JPH09234078A - 乳酸菌用分泌ベクター及び該ベクターを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全性が高くかつ適用範囲の広い乳酸菌用分
泌ベクター及び該ベクターを保持する形質転換体を提供
する。 【解決手段】 タンパク質またはペプチドの構造遺伝子
を挿入するための制限酵素部位を、ストレプトコッカス
・ボビス（Streptococcus bovis）由来の菌体外α-アミ
ラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列またはその下流配列の
いずれかの部位の直下に有する、乳酸菌用の分泌ベクタ
ーを作成した。また、構造遺伝子を組み込んだ該ベクタ
−をストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococ
cus thermophilus）種、またはラクトバチルス・デルブ
リュッキ（Lactobacillus delbrueckii）種に導入する
ことにより、これらの宿主に、外来構造遺伝子産物を分
泌させることが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品産業などで用
いられている乳酸菌の菌体外にタンパク質またはペプチ
ドを分泌生産するために用いる分泌ベクター、該ベクタ
ーを用いて得られる形質転換体または該形質転換体を用
いるタンパク質またはペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】菌体外酵素等の分泌シグナル配列を用い
て分泌ベクターを構築し、有用タンパク質やペプチドを
多量に生産する試みはこれまで広く行われてきた。宿主
としては、大腸菌や枯草菌等の細菌の他、酵母・カビ等
多くの生物が用いられ産業用の各種酵素が生産されてい
る（Fergus G. Priest (1984) Commercial enzymes, I
n: Extracellular enzymes (ed by F.G. Priest), van
Nostrand Reinhold (UK)Co. Ltd., Workingham, Berksh
ire, pp 32-50）。また、医薬品としてホルモン、イン
シュリン等多くの生理活性タンパク質やペプチドが作ら
れている。

【０００３】現在、有用タンパク質やペプチドの分泌生
産に関する基本的な技術はほぼ完成したとも考えられる
が、食品製造で有用な乳酸菌を宿主とする場合には未だ
に十分に技術的成熟をみたとはいえない。

【０００４】まず、乳酸菌では菌体外酵素などの分泌が
限られた菌種で知られているのみであるため、乳酸菌で
のタンパク質分泌に関するデータは少ない。比較的よく
研究されているのは、ラクトコッカス・ラクチス（Lact
ococcus lactis）のプロテアーゼ（Jan Kok (1990) Gen
etics of the proteolytic system of lactic acid bac
teria, FEMS Microbiol. Rev., 87, 15-42）、ラクトバ
チルス属のアミラーゼ（A. Fitzsimons, et al. (1994)
Development of an amylolytic Lactobacillus planta
rum silage strain expressing the Lactobacillus amy
lovorus a-amylase gene. Appl. Environmen. Microbio
l., 60,3529-3535）や表層タンパク質（H.J. Boot, et
al. (1992) Regulatory array forming surface protei
n of Lactobacillus. Annual Report 1992, TNO Medica
l Biological Laboratory, 26-27）、または各種乳酸菌
が生産するペプチド性のバクテリオシン（Todd R. Klae
nhammer (1993) Genetics of bacteriocins produced b
y lactic acid bacteria,FEMS Microbiol. Rev., 12, 3
9-86）などである。

【０００５】最近、これらの分泌シグナル配列を用いて
異種タンパク質を乳酸菌で分泌させようという試みが行
われているが（M. Sibacov, et al. (1991) Secretion
of TEM β-lactamase with signal sequences isolated
from the chromosome of Lactococcus lactis subsp.
lactis. Appl. Environ. Microbiol., 57, 341-348 ;W.
M. de Vos and G.F.M. Simons (1994) Gene cloning an
d expression systems in lactococci, In: Genetics a
nd biotechnology of lactic acid bacteria(ed by M.
J. Gasson and W.M. de Vos), Blackie Academic & Pro
fessional, Glasgow, pp 53-105）、今のところ宿主と
して用いられる乳酸菌や分泌できるタンパク質が限定さ
れる等の欠点がある。宿主について言えば、これまで分
泌について報告されている乳酸菌は、ラクトコッカス・
ラクチスや一部のラクトバチルス属乳酸菌のみであり、
他の多くの乳酸菌ではほとんど報告されていない。特
に、ヨーグルト製造に用いられ産業的に重要な乳酸菌で
ある、ストレプトコッカス・サーモフィルス、及びラク
トバチルス・デルブリュッキのタンパク質分泌について
は不明であり産業的応用の基礎が欠落していた。

【０００６】近年、乳酸菌のバイオテクノロジーが進展
し、食品製造などで重要な働きをする乳酸菌を遺伝子操
作によって育種できる可能性が高まっている（Michael
J. Gasson (1993) Progress and potential in the bio
technology of lactic acidbacteria, FEMS Microbiol.
Rev., 12, 3-20）。そして、タンパク質やペプチドを
乳酸菌の菌体外に分泌させることができれば、乳酸菌の
特性を変えて発酵産物であるヨーグルトやチーズの香味
やテクスチャーを改良したり、食用の有用タンパク質や
ペプチドを多量に生産することなどが期待できるため、
「分泌ベクター」の構築が望まれている。

【０００７】しかし、上述のように乳酸菌で広く用いる
ことのできる「分泌ベクター」は未だに構築されていな
いため、産業的応用のためには、研究の進んでいるラク
トコッカス・ラクチスのみならず、ヨーグルト乳酸菌を
含む多くの乳酸菌で機能する広宿主域の「分泌ベクタ
ー」が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安全性が高
く且つ適用範囲の広い「乳酸菌用分泌ベクター」及び該
ベクターによる形質転換体を提供することを目的とす
る。また本発明は、該形質転換体によるタンパク質の製
造方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、牛の第１
胃から分離された乳酸菌であるストレプトコッカス・ボ
ビス 148 が有する菌体外α-アミラーゼ遺伝子由来のシ
グナル配列を、広宿主域を示す（即ち、乳酸菌、枯草菌
及び大腸菌で複製可能である）pSYE2 プラスミドに挿入
して分泌ベクターを作成した。これを用いて様々な乳酸
菌で遺伝子産物の分泌を検討した結果、該ベクターが産
業上特に有用でかつタンパク質の分泌に関して遺伝子操
作を用いた研究報告が全くなかったストレプトコッカス
・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブリュッキに
ついて適用可能であることを見出し、本発明を完成し
た。

【００１０】即ち本発明は、乳酸菌用分泌ベクター及び
該ベクターを用いたタンパク質の製造方法に関し、具体
的には、（１）タンパク質またはペプチドの構造遺伝子
を挿入するための制限酵素部位を、ストレプトコッカス
・ボビス（Streptococcus bovis）由来の菌体外α-アミ
ラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列またはその下流配列の
いずれかの部位の直下に有する、ストレプトコッカス・
サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）種、ま
たはラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus
delbrueckii）種の乳酸菌に適用される分泌ベクター、
（２）（１）記載の分泌ベクターに異種タンパク質また
はペプチドの構造遺伝子が挿入された組換え分泌プラス
ミド、（３）（２）記載の組換え分泌プラスミドを含む
ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス
・デルブリュッキ、（４）（３）記載の形質転換体を培
養して得られる培養液から該遺伝子産物を回収すること
を特徴とする遺伝子産物の製造方法、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の「異種タンパク質の構造
遺伝子」としては、生物種を問わず、あらゆる種類の遺
伝子が挙げられる。例えば、有用酵素として、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、キモシン、リパー
ゼ、各種のグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ等が挙げ
られ、更に、生理活性タンパク質・ペプチドとして、イ
ンシュリン、インターフェロン、成長ホルモンなどの各
種ホルモン等が挙げられる。また、病原菌等の抗原とな
る表層タンパク質などを宿主細菌に分泌させて経口ワク
チンの製造を行うなど、分泌生産による応用は幅広い。
さらに、もともと分泌されるタンパク質・ペプチドはも
ちろん、本来は細胞内に局在する蛋白質に分泌シグナル
を付加して分泌させることも可能であろう。

【００１２】外来遺伝子として上記の遺伝子の他に、特
に乳酸菌においては、各種のプロテアーゼやペプチダー
ゼなどの遺伝子を用いると、該酵素を分泌する乳酸菌が
作成できるが、それらの育種株では乳タンパク質（カゼ
インなど）の分解様式が変化し、発酵産物であるチーズ
やヨーグルトなどのタンパク質やペプチドの組成が変わ
り、その結果として味や香り、更には製品のテクスチャ
ーを改良することなども期待できる。

【００１３】また、本発明の分泌ベクターには、該α-
アミラーゼ遺伝子のプロモーターの他に、乳酸脱水素酵
素遺伝子や乳糖分解酵素遺伝子等に由来する、各種プロ
モーターの適用が可能である。即ち、適当なプロモータ
ーを用いることによって、目的タンパク質の分泌量や分
泌時期を制御することが期待できる。さらに、該α-ア
ミラーゼ遺伝子プロモーターとともに該プロモーターの
上流域を同時に用いると、目的タンパク質の分泌量の増
加が認められる場合がある。

【００１４】本発明において、組換え分泌ベクターは、
目的に応じて、自律複製するベクターまたは宿主染色体
へ組込まれるベクターのいずれを利用しても構築でき
る。

【００１５】本発明の「組換え分泌プラスミドを含む形
質転換体」の培養は、用いられる宿主の菌種によって好
適な培養法を用いるのが良い。例えば乳酸菌の場合に
は、牛乳や脱脂粉乳培地、あるいは市販の M17 培地や
ラクトバチルス MRS 培地等を用いて宿主に適する温度
で静置培養するのが好適であるが、特に制限はない。ま
た、培養液からの「遺伝子産物」（目的とするタンパク
質またはペプチド）の回収は、通常用いられる方法、即
ち、遠心上清液（または濾過後の濾液）を用いて、塩析
法やアフィニティークロマト法等が適用できるが、その
方法には特に制限は無い。（もちろん、ヨーグルトのよ
うに目的のタンパク質またはペプチドを含む発酵液その
ものが有用である場合には、そもそも該遺伝子産物のみ
を回収する必要はない。） 尚、本発明における「分泌ベクター」を導入する宿主乳
酸菌、ストレプトコッカス・サーモフィルスやラクトバ
チルス・デルブリュッキは、ヨーグルト製造等に用いら
れている乳酸菌であるため人や動物にとって全く安全で
ある。したがって、安全な選択マーカーを用いれば、食
べても安全な有用タンパク質や、経口投与する医薬品
（経口ワクチンや消化酵素等）の生産にも適すると考え
られる。さらに、宿主乳酸菌の菌体内外に医薬効果を有
するタンパク質やペプチドを生産させ、培養液そのもの
を医薬品として用いることも可能であろう。

【００１６】

【実施例】以下に実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００１７】［実施例 1］ ストレプトコッカス・ボビ
ス148 菌体外α-アミラーゼ遺伝子(amyA) を発現する広
宿主域プラスミドの構築 該アミラーゼが乳酸菌で分泌されるか否かを知るため
に、amyA 遺伝子を含むDNA 断片を広宿主域プラスミド
pSYE2 へ挿入することを計画した。pBA101プラスミド
（Satoh, E., Y. Niimura, T. Uchimura, M. Kozaki,
K. Komagata (1993), Appl. Environ. Microbiol. 59,
3669-）に含まれる ストレプトコッカス・ボビス（Stre
ptococcus bovis／以後、「S.bovis」と略すことがあ
る）148 由来の菌体外α-アミラーゼ遺伝子 (amyA )
は、C 末端側をコードする配列がわずかに欠如している
ため、以下の方法で amyA 遺伝子全長を含む DNA 断片
を取得した。すなわち、先にクローニングした amyA 遺
伝子の一部をプローブとして、常法に従いコロニーハイ
ブリダイゼーションにより Sal I で消化した S. bovis
148 染色体から C 末端側を含む 約3.5 kb の DNA 断
片をクローニングした。得られた DNA 断片の Sal I -
Pvu II 断片を 「pBluescript II SK(+)」（TOYOBO社）
の Eco RV - Sal I 部位にサブクローニングした。「Ki
lo-Sequence Deletion Kit」（宝酒造社）を用いて am
yA ターミネーター下流まで短縮し、約 1.0kb の DNA
断片を得た。一方、pBA101プラスミドから amyA 遺伝子
を含む Sca I- Bam HI 断片を切り出し、pUC118（宝酒
造社）のSma I - Bam HI 部位にサブクローニングし
た。次に、得られた 2 種類のプラスミドから Bsm I -
Bam HI断片を切りだし、両断片を結合することにより a
myA 遺伝子全長を含むプラスミドを取得した。このプラ
スミドから amyA 遺伝子を含む約 2.9 kb の Eco RI -S
ma I 断片を切り出し、 「DNA Blunting Kit」（宝酒造
社）を用いて平滑化した後に、広宿主域ベクター pSYE2
プラスミド（特開平 5-176776）を Sma I で切断し脱
リン酸化したものとライゲーションした。ライゲーショ
ン反応液を Holoと Nes の方法（ Holo, H., and I. F.
Nes (1989), Appl. Environ. Microbiol., 55, 3119
-）に準じてエレクトロポレーション法によりストレプ
トコッカス・サーモフィルス（ Streptococcus thermop
hilus ／以後「S. thermophilus」と略すことがある）A
TCC 19258 に形質転換し、0.5 ％可溶性澱粉、1 ％ ラ
クトース、25 μg/ml エリスロマイシン（ 以後、Em と
略すことがある）を含む M17寒天平板培地（Difco 社）
で培養した。但し、コンピテント細胞の調製は以下のよ
うに行った。すなわち、1 ％ ラクトースを含む M17 液
体培地（Difco 社）を用いて 37℃で一晩培養した前培
養液を、同培地に 0.6 ％ グリシンと 0.175 Mスクロー
スを加え pH 5.5 に調整した培地に 2 ％ 接種し、 42
℃で 660nmにおける吸光度が OD=1.5 になるまで静置培
養したものを集菌した。得られた菌体を洗浄用緩衝液
（0.5 M スクロース、10％ グリセロール）で 2 回洗浄
し、培養液量の 1/50 容の同緩衝液に懸濁して分注後 -
80℃で凍結した。

【００１８】コロニーが出現した寒天培地にヨウ素蒸気
を噴霧し、ヨウ素‐澱粉反応によるハロー形成を調べた
結果、α-アミラーゼ陽性を示すクローンが検出され
た。得られたα-アミラーゼ陽性クローンから Anderson
と McKay の方法（Anderson,D. G., and L. L. McKay
(1983), Appl. Environ. Microbiol., 46, 549-）に従
いプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成した。これ
らのプラスミドを解析した結果、ベクター中の Em 耐性
遺伝子 (erm) の転写方向に対して amyA 遺伝子を含む
上記 2.9 kb DNA 断片が同方向に挿入されているもの
（pSAES1 プラスミド）、および逆方向に挿入されてい
るもの（pSAES5 プラスミド）が得られた（図 1 ）。精
製した pSAES1 および pSAES5 プラスミドを再び S. th
ermophilusATCC 19258 に導入した結果、Em 耐性で選択
した全ての形質転換株は可溶性澱粉を含む寒天平板培地
上でハローを形成した。したがって、S. thermophilus
ATCC19258 株が本α-アミラーゼを分泌することが判明
した。

【００１９】［実施例 2］ 乳酸菌形質転換体でのα-
アミラーゼ遺伝子 (amyA) の発現・分泌 実施例 1 で得られた pSAES5 プラスミドをエレクトロ
ポレーション法により「Streptococcus thermophilus A
TCC 19258」及び「Lactobacillus delbrueckiisubsp. b
ulgaricus（以後、L. bulgaricus と略すことがある）T
-11」（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に生命研条寄第3758号(FERM-BP-3758)として寄託されて
いる L. bulgaricus M-878 株より分離された形質転換
効率の高い株）、ラクトコッカス・ラクチス（ Lactoco
ccus lactis／以後、Lc. lactis と略すことがある）IL
1403にそれぞれ導入し、Em 耐性で選択した形質転換株
を多数得た。これらの形質転換株は可溶性澱粉を含む寒
天平板培地上でハローを形成したので、α-アミラーゼ
を分泌することが明確となった。さらに、形質転換株の
生育とα-アミラーゼ産生を経時的に調べた。すなわ
ち、25 μg/ml Em を含む M17 液体培地（Difco 社）
に、炭素源として S. thermophilus ATCC 19258(pSAES
5) では 1 ％ラクトース、Lc. lactis IL1403 (pSAES5)
では 1 ％グルコースを添加した培地を、また L. bulg
aricus T-11 (pSAES5) では 25 μg/mlEm を含む MRS
液体培地（Difco 社）を用いてそれぞれ培養した。経時
的に培養液を採り、培養液の 660 nm における吸光度に
より菌の生育を測定した。また、遠心分離により得られ
た培地上清のα-アミラーゼ活性を可溶性澱粉から遊離
する還元糖量を DNS 法（Luchsinger, W. W., and Corn
esky (1962), Anal. Biochem., 4, 364-）で定量するこ
とにより測定し、1 分間に 1 μmole のグルコースを遊
離する酵素活性を 1 ユニットと定義した。

【００２０】pSAES5 プラスミドを導入した全ての乳酸
菌形質転換株において、培地中にα-アミラーゼ活性が
認められた。いずれの乳酸菌の場合も菌の生育に伴って
α-アミラーゼ活性が増加し、培養約 6 時間目で菌の生
育が静止期に達する時期にα-アミラーゼ活性が最大と
なった。また、培養後期には活性が減少し、培養 24 時
間目には活性は消失した（図 2 ）。尚、この培養後期
の活性減少は S. bovis 148 でのα-アミラーゼ産生に
おいても同様に観察された。また、ここには示さないが
pSAES1 プラスミドを用いて同様の実験を行った場合も
α-アミラーゼの分泌が確認された。つまり、ベクター
の pSYE2 に対して amyA 遺伝子を含む DNA断片の挿入
方向に拘わらず amyA 遺伝子が発現することから、amyA
遺伝子のプロモーターがこれら 3 属の乳酸菌でも働
き、さらに、分泌シグナルも正常に機能することが明ら
かになった。したがって、本遺伝子のプロモーター、分
泌シグナルを用いれば、広く乳酸菌で機能する分泌ベク
ターの構築が期待される。

【００２１】［実施例 3］ amyA プロモーター及び分
泌シグナル配列を含む DNA 断片の取得 実施例 2 において S. bovis 148 由来 amyA 遺伝子の
プロモーター、分泌シグナル配列が異種乳酸菌 3 属に
おいて機能することが明らかになったため、これらプロ
モーター、分泌シグナル配列を利用した新規分泌ベクタ
ーの構築を検討した。そこで、amyA 遺伝子上流約 500
bp の非翻訳領域、amyA プロモーター、分泌シグナル配
列、および N 末端アミノ酸配列の一部をコードする領
域を含む断片を PCR 反応で増幅するために、配列番
号：１ に示した amyA 遺伝子の塩基配列を基にしてオ
リゴヌクレオチドプライマー、Pr1、Pr2、Pr3、Pr4（図
3 ）を合成した。尚、 amyA 遺伝子上流約 500 bp の
非翻訳領域を付加したのは、この領域がないものと比べ
て付加した方が Lc. lactis IL1403 の産生するα-アミ
ラーゼ活性が高かった結果が既に得られていたからであ
る。この際、分泌させたい外来遺伝子産物に amyA 遺伝
子産物 N 末端部分のアミノ酸が各々 1 残基、8残基、2
4 残基ずつ付加したキメラタンパク質となるよう、1 番
目、8 番目、24番目のアスパラギン酸のコドン GAT の
後に ATC を付加して Eco RV 部位 (GATATC) が導入さ
れるようにした。こうすることにより、平滑末端を有す
る外来遺伝子をこの Eco RV 部位に結合できる。さら
に、両端に Eco RI 部位と Hin dIII部位が生じるよう
にオリゴヌクレオチドを設計した。実施例 1 で構築し
た pSAES5 プラスミドを基質とし、Pr1 と Pr2、Pr3、P
r4 をプライマーとして Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造
社）を用いて、以下の条件で PCR 反応を行った。すな
わち、50 mM KCl、10 mM トリス緩衝液 (pH 8.4)、2.5
mM MgCl₂、200 μM dATP、200 μM dCTP、200 μM dGT
P、200 μM dTTP、0.1 μM プライマー（Pr1とPr2、Pr1
とPr3、Pr1とPr4 の組み合わせ）、2.5 ユニット Taq D
NA ポリメラーゼを含む反応液 50 μl を、94℃で 30
秒間、55℃で 30 秒間、72℃で 30 秒間 の反応を 25
回繰り返した。その結果、721 bp、742 bp、790 bp の
DNA 断片が特異的に増幅され、それぞれの断片を SECE
1、SECE2、SECE3 と命名した（図 3 ）。増幅された各
々の断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、EASYTRAP
^TM Ver.2（宝酒造社）を用いてゲルから回収した。

【００２２】［実施例 4］ amyA プロモーター及び分
泌シグナル配列を用いる「分泌ベクター」の構築 実施例 3 で得られた amyA 遺伝子由来のプロモーター
上流配列、およびプロモーター配列、分泌シグナル配列
を含む各断片 SECE1、SECE2、SECE3 をそれぞれ「DNA B
lunting Kit」（宝酒造社）を用いて平滑化した後、Sma
I で切断し脱リン酸化したベクター pSYE2 とライゲー
ションした。ライゲーション反応液を常法に従い大腸菌
TG1 に形質転換し、500 μg/ml Em を含む LB 寒天平
板培地で形質転換株を選択した。常法により形質転換株
からプラスミドを調製し、制限酵素による解析結果か
ら、構築したプラスミドのうち挿入した断片に含まれる
amyA プロモーターの転写方向がベクター中の Em 耐性
遺伝子と逆向きのものを、それぞれ pSECE1、pSECE2、p
SECE3（図 4 ）と命名した。本分泌ベクターの特徴は、
唯一存在する Eco RV 部位に平滑末端を有する外来遺伝
子を挿入することで分泌シグナル配列の下流に目的とす
る遺伝子を連結できることである。このとき、遺伝子の
読み枠が合うように構築されているため、挿入された外
来遺伝子は分泌シグナル配列と amyA 遺伝子産物 N 末
端アミノ酸の一部をコードする配列が付加した状態で a
myA プロモーターにより転写され、キメラタンパク質と
して翻訳される。さらに、挿入断片の両端にあるマルチ
プルクローニングサイトに含まれる制限酵素部位を用い
てカセット的に切り出すことができるため、目的遺伝子
に分泌シグナル配列を付加した後に各種プラスミドへの
サブクローニング等が容易にできる。すなわち、外来遺
伝子の挿入が容易で、宿主域の広い乳酸菌用分泌ベクタ
ー pSECE1、pSECE2、pSECE3 が構築された。

【００２３】［実施例 5］ 「分泌ベクター」によるα
-アミラーゼ遺伝子 (amyA) 産物分泌の確認 実施例 4 において構築した分泌ベクター 3 種の機能を
確認するため、まず S. bovis 148 由来 amyA 遺伝子を
挿入して、遺伝子産物であるα-アミラーゼの分泌を調
べた。amyA 遺伝子のコーディング領域を PCR 反応で増
幅するため、配列番号：１ に示した amyA 遺伝子の塩
基配列を基にしてオリゴヌクレオチドプライマー Pr5、
Pr6（図 5 ）を合成した。pSAES5 プラスミドを基質に
Pr5 と Pr6 をプライマーとして PCR 反応を行った。実
施例 3 に示した条件と同様に反応を行い、反応時間は
94℃で 30 秒間、55℃で 30 秒間、72℃で 1 分間 とし
た。その結果、約 2.2 kb の DNA 断片が特異的に増幅
され、これを断片 A とした。断片 A はプロモーターと
分泌シグナルを含まず、成熟型酵素の第 2 番目のアミ
ノ酸から最後のアミノ酸までを含む配列に相当する。増
幅された断片 A をアガロースゲル電気泳動により分離
し、常法に従ってゲルから回収した。回収した断片を
「DNA Blunting Kit」（宝酒造社）を用いて平滑化した
後、「T4 polynucleotide kinase」（宝酒造社）を用い
てリン酸化した。この断片を実施例 4で構築した分泌ベ
クター pSECE1、pSECE2、pSECE3 を Eco RV で切断し脱
リン酸化したものとライゲーションした。ライゲーショ
ン反応液を実施例 1 と同様にして S. thermophilus AT
CC 19258 にエレクトロポレーション法により導入し、2
5 μg/ml Em と可溶性澱粉を含む寒天平板培地上でのハ
ロー形成により、Em 耐性でα-アミラーゼ陽性のクロー
ンを選択した。得られた形質転換株からプラスミドを調
製し、制限酵素によって解析したところ、断片 A が am
yA プロモーターに対して正方向に挿入されていること
が確認された。断片 A が挿入された分泌プラスミドを
精製し、S. thermophilus ATCC 19258、L. bulgaricus
T-11、Lc. lactis IL1403 にエレクトロポレーション法
により導入した結果、Em 耐性で選択した全ての形質転
換株が可溶性澱粉を含む寒天平板培地上でハローを形成
したので、培地中にα-アミラーゼを分泌することが示
された。ここで、pSECE1 に断片 A を挿入したプラスミ
ドは結果として構造が pSAES5 プラスミドと同一にな
り、しかも pSAES5 プラスミドを導入した形質転換株と
同様にα-アミラーゼを分泌したことから、分泌ベクタ
ーが計画通りに正しく構築され、かつ、上記乳酸菌にお
いて正常に機能することが確認された。

【００２４】［実施例 6］ 乳酸菌での異種遺伝子の発
現・分泌（その 1：バチルス・ズブチリス由来のα-ア
ミラーゼ） 次に、実施例 4 で作成した分泌ベクターを用いて乳酸
菌での「異種遺伝子」の発現・分泌を調べるため、まず
バチルス・ズブチリス（ Bacillus subtilis／以後、
「B.subtilis」 と略すことがある）由来の菌体外α-ア
ミラーゼ遺伝子(amyE) を検討した。amyE 遺伝子のコー
ディング領域を PCR 反応で増幅するため、amyE 遺伝子
の塩基配列（Yamane, K., Y. Hirata, T. Furusato, H.
Yamazaki, and A. Nakayama (1984), J. Biochem., 9
6, 1849-）を基にしてオリゴヌクレオチドプライマー P
r7、Pr8（図 5 ）を合成した。amyE 遺伝子を含む pTUB
103 プラスミド（Yamane, K., Y. Hirata, T. Furusat
o, H. Yamazaki, and A. Nakayama (1984), J. Bioche
m., 96, 1849-）を基質に Pr7 と Pr8 をプライマーと
して、実施例 5 に示した条件で PCR 反応を行った。そ
の結果、約 1.4 kb のDNA 断片が特異的に増幅され、こ
れを断片 E とした。断片 E は amyE 遺伝子由来のプロ
モーターと分泌シグナルを含まず、成熟型酵素をコード
する配列に相当する。増幅された断片 E を実施例 5 と
同様に分泌ベクター pSECE1、pSECE2、pSECE3 の Eco R
V 部位に挿入し、断片 E が amyA プロモーターに対し
て正方向に挿入されている組換えプラスミドを S. ther
mophilus ATCC 19258 を宿主として得た。これらの形質
転換株から断片 E が挿入された分泌プラスミドを精製
し、S. thermophilus ATCC 19258、 L. bulgaricus T-1
1、 Lc. lactis IL1403にエレクトロポレーション法に
より導入し、Em 耐性で選択した全ての形質転換株が可
溶性澱粉を含む寒天平板培地上でハローを形成したこと
から、B. subtilis 由来の菌体外α-アミラーゼが S. t
hermophilus ATCC 19258、 L. bulgaricusT-11、 Lc. l
actis IL1403 でも分泌されることが判明した。ここ
で、amyE 遺伝子産物の局在性を調べるため、pSECE1 を
用いて得られた L. bulgaricus T-11、 Lc. lactis IL1
403 形質転換株の培養液を菌体外画分、細胞壁画分、菌
体内画分に分画して検討した。すなわち、L. bulgaricu
s T-11 形質転換株は25μg/ml Em を含む MRS 液体培地
で 12 時間培養し、 Lc. lactis IL1403 形質転換株は
1 ％ グルコースと 25 μg/ml Em を含む M17 液体培地
で 6 時間培養し、α-アミラーゼ活性が最大になった培
養液を遠心分離した。得られた上清を「菌体外画分」と
した。沈澱した菌体を洗浄し、4 mg/ml リゾチームを含
む 6.7 ％ スクロース- 1 mM EDTA - 50 mM トリス緩衝
液 (pH 8.0) に懸濁し、37℃で 1 時間反応して細胞壁
を分離させた後、遠心分離により得られた上清を「細胞
壁画分」とした。残った沈澱物を 20 mM リン酸緩衝液
(pH 6.0) に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離によ
り得られた上清を「菌体内画分」とした。得られた各画
分について、実施例 2 と同様の方法でα-アミラーゼ活
性を測定した。その結果、amyE 遺伝子を挿入した分泌
プラスミドを保持する形質転換株では菌体外画分にのみ
α-アミラーゼ活性が認められ（表 1 ）、amyE 遺伝子
産物が菌体外に分泌されたことが確認された。

【００２５】

【表１】 ──────────────────────────────────── 酵素活性(mU/ml) ───────────────────────────── プラスミド S.thermophilus L.bulgaricus Lc.lactis IL 1403 ──────────────────────────────────── EX CW CE EX CW CE EX CW CE ──────────────────────────────────── pSECE1-amyE − − − 87.0 ND ND 107.8 ND ND pSECE1-nuc 23.5 79.5 ND − − − 73.0 2.5 ND pSECE1-amyB ND 27.2 ND − − − − − − ──────────────────────────────────── 分泌ベクターpSECE1に各種外来遺伝子を挿入した場合の結果 EX：菌体外画分、CW：細胞壁画分、CE：菌体内画分、ND：検出されなかった、 −：実施していない 以上の結果から、本分泌ベクターを用いると S. thermo
philus ATCC 19258、L. bulgaricus T-11、 Lc. lactis
IL1403 において異種タンパク質の分泌が可能であるこ
とが判明した。また、pSECE2、pSECE3 いずれの分泌ベ
クターを用いた場合でも以上と同様の結果が得られた。
なお、元来のプロモーターおよび分泌シグナル配列を含
む amyE 遺伝子を S. thermophilus ATCC 19258、L. bu
lgaricus T-11、Lc. lactis IL1403 に導入してもα-ア
ミラーゼ活性は検出できなかった（データ略）。しか
し、ここで構築した分泌ベクター pSECE1、pSECE2、pSE
CE3 を用いることにより、もともとのプロモーター、シ
グナル配列によっては乳酸菌で発現しなかった外来遺伝
子 (amyE) が発現し、しかもその遺伝子産物が分泌され
たことから、本分泌ベクターの有用性が示された。

【００２６】［実施例 7］ 乳酸菌での異種遺伝子の発
現・分泌（その 2：スタフィロコッカス・アウレウス由
来のヌクレアーゼ） 実施例 4 で構築した分泌ベクターによる乳酸菌での異
種遺伝子の発現・分泌をさらに調べるため、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus／以
後、「S.aureus」と略すことがある）由来の菌体外ヌク
レアーゼ遺伝子 (nuc) について検討した。nuc 遺伝子
のコーディング領域を PCR 反応で増幅するため、nuc
遺伝子の塩基配列（Shortle, D. (1983), Gene, 22, 18
1-）を基にしてオリゴヌクレオチドプライマー Pr9、Pr
10（図 5 ）を合成した。nuc 遺伝子を含む pFOG301 プ
ラスミド（Shortle, D. (1983), Gene, 22, 181-）を基
質にPr9 と Pr10 をプライマーとして実施例 3 に示し
た条件で PCR 反応を行った。その結果、約 0.6 kb の
DNA 断片が特異的に増幅され、これを断片 N とした。
断片 N は nuc 遺伝子由来のプロモーターと分泌シグナ
ルを含まず、成熟型酵素をコードする配列に相当する。
増幅された断片 N を実施例 5 に示した場合と同様にし
て分泌ベクター pSECE1、pSECE2、pSECE3 の Eco RV 部
位に挿入し、S. thermophilus ATCC 19258 を宿主とし
てエレクトロポレーション法で導入した。サケ精子 DNA
の分解活性をトルイジンブルー色素の変色で検出する
Shortle の方法（Shortle, D. (1983), Gene, 22, 181
-）に従い、ヌクレアーゼ陽性クローンを選択した。得
られた Em 耐性の形質転換株のプラスミドを解析した結
果、断片 N が amyA プロモーターに対して正方向に挿
入されていることが確認された。断片 N が挿入された
分泌プラスミドを S. thermophilus ATCC 19258、L. bu
lgaricus T-11、Lc. lactis IL1403 にエレクトロポレ
ーション法で導入した結果、Em 耐性で選択した全ての
形質転換株がヌクレアーゼ陽性によるハロー形成を示
し、S. aureus 由来の菌体外ヌクレアーゼが上記乳酸菌
で分泌されることが判明した。

【００２７】次に、pSECE1 を用いて得られた S. therm
ophilus ATCC 19258、Lc. lactis IL1403 形質転換株に
ついて培養 6 時間目の培養液を用い、菌体外画分、細
胞壁画分、菌体内画分を調製した（実施例 6 と同じ方
法による）。得られた各画分について Kunitz の方法(K
unitz, M. (1950), J. Gen. Physiol., 33,363-)に従い
ヌクレアーゼ活性を測定した。その結果、全ての形質転
換株において主に菌体外画分にヌクレアーゼ活性が検出
され、細胞壁画分にも活性が認められた（前出の表
１）。pSECE2 または pSECE3 を用いても同様の結果が
得られた。以上の結果から、S. thermophilus ATCC 192
58、L.bulgaricus T-11、 Lc. lactis IL1403 において
nuc 遺伝子産物が本分泌ベクターを用いることによっ
て分泌できることが示された。また、S. aureus の nuc
遺伝子は自身のプロモーター、分泌シグナル配列を用
いても上記 3 種の乳酸菌で発現・分泌するが、Lc. lac
tis IL1403 での結果では、pSECE1、pSECE2、pSECE3 を
用いた場合の方がヌクレアーゼ活性が約10数倍高かっ
た。したがって、本分泌ベクターを用いることにより、
乳酸菌を宿主とした場合、異種タンパク質の分泌量を向
上させることができるという利点が示された。

【００２８】［実施例 8］ 乳酸菌での異種遺伝子の発
現・分泌（その 3：ストレプトコッカス・ボビス由来の
菌体内α-アミラーゼ） 実施例 6、7 に加え、本分泌ベクターのさらなる応用性
を検討するため、菌体内に局在するタンパク質として
S. bovis 148 由来の菌体内α-アミラーゼ遺伝子 (amy
B) 産物の分泌を試みた。amyB 遺伝子のコーディング領
域を PCR 反応で増幅するため、配列番号：２ に示した
amyB 遺伝子の塩基配列を基にしてオリゴヌクレオチド
プライマー Pr11、Pr12 （図 5 ）を合成した。S. bovi
s 148 染色体 DNA を基質に Pr11 と Pr12 をプライマ
ーとして、実施例 5 に示した条件で PCR 反応を行っ
た。その結果、約 1.6 kb の DNA 断片が特異的に増幅
され、これを断片 B とした。なお、amyB 遺伝子には元
来分泌シグナル配列は存在せず、断片 B は菌体内α-ア
ミラーゼの第 1 番目のアミノ酸から最後のアミノ酸ま
でを含む配列に相当する。増幅された断片 B を実施例
5 と同様にして分泌ベクター pSECE1、pSECE2、pSECE3
の Eco RV 部位に挿入して S. thermophilus ATCC 1925
8 を宿主としてエレクトロポレーション法により導入
し、断片 B が amyAプロモーターに対して正方向に挿入
されているクローンを得た。得られた形質転換株を培養
し、実施例 6 と同様にして菌体外画分、細胞壁画分、
菌体内画分を調製した。各画分について実施例 2 と同
様の方法でα-アミラーゼ活性を測定した。その結果、
pSECE1 と pSECE2 を分泌ベクターとして用いたとき S.
thermophilus ATCC 19258 の形質転換株において細胞
壁画分にのみα-アミラーゼ活性が認められた（前出の
表１）。この事実は、細胞内で合成された amyB 遺伝子
産物が分泌シグナルの作用で細胞膜を通過し、細胞壁に
達したことを示唆している。したがって、培地中へ遊離
されてはいないが、本来は菌体内に局在しているタンパ
ク質も細胞膜外に出すことが可能な場合があることが示
唆される。従って、本分泌ベクターを用いた乳酸菌での
異種タンパク質の分泌については幅広い応用が期待でき
る。

【００２９】

【発明の効果】本発明によって、人や家畜等が食べても
安全な乳酸菌を宿主とする分泌ベクターが構築された。
該ベクターは特に、ヨーグルトを含む各種発酵食品や飼
料、医薬品等の製造に応用することが可能な乳酸菌用の
分泌ベクターとして有用である。さらに、該ベクターの
利用によって、有用なタンパク質やペプチドを安全な宿
主である乳酸菌に製造させることが可能となり、また、
乳酸菌を育種してヨーグルト等の発酵食品の特性を改良
することも期待できる。

【００３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２８９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノム DNA 起源 生物名：ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus b
ovis) 株名：148 配列 ATCTGAATTC ATCGGTACAA TTGATATTAT GAATTGGTCT GATGGTATCA GTGCAGAAAT 60 TGGTTATATC ATCAACAAAA GTTTTTGGGG AGAAGGTTTT GCGACTGAAG TTAGTCAAAA 120 AATTGTTGAC TTTTGTTTTG AAGGTTTAGG GCTAAAAGAA GTTAATGGCT ATTGTGCTGT 180 TGAAAATCCG GCTTCGGCGC GAGTATTGAG TAAAATCGGC ATGGTGGAAG TAGAGCGTAT 240 CCCGAACGCA AAACAATTTA ATGGAAAATG GGTGACTTTT CAACATTTTC AAATCAAAAA 300 ATAATTTTAG TTTTAAAATT TTTACCACAT TCCCGATTAA ATTATCAAAA AATTGTCATT 360 ATTTGTTTGC GTTTTCATAA AAATGTGTTA TACTTTTATT GAATATGCAA CCGATTGCAA 420 AATAAAAAGA GTGTTTAGGA GGACAGCTTA TACGTTAATC ATAATAGCAG TGTTATTTTA 480 GAATTAGCAG AATAGTATGT GATTGATTGG GCAGGTTTCG CACATCGTTC TGGCTTATTT 540 TTTTACAGTT CAACGAAAAC GGTTGCGTAT TTTAATTTAT CTTTTTAGGA GATTATCCAT 600 GACATTTCAG AATAAAGTAA ATTTGAAAAA GAAGATGAAA AAAAGTCTAG GTTCATTGCT 660 TATTTTAACA GCTATTGGTG CTGGCGGATT AGTTCAAGTT AAAGTCGTTA ATGCAGATGA 720 ACAAGTGTCA ATGAAAGATG GTACGATACT TCATGCGTGG TGCTGGTCTT TCAATACCAT 780 TAAAGATAAT ATGCAAGCCA TTAAAGACGC AGGTTACACA AGTGTTCAAA CGTCCCCAAT 840 CAACACTGTT GTAGCTGGCG AAGGCGGAAA TAAGAGTTTA AAAAATTGGT ACTATCAATA 900 TCAACCAACT ATTTATAAAA TCGGTAACTA TCAATTAGGT ACTGAAGAAG AGTTTAAAGA 960 AATGAATCGT GTGGCTGATC AATACGGTAT TAAAATTATT GTGGATGCCG TCTTAAACCA 1020 CACAACTTCA GATTACAATC AAATCAGTCA AGAAATCAAA AACATCCCTA ACTGGACACA 1080 CGGAAACACT CTCATTTCTG ATTGGCATAA TCGCTACGAT GTTACTCAAA ATGCACTTCT 1140 TACACTTTAT GATTGGAATA CTCAAAATGA ATATGTCCAA CAATATTTGT TGAGTTATTT 1200 GAAACAAGCA GTAGCTGATG GTGCGGACGG TTTCCGCTAT GATGCCGCAA AACACATTGA 1260 ATTGCCAGGC GAATACGGCA GCAACTTCTG GAATGTTATT TTGAACAACG GTTCTGAGTT 1320 CCAGTACGGA GAAATTTTGC AGGATGATGT TTCAAATGAT GCTGGCTACG GTAAGTTGAT 1380 GAGTATCACT GCTTCAAATT ACGGTCAAAA AATCCGTTCA GCGCTAAAAG ACCGTCATAT 1440 CTCAGCAGGC AATTTGATGA ATTATCAAGT TTCAGGCGTT GACGCAGCAA ATCTTGTTAC 1500 CTGGGTAGAA TCACATGACA ATTATGCAAA TGATGACCAA GAATCAACTT GGATGAATGA 1560 TAGTGATATT GGTCTTGGAT GGGCTATGAT TACAGCTCGC GCTAAAGGAA CACCGTTGTT 1620 CTTCTCACGT CCAGTCGGTG GTGGTAATGG CACACGATTC CCAGGTCAAT CACAAATTGG 1680 TGATGCAGGT AGCAATCTTT ACAAAGACGC GACAGTGACT GCTGTTAATA AATTCCATAA 1740 TGCCATGGTT GGAGAATCAG AATACCTTCG TAATCCTGGT GGTGATGAAC AAGTTGCAAT 1800 GATTGAACGT GGCACAAAAG GTGCTGTTAT TGTGAACCTT GTTGACGGCG ACAAACAAAT 1860 TAATTCTGAA ACTAATTTGG CTGATGGTAC ATACACTGAC AAGGTTTCTG GTCGACAATT 1920 TAATGTTTCA AATGGTCGTA TTACAGGTAG CGTTCCATCA CGCTCAGCCG TTGTTTTGTA 1980 TGATGACCAA GCTAGCCAAG CAGCTCAAGT TTCAGTTGAT GGTTACAAAG AAGGCGACAA 2040 TAGCATTTCT AAAGCCACAG AAGTAACATT GAAAGCTAAA AATGCTGACT CTGCGACTTA 2100 CAAACTTGGT AATGGTCAAG AGGTAGCTTA TAAAGACGGT GATAAAGTCA CTGTTGGTGA 2160 AGGGCTTGAA GCTGGTCAAT CAACTACTCT AACATTGACT GCAACAGGAG CTGACGGTCA 2220 ATCAACAACG AAGACATACA CTTTCACAAT GAAAGACCCA AGTGCTGAGA CTAACATTTA 2280 CTTCCAAAAC CCAGATAATT GGTCAGAAGT GTATGCTTAC ATGTATTCAG CAAAAGATAA 2340 TAAACTTCTT GGCGCATGGC CTGGAACTAA GATGACTAAA GAAGCATCAG GTCGTTATTC 2400 AATCACAGTT CCTGCTTCAT ATGCTGAAGA AGGTGTGAAA GTAATCTTCA CAAATAATCA 2460 AGGCTCACAA TATCCACAAA ATGAAGGATT TGATTTCAAA GCAGAAGGCT TGTACTCAAA 2520 AGCTGGTTTG ATGCCTGATG TGCCAGCAGG AAAAACTCGT GTAACCTTTG ATAACCCTGG 2580 CGGTTGGGAT AGTGCGAATG CTTACCTCTA CTACGGAAAT CCTGTTCAAT ACCCTCTAGG 2640 TGTGTGGCCT GGAACACAAA TGACTAAAGA TGATGCTGGT AATTTCTACC TCGATCTCCC 2700 AGAAGAATAT GCTGATGTAA ATGCAAAAAT CATCTTTAAT CAGCCTGGAA CAAGCAACCA 2760 ATATCCTTAT AGTGAAGGAT TTAACCTTGT AAAATCTGGA AACTATAATA AAGATGGGCT 2820 AAAATAATTG TCCTTATCTC AATTCTAACT CCTTTCCCTA AGAAGTAGCT TTTCCCTCAG 2880 GCTACTTCTT TTTGTACTC 2899 配列番号：２ 配列の長さ：１６０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノム DNA 起源 生物名：ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus b
ovis) 株名：148 配列 ACTAATGAAA CTTTAATGCA ATACTTTGAA TGGTACCTGC CAAACGATGG TAAACACTGG 60 ATGCGATTAG CGGCTGATGC TCCTACACTT GCTCAAAAAG GTATCACAAA AATTTGGATG 120 CCTCCAGCGT TTAAAGCTAC TCATGATGGC GACGTTGGTT ATGGCGTTTA TGACCTTTTT 180 GACCTCGGTG AATTTGACCA AAAAGGGACT ATCCGAACAA AATACGGAAC CAAAGCTGAC 240 TATCTACAAG CAATTTCTGC TTTAAAAGAA AATCATATTG CACCTTTAGC TGATGTTGTC 300 TTAAATCACA AAGCTGCTGC TGACCATACT GAAACTTTTT CCGTTGTCGA AGTTGCCCCC 360 GATGACCGTA CAAAAATTAT CAGTAAACCT TTTGACATTG AAGGCTGGAC AAACTTCACT 420 TTTGATGGTC GACATAAAGC TTACAATGAT TTTGAATGGC ATTGGTACCA CTTTACTGGA 480 ACGGATTATG ATGTAAAAAC TGGTAAAAAC GGTATTTTCC AAATTCAGGG TGACAACAAA 540 GGTTGGGCAA ATCAAGATTT GGTTGATGGC GAAAATGGCA ATTACGACTA TCTTATGTAT 600 GCTGACCTTG ATTTTAAACA CCCAGAAGTT ATCAAAAATA TCTATGACTG GGCAGAATGG 660 TTCGTCGAAA CAACAGGAGT TTGTGGTTTT CGCTTGGATG CTATCAAGCA TATCGATTCA 720 TTCTTTATGA GCAATTTCAT CCGCGATATG AAGGAAAAAT ACGGTAAGGA TTTTTATGTT 780 TTTGGCGAAT TCTGGAACGG TGATGAAAAA ACTAACAATG ACTACCTTGC AACGACTGGA 840 CACCGCTTCG ATCTAATTGA TGTTCGTCTC CACCAAAATC TTTTTGAAGC AAGCAAAGAA 900 AAAGCTCATT ACGATTTACG ACAAATTTTT AATCATACCT TGGTGAAAAA TCAGCCTAAC 960 TCTGCCGTTA CTTTCGTTGA CAACCATGAT ACCCAACGAG GACAAGCTCT TGAATCTACA 1020 ATTGACGAAT GGTTCAAACC AGCGGCTTAC GCTCTCATCT TACTTCGCCA AACTGGTCTT 1080 CCATGCATCT TCTACGGTGA CTACTACGGC ATTTCAGGTG AATTTGCACA ACAAGACTTT 1140 CAAGATGATA TTGATAAGTT ACTTTTCTTA AGACAAGCAG CTGTTTATGG TAAAGAAATG 1200 AACTATTTTG ACAATCCAAA CTGCATTGGT TGGTCATATC TTGGAGATAA AGAGCATCCT 1260 ACTTCTCTTG CTGTTTTAAT CAACAACGCT CATTCTACAG CAAAACGAAT GTTTGTAGGC 1320 AAAAAATGGG CAGGAAAAAC GTTTACAGAT TATCTCGGAA ATCAAAATTC TACTATCGTC 1380 ATTGACGAAG AAGGTTACGG CAGTTTTCCA GTTGGCGCAG AATCCGTCTC TGCTTATATT 1440 CCACAAGATC AATAAATCAT CTTATAAAAC AAAAAACGAT TAGACTTTAA ATCTAATCGT 1500 TTTTACATAA TTATTTTTAT GTATTACATT ACCCAGCTTG TGCTGTTTGC ATTTGATAGT 1560 AGACACCTTG TTTTGCCATT AATTCTGCGT GTGTGCCATG TTC 1603

【図面の簡単な説明】

【図１】pSAES5 の制限酵素地図である。図中、細線は
pSYE2 ベクター部分、横縞の矢印 (amyA) は amyA 構造
遺伝子、縦縞の部分は同 5'-側非翻訳領域、塗りつぶし
矢印 (erm) は pSYE2 のエリスロマイシン耐性遺伝子お
よびその転写方向を示す。四角で囲まれた部分はマルチ
プルクローニングサイトに含まれる制限酵素部位を示
す。なお、pSAES1 は 5'-側非翻訳領域と amyA 構造遺
伝子が pSAES5 とは逆向きに挿入されており、その他の
構造は pSAES5 と同一である。

【図２】pSAES5 を導入した S.thermophilus ATCC 1925
8、L.bulgaricus T-11、Lc.lactis IL1403 形質転換株
の生育とα-アミラーゼ産生を経時的に示した図であ
る。図中、破線は 660 nm における培養液の吸光度を、
実線は培地中のα-アミラーゼ活性を示している。

【図３】オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図であ
る。Pr1 の配列は、Streptococcus bovis 148 の菌体外
α-アミラーゼ遺伝子 (amyA) の 5'-側非翻訳領域に存
在する Eco RI の認識部位の 4 塩基上流からの配列に
相当し、配列番号：１ の第1 番目から第 20 番目まで
の塩基配列からなる。Pr2 の配列は、Hind III EcoRV
の認識部位と、同じく第 699 番目から第 718 番目まで
の塩基配列の相補配列からなる。Pr3 の配列は、Hind I
II Eco RV の認識部位と、同じく第 720 番目から第 7
39 番目までの塩基配列の相補配列からなる。Pr4 の配
列は、Hind III Eco RV の認識部位と、同じく第 768
番目から第 787 番目までの塩基配列の相補配列からな
る。断片 SECE1 は、amyA 遺伝子上流の Eco RI の認識
部位から約 500 bp の非翻訳領域、プロモーター、分泌
シグナル、および菌体外α-アミラーゼ成熟型酵素 N 末
端の第 1 番目のアミノ酸までに相当する配列を含む。
断片 SECE2 は、amyA 遺伝子上流の Eco RI の認識部位
から約 500 bp の非翻訳領域、プロモーター、分泌シグ
ナル、および菌体外α-アミラーゼ成熟型酵素 N 末端の
第 8 番目のアミノ酸までに相当する配列を含む。断片
SECE3 は、amyA 遺伝子上流の Eco RI の認識部位から
約 500 bp の非翻訳領域、プロモーター、分泌シグナ
ル、および菌体外α-アミラーゼ成熟型酵素 N 末端の第
24 番目のアミノ酸までに相当する配列を含む。

【図４】分泌ベクター pSECE1 の制限酵素地図である。
図中、細線は pSYE2 ベクター部分、横縞の矢印は断片
SECE1 および断片中のamyA 遺伝子由来プロモーターの
転写方向を、塗りつぶし矢印は pSYE2 のエリスロマイ
シン耐性遺伝子およびその転写方向を示す。四角で囲ま
れた部分 (MCS1と MCS2) はマルチプルクローニングサ
イトに含まれる制限酵素部位を示す。なお、pSECE2 と
pSECE3 は断片 SECE2 と SECE3 がそれぞれ pSECE1 と
同様に挿入されているもので、その他の構造は pSECE1
と同一である。

【図５】オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。Pr5 の
配列は、S.bovis 148 の菌体外α-アミラーゼ成熟型酵
素の第 2 番目のアミノ酸からの配列に相当し、amyA 遺
伝子の塩基配列（配列番号：１ ）の第 719 番目から第
738 番目までの塩基配列からなる。Pr6 の配列は、Xba
I の認識部位と、同じく第 2,880 番目から第 2,899
番目までの塩基配列の相補配列からなる。Pr7 の配列
は、B.subtilis の菌体外α-アミラーゼ成熟型酵素の第
1 番目のアミノ酸からの配列に相当し、amyE 遺伝子の
塩基配列（Yamane, K., Y. Hirata, T. Furusato, H. Y
amazaki, and A. Nakayama (1984), J. Biochem., 96,
1849-）の第 124 番目から第 143 番目までの塩基配列
からなる。Pr8 の配列は、amyE 遺伝子の 3'-側非翻訳
領域を含む配列に相当し、同じく第 1,525 番目から第
1,544 番目までの塩基配列の相補配列からなる。Pr9 の
配列は、S.aureus の菌体外ヌクレアーゼ成熟型酵素の
第 1 番目のアミノ酸からの配列に相当し、nuc 遺伝子
の塩基配列（Yamane, K., Y. Hirata,T. Furusato, H.
Yamazaki, and A. Nakayama (1984), J. Biochem., 96,
1849-）の第 406 番目から第 425 番目までの塩基配列
からなる。Pr10 の配列は、amyE 遺伝子の 3'-側非翻訳
領域を含む配列に相当し、同じく第 947 番目から第 96
6 番目までの塩基配列の相補配列からなる。Pr11 の配
列は、S.bovis 148 の菌体内α-アミラーゼの第 1 番目
のアミノ酸からの配列に相当し、amyB 遺伝子の塩基配
列（配列番号：２ ）の第 1 番目から第 19 番目までの
塩基配列からなる。Pr12 の配列は、amyB 遺伝子の 3'-
側非翻訳領域を含む配列に相当し、同じく第 1,584 番
目から第 1,603 番目までの塩基配列の相補配列からな
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 佐々木 泰子 東京都東村山市栄町 １−21−３明治乳業 株式会社中央研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タンパク質またはペプチドの構造遺伝子
   を挿入するための制限酵素部位を、ストレプトコッカス
   ・ボビス（Streptococcus bovis）由来の菌体外α-アミ
   ラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列またはその下流配列の
   いずれかの部位の直下に有する、ストレプトコッカス・
   サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）種、ま
   たはラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus
   delbrueckii）種の乳酸菌に適用される分泌ベクター。
2. 【請求項２】 請求項１記載の分泌ベクターに、異種タ
   ンパク質またはペプチドの構造遺伝子が挿入された組換
   え分泌プラスミド。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組換え分泌プラスミドを
   含むストレプトコッカス・サーモフィルスまたはラクト
   バチルス・デルブリュッキ。
4. 【請求項４】請求項３記載の形質転換体を培養して得ら
   れる培養液から該遺伝子産物を回収することを特徴とす
   る遺伝子産物の製造方法。