DE60305933T2

DE60305933T2 - Prokaryotische expressionskassetten, die durch zink reguliert werden

Info

Publication number: DE60305933T2
Application number: DE60305933T
Authority: DE
Inventors: Isabelle Poquet; Daniel Llull
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2023-08-30
Also published as: EP1537215B1; DK1537215T3; WO2004020640A2; US8354272B2; CY1105480T1; US20060199246A1; PT1537215E; CA2496350C; FR2843973B1; FR2843973A1; EP1537215A2; CA2496350A1; WO2004020640A3; DE60305933D1; ATE329038T1; ES2266871T3; AU2003278224A1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von heterologen Proteinen bei grampositiven Bakterien, insbesondere Milchsäurebakterien.
Neben ihren herkömmlichen Verwendungen in der Lebensmittelindustrie, werden Milchsäurebakterien heutzutage zunehmend als Wirtszellen für die Herstellung von heterologen Proteinen von Interesse eingesetzt. Diese Proteine von Interesse können sehr verschiedenartiger Natur sein, und es ist folglich wünschenswert, über die breitestmögliche Auswahl an Expressionswerkzeugen zu verfügen, um deren Herstellung in Abhängigkeit von den Spezifitäten eines jeden unter ihnen zu optimieren.
Im Allgemeinen ist es notwendig, starke Promotoren zu verwenden, die ermöglichen, ein ausreichendes Expressionsniveau des Gens von Interesse zu erhalten. In einigen Fällen können konstitutive Promotoren verwendet werden; in anderen Fällen (beispielsweise dann, wenn das Produkt des Gens von Interesse für das Wirtsbakterium toxisch ist oder Gefahr läuft, mit dessen Metabolismus zu interferieren), ist es vorzuziehen, induzierbare Promotoren zu verwenden, die ermöglichen, die Expression im gewünschten Augenblick auszulösen oder zu stoppen.
Obwohl Milchsäurebakterien zahlreiche Gene besitzen, deren Transkription durch verschiedene Faktoren reguliert wird, verfügt man zum jetzigen Zeitpunkt lediglich über eine relativ begrenzte Auswahl an induzierbaren Promotoren, die in der Praxis für die Herstellung von Expressionskassetten von Genen von Interesse eingesetzt werden können (zur Beurteilung vergleiche DE VOS, Curr. Op. Microbiol., 2, 289-295, 1999). In der Tat verlangt diese Verwendung nicht nur, dass die betreffenden Promotoren regulierbar sind, sondern auch, dass ein ausreichender Expressionsunterschied zwischen den verschiedenen Indukionszuständen vorliegt; idealerweise soll die Expression ein hohes Niveau unter Indutkionsbedingungen erreichen und soll unter Bedingungen der Nicht-Induktion vollständig blockiert werden können. Des Weiteren ist es erforderlich, die Faktoren, die sich bei der Regulierung dieser Promotoren auswirken, leicht beherrschen zu können.
Bei vorhergehenden Arbeiten, deren Ziel es war, exportierte Proteine aus L. lactis zu identifizieren (POQUET et al., J. Bacteriol., 180, 1904-1912, 1998), klonierten die Erfinder, in Fusion mit dem Reportergen Δ_SPNuc, ein genomisches DNA-Fragment des Stammes L. lactis MG1363, umfassend ein damals als nlp3 (New LipoProtein 3) bezeichnetes Gen, dessen Produkt Homologien mit einem Protein aus S. pneumoniae aufweist, das in den Transport der Metalle impliziert ist. Die Sequenz dieses Fragments ist über GENBANK unter der Nummer U95834 verfügbar.
Die Erfinder haben ebenfalls beobachtet, dass das Gen nlp3 durch zweiwertige Metallkationen, insbesondere Zn²⁺ negativ reguliert war (POQUET et al. "Use of a new reporter tool to demonstrate metal regulation of nlp3, a gene putatively involved in metal uptake in Lactococcus lactis"; 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria, Veldhoven, Niederlande, 19-23. September 1999).
Auf der anderen Seite wurde im Rahmen der vollständigen Sequenzierung des Genoms von L. lactis IL1403, das Gen nlp3, bekannt als zitS, als Bestandteil eines Operons, bezeichnet als zitRSQP identifiziert (BOLOTIN et al., Antoine van Leeuwenhoek, 76, 27-76, 1999; BOLOTIN et al., Genome Res. 11, 731, 2001). Durch Homolgie mit bekannten Sequenzen wurden putative Funktionen bei dem Transport von Zink den Genen dieses Operons zugewiesen. So würde das Produkt des Gens zitP die Permease des Transportsystems bilden, die Produkte des Gens zitS und des Gens zitQ würden die Verbindung mit dem Substrat bzw. die Bindung mit dem ATP sicherstellen, und das Produkt des Gens zitR, das Homologien mit der Familie transkriptioneller Repressoren marR aufweist, wäre in die Regulation des Transports von Zink impliziert.
Es ist bis heute nicht in Betracht gezogen worden, das System zur Regulierung des Operons zitRSQP einzusetzen, um die Expression von heterologen Genen zu kontrollieren. Denn obwohl eine negative Regulierung durch die Zugabe von Zink ausgelöst werden kann (POQUET et al., 1999, oben erwähnt), erschien das Grundexpressionsniveau, das bei Nichtvorliegen dieser negativen Regulierung beobachtet wurde, als nicht ausreichend, um eine zufriedenstellende Produktion von Proteinen von Interesse zu ermöglichen. Ferner wusste man nicht, ob der putative Repressor ZitR tatsächlich in die Repression der Expression dieses Operons impliziert war und ob weitere Regulatoren, insbesondere die pleiotropen Regulatoren flp, die als in die Regulierung des Transports von Zink bei L. lactis eingreifend beschrieben werden (GOSTICK et al., Mol. Microbiol., 31, 1523-35, 1999; SCOTT et al., FEMS Microbiol. Lett., 192, 85-89, 2000) ebenfalls impliziert sein konnten, entweder als Co-Repressoren oder, im Gegensatz hierzu, als eventuelle Aktivatoren.
Nun haben aber die Erfinder durch Weiterverfolgen ihrer Studien über die Regulierung des Operons zitRSQP bei Vorliegen von sehr geringen Zn²⁺-Konzentrationen ein maximales Expressionsniveau beobachtet, das viel stärker ist als man es nach den früheren Versuchen annehmen konnte und das ermöglicht, einen Induktionsfaktor größer 100 zu erreichen. Des Weiteren haben sie die Feststellung gemacht, dass die Expression von den Regulatoren flp unabhängig war und mit Hilfe des Proteins ZitR vollständig kontrolliert werden konnte.
Die Untersuchung der Struktur des Promotors des Operons zitRSQP von L. lactis hat es den Erfindern ermöglicht, neben den herkömmlicherweise in den bakteriellen Promotoren vorliegenden Elementen, nämlich der -35-(TTGACA-) Box und der -10- (TATAAT-) Box, die durch 17pb getrennt sind, eine die -35-Box überlappende Palindromsequenz herauszustellen, welche mit hoher Wahrscheinlichkeit die Bindungsstelle von ZitR darstellt.
Die Beobachtungen, von denen oben berichtet wird, ermöglichen die Annahme, dass sich die Regulierung von zitRSQP nach dem folgenden Mecha nismus vollzieht: Der Repressor ZitR kann mit dem intrazellularen Zn²⁺ eine Komlex bilden, der eine sehr hohe Affinität zu der die -35-Box überlappenden Bindungsstelle aufweist; der Komplex ZitR-Zn²⁺, welcher an das Palindrom gebunden ist, verhindert den Zugang der RNA-Polymerase zur -35-Box und unterbindet folglich die Transkription; im Gegenzug bindet sich die nicht komplexierte Form von ZitR nichtan die -35-Stelle, was die Transkription des Operons ermöglicht, die sich dann mit hohe Effizienz vollzieht.
Die Regulierung des Operons zitRSQP mittels ZitR hängt demzufolgte von der intrazellulären Zn²⁺-Konzentration ab, die ihrerseits eine Funktion der Zn²⁺-Verfügbarkeit in dem Kulturmedium ist.
Das Operon zitRSQP repräsentiert mit hoher Wahrscheinlichkeit ein System zum Transport von Zink von sehr hoher Affinität, das durch das Bakterium nur unter Bedingungen sehr ernstem Zinkmangels eingesetzt wird, um das Zellüberleben zu ermöglichen; unter den üblichen Kultivierungsbedingungen auf reichen Medien ist Zink im Überfluss in der Umgebung vorhanden und wird über Systeme mit geringerer Affinität als der Komplex ZitSPQ transportiert, dessen Synthese nun unterbunden wird.
Diese Eigenschaften des Systems zur Regulierung des Operon zitRSQP von L. lactis, welche durch die Erfinder herausgestellt wurden, ermöglichen, dessen Verwendung für die Herstellung von Proteinen von Interesse in Wirtsbakterien, vor allem grampositiven Bakterien und insbesondere Milchsäurebakterien vorzugschlagen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind die verschiedenen Aspekte dieser Verwendung.
Nach einer ersten Variante liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung einer Expressionskassette für eine Nukleotidsequenz von Interesse, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Kontrolle der Expression der besagten Sequenz von Interesse ein Pulynukleotid verwendet wird, das gebildet ist aus:

– einem bakteriellen Promotor, nachfolgend p_Zn genannt, enthaltend eine Bindungssteile für das Protein ZitR aus Lactococcus lactis, wobei die besagte Stelle die folgende Sequenz enthält: AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEQ ID NO: 1), worin TTGACA die -35-Box des besagten Promotors repräsentiert und worin N A, C, G, oder T repräsentiert;
– einer Sequenz, die für ein Pulypeptid codiert, das eine Identität von wenigstens 80%, vorzugsweise von wenigstens 85 %, und in absolut bevorzugter Weise von wenigstens 95 %, mit dem Protein ZitR aus Lactococcus lactis aufweist, und die unter transkriptioneller Kontrolle des besagten Promotors steht;
– und dass das besagte Polynukleotid mit wenigstens einer Restriktionsschnittstelle ausgestattet wird, welche die Insertion einer Polynukleotidsequenz von Interesse unter der transkriptionellen Kontrolle des besagten Promotors ermöglicht.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Promotor p_Zn die folgende Sequenz:
AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEQ ID NO: 2), worin TATAAT die -10-Box des genannten Promotors darstellt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der genannte Promotor p_Zn eine Bindungsstelle für das Protein ZitR aus Lactococcus lactis mit der folgenden Sequenz:
AAAAATAAYGTTAACTGGTTGACATTATTTTT (SEQ ID NO: 3), worin Y T oder C repräsentiert.
Als Beispiel für Promotoren pZn, die für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette verwendbar sind, seien folgende genannt:

– der Promotor p_Zn des Stammes MG1363 aus Lactococcus lactis, der die folgende Sequenz umfasst: AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAAC CAGTA (SEQ ID NO: 4);
– der Promotor p_Zn des Stammes IL1403 aus Lactococcus lactis, welcher die folgende Sequenz aufweist: AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATAATTAA CCAGTA (SEQ ID NO: 5).

Nach einer zweiten Variante liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung einer Expressionskassette einer Nukleotidsequenz von Interesse, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Kontrolle der Expression der genannten Sequenz von Interesse ein Polynukleotid verwendet wird,

– das von einem bakteriellen Promoter p_Zn gebildet ist, wie er oben definiert ist;
– und dass das besagte Polynukleotid mit wenigstens einer Restriktionsschnittstelle ausgestattet wird, welche die Insertion einer Nukleotidsequenz von Interesse unter der transkriptionellen Kontrolle des Promoters ermöglicht.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Insertion einer Nukleotidsequenz von Interesse in eine durch ein Verfahren gemäß der ersten oder der zweiten Variante der Erfindung erhaltene Expressionkassette unter transkriptioneller Kontrolle des genannten Promotors p_Zn.
Die genannte Nukleotidsequenz von Interesse kann jedwede Sequenz sein, die unter transkriptioneller Kontrolle des Promotors p_Zn exprimiert werden soll. Es kann sich insbesondere um jedwede Sequenz handeln, die für ein heterologes Protein von Interesse codiert, das man in einem Wirtsbakterium er zeugen möchte; das genannte Protein kann ggf. ein Fusionsprotein sein, das Polypeptidsequenzen unterschiedlicher Herkunft verbindet.
Expressionskassetten, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden, können ggf. ferner die Elemente enthalten, die erforderlich sind, um die Adressierung des Proteins von Interesse an der Zelloberfläche oder dessen Sekretion in das Kulturmedium zu ermöglichen.
In diesem Rahmen wird nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Insertion einer Nukleotidsequenz, die für ein Peptid zur extrazellulären Adressierung codiert, und wenigstens einer Restriktionsschnittstelle vollzogen, welche die Klonierung einer Nukleotidsequenz von Interesse in translationeller Fusion mit dem genannten Adressierungs-Peptid, unter transkriptioneller Kontrolle des Promotors p_Zn in eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhaltene Expressionskassette ermöglicht.
Das genannte Adressierungs-Peptid kann beispielsweise ein Signalpeptid zur Sekretion, eine transmembrane Domäne, ein Signal zur Verankerung an der Wand, etc. sein.
Zahlreiche Adressierungs-Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind an sich bekannt. Als nicht einschränkend zu verstehende Beispiele seien die Peptide genannt, die in der Publikation von POQUET et al. (1998, oben genannt) oder in der Publikation von LE LOIR et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4119-4127, 2001) beschrieben sind.
Für die Herstellung von sekretierten Proteinen ist ein bevorzugtes Peptid zur extrazellulären Adressierung das Signalpeptid des Proteins Exp4 aus L. lactis, das der folgenden Sequenz entspricht: MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO: 6).
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Vektors, das die Herstellung einer Expressionskassette durch ein erfindungsgemäßes Verfahren sowie die Insertion der genannten Kassette in einen Vektor umfasst. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Transformation eines grampositiven Bakteriums, das die Herstellung einer Expressionskassette durch ein erfindungsgemäßes Verfahren sowie die Transformation des genannten Bakteriums durch die Expressionskassette umfasst.
Vorzugsweise ist das Bakterium ausgewählt aus den Milchsäurebakterien, insbesondere den thermophilen Lactococcen, Lactobazillen oder Streptococcen.
Es kann sich ggf. um Bakterien handeln, die aus Bakterienstämmen stammen, welche eine oder mehrere Modifikation(en) ihres Genoms aufweisen, mit dem Ziel die Herstellung und/oder die Sekretion von exprimierten Proteinen in den genannten Bakterien zu verbessern und/oder deren Degradation zu verhindern. Beispielsweise kann im Rahmen der Herstellung von exportierten Proteinen ein Bakterienstamm verwendet werden, bei dem die Proteaseaktivität PrtP und/oder die Proteaseaktivität HuA inaktiv sind, wie derjenige, welcher in der PCT-Anmeldung WO 00/39309 beschrieben ist, oder ein Bakterienstamm, der ein Protein überproduziert, das ermöglicht, die exportierten Proteine zu stabilisieren, wie das Protein Nlp4 aus Lactococcus lactis, oder eines seiner Homologen (POQUET et al., 1998, vorgenannte Publikation).
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Expressionskassetten oder von rekombinanten Vektoren, die geeignet sind, mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Proteinen von Interesse in einem grampositiven Bakterium, insbesondere Milchsäurebakterien erhalten zu werden.
Die Expressionskassetten, die geeignet sind, mittels eines Verfahrens gemäß der ersten Variante der Erfindung erhalten zu werden, können in einem Wirtsbakterium eingesetzt werden, um den Zeitpunkt der Expression eines in die Klonierungsstelle insertierten Gens von Interesse sowie das Niveau dieser Expression zu kontrollieren.
Wenn das Wirtsbakterium in Anwesenheit einer im Vergleich zu seinem Bedarf überschüssigen Menge an Zink kultiviert wird, wird die Expression des Gens von Interesse vollkommen unterbunden. Die Entfernung von Zn²⁺ aus dem Kulturmedium (die einfach durch Zugabe eines Chelatbildners der zweiwertigen Kationen, wie EDTA erfolgen kann) ermöglicht, die Repression aufzuheben und die Expression des Gens zu bewirken. Das Expressionsniveau kann einfach durch die Menge des zugegebenen Chelatbildners reguliert werden.
Man kann auch das Wirtsbakterium in einem Medium kultivieren, das eine Menge an Zink aufweist, die gerade ausreichend ist, um seinen Bedarf während eines gegebenen Zeitraums der Kultivierung (z.B. während der Wachstumsphase) zu decken. In diesem Fall bewirkt die Erschöpfung des Zinks am Ende dieses Zeitraums die Expression des Gens von Interesse.
In diesem Rahmen besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einem grampositiven Bakterium und insbesondere einem Milchsäurebakterium, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es folgendes umfasst:

– die Einführung einer Expressionskassette, die geeignet ist, mittels eines Verfahrens nach der ersten Variante der Erfindung erhalten zu werden, in das besagte Bakterium, wobei die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die für das Protein von Interesse codiert;
– die Kultivierung des Bakteriums in einem Medium enthaltend eine Menge an Zn²⁺, die ausreichend ist, um die Expression des genannten Proteins zu unterbinden;
– die Induktion der Produktion des genannten Proteins durch Entfernung von Zn²⁺ aus dem genannten Medium;
– die Gewinnung des hergestellten Proteins.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Entfernung von Zn²⁺ aus dem genannten Medium durch Zugabe eines Chelatbildners der zweiwertigen Kationen erzielt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Entfernung von Zn²⁺ aus dem genannten Medium durch Kultivierung des Bakteriums bis zur Erschöpfung des anfangs in dem Medium vorliegenden Zn²⁺ erreicht.
Nach den Versuchen, die durch die Erfinder an dem Modell-Stamm MG1363 aus L. lactis durchgeführt wurden, kann das Aufrechterhalten einer Zn²⁺-Menge, die ausreichend ist, um die Expression unter Kontrolle des p_zn/ZitR-Systems zu unterbinden, während der gesamten Dauer der Kultivierung dadurch sichergestellt werden, dass ein Medium verwendet wird, welches zu Beginn der Kultivierung in der Größenordnung zwischen 1 und 2 μM Zn²⁺ enthält, wobei die Schwelle zur vollständigen Repression auf 100nM bis 1 μM Zn²⁺ geschätzt werden kann. Die Zn²⁺-Konzentration des Mediums, unter der man die vollständige Aufhebung der Repression von p_zn erhält, ist sehr gering (in der Größenordnung des Nanomol und maximal von einigen Nanomol). Die Menge an Chelatbildner der zweiwertigen Kationen, die erforderlich ist, um die Entfernung von Zn²⁺ zu vollziehen und um die Expression unter der Kontrolle des Promotors p_zn zu induzieren, schwankt entsprechend der Zn²⁺-Menge, die zu Beginn in das Kulturmedium eingebracht wird; zur Unterrichtung sei gesagt, dass im Falle des Stamms MG 1363, bei einem reichen Kulturmedium, wie das Medium M17, eine Entfernung von Zn²⁺, welche ermöglicht, eine maximale Expression zu induzieren, mittels einer EDTA-Konzentration in der Größenordnung von 0,1 mM erreicht werden kann; im SA-Medium, das 10 nM Zn²⁺ enthält, kann eine Entfernung von Zn²⁺, welche ermög licht, eine maximale Expression zu induzieren, mittels einer EDTA-Konzentration in der Großenordnung von 0,01 mM erreicht werden.
Dia vorerwähnten Mengen an Zn²⁺ und an Kationen-Chelatbildner sind zur Unterrichtung gegeben. Anhand dieser Angaben sowie der weiteren durch die Beschreibung der vorliegenden Erfindung gelieferten Informationen kann der Fachmann durch vorherige Tests, die beispielsweise durchgeführt werden, indem ein Reportergen unter Kontrolle des p_zn/ZitR-Systems in einer erfindungsgemäßen Expressionskassette platziert wird, die nach der betreffenden Bakterienspezies oder dem betreffenden Bakterienstamm geeignetesten Mengen, die eingesetzten Betriebsbedingungen, wie das verwendete Medium, die Modalitäten der Zugabe von Zn²⁺ und/oder von Chelatbildner (beispielsweise auf einmal, in mehreren Malen, kontinuierlich etc.) sowie das gewünschte Expressionsniveau leicht bestimmen.
Expressionskassetten, die durch ein Verfahren nach der zweiten Variante der Erfindung erhältlich sind, werden vorzugsweise bei Bakterienstämmen, insbesondere Lactococcen-Stämmen verwendet, bei denen der endogene Repressor ZitR sowie eventuell der Komplex ZitSPQ inaktiv ist. Unter diesen Bedingungen stellt der Promotor p_Zn einen starken Promotor dar, der die Expression des Proteins von Interesse während der gesamten Dauer der Kultivierung ermöglicht. Die Inaktivierung des Repressors ZitR sowie des Komplexes ZitSPQ kann sich in an sich bekannter Weise vollziehen, insbesondere durch gerichtete Mutagenese des Operons zitRSQP.
In diesem Rahmen liegt eine Aufgabe der Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einem grampositiven Bakterium, bei dem der endogene Represson ZitR inaktiv ist, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es folgendes umfasst:

– die Einführung einer Expressionskassette, die geeignet ist, mittels eines Verfahrens nach der zweiten Variante der Erfindung erhalten zu werden, in das besagte Bakterium, wobei die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die für das Protein von Interesse codiert;
– die Kultivierung des Bakteriums;
– die Gewinnung des hergestellten Proteins.

Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise wie folgt eingesetzt werden:

– auf dem Gebiet der Herstellung von heterologen Proteinen von therapeutischem Interesse durch Gentechnik, um die Produktion dieser Proteine durch die Kulturen von transformierten Bakterien besser zu kontrollieren;
– in der Lebensmittelindustrie, vor allem bei der Herstellung fermentierter Produkte, um entsprechend dem Stadium der Fermentation die Produktion von Proteinen von Interesse, die insbesondere ermöglichen, die Qualität des fermentierten Endproduktes zu beeinflussen, zu kontrollieren.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibungsergänzung, die sich auf nicht einschränkend zu verstehende Beispiele bezieht, welche die Herstellung von Expressionskassetten gemäß der Erfindung veranschaulichen, besser verständlich.
BEISPIEL 1: REGULIERUNG VON ZIT DURCH ZN²⁺ BEI L. LACTIS
Die Expression von zit in Abhängigkeit von der Zn²⁺-Konzentration des Mediums wird durch 2 unterschiedliche Techniken gemessen:

– Die Messung der Nuc-Aktivität der durch das Plasmid pVE8020 getragenen Fusion ZitRs-Δ_SPNuc in dem Stamm aus L. lactis MG1363. Das Plasmid pVE8020 resultiert aus der Klonierung des chromosomalen DNA-Fragments des Stammes MG1363, das p_ZnzitRzitS' entspricht (GenBank 095834), in das Plasmid pFUN (POQUET et al., 1998, oben erwähnt; Gen-Bank AF038666).
– Die Quantifizierung der mRNA von zitS in dem Wildtyp-Stamm MG1363 (endogene Expression von zitS) und in dem durch pVE8020 transformierten Stamm MG1363.

Wirkung des Zinks auf die Nuc-Aktivität unter der Kontrolle des Promotors p_Zn
Es wurden zwei Arten von Versuchen durchgeführt:

1). Die Messung der Nuc-Aktivität (Nuklease aus Staphylococcus aureus) wurde an Kulturplatten vollzogen, die chemisch definiertes SA-Medium (JENSEN und HAMMER, Appl. Env. Microbiol. 59, 4363-66, 1993) enthielten, das eine Mindestmenge von jedem der für das Bakterienwachstum notwendigen Elemente enthält und vor allem zinkarm ist (10 nM ZnSO₄).

Auf diesem Medium wird ein Depot aus einer Zn²⁺-Lösung (20 μl ZnSO₄ mit 0,1 M) in Form eines die Platte durchquerenden Streifens realisiert.
Nach der Absorption der Zn²⁺-Lösung werden zwei Bakterienausstriche in Form von 2 parallel zueinander verlaufenden Streifen realisiert, die den Zinkstreifen senkrecht schneiden, nämlich ein Kontrollausstrich, (Stamm MG1363, der durch ein Plasmid (pVE8009) transformiert ist, das die Fusion Usp-Δ_SPNuc unter der Kontrolle des Promotors Usp trägt) sowie ein Ausstrich des Stamms MG1363, der durch pVE8020 (MG1363 (pVE8020)) transformiert ist.
Die Inkubation der Platten über Nacht bei 30°C ermöglicht das Wachstum der Bakterien und die Bildung eines Gradienten mit abnehmenden Zn²⁺-Konzentrationen durch Diffusion aus dem ZnSO₄-Streifen.
Es wird ein Farbtest der Nuklease-Aktivität durchgeführt, indem auf den Platten eine Toluidinblau enthaltende Detektions-Deckschicht abgeschieden und bei 37°C inkubiert wird (LACHICA et al., Appl. Microbiol., 21, 585-87, 1971; LE LOIR et al., J. Bacteriol., 176, 5135-39, 1994): Die Nuc-Aktivität wird durch den Wechsel der Detektions-Deckschicht zu rosa detektiert, die um die Streifen der Bakterienausstriche herum einen Hof bildet.
Während der um den dem Kontrollausstrich entsprechenden Streifen herum beobachtete Hof über die gesamte Länge des Bakterienstreifens eine konstante Größe und Identität aufweist (was darauf schließen lässt, dass weder die Nukleaseaktivität von Usp-Δ_SPNuc, noch deren Export, noch deren Expression von Zn²⁺ abhängig sind), ist derjenige, welcher um den des MG1363 (pVE8020) entsprechenden Streifens herum beobachtet wird, auf das von dem Zinkstreifen am weitesten entfernte Ende begrenzt, an dem seine Breite und seine Intensität mit der bei dem Kontrollstreifen beobachteten Breite und Intensität vergleichbar sind; die Intensität nimmt bei Annäherung an den Zinkstreifen ab, und es wird keinerlei Hof in der Nähe der Kreuzungsstelle mit diesem beobachtet.
Es zeigt sich also, dass hohe Zinkkonzentrationen die Expression des Promotors des Operons zitRSQP unterbinden.

2). Die Regulierung wurde auch durch Detektion des Reporters Nuc an einem SDS-PAGE-Gel dank dessen Enzymaktivität (Zymogramm) erforscht. Bei diesem Versuch wurde das SA-Medium weiter zinkverarmt, entweder indem jedwede Zugabe von ZnSO₄ während der Zubereitung unterbleibt oder indem ihm EDTA in einer Konzentration von 0,01 nM zugegeben wird. Der Stamm aus L. lactis MG1363 (pVE8020) wurde in dieses Medium eingeimpft, anschließend wurde die Kultur zweigeteilt, um einer Zugabe von 2 μM Zn²⁺ unterzogen zu werden oder nicht. Nach dem Wachstum bei 30°C ohne Rühren über Nacht wurden Kulturproben unter Normalisierung ihres Volumens in Abhängigkeit von ihrer OD₆₀₀ entnommen, so dass eine Zellzahl erhalten wird, die zu derjenigen von 1 ml Kultur bei OD₆₀₀ = 1 äquivalent ist. Die Proben wurden durch konzentrierte Trichloressigsäure gefällt, gewaschen, in Anwesenheit von Lysozym und von SDS lysiert und in einen Ladepuffer aufgenommen, entsprechend dem in POQUET et al., (1998, oben genannt) beschriebenen Protokoll.

Die Proteine wurden anschließend an einem SDS-PAGE-Gel mit 12,5 % Acrylamid nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Nuc-Aktivität wurde wie oben beschrieben detektiert. Drei eine Nukleaseaktivität aufweisende Proteinformen (die entsprechend ihres Molekulargewichtes dem Vorläufer des nicht gespaltenen Signalpeptids, der reifen Form Nlp3-Δ_SPNuc sowie dem Degradationsprodukt NucA entsprechen) wurden einzig bei der Kulturprobe detektiert, die keine Zugabe erfahren hat. Es wurde kein eine Nuc-Aktivität aufweisendes Protein in der mit Zn²⁺ angereicherten Probe detektiert. Diese Ergebnisse zeigen eine vollständige Repression in Anwesenheit von 2 μM Zn²⁺.
Wirkung von EDTA auf die Nuc-Aktivität unter Kontrolle des Promotors p_Zn
Die Messung der Nuc-Aktivität erfolgt an Kulturplatten, die zinkreiches M17-Medium enthalten (TERZAGHI and SANDINE, Appl. Environ. Microbiol., 29, 807-13, 1975).
Es wird ein Depot aus einer EDTA-Lösung (20 μl mit 0,1 M) sowie ein Ausstrich des das Kontrollplasmid enthaltenden Stammes MG1363 und ein Ausstrich des Stammes MG1363 (pVE8020) in Form von Streifen, wie oben beschrieben, vollzogen.
Nach der Inkubation bei 30°C über Nacht wird die Nuc-Aktivität wie oben beschrieben detektiert.
Der um den dem Kontrollausstrich entsprechenden Streifen beobachtete Hof weist – wie derjenige, welcher im Falle des Zinks beobachtet wurde – eine konstante Größe und Intensität über die gesamte Länge des Streifens auf.
Hingegen ist der Hof, welcher um den dem Ausstrich MG1363 (pVE8020) entsprechenden Streifen herum beobachtet wird, überraschenderweise in der Nähe des EDTA-Depots wesentlich intensiver als der des Kontrollausstriches; die Intensität nimmt sehr schnell ab, wenn man sich von dieser Kreuzungsstelle entfernt.
Es stellt sich folglich heraus, dass EDTA die Expression des Promotors des Operons zitRSQP induziert. Das Expressionsniveau erscheint außerdem höher als das, welches in dem vorhergehenden Versuch im Abstand von dem Zinkstreifen beobachtet wurde, und außerdem höher als das des Kontrollausstriches, welche durch den Promotor Usp kontrolliert wird; es kann demzufolge dank EDTA-Konzentrationen, die das Bakterienwachstum nicht beeinträchtigen (wie 0,1 mM in M17), ein sehr hohes Induktionsniveau von p_Zn zitR erreicht werden.
Quantitative Evaluierung der Wirkung von EDTA auf die Nuc-Aktivität unter der Kontrolle des Promotors p_Zn
Um die Wirkung von EDTA auf die exprimierte Nuc-Aktivität unter Kontrolle des Promotors des Operons zitRSQP quantitativ zu evaluieren, werden die folgenden Versuche durchgeführt:
Der durch pVE8020 transformierte Stamm MG1363 wird in M17-Medium, das mit Erythromycin mit 5 μg/l angereichert ist, bis zur exponentiellen Phase (OD₆₀₀ = 0,3) oder stationären Phase (OD₆₀₀ = 1,2) kultiviert. Diese Kultur wird in 4 Unterkulturen aufgeteilt; 3 von ihnen wird dann EDTA mit unterschiedlichen Endkonzentrationen (3,3 mM; 0,33 mM; 0,033 mM) zugesetzt; die vierte erhält keine EDTA-Zugabe (0 mM EDTA). Nach einer Inkubation von 30 Minuten oder 1 Stunde 30 Minuten werden von jeder Kultur Proben entnommen. Die Zellzahl einer jeden Probe wird durch Adaptation des Volumens normalisiert, derart dass man eine Zellzahl erhält, die zu derjenigen von 1 ml Kultur bei OD₆₀₀ = 1 äquivalent ist.
Die Zeilen werden anschließend lysiert und durch eine Behandlung mit konzentrierter Trichloressigsäure (16,7 %) gefällt, mit Aceton (80 %) gewaschen und in 100 μl Tris-Puffer (50 mM pH7) aufgenommen. 10 μl einer jeden so behandelten Probe werden auf einer Platte abgeschieden, die Medium zur Detekion der Nuc-Aktivität enthält (LACHICA et al., 1971; LE LOIR et al., 1994, oben genannt). Die Nuc-Aktivität wird durch die Größe des Hofes sowie die Intensität der Rosafärbung um jeden Ausstrich herum evaluiert. Für eine quantitative Evaluierung des Aktivitätsniveaus wird auf der gleichen Platte ein Vergleichsbereich aus gereinigtem Nuc-Protein (Verdünnung von 4 in 4 mittels 400 ng) deponiert.
Man stellt fest, dass die Größe des Hofes sowie die Intensität der Färbung in Abhängigkeit von der EDTA-Konzentration schwanken, die zur Behandlung der Zellen verwendet worden ist. Liegt kein EDTA vor, wird ein sehr feiner Hof ohne deutliche Färbung festgestellt; bei 0,033 mM EDTA wird ein feiner, deutlich rosa gefärbter Hof beobachtet; bei 0,33 mM wird ein breiter Hof mit sehr intensiver Rosafärbung beobachtet. Von 0,33 bis 3,3 mM wird keinerlei Erhöhung der Größe und der Intensität des Hofes beobachtet. Es wird keinerlei signifikanter Unterschied in der Größe und Intensität des Hofes zwischen der EDTA-Zugabe, die in der exponentiellen Phase erfolgt, und derjenigen, die in der stationären Phase erfolgt, noch zwischen den zwei Inkubationszeiten (30 Minuten oder 1 Stunde 30 Minuten) festgestellt.
Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Induktionsniveau der Expression von p_Zn mit der Konzentration der zugegebenen EDTA bis zu einer Sättigungsschwelle steigt (die in dem M17-Medium, unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen, bei einer EDTA-Konzentration in der Größenordnung von 0,33 mM erreicht ist, unabhängig von der Wachstumsphase und der Inkubationszeit).
Der Vergleich mit dem Vergleichsbereich aus gereinigtem Nuc-Protein ermöglicht zu beurteilen, dass das durch die Zugabe von 0,33 mM EDTA im M17-Medium erreichte Induktionsniveau in der Größenordnung von 100 liegt.
Wirkung des Zinks auf die Transkription des Operons zit
Die verwendeten Stämme sind der Wildtyp-Stamm aus L. lactis subsp cremoris MG1363 sowie dessen mutantes Derivat FNR (Doppelmutante flpA flpB, SCOTT et al., 2000, oben genannt; GOSTICK et al., 1999, oben genannt). Die Gene flp sind pleiotrope Regulatoren, die insbesondere beim Transport von Zink intervenieren; bei FNR ist die intrazelluläre Zinkkonzentration sieben bis acht mal geringer als die des Wildtyp-Stammes (GOSTICK et al., 1999, oben genannt).
Mittels einer Vorkultivierung jedes Stammes in SA-Medium über Nacht, das lediglich für FNR durch Erythromycin mit 5 μg/μl und mit Tetracyclin mit 5 μgl/μl angereichert ist, wird eine Kultivierung bei 30°C in SA-Medium vollzogen (dessen Zn²⁺-Konzentration 10 nM beträgt). In der frühen exponentiellen Phase (OD₆₀₀ 0,07 bis 0,08) wird diese Kultur in zwei Teile aufgeteilt; dem einen (+) wird ZnSO₄ zugegeben, um eine Endkonzentration an Zn²⁺ von 2 μM zu erzielen (die das Wachstum nicht beeinträchtigt); der andere Teil (–) erfährt keine Zugabe. Die Kultivierung wird ohne Änderung bis zur exponentiellen (OD₆₀₀ = 0,2) oder stationären (OD₆₀₀ = 0,8) Phase fortgesetzt. Die RNA der Bakterien wird dann entsprechend dem durch RAYA et al., (J. Bacteriol., 180, 3174-80) beschriebenen Protokoll extrahiert.
Nach der Extraktion wird die RNA-Konzentration durch Messung der OD₂₅₀ berechnet: 60 μg RNA werden auf einem Gel mit 1 % Agarose aufgetragen. Nach der Migration und dem Transfer auf eine Nylonmembran werden die zitRS-Transkripte durch Northern-Transfer mit einer spezifischen Sonde des Gens zitS detektiert.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eins spezifische mRNA der erwarteten Größe für zitRS nur bei Abwesenheit (–) einer Zugabe von Zn²⁺ und niemals bei deren Vorliegen (+) beobachtet wird, und zwar unabhängig von dem Stamm und von der Wachstumsphase zum Zeitpunkt der Zugabe.
Dies zeigt 1) dass die Repression der Expression des Operons zit durch Zn²⁺ im transkriptionellen Bereich erfolgt, 2) dass sie bei einer Zn²⁺-Konzentration des Mediums von 2 μM vollständig ist und 3) dass sie von den Genen flp unabhängig ist, da sie in der Mutante FNR erfolgt. Dieser letztgenannte Punkt lässt darauf schließen, dass die Regulierung durch Zn²⁺ ganz und gar von dem Regulator zitR abhängt.
Bei Nichtvorliegen einer Zn²⁺-Zugabe wird ein sehr starkes Expressionsniveau beobachtet, außer bei dem Stamm MG1363 in exponentieller Phase, wo nur eine geringe Expression beobachtet wird. Diese Resultate lassen darauf schließen, dass trotz der sehr geringen Zn²⁺-Konzentration (10 nM) des SA-Ausgangsmediums die intrazelluläre Zn²⁺-Konzentration zum Zeitpunkt der exponentiellen Phase, zu dem die Entnahme vorgenommen worden ist, im Falle des Stamms MG 1363 noch ausreichend ist, um die Transkription des Operons zit deutlich zu unterbinden. In stationärer Phase hingegen, nach Erschöpfung des in dem Medium vorliegenden Zn²⁺, ist die Expression sehr stark. Im Falle des Stammes FNR ist die Zn²⁺-Konzentration von 10 nM des Ausgangsmediums unzureichend, um – selbst während der exponentiellen Phase – eine intrazelluläre Zn²⁺-Konzentration sicherzustellen, welche die Transkription des Operons zit unterbindet.
Es stellt sich demzufolge heraus, dass die Induktion der Expression direkt von der intrazellulären Zn²⁺-Konzentration abhängig ist und das diese sehr gering sein muss, um eine maximale Expression zu erreichen.
Dies kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass:

1) die extrazelluläre Zn²⁺-Konzentration gesenkt wird; diese muss nämlich sehr viel geringer als 10 nM sein, wobei immer noch eine starke Repression gegenüber dem maximalen Induktionsniveau festgestellt wird. Die Senkung der extrazellulären Zn²⁺-Konzentration kann beispielsweise durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA (unabhängig von der Wachstumsphase) oder dadurch, dass in stationärer Phase unter Bedingungen verfahren wird, unter denen das anfangs in dem Medium vorliegende Zn²⁺ im Laufe des Wachstums durch die Bakterien verbraucht worden ist, oder aber durch eine Kombination dieser beiden Mittel erfolgen.
2) Mutanten, wie der oben erwähnte Stamm FNR, verwendet werden, bei denen der Transport des Zinks beeinträchtigt ist und die aus diesem Grund eine sehr geringe intrazelluläre Zn²⁺-Konzentration aufweisen.

BEISPIEL 2: KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN UNTER KONTROLLE DES SYSTEMS ZUR REGULIERUNG DES OPERONS ZITRSQP
Konstruktion von Plasmiden, die das System zur Regulierung des Operons zitRSQP enthalten
Plasmid pDI11
Das Promotor-Regulator-System p_Zn-zitR des Stammes MG1363 wird durch PCR-Amplifikation (kit DyNAzyme EXT von FINNZYMES) eines Teils des Inserts p_ZnzitRzitS' (GenBank U95834) des Plasmids pVE8020 mit den Oligonukleotiden Oligo 9 und Oligo MUT erhalten:
Oligo 9:
5'-CTAATGAGCGGGCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 7)
Oligo MUT:
5'-GCTCTAGAGCGGGATCCTTCATCGAAACTCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 8)
Oligo 9 hybridisiert mit der multiplen Klonierungsstelle (MCS) von pFUN und ermöglicht, jedes in diesen Vektor klonierte Insert zu amplifizieren. Oligo MUT ermöglicht, die potentielle Bindungsstelle der Ribosomen (RBS) von zitS zu eliminieren, und um die Klonierung des PCR-Fragments zu erleichtern: weist seine Sequenz, die in dem Überlappungsbereich zwischen zitR und zitS liegt, zwei (unterstrichene) Mutationen in der RBS (die Wildtyp-Sequenz 5'-GGAGGAG-3' ist zu 5'-TGAAGAG-3', komplementär zu 5'-CTCTTCA-3' in Oligo MUT mutiert) sowie die zwei Restriktionsschnittstellen BamHI und XbaI (fettgedruckt) auf.
Die Sequenz der Region des Plasmids pVE8020, ausgehend von welcher die Amplifikation (SEQ ID NO: 9) vollzogen wird, ist in 2 dargestellt. Die Ziffern auf der linken Seite der Sequenz entsprechen der Nummerierung der vollständigen Sequenz des Plasmids pVE8020. Die Paarungsbereiche der Primer Oligo 9 und Oligo MUT sind fettgedruckt und mit Pfeifen dargestellt. Die Sequenzen, welche für ZitR sowie einen Teil von ZitS codieren, sind angezeigt. Die potentiellen RBS (Ribosomen-Bindungsstellen) von zitR und zitS sind eingerahmt, und die Kodone zur Initiation der ATG-Translation sind unterstrichen. Die -35- und die -10-Box des Promotors sind eingerahmt und grau überstrichen; die potentielle Stelle zur Initiation der Transkription ist durch eine doppelte Unterstreichung angezeigt.
Das Amplifikationsprodukt von 700 Bp wird durch das Klenow-Fragment (PoIIK) der DNA-Polymerase von Escherichia coli, anschließend durch XbaI behandelt. Dieses modifizierte Fragment wird gereinigt und in den Vektor pFUN kloniert, der zuvor durch EcoRV und XbaI gespalten wurde: Die Ligationsmischung (Fragment + pFUN + Ligase des T4-Phagen) wird verwendet, um den Stamm MG1363 aus Lactococcus lactis zu elektroporieren, und Erythromycinresistente Klone werden auf festem M17-Medium + Glukose 0,5 % + Erythromycin 5 μg/ml selektioniert. Einer dieser Klone, der ein rekominantes Plasmid von 8,2 kb enthält, das nachfolgend als pDI11 bezeichnet wird, wird ausgewählt.
Die Schritte der Konstruktion dieses Plasmids sind in 3a dargestellt.
Es enthält die gesamte für ZitR codierende Sequenz sowie eine Sequenz 5', welche den Promotor p_Zn enthält. Diese Sequenz 5' (SEQ ID NO: 10) ist nachfolgend (bis zur potentiellen Stelle der Initiation der Transkription) dargestellt:
GATCTGTCAGCTGGTTCAACTAGCGGTGGTCAAACTGTTAGTAATAAAACTTA TTGTTTTGATGTTCGGCTTAAGGATGGAAGGATTTTTCAAATAAAAAAGTAAAA AATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATλATTAACCAGTA
Plasmid pDI12
pDI11 wird durch EcoRI und EcoRV gespalten und durch PollK behandelt, um ein lineares Fragment von 8,18 kb ohne die Restriktionsschnittstellen des MCS von pFUN zu erhalten (wodurch es möglich ist, sie später anderswo in die Konstruktion einzuführen), anschließend durch die Ligase des T4-Phagen behandelt. Der Stamm MG1363 wird durch die Ligationsmischung elektroporiert, und ein Erythromycin-resistenter Klon, der das Plasmid pDI12 enthält, wird wie oben beschrieben selektioniert.
Die Schritte der Konstruktion diese Plasmids sind in 3b dargestellt.
Konstruktion von ein Reportergen enthaltenden Plasmiden unter Kontrolle des Systems zur Regulierung des Operons zitRSQP
Plasmid pDI24
pDI24 umfasst die nachfolgenden Elemente: Eine Sequenz, die für ein Reporterprotein codiert, das ermöglicht, das System zu testen, gefolgt von einem Terminator.
Das gewählte Reporterprotein ist NucB, die Form ohne Peptidsignal der Nuklease Nuc von Staphylococcus aureus (SHORTLE, Gene, 22, 181-189, 1983). Sein offener Leserahmen wird unter der Kontrolle des Promotors p_nis (durch Nisin induzierbar) für die Transkription und der Signale von Usp45 aus L. lactis für die Translation (RBSUsp45 und Initiationskodon) und für die Sekretion (Signalpeptid PSUsp45) in das Plasmid pSEC1 (oder pVE3684, CHATEL et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8, 545-551, 2001) kloniert, wobei die Einheit p_nis-RBSUsp45-PSUsp45 in pDI24 kloniert wird.
Der gewählte Terminator ist der Terminator T1T2 (PESCHKE et al., J. Mol. Biol., 186, 547-555, 1985), der von dem Plasmid pVE5239 stammt (DIEYE et al., J. Bacteriol., 183, 4157-4166, 2001).
Für die Konstruktion von pDI24 wird pSEC1 durch XhoI gespalten, durch DNA-Polymerase des T4-Phagen behandelt und durch ClaI gespalten, um eine lineare Form von 3,8 kb zu erhalten. Parallel dazu wird pVE5239 durch SacI gespalten, durch DNA-Polymerase des T4-Phagen behandelt und durch ClaI gespalten, um ein Fragment von 217 Bp zu erhalten, das den Terminator T1T2 umfasst. Dieses Fragment wird gereinigt und mit der linearen Farm des Vektors pSEC1 verknüpft, und die Ligationsmischung wird verwendet, um den Stamm TG1 aus E. coli zu transformieren. Chloramphenicol-resistente Klone werden auf Platten LBT + Chloramphenicol 12,5 μg/ml selektioniert. Einer dieser Klone, der ein Plasmid von 4 kb enthält, welches als pDI24 bezeichnet wird, wird ausgewählt.
Die Schritte der Konstruktion von pDI24 sind in 4 dargestellt.
Plasmid pDI1224
Die Fusion PSUsp45-NucB wird unter die Kontrolle des Expressionssystems p_Zn-zitR in dem Plasmid pDI12 gestellt, um das Plasmid pDI1224 zu produzieren.
pDI12 wird durch XbaI gespalten, mit DNA-Polymerase des T4-Phagen behandelt, anschließend durch BamHI gespalten, um eine lineare Form von 8,1 kb zu erhalten. Parallel hierzu wird pDI24 durch SacII gespalten, mit DNA-Polymerase des T4-Phagen behandelt und durch BamHI gespalten, um ein Fragment von 932 Bp zu erhalten, das den offenen Leserahmen des Reporterproteins NucB (unter der Kontrolle von RBSUsp45 und von PSUsp45) sowie den Transkriptions-Terminator T1T2 enthält. Dieses Fragment van 932 Bp wird gereinigt und mit der linearen Form des Vektors pDI12 verknüpft, und das Ligationsprodukt wird verwendet, um MG1363 zu transformieren. Die Transformanten werden auf festem M17-Medium + Glukose 0,5 % + Erythromycin 5 μg/ml + EDTA 0,2 mM selektioniert. Die EDTA ermöglicht, dank des Systems p_Zn-zitR die Expression des Reporters zu induzieren und folglich ein erstes Screening des Phenotyps Nuc⁺ der rekombinanten Klone zu vollziehen. Der Nuc-Aktivitätstest wird entsprechend dem von LE LOIR et al., (J. Bacteriol. 176, 5135-5139, 1994) beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Die Schritte der Konstruktion von pDI1224 sind in 5 dargestellt.
Das Insert dieses Plasmids, welches das Reportergen enthält, das unter der Kontrolle des Expressionssystems p_Zn-zitR für NucB codiert, ist schematisch in 6a dargestellt.
Plasmid pDI30
Um das Niveau der durch p_Zn zitR kontrollierten Expression in Abhängigkeit von den Zn²⁺-Umgebungsbedingungen zu quantifizieren, wurde ein weiterer zytoplasmatischer Lokalisierungsreporter verwendet, nämlich die β-Galactosidase von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, die durch das Operon lacLM codiert ist.
Das Operon lacLM wurde durch PCR mittels des Plasmids pAMJ769 (MADSEN et al., Mol. Microbiol. 32, 75-87, 1999) unter Verwendung des folgenden Primer-Paares amplifiziert:
LAC5:
5'-GGCGGATCCTTTGAAAGGATATTCCTC-3' (SEQ ID NO: 15)
LAC3:
5'-CCTACGTATTAGAAATGAATGTTAAAGC-3' (SEQ ID NO: 16).
Die Primer LAC5 und LAC3 wurden entsprechend der Sequenz des Plasmids pAK80, veröffentlicht durch ISRAELSEN et al., (Appl. Environ. Microbiol. 61, 2540-2547, 1995) bzw. gemäß der Sequenz der Gene lacLM, die über Gen-Bank unter der Nummer M92281 verfügbar ist, gezeichnet. LAC5 überlappt die potentielle Bindungsstelle des Ribosoms von lacL (RBS, in der Sequenz fett gezeigt), und LAC3 enthält das Stop-Kodon von lacM. Des Weiteren wurden – um die Klonierung des Fragments PCR zu ermöglichen – die Restriktionsschnittstellen BamHI und SnaBI an den Enden von LAC5 bzw. LAC 3 eingeführt (sie sind in den Sequenzen hervorgehoben). Für die Konstruktion von pDI30 wurde das Rezeptor-Plasmid pDI1224 durch BamHI und EcoRV gespalten, um den sekretierten Reporter PSusp45NucB zu deletieren, und das Produkt von PCR lacLM nach der Spaltung durch BamHI und SnaBI wurde an seine Stelle inseriert. Diese Ligationsmischung wurde verwendet, um den Stamm von L. lactis MG1363 zu transformieren. Die Transformanten wurden in M17-Agar-Medium + Glukose 0,5 % + Erythromycin 5 μg/ml + X-Gal (5-Bromo-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactosid) 160 μg/ml + EDTA 0,5 mM selektioniert. Die Zugabe von X-Gal und von EDTA zu dem Medium ermöglicht, die Klone zu screenen, die pDI30 für ihren Phänotyp blau tragen, der mit der Hydrolyse des X-Gal durch die β-Galactosidase verbunden ist (es wurde bestätigt, dass die Klone bei Abwesenheit von EDTA weiß bleiben, was darauf schließen lässt, dass das Medium ausreichend Zn²⁺ enthält, um die Expression von LacLM zu schließen).
Das Insert dieses Plasmids, welches das Operon lacLM enthält, das unter der Kontrolle des Expressionssystems p_Zn-zitR für die β-Galactosidase codiert, ist schematisch in 6b dargestellt.
Die Schritte der Konstruktion von pDI30 sind in 7 dargestellt.
BEISPIEL 3: QUANTIFIZIERUNG DES INDUKTIONSNIVEAUS EINES REPORTERGENS ZUR ZYTOPLASMATISCHEN LOKALISATION UNTER KONTROLLE DES PROMOTORS P_ZNZITR
Der Stamm aus L. lactis MG1363, welcher das Plasmid pDI30 trägt, wurde in chemisch definiertem SA-Medium, das mit Zn²⁺ in einer Konzentration von 1 μM angereichert ist, kultiviert. Das Wachsen wurde über Nacht bei 30°C ohne Rühren vollzogen.
Am folgenden Tag war die Kultur zu etwa 1/100stel in SA-Medium verdünnt (das ZnSO₄ in der Konzentration von 10 nM enthält), und das Wachstum wurde durch Messen der OD₆₀₀ verfolgt. Bei dem Wert von OD₆₀₀∼0,2 wurde die Kultur in mehrere Unterkulturen aufgeteilt, die unterschiedlichen Behandlungen unterzogen wurden: keine Zugabe oder Zugabe von EDTA in den Konzentrationen von 10 – 30 – 50 – 100 – 300 oder 500 μM oder aber Zugabe von Zn²⁺ in der Konzentration von 1 μM. Zu unterschiedlichen Zeiten der Behandlung wurde das Wachstum durch Messen der OD₆₀₀ verfolgt, und die β-Galactosidase (β-Gal)-Aktivität der Bakterienextrakte wurde mittels der Miller-Methode quantifiziert. Bei Anwesenheit von ONPG produziert β-Gal O-Nitrophenol von gelber Farbe, das durch Messen der optischen Dichte bei 420 nm quantitativ bestimmt werden kann; 1 Miller-Einheit β-Gal-Aktivität wird als 1 nmol O-Nitrophenol pro Minute pro Einheit optischer Dichte pro ml Kultur produzierend definiert.
Die β-Gal-Aktivität, die nach einer Stunde Behandlung in Abhängigkeit von der zugegebenen EDTA-Konzentration (in μM ausgedrückt) gemessen wird, ist in 8a dargestellt; die mit Zn²⁺ in einer Konzentration von 1 μM angereicherte Unterkultur ist durch einen Pfeil (+ 1 μM Zn) markiert.
Bei Abwesenheit von EDTA oder bei Anwesenheit von Zn²⁺ beobachtet man ein sehr geringes Grundniveau der β-Gal-Aktivität. Bei Anwesenheit von EDTA beobachtet man eine sehr deutliche Induktion der β-Gal-Aktivität, die von der EDTA-Konzentration abhängt: Das maximale Aktivitätsniveau (Induktion mit einem Faktor > 100) wird bei den EDTA-Konzentrationen von 30 μM oder 50 μM erreicht, was folglich den optimalen Konzentrationen-Bereich definiert, der unter diesen Bedingungen einzusetzen ist, um eine maximale Induktion zu erzielen.
Im Laufe des gleichen Versuchs wurden auch das Wachstum (gepunktete Kurven) sowie die β-Gal-Aktivität (Kurven in durchgezogenen Linien) einiger Unterkulturen in Abhängigkeit von der Zeit gemessen; die Ergebnisse sind in 8b dargestellt. Die untersuchten Unterkulturen wurden bei OD₆₀₀∼0,2 (durch einen Pfeil markiert) den folgenden Behandlungen unterzogen: keine Zugabe (☐); Zugabe von EDTA mit einer Konzentration von 30 μM (Δ) oder 50 μM
; Zugabe von Zn²⁺ mit 1 μM (O). In gleichmäßigen Zeitabständen nach diesen Behandlungen werden Aliquote entnommen, um die β-Gal-Aktivität der Bakterienzellen zu quantifizieren. Das Induktionsniveau hängt sowohl von der EDTA-Expositionszeit als auch von der EDTA-Konzentration ab. Die maximale Induktion liegt bei einem Faktor > 500 für 3 bis 4 Stunden bei Anwesenheit von EDTA 30 μM, wodurch es möglich ist, die Einsatzbedingungen des Systems zu definieren.
BEISPIEL 4: KONSTRUKTION VON PLASMIDEN, DIE EINE SEQUENZ ENTHALTEN, WELCHE FÜR EIN SEKRETIONS-SIGNALPEPTID CODIERT
Diese Plasmide werden durch Substitution von Elementen des Sekretionssystems PSUsp45 des Plasmids pSEC durch diejenigen des Sekretionssystems von Exp 4 konstruiert.
Die Sequenz, die das Signalpeptid von Exp 4 codiert (PSExp4), begleitet von den Translationssignalen von Exp4, d.h. dessen RBS (oder RBSExp4) und dessen Kodon zur Initiation der Translation, wurde mittels des Plasmids pVE8020 (POQUET et al., 1998, oben genannt) unter Verwendung der Primer- Paare Exp4-5 + Exp4-NdeI sowie M13reverse + Exp4-NdeI amplifiziert, deren Sequenzen folgende sind:
M13reverse:
5'-CAGGAAACAGCTRTGACC-3' (SEQ ID NO: 11);
Exp4-5:
5'-GTTCTAAGGATCCATTAACTTAAGGAG-3' (SEQ ID NO: 12);
Exp4-NdeI:
5'-TTTGTGATGCATATGCAAATACAACGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 13);
Die Primer Exp4-5 und Exp4-NdeI wurden ausgehend von dem Teil 5' des Gens exp4 des Stammes MG1363 aus L. lactis (GENBANK Nummer U95836) entworfen.
Bei Exp4-5 und Exp4-NdeI wurden Restriktionsschnittstellen (fettgedruckt) an den Enden von PSExp4 eingeführt, um dessen Klonierung zu erleichtern, BamHI an 5' bzw. NsiI an 3' (stromabwärts der potentiellen Spaltstelle von PSExp4). Die Stelle NsiI wird an einer Position eingeführt, welche die Klonierung von PSExp4 in Phase mit NucB ermöglicht.
Darüber hinaus umfasst Exp4-NdeI eine NdeI-Schnittstelle (unterstrichen), um eine eventuelle Klonierung (eines Proteins von Interesse) in Phase mit PSExp4 zu ermöglichen. Die Insertion der Stellen NdeI und NsiI führt nur zwei A-minosäuren am N-terminalen Ende von NucB ein: Tyr (codiert durch TAT bei Exp4-NdeI) und AIa (GCA bei Exp4-NdeI), was die Sequenz kaum stört.
Die Amplifikation durch Exp4-5 + Exp4-NdeI mittels der DNA des Plasmids pVE8022 erzeugt ein Fragment von 117 Bp.
Das durch dieses Fragment codierte Peptid entspricht der Sequenz MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA↓YA (SEQ ID NO: 14), die bis zu der vorgenannten Spaltstelle (welche durch einen Pfeil angezeigt ist), die von den zwei, stromaufwärts von NucB inserierten Aminosäuren Y und A gefolgt ist, der Sequenz des Signalpeptids von Exp4 entspricht.
Nach der Spaltung durch BamHI und NsiI wird das Fragment Exp4-5 + Exp4-NdeI von 117 Bp durch Ligation in pSEC1 (CHATEL et al., 2001, oben genannt) inseriert, das durch die gleichen Enzyme gespalten wird, was die Substitution von PSUsp45 durch PSExp4 ermöglicht.
Die PCR-Amplifikation durch M13reverse + Exp4-NdeI mittels der DNA des Plasmids pVE8022 erzeugt ein Fragment von 799 Bp. Dieses Fragment enthält die Signale zur Transkription, Translation und Sekretion von Exp4.
Nach der Spaltung durch EcoRV und NsiI, wird dieses Fragment in pSEC1 inseriert, das zuvor durch XbaI digeriert, durch die Polymerase des T4-Phagen behandelt und durch NsiI gespalten wurde. Bei dem resultierenden Plasmid stehen die Produktion und die Sekretion von NucB auf diese Weise unter Kontrolle der Signale zur Transkription, Translation und Sekretion von Exp4.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Expressionskassette für eine Nukleotidsequenz von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontrolle der Expression der besagten Sequenz von Interesse ein Polynukleotid verwendet wird, das gebildet ist aus: – einem bakteriellen Promotor, nachfolgend p_Zn genannt, enthaltend eine Bindungsstelle für das Protein ZitR aus Lactococcus lactis, wobei die besagte Bindungstelle die folgende Sequenz enthält: AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEQ ID NO: 1), wobei TTGACA die -35-Region des besagten Promotors repräsentiert und wobei N A, C, G, oder T repräsentiert; und – eine Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, das eine Identität von mindestens 80% mit dem Protein ZitR aus Lactococcus lactis aufweist und unter transkriptioneller Kontrolle des besagten Promotors steht; und wobei das besagte Polynukleotid mit mindestens einer Restriktionsschnittstelle ausgestattet ist, die es erlaubt die besagte Sequenz von Interesse unter der transkriptionellen Kontrolle des besagten Promotors p_Zn zu inserieren.
Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor p_Zn die folgende Sequenz enthält: AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEQ ID NO. 2), wobei die Sequenz TATAAT die -10-Region des Promotors darstellt.
Das Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor p_Zn eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe: – der Sequenz: AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAA TTAACCAGTA (SEQ ID NO: 4); – der Sequenz: AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATA ATTAACCAGTA (SEQ ID NO: 5).
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in diese besagte Kassette eine Nukleotidsequenz, die für ein Peptid zur extrazellulären Adressierung codiert, und mindestens eine Restriktionsschnittstelle inseriert wird, die es erlaubt, eine Nukleotidsequenz von Interesse in translationeller Fusion mit dem besagten Adressierungs-Peptid unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors p_Zn zu klonieren.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Peptid zur extrazellulären Adressierung ein Signalpeptid mit der Sequenz MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO: 6) ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in die besagte Kassette eine Nukleotidsequenz von Interesse unter transkriptioneller Kontrolle des Promotors p_Zn inseriert wird.
Verfahren zur Herstellung einer Expressionskassette für eine Nukleotidsequenz von Interesse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontrolle der Expression der Sequenz von Interesse ein Polynukleotid verwendet wird, das aus einem bakteriellen Promoter p_Zn gebildet ist, der gemäß den Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, und dass das besagte Polynukleotid mit mindestens einer Restriktionsschnittstelle ausgestattet ist, die die Insertion der besagten Nukleotidsequenz von Interesse unter der transkriptionellen Kontrolle des genannten Promoters p_Zn erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in die besagte Kassette eine Nukleotidsequenz, die für ein Peptid zur extrazellulären Adressierung codiert, und mindestens eine Restriktionsschnittstelle inseriert wird, die die Klonierung einer Nukleotidsequenz von Interesse in translationeller Fusion mit dem besagten Peptid zur extrazellulären Adressierung erlaubt, unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors p_Zn.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Peptid zur extrazellulären Adressierung ein Signalpeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in die besagte Kassette eine Nukleotidsequenz von Interesse inseriert wird unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors p_Zn.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, dadurch gekennzeichnet, dass es die Herstellung einer Expressionskassette nach einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, sowie die Insertion der genannten Kassette in einen Vektor.
Verfahren zur Transformation eines grampositiven Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, dass es die Herstellung einer Expressionskassette nach einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, und die Transformation der genannten Bakterien mit der besagten Expressionskassette.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien Milchsäurebakterien sind.
Verwendung einer Expressionskassette, erhältlich nach einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, oder eines rekombinanten Vektors, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 11 für die Herstellung eines Proteins von Interesse in einem grampositiven Bakterium.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einem grampositiven Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – die Einführung einer Expressionskassette erhältlich nach einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 in das besagte Bakterium, wobei die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die für das Protein von Interesse codiert und unter der transkriptionellen Kontrolle des Promoters p_Zn angeordnet ist; – Kultivierung des Bakteriums in einem Medium enthaltend eine Menge Zn²⁺, die ausreichend ist zur Unterdrückung der Expression des genannten Proteins; – die Induktion der Produktion des genannten Proteins durch Entfernen des Zn²⁺ aus dem genannten Medium; – die Gewinnung des hergestellten Proteins.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung von Zn²⁺ aus dem genannten Medium durch die Zugabe eines Chelatbildners für zweiwertige Kationen erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung von Zn²⁺ aus dem genannten Medium durch Kultivierung der Bakterien bis zur Erschöpfung des anfänglich in dem Medium enthaltenen Zn²⁺ erreicht wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einem grampositiven Bakterium, in dem der endogene Repressor ZitR inaktiv ist, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – die Einführung einer Expressionskassette erhältlich nach einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10 in das besagte Bakterium, wobei die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die für das Protein von Interesse codiert und unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors p_Zn angeordnet ist; – Kultivierung der Bakterien; – Gewinnung des hergestellten Proteins.