JP2002542816A

JP2002542816A - フルオロデオキシウリジン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株

Info

Publication number: JP2002542816A
Application number: JP2000615736A
Authority: JP
Inventors: ルビー，デニス・イー; フランク，クリスティン・エイ
Original assignee: シガ・テクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2002-12-17
Also published as: EP1173545A2; DE60031106D1; EP1173545B1; CA2370798A1; WO2000066711A3; ATE341613T1; AU780780B2; AU4368700A; WO2000066711A2; US6312955B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、５-フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）に耐性を有するグラム陽性菌を特長とする。このような細菌は、共生細菌であり、且つ抗生物質耐性でないことが好ましい。抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを用いて、本発明による細菌を形質転換することも可能である。患者における抗原性タンパク質に対する免疫応答を刺激するために、このような形質転換細菌を使用して、ワクチンを調製することができる。本発明は、さらに、ＦＵｄＲに耐性を有するグラム陽性細菌を単離する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景１．発明の分野本発明は、５−フルオロデオキシウリジンに耐性を有するグラム陽性菌菌株、
およびこのような細菌菌株を産生する方法に関する。

【０００２】２．関連技術に関する説明共生グラム陽性菌は、粘膜表面でコロニーを形成したり、分泌ＩｇＡ、ならび
に全身性免疫、これらの生物の表面上に提示される組換え抗原に対する応答を刺
激することができる生ワクチンベクターとして、現在開発中である。このような
有望な生ワクチンデリバリーシステムの候補は、口腔細菌であるストレプトコッ
カス・ゴルドニ(Streptococcus gordonii)であり、これは、大抵の口腔部位でコ
ロニーを形成することができるヒト歯垢の成分である。こうした生物を生ワクチ
ンベクターとして使用することに関連した１つの重要な問題点は、調査研究およ
び臨床試験におけるこれらの組換え生物の操作中に使用するための、非抗生物質
選択可能マーカーを開発すること、ならびに動物試験におけるコロニー形成およ
び起こりうるこうした生物の環境中への分散のモニタリングが必要なことである
。

【０００３】チミジンキナーゼ（ＴＫ；ＥＣ２．７．１．２１）は、チミジンおよびおよ
びＡＴＰからのチミジレート形成を触媒するピリミジンヌクレオチド代謝のサル
ベージ経路における重要な酵素である。先の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の試験でも、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの試験
でも、それらの、ピリミジン類縁体フルオロデオキシウリジンに対する耐性を基
準にして、本質的に遺伝的背景でのｔｄｋ突然変異を選択できることが示唆され
た。ＦＵＤＲは、ＴＫによりリン酸化されて５-フルオロデオキシウリジン一リ
ン酸になると、チミジレートシンセターゼ（チミジレート合成のための新規合成
（de novo)経路における最終酵素である）を阻害すると考えられる。その結果と
して、前もって形成されたチミジンのソースが存在しないことにより、必須代謝
産物であるＴＭＰが細胞から奪われることとなり、従って、ｔｄｋの変異につい
て選択圧となる。事実、先の、ＦＵＤＲ耐性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）単離菌は全て、遺伝子地図上の２７．５分に、１つの遺伝子座にマ
ッピングされる突然変異を有しており、且つチミジンキナーゼ活性が欠如してい
た。このことから、ＦＵｄＲ耐性の通常のメカニズムは、チミジンキナーゼ活性
の欠如であること、およびＥ．ｃｏｌｉのＦＵｄＲ突然変異体における突然変異
は全て、ｔｄｋ遺伝子座で起こることが示唆される。

【０００４】Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉのチミジンキナーゼをコードする遺伝子がクローン化さ
れ、そのヌクレオチド配列が決定されているため、我々は、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉ
ｉのＦＵｄＲ耐性菌株を選択することが可能かどうかを判定し、可能であれば、
最も有力な選択可能マーカーとして評価しようと試みた。

【０００５】発明の概要簡単に説明すると、本発明は、５-フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）耐
性グラム陽性菌を特徴とする。このような細菌は共生的であり、且つ抗生物質耐
性でないことが好ましい。本発明による細菌は、抗原性タンパク質をコードする
ＤＮＡを用いて形質転換することが可能である。患者における抗原性タンパク質
に対する免疫応答を刺激するために、このような形質転換細菌を使用して、ワク
チンを調合することが可能である。

【０００６】本発明は、さらに、ＦＵｄＲ耐性のグラム陽性菌を単離する方法を提供する。

【０００７】本発明の前述および他の目的、以下で明らかになる本発明の利点および特長と
共に、本発明の性質は、本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および添付のク
レームを参照することにより、さらに明確に理解されるであろう。

【０００８】発明の好ましい実施形態の詳細な説明さらに詳細には、本発明は、（１）５-フルオロデオキシウリジン（「ＦＵｄ
Ｒ」）を含む培地で細菌を培養するステップと、（２）ＦＵｄＲの存在下で増殖
する細菌を選択するステップとを含む、ＦＵｄＲ耐性グラム陽性菌の菌株を単離
する方法に関する。

【０００９】本発明の方法で使用する培地は、ブレイン−ハートインフュージョン(brain-h
eart infusion)およびトリプティックソイブロス(tryptic soy broth)からなる
群から選択されることが好ましい。本発明の方法で使用する培地は、約０．５〜
約５０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明の
方法で使用する培地は、約１〜約１０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを含む。培地は、約
１２．５μｇ／ｍｌのウリジンおよび約２μｇ／ｍｌのチミジンをさらに含むこ
とが望ましい。

【００１０】任意のグラム陽性菌を本発明の方法で使用することが可能である。本発明で使
用される細菌は、グラム陽性共生細菌であり、且つ抗生物質耐性でないことが好
ましい。本発明で使用するのに特に好ましい細菌種は、ストレプトコッカス・ゴ
ルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ）である。

【００１１】本発明は、さらに、単離されたＦＵｄＲ耐性グラム陽性菌を提供する。このよ
うな細菌は、本発明の方法で単離してもよく、組換え方法で作成してもよい。本
発明による細菌は、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓｇｏｒｄｏｎｉｉ）等の共生細菌であり、且つ抗生物質耐性でないことが好
ましい。

【００１２】本発明による細菌は、結果としてｔｄｋのＯＲＦに翻訳終止コドンが導入され
るｔｄｋ遺伝子における点突然変異に起因する、ＦＵｄＲ耐性である。このよう
な突然変異は、早発的に終結されたＴＫポリペプチドの発現を招く。本発明の好
ましい実施形態では、上記早期終結ＴＫポリペプチドは、ドメインＶＩＩを欠く
。

【００１３】患者における免疫応答を刺激するために、抗原性タンパク質をコードするＤＮ
Ａを用いて、本発明によるＦＵｄＲ耐性細菌をさらに形質転換することが可能で
ある。好ましい実施形態では、患者における疾患に対する免疫応答を刺激するた
めに、病原性細菌の表面タンパク質をコードするＤＮＡを用いて、ワクチン組成
物で使用する本発明による細菌を形質転換することが可能である。本発明の状況
で使用される用語「患者」は、免疫応答が生じることが望まれる、ヒトを含むが
ヒトに限らない動物を指すと理解される。本発明の特に好ましい実施形態におい
て、ＤＮＡは、米国特許第４，７８４，９４８号および第５，８４０，３１４号
（その内容は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に記載の
連鎖球菌Ｍ６タンパク質、またはそのフラグメントをコードする。たとえば、米
国特許第５，６１６，６８６号、第５，７８６，２０５号および第５，８２１，
０８８号（その内容は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）
に記載の方法を使用して、それらの表面上に異種タンパク質を発現するように
、グラム陽性菌を形質転換することが可能である。

【００１４】本発明の好ましい実施形態をさらに十分に説明するために、以下の実施例を示
す。これらの実施例は、決して、広範囲の本発明を制限するものと解釈すべきで
はない。

【００１５】実施例１この試験では、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉのＦＵｄＲ^r菌株の選択、ならびにそれ
らの遺伝学的特性、生化学的特性および（ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖ
ｏでの）増殖特性の特性決定について説明する。我々は、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ
の自然発生的ＦＵｄＲ耐性菌株が一段階で容易に選択されることを実証し、結果
として生じたｔｄｋ遺伝子座における突然変異の性質を同定し、チミジンキナー
ゼ酵素活性およびチミジン取込みに対するこれらの突然変異の生化学的結果を分
析する。さらに、我々は、ＦＵｄＲ耐性菌株の経口／鼻腔内接種材料を接種した
マウスのコロニー形成は、親Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに匹敵することを示す。

【００１６】実験手順細菌菌株および培養条件Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株Ｖ２８８（ＡＴＣＣ３５
１０５）の自然発生的ストレプトマイシン耐性突然変異体である、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株ＧＰ２０４が、この試験に記載のＦＵｄ
Ｒ^rＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株が選択された親菌株である。テキストに指示され
ている通りに、適当な成分（硫酸ストレプトマイシン、５００μｇ／ｍｌ；ＦＵ
ｄＲ、５０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌウリジンおよび２μｇ／ｍｌチミジ
ン）を加えたブレイン−ハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ；ＤＩＦＣＯ）
またはトリプティックソイブロス（ＤＩＦＣＯ）のいずれかで、３７℃にて、Ｓ
．ｇｏｒｄｏｎｉｉ培養を静的培養として増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＫＹ８
９５（Ｆ-、ｔｄｋ-、１-ｉｌｖ）は、チミジンキナーゼ活性が欠如している。
ＴＫ活性を回復するＥ．ｃｏｌｉｔｄｋ遺伝子を発現するプラスミドを含むＥ
．ｃｏｌｉ菌株ＫＹ８９５も、この試験で使用した。

【００１７】ｔｄｋ遺伝子のＰＣＲ増幅およびヌクレオチド配列分析ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株の染
色体ＤＮＡ調製物からチミジンキナーゼのオープンリーディングフレームを増幅
した。使用した方法は、ＧｅｎｅＡｍｐＸＬＰＣＲＫｉｔ（Ｐｅｒｋｉ
ｎＥｌｍｅｒ）およびＴｔｈＳｔａｒｔＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）の製造業者により指示されたものを改変したものであった。簡単に記載す
ると、ＰＣＲ反応は、以下の成分を含む反応混合物５０μｌであった:（ＸＬ緩
衝液ＩＩ（１×）、Ｍｇ（ＯＡｃ）₂溶液（１．１ｍＭ）、プライマーＣＦ１２
（５’-ＧＡＴＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＡＣＧＧ-３’
、０．４μＭ）、プライマーＣＦ１３（５’-ＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴ
ＧＧＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＧ-３’、０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（０．２μＭ）
、ＴｔｈＳｔａｒｔＡｎｔｉｂｏｄｙ（０．８８μｇ）、ｒＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼ（２Ｕ）、ＳＰ２０４（１-１）Ｌｏｔ＃ＳＰ２２-０９染色体ＤＮ
Ａ（１８０ｎｇ）またはＧＰ２０４Ｌｏｔ＃ＳＰ５-ＩＢ染色体ＤＮＡ（２６
２ｎｇ））。ＴｔｈＳｔａｒｔＡｎｔｉｂｏｄｙおよびｒＴｔｈＤＮＡポ
リメラーゼを、５６:１モル濃度溶液（ＴｔｈＳｔａｒｔＡｎｔｉｂｏｄｙ:
ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）として調製し、ＰＣＲ反応に加える前に、室温
で５分間インキュベートした。この反応混合物にシリコンオイルを重層し、次い
で、以下のプログラム（（９４℃、１分；５３℃、１分；７２℃、２分）１×；
（９４℃、３０秒；５５℃、１分；７２℃、１分）３５×および（７２℃、１０
分）１×）に従って、ＥＲＩＣＯＭＰＴｗｉｎＢｌｏｃｋ熱サイクラー内で
熱循環に供した。製造業者により指示された説明書に従って、５７６ｂｐのＰＣ
Ｒ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔで供給される
ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。

【００１８】ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔを使用
してプラスミドＤＮＡ鋳型を調製し、子牛胸腺ＤＮＡを検定標準として使用して
蛍光光度計（ＨｏｅｆｆｅｒＤＹＮＡＱｕａｎｔ２００）で計量した。Ｄ
ＮＡ配列決定のために、プラスミドＤＮＡ鋳型をＣｅｎｔｒａｌＳｅｒｖｉｃ
ｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆｔｈｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｅ
ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＯｒｅｇｏｎＳ
ｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙに提出した。製造業者（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰ／Ｎ４０２１１４，ＲｅｖｉｓｉｏｎＣ）によ
り指定された方法に従って、ＡＢＩＰｒｉＳＭＴｍＤｙｅＰｒｉｍｅｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＫｉｔｗｉｔｈＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ＠ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳＫｉｔを使用して、ＤＮＡジ
デオキシ鎖終結シーケンシング反応混合物を調製した。Ｔ７ダイプライマー（５
’-ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ-３’）およびＭ１３リバースダ
イプライマー（５’-ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ-３’）を使用して
両鋳型を配列決定し、ＡＢＩ３７３シーケンサーでシーケンシング反応を分析
した。

【００１９】無細胞転写および翻訳製造業者の指示に従って、ＴｎＴＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ
ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプログラムするために、放射標識の非存在下且つ
Ｌ-［³⁵Ｓ］-メチオニン（ＡｍｅｒｓｈａｍＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｃｏ．；１２４９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、プラスミドＤＮＡ鋳型を使
用して、連結転写／翻訳反応を同時に実施した。合成された放射性ポリペプチド
をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、オートラジオグラフィー
で可視化した。

【００２０】チミジンキナーゼ酵素アッセイおよびチミジン取込み既述の通り、［³Ｈ］-チミジンの［³Ｈ］-ＴＭＰへの転換に従うフィルター結
合アッセイで、非放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳産物のチミジンキナーゼ活性を
決定した。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株の対数増殖期のチミジン取込みを測定した
。一晩培養からのアリコートを、５００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを
含むＢＨＩブロスで１:１００希釈し、Ａ_590nm＝０．５まで３７℃で増殖させた
。［³Ｈ］ｄＴ（最終濃度０．７５μＭ；８５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を総量１ｍｌで
加え、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、アリコート５０μ
ｌを取り、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で予め湿らせたＷｈａｔｍａｎ３
ＭＭ濾紙ディスク上にスポットし、既述通りに、処理して取込まれた放射標識を
決定した。

【００２１】マウスコロニー形成Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株を、ＢＨＩブロス（適当な選択的添加物を含む）培
養液５０ｍｌで、ＯＤ₆₅₀＝０．８まで３７℃で増殖させた。この培養液４５ｍ
ｌを、４０℃にて、２，２００×ｇで２０分間遠心分離した。上澄を吸引し、連
鎖球菌細胞ペレットを、用時調製したＢＨＩ１ｍｌに再懸濁した。この濃度の
細胞懸濁液により、１〜５×１０⁹ｃｆｕ／５０μｌ用量が送達された。適当な
選択的添加物を含む５％羊血寒天上に接種材料の段階希釈をプレーティングする
ことにより、コロニー数を確認した。メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢；Ｃ
ｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）に、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを移植する前の２日間、
随時摂取可能な水に入れてストレプトマイシン（５ｇｍ／ｌ）を投与し（-２日
）、移植中ずっと、ストレプトマイシン水で維持し、その後、非添加水に戻した
。０日に、各細胞懸濁液５０μｌを鼻孔と口腔との間に一様に分布させてマウス
に移植し、２日に、新たに増殖させた細胞でこの工程を繰返した。毎週または隔
週の間隔で、マイクロスワブ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、連鎖球菌コロニー形
成について、各マウスの咽頭領域、歯肉および歯をモニタリングし、続いて、適
当な選択的添加物を含む５％羊血寒天上にプレーティングした。このプレートを
３７℃で４８時間インキュベートした後、生じたコロニーを計数した。

【００２２】結果ＦＵｄＲ^rＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株の選択。グラム陰性菌系での以前の調査研究で、細菌を阻止濃度の５-フルオロデオキ
シウリジン（ＦＵｄＲ）に曝露すると突然変異が生じ、細菌ゲノムのｔｄｋ遺伝
子の遺伝学的不活化が随伴することを証明した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｇｏｒｄｏｎｉｉ等のグラム陽性菌が類似した挙動を示すかどうかは分からなか
った。代表的なグラム陽性共生細菌の相対的ＦＵｄＲ感受性を決定するために、
Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、菌株ＧＰ２０４（ストレプトマイシン耐性、Ｓｍ^r）を
ＦＵｄＲ選択プレート上にプレーティングした。選択プレートは、チミジレート
合成の代替新規生合成経路を促進するために、ウリジン（１２．５μｇ／ｍｌ）
およびチミジン（２μｇ／ｍｌ）の存在下で、１〜６０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを
含むブレイン−ハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天ベースであった。ポジテ
ィブコントロールおよびネガティブコントロールとして、それぞれ、野生型ｔｄ
ｋ遺伝子発現Ｅ．ｃｏｌｉ菌株および十分に研究されたＴＫ突然変異体（ＫＹ８
９５）を使用した。得られた結果から、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＧＰ２０４は、
Ｅ．ｃｏｌｉと比較して、ＦＵｄＲ阻害に非常に敏感であることが分かった。Ｔ
Ｋ⁺Ｅ．ｃｏｌｉは、６０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲの存在下でコロニーを形成した
が、０．５μｇ／ｍｌという僅かなＦＵｄＲの存在下で、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ
ＧＰ２０４の著しい阻害は明白であった。従って、ＦＵｄＲＳ．ｇｏｒｄｏ
ｎｉｉ菌株を選択し単離するために、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＧＰ２０４を、１
〜１０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを含む繰り返し選択プレート上にプレーティングし
た。こうした条件で、１μｇ／ｍｌＦＵｄＲを含むプレート上にＦＵｄＲ^rコ
ロニー２個が得られ、ＳＰ２０４（１-１）およびＳＰ２０４（１-２）と呼ばれ
た。１０μｇ／ｍｌＦＵｄＲを含むプレート上でＦＵｄＲ^rコロニー１個が増
殖し、ＳＰ２０４（１０-１）と呼ばれた。これらの菌株が親菌株Ｓ．ｇｏｒｄ
ｏｎｉｉＧＰ２０４に由来することを保証するために、ＳＰ２０４（１-１）
、ＳＰ２０４（１-２）およびＳＰ２０４（１０-１）のＳｍ^r表現型を検証した
。さらなる定量分析で、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＧＰ２０４ＦＵｄＲ耐性突然
変異体が生じる自然発生的突然変異率は、１×１０^-6であることが分かった。

【００２３】Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＦＵｄＲ突然変異体ｔｄｋ遺伝子座のヌクレオチド配列
分析。グラム陰性細菌の場合と同様に、ｔｄｋ遺伝子にマッピングされた突然変異が
、ＦＵｄＲ耐性獲得の原因であるかどうかを決定するために、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株ＳＰ２０４（１-１）
、ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０-１）およびＧＰ２０４（ＰＣＲ反応
の陽性対照として含めた）の染色体ＤＮＡ調製物から、チミジンキナーゼオープ
ンリーディングフレームを増幅した。ＰＣＲプライマーは、以前に公表された、
菌株ＤＬ-１由来のＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉｔｄｋ遺伝子の配列（Ｃｈａｌｌｉ
ｓ）に基づいており、全ｔｄｋ遺伝子座（５７６ｂｐ）を含む５７９塩基対（ｂ
ｐ）ＤＮＡ産物を増幅するようにデザインした。いずれの場合にも、ＤＮＡサイ
ズ標準と比較して測定したとき、およそ６００ｂｐのサイズの独特のＰＣＲ産物
が得られた。

【００２４】増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲルから切除し、プラスミドベクターｐＣ
Ｒ２．１に連結し、ＩＮＶαＦコンピテント細胞に形質転換した。アンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）耐性コロニーを寒天プレートで選択した。制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩで消化した代表的なコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、
アガロースゲル電気泳動法で分析し、適当なサイズ（〜６００ｂｐ）の挿入物が
存在することを確認した。Ｍ１３逆プライマーおよびＴ７シーケンシングプライ
マーを使用して、代表的なクローン由来のプラスミドＤＮＡを、両鎖について配
列決定した。

【００２５】ＦＵｄＲ^r菌株からのＤＮＡ配列分析で、ｔｄｋＯＲＦは、Ｓ．ｇｏｒｄｏ
ｎｉｉＧＰ２０４の配列と比較して、それぞれ、１個の塩基対置換を含み、そ
の結果、翻訳終止コドンをｔｄｋＯＲＦの各菌株独特の位置に導入することにな
ったことが明らかになった（図１）。ＳＰ２０４（ｌ-１）のｔｄｋＯＲＦは
、１９１アミノ酸ｔｄｋＯＲＦのコドン８６に、ＧＡＧからＴＡＧへのトラン
スバージョン突然変異を含んでいた。ＳＰ２０４（１-２）の突然変異は、コド
ン１５５に生じたＣＧＡからＴＧＡへのトランスバージョン突然変異であった。
ＳＰ２０４（１０-１）では、ｔｄｋＯＲＦのコドン８８に、ＣＡＧからＴＡ
Ｇへの別のトランスバージョン突然変異が認められた。誘導されたＳ．ｇｏｒｄ
ｏｎｉｉＧＰ２０４のヌクレオチド配列は、ＤＬＩ（Ｃｈａｌｌｉｓ）につい
て公表されたヌクレオチド配列と残基１個が異なり、ｔｄｋＯＲＦのヌクレオ
チド５４に、サイレントＡからＧへの突然変異を含むことにも留意すべきである
。ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０-１）も、それぞれ、ヌクレオチド５
４にサイレント突然変異を含んでおり、親菌株Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＧＰ２０
４に由来することが確認された。

【００２６】Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＦＵｄＲ^r突然変異体におけるＴＫ活性の喪失。全長Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＴＫポリペプチドの予測分子量は２１，８４３ダ
ルトンである。ＳＰ２０４（１-１）、ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０
-１）ＦＵｄＲ^r突然変異体によりコードされる早期終結ＴＫポリペプチドの予測
分子量は、それぞれ、９，８００ダルトン、１７，８００ダルトンおよび１０，
１００ダルトンである（図１）。これらの表現型を検証するために、ｐＣＲ２．
１プラスミドベクターでクローニングされたＦＵｄＲ^rｔｄｋ遺伝子座を、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写し、誘導された転写物を、［³⁵Ｓ］メチオニ
ンの存在下、ウサギ網赤血球溶解物で翻訳し、放射標識された翻訳産物をゲル電
気泳動法で分析した。図２ａのデータから、このゲルの蛍光写真で確認される標
識されたｉｎｖｉｔｒｏ翻訳産物の見掛けの分子量は、ＳＰ２０４（１-１）
、ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０-１）のｔｄｋ遺伝子座のＴＫ切断生
成物の予測サイズと良好な一致を示すが、ＳＰ２０４（１-１）ｔｄｋ由来の転
写物は、翻訳不良であるか、翻訳産物が不安定であるかかのいずれかであった。

【００２７】先に、我々は、真核ＴＫ酵素でも原核ＴＫ酵素でも高度に保存されている７つ
の機能的ドメイン（Ｉ〜ＶＩＩ）を同定した。ＳＰ２０４（１-１）およびＳＰ
２０４（１０-１）によりコードされた切断型ＴＫ酵素は、ドメインＩＩＩ〜Ｖ
ＩＩが欠如しており、切断型ＳＰ２０４（１-２）ＴＫ酵素は必須ドメインＶＩ
Ｉ（カルボキシル末端付近の４アミノ酸配列）が欠如している。この観察結果か
ら、切断型ＦＵｄＲ^rｔｄｋＯＲＦの中で、活性なＴＫ酵素をコードするもの
はないと予測される。この予想をテストするために、抽出物が［³Ｈ］チミジン
を［³Ｈ］ＴＭＰに転換する能力で測定したときの、チミジンキナーゼ活性につ
いて、ＦＵｄＲ^rｔｄｋ由来のｉｎｖｉｔｒｏ転写産物でプログラムされた非
標識翻訳反応を試験した。図２ｂで明白なように、ＳＰ２０４（１-１）、ＳＰ
２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０-１）ＴＫ翻訳では、［³Ｈ］チミジンリン
酸化活性がバックグラウンド以上に存在し、親ＧＰ２０４ＴＫ翻訳反応では、高
レベルのチミジンキナーゼ活性が明白であった。これらのデータをひとまとめに
して考えると、各ＦＵｄＲ'ＳＰ２０４菌株は、ｔｄｋ遺伝子座内の、トリプレ
ットコドンの最初の塩基に突然変異を有し、その結果、各菌株の独特の部位に翻
訳終止コドンを導入したことがわかる。各ＳＰ２０４菌株のｔｄｋＯＲＦのｉ
ｎｖｉｔｒｏ翻訳産物の分析で、切断型ＴＫポリペプチドが合成されること、
およびこれらの不完全なポリペプチドはチミジンキナーゼ欠失であることが確認
される。

【００２８】Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉにおけるＦＵｄＲ^rのｉｎｖｉｖｏ結論。ＦＵｄＲ^rＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ突然変異体を単離して特性決定したため、
何か結論があるとすれば、チミジンキナーゼ欠失表現型が細胞培養またはレシピ
エント動物におけるＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉの増殖にどんな影響を及ぼすかを決定
することが関心事であった。組換えＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ菌株構築物用の選択
可能マーカーとして、ＦＵｄＲ^rを伝統的な抗生物質耐性の代わりに使用するの
であれば、またそれらをｉｎｖｉｖｏワクチンデリバリー媒体として実行する
のであれば、この情報は重要であろう。３つのＦＵｄＲ^r突然変異体（ＳＰ２０
４（１-１）、ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（ｌ０-１））は全て同じＴＫ-
表現型を示すため、ｉｎｖｉｖｏ分析を簡素化するために、我々は、さらなる
分析用にＳＰ２０４（ｌ-１）１個を選択した。

【００２９】取り組むべき第１の問題は、標準的な実験的増殖条件でＳＰ２０４（１-１）
の増殖が損なわれないかということであった。外因的に加えられたウリジンおよ
びチミジンの存在下ではあるが、ＢＨＩプレート上で突然変異体を単離して増殖
できることによって、この問題には、既にある程度答が出されていた。我々は、
様々な培地を使用したブロス培養で、もっと厳密に問題点に取り組んだ。トリプ
チカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）等の最小培地では、ＳＰ２０４（１-１）の増殖
は、親菌株ＧＰ２０４と比較して、ひどく阻害されることを発見した。この阻害
は、大部分が（しかし全部ではない）、５０μｇ／ｍｌ外因性ウラシルを増殖培
地に加えることにより抑えられる（データ示さず）。対照的に、図３に示す通り
、ＳＰ２０４（１-１）はリッチブロス培養（ＢＨＩ）でかなりよく増殖した。
この実験は、ＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）の一晩培養の１:１００逆希
釈を、用時調製ＢＨＩブロスに接種し、ヌクレオチドを加えずに、３７℃で増殖
をモニタリングした結果を示す。こうした条件で、ＳＰ２０４（１-１）は、Ｇ
Ｐ２０４と同じ速度で増殖し、同じ細胞密度に達することがわかり、必要な外因
性ヌクレオチドは、ＢＨＩ調製物で供給されることが示唆される。この結果から
、培養条件でＦＵｄＲ^rを選択可能マーカーとして使用できるという仮説が裏付
けられるが、使用する培地への注意が不可欠である。

【００３０】取り組むべき次の問題は、あるとすれば、ＦＵｄＲ^rマーカーの存在が、ヌク
レオシド取込みおよび／または代謝にどのような影響を及ぼすかということであ
る。先の、グラム陰性細菌Ｅ．ｃｏｌｉでの研究で、チミジン取込みと細胞内チ
ミジンキナーゼ活性レベルとの間に固有の関連があることが示唆された。Ｓ．ｇ
ｏｒｄｏｎｉｉ等のグラム陽性菌が同じ方式で反応するかどうかを決定するため
に、ＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）でチミジン取込みを直接測定した。
ＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）の対数期培養の２組のアリコート１ｍｌ
に、［³Ｈ］チミジンを加えた。０分または１０分間インキュベートした後、Ｔ
ＣＡで細胞を沈澱させ、洗浄し、細胞内放射能を決定するためにカウントした。
図４のデータから分かるように、ＧＰ２０４はチミジンを速やかに吸収すること
ができたが、ＳＰ２０４（１-１）は大きく阻害され、１０分間インキュベート
した後でも、痕跡量の放射能が蓄積しただけであった。この結果から、グラム陰
性およびグラム陽性細菌で、ヌクレオチド取込みと代謝が連結される方式の共通
点が示唆され、また、濃度または外因性ヌクレオシド／ヌクレオチドが未知のｉ
ｎｖｉｖｏ状況で、ＴＫ７菌株の増殖が損なわれる可能性があるかどうかとい
う問題が提起される。

【００３１】少なくとも幾つかの培養条件で、ＳＰ２０４（１-１）による増殖もチミジン
取込みもｉｎｖｉｔｒｏで損なわれると考えられるため、栄養条件が変わりや
すく且つ未知のレシピエント動物で、ＳＰ２０４（１-１）がコロニーを形成し
て持続する能力が、同様に影響を受けるかどうかを決定することは興味深い。も
しそうであれば、ＦＵｄＲ^rマーカーの潜在的ワクチン調製物での使用は禁忌で
あろう。モデルシステムとして、我々はＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。先の研
究で、経口的および鼻腔内的にマウス接種したとき、組換えＳ．ｇｏｒｄｏｎｉ
ｉ菌株は、コロニーを長期間（８〜１２週間）形成でき、その結果、活発な局
所免疫応答および全身性免疫応答を誘導することを示した。従って、マウス１０
匹ずつの２グループにストレプトマイシンを投与して、既存の内因性細菌叢を抑
制した。次いで、２回の口腔鼻移植（４８時間離す）の各回に、ＧＰ２０４また
はＳＰ２０４（１-１）（両者ともストレプトマイシン耐性である）のいずれか
１０⁹ｃｆｕを、各群の個々のマウスに投与した。次いで、導入された接種材料
によるコロニー形成のレベルおよび持続期間を、定期的に口腔をスワブしてスト
レプトマイシンおよび／またはＦＵｄＲ含有血液寒天プレート上にプレーティン
グすることにより、モニタリングした。意外なことに、コロニーを形成したマウ
スの数またはコロニー形成の平均持続期間に差はなかった（図５）。どちらの場
合にも、最初は、１００％のマウスがコロニーを形成した。個々の動物のコロニ
ー形成持続期間は１〜１２週の間で変化したが、ＧＰ２０４群とＳＰ２０４（１
-１）群との間に統計学的有意差は認められなかった。対照的に、データの視覚
的精査から、どちらかといえば、平均して、ＳＰ２０４（１-１）はＧＰ２０４
よりも僅かによくコロニーを形成する傾向があった。同様に、コロニー形成の程
度の列挙は、明白な差を示さなかった。

【００３２】考察本明細書に示す結果により、Ｅ．ｃｏｌｉ等のグラム陰性菌とグラム陽性共生
細菌Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの間の、ヌクレオチド代謝（少なくともチミジンの
場合）の見掛け上の共通点が確認された。本明細書に示すデータから、阻止濃度
のＦＵｄＲ存在下で増殖させたとき、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは約１×１０^-6の頻
度でＦＵｄＲ耐性突然変異体を生じさせることが分かった。ＦＵｄＲ^r獲得の原
因であるゲノムの遺伝子座の同定によって、３つの独立した突然変異（ＳＰ２０
４（ｌ-１）、ＳＰ２０４（１-２）、ＳＰ２０４（１０-１））全てが、ヌクレ
オシドサルベージ酵素チミジンキナーゼをコードする同一遺伝子ｔｄｋにマッピ
ングされることが明らかになった。３つのＦＵｄＲ^r突然変異体は、それぞれ、
ｔｄｋオープンリーディングフレーム内にナンセンス突然変異を導入して、他の
チミジンキナーゼ酵素に不可欠であることが分かっている１つ以上のモチーフが
欠如した切断型タンパク質を生じさせることによって、チミジンキナーゼ欠失表
現型を獲得した。ＳＰ２０４（１-１）ｔｄｋ遺伝子、ＳＰ２０４（１-２）ｔｄ
ｋ遺伝子、ＳＰ２０４（１０-１）ｔｄｋ遺伝子によりコードされた切断型酵素
の中で、酵素活性を保持したものはないことが、酵素アッセイで確認された。

【００３３】ＦＵｄＲ^rＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ突然変異体を単離しようとする最初の勢い
によって、このマーカーを候補の組換えワクチン菌株のためのｉｎｖｉｔｒｏ
選択に使用すること、およびｉｎｖｉｖｏで、レシピエント動物に移植された
生物の検出を容易にすることが可能になった。従って、ＦＵｄＲ^r突然変異体は
増殖できるが、野生型Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉの増殖は阻害する選択条件を確立する
ことができ（１μｇ／ｍｌＦＵｄＲ、１２．５μｇ／ｍｌウリジンおよび２μ
ｇ／ｍｌチミジン）、したがって、ｉｎｖｉｔｒｏでの非抗生物質による選択
方法としてＦＵｄＲ^rを使用できることを示すことは興味深い。富栄養培地では
、ＦＵｄＲ^rＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉの増殖は（野生型Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉと比
較して）損なわれず、この方式で誘導された組換え体は、ワクチン接種材料向け
に、高密度まで容易に増殖できることも分かった。最も重要なことは、ｉｎｖ
ｉｖｏ移植実験で、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉがマウスの口腔でコロニー形成を確
立し且つ持続できる能力は、ＦＵｄＲ^r突然変異の存在によって損なわれないこ
とが示唆されたことである。この結果から、ネズミ口腔粘膜上で見られる状況お
よび環境では、機能的チミジンキナーゼは不可欠ではないことが示唆される。従
って、このことは、他の粘膜ニッチ、たとえば、腸管または尿生殖管でコロニー
を形成する共生細菌および他種に当てはまるはずである。ひとまとめにして考え
ると、本明細書で得られた結果から、ＦＵｄＲ^rは、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ系組
換えワクチンにおける選択方法および表現型マーカーとして有用なことが分かる
。この方法は、幾つかの潜在的利点を有する。第１に、ＦＵｄＲは、ヒトの疾患
の治療に日常的に使用されないため、移植されたワクチンの検出を複雑にするＦ
ＵｄＲ^r口腔細菌のかなりの貯蔵所がないはずである。このことは、臨床治験中
ずっと、ワクチンコロニー形成のレベルおよび持続期間をモニタリングできるよ
うにするために重要な因子である。１×１０^-6の自然発生的突然変異率が問題で
あるならば、組換えワクチンで、ＦＵｄＲ^rを天然のストレプトマイシン耐性マ
ーカーと組み合せることができる。臨床治験の間に生じる自然発生的ＦＵｄＲ^r
／Ｓｍ^r突然変異体の見込み率は、ほとんど無視できるほど小さい。第２に、Ｆ
ＵｄＲ^rチミジンキナーゼをコードする遺伝子は、十分に研究されていることで
ある。ＴＫ-表現型には、積極的な生化学的選択方法も消極的な生化学的選択方
法も存在する。さらに、この表現型は、多数の基本型ウイルスのワクチンで問題
なく使用されてきた。最後に、しかも最も重要なことには、ＦＵｄＲは抗生物質
ではなく、且つＦＵｄＲ^rはプラスミド媒介性ではない。抗生物質耐性病原性細
菌の出現率が上昇したため、操作された、または選択された、臨床関連の薬剤に
対する耐性マーカーを、構成体（プラスミド等）中に含まない生菌菌株がワクチ
ンベクターとして使用される場合、それによって生菌菌株が移植された共生病原
体から常在病原体に変わることができることが不可欠である。ＦＵｄＲ^rゲノム
マーカーは、これらの両基準を満たす。

【００３４】様々な具体的な材料、手順および実施例を参照することにより、本発明を本明
細書に説明してきたが、本発明は、本発明の目的に合わせて選択された特定の材
料、材料の組み合せ、および手順に限定されないことが理解される。このような
詳細の多数の変更が含まれてもよく、また当業者に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＵｄＲ^r突然変異体のｔｄｋ遺伝子構造。指示された菌株由来のｔｄｋ遺伝
子のヌクレオチド配列分析から推定されるオープンリーディングフレームの主要
な特徴を示す線図である。下付きの数字で示したコドン番号で、予測される開始
コドンおよび終止コドンの位置および同一性を示す。ＦＵｄＲ^r突然変異体につ
いて、本来のヌクレオチドおよび突然変異を示す。左側は菌株の名称であり、右
側は、各ｔｄｋ遺伝子によりコードされるポリペプチドの予測分子量である。

【図２】ＦＵｄＲ^rｔｄｋ遺伝子の構造分析および機能分析。野生型Ｓ．ｇｏｒｄｏｎ
ｉｉおよびＦＵｄＲ^r突然変異体のｔｄｋ遺伝子の転写物を作成し、次いで、
［³⁵Ｓ］メチオニンの存在下および非存在下で、ウサギ網赤血球溶解物中で翻訳
した。Ａ）ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で放射
標識翻訳産物を分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。レーンＭ、分子
量マーカー（それぞれ、４６、３０、２１．５、１４．３、６．５および３．４
ｋＤａ）；レーン１、ＲＮＡ無添加；レーン２、ＧＰ２０４；レーン３、ＳＰ２
０４（１-１）；レーン４、ＳＰ２０４（１-２）；レーン５、ＳＰ２０４（１０
-１）。Ｂ）［³Ｈ］チミジンの［³Ｈ］チミジン一リン酸への転換を測定する既
述のプロトコールを使用して、非標識翻訳産物を、チミジンキナーゼ酵素活性に
ついて試験した。各ｔｄｋ遺伝子産物について、放射標識の取込みを示す。「な
し（Ｎｏｎｅ）」と表示されたレーンは、外因性ＲＮＡを全く加えなかった網赤
血球溶解物により指令された取込みを示す。

【図３】ＢＨＩブロス中でのＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）の相対的増殖速度
。２組のＢＨｌブロス培養に、等量のＧＰ２０４（白抜きの丸）またはＳＰ２０
４（中黒の丸）を接種した。培養を、攪拌せずに３７℃でインキュベートした。
サンプルを３０分毎に採取し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【図４】ＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）によるチミジンの取込み。ＧＰ２０４
およびＳＰ２０４（１-１）のブロス培養を中間対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ）まで
増殖させた。５９０ｎｍにおける培養の吸光度を測定した。各培養のアリコート
１ｍｌを採取し、［³Ｈ］チミジンと混合し、３７℃でインキュベートした。０
分および１０分間インキュベートした後、各アリコートから３組のサンプル５０
μｌを採取し、処理してＴＣＡ沈澱可能な放射能を測定した。次いで、得られた
、取込まれたカウントを、細菌の細胞数に正規化した。

【図５】ＧＰ２０４およびＳＰ２０４（１-１）によるマウスコロニー形成。ＧＰ２０
４およびＳＰ２０４（１-１）のブロス培養を中間対数期まで増殖させた。細胞
を収穫し、ブロスで１回洗浄した。５０μｌ中に１０⁹細菌が含まれるような濃
度を得るように、細胞ペレットをブロス中に再懸濁し、これを、それぞれ２日に
（４８時間離して）、群当たり１０匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスに、鼻腔内およ
び口腔に点滴した。接種マウスの口腔を毎週スワブし、ストレプトマイシン含有
血液寒天プレート上にプレーティングした。２個より多い、ストレプトマイシン
耐性、α−溶血性グラム陽性球菌のコロニーが回収された場合、そのマウスをコ
ロニー形成陽性と評点をつけ、中黒の円で示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フランク，クリスティン・エイアメリカ合衆国オレゴン州97321，オールバニー，ノースウェスト・インディペンデンス・ハイウェイ 2262 Ｆターム(参考） 4B065 AA49X AB01 AC14 AC20 BA01 BA23 BB01 BB12 BB13 BC03 BC50 CA45

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＦＵｄＲ含有培地上で細菌を培養するステップと、ＦＵｄＲの存在下で増殖する細菌を選択するステップとを含む、５-フルオロデオキシウリジン（「ＦＵｄＲ」）に耐性のグラム陽性菌
株を単離する方法。
【請求項２】前記培地が、ブレインハートインフュージョンおよびトリプ
ティックソイブロスからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記培地が０．５〜５０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを含む請求項
１に記載の方法。
【請求項４】前記培地が１〜１０μｇ／ｍｌのＦＵｄＲを含む請求項３に
記載の方法。
【請求項５】前記培地が１２．５μｇ／ｍｌのウリジンおよび２μｇ／ｍ
ｌのチミジンをさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記細菌が抗生物質耐性ではない請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記細菌が共生細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記細菌がストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus g
ordonii)である請求項７に記載の方法。
【請求項９】請求項１に記載の方法で単離された細菌。
【請求項１０】５-フルオロデオキシウリジンに耐性である単離されたグ
ラム陽性細菌。
【請求項１１】前記細菌が共生細菌である請求項１０に記載の細菌。
【請求項１２】前記共生細菌がストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptoco
ccus gordonii)である請求項１０に記載の細菌。
【請求項１３】前記細菌がｔｄｋ遺伝子に点突然変異を含み、その結果と
して翻訳終止コドンをｔｄｋＯＲＦに導入することになる請求項１０に記載の
細菌。
【請求項１４】前記突然変異が、結果として早発的に終結されたＴＫポリ
ペプチドの発現を招く請求項１３に記載の細菌。
【請求項１５】前記早発的に終結されたＴＫポリペプチドがドメインＶＩ
Ｉを欠く請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】抗原性タンパク質をコードするＤＮＡにより前記細菌が形
質転換されている請求項１０に記載の細菌。
【請求項１７】前記抗原性タンパク質がＭ６タンパク質である請求項１６
に記載の細菌。
【請求項１８】請求項１０に記載の細菌およびそのための担体を含む組成
物。