酸クロルヘキシジン 0.1
本発明の組成物 3.0
水 バランス
成分 重量%
ガムベース 30.0
炭酸カルシウム 2.0
結晶ソルビトール 53.0
グリセリン 0.5
風味オイル 0.1
本発明の組成物 2.0
水 バランス
Claims (15)
- 前記ペプチドが、約70個未満のアミノ酸である、請求項1に記載の抗菌性組成物。
- 前記二価陽イオンが、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Sn2+、Mn2+、SnF+およびCuF+を含む群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
- 前記二価陽イオンがCa2+またはZn2+である、請求項5に記載の抗菌性組成物。
- 前記組成物における、前記二価陽イオンの前記ペプチドに対するモル比が0.5から15.0:1.0の範囲である、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
- 前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が0.5:1.0から4.0:1.0の範囲である、請求項7に記載の抗菌性組成物。
- 前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が1.0:1.0から4.0:1.0の範囲である、請求項8に記載の抗菌性組成物。
- 前記二価陽イオンの前記ペプチドに対する前記モル比が1.0:1.0から2.0:1.0の範囲である、請求項9に記載の抗菌性組成物。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物および製薬上許容できる担体を含む医薬組成物。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与する工程を含む、被験者の齲触または歯周病の治療または予防方法。
- 前記組成物を被験者の歯または歯ぐきに投与する、請求項12に記載の齲触または歯周病の治療または予防方法。
- 前記組成物を局所的投与により投与する、請求項13に記載の齲触または歯周病の治療または予防方法。
- 被験者の齲触または歯周病を治療または予防するための医薬の調製における、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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