ES2266871T3 - Casetes de expresion procariotas reguladas por el cinc. - Google Patents
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Abstract
procedimiento de construcción de un casete de expresión de una secuencia nucleotídica de interés, caracterizado porque se utiliza para controlar la expresión de dicha secuencia de interés un polinucleótido constituido por: - un promotor bacteriano, denominado en adelante pZm, que contiene un lugar de fijación para la proteína ZitR de Lactococcus lactis, incluyendo dicho lugar la siguiente secuencia: AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEC ID Nº: 1), en la que TTGACA representa la caja -35 de dicho promotor, y N representa A, C, G o T; y - una secuencia codificadora para un polipéptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con ZitR de Lactococcus lactis colocada bajo control transcripcional de dicho promotor; y porque se asocia dicho polinucleótido con por lo menos un sitio de restricción que permite la inserción de dicha secuencia de interés bajo control transcripcional de dicho promotor pzn.
Description
Casetes de expresión procariotas reguladas por
el cinc.
La invención se refiere a la producción de
proteínas heterólogas en las bacterias con
Gram-positivo, especialmente bacterias lácticas.
Además de sus usos tradicionales en la industria
agroalimentaria, las bacterias lácticas se utilizan cada vez más en
la actualidad como células huésped para la producción de proteínas
heterólogas de interés. Estas proteínas de interés pueden ser de
naturaleza muy variada, por lo que es deseable disponer de la
selección más amplia posible de herramientas de expresión para poder
optimizar su producción en función de las especificidades de cada
una de ellas.
De manera general, es necesario utilizar
promotores fuertes, que permitan obtener un nivel de expresión
suficiente del gen de interés. En algunos casos, se pueden emplear
promotores constitutivos; en otros casos (por ejemplo cuando el
producto del gen de interés es tóxico para la bacteria huésped o
corre el riesgo de interferir con el metabolismo de la misma), es
preferible utilizar promotores inductibles, que permitan activar o
detener la expresión en el momento deseado.
Aunque las bacterias lácticas poseen numerosos
genes cuya transcripción es regulada mediante diversos factores,
sólo se dispone actualmente de una selección relativamente
restringida de promotores inductibles utilizables en la práctica
para la construcción de casetes de expresión de genes de interés
(para revista, véase DE VOS, Curr. Op. Microbiol., 2,
289-295, 1999). En efecto, dicho empleo requiere no
sólo que los promotores afectados sean regulables, sino que exista
un diferencial de expresión suficiente entre los distintos estados
de inducción; idealmente, la expresión debe alcanzar un nivel
elevado en condiciones de inducción, y poder estar totalmente
bloqueada en condiciones de no inducción. Además, es necesario poder
dominar con facilidad los factores que intervienen en la regulación
de dichos promotores.
En los anteriores trabajos, orientados en
identificar proteínas exportadas de L. lactis (POQUET et
al., J. Bacterial., 180, 1904-1912, 1998), los
Inventores clonaron, en fusión con el gen reportero
\Delta_{SP}Nuc, un fragmento de ADN genómico de la cepa L.
lactis MG 1363 que incluía un gen denominado en aquella época
nlp3 (New LipoProtein 3), cuyo producto presenta
homologías con una proteína de S. pneumoniae implicada en el
transporte de metales. La secuencia de este fragmento está
disponible en GENBANK con el número U95834.
Los inventores observaron asimismo que el gen
nlp3 era negativamente regulado por cationes metálicos
divalentes, especialmente Zn^{2+} (POQUET et al. "Use of
a new reporter tool to demonstrate metal regulation of nlp3,
a gene putatively envolved in metal uptake in Lactococcus
lactis"; 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria, Veldhoven,
Países Bajos, 19-23 de septiembre de 1999).
Por otra parte, en el marco de la secuenciación
completa del genoma de L. lactis IL1403, el gen nlp3,
rebautizado zitS, fue identificado como constituyente de un
operón denominado zitRSQP (BOLOTIN et al., Antoine
van
Leeuwenhoek, 76, 27-76, 1999; BOLOTIN et al., Genome Res. 11, 731, 2001). Por homología con secuencias conocidas, se atribuyeron unas funciones putativas en el transporte del cinc a los genes de dicho operón. De este modo, el producto del gen zitP constituiría la permeasa del sistema de transporte, los productos del gen zitS y del gen zitQ asegurarían respectivamente la unión con el sustrato y la unión con el ATP, y el producto del gen zitR, que presenta homologías con la familia de represores transcripcionales marR, estaría involucrado en la regulación del transporte del cinc.
Leeuwenhoek, 76, 27-76, 1999; BOLOTIN et al., Genome Res. 11, 731, 2001). Por homología con secuencias conocidas, se atribuyeron unas funciones putativas en el transporte del cinc a los genes de dicho operón. De este modo, el producto del gen zitP constituiría la permeasa del sistema de transporte, los productos del gen zitS y del gen zitQ asegurarían respectivamente la unión con el sustrato y la unión con el ATP, y el producto del gen zitR, que presenta homologías con la familia de represores transcripcionales marR, estaría involucrado en la regulación del transporte del cinc.
Hasta ahora, no se había planteado la
utilización del sistema de regulación del operón zitRSQP para
controlar la expresión de genes heterólogos. En efecto, aunque se
pueda activar una regulación negativa mediante la adición de cinc
(POQUET et al., 1999 ya mencionado), el nivel de expresión de
base observado en la ausencia de dicha regulación negativa no se
revelaba suficiente como para permitir una producción satisfactoria
de proteínas de interés. Además, se ignoraba si el represor putativo
ZitR estaba efectivamente involucrado en la represión de la
expresión de dicho operón, y si otros reguladores, especialmente los
reguladores pleiotrópicos flp, descritos como intervinientes
en la regulación del transporte del cinc en L. lactis
(GOSTICK et al., Mol. Microbiol., 31,
1523-35, 1999; SCOTT et al., FEMS Microbiol.
Lett., 192, 85-89, 2000), podían estar asimismo
involucrados, bien como co-represores, bien al
contrario como posibles activadores.
Sin embargo, siguiendo con sus estudios sobre la
regulación del operón zitRSQP, los Inventores comprobaron, en
presencia de muy bajas concentraciones de Zn^{2+}, un nivel máximo
de expresión mucho más elevado que el que se podía suponer según los
experimentos anteriores, y que permite alcanzar un factor de
inducción superior a 100. Además, comprobaron que la expresión era
independiente de los reguladores flp, y podía ser totalmente
controlada por medio de la proteína ZitR.
El estudio de la estructura del promotor del
operón zitRSQP de L. lactis permitió a los Inventores
poner en evidencia, además de los elementos clásicamente presentes
en los promotores bacterianos, es decir las cajas -35 (TTGACA) y -10
(TATAAT) separadas por 17pb, una secuencia en palindromo que se
solapa a la caja -35, que representa muy probablemente el lugar de
fijación de ZitR.
Las observaciones presentadas anteriormente
permiten suponer que la regulación de zitRSQP se efectúa
según el siguiente mecanismo: el represor ZitR puede formar con el
Zn^{2+} intracelular un complejo que presenta una afinidad muy
importante por el lugar de fijación que se solapa a la caja -35; el
complejo ZitR-Zn^{2+} fijado al palindromo impide
el acceso del ARN a la caja -35, y reprime por lo tanto la
transcripción; por el contrario, la forma no complejada de ZitR no
se fija en el sitio -35, lo que permite la transcripción del operón,
que se efectúa con gran eficacia.
La regulación del operón zitRSQP por
medio de ZitR depende por lo tanto de la concentración intracelular
de Zn^{2+}, esta misma función de la disponibilidad de Zn^{2+}
en el medio de cultivo.
El operón zitRSQP representa muy
probablemente un sistema de transporte del cinc de muy gran afinidad
que la bacteria sólo utiliza en condiciones de carencia de cinc muy
severa, para permitir la supervivencia celular; por el contrario, en
las condiciones habituales de cultivo en medios ricos, el cinc está
presente en abundancia en el entorno, y es transportado a la célula
mediante sistemas de menor afinidad que el complejo ZitSPQ, cuya
síntesis queda entonces reprimida.
Estas propiedades del sistema de regulación del
operón zitRSQP de L. lactis puestas en evidencia por
los Inventores permiten proponer su utilización para la producción
de proteínas de interés en bacterias huésped, especialmente
bacterias Gram-positivo, y en particular bacterias
lácticas.
La presente invención tiene por objeto los
distintos aspectos de dicha utilización.
Según una primera variante, la presente
invención tiene por objeto un procedimiento de construcción de un
casete de expresión de una secuencia nucleotídica de interés,
caracterizado porque se utiliza para controlar la expresión de dicha
secuencia de interés un polinucleótido constituido por:
- -
- un promotor bacteriano, denominado en adelante p_{Zn}, que contiene un lugar de fijación para la proteína ZitR de Lactococcus lactis, incluyendo dicho lugar la siguiente secuencia:
- AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEC ID Nº: 1),
en la que TTGACA representa la caja -35 de dicho
promotor, y N representa A, C, G o T;
- -
- una secuencia codificadora para un polipéptido que presenta por lo menos el 80%, preferiblemente por lo menos el 85%, y de manera totalmente preferida por lo menos el 95% de identidad con la proteína ZitR de Lactococcus lactis colocada bajo control transcripcional de dicho promotor;
- -
- y porque se asocia dicho polinucleótido con por lo menos un sitio de restricción que permite la inserción de una secuencia nucleotídica de interés bajo control transcripcional de dicho promotor.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, el promotor p_{Zn} incluye la siguiente
secuencia:
- AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEC ID Nº: 2),
en la que TATAAT representa la caja -10 de dicho
promotor.
Según otro modo de realización preferido de la
presente invención, dicho promotor p_{Zn} contiene un sitio de
fijación para la proteína ZitR de Lactococcus lactis que
incluye la siguiente secuencia:
- AAAAATAAYGTTAACTGGTTGACATTATTTTT (SEC ID Nº: 3),
En la que Y representa a T o C.
A título de ejemplo de promotores p_{Zn}
utilizables para la construcción de un casete de expresión conforme
a la invención, se cita:
- -
- el promotor p_{Zn} de la cepa MG1363 de Lactococcus lactis, que incluye la secuencia:
- AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SECID Nº: 4);
- -
- el promotor p_{Zn} de la cepa IL1403 de Lactococcus lactis, que incluye la secuencia:
- AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEC ID Nº: 5)
Según una segunda variante, la presente
invención tiene por objeto un procedimiento de construcción de un
casete de expresión de una secuencia nucleotídica de interés,
caracterizado porque se utiliza para controlar la expresión de
dicha secuencia de interés un polinucleótido constituido por:
- -
- un promotor bacteriano p_{Zn}, como el definido anteriormente;
- -
- y porque se asocia dicho polinucleótido a por lo menos un sitio de restricción que permite la inserción de una secuencia nucleotídica de interés bajo control transcripcional de dicho promotor.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, se efectúa la inserción de una secuencia
nucleotídica de interés en un casete de expresión obtenido mediante
un procedimiento conforme a la primera o la segunda variante de la
invención, bajo control transcripcional del promotor p_{Zn}.
Dicha secuencia nucleotídica de interés puede
ser cualquier secuencia que se desea expresar bajo control
transcripcional del promotor p_{Zn}. Especialmente, puede tratarse
de cualquier secuencia codificadora para una proteína heteróloga de
interés que se desea producir en una bacteria huésped; en su caso,
dicha proteína puede ser una proteína de fusión, que asocia
secuencias polipeptídicas de origen diverso.
Unos casetes de expresión obtenidos mediante un
procedimiento conforme a la invención pueden incluir, en su caso,
además de los elementos necesarios para permitir el direccionamiento
de la proteína de interés en la superficie celular, o su secreción
en el medio de cultivo.
En este marco, según modo de realización
preferido de la presente invención, se efectúa la inserción de una
secuencia nucleotídica codificadora para un péptido de
direccionamiento extracelular, y de por lo menos un sitio de
restricción que permite la clonación de una secuencia nucleotídica
de interés en fusión traduccional con dicho péptido de
direccionamiento, bajo control transcripcional del promotor
p_{Zn}, en un casete de expresión obtenido mediante un
procedimiento conforme a la invención.
Dicho péptido de direccionamiento puede ser, por
ejemplo, un péptido señal de secreción, un dominio transmembranario,
una señal de anclaje a la pared, etc.
Se conocen en sí numerosos péptidos de
direccionamiento utilizables en el marco de la presente invención. A
título de ejemplos no limitativos, se mencionan los péptidos
descritos en la publicación de POQUET et al., (1998, ya
mencionado), o en la publicación de LE LOIR et al. (Appl.
Enviro. Microbiol., 67, 4119-4127, 2001).
Para la producción de proteínas segregadas, un
péptido de direccionamiento extracelular preferido es el péptido
señal de la proteína Exp4 de L. lactis, que responde a la
secuencia:
- MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEC ID Nº: 6).
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de construcción de un vector recombinante que
incluye la construcción de un casete de expresión mediante un
procedimiento conforme a la invención, y la inserción de dicho
casete en un vector. La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de transformación de una bacteria con
gram-positivo que incluye la construcción de un
casete de expresión mediante un procedimiento conforme a la
invención, y la transformación de dicha bacteria mediante dicho
casete de expresión.
Preferiblemente, se elige dicha bacteria entre
las bacterias lácticas, especialmente lactococos, lactobacilos o
estreptococos termofilos.
En su caso, puede tratarse de bacterias
procedentes de cepas bacterianas que incluyan una o varias
modificaciones de su genoma, con objeto de mejorar la producción y/o
la secreción de proteínas expresadas en dichas bacterias, y/o en
evitar su degradación. Por ejemplo, en el marco de la producción de
proteínas exportadas, se puede utilizar una cepa bacteriana en la
que la actividad proteásica PrtP y/o la actividad proteásica HuA
están inactivas, como la descrita en la Solicitud PCT WO 00/39309 o
una cepa bacteriana que produzca en exceso una proteína que permita
estabilizar las proteínas exportadas, como la proteína Nlp4 de
Lactococcus lactis, o uno de sus homólogos (POQUET et
al., 1998, publicación ya mencionada).
La presente invención tiene asimismo por objeto
la utilización de casetes de expresión o vectores recombinantes
susceptibles de ser obtenidos mediante un procedimiento conforme a
la invención para la producción de proteínas de interés en una
bacteria con gram-positivo, especialmente bacterias
lácticas.
Los casetes de expresión susceptibles de ser
obtenidos mediante un procedimiento conforme a la presente variante
de la invención pueden utilizarse en una bacteria huésped, para
controlar el momento de la expresión de un gen de interés insertado
en el sitio de clonación, y el nivel de dicha expresión.
Cuando se cultiva la bacteria huésped en
presencia de una cantidad de cinc excesiva con relación a sus
necesidades, la expresión del gen de interés queda totalmente
reprimida. La depleción de Zn^{2+} del medio de cultivo (que puede
efectuarse simplemente mediante adición de un agente quelador de los
cationes divalentes, como el EDTA) permite levantar la represión y
provocar la expresión del gen. El nivel de expresión puede regularse
con facilidad mediante la cantidad de agente quelador añadido.
Asimismo, se puede poner en cultivo a la
bacteria hospedadora en un medio que incluya una cantidad de cinc
justo suficiente para cubrir sus necesidades durante un período dado
del cultivo (por ejemplo durante la fase de crecimiento). En este
caso, el agotamiento del cinc al término de dicho período provoca la
expresión del gen de interés.
En este marco, la presente invención tiene por
objeto un procedimiento de producción de una proteína de interés en
una bacteria con gram-positivo, especialmente una
bacteria láctica, caracterizado porque incluye:
- -
- la introducción en dicha bacteria de un casete de expresión susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento conforme a la primera variante de la invención, que incluye una secuencia codificadora para dicha proteína de interés;
- -
- el cultivo de dicha bacteria en un medio que contiene una cantidad de Zn^{2+} suficiente para reprimir la expresión de dicha proteína;
- -
- la inducción de la producción de dicha proteína mediante depleción de Zn^{2+} de dicho medio;
- -
- la recuperación de la proteína producida.
Según un modo de aplicación preferido del
procedimiento de la invención, la depleción de Zn^{2+} de dicho
medio se obtiene mediante adición de un quelador de los cationes
divalentes.
Según otro modo de aplicación preferido de la
presente invención, la depleción de Zn^{2+} de dicho medio se
obtiene mediante cultivo de la bacteria hasta agotamiento del
Zn^{2+} inicialmente presente en el medio.
Según los experimentos efectuados por los
Inventores con la cepa modelo MG1363 de L. lactis, el
mantenimiento durante toda la duración del cultivo de una cantidad
de Zn^{2+} suficiente para reprimir la expresión bajo control del
sistema p_{Zn}/ZitR puede asegurarse mediante el uso de un medio
que contenga, en el inicio del cultivo, del orden de 1 a 2 \muM de
Zn^{2+}, pudiendo estimarse el umbral de represión total en entre
100 nM y 1 \muM de Zn^{2+}. La concentración de Zn^{2+} del
medio por debajo de la cual se obtiene el levantamiento completo de
la represión de p_{Zn} es muy débil (del orden del nanomolar, y
como máximo de algunos nanomolares). La cantidad de quelador de los
cationes divalentes necesaria para efectuar la depleción de
Zn^{2+} e inducir la expresión bajo control del promotor p_{Zn}
varía según la cantidad de Zn^{2+} aportada inicialmente al medio
de cultivo; a título indicativo, en el caso de la cepa MG1363, para
un medio de cultivo rico tal como el medio M17, se puede obtener una
depleción de Zn^{2+} que permita inducir una expresión máxima a
partir de una concentración de EDTA del orden de 0,1 mM; en medio
SA, que contiene 10 nM de Zn^{2+}, se puede obtener una depleción
de Zn^{2+} que permita inducir una expresión máxima a partir de
una concentración de EDTA del orden de 0,01 mM.
Las cantidades de Zn^{2+} y de agente quelador
de cationes mencionadas anteriormente se dan a título indicativo. A
partir de dichas indicaciones, y de la demás información
suministrada por la descripción de la presente invención, el
especialista en la materia puede determinar con facilidad, mediante
pruebas previas, efectuadas por ejemplo colocando un gen reportero
bajo control del sistema p_{Zn}/ZitR en un casete de expresión
conforme a la invención, las cantidades más adecuadas según la
especie o la cepa bacteriana afectada, las condiciones operativas
aplicadas, tales como el medio empleado, las modalidades de la
adición de Zn^{2+} y/o de agente quelador (por ejemplo, en una
sola vez, en varias veces, en continuo, etc.) y el nivel de
expresión deseado.
Se utilizarán casetes de expresión susceptibles
de ser obtenidos mediante un procedimiento conforme a la segunda
variante de la invención preferiblemente en cepas de bacterias,
especialmente lactococos, en las que el represor ZitR endógeno está
inactivo, así como eventualmente el complejo ZitSPQ. En estas
condiciones, el promotor p_{Zn} constituye un promotor fuerte, que
permite la expresión de la proteína de interés durante toda la
duración del cultivo. La inactivación del receptor ZitR y del
complejo ZitSPQ puede efectuarse de manera conocida en sí,
especialmente mediante mutagénesis dirigida del operón
zitRSQP.
En este marco, la presente invención tiene por
objeto un procedimiento de producción de una proteína de interés en
una bacteria con gram-positivo en la que el represor
ZitR endógeno está inactivo, caracterizado porque incluye:
- -
- la introducción en dicha bacteria de un casete de expresión susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento conforme a la segunda variante de la invención, que incluye una secuencia codificadora para dicha proteína de interés;
- -
- el cultivo de dicha bacteria;
- -
- la recuperación de la proteína producida.
La presente invención puede aplicarse por
ejemplo:
- -
- en el ámbito de la producción de proteínas heterólogas de interés terapéutico mediante ingeniería genética, para mejor controlar la producción de dichas proteínas mediante los cultivos de bacterias transformadas;
- -
- en la industria agroalimentaria, especialmente en la fabricación de productos fermentados, para controlar según la fase de la fermentación, la producción de proteínas de interés que permitan especialmente influir sobre la calidad del producto fermentado acabado.
La presente invención se entenderá mejor con la
ayuda de la siguiente descripción complementaria, que se refiere a
ejemplos no limitativos, que ilustran la construcción de casetes de
expresión conforme a la invención.
La expresión de zit en función de la
concentración de Zn^{2+} del medio se mide mediante 2 técnicas
distintas:
*La medición de la actividad Nuc de la fusión
ZitRS-\Delta_{SP}Nuc, portada por le plásmido
pVE8020, en la cepa de L. lactis MG1363. El plásmido pVE8020
resulta de la clonación del fragmento de ADN cromosómico de la cepa
MG1363 correspondiente a p_{Zn}zitRzitS' (GenBank U95834)
en el plásmido pFUN (POQUET et al., 1998, ya mencionado;
GenBank AF038666).
*La cuantificación del ARNm de zitS en
la cepa MG1363 salvage (expresión endógena de zitS) y en la
cepa MG1363 transformada mediante pVE8020).
Se realizaron dos tipos de experimentos:
1). Se efectuó la medición de la actividad Nuc
(nucleasa de Staphylococcus aureus) en cajas de cultivo que
contenían medio químicamente definido SA (JENSEN y HAMMER, Appl.
Env. Microbiol. 59, 4363-66, 1993), que incluye
una cantidad mínima de cada uno de los elementos necesarios para el
crecimiento bacteriano, y es especialmente pobre en cinc (10 nM de
ZnSO_{4}).
Se efectúa en este medio el depósito de una
solución de Zn^{2+} (20 \mul de ZnSO_{4} a 0,1M) en forma de
una estría que atraviesa la caja.
Tras absorción del depósito de Zn^{2+}, se
efectúan 2 depósitos de bacterias en forma de 2 estrías paralelas
entre sí, que cortan perpendicularmente la estría de cinc: un
depósito testigo, (cepa MG1363 transformada mediante un plásmido
(pVE8009) portador de la fusión
Usp-\Delta_{SP}Nuc bajo control del promotor
Usp) y un depósito de la cepa MG1363 transformada mediante pVE8020
(MG1363(pVE8020)).
La incubación de las cajas durante una noche a
30ºC permite el crecimiento de las bacterias y la creación de un
gradiente de concentraciones de Zn^{2+} decrecientes mediante
difusión a partir de la estría de ZnSO_{4}.
Se realiza un test coloreado de la actividad
nucleásica, disponiendo en las cajas una sobre-capa
de detección que contiene azul de toluidina e incubando a 37ºC
(LACHICA et al., Appl. Microbiol., 21,
585-87, 1971; LE LOIR et al., J. Bacteriol.,
176, 5135-39, 1994): la actividad Nuc se detecta
mediante el viraje al rosa de la sobre-capa de
detección, formando un halo alrededor de las estrías de depósitos
bacterianos.
Mientras que el halo observado alrededor de la
estría correspondiente al depósito testigo es de tamaño e intensidad
constante en toda la longitud de la estría bacteriana (lo que indica
que ni la actividad nucleásica de
Usp-\Delta_{SP}Nuc, ni su exportación, ni su
expresión dependen del Zn^{2+}), el observado alrededor de la
estría correspondiente al depósito MG1363(pVE8020) está
limitado al extremo más alejado del depósito de cinc, donde su
longitud e intensidad son comparables con las observadas para el
depósito testigo; la intensidad decrece a proximidad del depósito de
cinc, y no se observa halo alguno a proximidad de la intersección
con éste.
Por lo tanto, se observa que concentraciones
elevadas de cinc reprimen la expresión del promotor del operón
zitRSQP.
2). Se estudió asimismo la regulación mediante
detección del reportero Nuc en un gel SDS-PAGE
gracias a su actividad enzimática (zimograma). Para este
experimento, se ha empobrecido aún más en cinc el medio SA, bien
omitiendo cualquier adición de ZnSO4 durante su preparación, bien
añadiéndole EDTA a 0,01 nM. Se inoculó la cepa de L. lactis
MG1363 (pVE8020) en este medio, y se dividió el cultivo en dos para
recibir o no una adición de 2 \muM de Zn^{2+}. Tras crecimiento
a 30ºC sin agitación durante la noche, se extrajeron unas muestras
de cultivo, normalizando su volumen en función de su DO_{600}, de
manera a obtener un número de células equivalente al de 1 ml de
cultivo a DO_{600} = 1. Se precipitaron las muestras por medio de
ácido tricloroacético concentrado, y se lavaron, lisaron en
presencia de lisozima y SDS, y se retomaron en un tampón de carga,
según el protocolo descrito en POQUET et al. (1998, ya
mencionado).
A continuación, se separaron las proteínas según
su peso molecular en un gel SDS-PAGE al 12,5% de
archilamida. Se detectó la actividad Nuc como se ha descrito
anteriormente. Se detectaron tres formas protéicas que presentaban
una actividad nucleásica (que según su peso molecular, corresponden
al precursor, al péptido-señal no dividido, a la
forma madura Nlp3-\Delta_{SP}Nuc, y al producto
de degradación NucA) únicamente en la muestra de cultivo que no
había recibido adición alguna. No se detectó proteína alguna con
actividad Nuc en la muestra con añadido de Zn^{2+}. Estos
resultados demuestran que la represión es total en presencia de 2
\muM de Zn^{2+}.
La medición de la actividad Nuc se efectúa en
cajas de cultivo que contienen medio M17 (TERZAGHI and
SANDINE, Appl. Environ. Microbiol., 29, 807-13, 1975) rico en cinc.
SANDINE, Appl. Environ. Microbiol., 29, 807-13, 1975) rico en cinc.
Se efectúa el depósito de una solución de EDTA
(20 \mul a 0,1M), así como un depósito de la cepa MG1363 que
contiene el plásmido testigo, y un depósito de la cepa
MG1363(pVE8020) en forma de estrías, como se ha descrito
anteriormente.
Tras incubación a 3ºC durante una noche, se
detecta la actividad Nuc como se ha descrito anteriormente.
El halo observado alrededor de la estría
correspondiente al depósito testigo es, como el observado en el caso
del cinc, de tamaño e intensidad constante en toda la longitud de la
estría. Por el contrario, de forma sorprendente, el observado
alrededor de la estría correspondiente al depósito
MG1363(pVE8020) es, a proximidad del depósito de EDTA, mucho
más intenso que el del depósito testigo; la intensidad decrece muy
rápidamente al alejarse de dicha intersección.
Por lo tanto, se observa que el EDTA induce la
expresión del promotor del operón zitRSQP. El nivel de
expresión aparece además más elevado que el observado a distancia de
la estría de cinc en el experimento anterior, y además más elevado
que el del testigo, controlado mediante el promotor Usp: por lo
tanto, se puede alcanzar un nivel muy fuerte de inducción de
p_{Zn} zitR gracias a concentraciones de EDTA que no
afectan al crecimiento bacteriano (como 0,1 mM en M17).
Para evaluar cuantitativamente el efecto del
EDTA sobre la actividad Nuc expresada bajo control del promotor del
operón zitRSQP, se efectuaron los siguientes
experimentos:
Se cultiva la cepa MG1363 transformada mediante
pVE8020 en medio M17 al que se añade eritromicina a 5 \mug/l,
hasta la fase exponencial (DO_{600} = 0,3) o estacionaria
(DO_{600} = 1,2). Se divide dicho cultivo en 4 subcultivos; se
añade a 3 de ellos EDTA a distintas concentraciones finales (3,3 mM;
0,33 mM; 0,033 mM); el cuarto no recibe adición de EDTA (0 mM EDTA).
Tras 30 min o 1:30 h de incubación, se extraen muestras de cada
cultivo. Se normaliza el número de células de cada muestra,
adaptando el volumen de manera a obtener un número de células
equivalente al de 1 ml de cultivo a DO_{600} = 1.
A continuación, se lisan y precipitan las
células mediante un tratamiento con ácido tricloroacético
concentrado (16,7%), se lavan con acetona (80%) y se retoman en 100
\mul de tampón Tris (50 mM pH7). Se depositan 10 \mul de cada
muestra así tratada en una caja que contiene medio de detección de
la actividad Nuc (LACHICA et al., 1971; LE LOIR et
al., 1994, ya mencionado). Se evalúa la actividad Nuc por el
tamaño del halo y la intensidad de la coloración rosa alrededor de
cada depósito. Para una evaluación cuantitativa del nivel de
actividad, se deposita en la misma caja una gama de calibrado de
proteína Nuc purificada (dilución de 4 en 4 a partir de 400 ng).
Se comprueba que el tamaño del halo y la
intensidad de la coloración varían en función de la concentración de
EDTA empleada para tratar las células. En la ausencia de EDTA, se
observa un halo muy fino sin coloración nítida; a 0,033 mM de EDTA,
se observa un fino halo, netamente coloreado de rosa; a 0,33 mM, se
observa un halo ancho, de color rosa muy intenso. No se observa
aumento alguno del tamaño y la intensidad del halo de 0,33 a 3,3 mM.
No se observa diferencia significativa alguna del tamaño y la
intensidad del halo entre la adición de EDTA efectuada en fase
exponencial y la efectuada en fase estacionaria, ni entre los dos
tiempos de incubación (30 min o 1:30 h).
Estos resultados indican que el nivel de
inducción de la expresión de p_{Zn} aumenta con la concentración
de EDTA añadida, hasta un umbral de saturación (que se alcanza en
medio M17, en las condiciones experimentales descritas aquí, para
una concentración de EDTA del orden de 0,33 mM, cualquiera que sea
la fase de crecimiento y el tiempo de incubación).
La comparación con la gama de calibrado de
proteína Nuc purificada permite estimar que el nivel de inducción
obtenido mediante adición de 0,33 mM de EDTA en medio M17 es del
orden de 100.
Las cepas utilizadas son la cepa salvaje de
L. lactis subs. cremoris MG1363, y su derivada mutante FNR
(doble mutante flpA flpB, SCOTT et al., 2000, ya
mencionado; GOSTICK et al., 1999, ya mencionado). Los genes
flp son reguladores pleiotrópicos que intervienen
especialmente en el transporte del cinc: en FNR, la concentración
intracelular de cinc es de siete a ocho veces menor que la de la
cepa salvaje (GOSTICK et al., 1999, ya mencionado).
A partir de un precultivo de una noche de cada
cepa en medio SA al que se añade, sólo para FNR, eritromicina a 5
\mug/\mul y tetraciclina a 5 \mug/\mul, se efectúa un
cultivo a 30ºC en medio SA (cuya concentración de Zn^{2+} es de 10
nM). En fase exponencial precoz (DO_{600} 0,07 a 0,08), se divide
dicho cultivo en dos partes: a una (+) se añade ZnSO_{4} para
obtener una concentración final de Zn^{2+} de 2 \muM (que no
afecta al crecimiento); a la otra (-) no se añade nada. Se continua
el cultivo sin modificación hasta la fase exponencial (DO_{600} =
0,2) o estacionaria (DO_{600} = 0,8). Se extrae entonces el ARN de
las bacterias según el protocolo descrito por RAYA et al.,
(J. Bacterial., 180, 3174-80, 1998).
Tras la extracción, se evalúa la concentración
de ARN mediante medición de la DO_{260}: se depositan 60 \mug de
ARN en un gel al 1% de agarosa. Tras migración y transferencia a una
membrana de nylon, se detectan los transcritos zitRS mediante
transferencia de Northern, con una sonda específica del gen
zitS.
Los resultados se ilustran en la Figura 1.
Estos resultados muestran que sólo se observa un
ARNm específico del tamaño esperado para zitRS en la ausencia
(-) de adición de Zn^{2+} y nunca en su presencia (+), cualquiera
que sea la cepa y cualquiera que sea la fase de crecimiento en el
momento de la adición.
Esto muestra 1) que la represión mediante el
Zn^{2+} de la expresión del operón zit se efectúa a nivel
transcripcional, 2) que es total para una concentración de Zn^{2+}
del medio de 2 \muM, y 3) que es independiente de los genes
flp, ya que se ejerce en el mutante FNR. Este último punto
indica que la regulación mediante el Zn^{2+} depende totalmente
del regulador zitR.
En la ausencia de adición de Zn^{2+}, se
observa un nivel de expresión muy fuerte, salvo para la cepa MG1363
en fase exponencial, donde se observa una débil expresión. Estos
resultados indican que, a pesar de la muy débil concentración de
Zn^{2+} (10 nM) del medio SA inicial, la concentración
intracelular de Zn^{2+} en el momento de la fase exponencial donde
se ha efectuado la extracción es aún suficiente, en el caso de la
cepa MG1363, para reprimir fuertemente la transcripción del operón
zit. Por el contrario, en la fase estacionaria, tras el
agotamiento del Zn^{2+} presente en el medio, la expresión es muy
fuerte. En el caso de la cepa FNR, la concentración de Zn^{2+} de
10 nM del medio inicial es insuficiente para asegurar, incluso
durante la fase exponencial, una concentración de Zn^{2+}
intracelular que reprima la transcripción del operón zit.
Por lo tanto, se observa que la inducción de la
expresión depende directamente de la concentración intracelular de
Zn^{2+}, y que ésta debe ser muy baja para obtener una expresión
máxima.
Esto se puede obtener especialmente:
- 1)
- Rebajando la concentración extracelular de Zn^{2+}; en efecto, ésta debe ser muy inferior a 10 nM, con la que se observa aún una expresión importante con relación al nivel máximo de inducción. La reducción de la concentración extracelular de Zn^{2+} puede efectuarse por ejemplo mediante la adición de un agente quelador, como el EDTA (cualquiera que sea la fase de crecimiento), u operando en fase estacionaria, en condiciones en que el Zn^{2+} inicialmente presente en el medio ha sido consumido por las bacterias en el transcurso del crecimiento, o mediante una combinación de estos dos medios.
- 2)
- Utilizando mutantes en los que queda afectado el transporte del cinc, y que poseen por ello una concentración de Zn^{2+} intracelular muy baja, tales como la cepa FNR mencionada anteriormente.
El sistema promotor-regulador
p_{Zn}-zitR de la cepa MG1363 se obtiene mediante
amplificación PCR (kit DyNAzyme EXT de FINNZYMES) de una parte de la
inserción p_{Zn}zitRzitS' (GenBank U95834) del plásmido
pVE8020 con los oligonucleótidos oligo 9 y oligo MUT:
Oligo 9:
- 5'-CTAATGAGCGGGCTTTTT-3' (SEC ID Nº: 7)
Oligo MUT:
- 5'-GCTCTAGAGCGGGATCCTTCATCGAAACTCTTCAG-3' (SEC ID Nº: 8)
Oligo 9 se hibrida con el sitio de clonación
múltiple (MCS) de pFUN, y permite amplificar cualquier inserción
clonada en este vector. Oligo MUT permite eliminar el sitio de
fijación potencial de los ribosomas (RBS) de zitS y para
facilitar la clonación del fragmento PCR: su secuencia, situada en
la zona de solapado entre zitR y zitS, presenta dos
mutaciones (subrayadas) en el RBS (la secuencia salvaje
5'-GGAGGAG-3' muta en
5'-TGAAGAG-3', complementaria de
5'-CTCTTCA-3' en el oligo
MUT) y los dos sitios de restricción BamHI y XbaI (en
negrita).
La secuencia de la zona del plásmido pVE8020 a
partir de la cual se efectúa la amplificación (SEC ID Nº: 9) está
representada en la Figura 2. Las cifras a la izquierda de la
secuencia corresponden a la numeración de la secuencia entera del
plásmido pVE8020. Las zonas de emparejamiento de los cebos oligo 9 y
oligo MUT están representadas en negrita y con flechas. Se indican
las secuencias codificadoras para ZitR y parte de ZitS. Los RBS
(sitios de fijación de los ribosomas) potenciales de zitR y
zitS están enmarcados, y los codones de inicio de la
traducción ATG están subrayados. Las cajas -35 y -10 del promotor
están enmarcadas y subrayadas en gris; el sitio potencial de inicio
de la transcripción se indica mediante un doble subrayado.
Se trata el producto de amplificación de 700 pb
mediante el fragmento Klenow (PollK) del ADN polimerasa de
Escherichia coli, y mediante XbaI. Se purifica y clona
este fragmento modificado en el vector pFUN, previamente digerido
mediante EcoRV y XbaI: la mezcla de ligación (fragmento + pFUN +
ligasa del fago T4) se utiliza para electroporar la cepa MG1363 de
Lactococcus lactis, y se seleccionan clones resistentes a la
eritromicina, en medio sólido M17 + glucosa al 0,5% + eritromicina
5 \mug/mL. Se elige uno de dichos clones, que contenga un plásmido
recombinante de 8,2 kb, denominado en adelante pDl11.
Las etapas de la construcción de dicho plásmido
están representadas en la Figura 3a.
Contiene la totalidad de la secuencia
codificadora para ZitR, así como una secuencia 5' que incluye al
promotor P_{Zn}. Esta secuencia 5' (SEC ID Nº: 10) está
representada a continuación (hasta el sitio potencial de inicio de
la transcripción):
pDl11 es digerido por EcoRI y
EcoRV y tratado mediante PollK para obtener un fragmento
lineal de 8,18 kb desprovisto de los sitios de restricción del MCS
de pFUN (lo que permite de introducirlos posteriormente en otro
lugar de la construcción), y se trata mediante la ligasa del fago
T4. Se electropora la cepa MG1363 mediante la mezcla de ligación, y
se selecciona un clon resistente a la eritromicina y que contenga el
plásmido pDl12, como se ha descrito anteriormente.
Las etapas de la construcción de dicho plásmido
están representadas en la Figura 3b.
pDl24 incluye los siguientes elementos: una
secuencia codificadora para una proteína reportero que permita
probar el sistema, seguida por un finalizador.
La proteína reportero elegida es Nucb, la forma
desprovista de péptido señal de la nucleasa Nuc de
Staphylo-coccus aureus (SHORTLE, Gene, 22,
181-189, 1983). Se clona su marco abierto de lectura
en el plásmido pSEC1 (o pVE3684, CHATEL et al., Clin. Diagn.
Lab. Immunol., 8, 545-551, 2001) bajo el control
del promotor P_{nis} (inductible mediante la nisina) para la
transcripción, y señales de Usp45 de L. lactis para la
traducción (RBSUsp45 y codón de inicio) y la secreción (péptido
señal PSUsp45): se clona el conjunto
P_{nis}-RBSUsp45-PSUsp45 en
pDl24.
El finalizador elegido es el finalizador T1T2
(PESCHKE et al., J. Mol. Biol., 186, 547-555,
1985) que procede del plásmido pVE5239 (DIEYE et al., J.
Bacterial., 183, 4157-4166, 2001).
Para la construcción de pDl24, pSEC1 es digerido
por XhoI, tratado mediante el ADN polimerasa del fago T4, y
digerido por ClaI, para obtener una forma lineal de 3,8 kb.
En paralelo, pVE5239 es digerido por SacI, tratado mediante
el ADN polimerasa del fago T4, y digerido por ClaI, para
obtener un fragmento de 217 pb que contiene el finalizador T1T2. Se
purifica y liga dicho fragmento con la forma lineal del vector
pSECI, y se utiliza la mezcla de ligación para transformar la cepa
TG1 de E. coli. Se seleccionan unos clones resistentes al
cloramfenicol en cajas
LBT + cloramfenicol 12,5 \mug/mL. Se elige uno de dichos clones, que contiene un plásmido de 4 kb denominado pDl24.
LBT + cloramfenicol 12,5 \mug/mL. Se elige uno de dichos clones, que contiene un plásmido de 4 kb denominado pDl24.
Las etapas de la construcción de pDl24 están
representadas en la figura 4.
Se coloca la fusión PSUsp45-NucB
bajo el control del sistema de expresión P_{Zn}-zitR en el
plásmido pDl12, para producir el plásmido pDl1224.
pDl12 es digerido por XbaI, tratado mediante el
ADN polimerasa del fago T4, y digerido por BamHI, para obtener una
forma lineal de 8,1 kb. En paralelo, pDl24 es digerido por Sacll,
tratado mediante el ADN polimerasa del fago T4, y digerido por
BamHl, para obtener un fragmento de 932 pb que contiene el marco
abierto de lectura de la proteína reportero NucB (bajo el control de
RBSUsp45 y PSUsp45), y el finalizador de transcripción T1T2. Este
fragmento de 932 pb es purificado y ligado con la forma lineal del
vector pDl12, y se utiliza el producto de ligación para transformar
MG1363. Se seleccionan los transformantes en medio sólido M17 +
glucosa 0,5%, + eritromicina 5 \mug/mL + EDTA 0,2 mM. El EDTA
permite inducir, gracias al sistema p_{Zn}-zitR, la
expresión del reportero y efectuar por lo tanto una primera criba
del fenotipo Nuc+ de los clones recombinantes. El test de actividad
Nuc se efectúa siguiendo el protocolo descrito por LE LOIR et
al., (J. Bacterial. 176, 5135-5139, 1994).
Las etapas de construcción de pDl1224 están
representadas en la Figura 5.
La inserción de dicho plásmido que contiene el
gen reportero codificador para NucB, bajo control del sistema de
expresión p_{Zn}-zitR, está esquematizada en la
Figura 6a.
Para cuantificar el nivel de expresión
controlada mediante p_{Zn} zitR en función de las condiciones
medioambientales de Zn^{2+}, se utilizó otro reportero de
localización citoplásmica: la \beta-galactosidasa
de Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, codificada
mediante el operón lacLM.
Se amplificó el operón lacLM mediante PCR
a partir del plásmido pAMJ769 (MADSEN et al., Mol. Microbiol.
32, 75-87, 1999), utilizando en siguiente par de
cebos:
LAC5:
- 5'-CGCGGATCCTTTGAAAGGATATTCCTC-3' (SEC ID Nº: 15)
LAC3:
- 5'-CCTACGTATTAGAAATGAATGTTAAAGC-3' (SEC ID Nº: 16).
Se han dibujado los cebos LAC5 y LAC3
respectivamente según la secuencia del plásmido pAK80, publicada por
ISRAELSEN et al., (Appl. Environ. Microbiol. 61,
2540-2547, 1995) y según la secuencia de los genes
lacLM disponible en GenBank con el número M92281. LAC5 se
solapa al sitio potencial de fijación del ribosoma de lacL
(RBS, indicado en negrita en la secuencia), y LAC3 contiene el codón
stop de lacM. Además, para permitir la clonación del
fragmento PCR, se introdujeron los sitios de restricción
BamHI y SnaBI en los extremos de LAC5 y LAC3
respectivamente (subrayados en las secuencias). Para la construcción
de pDI30, el plásmido receptor pDI1224 ha sido digerido por
BamHI y EcoRV para deletar el reportero segregado
PSusp45NucB, y el producto de PCR lacLM, tras digestión por
BamHI y SnaBI, fue insertado en su lugar. Esta mezcla
de ligación se utilizó para transformar la cepa de L. lactis
MG1363. Los transformantes se seleccionaron en medio gelosado M17 +
glucosa 0,5% + eritromicina 5 \mug/mL + X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido)
160 \mug/ml + EDTA 0,5 mM. La adición de X-Gal y
EDTA en el medio permite cribar los clones que llevan pDI30 para su
fenotipo azul, ligado a la hidrólisis del X-Gal
mediante la \beta-galactosidasa (se ha comprobado
que en la ausencia de EDTA, los clones siguen blancos, lo que indica
que el medio contiene suficiente Zn^{2+} para formar la expresión
de LacLM).
La inserción de este plásmido que contiene el
operón lacLM codificador para la
\beta-galactosidasa, bajo control del sistema de
expresión p_{Zn}-zitR, está esquematizado en la
Figura 6b.
Las etapas de la construcción de pDI30 se
representan en la Figura 7.
Se cultivó la cepa de L. lactis MG1363,
que lleva el plásmido pDI30, en medio químicamente definido SA, al
que se añadió Zn^{2+} a 1 \muM. El crecimiento se efectuó el
crecimiento durante una noche a 30ºC sin agitación.
El día siguiente, se diluyó el cultivo a
alrededor de 1/100ª parte en medio SA (que contiene ZnSO_{4} en
una concentración de 10 nM) y se siguió el crecimiento mediante
medición de la DO_{600}. En el valor de DO_{600}\sim0,2, se
dividió el cultivo en varios subcultivos sometidos a distintos
tratamientos: ninguna adición o adición de EDTA con concentraciones
de 10 - 30 - 50 - 100 - 300 o 500 \muM, o adición de Zn^{2+}
con una concentración de 1 \muM. En distintos tiempos de
tratamiento, se siguió el crecimiento mediante medición de la
DO_{600}, y se cuantificó la actividad
\beta-galactosidasa (\beta-Gal)
de los extractos bacterianos mediante el método de Miller. En
presencia de ONPG, la \beta-Gal produce
O-nitrofenol de color amarillo que se puede dosificar
mediante medición de la densidad óptica a 420 nm; 1 unidad Miller de
actividad \beta-Gal se define como productora de 1
nmol de O-nitrofenol por minuto por unidad de densidad
óptica por mL de cultivo.
La actividad \beta-Gal medida
después de 1 h de tratamiento en función de la concentración de EDTA
añadida (expresada en \muM) está representada en la Figura 8a; el
subcultivo al que se ha añadido Zn^{2+} a 1 \muM está indicado
mediante una flecha (+1 \muM Zn).
En la ausencia de EDTA o en presencia de
Zn^{2+}, se observa un nivel de actividad
\beta-Gal de base muy débil. En presencia de EDTA,
se observa una inducción muy nítida de la actividad
\beta-Gal que depende de la concentración de EDTA:
el nivel de actividad máximo (inducción de un factor > 100) se
obtiene para las concentraciones de 30 \muM o 50 \muM de EDTA,
lo que define por lo tanto la gama de concentraciones óptima a
utilizar en dichas condiciones para conseguir una inducción
máxima.
En el transcurso del mismo experimento, se
midieron asimismo el crecimiento (curvas en trazo discontinuo) y la
actividad \beta-Gal (curvas en trazos continuos)
de ciertos subcultivos en función del tiempo; los resultados están
representados en la Figura 8b. Los subcultivos estudiados fueron
sometidos, en la DO600\sim0,2 (indicada por una flecha), a los
siguientes tratamientos: ninguna adición (\boxempty); adición de
EDTA a 30 \muM (\Delta) o 50 \muM (0); adición de Zn^{2+} a
1 \muM (O). A intervalos de tiempo regulares después de dichos
tratamientos, se extraen alícuotas para cuantificar la actividad
\beta-Gal de las células bacterianas. El nivel de
inducción depende a la vez del tiempo de exposición al EDTA y de su
concentración. La inducción máxima es de un factor >500 para 3 a
4 h en presencia de EDTA a 30 \muM, lo que permite definir las
condiciones de utilización del sistema.
Estos plásmidos se construyen mediante
sustitución de lementos del sistema de secreción PSUsp45 del
plásmido pSEC por los del sistema de secreción de Exp4.
La secuencia codificadora del péptido señal de
Exp4 (PSExp4), acompañada de las señales de traducción de Exp4, es
decir su RBS (o RBSExp4) y su codón de inicio de la traducción, fue
amplificada a partir del plásmido pVE8022 (POQUET et al.,
1998 ya mencionado), utilizando los pares de cebos
Exp4-5 + Exp4-NdeI y M13reverse +
Exp4-NdeI, cuyas secuencias son:
M13reverse:
- 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEC ID Nº: 11);
Exp4-5:
- 5'-GTTCTAAGGATCCATTAACTTAAGGAG-3' (SEC ID Nº: 12);
Exp4-Ndel:
- 5'-TTTGTGATGCATATGCAA.ATACAACGGCTGTTG-3' (SEC ID Nº: 13).
Los cebos Exp4-5 y
Exp4-NdeI se diseñaron a partir de la parte 5' del
gen exp4 de la cepa MG1363 de L. lactis (GENBANK
número U95836).
En Exp4-5 y
Exp4-Ndel, se han introducido sitios de restricción
(en negrita) en los extremos de PSExp4 para facilitar su clonación,
respectivamente BamHI en 5' y NsiI en 3' (aguas abajo
del sitio de división potencial de PSExp4). Se introduce el sitio
NsiI en una posición que permite la clonación de PSExp4 en
fase con NucB.
Además, Exp4-NdeI incluye un
sitio NdeI (subrayado) para permitir una posible clonación
(de una proteína de interés) en fase con PSExp4. La inserción de los
sitios NdeI y NsiI introduce únicamente dos
aminoácidos en el extremo N-terminal de NucB: Tyr
(codificado por TAT en Exp4-NdeI) y Ala (GCA en
Exp4-NdeI), lo que perturba poco la secuencia.
La amplificación mediante Exp4-5
+ Exp4-NdeI a partir del ADN del plásmido pVE8022
produce un fragmento de 117 pb.
El péptido codificado mediante este fragmento
responde a la secuencia
MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA\downarrow
YA (SEC ID Nº: 14) que corresponde a la secuencia del péptido señal de Exp4, hasta el sitio ya mencionado de división (indicado mediante una flecha) seguido por los dos aminoácidos Y y A insertados aguas arriba de NucB.
YA (SEC ID Nº: 14) que corresponde a la secuencia del péptido señal de Exp4, hasta el sitio ya mencionado de división (indicado mediante una flecha) seguido por los dos aminoácidos Y y A insertados aguas arriba de NucB.
Tras su digestión por BamHI y
NsiI, se inserta el fragmento Exp4-5 +
Exp4-NdeI de 117 pb mediante ligación en pSEC1
(CHATEL et al., 2001 ya mencionado) digerido por las mismas
encimas, lo que permite la sustitución de PSUsp45 por PSExp4.
La amplificación PCR por M13reverse +
Exp4-Ndel a partir del ADN del plásmido pVE8022
produce un fragmento de 799 pb. Este fragmento contiene las señales
de transcripción, de traducción y de secreción de Exp4.
Tras su digestión por EcoRV y
NsiI, se inserta dicho fragmento en pSEC1 previamente
digerido por XbaI tratado mediante la polimerasa del fago T4
y digerido por NsiI. En el plásmido resultante, la producción
y la secreción de NucB se sitúan así bajo control de las señales de
transcripción, de traducción y de secreción de Exp4.
<110> INSTITUTO NACIONAL DE
INVESTIGACIONES AGRONÓMICAS (INRA)
\hskip1cm Isabelle, POQUET
\hskip1cm Daniel, LLULL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CASETES DE EXPRESIÓN PROCARIOTAS
REGULADOS POR EL CINC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPbv539/116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02 10805
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-08-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.1
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<210>1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia consenso del promotor
bacteriano pzn
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (12)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> -35_señal
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<222> (19)..(24)
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<223>
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaaataang tnnnnnnntt gacattattt tt
\hfill32
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<210> 2
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia consenso del promotor
bacteriano pzn
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (9)..(9)
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<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (12)..(18)
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<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> -35_signal
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<222> (19)..(24)
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<223>
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (33)..(41)
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<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> -10_señal
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<222> (42)..(47)
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<223>
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaataang tnnnnnnntt gacattattt ttnnnnnnnn ntataat
\hfill47
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Lactococcus lactis
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<221> misc_feature
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<222> (9)..(9)
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<223> Y = T o C
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<220>
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<221> -35_signal
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<222> (19)..(24)
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<223>
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaaataayg ttaactggtt gacattattt tt
\hfill32
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<211> 56
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<212> DNA
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<213> Lactoccocus lactis
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<220>
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<221> -35_signal
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<222> (19)..(24)
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<223>
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<220>
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<221> -10_signal
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<222> (42)..(47)
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<223>
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaaataatg ttaactggtt gacattatttttactttgtc atataattaa ccagta
\hfill56
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<210> 5
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<212> DNA
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<213> Lactoccocus lactis
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<220>
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<223>
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<220>
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<222> (43)..(48)
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<223>
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaataac gttaactggt tgacattatt ttttctttgc tatataatta accagta
\hfill57
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<210> 6
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Lactoccocus lactis
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<400> 6
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\sa{Met Lys Lys Ile Asn Leu Ala Leu Leu Thr Leu
Ala Thr Leu Met Gly}
\sac{Val Ser Ser Thr Ala Val Val Phe Ala}
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<210> 7
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
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<223> Cebo PCR
\newpage
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipctaatgagcg ggcttttt
\hfill18
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<210> 8
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebo PCR
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagagc gggatccttc atcgaaactc ttcag
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 1100
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<212> DNA
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<213> Lactoccocus lactis
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<220>
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<221> -35_signal
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<222> (295)..(300)
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<223>
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<220>
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<221> -10_signal
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<222> (318)..(323)
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<223>
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<221> RBS
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<222> (393)..(348)
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<223>
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<221> misc_feature
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<222> (362)..(362)
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<223> N = A. C, G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (412)..(412)
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<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (445)..(445)
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<223> N = A, C, G o T
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<220>
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<221> RBS
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<222> (780)..(786)
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<223>
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<210> 10
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<211> 160
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<212> DNA
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<213> Lactoccocus lactis
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<220>
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<221> -35_signal
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<222> (123)..(128)
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<220>
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\newpage
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<210> 11
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
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<223> Cebo PCR
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgacc
\hfill18
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<223> Cebo PCR
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttctaagga tccattaact taaggag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebo PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgtgatgc atatgcaaat acaacggctg ttg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> PRT
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Lys Ile Asn Leu Ala Leu Leu Thr Leu
Ala Thr Leu Met Gly}
\sac{Val Ser Ser Thr Ala Val Phe Ala Tyr
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebo PCR
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcct ttgaaaggat attcctc
\hfill27
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<210> 16
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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<220>
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<223> Cebo PCR
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacgtatt agaaatgaat gttaaagc
\hfill28
Claims (18)
1. procedimiento de construcción de un casete de
expresión de una secuencia nucleotídica de interés,
caracterizado porque se utiliza para controlar la expresión
de dicha secuencia de interés un polinucleótido constituido por:
- -
- un promotor bacteriano, denominado en adelante p_{Zn}, que contiene un lugar de fijación para la proteína ZitR de Lactococcus lactis, incluyendo dicho lugar la siguiente secuencia:
- AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTT (SEC ID Nº: 1),
en la que TTGACA representa la caja -35 de dicho
promotor, y N representa A, C, G o T; y
- -
- una secuencia codificadora para un polipéptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con ZitR de Lactococcus lactis colocada bajo control transcripcional de dicho promotor;
y porque se asocia dicho polinucleótido con por
lo menos un sitio de restricción que permite la inserción de dicha
secuencia de interés bajo control transcripcional de dicho promotor
p_{Zn}.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el promotor p_{Zn} incluye la
siguiente secuencia:
- AAAAATAANGTNNNNNNNTTGACATTATTTTTNNNNNNNNNTATAAT (SEC ID Nº: 2),
en la que TATAAT representa la caja -10 de dicho
promotor.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el promotor pZn incluye una secuencia
elegida entre:
- - la secuencia:
- AAAAATAATGTTAACTGGTTGACATTATTTTTACTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SECID Nº: 4);
- -
- la secuencia:
- AAAAAATAACGTTAACTGGTTGACATTATTTTTTCTTTGCTATATAATTAACCAGTA (SEC ID Nº: 5)
4. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se inserta en
dicho casete una secuencia nucleotídica codificadora para un péptido
de direccionamiento extracelular, y por lo menos un sitio de
restricción que permite la clonación de una secuencia nucleotídica
de interés, en fusión traduccional con dicho péptido de
direccionamiento, bajo control transcripcional del promotor
p_{Zn}.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4,
caracterizado porque dicho péptido de direccionamiento
extracelular es un péptido señal de secuencia:
- MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEC ID Nº: 6).
6. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se inserta en
dicho casete una secuencia nucleotídica de interés, bajo control
transcripcional del promotor p_{Zn}.
7. Procedimiento de construcción de un casete de
expresión de una secuencia nucleotídica de interés,
caracterizado porque se utiliza, para controlar la expresión
de dicha secuencia de interés, un polinucleótido constituido por un
promotor bacteriano p_{Zn}, tal como se define en las
reivindicaciones 1 a 3, y porque se asocia dicho polinucleótido con
al menos un sitio de restricción que permite la inserción de dicha
secuencia nucleotídica de interés bajo control transcripcional de
dicho promotor p_{Zn}.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7,
caracterizado porque se inserta en dicho casete una secuencia
nucleotídica codificadora para un péptido de direccionamiento
extracelular, y por lo menos un sitio de restricción que permite la
clonación de una secuencia nucleotídica de interés en fusión
traduccional con dicho péptido de direccionamiento, bajo control
transcripcional del promotor p_{Zn}.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho péptido de direccionamiento
extracelular es un péptido señal de secuencia SEC ID Nº: 6.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque se inserta en
dicho casete una secuencia nucleotídica de interés, bajo control
transcripcional del promotor p_{Zn}.
\newpage
11. Procedimiento de construcción de un vector
recombinante, caracterizado porque incluye la construcción de
un casete de expresión mediante un procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y la inserción de dicho
casete en un vector.
12. Procedimiento de transformación de una
bacteria con gram-positivo, caracterizado
porque incluye la construcción de un casete de expresión mediante un
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y
la transformación de dicha bacteria mediante dicho casete de
expresión.
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicha bacteria es una bacteria
láctica.
14. Utilización de un casete de expresión
susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o de un vector
recombinante susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento
según la reivindicación 11, para la producción de una proteína de
interés en una bacteria con gram-positivo.
15. Procedimiento de producción de una proteína
de interés en una bacteria con gram-positivo,
caracterizado porque incluye:
- -
- la introducción en dicha bacteria de un casete de expresión susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que incluye una secuencia codificadora para dicha proteína de interés, colocada bajo control transcripcional del promotor p_{Zn};
- -
- el cultivo de dicha bacteria en un medio que contiene una cantidad de Zn^{2+} suficiente para reprimir la expresión de dicha proteína;
- -
- la inducción de la producción de dicha proteína mediante depleción de Zn^{2+} de dicho medio;
- -
- la recuperación de la proteína producida.
16. Procedimiento, según la reivindicación 15,
caracterizado porque la depleción de Zn^{2+} de dicho medio
se obtiene mediante adición de un quelador de los cationes
divalentes.
17. Procedimiento, según la reivindicación 15,
caracterizado porque la depleción de Zn2+ de dicho medio se
obtiene mediante cultivo de la bacteria hasta agotamiento del Zn2+
inicialmente presente en el medio.
18. Procedimiento de producción de una proteína
de interés en una bacteria con gram-positivo en la
que el represor ZitR endógeno está inactivo, caracterizado
porque incluye:
- -
- la introducción en dicha bacteria de un casete de expresión susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que incluye una secuencia codificadora para dicha proteína de interés, colocada bajo control transcripcional del promotor pZn;
- -
- el cultivo de dicha bacteria;
- -
- la recuperación de la proteína producida.
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