ES2205038T3 - Terapia de reemplazo para la caries dental. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN CEPAS MUTANTES DE STREPTOCOCCUS MUTANS CARACTERIZADAS POR UNA DEFICIENCIA EN LA PRODUCCION DE ACIDO LACTICO Y LA PRODUCCION DE UNA ALCOHOL DESHIDROGENASA RECOMBINANTE (ADH). ESTAS CEPAS DE S. MUTANS RECOMBINANTES SON ADECUADAS PARA SU USO EN UN METODO PARA PREVENIR Y TRATAR LA CARIES DENTAL.

Description

Terapia de reemplazo para la caries dental.

Declaración de una investigación esponsorizada federalmente

Esta invención está realizada al menos en parte con fondos del gobierno Federal a través de una subvención del Instituto Nacional de Investigación Dental. La subvención no. DE04529 del Servicio de Salud Pública. El gobierno puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a los métodos y composiciones para la prevención de la caries dental.

Descripción de la materia relacionada

La capacidad de una bacteria dada para colonizar un hospedador se determina mediante un número de factores tales como las necesidades metabólicas de las bacterias, y las interacciones de las bacterias con la flora de la bacteriana pre-existente. Las interacciones bacterianas pueden clasificarse generalmente tanto como "positivas" como "negativas". En interacciones positivas, una cepa bacteriana "efectora" altera el microambiente para promover la colonización de un segundo organismo "diana". En interacciones "negativas", la cepa efectora altera el microambiente de modo que decrece o previene completamente la colonización de la bacteria diana. Las interacciones negativas entre bacterias competitivas durante la colonización del huésped son llamadas comúnmente interferencia bacteriana.

Los regímenes terapéuticos que toman ventaja de la interferencia bacteriana para sustituir una cepa bacteriana patogénica por una cepa efectora no patogénica se denominan terapias de reemplazo. La terapia de reemplazo exitosa requiere una cepa efectora que: 1) no sea patogénica 2) altere el microambiente así como prevenga la colonización o crecimiento derivado de organismos patógenos, 3) colonizan persistentemente el huésped a riesgo de prevenir la reinfección por el organismo patogénico diana, y desplace agresivamente el organismo patogénico de los tejidos a riesgo donde el patógeno es parte de la flora indígena del huésped.

Es bien conocido que las caries dentales son causadas por una bacteria que coloniza la cavidad oral.

La principal bacteria patógena que causa la caries dental en humanos es la bacteria Streptococcus mutans. Los rasgos característicos de S. mutans implicados en la cariogénesis incluyen su capacidad para producir ácido láctico, así como la capacidad para acumular éste sobre el esmalte de los dientes (es decir, formación de placa) (Gibbons et al., 1969 J.Bacteriol., 98:341-346; Makinen et al., 1972, Int Dent.J., 22:362-386; y Jordan, 1965, Ann. N.Y. Acad. Sci., 131:905-912). La aplicación de los principios de terapia de reemplazo requerirán el aislamiento de una cepa efectora no cariogénica de S. mutans, por ejemplo, una cepa de S. mutans deficiente en la síntesis de ácido láctico. El progreso en la aplicación de la terapia de reemplazo para la caries dental se ha revisado recientemente (Hilman y al., 1989, In: New Biotechnologies in Oral Research, H.M.Myers, ed., S.Karger, Basel, Switzerland, pgs. 1-17).

La generación de una cepa de S. mutans deficiente en ácido láctico, y así una adecuada cepa para la terapia de reemplazo para la caries dental se encontró con una dificultad considerable. Los defectos en la síntesis de ácido láctico son letales para S. mutans. Abhyanakar y al.(1985, J. Dent. Res., 64:1267-1271) generaron un mutante S. mutans deficiente en lactato deshidrogenasa (LDH) por mutagénesis química usando una cepa de S. mutans atípica que contiene una mutación (espontánea) preexistente que afecta al metabolismo del piruvato. Sin embargo, las mutaciones inducidas químicamente y las mutaciones generadas espontáneamente en esta cepa permanecen sin caracterizar. Sin embargo, las mutaciones no caracterizadas, inducidas químicamente pueden revertir al tipo salvaje, y así el fenotipo cariogénico, patogénico. Los intentos siguientes para producir deficiencias de LDH en otras cepas de S. mutans han fallado (Hillman y al., 1994, Infect. Inmun., 62:60-64; Chen y al., 1994, J. Bacteriol., 176:1542-1545).

Existe una clara necesidad en el campo para establecer la cepa de S. mutans no cariogénica deficiente en ácido láctico, que es adecuada para el uso en una terapia de reemplazo en la prevención y/o tratamiento de caries dentales.

Resumen de la invención

La invención se basa en el descubrimiento que la cepa de Streptococcus mutans deficiente en ácido láctico puede generarse introduciendo una mutación en un gen implicado en las vías de síntesis del ácido láctico, y previniendo la letalidad de esta mutación por la introducción de un gen (adh) de la alcohol deshidrogenada recombinante en la bacteria deficiente en ácido láctico. El recombinante adh previene la acumulación de metabólitos (por ejemplo, piruvato) en la bacteria, así evadiendo la letalidad por deficiencia del ácido láctico. Esta estrategia puede ser aplicada para la producción de una cepa de S. mutans adecuada para el uso en la terapia de reemplazo para la caries dental.

En general, la invención presenta los métodos y las composiciones para la prevención y/o tratamiento de la caries dental en un huésped susceptible a la caries dental.

En otro aspecto, la invención caracteriza una cepa de Streptococcus mutans caracterizada por una deficiencia en la producción de ácido láctico (por ejemplo, debido a la eliminación de la actividad de la lactato deshidrogenasa) y, en su lugar, la producción de una alcohol deshidrogenasa recombinante (ADH). "Deficiencia en la producción de ácido láctico" o "deficiente en ácido láctico" se refiere a que la cepa de S. mutans recombinante produce cantidades decrecientes sustancialmente de ácido láctico comparado con S. mutans de tipo salvaje. Preferiblemente un S. mutans recombinante "deficiente en ácido láctico" produce ácido láctico no detectable. La invención también incluye métodos para la producción de cepas recombinantes de la invención.

Una cepa preferida de S. mutans recombinante se caracteriza por: 1) una deficiencia en la producción de ácido láctico; 2) producción de la alcohol deshidrogenasa recombinante, y 3) producción de una bacteriocina que tiene actividad antibacteriana contra una cepa de Streptococcus mutans susceptible a bacteriocina, y 4) opcionalmente puede ser auxotrófica (por ejemplo., auxotrófica para D-alanina).

Cepas S. mutans recombinantes preferidas adicionales son deficientes en la producción de ácido láctico, producen una alcohol deshidrogenasa recombinante, y son auxotróficas (por ejemplo autotróficas para D-alanina).

La invención presenta adicionalmente composiciones farmacéuticas compuestas de una cepa S. mutans que produce ADH recombinante deficiente en ácido láctico recombinante, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La invención también se refiere a un método de reducción de la incidencia o gravedad de la caries dental en un huésped susceptible a caries dental mediante la administración oral a un huésped susceptible a caries dental de una cepa de Streptococcus mutans recombinante que tiene 1) un gen alcohol deshidrogenasa recombinante y 2) una deficiencia en la producción de ácido láctico, en una cantidad efectiva para el reemplazo de las cepas S. mutans del huésped que causan caries dental en la cavidad oral del huésped.

La invención se refiere adicionalmente a una composición para el mantenimiento de una bacteria D-alanina auxotrófa (por ejemplo, un auxotrofo D-alanina S. mutans) en la cavidad oral de un huésped que contiene un auxotrofo bacteriano D-alanina que mantiene las cantidades de D-alanina.

Una ventaja de la invención es que la cepa S. mutans recombinante 1) es deficiente en ácido láctico, y así no causa caries dental, y 2) sustituirán efectivamente las cepas que causan la caries dental de S. mutans en la cavidad oral del huésped.

Otra ventaja es que, donde el S. mutans recombinante es un auxtrofo D-alanina, la colonización de la cepa se puede controlar mediante la administración de D-alanina.

Otros rasgos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción siguiente de las realizaciones preferidas de las mismas, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción breve de las figuras

La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos (ID. de SEC. Nº:1) y de DNA (ID. de SEC. Nº:2) de la alcohol deshidrogenasa II de Z. mobilis.

La Fig. 2 muestra el efecto de la glucosa en el crecimiento, supervivencia, concentración de piruvato intracelular de las cepas CH4ts de Streptococcus mutans y NG8 (control). Símbolos: NG8 con glucosa, ---\Box---; NG8 sin glucosa, ---\medcirc---; CH4ts con glucosa, ---\medcirc---; CH4ts sin glucosa ---\Delta---.

La Fig. 3 muestra el efecto de la concentración de glucosa y temperatura en el medio de cultivo continuo de la cepa CH4ts de S. mutans a una proporción de dilución del 10%. Símbolos del panel A: ---\Box---, densidad óptica; ---\medcirc---, concentración de glucosa; símbolos del Panel B: ---\medcirc---, pH; ---\Box---, concentración de ácido láctico; ---\Delta---, lavado teórico; ---\medcirc---, concentración de etanol; ---\Box---, concentración de acetoina.

La Fig. 4 muestra los efectos de la concentración de glucosa y temperatura sobre el cultivo continuo de la cepa CH4ts de S. mutans a una proporción de dilución de 0,6%. Símbolos: ---\Box---, densidad óptica; ---\medcirc---, glucosa; ---\medcirc---, lavado teórico.

Descripción detallada

La caries dental es causada por la producción y acumulación de ácido láctico por Streptococcus mutans que coloniza normalmente la cavidad oral. Sin embargo, dado que la mutación en la vía de producción del ácido láctico de S. mutans es letal para la bacteria, la introducción de S. mutans deficiente en ácido láctico dentro de la cavidad oral para sustituir la cepa S. mutans que produce ácido láctico no ha sido posible.

La invención se basa en el descubrimiento de que se pueden generar cepas de Streptococcus mutans deficientes en ácido láctico, viables transformando las cepas con ácido nucléico que codifica una alcohol deshidrogenasa recombinante (ADH), e introduciendo una mutación en la vía de síntesis del ácido láctico para rendir la cepa que produce ADH recombinante deficiente en ácido láctico. La ADH recombinante previene la acumulación de metabolitos en la bacteria, así evadiendo la letalidad de la deficiencia de ácido láctico. Esta estrategia puede aplicarse a la producción de cepas S. mutans recombinantes apropiadas para el uso en una terapia de reemplazo para la caries dental.

Cepas Streptococcus mutans recombinantes de la invención

Una "cepa Streptococcus mutans recombinante" es una cepa de S. mutans que aparece de forma no natural que se ha generado usando cualquiera de una variedad de técnicas de ácido nucleico recombinante (es decir, técnicas que implican la manipulación de DNA o RNA). En general, una cepa de Streptococcus mutans recombinante de la invención se caracteriza mínimamente por: 1) una deficiencia en la producción de ácido láctico, y 2) producción de una alcohol deshidrogenasa recombinante (ADH).

Cepas S. mutans recombinantes son caracterizadas más a fondo preferiblemente mediante la producción de una bacteriocina con actividad antibacteriana contra una cepa S. mutans susceptible a bacteriocina. "Bacteriocina", como se usa aquí, se refiere a una toxina de tipo bacteriocina o bacteriocina específica producida por la cepa JH1000 de S. mutans (Hilman et al., 1984, Infect. Immun., 44:141-144). La bacteriocina de JH1000 S. mutans tiene un peso molecular aparente de menos de alrededor de 1.000 Da, y tiene una actividad antibacteriana contra cepas S. mutans susceptibles a la bacteriocina. La producción de la bacteriocina así proporciona las cepas S. mutans con una ventaja selectiva sobre las cepas S. mutans que no producen bacteriocina normalmente presentes en la cavidad oral. La bacteriocina, cuando está presente en una cepa S. mutans recombinante de la invención, elimina las cepas S. mutans susceptibles a bacteriocina residentes, interfiriendo así con la colonización de las cepas susceptibles a bacteriocina y promoviendo la colonización de S. mutans recombinante de la cavidad oral.

Porque debe ser deseable controlar la colonización de la cavidad oral mediante cepas S. mutans recombinantes de la invención, la cepa S. mutans es preferiblemente un auxotrófo para una sustancia orgánica que no está presente normalmente en la cavidad oral del huésped mamífero, más preferiblemente un auxotrófo para un D-aminoácido, aún más preferiblemente un auxotrófo D-alanina. La colonización de las cepas auxotróficas puede ser controlada regulando la cantidad de sustancia orgánica para la que la cepa tiene auxotrofia. Así, la necesidad consigue liberar el huésped de S. mutans recombinante, se puede terminar la colonización mediante la administración retenida de la sustancia orgánica específica para la cual la cepa es auxotrófica.

Así, las cepas de S. mutans recombinante de la invención se caracterizan por: 1) una deficiencia de ácido láctico, y 2) producción de ADH recombinante, y además se puede caracterizar mediante 3) producción de bacteriocina, y/o 4) una auxotrofia para una sustancia orgánica específica, preferiblemente un D-aminoácido, más preferiblemente D-alanina. La producción de cada una de las cepas de S. mutans recombinante de la invención se describirá ahora en detalle.

Cepas de Streptococcus mutans padres para el uso en la producción de cepas S. mutans recombinante de la invención

La cepa de Streptococcus mutans para el uso en la producción de las cepas de S. mutans recombinante de la invención puede ser cualquier cepa S. mutans. Preferiblemente, la cepa de S. mutans usada para producir cepas de S. mutans recombinantes de la invención tienen una ventaja selectiva sobre las cepas de S. mutans de tipo salvaje que normalmente colonizan la cavidad oral. La ventaja selectiva puede conferirse mediante cualquiera de una variedad de características (por ejemplo, producción de un compuesto antibacteriano, necesidades metabólicas relativas, tasa de crecimiento relativo, producción de rescatadores para los metabolitos) que promueven la colonización de la cavidad oral por la cepa, y reemplazo de la cepa residente que coloniza la cavidad oral.

Preferiblemente, la colonización por las cepas de S. mutans recombinante de la invención no desestabilizan sustancialmente la colonización mediante otra cepa que no sea S. mutans (por ejemplo, flora bacteriana normal no asociada con cariogénesis). Por ejemplo, infección de voluntarios humanos con una cepa variante de JH1000 de S. mutans que produce niveles potenciados de bacteriocina que resultaron de la sustitución de las cepas de S. mutans cariogénicos residentes (presumiblemente en parte debido a la producción de bacteriocina por la cepa JH1000) sin efecto sobre otras especies Gram positivas residentes en la cavidad oral (Hillman et al., 1987, J.Dent. Res., 66:1092-1094).

Preferiblemente, la cepa S. mutans produce la bacteriocina de JH1000 S. mutans. Más preferiblemente, las cepas S. mutans recombinantes se generaron a partir de variantes de JH1000 S. mutans que producen cantidades superiores de la bacteriocina comparándolo con las cantidades producidas por JH1000 S. mutans. Una "variante" es una bacteria modificada genéticamente que exhibe una alteración fenotípica en relación a la cepa padre de la que deriva. La alteración fenotípica puede resultar a partir de cualquiera de una variedad de lesiones genéticas, como una alteración en: 1) el promotor enlazado operativamente al gen estructural (por ejemplo, efectuar un incremento en la transcripción del gen); y/o 2) el gen estructural que codifica un producto específico (por ejemplo, tal que el producto tiene la actividad potenciada). Una lesión genética es una alteración en la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje que resulta en una alteración fenotípica en la bacteria.

Por ejemplo, una "variante de bacteriocina" de JH1000 de S. mutans es una bacteria que ha incrementado la actividad bacteriocina en comparación a la cepa padre de JH100 de S. mutans. Preferiblemente, la actividad bacteriocina de la variante JH100 de S. mutans aumentó en relación a la actividad bacteriocina de la cepa de S. mutans padre, preferiblemente alrededor de 10 veces, preferiblemente cerca de 1,5 veces a 5 veces, más preferiblemente alrededor de 2 veces a 4 veces, generalmente alrededor de 3 veces en relación a la cepa JH1000 de S. mutans. La actividad bacteriocina incrementada de estas variantes puede resultar de un nivel incrementado de producción de bacteriocina en relación a la cepa padre y/o producción de una bacteriocina que tiene actividad bacteriana incrementada comparado con la bacteriocina de S. mutans de tipo salvaje.

Se pueden generar "variantes" por una variedad de métodos bien conocidos en el campo tal como mutagénesis (es decir, exposición de una bacteria a un mutágeno), selección de mutantes espontáneos, o manipulación genética usando técnicas recombinantes. La mutagénesis se puede culminar exponiendo la bacteria a luz ultravioleta, o cualquiera de una variedad de mutágenos químicos, de acuerdo con los métodos bien conocidos en el campo (por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), ácido nitroso, hidroxilamina, análogos de nucleótido (por ejemplo, 5-bromouracilo, 2-aminopurina), o agentes intercalantes (por ejemplo acridinas). Los métodos para la generación de mutantes bacterianos son bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

"Mutaciones espontáneas" son mutaciones que se presentan naturalmente, es decir, sin manipulación genética directa por el hombre, o exposición a un mutágeno. La selección de mutantes espontáneos puede lograrse cultivando la cepa y seleccionando las variantes deseadas mediante, por ejemplo, la producción de bacterias variantes o sobreproducción de un factor específico, por ejemplo, bacteriocina. Los métodos de selección de mutantes espontáneos son bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra).

Métodos para producir variantes usando técnicas recombinantes son bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Por ejemplo variantes JH100 de S. mutans que tienen actividad bacteriocina incrementada se pueden generan mediante la expresión de copias múltiples de DNA que codifica bacteriocina, y/o mutación del promotor de la bacteriocina para proporcionar niveles superiores de transcripción.

Genes de la alcohol deshidrogenasa

Porque los defectos en la síntesis del ácido láctico son letales para S. mutans (Hillman et al., 1994, Infect. Immun., 62:60-64; Hillman et al., 1994, J.Bacteriol., 176:1542-1545), el defecto en las cepas S. mutans deficientes en ácido láctico, recombinantes debe ser complementado por la producción de una alcohol deshidrogenasa recombinante (ADH). La producción de la ADH recombinante previene la acumulación de metabolitos, por ejemplo., piruvato, que de otro modo causa la muerta de S. mutans deficiente en ácido láctico.

La "producción de ADH recombinante" se refiere a que la cepa S. mutans recombinante expresa un enzima ADH funcional que se ha introducido en las cepas de S. mutans usando técnicas de DNA recombinante (es decir, el S. mutans ha sido transformado con DNA que codifica un enzima ADH). "Transformación" significa un cambio genético permanente (es decir, estable) inducido en una célula seguido de la incorporación de DNA nuevo (es decir, DNA exógeno a la célula).

El DNA que codifica por ADH puede derivarse de cualquier organismo, preferiblemente a partir de una bacteria, más preferiblemente a partir de Zymomonas mobilis o Streptococcus rattus, aún más preferiblemente de Z. mobilis. El DNA que codifica ADH puede derivarse de S. mutans, así esta introducción del DNA que codifica ADH, en combinación con el gen adh de S. mutans nativo, proporciona copias múltiples de DNA que codifica la ADH en el genoma de S. mutans. Alternativamente, la ADH recombinante puede generarse mediante la introducción de una mutación en el mecanismo regulador del gen adh de S. mutans (por ejemplo, una mutación en el promotor adh para proporcionar una trascripción incrementada del gen adh). Preferiblemente, la ADH recombinante es la alcohol deshidrogenasa II de Z. mobilis, que se clonó y secuenció (Nº de acceso Genbank: M15394; Conway et al., 1987, J.Bacteriol., 169:2591-2597, incorporada aquí a modo de referencia). Las secuencias de aminoácidos (ID de SEC. Nº:1) y secuencias de DNA (ID de SEC. Nº:2) de la alcohol deshidrogenasa de Z. mobilis se muestran en la Fig.1.

Los métodos para identificación, clonación, transformación estable y expresión de los fragmentos de DNA que codifican un DNA de interés (por ejemplo, ADH) son rutinarios y bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Por ejemplo, aislamiento del DNA que codifica ADH puede realizarse mediante amplificación por PCR de la secuencia a partir de DNA genómico, o a partir de un clon preexistente del gen. La expresión de ADH recombinante puede lograrse mediante unión operativa del gen estructural adh a un promotor que facilita la expresión en S. mutans (por ejemplo, spaP o el promotor Idh nativo).

La producción de una ADH funcional puede ensayarse mediante, por ejemplo, usando ensayos de actividad de ADH convencionales (por ejemplo, ensayos para la oxidación dependiente de NAD de etanol) que son bien conocidas en el campo (Neal et al., 1986, Eur. J.Biochem., 154:119-124, incorporada aquí a modo de referencia).

Generación de S. mutans deficiente en ácido láctico

"Deficiente en ácido láctico" o "deficiencia en la producción de ácido láctico" se refiere a que la cepa S. mutans produce cantidades decrecientes sustancialmente de ácido láctico en relación a S. mutans de tipo salvaje. Preferiblemente, S. mutans recombinante "deficiente en ácido láctico" produce ácido láctico no detectable.

\newpage

Cepas S. mutans recombinantes de la invención son deficientes en ácido láctico como resultado de un defecto en la vía de síntesis del ácido láctico. Un "defecto" es una alteración en la codificación del DNA del gen que previene la expresión de un producto génico funcional. Los "defectos" incluyen alteraciones que resultan en la inhibición de, o un incremento sustancial en, la trascripción y/o traducción de genes. Los "defectos" también incluyen alteraciones en un gen estructural, tal que el producto del gen traducido y trascrito no es funcional, o funciona a un nivel sustancialmente disminuido comparado con el producto del gen de tipo salvaje.

Un "defecto en la vía de síntesis del ácido láctico" es un defecto genético que previene, o disminuye sustancialmente, la producción de ácido láctico. Los defectos de la ruta de síntesis del ácido láctico pueden incluir, por ejemplo, lesiones genéticas en un enzima que facilita la síntesis de ácido láctico, y/o un promotor unido operativamente a un gen estructural que codifica un enzima requerido para la síntesis de ácido láctico. Preferiblemente, el defecto en la ruta de síntesis del ácido láctico se debe a un defecto en el gen que codifica la lactato deshidrogenasa (Idh) (por ejemplo, un defecto en el gen estructural Idh, y/o un defecto en el promotor unido operativamente al gen estructural Idh). S. mutans que tiene un defecto en LDH se denominan cepas LDH^{-}.

El defecto en la ruta de síntesis del ácido láctico se puede introducir mediante mutagénesis (es decir, exposición de una bacteria a un mutágeno), selección de mutantes espontáneos, o manipulación genética usando técnicas recombinantes. Como se discutió anteriormente, cada una de las técnicas son bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Preferiblemente, el defecto de la ruta de síntesis del ácido láctico se introdujo usando técnicas recombinantes, por ejemplo, introducción de un gen estructural Idh defectivo dentro de la bacteria y consiguiente recombinación específica del para sustituir el Idh de tipo salvaje por el Idh defectivo. El gen Idh de S. mutans se clonó, se determinó su secuencia de nucleótidos (número de acceso GenBank M72454), y el gen Idh recombinate expresado en Escherichia coli (Duncan et al., 1991, Infect. Immun., 59:3930-3934; Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295, se incorporó aquí por referencia).

Producción de las cepas de S. mutans recombinantes auxotróficas

En el caso que llegue a ser deseable liberar el huésped de S. mutans recombinante que coloniza la cavidad oral, la cepa S. mutans recombinante infectada es preferiblemente una auxótrofo. Un "auxótrofo" es una bacteria que requiera una fuente de una(s) sustancia(s) orgánica(s), además de una fuente de carbono, para crecer. Por ejemplo, un "auxótrofo D-alanina" es una bacteria que no puede crecer sin una fuente de D-alanina. Aunque los auxótrofos persisten frecuentemente (es decir, sobreviven sin crecimiento) durante un periodo de tiempo corto en ausencia de la sustancia orgánica requerida, el mantenimiento de la colonización auxotrófica requiere suplementos periódicos con sustancia orgánica.

Por ejemplo, la bacteria auxotrófica D-alanina requiere suplementos de D-alanina periódicos para crecer y mantener la colonización de un nicho, tal como la cavidad oral. Porque los mamíferos no producen D-aminoácidos normalmente, y la D-alanina no se secreta normalmente por organismos de la flora normal, la D-alanina no puede adquirirse por un auxótrofo D-alanina a partir del ambiente normal de la cavidad oral del huésped. Así, el uso de auxótrofos en el método terapéutico de la invención proporciona la ventaja que la colonización oral mediante S. mutans recombinante se puede interrumpir ocultando el suplemento orgánico específico, por ejemplo, suplemento de D-alanina.

Los auxótrofos bacterianos pueden generarse usando una variedad de técnicas bien conocidas en la materia, como mutagénesis química, selección de mutantes espontáneos, y/o técnicas recombinantes (por ejemplo, mutagénsis de transposón, sustitución mediante recombinación con un gen no funcional o defectivo) (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Preferiblemente las cepas S. mutans auxotróficas se generaron mediante cualquier selección de mutantes espontáneos, o mediante métodos recombinantes (por ejemplo, introducción de un defecto en una ruta de síntesis para un D-aminoácido). Preferiblemente, cepas S. mutans autotróficas en D-alanina se generaron por introducción de un defecto en el gen que codifica la alanina racemasa, el enzima que convierte la L-alanina a D-alanina. Se clonaron los genes que codifican la alanina racemasa de varias bacterias diferentes (Bacillus stearothermophilus, Tanizawa et al, (1988) Biochem, 27:1311-16; Bacillus subtilis, Ferrari et al., Subtilis (1985) Biotechno. (NY) 3:1003-7; E.coli, Lobocka, (1994), J.Bacteriol, 176:1500-10; Salmonella typhimurium, Galakatos et al., (1986) Biochem. 23:3255-60; y Salmonella typhimurium, Wasserman et al., (1984) Biochem 23:5182-7).

Composiciones farmacéuticas que contienen S. mutans recombinante de la invención

Una composición farmacéutica es una composición apropiada para la administración oral de una cepa S. mutans recombinante de la invención a un paciente susceptible a la caries dental. En general, las composiciones farmacéuticas de la invención se componen de una cepa S. mutans recombinante y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Un "vehículo aceptable farmacéuticamente" se refiere a un vehículo para la distribución de una cepa S. mutans recombinante en la cavidad oral del huésped, en que el vehículo es compatible con ambas viabilidades, la de las células bacterianas y las células del huésped. Vehículos aceptables farmacéuticamente adecuados para el uso en la administración de la cepa S. mutans recombinante viable de la invención son bien conocidos por aquellos experimentados en el campo. La selección de un vehículo aceptable farmacéuticamente dependerá además de una variedad de factores incluyendo la cepa S. mutans recombinante que se administra, y la formulación usada para distribuir el S. mutans recombinante.

Vehículos aceptables farmacéuticamente adecuados para el uso con las cepas S. mutans recombinantes de la invención incluyen, pero no se limitan, a soluciones salinas tampón (por ejemplo, solución tampón de fosfatos), medio de cultivo aceptable farmacéuticamente (por ejemplo, caldo de Luria, caldo de infusión de corazón-cerebro (BHI), o otras soluciones que mantienen la viabilidad de la bacteria. Adicionalmente, tales vehículos aceptables farmacéuticamente pueden ser soluciones no acuosas o acuosas, suspensiones y emulsiones. Una variedad de vehículos aceptables farmacéuticamente para la administración oral de bacterias liofilizadas o viables son bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. 18th ed., Gennaro, ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, incorporadas aquí por referencia, y la composición farmacéutica LACTINEX ™, una formulación disponible comercialmente para la administración oral de Lactobacillus viable).

Las cepas de S. mutans recombinante de la invención se pueden formular en cualquiera de una variedad de composiciones apropiadas para administración oral. Por ejemplo, la cepa de S. mutans recombinante se puede formular para administración como un liofilizado o pasta celular preparada a partir de un cultivo de S. mutans recombinante, o el cultivo de S. mutans recombinante se puede administrar directamente a la cavidad oral. La cepa de S. mutans recombinante también se puede administrar en forma de enjuague bucal, pasta de dientes, hilo dental, chicles, o comprimidos masticables.

La composición farmacéutica puede contener adicionalmente nutrientes para mantener la viabilidad de la bacteria en la composición. La composición farmacéutica puede también contener agentes aromatizantes, agentes colorantes, fragancias, u otros compuestos que incrementan el sabor de la composición y/o realzar la conformidad del paciente sin comprometer la efectividad de la composición. Los métodos para la preparación de formulaciones para la administración oral son bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Reminghton's Pharmaceutical Sciences 18th ed., supra, incorporada aquí por referencia).

Composiciones para el mantenimiento de S. mutans recombinante auxotrófico de la invención

La colonización de la cavidad oral mediante cepas S. mutans autotróficas, recombinantes debería mantenerse mediante la administración periódica de la sustancia orgánica para la que la cepa es auxotrófica. En la ausencia prolongada de la sustancia orgánica, los auxótrofos cesarán el crecimiento y la cepa no colonizara persistentemente mucho tiempo la cavidad oral. Por ejemplo, en ausencia de D-alanina, los auxótrofos D-alanina experimentan lisis debido a una pared celular debilitada. El uso de S. mutans recombinante auxotrófico en el método terapéutico de la invención suministra un mecanismo "infalible" para eliminar la cepa en el caso de cualquier efecto adverso no deseado. Sin embargo, debido a que las cepas S. mutans recombinantes de la invención son similares a las cepas S. mutans indígenas que colonizan normalmente la cavidad oral, la posibilidad de efectos adversos indeseables es baja.

El mantenimiento de la colonización de la cavidad oral mediante cepas S. mutans recombinantes auxotróficas de la invención puede lograrse mediante la administración oral de una cantidad que mantiene el auxótrofo de la sustancia orgánica para la que la bacteria es auxotrófica. Una "cantidad que mantiene el auxótrofo bacteriano" es una cantidad de una sustancia orgánica suficiente para mantener la supervivencia del auxótrofo bacteriano en la cavidad oral del huésped. Por ejemplo, donde el S. mutans recombinante es auxotrófico para D-alanina, una "cantidad que mantiene el auxótrofo bacteriano D-alanina" es una cantidad de D-alanina suficiente para que pueda sobrevivir la cepa auxotrófica D-alanina en la cavidad oral del huésped. En general, una dosis única que contiene la cantidad de D-alanina que mantiene el auxótrofo de D-alanina contiene de alrededor de 1 mg a 100 mg, preferiblemente de alrededor de 5 mg a 75 mg, mucho más preferiblemente de alrededor de 10 mg a 50 mg, mucho más preferiblemente de alrededor de 20 mg a 25 mg de D-alanina. La concentración de D-alanina en la composición farmacéutica en forma de una solución comprende de alrededor de 0,01 mg/mL a 167 mg/mL (la última será una solución saturada de D-alanina en agua a 25ºC), preferiblemente a partir de 0,1 mg/mL a 50 mg/mL, más preferiblemente de alrededor de 1mg/mL a 25 mg/mL. Las concentraciones de D-alanina en la composición farmacéutica pueden variar de acuerdo al vehículo usado y el punto de saturación de la D-alanina en el vehículo específico.

La sustancia orgánica requerida para el mantenimiento de S. mutans recombinante autotrófico en la cavidad oral puede formularse mediante una variedad de vías. Por ejemplo, donde S. mutans recombinante es auxotrófico para D-alanina, la composición para el mantenimiento del auxótrofo D-alanina puede formularse como un enjuague, goma de mascar, hilo dental, pasta de dientes, comprimidos masticables, o cualquier otra formulación adecuada para la administración oral a la cavidad oral del huésped. Además de la sustancia orgánica (por ejemplo, D-alanina), la composición puede contener adicionalmente agentes aromatizantes, agentes colorantes, fragancias, u otros compuestos que incrementan el sabor de la composición y/o potencian la conformidad del paciente sin comprometer la efectividad de la sustancia orgánica contenida en la composición.

Las composiciones farmacéuticas formuladas para la administración oral de la cepa de S. mutans recombinante de la invención y, donde se desee, su mantenimiento en la cavidad oral debe desarrollarse dentro de las características intrínsecas de la cavidad oral y cualquier flora bacteriana normal deseable que colonice la cavidad oral. Los métodos para la preparación de adecuadas formulaciones para la administración oral son bien conocidas en el campo (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciencies, 18th ed., Gennaro, ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, incorporada aquí a modo de referencia).

Administración

Las cepas S. mutans recombinantes de la invención se pueden administrar a cualquier huésped susceptible de caries dental, preferiblemente un huésped en el que S. mutans puede colonizar la cavidad oral, preferiblemente un huésped mamífero (por ejemplo, humano, canino, equino, felino, ovino, etc.,) más preferiblemente un huésped humano. Las cepas de S. mutans recombinante pueden administrarse al huésped de cualquier edad, por ejemplo, niño, adolescente, o adulto.

Las cepas S. mutans recombinante de la invención pueden administrarse oralmente en una variedad de vías. Por ejemplo, las cepas S. mutans recombinantes pueden administrarse en forma de suspensiones, comprimidos masticables, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida (por ejemplo, un implante oral que contiene la cepa S. mutans recombinante) o polvos liofilizados. Las cepas S. mutans recombinantes se pueden administrar mediante la aplicación directa de un liofilizado, cultivo o pasta de células en la dentadura del paciente. Cualquier modo de administración es adecuado tanto tiempo como la composición terapéutica se aplique a la cavidad oral. Preferiblemente, S. mutans recombinante se administra por aplicación de una suspensión celular bacteriana directamente a la dentadura del paciente, por ejemplo, mediante cepillado y limpieza con hilo dental.

En general, la cantidad de S. mutans recombinante administrada a un paciente será una cantidad efectiva para el reemplazo de las cepas S. mutans que causan caries en la cavidad oral del huésped. "Una cantidad efectiva para el reemplazo de las cepas S. mutans que causan caries dental en la cavidad oral del huésped" se refiere a una cantidad efectiva para la colonización de la cavidad oral mediante la cepa S. mutans recombinante, y la eliminación de la cepa S. mutans residente productora de ácido láctico y causante de caries dental (por ejemplo, por competición entre la bacteria para los nutrientes y/o para la producción de una bacteriocina para la cepa S. mutans recombinante). El término "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición farmacéutica de la presente invención se refiere a unidades discretas físicamente adecuadas como dosis unitaria para el sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo (por ejemplo, S. mutans recombinante viable) calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, transportador, o vehículo.

Dosis específicas pueden variar ampliamente de acuerdo a varias variables de los pacientes incluyendo, talla, peso, edad, gravedad de la enfermedad (por ejemplo, la tenacidad y/o cantidad de ácido láctico producido, S. mutans residente causante de caries dental) y grado de reacción a la terapia (por ejemplo, la susceptibilidad de la cavidad oral del huésped a la colonización). Los métodos para determinar las vías apropiadas de administración y dosis son generalmente determinadas basándose en cada caso por el dentista u otro clínico. Tales determinaciones son rutinarias para uno experimentado ordinariamente en la materia (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. 18th ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990).

En general, el número de S. mutans recombinante administrado al paciente será del rango de alrededor de 10^{2} a 10^{15} bacterias, preferiblemente de alrededor de 10^{3} a 10^{14} bacterias, más preferiblemente de alrededor de 10^{5} a 10^{12} bacterias, normalmente alrededor de 10^{11} bacterias. Las dosis apropiadas para la administración pueden extrapolarse fácilmente a partir de dosis suficientes para la colonización de Streptococcus ssp. de la cavidad oral en un modelo animal, por ejemplo, colonización de S.rattus de la cavidad oral de las ratas. Las dosis apropiadas pueden estimarse también a partir de dosis apropiadas para la colonización de la cavidad oral humana mediante la cepa JH1000 de S. mutans que produce bacteriocina, y variantes de la misma que expresan niveles variables de la actividad bacteriocina (Hillman et al., 1987, J.Dent. Res. 66:1092-0194, incorporada aquí a modo de referencia).

Múltiples dosis de la cepa S. mutans recombinante se pueden administrar para conseguir la colonización de la cavidad oral y sustitución de la cepa S. mutans que causa caries dental residente en el huésped. En general, las cepas S. mutans recombinantes de la invención necesitan sólo administrarse al paciente una vez. Donde la cepa S. mutans recombinante es un auxótrofo, la colonización de la cepa deberá mantenerse por la administración de una composición que contiene la sustancia orgánica apropiada. Por ejemplo, donde la cepa S. mutans recombinante es un auxótrofo D-alanina, la D-alanina debe administrarse para la colonización persistente de la cavidad oral. D-alanina, o otras sustancias orgánicas apropiadas, se administran generalmente al menos una vez a la semana, preferiblemente al menos una vez al día, más preferiblemente al menos dos veces al día, y puede administrarse como parte del cuidado dental rutinario de los pacientes, por ejemplo, como un componente de la pasta de dientes, hilo dental, o enjuague bucal.

La colonización exitosa de la cavidad oral del huésped por la cepa S. mutans recombinante se establecerá mediante el cultivo de las bacterias de la cavidad oral del paciente, e identificando la cepa recombinante mediante, por ejemplo, la producción de ADH recombinante, producción de bacteriocina, ELISA, crecimiento en un medio indicador del pH selectivo, u otro método bien conocido en la materia para la identificación de cepas bacterianas.

Los siguientes ejemplos se entienden para ilustrar pero no para limitar la invención. Mientras que son típicos de aquellos que deberían usarse, otros procedimientos conocidos por aquellos experimentados ordinariamente en la materia pueden ser usados alternativamente.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y métodos Cepas bacterianas, plásmidos, y condiciones de crecimiento

Se describieron previamente los métodos para generar la cepa CH4ts de S. mutans (Chen et al, 1994, J. Bacteriol., 176:1542-1545) y aislamiento de la cepa NG8 de S. mutans (Lee et al, 1989, Infect. Immun., 573306-3313) La cepa DH5\alpha de E. coli, usada para clonar, está disponible públicamente. La construcción del plásmido pLO1276 (Conway et al, 1987, J.Bacteriol., 169:949-954) que contiene clonado el gen (PDC) descarboxilasa piruvato de Zymomonas mobilis, el plásmido pLO1286 (Conway et al., 1987, J.Bacteriol., 169:2591-2597) que contiene el gen (adh) de la alcohol deshidrogenasa II de Z. mobilis, pCR3-8 plásmido basado en pCR2 que contiene el gen spaP de S. mutans clonado (Crowley et al, 1995, J.Dent. Res., 74, No. Abstract 1511) y el plásmido pVA981 que contiene un gen de resistencia a la tetraciclina derivado de S. mutans (Tovian et al., 1984, J.Bacteriol., 160:556-563) que se describió previamente. Cada una de las referencias citadas anteriormente se incorporara aquí a modo referencia a las descripciones respectivas de la construcción de los plásmidos indicados, y la generación y aislamiento de las cepas narradas.

Cultivos continuos y descontinuos de CH4ts crecieron en el medio definido de Carlsson (Carlsson et al, 1970, Caries Res., 4:297-304) suplementado con triptona 0,5% y glucosa 1%. Las células para el ensayo de la actividad ADH crecieron en un caldo Todd-Hewit suplementado con glucosa al 1%. Se usó ampicilina (50 \mug/ml), tetraciclina (10 \mug/ml), y eritromicina (5 \mug/ml) donde fue apropiado.

Ensayos de cultivos

Muestras del cultivo continuo y descontinuo se extrajeron a los tiempos indicados, y se determinaron sus pHs y absorbancias a 550 nm. Se extrajeron las células por centrifugación a 4ºC y el resultado de los licores de células libres se ensayó enzimáticamente (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para glucosa, etanol, ácido láctico y por cromatografía líquida de gas (Hillman et al, 1987, Infect. Inmun., 55:1399-1402) para acetoína. Los sedimentos de células se lavaron una vez por centrifugación con tampón fosfato (PBS) y se ensayaron químicamente (Friedmann et al., 1957, en: S.P. Colowick y N.O Kaplan (ed). Methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, p.414-418) para determinar las concentraciones de piruvato intracelulares. Los datos presentados en las figuras son la media de los experimentos por duplicado.

Ensayo para la actividad de la alcohol deshidrogenasa

Las células de los cultivos de 200 ml de toda la noche de las cepas de S. mutans y E. coli se recuperaron por centrifugación a 4ºC y se lavaron dos veces en tampón de KPO_{4} 100 mM (pH 8,5). Los pellets de las células se resuspendieron en 1 mL de tampón y se rompieron haciéndolas pasar a través de una prensa francesa a 15,000 psi. Los restos de las células se extrajeron por centrifugación a 4ºC durante 30 minutos. Los extractos de células libres se guardaron en hielo y se ensayó la oxidación dependiente de NAD del etanol de acuerdo con los métodos de Neale et al. (Neal et al., 1986, Eur. J.Biochem., 154:119-124).

Ensayo para la actividad de la lactato deshidrogenasa

Los ensayos de la actividad LDH se realizaron como se describió previamente (Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295). En breve, la actividad LDH se ensayó como la oxidación dependiente de fructosa-1,6-difosfato, (FDP) y piruvato del NADH medido a 340 nm con un espectrofotómetro. La mezcla de reacción contenía 100 \mumol de fosfato potásico, pH 6,2, 10 \mumol de piruvato sódico, y 1-5 \mul de la muestra se ensayaran en un volumen final de 1 mL. Los niveles del trasfondo de la actividad se midieron durante 1 min, y luego la reacción se inició mediante la adición de 20 \mumol de FDP.

Ejemplo 2 Clonación del gen estructural de Zymomonas mobilis adh para la expresión en S. mutans

El plásmido pADH que contiene el marco de lectura abierto de Z. mobilis adh fusionado con la secuencia reguladora del gen de S. mutans spaP. Se construyó el pADH mediante el plásmido de digestión primero pCR3-8 con SacI y DraIII, y luego tratando el DNA digerido con nucleasa de judía Mung para extraer el gen spaP entero excepto para este promotor, el sitio de unión al ribosoma, y 52 bases del extremo 5' del marco de lectura abierto. Un fragmento de 4,2 kb del plásmido pCR3-8 linealizado se recubrió mediante electroforesis en gel de agarosa.

Se usó la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar el marco de lectura abierto entero del gen Z. Mobilis adh excepto para el codón de inicio de la traducción (ATG) más una base (G) adicional del plásmido pL01286 usando los cebadores sintéticos (ID. de SEC NO:3) (5'CTTCTTCAACTTTTTATSTTCCTTTCG) hacia delante y (5'CGGAGGCATTGTTTG (ID. de SEC. NO:4) reverso. El fragmento amplificado se recuperó mediante electroforesis en gel de agarosa, se trató con nucleasa de judía Mung y quinasa de polinucleótido, y ligado dentro del fragmento pCR3-8 para formar la fusión traduccional con spaP. El plásmido resultante, pADH se usó para transformar las células DH5\alpha de Escherichia coli. Se seleccionaron los transformantes en medio LB que contenía ampicilina. El tamaño adecuado y la orientación del inserto pADH se confirmaron mediante análisis con enzimas de restricción.

En una preparación para clonar en S. mutans, se convirtió pADH a pADH-tet insertando el fragmento HincII de 3,5 kb de pVA981 que contiene un gen de resistencia a la tetraciclina derivado de S. mutans (Tobian et al., 1984, J.Bacteriol., 160:556-563) en el sitio ScaI de pADH. El constructo pADH-tet se usó para transformar DH5\alpha, y los transformantes seleccionados del caldo de Luria (LB) con tetraciclina se probaron para la sensibilidad a la ampicilina. Se transformó S. mutans con pADH-tet usando métodos de Perry y Kuramitsu (Perry et al., 1981, Infect. Immun., 32:1295-1297).

Ejemplo 3 Efectos de la concentración de glucosa sobre el crecimiento de CH4ts y NG8 en cultivos discontinuos

Los cultivos discontinuos durante toda la noche de CH4ts(idh^{ts}) y sus parientes NG8 S. mutans, crecieron a 30ºC. CH4ts contiene una mutación sensible a la temperatura de la lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH de CH4ts se comporta como tipo salvaje a 30ºC, pero una vez alcanza un cambio de temperatura de cultivo a 42ºC, la LDH lábil al calor es inactiva. Esta cepa así permite experimentos para determinar el papel de la LDH en la letalidad de LDH-mutantes de S. mutans. Las células lavadas se diluyeron 1:1,000 en medio fresco con y sin glucosa y se incubaron a 42ºC en un baño de agua. Al mismo tiempo que se indica en la Fig. 2 (Panel A), el contaje de células viables se determinó mediante muestras dispersadas en placas de infusión de corazón cerebro (BHI) e incubando las placas a 30ºC. Los resultados mostraron que en ausencia de glucosa (línea de puntos), CH4ts (triángulos abiertos) y NG8 (círculos abiertos) se comportaban idénticamente; crecimiento cesado después de 3 horas y se siguió mediante muerte celular lenta (vida media = 23,5 horas). Aunque, se diferencian de sus padres (cuadrados abierto), CH4ts (círculos abiertos) paró el crecimiento a las 3 horas de situarse en la presencia de glucosa (líneas sólidas) y se experimentó una muerte celular acelerada (vida media = 12,1 horas). Esta diferencia temporalmente correlativa con la acumulación de concentraciones intracelulares elevadas de piruvato en el mutante (Fig.2, Panel B).

Ejemplo 4 Efecto de la glucosa y temperatura sobre el crecimiento y concentración del producto final en CH4ts y NG8 en cultivo continuo

Creció CH4ts hasta saturación a 30ºC en el vaso de reacción de un quimiostato. El medio de flujo suministró una proporción de dilución de 0,1 h^{-1} se mantuvo durante 72 hrs antes de que la temperatura del cultivo cambiara a 42ºC. En 3 horas, la densidad celular empezó a declinar a una proporción equivalente a la proporción teórica de lavado, indicando un cese del crecimiento celular (Fig. 3). Esto correlacionó con un incremento de la concentración de glucosa observado en el vaso de reacción.

Cuando el experimento del cultivo continuo se repitió usando una proporción de dilución de 0,006 h^{-1}, se logró el crecimiento estable de CH4ts cuando la temperatura cambió a 42ºC (Fig. 4). Siguiendo inmediatamente el cambio de temperatura, las concentraciones de ácido láctico descendieron de acuerdo con la proporción de lavado predicha. El cese de la producción de lactato se acompañó por la iniciación de etanol y la producción de acetoína, resultando en un incremento gradual del pH del cultivo continuo. Las concentraciones de glucosa se mantienen indetectables durante el experimento.

Estos datos muestran que el crecimiento estable de CH4ts a 42ºC puede alcanzarse en un cultivo continuo bajo condiciones limitantes de glucosa. Bajo condiciones limitantes de glucosa, CH4ts se comportó como mutante deficiente de LDH derivado químicamente de S.rattus (Hillman et al., 1987, Infect. Immun., 55:1399-1402) con respecto al incremento de la producción de acetoína y etanol en lugar de la producción de ácido láctico. Estos resultados de acuerdo con los estudios de fermentación y enzimología que indican que los S. mutans tenían vías alternativas reguladas para el metabolismo del pirivato. Bajo condiciones apropiadas de cultivo, S. mutans de tipo salvaje produce cantidades sustanciales de formiato, acetato, etanol y acetoína (Yamada et al., 1975, J.Bacteriol., 124:55-61; Hillman et al., 1987, Infect. Immun., 55:1399-1402) además de lactato. Aunque estas vías alternativas son aparentemente insuficientes para compensar la ausencia de la actividad LDH.

Ejemplo 5 La producción de LDH rescata la letalidad de LDH^{-} en S. mutans

Las cepas de E. coli DH5\alpha transformadas con pADH, que contiene el marco de lectura abierto de Z. mobilis adh fusionado a la secuencia reguladora spaP de S. mutans, que expresa la actividad ADH clonada (actividad específica de 6,95 \mumol/min/mg de proteína). Este resultado está de acuerdo con los datos publicados previamente que indican que el promotor spaP y el sitio de unión al ribosoma (rbs) son activos en E. coli (Lee et al, 1988, Infect. Immun., 56:2114-2199). El nivel de la actividad de ADH fue de aproximadamente del 17% del encontrado en DH5\alpha transformado con PLO1286 (actividad específica 41,8 \mumol/min/mg de proteína), que tenía el gen adh clonado original y las secuencias reguladoras de Z. mobilis. La interrupción del gen de resistencia a la ampicilina en el esqueleto pCR2 por inserción del gen de resistencia a la tetraciclina a partir de pVA981 (pADH-tet) no afecta al nivel de actividad de ADH.

Un microgramo de p ADH-tet se usó para transformar CH4ts. La recombinación de tipo Campbell instaló la fusión spaP::adh en el cromosoma de CH4ts. El sitio de inserción no se identificó, pero parecía ser una región de homología suministrada por cualquier spaP o el gen adh endógeno. Se seleccionaron CH4ts transformadas mediante crecimiento a 42ºC en un medio que contiene tetraciclina. A partir de varios centenares de clones que se alcanzaron, un aislado purificado llamado CH4ts::adh contiene actividad ADH más sustancialmente (actividad específica, 60,43 \mumol/min/mg de proteína) que es el abuelo NG8 de tipo salvaje (actividad específica, < 1,0 \mumol/min/mg de proteína).

CH4ts::adh y NG8 crecieron a 42ºC durante 48 horas en un caldo Todd-Hewitt suplementado con glucosa al 2%. Los licores de cultivos de células libres de CH4ts::adh tenían un pH (4,7) y un contenido en etanol (21,60 mM) significativamente superiores a los de los líquidos de cultivo realizados de NG8 (4,0 y <1 mM). Resultados idénticos se obtuvieron cuando se usaron concentraciones (5, 10 o 20%) superiores de glucosa.

El crecimiento de CH4ts::adh a 42ºC en medio definido suplementado con triptona al 0,5% y varias trazas de carbono al 1% se comparó con NG8 (Tabla 1)

(Tabla pasa a página siguiente)

1

Las proporciones y los rendimientos son comparables cuando la glucosa, lactosa o sacarosa sirven como fuente de carbono. CH4ts::adh tenían tiempos dobles menores y rendimientos superiores que NG8 cuando se usaba galactosa, sorbitol y manitol como fuente de carbono. No se detectó ácido láctico en los licores de cultivo de CH4ts::adh creciendo en cualquiera de las fuentes de carbono, y etanol se presentó en cantidades mucho más grandes que se encontraron en licores de cultivo de NG8.

Estos datos muestran que la cepa de S. mutans recombinante CH4ts::adh exhibe niveles superiores sustancialmente de actividad ADH que la cepa control de tipo salvaje NG8 bajo condiciones idénticas de crecimiento. Además, los transformantes de CH4TS crecieron a temperatura no permisiva, indicando que la actividad ADH clonada evitó el bloqueo metabólico causado por la deficiencia de LDH.

Estos datos además muestran que las proporciones de crecimiento y los rendimientos de crecimiento de CH4ts::adh y NG8 fueron similares cuando glucosa, lactosa o sacarosa sirvieron como fuente de carbono, y los rendimientos de crecimiento fueron también comparables. Aunque, NG8 creció pobremente en ambos, manitol y sorbitol, bajo condiciones aeróbicas, pero CH4ts::adh creció bien. Estos resultados indican que la actividad ADH clonada suministra suficiente producción de etanol para servir como un sitio adecuado para el exceso de electrones generados durante el metabolismo del poliol. NG8m también crece pobremente en galactosa. No está claro porque CH4ts::adh muestra mejor crecimiento que NG8 en esta fuente de carbono que se metaboliza vía la ruta tagatosa-6-fosfato en S. mutans (Hamilton et al, 1979, J.Bacteriol., 140:1102-1104), particularmente desde que su crecimiento en lactosa es comparable.

Ejemplo 6 Producción de piruvato descarboxilasa no rescata la letalidad de LDH^{-} en S. mutans

Un estudio similar al descrito en los Ejemplos 2-5 se realizó para determinar si un defecto en LDH puede remitirse mediante la producción de piruvato descarboxilasa. El gen de la piruvato descarboxilasa (pdc) de Z. mobilis (Conway et al, 1987, J.Bacteriol., 169:949-954) se fusionó al spaP y se introdujo en CH4ts en un vector suicida como se describe para el gen de Z. mobilis adh. Los transformantes que expresan PDC resistentes a la tetraciclina se aislaron y probaron para el crecimiento a temperatura de 42ºC no permisiva como se describió anteriormente. LDH^{-} S. mutans que expresa la actividad PDC clonada no creció a una temperatura no permisiva. Estos resultados indican que la letalidad del defecto LDH^{-} en S. mutans no se puede rescatar mediante la producción de PDC. Además, estos datos indican que la concentración de ADH no se saturó en el metabolismo del piruvato en mutantes deficientes de LDH de S. mutans.

Ejemplo 7 Aislamiento de JH1000 y variantes JH1000 que producen niveles aumentados de la actividad bacteriocina

El aislamiento de S. mutans JH1000 se describió (Hillman et al., 1984, Infect. Immun., 44:141-144). Pronto, se identificó a partir de los aislados frescos de estreptococos mutans obtenidos a partir de 115 sujetos en agar mitis salivarius que contiene bacitracina. JH1000 inhibió el crecimiento de todos las otras cepas de S. mutans, como un gran número y variedad de cepas de laboratorio en un ensayo de antagonismo aplazado. La evidencia indica (Hillman et al, 1984, Infect. Immun., 44:141-144) que JH1000 produce un compuesto pequeño (menor de 1.000 Da) del tipo bacteriocina, del tipo estable a antibiótico que actualmente se caracterizará. Este compuesto se denominó S. mutans bacteriocina. Los ensayos microbiológicos y serológicos confirmaron que JH1000 es un representante de las especies S. mutans. Variantes de las cepas susceptibles de bacteriocina, cualquiera que aparezca naturalmente o generada mediante mutagénesis química, que son resistentes a las propiedades de matanza de la bacteriocina aún no ha sido identificado. Este resultado indica que, a diferencia de la mayoría de antibióticos, el riesgo de super-infección por de cepas (causantes de enfermedad) de tipo salvaje resistentes es mínimo.

La cepa JH1000 se sometió a mutagénesis química usando metanosulfonato de etilo (EMS) de acuerdo con los métodos bien conocidos en el campo (Hillman 1978, Infect. Immun., 21:206-212). JH1005 es una variante inducida de EMS ejemplar de JH1000. Variantes que producen niveles elevados de bacteriocina se identificaron por crecimiento de un caldo de cultivo de la cepa a ensayar durante 8 horas o más. El cultivo se centrífugo para extraer las células bacterianas, y muestras de 20 \mul del sobrenadante del cultivo se diluyeron seriadamente en pocillos de una placa microtitulada. 100 \mul de la parte superior del agar que contiene una cepa diana (normalmente S.rattus BHT-2, Str^{R}) y 1 mg/mL de estreptomicina se añadieron a cada pocillo. Tras la incubación durante toda la noche, se determinó la dilución más baja que previno el crecimiento de la cepa indicadora.

Usando este método de cubierta, variantes derivadas de EMS (JH1005) y espontáneas (JH1140) se encontraron que produjeron aproximadamente niveles elevados 3 veces de la actividad tipo bacteriocina. JH1000, así como las variantes JH1000, producen ácido láctico, y así no son adecuadas para terapias de reemplazo para la prevención y/o tratamiento de la caries dental.

Ejemplo 8 Colonización de la cavidad oral humana por variantes S. mutans JH1000

Se ha descrito la colonización de la cavidad oral de roedores y humanos mediante variantes JH1000 con actividad bacteriocina incrementada (Hilman et al., 1987, J.Dent. Res., 66:1092-1094). En breve, las variantes de JH1000 o JH1000 se aplicaron a los dientes de voluntarios humanos usando un régimen de infección que implica una prevención dental estándar, seguido por cepillado y lavado de los dientes con hilo dental con una suspensión de células que contiene alrededor de 10^{11} bacterias JH1000 o bacterias variantes de JH1000.

El nivel de actividad de bacteriocina y la capacidad de colonizar la cavidad oral se correlacionó fuertemente. Durante un periodo de 1 año tras la infección con la cepa JH1005, los mutantes indígenas de estreptococos mutans se sustituyeron gradualmente por JH1005. Además, el número total de estreptococos mutants decreció significativamente en dos o tres de los sujetos ensayados.

Ejemplo 9 Generación de mutantes recombinados de S. mutans usando el transposón de mutagénesis de la cepa de S. mutans

El plásmido pTV1-OK es un derivado repA(ts) del plásmido pWV01 de Lactococcus lactis (Leenhouts et al, 1991, Plasmid, 26:55-66) para la replicación condicional en ambos E. coli y S. mutans. Estos poseen un gen de resistencia a la kanamicina en el esqueleto del plásmido que se expresa en ambos E. coli y S. mutans y el transposón Tn917 que confiere resistencia a la eritromicina en S. mutans.

El plásmido pTV1-OK se introdujo en la cepa JH1005 de S. mutans y las células transformadas se seleccionaron a 28ºC en BHI agar que contiene kanamicina. La transformación de JH1005 con 1 mg de DNA pTV1-OK proporciono cuatro transformantes resistentes a la kanamicina, que está de acuerdo con las frecuencias de transformación a partir de experimentos tempranos (Hillman et al., 1994, Infect. Immun., 62:60-64). Se generaron combinados independientes de inserciones Tn917 en el DNA cromosomal mediante cambio de temperatura (45ºC) como se describió por Camilli et al. (1990, J.Bacteriol, 172:3738-3744). Pronto, el crecimiento de cultivos saturados en presencia de kanamicina a la temperatura permisiva (28ºC) se subcultivaron 1/50 o 1/100. Seguido de un cambio a 45ºC e incubación toda la noche, los insertos de Tn917 dentro del cromosoma del huésped se aislaron mediante muestras en placas en BHI agar que contienen concentraciones selectivas de eritromicina. Se encontró que 10^{5} de 10^{9} unidades formadoras de colonias totales retenían su resistencia a este antibiótico. Noventa de 100 colonias de resistencia a la eritromicina escogidas al azar mostraron por réplica de la copia ser sensibles a kanamicina. Este hallazgo indica que el 90% de los clones resistentes a la eritromicina fueron el resultado de la pérdida coincidente de pTV1-OK y la transposición de Tn917 dentro del cromosoma JH1005. El análisis Southern blot de mutantes resistentes a la eritromicina seleccionados al azar sugirió que la transposición Tn917 fue al azar y resultó en inserciones cromosómicas únicas. El análisis Southern blot también indica que el 10% de los clones resistentes a la kanamicina/ resistentes a la eritromicina fueron el resultado de las fusiones de replicón que se instalaron en el plásmido pTV1-OK entero en el cromosoma JH1005.

Combinados independientes de los clones sensibles a kanamicina se filtraron para la producción de bacteriocina, sensibilidad a la glicina 1%, y sensibilidad ácida, y incapacidad de crecimiento anaeróbico en manitol o en ausencia de suplementos de D-alanina. Los mutantes en cada categoría se aislaron en los rangos de frecuencia de 1 a 2 x 10 ^{-3}.

El análisis de Southern blot de dos mutantes deficientes de bacteriocina indicaron la existencia de al menos dos genes no enlazados implicados en la producción de bacteriocina y al menos tres locus genéticos no enlazados implicados en la sensibilidad ácida. Además de la introducción de los alelos de sensibilidad ácida inducida por Tn917 aislados en JH1005 dentro de la transformación natural vía NG8, el transposón (que codifica resistencia a eritromicina) se co-insertó con el fenotipo mutante a frecuencias altas. Esta unión indica que la lesión inducida por Tn917 fue responsable de los fenotipos mutantes). Combinaciones de mutantes de Tn917 se obtuvieron en NG8 cepas transformadas naturalmente con frecuencias de transposición similares y eficiencias de pérdida del plásmido tras la el cambio de temperatura.

Un gen implicado en la producción de bacteriocina se clonó en E.coli usando una técnica de rescate de marcador. El DNA cromosómico del mutante se digirió hasta completarse con EcoRI (que no corta dentro de Tn917) y se ligó en el sitio EcoRI en la secuencia de clonación múltiple de pUC19. La librería se transformó en MC1061 con selección para la resistencia a la ampicilina, y se alcanzaron colonias que se replican en medio con eritromicina. Se alcanzaron dos clones que mostraron que contenían el DNA del plásmido que reaccionó en el análisis dot blot con una sonda Tn917. Estos plásmidos son actualmente secuenciados usando cebadores que leen hacia fuera desde el extremo distal de eritromicina hasta el extremo final de la eritromicina de Tn917.

Esta es la mutagénesis Tn917 usada exitosamente en S. mutans y estreptococos orales. Anomalías previas usando construcciones como pTV1 o pLTV3 (Youngman, 1987, In Plasmids: A Practical Approach, Hardy, ed., IRL Press, Oxford, pgs. 79-103; Camilli et al., 1990, J.Bacteriol., 172:3738-3744) se atribuyeron a la incapacidad del esqueleto del plásmido para replicarse en S. mutans. Usando las funciones replicativas del replicón pWV01Ts de Lactococcus, se encontró que pTV1-OK era estable manteniendo la temperatura permisiva en S. mutans, por esta razón proporciona oportunidades suficientes para la transposición Tn917 que ocurre a una temperatura no permisiva. Así, el método descrito anteriormente puede usarse para generar cepas de S. mutans auxotróficas, así como otras cepas derivadas de S. mutans que tienen fenotipos deseables, para su uso en la presente invención.

Ejemplo 10 Construcción de una cepa LDH^{-}, ADH^{+}, de S. mutans que produce bacteriocina

El gen Idh de JH10000 se clonó y secuenció (Hillman et al, 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295; Duncan et al., 1991, Infect. Immun., 59:3930-3934). Pronto, el gen Idh JH1000 se clonó en la cepa MC1061 de Escherichia coli usando pBR322 como vector. Un clon, p10-5, que contiene el gen Idh se identificó por hibridación con una sonda de oligonucleótido deducida de la secuencia amino terminal de la proteína LDH purificada de JH1000 (Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58:1290-1295). Estos resultados se verificaron mediante la demostración de la actividad LDH JH1000 en extractos de células en bruto de los transformantes p10-5/MC1061. Se determinaron la secuencia del nucleótidos de la Idh clonada y sus señales reguladoras y marcos de lectura abiertos deducidos. La secuencia del gen Idh JH1000 estaba disponible en GenBank, número de acceso M72545 (descripción LDH SM). Se inactivo el gen Idh clonado mediante digestión de la construcción p10-5 con el enzima de restricción Hpal. Esto resultó en la extracción de 510 bases a partir del marco de lectura abierto de Idh, inactivando así permanentemente el gen. El fragmento de DNA de tamaño apropiado a partir de esta digestión se recuperó mediante electroforesis en gel de agarosa, se trató con nucleasa de judía Mung para producir extremos despuntados, y se desfosforiló por reacción con la fosfata intestinal de ternera.

El marco de lectura abierto entero del gen adh de Z. mobilis (excepto por sustitución de las tres primeras bases con un residuo de guanidina y la adición de un codón transcripcional y traduccional al final del marco de lectura abierto) se amplificó por PCR. Después de la purificación del gel, este fragmento se trató con nucleasa de judía Mung para producir extremos despuntados, y se fosforiló por reacción con la quinasa polinucleótida. Este producto y el producto p10-5 descrito anteriormente se ligó y transformó dentro de E.coli DH5\alpha con selección para la resistencia a ampicilina. Las células permeabilizadas de los clones purificados se cribaron para ver su actividad ADH como se describió anteriormente. Los plásmidos de los clones positivos ADH se purificaron luego y se confirmaron mediante mapeo de restricción para confirmar la construcción genética.

Una construcción genética tal se modifica más a fondo por eliminación del gen de resistencia a ampicilina en el esqueleto de pBR322, y sustitución con el gen de resistencia a tetraciclina pVA981. Se usó esta construcción para transformar JH1140, se seleccionaron los transformantes en un medio que contiene tetraciclina. Son purificados los transformantes heterodiploides que se obtienen, crecieron toda la noche en un caldo Todd-Hewit, y diluciones apropiadas se dispersaron en un medio tetrazolio de glucosa. Después de 3 días de incubación en tubos de ensayo, se obtuvieron colonias rojas, que indican delección de LDH (o indicando la producción de ácido reducida), se aislaron y purificaron como mutantes deficientes de LDH-putativo.

El fenotipo y genotipo de los transformantes se confirmó ensayando los cultivos de caldo de 2 días de antigüedad para ácido láctico y etanol, mediante análisis de Southern blot, y mediante ensayos espectrofotómetricos de extractos de células libres para la actividad de LDH como se describió anteriormente. La producción de ácido láctico en estas cepas se espera que sea indetectable, mientras que el contenido en etanol del medio se espera que sea de alrededor de 25 mM en un caldo que contiene el 1% o más de glucosa. La actividad de la LDH de estos transformantes se espera que sea indetectable.

Las cepas de transformantes se caracterizaron más a fondo examinando el crecimiento de los padres y transformantes en varias fuentes de carbono, con y sin oxígeno. Se espera que los transformantes crezcan como o mejor que la cepa padre en términos de tiempo de generación y rendimiento celular. Las cepas transformantes y padres crecen también en cultivos quimioestáticos con el fin de evaluar exactamente los productos finales de fermentación bajo condiciones diferentes de crecimiento. La cepa transformante se espera que produzca ácido láctico indetectable bajo todas las condiciones de cultivo, y para producir acetoína significativa sólo durante la incubación aeróbica.

El potencial cariogénico del transformante se determina también en un modelo de rata de caries dental usando ratas desinfectadas y/o convencionales. Se espera que el transformante sea virtualmente no cariogénico, mientras que la cepa padre debería producir una alta incidencia y gravedad de lesiones cariadas. Se ensayó también la producción de placas y producción de bacteriocina mediante los transformantes y cepas padre.

Donde las cepas transformantes al menos satisfacen mínimamente las expectaciones descritas anteriormente (es decir, es deficiente en la producción de ácido láctico, y es no cariogénica), el transformante es una cepa S. mutans recombinante adecuada para el uso en la prevención y tratamiento de la caries dental.

\newpage

Las siguientes cepas bacterianas se depositaron en o antes del 7 de Junio, 1995, en the American Type Culture Collection, 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC).

Depósito	No. de Acceso ATCC
JH1000	No. de Acceso 55677
JH1140	No. de Acceso 55676

Este depósito se realizó bajo las previsiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimientos de la Patente y las Regulaciones de más abajo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La bacteria puede estar disponible mediante ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest y el solicitante asegura la disponibilidad no restringida y permanente del los descendientes del cultivo a la emisión pública de la patente de E.E.U.U. pertinente que se pone al alcance del público en cualquier solicitud de patente extranjera de E.E.U.U., siempre que venga primero, y asegure la disponibilidad del progenitor de uno determinado mediante el Comisionado estadounidense de Patentes y Marcas registradas que se titularán aquí de acuerdo a la 35 U.S.C. \NAK122 y las normas del Comisionado consecuentes a éste (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con referencia particular a 886 OG 638). El beneficiario de la presente solicitud está de acuerdo que si el depósito del cultivo muere o se pierde o se destruye cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, se sustituirá pronto en la notificación con un espécimen adecuado del mismo cultivo. La disponibilidad de la cepa depositada no se construyó como una licencia para poner en práctica la invención en contraposición de las directrices concedidas bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de las patentes.

Claims (24)

1. Una cepa de Streptococcus mutans recombinante caracterizada por

(a) una deficiencia en la producción de ácido láctico; y

(b) producción de una alcohol deshidrogenasa recombinante

2. La cepa de la reivindicación 1, en donde la deficiencia en la producción de ácido láctico se debe al defecto en el gen de la lactato deshidrogenasa.

3. La cepa de la reivindicación 1 ó 2, en donde el gen de la alcohol deshidrogenasa recombinante es un gen de la alcohol deshidrogenasa de Zymomonas mobilis o Streptococcus rattus, preferiblemente el gen II de la alcohol deshidrogenasa de Zymomonas mobilis.

4. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que se caracteriza además por la producción de una bacteriocina.

5. La cepa de la reivindicación 4, en donde la bacteriocina tiene un peso molecular menor de 1.000 daltons, y tiene una actividad antibacteriana contra la cepa de Streptocoiccus mutans susceptible a la bacteriocina.

6. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que es auxótrofa para una sustancia orgánica, preferiblemente para un D-aminoácido, y más preferiblemente para D-alanina.

7. La cepa de la reivindicación 6, que contiene un defecto en el gen de la alanina racemasa.

8. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, que deriva de JH1000 o a partir de una variante de la cepa de Streptococcus mutans recombinante de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en donde dicha variante produce una bacteriocina que tiene actividad antibacteriana contra una cepa de Streptococcus mutans susceptible a la bacteriocina.

9. La cepa de la reivindicación 8, en donde dicha variante produce una bacteriocina en un nivel incrementado en relación a JH1000 de Streptococcus mutans.

10. La cepa de la reivindicación 9, en donde dicha variante es JH1140 de Streptococcus mutans o una variante de la misma.

11. JH1140 de Streptococcus mutans que tiene ATCC No. de Acceso 55675.

12. Un método para producir una cepa de Streptococcus mutans recombinante de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 que comprende los pasos de:

(a)

transfomar una cepa de Streptococcus mutans con un gen que codifica la alcohol deshidrogenasa; y

(b)

introducir una mutación en la ruta de síntesis del ácido láctico.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cepa de Streptococcus mutans recombinante de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, opcionalmente en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 además comprende D-alanina.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 ó 14, además comprende un agente potenciador del sabor.

16. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 15, formulada como enjuague bucal, pasta de dientes, goma de mascar, comprimidos masticables, liofilizado, o medio de cultivo.

17. El uso de una cepa de Streptococcus mutans recombinante de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 para la preparación de un medicamento para reducir la incidencia o gravedad de la caries dental.

18. El uso de la reivindicación 17, en donde la cepa de Streptococcus mutans recombinante está contenida en un enjuague bucal, pasta de dientes, goma de mascar, hilo dental, comprimidos masticables, liofilizado, o medio de cultivo.

19. El uso de la reivindicación 17 ó 18, que además comprende usar D-alanina para la preparación de dicho medicamento.

\newpage

20. Una composición para el mantenimiento de un auxótrofo bacteriano de D-alanina en la cavidad bucal de un huésped que comprende D-alanina.

21. La composición de la reivindicación 20, en donde la cantidad para mantener el auxótrofo bacteriano D-alanina es de alrededor de 0,01 mg/mL a 167 mg/mL.

22. La composición de la reivindicación 20 ó 21, en donde la composición además comprende un agente potenciador del sabor.

23. La composición de cualquiera de las reivindicaciones de 20 a 22, formulada como un enjuague bucal, pasta de dientes, goma de mascar, hilo dental, o comprimido masticable.

24. La composición de cualquiera de las reivindicaciones de 20 a 23 en donde dicho auxótrofo bacteriano de D-alanina es un auxótrofo Streptococcus mutans D-alanina.