DD275478A1 - Herstellungsverfahren fuer expressionsvektoren zur thermoinduzierbaren genexpression in grampositiven bakteriellen wirten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konstruktion und Erprobung von neuen Vektorplasmiden, die fuer eine thermoinduzierbare Expression von Genprodukten in grampositiven bakteriellen Wirten verwendbar sind. Sie verfolgt das Ziel, erstmals derartige Vektoren fuer eine effiziente Auspraegung von Genprodukten in grampositiven Wirtsorganismen mittels Thermoinduktion bereitzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem - durch gerichtete in vitro-Mutagenese unmittelbar stromauf des Leserahmens des Lambda-cI857-Repressorgens ein Restriktionsort erzeugt wird,-unter Nutzung dieses Restriktionsortes das cI857-Gen mit in grampositiven Mikroorganismen funktionsfaehigen Expressionssignalen, vorzugsweise der Expressionseinheit des Staphylokinase-Gens des S. aureus-Phagen 42D, gekoppelt wird, und-gleichzeitig hierbei Expressionsvektoren erzeugt werden, mit denen unter Kontrolle des Lambda-PR-Promotors eine thermoinduzierbare Expression von ausgewaehlten Genen in grampositiven Wirtsorganismen durchfuehrbar ist.In der bevorzugten Ausfuehrungsform der Erfindung werden die Expressionsvektoren pBS52, pBS71 und pBS72 erhalten, mit denen eine thermoinduzierbare Auspraegung von Alpha-Amylase bzw. Staphylokinase in Bacillus gelingt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konstruktion und Erprobung von Vektorplasmiden, die für eine thermoinduzierbare Expression von Genprodukten in grampositiven bakteriellen Wirten einsetzbar sind. Diese Plasmide können vorteilhaft für die durch Veränderung der Kultivierungstemperatur der Wirte regulierbare Expression von sekretorischen Proteinen herangezogen werden.

Die Erfindung bietet Nutzungsmöglichkeiten in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit in der pharmazeutisch-chemischen Industrie, deren Produkte ihrerseits in der Human-und Veterinärmedizin sowie in der Pflanzen- und Tierproduktion verwendet werden, und in der Nahrungsmittelerzeugung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die industrielle Gewinnung von Wirkstoffen mit Hilfe gentechnisch veränderter Mikroorganismen hat eine ständig zunehmende Bedeutung, da sie die Möglichkeit bietet, sowohl eine Massenproduktion von schwer zugänglichen Proteinen durchzuführen als auch neue, bisher nicht bekannte Wirkstoffe biotechnologisch herzustellen bzw. bekannte zu modifizieren. Seit den 70er Jahren werden in ständig wachsender Zahl Gene aus Prokaryoten und Eukaryoten isoliert und in mikrobiellen, insbesondere bakteriellen Wirten, wie E.coli, kloniert und exprimiert (siehe etwa E.-LWinnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim, 1984). Um die Nachteile auszuräumen, die entstehen, wenn Genprodukte ausgeprägt werden sollen, die das Wachstum des Wirtsorganismus hemmen oder gar toxisch für den Produzentenstamm sind, wurden - primär wiederum für E. coliinduzierbare, d. h. zu einem gewünschten Zeitpunkt der Kulturführung anschaltbare, Expressionssysteme entwickelt. Unter diesen speziellen Expressionssystemen haben diethermoregulierten den Vorteil, daß sie durch einen einfachen Shift der Kultivierungstemperatur (etwa von 30⁹C auf 42°C) angeschaltet werden können. Im Vergleich zu den durch Metabolitkonzentration regulierten, chemisch induzierbaren Expressionssystemen, wie z. B. dem Iac- oder dem frp-Operon, bedürfen sie keiner Zugabe eines spezifischen, meist aufwendig herstellbaren Induktors. Von den durch Temperaturveränderung induzierbaren Expressionssystemen ist das Promotor-Repressor-System der frühen Gene des E. co/Z-Phagen Lambda am intensivsten untersucht (vgl. Ptashne, M., A Genetic Switch, Gene Control and Phage Lambda, Cell Press & Blackwell Sei. Publ., 1986), so daß es als klassisches Modell derthermoregulierten Genexpression in E.co/i-Wirten gilt.

In diesem Modell erfolgt die Regulation auf der Transkriptionsebene. Sie beruht auf dertemperaturabhängigen Ausbildung oder Zerstörung des Komplexes eines temperaturlabilen Cl-Repressorproteins mit den Operator-Regionen der DNS-Sequenz der P_L- bzw. PR-Promotorregion des Phagen Lambda. Bei Temperaturn unter 30⁰C liegt der Repressor in einer Konformation vor, die seine Bindung an die Operator-Sequenz und damit die Verhinderung der Transkription durch eine sterische Beeinflussung der Wechselwirkung der RNS-Polymerase mit der Promotorsequenz bewirkt. Bei höherer Temperatur denaturiert das Repressorprotein und dissoziiert vom Operator. Bei 42⁰C sind alle Repressormoleküle inaktiviert, wodurch der Promotor für die Transkriptionsinitiation freigegeben und die Expression des mit diesem Promotor fusionierten Genes angeschaltet wird. Da die Lambda-Promotoren Pl und Pr starke E. co/APromotoren sind, wurde das Lambda-Promotor-Repressor-System zur effizienten Expression von heterologen Genen in diesem Wirt eingesetzt. Beispielhaft wurde diese Prinziplösung u.a. bei der Expression der Gene für Human-Interferone der Typen Alpha, Beta und Gamma, für T4-DNS-Ligase, für Human-Interleu kin 2, für tierische Wachstumshormone sowie für Human-Cu/Zn-Superoxid-Dismutase angewendet (vgl. etwa Remaut E. et al. [1983] Gene 22,103-113; Devos R. et al. [1983] Nucl. Acids Res.11,4307-4323; Simons G. et al. [1984] Gene 28,55-64; George HJ. et al. [1985] DNA 4,273-281; Hartman J. R. et al. [1986] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83,7142-7146 sowie Patentschrift DD 251787). In der genannten Patentschrift wird zur Vermeidung der in E.co/i-Wirten unter Induktionsbedingungen häufig auftretenden Plasmidinstabilitäten sowie zur weiteren Erhöhung der Ausbeute des zu erzeugenden Polypeptids die Einfügung von Transkriptionsterminatoren stromab des auszuprägenden Gens in Verbindung mit dem Einsatz von high-copy-Replikons beschrieben.

Als Wirte für das thermoregulierbare Lambda-System wurden bisher ausschließlich gramnegative Mikroorganismen, insbesondere E.co/i-Stämme eingesetzt (vgl. Murooka Y. & Mitani I. [1985] J. Biotechnol. 2,303-316; Davison J. et al. [1987] Gene 60,227-235).

Für Bacillus sind bis heute lediglich zwei Beispiele einer thermoregulierbaren Genexpression beschrieben worden. Beide beruhen in Analogie zum Lambda-System auf der De-/Repression eines frühen Promotors des Bacillus si/bf/7/s-Phagen 0105 durch ein Repressorprotein dieses Phagen. Dabei handelt es sich zum einen um das temperaturlabile Cts23-Repressorprotein (Osburne M.S. et al. [1985] J. Bacteriol. 163,1101-1108) und zum anderen um das nicht-temperatursensitive Wildtyp-Repressorprotein, dessen Gen sich auf einem temperaturempfindlichen Replikon befindet (Dhaese P. et al. [1984] Gene 32, 181-194; Patentschrift GB 2166743).

Für beide Konstruktionen besteht der Hauptnachteil, daß der regulierbare frühe Promotor des B.subtHls-Phagen 0 105 im Vergleich zu anderen bekannten B.subtiHs-Promotoren als schwach eingestuft werden muß. Das Niveau der Expression, die bisher lediglich am Beispiel eines Antibiotika-Resistenzgens demonstriert wurde, liegt eine Größenordnung unter der Leistungsfähigkeit der bekannten B.subtiHs-Promotoren spoOI bzw. spo02(vgl. Osburne et al., a.a.O.). Beide Konstruktionen weisen außerdem den Nachteil auf, daß keine volle, sondern lediglich eine 24f ache Repression der Expressionsrate erreichbar ist (Fortbestehen einer Restaktivität). In beiden Fällen befinden sich weiterhin das Repressorgen und die Promotor/Operator-Region auf zwei separaten Plasmiden, so daß zur Aufrechterhaltung des Selektionsdruckes gleichzeitig zwei Antibiotika supplementiert werden müssen. Darüber hinaus kann die Derepression im Falle des binären Systems mit dem temperatursensitiven Replikon erst nach einigen Generationen des Wachstums der Kultur bei 42°C eintreten, nachdem nämlich das C-0105-Repressorplasmid ausverdünnt ist.

Bei den Versuchen, das effiziente Promotor-Repressor-System des E.co/APhagen Lambda auch in B.subtilis, einem grampositiven Wirt, zu etablieren, der aufgrund einer Reihe von Vorteilen für die Gewinnung gentechnischer Produkte zunehmende Bedeutung erlangt, konnte bisher keine thermoinduzierbare Genexpression erreicht werden (Murooka Y. et al. [1986] Appl. Microbiol. Biotechnol. 24,504-508). Die Ursache hierfür ist darin zu sehen, daß es bisher nicht gelang, das Lambda-Cl-Repressorprotein in diesem Wirtssystem zur Expression zu bringen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, erstmals Expressionsvektoren für eine effiziente thermoinduzierbare Ausprägung von Genprodukten in grampositiven bakteriellen Wirten bereitzustellen.

-β- 275 478 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrstufiges gentechnisches Verfahren zu beschreiben, mit dem stabile Expressionsvektoren für eine thermoinduzierbare Ausprägung von Genprodukten in grampositiven bakteriellen Wirten konstruiert werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Unter Nutzung von Abschnitten gentechnischer Standardoperationen der DNS-Rekombination und der Einbringung von DNS in bakterielle Rezipienten wird das Verfahren eingeleitet, indem in einer bereitgestellten Target-DNS, die sowohl das komplette Gen für das Cl 857-Repressorprotein (Kurzwort: c/857-Gen) als auch die Ря-Promotorregion des E. co/Z-Phagen Lambda in nativer Anordnung trägt, unmittelbar stromauf des Leserahmens des c/857-Repressorgens durch gerichtete in-vitro-Mutagenese ein Restriktionsort erzeugt wird und die so modifizierte Target-DNS gewonnen wird. Nach diesem Schritt I wird die modifizierte Target-DNS, die die mutagenisierte Lambda-P_R-c/857-Region enthält (Kurzwort: mutagenisierte Teilsequenz), in einen Plasmidvektor inseriert, der in grampositiven bakteriellen Wirten repliziert und ein zu exprimierendes Gen (Kurzwort: Zielgen) enthält. Auf diese Weise werden Zwischenplasmide der pBS-Familie erhalten (Schritt II). Im nachfolgenden Schritt III wird das Lambda-c/857-Gen unter Nutzung des erzeugten Restriktionsortes mit Expressionssignalen verknüpft, die in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähig sind. Klone mit den auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmiden werden phänotypisch auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Zielgens überprüft. Durch Klonierung in jeweils einem bakteriellen Rezipienten wird die für den abschließenden Schritt IV des Verfahrens erforderliche Menge der erhaltenen Expressionsvektoren der pBS50-Familie gewonnen.

In Komplettierung des Verfahrens wird, falls erforderlich, die Box des Zielgens der in Schritt III erhaltenen Expressionsvektoren der pBS 50-Familie durch eine alternative Genbox substituiert. Die in diesem Schritt IV erhaltenen Klone mit rekombinanten Plasmiden der pBS71/72- bzw. pBS81/82-Familie werden phänotypisch auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des alternativen Gens überprüft und das auf diese Weise in submerser Kultivierung der eingesetzten rekombinanten grampositiven Wirte hergestellte Genprodukt erforderlichenfalls gesammelt.

In der weiteren Ausgestaltung dieses Grundzuges der Erfindung wird die in Schritt I eingesetzte Target-DNS mit der Pr-Promotorregion und dem c/857-Repressorgen aus einem rekombinanten Phagen, vorzugsweise aus einem rekombinanten Eco//-Phagen der M 13-Familie oder alternativ aus dem nativen E.co/Z-Phagen Lambda bzw. aus einem rekombinanten Plasmidvektor, bereitgestellt. In diese Target-DNS wird durch das an sich bekannte Teilverfahren der gerichteten in-vitro-Mutagenese unmittelbar stromauf des Leserahmens des c/857-Repressorgens ein DNS-Segment eingefügt, welches eine Hexanukleotid-Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, so für die Enzyme BgIIl bzw. Sal I, vorzugsweise jedoch für die Restriktase BamHI, aufweist.

Die so modifizierte Target-DNS bzw. mutagenisierte Teilsequenz wird anschließend aus der replikativen (doppelsträngigen) Form des eingesetzten Spenders, vorzugsweise aus der replikativen Form des eingesetzten M13-Phagen, auf einem Restriktionsfragment gewonnen und für den Folgeschritt Il bereit gehalten.

Für diesen Schritt Il wird die mutagenisierte Teilsequenz nun in ein in grampositiven bakteriellen Wirten replizierendes Promotorsuchplasmid integriert. Die erfolgreiche Klonierung der mutagenisierten Teilsequenz ist hierbei anhand der Expression des Indikatorgens (Zielgens) erkennbar. Als Indikatorgen wird hier vorzugsweise auf eine amy-Genbox zurückgegriffen. Die auf diese Weise erhaltenen Zwischenplasmide der pBS-Familie werden aus den rekombinanten grampositiven bakteriellen Wirten isoliert und für den nachfolgenden Schritt III des beschriebenen Verfahrens zur Verfugung gestellt. Dieser Schritt besteht darin, in wenigstens einem dieser pBS-Zwischenplasmide unter Nutzung des eingefügten Restriktionsortes für ein Enzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenz ein DNS-Fragment zu inserieren, das die in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen nativen Expressionssignale eines bakteriellen Gens bzw. eines Gens eines Bakteriophagen, vorzugsweise eines Gens eines Staphylococcus aureus-Phagen, enthält. Klone der grampositiven bakteriellen Rezipienten mit den so erhaltenen rekombinanten Expressionsvektoren der pBS 50-Familie werden mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des jeweiligen Zielgens überprüft. Anschließend werden die benötigten Mengen an DNS dieser Vektoren aus Kulturen der rekombinanten Rezipienten gewonnen und für den gegebenenfalls erforderlichen abschließenden Schritt IV des Verfahrens bereitgestellt.

In diesem Schritt wird in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die Box des Indikatorgens durch eine alternative Genbox für ein intrazelluläres bzw. sekretorisches Protein pro- bzw. eukaryotischer Herkunft substituiert. Vorzugsweise erfolgt diese Substitution durch eine Genbox für ein sekretorisches Protein aus einem Bakterium oder einem Bakteriophagen. Die Rezipienten-Klone mit den auf diese Weise in Schritt IV hergestellten Expressionsvektoren der pBS71/72-sowie pBS80/81-Familien werden wiederum mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des alternativen Strukturgens überprüft. Aus Kulturen dieser rekombinanten grampositiven bakteriellen Wirte werden die benötigten Mengen Plasmid-DNS dieser Expressionsvektoren gewonnen.

Für das phänotypische Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des auf dem jeweiligen pBS-Expressionsvektor enthaltenen Zielgens - auch alternative Gene obiger Kennzeichnung werden unter dem hier beschriebenen Aspekt nunmehr allgemein als Zielgene verstanden - wird ein Mikroorganismenstamm der Gattung Bacillus, vorzugsweise ein Stamm der Art Bacillus subtilis, eingesetzt. Das mit diesen Vektoren herstellbare Genprodukt wird erforderlichenfalls nach Submerskultivierung der eingesetzten rekombinanten grampositiven Wirte gesammelt.

Für die Ausführung des phänotypischen Screenings sowie für die Ausprägung des jeweiligen Zielgens wird entweder am Beginn der Hauptkultur oder in der frühen Wachstumsphase des herangezogenen, mit einem pBS-shuttle-Expressionsvektor transformierten, grampositiven bakteriellen Wirtsstammes ein Thermo-Induktionsschritt durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt dabei die Erhöhung der Kultivierungstemperatur von 28°C bis 30°C auf 37⁰C bis 42"C innerhalb eines Zeitintervalls von 3 Minuten. Anschließend wird die Kultivierung jeweils noch bis zu 30 Stunden fortgesetzt.

In der bevorzugten Ausführungsform wird im Startteil des Verfahrens das c/-857-Repressorgen des £ co/Z-Phagen Lambda mit solchen Expressionssignalen verknüpft, die in Zellen von B.subtilis realisiert werden, um so das temperatursensitive Repressorprotein erstmals in diesem Wirtssystem auszuprägen zu können. Da die natürliche DNS-Sequenz des Lambda-Phagen

in dieser Region keinen Restriktionsort für eine derartige Verknüpfung aufweist, wird in einem ersten Schritt unmittelbar stromauf des Leserahmens des cA857-Gens nunmehr ein BamHI-Ort erzeugt. Als Ausgangssequenz wird hierzu die DNS des rekombinanten Phagen

M 13tg 730(P_R cA857 /fnß)Pstl

herangezogen.

Dieser Phase ist gewonnen worden, indem in den singulären Pstl-Ort des Polylinkers der DNS des literaturbekannten E. coil· Phagen M13 tg 130 ein 1783 bρ großes DNS-Fragment inseriert wurde, welches das komplette Gen für das temperaturlabile CI-857-Repressorprotein des Bakteriophagen Lambda in der nativen Anordnung zu den Promotoren P_RM und Pr enthält. Die Sequenz der P_R-Promotorregion einschließlich des RBS des Lambda-cro-Gens ist auf diesem Insert darüber hinaus mit der N-terminalen Teilsequenz eines Human-/7hß-Gens verknüpft (Abb. 1). Der so konstituierte rekombinante M 73-Phage wurde nach dem Verfahren einer früheren Erfindung des VNII Genetika (UdSSR) erhalten, welche die Konstruktion von Vektoren zur Expression von hlfnß in E. coliunter der Kontrolle von Lambda-Signalen betrifft.

Zur Erzeugung des BamHI-Ortes wird die an sich bekannte Methode der gerichteten in vitro-Mutagenese unter Einsatz eines für diesen Fall bereitgestellten 43mer-Oligodeoxynukleotids angewendet. Dieses Oligonukleotid ist so aufgebaut, daß die einzufügende DNS-Sequenz- diese enthält in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung den gewünschten BamHI-Ort -an beiden Termini von jeweils einer Sequenz flankiert wird, die eine für die Hybridisierung ausreichend stabile Basenpaarung zu den an den beabsichtigten Insertionsort angrenzenden Nukleotiden der cAAusgangssequenz gewährleistet. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Oligonukleotid folgender Sequenz eingesetzt:

5' GGTGATAGATTTAAGGAGGGATCCATAATGAGCACAAAAAAGA 3';

dieses enthält den Erkennungsort für die Restriktase BamHI in der neu einzufügenden Sequenz (doppelt unterstrichen) unmittelbar stromauf des Leserahmens des Lambda-c/-857-Repressorgens. Die flankierenden, zur Ausgangssequenz des kodierenden Stranges komplementären Regionen umfassen jeweils im 5'-Bereich 14 sowie im 3'-Bereich 16 Nukleotide. Mit dem voranstehend skizzierten 43mer-Oligodeoxvnukleotid wird die einzelsträngige DNS des Ausgangsphagen

M 13tg 730(P_R c/-857 /rnß)Pstl

hybridisiert, die ihrerseits aus Überständen eines mit diesem Phagen transfizierten E. colüung', duD-Wirtsorganismusses, vorzugsweise des Stammes E. coll RZ1032, gewonnen wurde. Durch die Wahl dieses Wirtes enthält der das c/-Gen kodierende Strang der nach der Hybridisierung komplementierten und ligierten DNS, Uridin-Basen anstelle von Thymidin-Basen. Mit dieser DNS wird nachfolgend ein E.co/AWirt mit den Wildtyp-Allelen ung⁺, dut⁺, vorzugsweise der Stamm E. coHIG 1, transfiziert. Die aus den erhaltenen transfizierten Klonen gewonnene Λί 73-DNS wird durch Sequenzanalyse auf die Anwesenheit der neu einzufügenden Sequenz sowie auf deren korrekten Einbau in die beabsichtigte Position der Ausgangssequenz untersucht. Diejenigen Klone, die diese Eigenschaften aufweisen, enthalten die als

M 13tg 730(Pr BamHI c/-857 /ftißJPstl

bezeichneten rekombinanten Phagen.

Im zweiten Schritt der bevorzugten Ausführungsform wird die mutagenisierte Lambda-DNS-Sequenz einschließlich der PR-Promotorregion auf einen Plasmidvektor überführt. Hierfür wird nun das literaturbekannte S.subf/7/s-Promotorsuchplasmid pKB8 (Molekülgröße 6,6kb; Marker: MLS-Resistenzgen) eingesetzt, das das promotorlose a-Amylase-Strukturgen aus B.amyloliquefaciens {amyF) mit nativem RBS als Indikatorgen für Promotorinsertionen trägt (s.a. Abb.3). Die Bereitstellung dieses Plasmids für die Aufnahme der mutagenisierten Lambda-DNS-Sequenz ist hier mit folgenden Vorteilen verbunden:

- Für die Insertion steht ein unikaler Pstl-Ort zur Verfügung (die mutagenisierte DNS-Sequenz einschließlich der PR-Promotorregion ist als Pstl-Fragment gewinnbar);

- inserthaltige rekombinante Plasmide sind bereits im phänotypischen Screening des Rezipientenstammes anhand der a-Amylase-Bildung erkennbar (im Ergebnis der Verknüpfung der Lambda-P_R-Promotorsequenz mit dem amyF-Strukturgen erfolgt in a-Amylase-negativen Rsubt/V/s-Rezipientenstämmen Amylasebildung unter Kontrolle des Lambda-P_R-Promotors);

- durch die Fusion der Lambda-PR-Promotorregion mit dem a/nyf-lndikatoren entsteht bereits eine Konstruktion, die in den nachfolgenden Schritten als Modell für den Nachweis und die Charakterisierung der temperaturinduzierbaren Genexpression in B.subtilis einsetzbar ist (die Bildung der sekretorischen a-Amylase kann leicht einer qualitativen und quantitativen Testung unterzogen werden).

Zur Überführung der mutagenisierten Lambda-Sequenz wird aus der replikativen Form der DNS der M 13tg 730(Pr BamHI cl-857 /rnß)Pstl-KIone ein 1794bp großes Pstl-Fragment gewonnen, auf dem nunmehr ein BamHI-Ort zwischen dem Leserahmen des c/-857-Repressorgens und der P_RM-Promotorregion positioniert ist (vgl. Abb. 1). Dieses Fragment, das außerdem den Lambda-P_R-Promotor enthält, wird in den unikalen Pstl-Ort des S.subf/7/s-Promotorsuchplasmids pKB8 inseriert. Nach Transformation eines a-Amylase-negativen B.subf/7/s-Rezipienten, vorzugsweise des Stammes 21 amyA recEA, werden unter den Erythromycin-resistenten und Amylase-bildenden Klonen diejenigen identifiziert, die das neue, als pBS 10 bezeichnete Zwischenplasmid enthalten. Auf diesem Plasmid ist die aus dem M 73-Phagen gewonnene mutagenisierte Lambda-DNS-Sequenz stromaufwärts des a-Amylase-Strukturgens in der Weise eingefügt, daß die Amylase-Expression unter der Kontrolle der Lambda-P_R-Promotorregion erfolgt (s. a. Abb. 3).

Amylase-negative ß.subf/7/s-Stämme, die pBS 10 beherbergen, bilden a-Amylase erwartungsgemäß konstitutiv sowohl bei Temperaturen unter wie auch über 30°C (vgl. Abb. 5). Das Zwischenplasmid pBS 10 weist den Vorteil auf, daß es eine Lambda-DNS-Sequenz einschließt, auf der ein durch gerichtete Mutagenese erzeugter BamHI-Ort stromauf des Leserahmens des c/-857-Repressorgens angelegt ist.

In einem dritten Verfahrensschritt der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dieser BamHI-Restriktionsort genutzt, um das d-Repressorgen nunmehr mit in B.subtilis-Zellen effizienten Expressionssignalen zu verknüpfen. Hierfür werden die Signale der Staphylokinase-Expressionseinheit (sak-EE) des S. aureus-Pbagen 42 D herangezogen. Als Spender der sak-EE wird der rekombinante E. co/z-Expressionsvektor pBB 209 (Molekülgröße 3154 bp; Marker: Ampicillinresistenzgen, vgl. Abb. 3) eingesetzt, der unmittelbar stromab der sak-EE einen unikalen BamHI-Ort zur Fusion mit einem zu exprimierenden Gen aufweist. Dieser Vektor ist nach dem Verfahren einer früheren Anmeldung des Zentralinstitutes, die die Herstellung von Expressionsvektoren zur Ausprägung reifer Genprodukte betrifft, verfügbar geworden.

Die Verknüpfung der sak-EE mit dem c/-857-Repressorgen wird in der Strategie der Konstruktion von E. coli/B. sufcf/7/s-shuttle-Vektoren durch Fusion des B. subf/V/s-Zwischenplasmids pBS 10 mit dem E. co/Z-Expressionsvektor pBB209 ausgeführt. Sie erfolgt vorteilhaft durch aufeinanderfolgende Transformation von Stämmen aus beiden Wirtssystemen ohne Screening der Klone des zuerst transformierten Wirtes. Dieses Vorgehen beruht darauf, daß

- durch Replikation und Ausprägung derAmpicillinresistenzim E. co//-Wirtssystem sowie

- durch Replikation und Ausprägung der MLS-Resistenz im S. subf/7/s-Wirtssystem

nach Passagierung der rekombinanten Plasmidpopulation durch Stämme aus beiden Wirtssystemen mit hoher Wahrscheinlichkeit solche Shuttle-Vektoren selektiert werden, die jeweils beide Antibiotikaresistenzgene und Replikationsorigins enthalten, womit anschließend im phänotypischen Screening bereits jeder der beiden Wirte auf Anwesenheit sowie Induzierbarkeit der P_n-amyf-Modellgenfusion überprüft werden kann.

Mit dieser Strategie nutzt man den Vorteil, daß in Fällen, in denen primäre Transformanten-Klone mit den gesuchten rekombinanten Plasmiden sich nicht ohne weiteres phänotypisch erkennen lassen, anstelle einer aufwendigen Suche nach diesen Chimären eine einfache Selektion durch Transformation eines Stammes aus dem zweiten Wirtssystem mit der Gesamtpopulation der nach der Transformation des ersten Wirtes erhaltenen Plasmide ausführbar ist. In Realisierung dieser Klonierucgsstrategie wird das Zwischenplasmid pBS 10 mit der Restriktase BamHI partiell so gespalten, daß vorwiegend linearisierte Plasmidmoleküle entstehen, die anschließend mit dem ebenfalls mit BamHI geöffneten Vektor pBB209 ligiert werden. Aus den nach Transformation von Stamm E. co//TG1 bei 30⁰C, d. h. unter permissiven Bedingungen (Vermeidung von strukturellen Plasmidinstabilitäten in diesem Wirt), erhaltenen Ampicillin-resistenten Klonen wird eine Gesamtpräparation ihrer Plasmid-DNS gewonnen, mit der ein Amylase-negativer B. subtills-Stamm, vorzugsweise der Stamm 21 amy4 recE4, transformiert wird.

Beim Screening der erhaltenen 3,subt///s-Klone wird von der nun zu erwartenden Induzierbarkeit des Lambda-PR-Promotors ausgegangen: Unter den Erythromycin-resistenten Klone werden folglich diejenigen ausgewählt, die nach Kultivierung bei Temperaturen unter 30°C keine Amylase bilden, diese jedoch nach Überführung auf Kultivierungstemperaturen über 37⁰C auszuprägen vermögen. Solche Klonen werden anschließend hinsichtlich ihres Plasmid-DNS-Gehaltes charakterisiert. Ein Vertreter der in der bevorzugten Ausführungsform auf diese Weise erhaltenen shuttle-Vektoren, der die Bezeichnung pBS 52 (Molekülgröße 11,4 kb; Marker: MLS-Resistenzgen und Ampicillin-Resistenzgen) erhielt, ist in Abb.4 dargestellt. Wie angestrebt, befindet sich das c/-857-Repressorgen auf ihm nun unter Kontrolle der sak-EE. Dieser shuttle-Vektor besitzt verfahrensgemäß außerdem den Vorzug, daß er das mit der Lambda-P_R-Promotorregion fusionierte a/nyF-Strukturgen einschließt und somit bereits sowohl in B.subtiliswte auch in E co//für die Charakterisierung des Induktionsverhaltens einsetzbar ist (dieser Umstand konnte vorteilhaft beim Screening der Transformaten-Klone zur Auffindung derartiger Plasmide genutzt werden). Eine weitere Besonderheit dieses Vektors besteht darin, daß sich infolge der ausgeführten Klonierungs- und Selektionsschritte (Stichwort: partielle BamH!-Restriktion) die Orientierung des internen, vom Zwischenplasmid pBS 10 stammenden BamHI-Fragmentes mit der P_R-amyF-Modellgenbox umgekehrt hat. Dadurch verändert sich bei Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit dieser Konstruktion die Relation der Restriktionsorte auf dem shuttle-Plasmid pBS52 im Vergleich zum Zwischenplasmid pBS 10, woraus erneut vorteilhafte Möglichkeiten für Anschlußarbeiten zur Fusion der Рц-Promotorregion mit einem weiteren Modellgen (siehe unten) resultieren.

Amylase-negative S.subf/V/s-Wirtsstämme, die pBS52 beherbergen, sind durch Temperaturshift nunmehr zur Expression des amyf-Modellgens befähigt. Diese Induzierbarkeit ist auf der Grundlage des klassischen Lambda-Promotor-Repressor-Modells darauf zurückführbar, daß bei Kultivierungstemperaturen unter 30⁰C der Lambda-P_R-Promotor durch das konstitutiv unter Kontrolle der sak-EE gebildete, mit den Operatorregionen des P_R-Promotors interagierende CI-857-Repressorprotein reprimiert ist, woraufhin das amyf-Gen nicht abgelesen wird. Im Ergebnis eines Temperturshifts auf mindestens 37 ⁰C wird die Konformation der temperaturlabilen Repressormoleküle so verändert, daß sie sich von der P_R-Operatorregion ablösen und nunmehr die Transkription des amyf-Gens freigeben.

Die Menge der gebildeten und sekretierten a-Amylase kannlm qualitativen und quantitativen Test leicht ermittelt werden. In Abbildung 5 sind für den in der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens mit pBS52 transformierten Stamm S. subtilis 21 amy 4 recE4 jeweils die Amylase-Titer ohne Induktion der Bildungskinetik nach Induktion gegenübergestellt. Wie die Ergebnisse eindeutig zeigen, wird die einsetzende a-Amylase-Expression dieses rekombinanten Wirtes ausschließlich durch den Shift der Kultivierungstemperatur von 3O⁰C auf 42⁰C ausgelöst. Dieser Effekt wurde zu zwei verschiedenen Induktions-Zeitpunkten reproduziert. Charakteristisch ist weiterhin, daß die Amylase-Expression sofort nach Induktion einsetzt und bis in die späte stationäre Wachstumsphase der Kultur andauert, so daß eine lang anhaltende Produktbildungsphase erzielt werden kann. Dieses Induktionsverhalten sowie das erreichte Expressionsniveau von etwa lOOmg/l im Fall der sekretorischen a-Amylase demonstrieren die Leistungsfähigkeit des verfahrensgemäß erhaltenen neuen temperaturregulierbaren Expressionssystems in B. subf/7/s-Wirten.

Im zweiten Abschnitt der bevorzugten Ausführungsform wird das etablierte induzierbare B. subr/7/s-Expressionssystem unter Einbeziehung eines weiteren Modellgens erprobt. Hierfür wird das Strukturgen der Staphylokinase des Staphylococcus aureus-Phagen42D (sa/c-Gen) eingesetzt. Diese Wahl bietet (wie im Falle des a-Amylase-Gens) den Vorteil, daß die Bildung des sekretorischen SAK-Genproduktes sich leicht einem qualitativen sowie quantitativen Test unterziehen läßt. In Anwendung des Verfahrens einer früheren Anmeldung des Zentralinstitutes sind rekombinante Trägerplasmide wie рВВЗОО und pBB 301 verfügbar geworden, die das o.g. saic-Gen einschließen.

Als Spender der sa^-Genbox wird vorzugsweise das E co//-Plasmid pBB301, ein Abkömmling von pDB 17, einem dieser sakrekombinanten Trägerplasmide, gewählt. Plasmid pBB301 (Molekülgröße 4007 bp; Marker: Ampicillinresistenzgen) ist dadurch charakterisiert, daß es die promotorlose safr-Genbox einschließlich der nativen SD-Sequenz enthält, die in den Hincll-Ort des

Polylinkers des Eco/Z-Klonierungsvektors pUC18 inseriert ist (Abb.6). Für die Fusion mit Promotoren, unter deren Kontrolle das saür-Strukturgen exprimiert werden soll, steht u.a. der Restriktionsort für das Enzym Pstl aus dem pUC18-Polylinkerzur Verfügung.

Auf dem shuttle-Plasmid pBS52, dem Träger des induzierbaren Expressionssystems, ist ein derartiger Restriktionsort stromab der P_R-Promotorregion positioniert (hier Fusionsort mit dem amyF-Modellgen). Gegebenenfalls wird in einem vorbereiteten Verfahrensschritt durch Verkleinerung dieses Vektors, d.h. in den Schritten

- Spaltung des Eco/Z/asubf/V/s-shuttle-Plasmids pBS52 mit Pstl,

- Selbstligation der entstandenen Fragmente,

- Selektion der nach Transformation eines a-Amylase-negativen B.subivV/s-Stammes erhaltenen Klone sowie

- Überprüfung dieser Klone auf Ausbleiben einer Amylase-Bildung der Pstl-Restrilctionsort stromab des P_R-Promotors unikalisiert.

Dieses Vorgehen bietet den Vorteil, daß auf einfache Weise

- von den beiden nach Spaltung mit Pstl entstehenden Plasmid-Komponenten nur die gesuchte, P_R enthaltende Komponente durch autonome Replication in B. subtilis selektiert wird (die zweite Komponente ist in B. subr/7/s-Wirten nicht autonom replikationsfähig) sowie

- Klone mit verkleinerten S.subf/7/s-Plasmiden von den ebenfalls selektierten Klonen mit dem Ausgangsplasmid pBS52 (die durch Rekonstituierung beider Fragmente bzw. durch nichtvollständige Restriktion erhalten werden können) bereits im phänotypischen Screening des jeweiligen Wirtes erkennbar sind (anhand des Ausbleibens einer a-Amylase-Synthese).

Mit dem voranstehend beschriebenen Teilschritt konnte erreicht werden, daß alle ausgewählten Amylase-negativen, Erythromycin-resistenten Klone des Wirtsstammes B. subtilis 21 amy4 recE 4 verkleinerte Plasmide der angestrebten Struktur enthielten, die als pBS60 (Molekülgröße 4,9 kb; Marker: MLS-Resistenzgen) bezeichnet wurden (s.a. Abb. 6). Auf diesen S.subf/7/s-Expressionsplasmiden befindet sich stromab des Lambda-P_R-Promotors ein unikaler Pstl-Ort, der für die Fusion mit einem zu exprimierenden Gen nutzbar ist.

In einem nächsten Verfahrensschritt des zweiten Abschnittes der bevorzugten Ausführungsform wird nun die Lambda-Pp-Promotorregion mit dem safc-Modellgen verknüpft. Zu diesem Zweck werden die beiden Plasmide pBS 60 und pBB 301 über ihren unikalen Pstl-Ort fusioniert. Hierbei ist es möglich, nach direkter Klonierung in B.subtilis die Klone mit den gewünschten rekombinanten Plasmiden, welche die Expression des sa/c-Gens unter der Kontrolle des PR-Promotors bewirken, bereits im phänotypischen Screening anhand der SAK-Bildung auf Agar-Testplatten zu erkennen.

Aus den SAK-positiven B. subf/7/s-Transformantenklonen wird ein Vertreter ausgewählt und hinsichtlich seines Plasmid-DNS-Gehaltes untersucht. Die Struktur des so erhaltenen F.co///S. subf/7/s-shuttle-Plasmids, das als pBS70 (Molekülgröße 8,9kb; Marker: MLS- und Ampicillin-Resistenzgen) bezeichnet wird, ist in Abb. 6 dargestellt. Dieses Plasmid vermittelt konstitutive SAK-Expression der B. subf/7/s-Rezipientenstämme, da durch die Vektorverkleinerung im vorbereitenden Verfahrensschritt das c/-857-Repressorgen von pBS52 ausgegliedert worden ist (so daß keine Repressor-Bildung erfolgen und somit der Lambda-PR-Promotor nicht reprimiert werden kann).

Zur Etablierung eines temperaturinduzierbaren SAK-Expressionssystems werden anschließend shuttle-Plasmide konstruiert, die sowohl das mit dem P„-Promotor fusionierte safc-Modellgen als auch das mit der sak-EE verknüpfte c/-857-Repressorgen einschließen. In der bevorzugten Ausführungsform wird dazu das Рщ-amyF-Modellgen von pBS 52 durch die Рц-sak-Genbox von pBS70 substituiert. Dieser Schritt wird ausgeführt, indem nach Deletion jener beiden EcoRI-Fragmente von pBS52, die die Pn-amyF-Genbox kodieren (vgl. Abb.4), das als 1,8kb EcoRI-Fragment aus pBS70 entnommene PR-safr-Modellgen mit dem so gewonnenen pBS 52-Hauptfragment fusioniert wird. Die Klone der Wirte, die die gesuchten rekombinanten E. coli/B. subtilisshuttle-Plasmide beider Insertorientierungen pBS71 bzw. pBS72 (Molekülgröße: 10,8 kb; Marker: MLS-sowie Ampicillin-Resistenzgen, s. a. Abb. 6) enthalten, sind wiederum bereits im phänotypischen Screening anhand der Induzierbarkeit der SAK-Expression erkennbar.

Ein weiterer Zugang zur Konstruktion von shuttle-Plasmiden, die beide Komponenten des induzierbaren SAK-Expressionssystems einschließen, wird realisiert durch die Übertragung der sa/r-EE-c/-857-Genbox von pBS52 auf das shuttle-Plasmid pBS70. Bevorzugt wird hierzu das mit der sak-EE fusionierte c/-857-Repressorgen als 2,6kb großes Pvull-Fragment aus pBS52 entnommen und in den unikalen EcoRV-Ortvon pBS70 inseriert. Nach Transformation von B. subtilisbzw. Eco/Zwerden in einem Ein-Schritt-Verfahren im phänotypischen Screening nun diejenigen Klone identifiziert, die bei 37⁰C SAK-positiv, bei 30⁰C jedoch SAK-negativ sind. Solche Klone enthalten ein Plasmid mit dem induzierbaren SAK-Expressionssystem, bestehend aus der Рщ-sak- sowie der sa/c-EE-cA857-Genbox als Teilkomponenten. Klone dieser Beschaffenheit werden anschließend hinsichtlich ihres Plasmid-DNS-Gehaltes charakterisiert. Die Struktur der so erhaltenen E coli/B. subf/7/s-shuttle-Plasmide beider Insertorientierungen, die als pBS80 bzw. pBS81 bezeichnet werden (Molekülgröße 11,5kb; Marker: MLS- und Ampicillin-Resistenzgen), ist in Abb.6 dargestellt.

B.subtilis- und E.co/Z-Wirtsstämme, die pBS80 enthalten, bilden bei Kultivierungstemperaturen unter 3O⁰C keine Staphylokinase, sind jedoch nach Temperaturshift auf mindestens 37⁰C zur SAK-Bildung befähigt. Dieses Verhalten ist bereits vorteilhaft im o.a. phänotypischen Screening benutzt worden.

Durch beide Ausführungsformen ist auch mit einem zweiten Modellgen, dem sak-Gen des S. aureus-Phagen 42 D, die Funktionsfähigkeit des temperaturinduzierbaren Expressionssystems für B. subtilis unter Einbeziehung der Repressorkontrollierten Lambda-PR-Promotor/Operator-Region nachgewiesen worden.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Ausführungen sollen an einigen Beispielen die einzelnen Schritte des Verfahrens zur Herstellung von Expressionsvektoren für die thermoinduzierbare Ausprägung von Genen in grampositiven bakteriellen Wirten näher veranschaulichen. Sie enthalten dabei jedoch keine detaillierten Angaben zu den herangezogenen Standardverfahren der Gentechnologie und der Mikrobiologie (wie Gewinnung von Plasmid- bzw. Phagen-DNS, Spaltung von DNS mit Restriktionsenzymen, DNS-Sequenzanalyse, DNS-Hybridisierung, Darstellung und Charakterisierung von Plasmid-DNS mittels Agarose-Gelelektrophorese, Gewinnung von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen, Umwandlung von sticky ends in blunt ends,

Einfügen von Gensequenzen in Vektorplasmide, Ausführung von Ligationsreaktionen, Transformation bzw. Transfektion von bakteriellen Rezipientenstämmen mit Plasmid- bzw. Phagen-DNS und Kultivierung von Mikroorganismen). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in einer Reihe von Veröffentlichungen ausführlich beschrieben, beispielsweise in

- „Advanced Bakterial Genetics, a Manual for Genetic Engineering" (R.W. Davis, D. Botstein, J.R. Roth), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980;

- »Molecular Cloning,a Laboratory Manual" (T.Maniatis, E.F.Fritsch,J.Sambrock), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982;

- Monographien der Serie „Methods in Enzymology", Acad. Press, Bände65(1980),68{1980),100(1983,101 (1983), 153 (1987), 154(1987);

- Monographien der Serie .Methods in Microbiology", Acad. Press, Bände 1 (1969), 2 (1970), ЗА (1970), 5B (1971), 6A (1971) sowie 18 (1984).

Beispiel 1: Thermoinduzierbare Ausprägung des a-Amylase-Gens (amyF) von Bacillus amyloliquefaciensin B.subtilis unter Einbeziehung des Plasmids pBS52

1.1. Erzeugung eines BamHI-Restriktionsortes vor dem Leserahmen des Lambda-c/857-Repressorgens (Schritt I)

Die Erzeugung des BamHI-Ortes erfolgt nach der Methode der gerichteten in-vitro-Mutagenese (Kunkel T. A. et al., Meth. Enzymof. [1987] 154, ). Als Targetsequenz wird die DNS des rekombinanten Phagen (M 13tg 130 (P_R cl-857 ifnß) Pstl eingesetzt (Abb.1).

Zunächst wird die benötigte Menge einzelsträngiger M13-DNS (etwa 10pg) aus dem Überstand einer Submerskultur des den o.g. Phagen enthaltenden Eco/i-Stammes RZ1032 isoliert, gereinigt und in 1OmM TrisHCI-Puffer gelöst. Durch die Wahl dieses Wirtes, der unter Zusatz von 0,25 цд Uridin/ml angezogen wird, enthält diese DNS Uridin-Basen anstelle von Thymidin-Basen. Etwa 5цд dieser M 13-Uridin-DNS werden mit etwa 20ng des 5'-phosphorylierten 43mer-Oligodesoxyribonukleotids folgender Sequenz hybridisiert (1 Stunde, 56⁰C):

5' GGTGATAGATTTAAGGAGGGATCCATAATGAGCACAAAAAAGA 3'.

Anschließend wird das Template in an sich bekannter Weise durch eine Klenow-Reaktion mit nachfolgender Ligation in die doppelsträngige zirkuläre Form der M 13-DNS umgewandelt. Mit Proben dieser DNS werden kompetente Zeilen des E. coil· Rezipientenstammes TG1 transfiziert. Da dieser Stamm die ung⁺- und duf¹"-Wildtyp-Allelen enthält, werden in den TG1 -Zeilen nur die DNS-Stränge repliziert, die keine fehlerhaft inkorporierten Uridin-Basen enthalten. Dadurch werden Klone mit den mutagensisierten, den BamHI-Ort tragenden M 13-Phagen angereichert. Aus den Überständen (etwa 1 ml) von 12 auf diese Weise erhaltenen E. coli-TG 1 -Klonen wird etwa je 10 цд einzelsträngiger M13-DNS präpariert und in 10 m M TrisHCI-Puffer gelöst. Proben dieser DNS (etwa je 1 \ig) werden in an sich bekannter Weise einer DNS-Sequenzanalyse nach dem Kettenterminationsverfahren von Sanger et al. unterzogen. Aufgrund der ermittelten Nukleotidsequenz werden die Klone mit der mutagensierten Lambda-Sequenz identifiziert (Abb.2). Diese Methode erwies sich als so effizient, daß 40% der gewonnenen Klone den gesuchten rekombinanten Phagen M13tg 130 (P_R Bam Hl c/-857 Delta ifnß) Pstl enthielten, der den BamHI-Ort vor den Leserahmen des c/857-Repressorgens besaß.

Aus 100ml Zellsuspension dieser E.coli-IQ 1-Klone wird an sich bekannter Weise die doppelsträngige (replikative) Form der M 13-DNS isoliert, in TrisHCI-Puffer gelöst und für den Folgeschritt Il bereitgestellt.

1.2. Überführung der mutagensierten Lambda-c/857-Sequenz auf einen Plasmidvektor (Schritt II)

Aus etwa 5 \xq der in Schritt I bereitgestellten doppelsträngigen M 13-DNS wird nach Spaltung mit der Restriktase Pstl das 1794 bp große Pstl-Pstl-Fragment gewonnen, das die mutagenisierte Lambda-c/857-Sequenz sowie den Lambda-P_R-Promotor enthält. Für die Klonierung dieses Fragmentes wird das Promotorsuchplasmid pKB8 (Abb. 3) ausgewählt. Es enthält einen unikalen Pstl-Ort vor der promotorlosen a-amy-lndikatorgenbox. Die benötigte Menge an pKB8-Plasmid-DNS (etwa 5цд) wird aus Kulturen von B.subtilis2\ amy4 recE4(pKB8) isoliert, gereinigt und in TrishHCI-Puffer gelöst. Das mit Pstl linearisierte Plasmid pKB8 wird mit dem o.g. 1794bp großen Pstl-Pstl-Fragment unter Zuhilfenahme von T4-Ligase ligiert. Nach Transformation von B. subtilis 21 amy4 recE 4 werden unter den Amylase-positiven Klonen diejenigen identifiziert, die das neue, als pBS 10 bezeichnete Zwischenplasmid enthalten. Auf diesem Plasmid ist das Pstl-Fragment in der in Abb. 3 angegebenen Orientierung inseriert, die die Expression des amy-lndikatorgens unter P_R-Kontrolle bewirkt. Aus Submerskulturen des o.g. pBS10 enthaltenen B. subtilis-Stammes werden die für den Folgeschritt benötigten Mengen Plasmid-DNS (etwa 5pg) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.

1.3. Verknüpfung des Lambda-c/857-Repressorgens mit in B. subtilis funktionsfähigen Expressionssignalen des sakA2 D-Gens Der durch gerichtete in-vitro-Mutagenese erzeugte BamHI-Ort vor dem Leserahmen des Lambda-c/857-Repressorgens wird nun genutzt, um dieses Gen mit den Transkriptions- und Translationssignalen des sak-Gens des S. aureus-Phagen 42D zu verknüpfen. Diese Expressionssignale (sa/r-EE) werden auf dem rekombinanten E. co/Z-Plasmid pBB209 bereitgestellt, das stromab der sa/c-EE einen unikalen BamHI-Ort für die Fusion mit einem zu exprimierenden Gen aufweist (Abb. 3). Die benötigten Mengen pBB 209-Plasmid-DNS (etwa 5 цд) werden aus Kulturen von £ coliTG 1 (pBB 209) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Die Verknüpfung der sak-EE mit dem c/857-Gen erfolgt durch Fusion der beiden bereitgestellten Vektoren pBS 10 und pBB209. Hierfür wird die pBS 10-DNS, die 3 BamHI-Orte aufweist, mit dem Restriktonsenzym BamHI partiell so gespalten, daß vorwiegend an nur einem BamHI-Ort linearisierte pBS 10-Moleküle entstehen. Diese limitierte Restriktion wird durch 2minütige Inkubation von 2 цд pBS 10-DNS mit 10E des Restriktionsenzyms BamHI bei 37°C erreicht. Das Restriktionsgemisch wird daraufhin mit den BamHI-linearisierten pBB209-Molekülen unter Zuhilfenahme von T4-DNS-Ligase ligiert. Mit dem auf diese Weise erhaltenen Ligationsgemisch werden kompetente Zellen von E. coliTG 1 transformiert. Hierbei wird die Hitzeschock-Behandlung bei 32⁰C ausgeführt, um eventuellen Plasmidinstabilitäten in diesem Wirt unter nichtpermissiven Bedingungen

vorzubeugen. Aus der Gesamtheit der erhaltenen E co/i-TG 1 -Klone wird (ohne Screening) eine Gesamt-Plasmid-DNS-Präparation (etwa Юцд) gewonnen. Mit Proben dieses DNS-Pools (2 ug) werden daraufhin kompetente Zahlen von S. subf/7/s21 amy4 recE 4 transformiert.

Die auf diese Weise erhaltenen S. subt/7/s-Klone werden nun zunächst einem phänotypischen Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Amylase-Expression unterzogen. Hierfür werden Oberflächenkulturen auf Agar-Platten angelegt, die neben dem Antibiotikum Erythromycin (etwa Юцд/гпІ) 0,15% des Substrates Amylopektinazur enthalten. Amylase-bildende Klone können anhand der Ausbildung eines Halos auf diesen Testplatten erkannt werden. Durch parallele Inkubation der Oberflächenkulturen bei 30⁰C bzw. 42"C werden unter den B.subf/7/s-Klonen nun diejenigen ausgewählt, die bei 42°C Amypositiv, bei 30⁰C jedoch Amy-negativ sind. Diese Klonierungs- und Selektionsstrategie erwies sich als so effizient, daß unter 100 untersuchten Klonen ein induzierbarer Klon identifiziert werden konnte. Aus Kulturen der im phänotypischen Screening als thermoinduzierbar erkannten S.subr/7/s-Klone wird daraufhin die Plasmid-DNS isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Die auf diese Weise erhaltenen Expressionsplasmide der pBS50-Familie werden durch Restriktion mit den Enzymen BamHI, EcoRI, Kpnl, Pvull, Pstl, EcoRV, Hindill sowie ihrer Kombinationen charakterisiert. Ein Vertreter dieser Expressionsplasmide ist der Eco/Z/Rsubr/V/s-shuttle-Vektor pBS52. Auf diesem Plasmid befindet sich nun das Lambda-c/857-Repressorgen unter Kontrolle der sak-EE sowie das amyf-Strukturgen unter Kontrolle des Lambda-P_R-Promotors (Abb.4).

Durch die ausgeführte Klonierungsstrategie (Stichwort: partielle BamHI-Restriktion) hat sich darüber hinaus die Orientierung des internen, vom Zwischenplasmid pBS 10 stammenden BamHI-Fragmentes mit der P_R-amyf-Modellgenbox umgekehrt. Für die Funktionsfähigkeit der Konstruktion war diese Inversion jedoch ohne Bedeutung.

1.4. Thermoinduzierbare Amylase-Expression durch Stamm B. subtilis 21 amy4 recE4(pBS52) Der Stamm S.subf/7/s21 amy4 recE4(pBS52) wird nun herangezogen, um die thermoinduzierbare Amylase-Expression in Submerskulturen quantitativ zu bewerten. Als Kulturmedium wird Nährbouillon II, bestehend aus

pankreatischem Pepton (Fleisch.Gelatine, Kasein) 6,75 g/l

Eiweißhydrolysat 1,75g/l

Hefeextrakt 1,50 g/l

NaCI 5,00 g/l

nach 12minütiger Sterilisation bei etwa 120°C (pH 7,2 ± 0,3) mit einem Zusatz von 80 цд Ampicillin/ml Medium verwendet. Die Kultur wird submers auf einem Rotationsschüttler (220U/min) gerührt.

Die Kultivierung erfolgt in den Stufen Vor- und Hauptkultur. Zunächst wird eine Vorkultur (etwa 10mI) von einer Einzelkolonie des o.g. Stammes angeimpft und über Nacht 16 Stunden bei 30°C angezogen. Von dieser Vorkultur werden mehrere Kolben mit je 100 ml Kulturmedium 2% v/v beimpft und als Hauptkulturen in 2 getrennten Partien jeweils bei 30°C bzw. 42⁰C unter sonst gleichen Bedingungen kultiviert. Der Temperaturshift erfolgt bei einem Teil der Kolben mit dem Beginn, bei einem zweiten Teil nach der 4. Stunde der Kultivierung der Hauptkulturen. Als Kontrolle werden unter gleichen Bedingungen angezogene Kulturen des konstitutiv Amylase-bild'enden Stammes S.subf///s21 amy4 recE4 (pBS10) mitgeführt. Von den parallel bei 30⁰C bzw. 42⁰C angezogenen und zu zwei verschiedenen Zeitpunkten induzierten Kulturen werden simultan nach je 2 bis 4 Stunden Kultivierungszeit jeweils 1 ml Probe entnommen. In diesen Proben werden der Wachstumszustand der Kultur anhand der optischen Dichte bei 600 nm und die enzymatische Aktivität der a-Amylase anhand eines kolorimetrischen Testes ermittelt. Für den Amy-Test werden 2 bis 20μΙ des nach Pellettierung der Zellen (5' lOkopm) erhaltenen Kulturüberstandes bzw. daraus hergestellter Verdünnungen (bis 1:200) eingesetzt. Sie werden mit je 300μΙ einer 1%igen Amylopektinazurlosung, die 6OmM Na-Azetat (pH 5,0) enthält, gemischt und 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die Beendigung der Reaktion erfolgt durch Zugabe von 1 ml Aqua destillata. Anschließend werden die Proben sedimentiert (10' lOkopm). In den Überständen wird mit einem Spektrophotometer bei 600 nm die Extinktion gegen eine Kontroilösung, die aus dem eingesetzten Kulturmedium hergestellt wurde, ermittelt. Die abgelesenen und entsprechend der Verdünnung berechneten Werte werden graphisch dargestellt (vgl. Abb. 5).

Die nach Untersuchung des Stammes B.subtilis21 amy4 recE4(pBS52) ermittelten Amylase-Titer demonstrieren die hohe Effizienz der Thermoinduktion, die mit dem verfahrensgemäß hergestellten Expressionsvektor pBS 52 erreichbar ist. Gegenüber den bisher bekannten chemisch oder thermisch induzierbaren ß.subf/7/s-Expressionssystemen, die lediglich 100fache Induktionsraten erlauben, betrug der mit dem Vektor pBS52 in B. subtilis erzielte Induktionsfaktor 1400. Dieser Induktions-Repressions-Grad wurde für diesen Wirt bisher nicht beschrieben.

Beispiel 2: Thermoinduzierbare Ausprägung des Staphylokinase-Gens (safc42D) des S.aureus-Phagen 42 D in B. subtilis unter Einbeziehung der Expressionsvektoren pBS71 und ρBS72

Die Konstruktion der Expressionsvektoren pBS71 und pBS72 erfolgt durch Substitution des amyf-Gens von pBS52 durch das sak-Gen. Als Ausgangsplasmid wird der Expressionsvektor pBS52 eingesetzt. Die benötigten Mengen pBS52-Plasmid-DNS (etwa 5 мд) werden aus Kulturen von B. subtilis2"\ amy 4 recE4(pBS 52) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Als Spender der sa*42 D-Genbox wird das rekombinante Plasmid pBB301 herangezogen. Die benötigten Mengen (etwa 5мд) рВВЗОІ-Plasmid-DNS werden in analoger Weise aus Kulturen von E. coWTG MpBB 301) gewonnen. Auf diesem Plasmid befindet sich stromauf der promotorlosen sakA2 D-Genbox ein unikaler Pstl-Ort, über den das sak42 D-Gen mit dem Lambda-Pn-Promotor verknüpft wird. Hierfür wird das Plasmid pBS 52 mit Pstl in 2 Fragmente zerlegt. Dieses Fragmentgemisch wird mit dem Pstllinearisierten Plasmid pBB301 unter Zuhilfenahme von T4-DNS-Ligase ligiert. Mit Proben des Ligationsgemisches werden daraufhin kompetente Zellen von B. subtilis GB 500 transformiert, die erfolgreiche Fusion des P_R-Promotors mit der sa<r42D-Genbox wird zunächst in einem phänotypischen Screening untersucht.

Hierfür werden die erhaltenen S.subf/7/s-Klone auf Agar-Medien kultiviert, die 10% Magermilch und 1 % Human-Plasminogen enthalten. Um eventuell durch Wirtsproteasen verursachte Fehlinterpretation auszuschließen, werden Kontrollplatten ohne Plasminogen-Zugabe mitgeführt. Die Expression der vom sak42D-Gen kodierten Staphylokinase bewirkt Lyse-Höfe auf den plasminogenhaltigen Magermilchplatten (keine Lyse-Höfe auf den Protease-Kontrollplatten).

Aus Kulturen der auf diese Weise identifizierten Sak-positiven B. subf///s-GB500-Klone wird die Plasmid-DNS (etwa je 5 Mg) isoliert, gereinigt, in TrisHCI-Puffer gelöst und daraufhin mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, EcoRV, Pst I, FVu Il sowie ihren Kombinationen charakterisiert. Ein als ρBS70 bezeichneter Vertreter dieser Plasmide enthält erwartungsgemäß die sak42D-Genbox unter Kontrolle des Lambda-PR-Promotors (Abb.6). Etwa 2цд pBS70-Plasmid-DNS werden mit der Restriktase EcoRI in 2 Fragmente zerlegt. Aus diesem Gemisch wird in an sich bekannter Weise nach Auftrennung im Agarosegel das die P_R-safc42 D-Box enthaltende 1,8 kb EcoR l-EcoR I-Fragment isoliert und in TrisHCI-Puffer gelöst. In analoger Weise wird aus dem Plasmid pBS52 das 8,9 kb EcoR l-EcoR I-Fragment mit der sa/cEE-c/857-Kassette gewonnen und in TrisHCI-Puffer gelöst. Beide bereitgestellte EcoR I-Fragmente werden nun unter Zuhilfenahme von T4-DNS-ügase einer Ligationsreaktion unterzogen. Mit Proben des auf diese Weise erhaltenen Ligationsgemisches werden kompetente Zellen von B. subtilis GB500 transformiert. Die erhaltenen Erythromycin-resistenten Klone werden in der bereits eingangs beschriebenen Weise (als Oberflächenkulturen auf SAK-Testplatten) auf diethermoinduzierbare Ausprägung von Staphylokinase überprüft. Aus den rekombinanten S. subtilis-GB 500-Klonen, die bei 42⁰C SAK-positiv sind, werden diejenigen ausgewählt, die bei 3O⁰C keine SAK bilden. Als Kulturen dieser Klone wird die Plasmid-DNS (je etwa 5 цд) isoliert, gereinigt, in TrisHCI-Puffer gelöst und mit den Enzymen BamH I, EcoR I, EcoRV, Pstl sowie Pvu Il (einschließlich ihrer Kombinationen) charakterisiert. Die auf diese Weise hergestellten Plasmide pBS71 und pBS72 sind in Abb. β dargestellt.

Sie unterscheiden sich in der gegenseitigen Orientierung der P_R-saA42 D- und safcEE-c/857-Kassetten. B. subf/V/s-GBSOO-Klone, die pBS71 oder pBS 72 enthalten, sind zurthermoinduzierbaren Ausprägung von Staphylokinase befähigt. Diese Induzierbarkeit wurde bereits im phänotypischen Screening demonstriert.

Legenden zu den Abbildungen

Abb.1

Struktur des Phagen M 13tg 130 (P_R c/857 ;7hß)Pstl. Aus dem Pstl-Insert ist ein Segment mit den Lambda-Promotorregionen P_R und Prm in der Wildtyp-DNS-Sequenz dargestellt. Die Basen-Substitution durch das mutagene Oligonukleotid ist unterhalb der Lambda-Sequenz angegeben. OR: Рц-Operatorboxen; mRNA-Start in E. colinach BlattnerStDahlberg (1972) Nature(L) NewBiol 237: 227; mRNA-Start in B. subtilis nach Murooka et al. (1986) Appl Microbiol Biotechnol 24: 504-508.

Abb. 2

DNA-Sequenzanalyse der mutagenisierten M 13tg 130 (Pr c/857 /frißlPstl-Phagen. Bahnen 1-4 & 5-8 v. I. п. г.: Mutagenisierte Sequenzen mit BamH I-Ort. Zwischen den Pfeilen befinden sich die in die Wildtyp-Sequenz inserierten Nukleotide. Bahnen 9-12: Lambda-Wildtyp-Sequenz. ATG: Translationsstart des Lambda-c/857-Gens.

Abb.3

Konstruktion des shuttle-Expressionsplasmids pBS52 für diethermoregulierende Amy-Expression in B. subtilis und E. coli.

mayF: a-Amylase-Strukturgen von B. amyloliquefaciensmitnativem RBS;

Pr: Lambda-Pp-Promotorregion mit cro-RBS und 144 bp des /fnß-Strukturgens; die Translation des /fn-Leserahmens wird

stromauf des a/ny-RBS terminiert; die Amy-Translations-Initiation erfolgt von den eigenen Signalen; Cl: Mutagenisierte Lambda c/857-Genbox; EE: sa/r-Expressionseinheit.

Abb. 4

Struktur des shuttle-Expressionsplasmids pBS52 für die thermoinduzierbare Amy-Expression in B. subtilis und E. coli. Die DNA-Sequenz am BamH I-Fusionsort zwischen der sak-EE und der mutagenisierten Lambda-c/857-Sequenz ist im oberen Teil" der Abbildung dargestellt.

Abb. 5

Kinetik der a-Amylase-Bildung durch B. subf/7/s21 amyA recEA mit pBS 10 (konstitutiv) und pBS52 (thermoinduzierbar). Über-Nacht-Kulturen (3O⁰C) wurden 1:10 verdünnt und in Nbll-Medium bei 3O⁰C oder 42⁰C unter sonst gleichen Bedingungen inkubiert. Der Temperaturshift erfolgte entweder zu Kultivierungsbeginn oder nach 4 h. Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben aus dem Kulturüberstand entnommen und in ihnen die Amy-Titer kolorimetrisch ermittelt.

Abb. β

Konstruktion der shuttle-Expressionsplasmide pBS71 und pBS 72 für die thermoregulierbare Sak-Expression in S. subtilis und E. coli.

Claims (44)

1. Herstellungsverfahren für Expressionsvektoren zurthermoinduzierbaren Genexpression in gram positive η bakteriellen Wirten unter Anwendung von Standardmethoden der DNS-Rekombination, der Einbringung von DNS in bakterielle Rezipienten, ihrer Kultivierung sowie gegebenenfalls der Produktgewinnung aus solchen rekombinanten Rezipienten, gekennzeichnet dadurch, daß man

- in einer bereitgestellten Target-DNS, die sowohl das komplette Gen für das el 857-Repressorprotein (Kurzwort: cl857-Gen) als auch die P_R-Promotorregion des E.coli-Phagen Lambda in nativer Anordnung trägt, unmittelbar stromauf des el 857-Leserahmens mittels gerichteter in vitro-Mutagenese ein DSN-Segmentfür einen Restriktionsort einfügt, und die so modifizierte Target-DNS für den Folgeschritt des Verfahrens gewinnt (Schritt I),

- eine dieser modifizierten Target-DNS als Restriktionsfragment entnommene Teilsequenz, welche die mutagenisierte (PR-cl8571-Region enthält (Kurzwort: mutagenisierte Teilsequenz), in einen in grampositiven baJcterieJJen Wirten replizierenden PJasmidvektor mit einem zu exprimierenden Gen (Kurzwort: Zielgen) inseriert und durch Klonierung in einem grampositiven bakteriellen Rezipienten jeweils die erforderlichen Mengen an DNS der auf diese Weise erhaltenen Zwischenplasmide der pBS-Familie gewinnt (Schritt II),

- anschließend in wenigstens einem ausgewählten pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Restriktionsortes ein DNS-Fragment mit in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen Expressionssignalen (Kurzwort: EE) inseriert, Klone mit den erhaltenen rekombinanten Plasmiden mit Hilfe eins phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des jeweiligen Zielgens überprüft und durch Klonierung in einem bakteriellen Rezipienten die erforderlichen Mengen an DNS der auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektoren der pBS 50-Familie gewinnt (Schritt III),

- daraufhin in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die Box des Zielgens durch eine alternative Genbox substituiert, Klone mit den erhaltenen rekombinanten Vektoren mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des jeweiligen alternativen Strukturgens überprüft und durch Vermehrung in einem bakteriellen Rezipienten die erforderlichen Mengen an DNS der auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektoren der Familien pBS70 bzw. pBS80 gewinnt (Schritt IV).

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt I die Target-DNS mit der Pn-Promotorregion und dem cl857-Gen

- aus dem nativen E.coli-Phagen Lambda,

- aus einem rekombinanten Phagen bzw.

- aus einem rekombinanten Plasmidvektor
bereitstellt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Target-DNS o. g. Beschaffenheit aus einem rekombinanten DNS-Phagen bereitstellt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Target-DNS o. g. Beschaffenheit aus einem rekombinanten E.coli-Phagen der M 13-Familie bereitstellt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die Target-DNS o. g. Beschaffenheit aus dem rekombinanten Phagen M13 tg 130 (Pr el857 AIFNß)Pstl bereitstellt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man in die Target-DNS ein DNS-Segment einfügt, welches eine Hexanukleotid-Erkennungssequenzfür ein Restriktionsenzym aufweist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man in die Target-DNS ein DNS-Segment einfügt, welches die Erkennungssequenz für eines der nachstehenden Restriktionsenzyme

BamHI, BgIII bzw. Sail
aufweist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt Il die mutagenisierte Teilsequenz als Pstl-Pstl-Restriktionsfragment aus einem mutagenisierten rekombinanten Л/ИЗ-Phagen entnimmt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 5 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man die mutagenisierte Teilsequenz als 1794bp-Pstl-Pstl-Fragmentausdem mutagenisierten rekombinanten Phagen M13 tg 130(P_R BamHI el857 AIFNß)Pstl entnimmt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt Il für die Aufnahme der mutagenisierten Teilsequenz ein Promotor-Suchplasmid mit einem Indikatorgen bereitstellt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Aufnahme der mutagenisierten Teilsequenz ein Promotor-Suchplasmid mit unikalem Pstl-Ort vor dem Indikatorgen bereitstellt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Aufnahme der mutagenisierten Teilsequenz ein Promotor-Suchplasmid mit unikalem Pstl-Ort vor einem promotorlosen Alpha-Amylase-Gen (Kurzwort: amy) bereitstellt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Aufnahme der mutagenisierten Teilsequenz das Promotor-Suchplasmid pKB8 mit promotorlosem amyF-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens bereitstellt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1,6,8 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein in grampositiven bakteriellen Wirten replizierendes pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenz ein DNS-Fragment mit in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen nativen Expressionssignalen eines bakteriellen Gens inseriert.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1,6,8 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein in grampositiven bakteriellen Wirten replizierendes pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenz ein DNS-Fragment mit in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen nativen Expressionssignalen eines Gens eines Bakteriophagen inseriert.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenz ein DNS-Fragment mit in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen nativen Expressionssignalen eines Gens eines Staphylococcus aureus-Phagen inseriert.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenzein DNS-Fragment mit den in grampositiven bakteriellen Wirten funktionsfähigen nativen Expressionssignalen des Staphylokinase-Gens des S.aureus-Phagen 42 D (Kurzwort: SAK-EE bzw. EE) inseriert.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenz die aus einem rekombinanten Trägerplasmid entnommene SAK-EE inseriert.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III in wenigstens ein pBS-Zwischenplasmid unter Nutzung des eingefügten Ortes für ein Restriktionsenzym mit einer Hexanukleotid-Erkennungssequenzdie aus einem rekombinanten E-coli-Trägerplasmid der pBB-Serie entnommene SAK-EE inseriert.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1,7,13,15,17 und 19, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III

- das Zwischenplasmid pBS 10 (Molekülgröße 8,4kb) unter Nutzung des eingefügten BamHI-Ortes mit dem 3154bp großen BamHI-linearisierten E.coli-Plasmid pBB209zu dem ЕЕ-сІ/Рв-amyF)-shuttle-Vektor pBS52 (Molekülgröße 11,4 kb) fusioniert.

- diesen Vektor enthaltene Klone mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Amylase-Gens überprüft und diesen Vektor in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

21. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12 sowie 14 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die amy-Genbox durch eine alternative Genbox für ein intrazelluläres Protein substituiert.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die amy-Genbox durch eine alternative Genbox für ein intrazelluläres prokaryotisches Protein substituiert.

23. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12 sowie 14 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die amy-Genbox durch eine alternative Genbox für ein sekretorisches Protein substituiert.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die amy-Genbox durch eine alternative Genbox für ein sekretorisches Protein eines Mikroorganismus substituiert.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in wenigstens einem Expressionsvektor der pBS50-Familie die amy-Genbox durch eine Alternative, aus der DNS eines Bakteriums bzw. eines Bakteriophagen isolierte Genbox für ein sekretorisches Protein substituiert.

26. Verfahren gemäß Anspruch 1,20 und 24, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt IV in einem Expressionsvektor pBS52 die amvF-Genbox durch die sak42 D-Genbox substituiert.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Substitution in Schritt IV die sak24D-Genbox auf einem rekombinanten E.coli-Trägerplasmid bereitstellt.

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Substitution in Schritt IV die sak42 D-Genbox auf einem E. coli-Trägerplasmid der pBB-Serie bereitstellt.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Substitution in Schritt IV die sak42 D-Genbox auf dem Trägerplasmid рВВЗОІ (Molekülgröße 4077 bp) bereitstellt.

30. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 20 bis 28, gekennzeichnet dadurch, daß man in Einleitung des Schrittes IV

- aus dem shuttle-Vektor pBS52 ein 4,9kb großes Pstl-Pstl-DNS-Fragment isoliert und

- das nach Zirkularisierung dieser DNS entstandene, den P_n-Promotor ohne amyF-Gen enthaltende Zwischenplasmid pBS60 (Molekülgröße 4,9kb; MLS-Resistenzdeterminante) in einem grampositiven Rezipienten kloniert.

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, gekennzeichnet dadurch, daß man das Zwischenplasmid pBS60 in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

32. Verfahren gemäß Anspruch 29,30 und 31, gekennzeichnet dadurch, daß man

- sowohl das Trägerplasmid pBB301 als auch das Zwischenplasmid pBS60 in ihrem jeweils singulären Pstl-Spaltort linearisiert,

- beide DNS-Abschnitte zu dem (P_R-sak)-shuttle-Vektor pBS70 (Molekülgröße 8,9 kb) fusioniert und diesen Vektor in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

33. Verfahren gemäß Anspruch 29,30 und 31, gekennzeichnet dadurch, daß man

- die Pstl-Iinearisierte pBB301-DNS mit dem 4,9kb großen Pstl-Pstl-DNS-Fragment aus dem Vektor pBS52 direkt zu dem (P_R-sak)-shuttle-Vektor pBS70 (Molekülgröße 8,9 kb) fusioniert und

- diesen Vektor in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

34. Verfahren gemäß Anspruch 20,32 oder 33, gekennzeichnet dadurch, daß man

- den dem Vektor pBS70 als 1,8kb großes EcoRI-EcoRI-Teilfragment entnommen (P_R-sak)-DNS-Block mit dem 8,9kb großen EcoRI-EcoRI-Hauptfragment des shuttle-Vektors pBS 52 fusioniert,

- die hierbei erhaltenen (EE-cl857/P_R-sak)-shuttle-Vektoren pBS71 sowie pBS72 (Molekülgröße jeweils 10,8kb), die sich voneinander durch die Orientierung des (P_R-sak)-Blockes unterscheiden, mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Staphylokinase-Gens überprüft und beide Vektoren in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

35. Verfahren gemäß Anspruch 20,32 oder 33, gekennzeichnet dadurch, daß man

- den dem Vektor pBS52 als 2,6kb großes Pvull-Pvull-Fragment entnommen (EE-cI857)-DNS-Block mit der EcoRV-linearisierten pBS70-DNS fusioniert.

- die hierbei erhaltenen (P_R-sak/EE-cl857)-shuttle-Vektoren pBS80 sowie pBS81 (Molekülgröße jeweils 11,5kb), die sich voneinander durch die Orientierung des (EE-cl857)-Blockes unterscheiden, mit Hilfe eines phänotypischen Screenings auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Staphylokinase-Gens überprüft und beide Vektoren in einem Bacillus subtilis-Rezipienten kloniert.

36. Verfahren gemäß Anspruch 1,20,34 und 35, gekennzeichnet dadurch, daß man für das phänotypische Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des im jeweiligen pBS-Expressionsvektor enthaltenen Zielgens einen Mikroorganismen-Stamm der Gattung Bacillus einsetzt.

37. Verfahren gemäß Anspruch 36, gekennzeichnet dadurch, daß man für das phänotypische Screening auf Thermoinduzierbarkeit Expression des im jeweiligen pBS-Expressionsvektor enthaltenen Zielgens einen Mikroorganismen-Stamm der Art Bacillus subtilis einsetzt.

38. Verfahren gemäß Anspruch 1,20 und 37, gekennzeichnet dadurch, daß man für das Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Amylase-Gens jeweils einen der beiden nachfolgend angegebenen Stämme

B. subtilis 21 amy4 recE4 bzw.
B. subtilis 168 amy4 Ieu8 metB5
einsetzt.

39. Verfahren gemäß Anspruch 1,34,35 und 37, gekennzeichnet dadurch, daß man für das Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Staphylokinase 42 D-Gens jeweils einen der beiden nachfolgend angegebenen Stämme

B. subtilis DB104 bzw.
B. subtilis GB 500
einsetzt.

40. Verfahren gemäß Anspruch 1,20 und 38, gekennzeichnet dadurch, daß man das phänotypische Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Amylase-Gens auf die rekombinanten Wirtsstämme

B. subtilis 21 amy4 recE4(pBS52) bzw.
B. subtilis 168 amy4 Ieu8 metB5(pBS52)
anwendet.

41. Verfahren gemäß Anspruch 1,34,35 und 39, gekennzeichnet dadurch, daß man das phänotypische Screening auf Thermoinduzierbarkeit der Expression des Staphylokinase 42 D-Gens auf die rekombinanten Wirtsstämme

B. subtilis DB 104(pBS71),
B. subtilis DB 104(pBS 72),
B. subtilis DB 104( ρ BS 80),
B. subtilis DB 104(pBS81),
B. subtilis GB 500(pBS71),
B. subtilis GB 500(pBS 72),
B. subtilis GB500(pBS80) bzw.
B. subtilis GB 500(pBS81)
anwendet.

42. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 36 bis 41, gekennzeichnet dadurch, daß man im phänotypischen Screening und/oder bei der Ausprägung des jeweils zu exprimierenden Zielgens durch Kultivierung des herangezogenen, mit einem pBS-shuttle-Expressionsvektor transformierten grampositiven bakteriellen Wirtsstammes am Beginn der Hauptkultur einen Thermo-Induktionsschritt durchführt.

43. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 36 bis 41, gekennzeichnet dadurch, daß man im phänotypischen Screening und/oder bei der Ausprägung des jeweils zu exprimierenden Zielgens durch Kultivierung des herangezogenen, mit einem pBS-shuttle-Expressionsvektor transformierten grampositiven bakteriellen Wirtsstammes in der frühen Wachstumsphase der Hauptkultur einen Thermo-Induktionsschritt durchführt.

44. Verfahren gemäß Anspruch 42 oder 43, gekennzeichnet dadurch, daß man den Thermo-Induktionsschritt durch eine innerhalb von 3 Minuten ausgeführte Erhöhung der Kultivierungstemperatur von 28°C bis 30⁰C auf 37°C bis 42°C realisiert.

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