JP5619352B2 - 細菌を処置するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は細菌学の分野に関する。特に、本発明は組成物(例えばランチビオティック(lantibiotic)およびムピロシンならびに/またはゲンタマイシンを含む)、および細菌を処置する(例えば細菌を死滅させるまたは細菌の成長を阻害する)方法を提供する。例えば、本発明は薬学的化合物(例えばランチビオティックおよびムピロシンならびに/またはゲンタマイシンを含む)、およびこれを研究用途、治療用途、薬物スクリーニング用途に使用する方法を提供する。
従来の薬学的抗生物質の、医学目的、獣医学目的、および農業目的の使用が増加した事より、同時に病原性細菌の抗生物質耐性株が発生している。
本発明は細菌学の分野に関する。特に、本発明は組成物(例えばランチビオティックおよびムピロシンならびに/またはゲンタマイシンを含む)、および細菌を処置する(例えば細菌を死滅させるまたは細菌の成長を阻害する)方法を提供する。例えば、本発明は薬学的化合物(例えばランチビオティックおよびムピロシンならびに/またはゲンタマイシンを含む)、およびこれを研究用途、治療用途、薬物スクリーニング用途に使用する方法を提供する。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、本発明の方法または組成物により処置される個体(例えばヒト、動物、または他の生物)を指す。対象には、限定されるものではないが、哺乳動物(例えばネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)を含み、最も好ましくはヒトを含む。本発明の文脈において、「対象」という用語は概して、細菌(例えばMRSAなどの病原性細菌)の存在によって特徴付けられる状態のための処置、または細菌への曝露の可能性を見越した処置を受けるまたは受けた個体を指す。本明細書において使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、特に明示する場合を除き互換的に用いられる。
ブドウ球菌属は、表在性の膿瘍(例えば、腫脹、麦粒腫、フルンケル、および他の限局性膿瘍)からより深部の感染(例えば、骨髄炎、肺炎、心内膜炎、尿路感染症、敗血症性網膜炎、髄膜炎、手術後の創傷感染、敗血症、および食中毒)までの範囲の多種多様な疾患を引き起こすグラム陽性細菌病原体である。黄色ブドウ球菌は、手術創の病院内(院内)感染の主な原因であり、表皮ブドウ球菌は留置医療デバイスに関連する感染を引き起こす。(例えば、Silverstein et al., 1990; Patti et al., 1994; Dann et al., 1994を参照)。
以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様および局面を示しさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。
マウスの皮膚感染を除去するムピロシンおよびナイシンを含む組成物
材料:
リソスタフィンはBiosynexus社により製造され、ナイシン(AMBICIN N)はAMBI社から入手した。ムピロシン(BACTROBAN軟膏)、バシトラシン(Sigma)、およびバシトラシン軟膏(G&W Laboratories社)は全て市販されているものを入手した。ポリエチレングリコール(PEG)400およびPEG 3350は、Spectrum Chemicalsから購入した。
黄色ブドウ球菌をトリプティックソイブロス(tryptic soy broth)(SA8;1〜6×109CFU/mLの範囲)中で一晩培養したものを、4000×gで10分間遠心分離し、等量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁した。細菌を透過パーセント40(Spectronic 20D+)に希釈し、その後、最終的な細菌濃度が約3×105となるようにPBS中に1:1000に希釈した。SKH1(hrhr)無毛マウス(Charles River)を、0.2mLのケタミン(80mg/kg)およびキシラジン(32mg/kg)を腹腔内に送達することにより鎮静させた。マウスの背の上部を70%アルコールワイプでこすり、乾燥させた。150グリットのサンドペーパーを使用し、細かい擦過傷をマウスの背の肩の間に作製した。領域に溶液がしみ込むまで、滅菌綿棒により擦過領域上に細菌を塗った。
74gのPEG 400および24gのPEG 3350を250mLのガラスビーカーに加え、全てのPEG 3350が溶けるまで加熱した。この溶液を十分に攪拌し、室温まで冷まし、滑らかな不透明の軟膏を得た。粉末のナイシンおよびバシトラシンをw/wベースでこの軟膏に加え、均質に混ざるまで攪拌した。ムピロシンを含有する製剤用に1gのBactroban軟膏を量って容器に入れ、粉末のナイシンを2%または6%(w/w)まで加えて十分に混合した。リソスタフィンをまず、約150mg/mLの濃度にDI水に溶解し、その後軟膏に混合して最終濃度を2%(w/w)にした。
マウスモデルにおいて黄色ブドウ球菌による皮膚感染を根絶することを目的とする処置は、感染させた次の朝に開始した(1日目)。ナイシン(0、2、または6% w/w)、ムピロシン(0または2%)、バシトラシン(0または500U)、およびリソスタフィン(0または2% w/w)を含む約0.1gの局所用軟膏を、滅菌綿棒を用いて、1日3回、1日目および2日目に感染領域上に塗った。マウスを3日目の朝にCO2による窒息によって屠殺し、感染領域の周りの0.5cm2の皮膚小片を切除した。この皮膚試料を切り裂き、1mLの5mg/mLプロテイナーゼK、20 mg/mLのエステラーゼ、およびPBS中20 mg/mLの活性炭の入った試験管に入れ、抗菌剤の活性を中和した。microtip(VirTis)を備えるVirsonic 600において3Wで5秒間、0Wで5秒間を交互に行う、試料当たり2分間の処理である超音波処理により、細菌を皮膚試料から取り除いた。ボルテックスによる混合後、それぞれ50μLの試料を血液寒天プレート上に画線し、37℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数して未処置対照を比較した。
接種した黄色ブドウ球菌を部分層創傷から排除するムピロシンおよびナイシンを含む組成物
実験動物
特定病原体未感染(SPF: Looper Farms, North Carolina)の、体重25〜30kgの若い雌のブタを、実験を始める2週間前から施設内で飼育した。この動物に制約なしに基礎飼料を与え、温度(19〜21℃)および明るさ(12h/12h LD)が管理された動物施設内(米国実験動物公認協会(American Association for Accreditation of Laboratory Animal)基準に適合)に個々に収容した。この研究に使用した実験動物プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する連邦政府の指針に従った(U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Department of Agriculture参照)。動物は、痛みおよび不快の任意の観察可能な徴候について毎日モニタリングした。予測される不快を最小にするのを助けるために、鎮痛性のブプレノルフィン0.03mg/kg(注射可能Buprenex;Reckitt Benckiser Hull, England)を最初の日に各動物に与え、その後、無感覚である間、これを3日毎に与えた。25μg/時間であるフェンタニール経皮系(Duragesic; Alza Corp. Mountain View, CA)を実験全体を通して使用した。
各動物をTelazol HCl(1.4mg/kg)、Xylazine(2mg/kg)、Atropine(0.05mg/kg)I.M.、ならびにイソフルランおよび酸素の配合物の吸入を用いて麻酔した。ブタの背の毛を標準的な動物用のバリカンで刈った。動物の両側の皮膚を、非抗生物質石けん(NEUTROGENA)および滅菌水により洗浄することにより調製した。滅菌ガーゼにより、この動物の水分を吸い取った。48の部分層創傷(10mm×7mm×深さ0.3mm)を、7mmブレードを装着した特殊なエレクトロケラトーム(electrokeratome)を用いて、各動物の脊椎傍胸部体域において測定した。創傷を、少なくとも7cmの未創傷皮膚により互いに分けた。次に各創傷に既知の量の黄色ブドウ球菌(106懸濁液)を接種した。滅菌TEFLONスパチュラを用いて、懸濁液で試験部位を10秒間軽く洗った。接種後、創傷でコロニーを形成してバイオフィルムを作る時間を細菌に与えるために、処置を始める前に創傷をTEGADERMポリウレタンフィルム包帯剤(3M社)で24時間覆った。
American Type Culture Collection(ATCC),Rockville, Marylandから直接的入手した病原性分離株の新しい培養物を使用した(黄色ブドウ球菌 ATCC番号6538)。凍結乾燥された細菌培養物を、ATCC標準回復プロトコルに従って回復させた。全ての接種物懸濁液は、一晩成長したものを培養プレートからかき取って4.5mlの滅菌水中に入れ、懸濁液の混濁がMcFarlandの#8混濁基準の懸濁液と等しくなるまで懸濁することによって作製した。結果として、約108コロニー形成単位/ml(CFU/ml)の懸濁液濃度が得られた。この108懸濁液を連続的に希釈し、35mlのトリプティックソイブロス(TSB)中106 CFU/mlの濃度を有する接種物懸濁液を作製した。少量の接種物懸濁液を、実験前に生存可能な生物の正確な濃度を定量するために培養培地上に置いた。この接種物懸濁液は、各部位に接種するために直接的に使用した。25μlアリコートの懸濁液を、各創傷部位の中心で、滅菌したガラスシリンダー(直径22mm)に入れた。滅菌TEFLONスパチュラを用いて、懸濁液で試験部位を10秒間軽く洗った。接種後、細菌に創傷上でバイオフィルムを作らせるために、創傷をポリウレタン包帯剤で48時間覆った。その後包帯剤をベースライン創傷を培養するために取り除き、図5に説明する実験設計に従って残りを処置した。創傷は1日に2回処置した。
3箇所の創傷を接種の48時間後に培養してバイオフィルムベースラインを定量し、各処置群から2箇所の創傷を処置後2日目、5日目、および7日目に培養した。各試料採取時では、部位は量的に培養した。各部位は1回のみ培養した。創傷領域は、2つのハンドルにより適切な位置に保持された滅菌ガラスシリンダー(外径22mm)に含まれる。1mLの洗浄液をガラスシリンダー内にピペットで取り、部位を滅菌TEFLONスパチュラで30秒間洗った。
黄色ブドウ球菌を排除するゲンタマイシンおよびナイシンを含む組成物
実施例2に説明するような、表面皮膚を擦過し黄色ブドウ球菌を接種したマウスを、6%のナイシンおよび0.1%のゲンタマイシンの組み合わせを含む組成物で処置した。この組み合わせは実質的に全ての検出可能な黄色ブドウ球菌を排除した。
メチシリン感受性およびメチシリン耐性の黄色ブドウ球菌の処置において、ムピロシンのみを含む組成物よりも優れている、ナイシンおよびムピロシンを含む組成物
実施例2に説明するようにマウスの表面皮膚を擦過し、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)のいずれかに感染させ、次いで溶媒(PEGクリーム)のみを含む組成物、ムピロシン(2%)を含む組成物、またはムピロシン(2%)およびナイシン(6%)を含む組成物(アクティブY)で処置した。図10は、第一または第二の処置のいずれかの後に回収された細菌(MSSA)または1日後または3日後に回収された細菌(MRSA)の対数(CFU/ml)の平均を示す。ナイシンおよびムピロシンの併用は、対照およびそれぞれ単独での処置と比較して、MSSAおよびMRSA両方の処置(例えばMSSAおよびMRSA両方の死滅および/または成長の阻害)において優れている。
インビトロでムピロシン、ネオマイシン、またはゲンタマイシンと相乗的に作用しないナイシン
細菌をインビトロで処置する(例えば細菌を死滅させるかつ/または細菌の成長を阻害する)ためにナイシンが他の抗微生物剤と相乗的な様式で機能可能であるかどうかを判定するため、ナイシン単独の、またはナイシンとムピロシン、ネオマイシン、またはゲンタマイシンのいずれかとを併用した最小の阻害濃度(MIC)を試験した。図11に示すように、ある量のナイシンおよび他の抗微生物剤と一緒にインキュベーションした後の、生存可能な黄色ブドウ球菌の減少の対数を算出することにより、MICを測定した。
皮膚感染処置においてネオマイシンまたはガリデルミンと相乗的に作用しないナイシン
表面創傷モデル(実施例2参照)において細菌を処置する(例えば細菌を死滅させるかつ/または細菌の成長を阻害する)ためにナイシンが他の抗微生物剤と相乗的な様式で機能可能であるかどうかを判定するため、ナイシンをネオマイシンまたはガリデルミンのいずれかと併用して試験した。ナイシンは皮膚感染モデルにおいてネオマイシンまたはガリデルミンのいずれとも相乗的に作用しなかった。
皮膚感染処置においてゲンタマイシンと相乗的に作用するナイシンおよびムピロシンと相乗的に作用するガリデルミン
表面創傷モデル(実施例2参照)において細菌を処置する(例えば細菌を死滅させるかつ/または細菌の成長を阻害する)ためにナイシンまたはガリデルミンが他の抗微生物剤と相乗的な様式で機能可能であるかどうかを判定するため、ナイシンまたはガリデルミンをそれぞれゲンタマイシンおよびムピロシンのいずれかと併用して試験した。ナイシンはゲンタマイシンと相乗的に作用し、ガリデルミンはムピロシンと相乗的に作用し、これは皮膚感染モデルにおいて細菌の数を減少させた。
皮膚感染処置においてバシトラシンと相乗的に作用しないムピロシン
表面創傷モデル(実施例2参照)において細菌を処置する(例えば細菌を死滅させるかつ/または細菌の成長を阻害する)ためにムピロシンがバシトラシンと相乗的な様式で機能可能であるかどうかを判定するため、ムピロシンをバシトラシンと併用し細菌を処置する能力について試験した。図12に示すように、ムピロシンはバシトラシンと相乗的に作用せず、この二つを一緒に使用した場合に感染創傷モデルにおける黄色ブドウ球菌の減少において付加的な利益も無かった。
縫合糸感染モデルにおいて黄色ブドウ球菌を処置するための相乗作用能力をもたらす、ナイシンおよびムピロシンを含む組成物
深部組織感染モデルにおいて、ナイシンおよびムピロシンが単独または互いに組み合わされた場合のいずれかで黄色ブドウ球菌を処置することができるかどうかを判定した。マウスに深い切り傷(例えば閉じるために縫合糸が必要な傷)が作られた縫合糸皮膚感染モデルを作製し、黄色ブドウ球菌を切開部に導入した。図13に示すように、ナイシンおよびムピロシンが単独では黄色ブドウ球菌の処置にほとんど効果を示さなかった。しかしながら、ナイシンにムピロシンを加えた組み合わせは、感染をほとんど根絶した。したがって、ナイシンおよびムピロシンの組み合わせは皮下感染だけでなく深部組織感染の処置に使用することができる。
Claims (15)
- グラム陽性細菌によって引き起こされる感染の処置または予防のための薬剤の製造における、ナイシンおよびムピロシンの有効量を含む組成物の使用。
- 前記薬剤がクリームである、請求項1に記載の使用。
- 前記薬剤がスプレーである、請求項1に記載の使用。
- 前記薬剤がポリエチレングリコールを含む、請求項1に記載の使用。
- 前記薬剤が6%ナイシンを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤が2%ムピロシンを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記グラム陽性細菌が非ムピロシン耐性グラム陽性細菌である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用。
- 前記グラム陽性細菌が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
- 前記黄色ブドウ球菌が抗生物質耐性である、請求項8に記載の使用。
- 前記黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項8に記載の使用。
- 前記感染の処置または予防が、黄色ブドウ球菌の成長を阻害する、請求項8〜10のいずれか一項に記載の使用。
- 前記感染の処置または予防が、非処置対照と比較して、黄色ブドウ球菌の3 logまたはそれ以上の減少をもたらす、請求項11に記載の使用。
- 前記減少が薬剤の投与の2日以内に起こる、請求項12に記載の使用。
- 前記感染が、創傷の感染である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用。
- 前記感染が、皮膚表面の感染である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用。
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