CN112063650A

CN112063650A - 一种监测dna顺式元件在植物中表达模式的无损报告系统、构建方法及其应用

Info

Publication number: CN112063650A
Application number: CN202010934723.4A
Authority: CN
Inventors: 和玉兵
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明涉及一种DNA顺式元件在植物中表达模式的无损监测方法及其应用。报告系统被广泛用于监测DNA顺式元件的表达模式，但是常用的报告系统需要特殊的设备、昂贵的化学药品或对生物样品进行破坏性处理。本发明构建了一个新的报告基因RUBY，该基因合成的酶能将酪氨酸转化为红色的甜菜红素，本发明利用RUBY监测DNA顺式元件的表达模式，成功实现了可见光下裸眼可视的DNA顺式元件在植物中表达模式的无损监测。

Description

一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的无损报告系统、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种新的指示DNA顺式元件在植物中表达模式的报告系统及其应用。本发明的报告系统通过植物体内产生的可见光下可被裸眼直接观察的色素来指示。本发明还涉及上述报告系统的构建和应用。

背景技术

顺式作用元件(cis-acting element)是存在于基因旁侧序列中，能影响基因表达的一段DNA序列，它们的作用是参与基因表达的调控。基因处于顺势元件调控之下，在生物体中展现出的表达情况称为该顺势元件的表达模式(expression pattern)。植物中已有较多顺势元件被报道，其中比较知名比如响应生长素浓度的顺式元件DR5(Ulmasov T,Murfett J,Hagen G,Guilfoyle TJ.Aux/IAA proteins repress expression ofreporter genes containing natural and highly active synthetic auxin responseelements.Plant Cell,1997,9(11):1963-1971)；控制生长素合成基因YUC4表达模式的顺式元件YUC4启动子(Cheng Y,Dai X,Zhao Y.Auxin biosynthesis by the YUCCA flavinmonooxygenases controls the formation of floral organs and vascular tissuesin Arabidopsis.Genes Dev,2006,20(13):1790-1799)。目前，监测顺式元件在植物中表达模式的方法包括：通过原位杂交(in situ hybridization)来原位检测被顺式元件调控的基因的表达模式(Cheng Y,Qin G,Dai X,Zhao Y.NPY1 a BTB-NPH3-like protein,playsa critical role in auxin-regulated organogenesis in Arabidopsis.Proc NatlAcad Sci U S A,2007,104(47):18825-18829)这种方法包括取样、制样、样品检测等非常多的步骤，操作很复杂，并且需要杀死样品，无法活体观察。此外，通过能产生特殊信号的基因作为报告子来对顺式元件的表达模式进行监测是一种比较常见的方法。

目前，已经开发了多种报告基因来监测顺式元件的表达。绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物(例如RFP、mCherry和YFP)作为报告分子可以用来监测顺式元件的表达(Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,Ward WW,Prasher DC.Green fluorescent protein as a markerfor gene expression.Science,1994,263(5148):802-805；Heim R,Cubitt AB,TsienRY.Improved green fluorescence.Nature,1995,373(6516):663-664)。尽管GFP易于使用，但有局限性。荧光蛋白通常需要被特殊波长的光激发，并且只能观察到特殊波长的光，因此需要特殊的激发器作为光源，且观察时需要对自然光中的杂光进行遮挡。此外，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作为一种报告基因也被广泛用于植物中，用于监测顺式元件的表达模式(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.Embo j,1987,6(13):3901-3907)。例如，DR5:GUS转基因品系通常用于监测植物生长素的分布(SabatiniS,Beis D,Wolkenfelt H,Murfett J,Guilfoyle T,Malamy J,Benfey P,Leyser O,Bechtold N,Weisb eek P,Scheres B.An auxin-dependent distal organizer ofpattern and polarity in the Arabidopsis root.Cell,1999,99(5):463-472)。荧光素酶是另一个在植物和动物中均被广泛使用的报告分子(Contag CH,Bachmann MH.Advancesin in vivo bioluminescence imaging of gene expression.Annu Rev Biomed Eng,2002,4:235-260)。但是GUS和萤光素酶分别需要添加昂贵的底物X-Gluc(5-溴-4-氯-1H-吲哚-3-β-D-吡喃葡萄糖苷酸)和萤光素来进行显色反应，随后进行处理或者直接通过仪器观察，因此会对植物组织产生损伤或者破坏，或者增加无菌培养的组织被污染的可能。此外，荧光素酶催化底物产生的荧光也需要特殊的仪器进行拍照或观察。这些因素增加了这几种报告系统的检测成本并且限制了使用范围。

甜菜红素是一类可以由酪氨酸逐步合成而来的植物天然产物(Strack D,Vogt T,Schliemann W.Recent advances in betalain research.Phytochemistry,2003,62(3):247-269；Xu J-J,Fang X,Li C-Y,Yang L,Chen X-Y.General and specialized tyrosinemetabolism pathways in plants.aBIOTECH,2020,1(2):97-105)。甜菜、火龙果和其他植物中见到的鲜红色就是甜菜红素积聚的结果。目前，甜菜红素的生物合成途径已有较详尽的研究，发现仅需三个蛋白(CYP76AD1、DODA、GT)表达即可将酪氨酸转化为甜菜红素(Polturak G,Aharoni A.Advances and future directions in betalain metabolicengineering.New Phytol,2019,224(4):1472-1478)。酪氨酸首先在苯环上被羟基化，生成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)。该反应由P450氧化酶CYP76AD1催化。L-DOPA可被CYP76AD1进一步氧化为环-DOPA。同时，L-DOPA也会被L-DOPA 4，5-二加氧酶(DODA)催化生成甜菜酸，其随后与环-DOPA缩合成甜菜苷配基，缩合反应不需要酶。最后，通过GT(葡萄糖基转移酶)将糖基添加到甜菜苷配基中，生成颜色鲜亮的甜菜红素。众所周知，酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，在各类生物体内均大量存在，因此若能使用酪氨酸作为底物来合成甜菜红素，并以甜菜红素作为报告分子，就可以完全避免添加外源底物的操作。

发明内容

针对传统DNA顺式元件表达模式报告系统的局限性，需要开发可广泛用于无创、连续和低成本的有效监测DNA顺式元件表达模式的新报告系统。本发明利用一种在自然光下肉眼可见的甜菜红色素作为报告分子，设计了一种新的指示DNA顺式元件在植物中的表达模式的报告系统。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的无损报告系统，所述无损监测报告系统为包括顺次设置待监测的DNA顺式元件、甜菜红素生物合成基因RUBY基因、终止子的载体。

所述甜菜红素生物合成基因RUBY基因为无损监测报告系统的报告基因，其作用在于，RUBY基因表达的蛋白质可以在植物细胞中合成一种色素，在可见光下可以直接通过裸眼观察，使本发明系统能够在可见光下裸眼可视的监测DNA顺式元件在植物中的组织表达模式。

进一步的，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT(葡萄糖基转移酶)基因；CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因分别表示细胞内甜菜红色素合成途径上的三个基因，编码的CYP76AD1蛋白、DODA蛋白和GT蛋白分别表示细胞内甜菜红色素合成途径上的三个酶。

所述CYP76AD1基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示CYP76AD1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述DODA基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.2所示DODA氨基酸序列的核苷酸序列，

所述GT基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；优选的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示

进一步的，所述RUBY基因的CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接。

根据前文技术背景中甜菜红素的合成文献(Polturak G,et al.New Phytol,2019)可知，甜菜红素合成只需要这三个蛋白即可。因此，只要能同时表达这三个蛋白即可保证在植物体内产生甜菜红素，三个蛋白的连接顺序不影响三个蛋白最终功能的发挥。

在某个特定的实施例中，以CYP76AD1基因-DODA基因-GT基因的顺序，通过DNA连接单元依次连接，RUBY基因结构为：CYP76AD1基因-DNA连接单元-DODA基因-DNA连接单元-GT基因。最后再加上终止密码子。

进一步的，所述DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列；

优选的，所述DNA连接单元的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.4所示2A肽氨基酸序列的DNA序列；

进一步优选的，所述DNA连接单元为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2，根据2A肽反推的核苷酸序列2A1和2A2均能表达出2A肽。

在某个特定的实施例中，RUBY基因为采用2A肽编码核苷酸序列2A1、2A2作为DNA连接单元，以SEQ ID NO.5所示CYP76AD1基因-SEQ ID NO.8所示2A1-SEQ ID NO.6所示DODA基因-SEQ ID NO.9所示2A2-SEQ ID NO.7所示GT(葡萄糖基转移酶)基因-终止密码子的顺序依次顺次连接。

进一步的，载体的骨架质粒为植物载体。

进一步的，所述终止子为所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子；

优选的，所述终止子为能在双子叶类植物或单子叶类植物中发挥功能的终止子；

进一步优选的，所述终止子为能在拟南芥或水稻中发挥功能的终止子；

更进一步优选的，所述终止子为如SEQ ID NO.10所示的tHsp或如SEQ ID NO.11所示的tNOS。

本发明的第二个目的是提供一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统的构建方法，包括以下步骤：

1)提供报告基因载体的骨架质粒，构建RUBY基因-终止子片段，将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子；

2)将待监测的DNA顺式元件连入步骤1)得到的RUBY-终止子片段之前，获得所述无损监测报告系统pDNA顺式元件-RUBY-终止子。

进一步的，所述步骤1)的具体操作为：分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子片段；使用体外重叠延伸PCR的方法将CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因三种DNA分子通过DNA连接单元以任意顺序组合为RUBY基因，在RUBY基因之后连接终止子，获得RUBY基因-终止子片段；将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

在某一个特定的实施例中，当RUBY基因结构为：CYP76AD1基因-DNA连接单元-DODA基因-DNA连接单元-GT基因，所述步骤1)的具体操作为：

1-1)通过体外全基因合成的方式分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子；

1-2)连接GT基因和终止子，获得GT基因-终止子片段；

1-3)使用体外重叠延伸PCR的方法将获得的CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因-终止子片段之间通过DNA连接单元顺次连接，得到RUBY基因-终止子片段；

1-4)将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

进一步的，所述步骤2)具体操作为：通过PCR扩增待监测的DNA顺式元件，将待监测的DNA顺式元件连入步骤1)得到的pRUBY-终止子中RUBY-终止子片段之前，得到含有RUBY基因表达盒的报告基因载体pDNA顺式元件-RUBY-终止子，即为所述无损检测报告系统。

本发明的第三个目的是提供前述的监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统或前述的监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统的构建方法在监测植物中DNA顺式元件表达模式中的应用。

进一步的，本发明的无损监测报告系统的结果判定方式为：采用所述监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统转化植物后，直接通过裸眼观察植物的哪些组织或者器官变成甜菜红素的颜色，即红色，确定待监测的DNA顺式元件的在植物中表达模式。

进一步的，所述DNA顺式元件的表达可以发生在各类植物整体或植物的部分组织或者器官，优选的，所述植物为双子叶类植物和/或单子叶类植物，进一步优选的，所述植物为拟南芥和/或水稻。

本发明使用单个启动子有效地共表达整个途径。在某一个特定的实施例中，RUBY基因为采用能编码2A肽的核苷酸序列2A作为DNA连接单元，以CYP76AD1基因-2A1-DODA基因-2A2-GT基因的顺序依次顺次连接。我们去除CYP76AD1、DODA和GT的终止密码子，将三者通过能编码2A肽的DNA序列顺次连接，最后接上终止密码子，组合成一个人造基因，命名为RUBY。

众所周知，酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，在各类生物体内均大量存在，植物中酪氨酸首先在苯环上被羟基化，生成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)。该反应由P450氧化酶CYP76AD1催化。L-DOPA可被CYP76AD1进一步氧化为环-DOPA。同时，L-DOPA也会被L-DOPA 4，5-二加氧酶(DODA)催化生成甜菜酸，其随后与环-DOPA缩合成甜菜苷配基。缩合反应不需要酶。最后，通过GT(Glycosyl transferase，葡萄糖基转移酶)将糖基添加到甜菜苷配基中，生成颜色鲜亮的甜菜红素。

将这三个甜菜红素生物合成基因融合成一个开放阅读框，可以使用单个启动子和终止子表达该开放阅读框。

在这三个基因之间插入了编码2A肽的序列，2A肽是一种只有20个左右氨基酸组成的短肽，蛋白质翻译时，核糖体遇到新翻译产生的2A肽时会导致核糖体发生“跳跃”，继而导致肽链在2A肽的末尾处发生自我切割(Sharma P,Yan F,Doronina VA,Escuin-Ordinas H,Ryan MD,Brown JD.2A peptides provide distinct solutions to driving stop-carryon translational recoding.Nucleic Acids Res,2012,40(7):3143-3151)，因此利用2A肽能在单个启动子的控制下同时表达多种蛋白质(Liu Z,Chen O,Wall JBJ,Zheng M,ZhouY,Wang L,Vaseghi HR,Qian L,Liu J.Systematic comparison of 2A peptides forcloning multi-genes in a polycistronic vector.Sci Rep,2017,7(1):2193)。RUBY基因转录后，能产生三种独立的酶，催化酪氨酸合成甜菜红素。DNA顺式元件可以放置在RUBYDNA之前来驱动RUBY的表达，随后通过甜菜红素的表达位置和颜色的深浅推断出该DNA顺式元件在植物中的表达模式。

本发明某一个特定的实施例中，使用拟南芥YUC4启动子(核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示)作为待监测DNA顺式元件控制RUBY的表达，使用植物中被广泛使用的tHsp作为RUBY的转录终止子(Nagaya S,Kawamura K,Shinmyo A,Kato K.The HSP terminator ofArabidopsis thaliana increases gene expression in plant cells.Plant CellPhysiol,2010,51(2):328-332)。YUC4编码植物生长素生物合成中的关键酶，已有研究表明YUC4在花的雌蕊顶端特异表达(Cheng Y,Dai X,Zhao Y.Auxin biosynthesis by theYUCCA flavin monooxygenases controls the formation of floral organs andvascular tissues in Arabidopsis.Genes Dev,2006,20(13):1790-1799)。我们在YUC4：RUBY转基因植株中观察到了类似的表达模式。

此外，本发明另一个特定的实施例中，使用响应生长素的人工合成启动子DR5(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)作为待监测DNA顺式元件(Ulmasov T,Murfett J,Hagen G,Guilfoyle TJ.Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containingnatural and highly active synthetic auxin response elements.Plant Cell,1997,9(11):1963-1971)驱动RUBY的表达，使用在植物中广泛使用的NOS终止子(Bevan M,BarnesWM,Chilton MD.Structure and transcription of the nopaline synthase generegion of T-DNA.Nucleic Acids Res,1983,11(2):369-385)来终止RUBY的转录。我们将DR5：RUBY转化为水稻，在水稻根中的DR5：RUBY和DR5：GFP显示出相似的模式，但是DR5：RUBY易于观察，无需任何处理或改变光照条件。因为水稻叶片存在较强的自发荧光，因此我们在水稻叶片中观察到DR5：RUBY相比于DR5：GFP的优势更加明显。

本发明的有益效果体现在：

本发明设计了一种新的指示DNA顺式元件在植物中表达模式的报告系统，由于本发明报告系统中的报告分子甜菜红素生物合成基因RUBY能够在植物中产生在可见光下裸眼可见的甜菜红素，从而为监测DNA顺式元件的表达模式提供了可见的颜色指示。采用本发明的无损报告系统，能够简单地通过颜色监测DNA顺式元件的表达模式，不需要专用设备或昂贵的基材，因此本发明提供了一种具有观察方便、节省成本的报告系统。本发明的无损报告系统可以用于荧光蛋白报告系统无法较好观察的叶片等绿色组织；可以对植物中基因表达模式进行原位观察，不用对植物进行取样，避免因为取样时的机械外力刺激使顺式元件的表达模式受到干扰。本发明的报告系统是现有报告系统的优良替代方案。

附图说明

图1为RUBY基因的构建示意图：

图1A为将酪氨酸转化为红色的甜菜红素的化学反应流程图；

图1B为在单个表达盒中表达完整的甜菜红素生物合成途径的策略。

图2为利用RUBY基因检测拟南芥生长素合成基因YUC4启动子在拟南芥中的表达模式，左边为野生型拟南芥的花，右边为YUC4:RUBY转基因拟南芥的花。

图3为利用RUBY基因检测生长素应答DNA顺式元件DR5在水稻中的表达模式

图3A部位为水稻根部，由左至右分别为DR5:RUBY在可见光下、DR5:GFP在明场、DR5:GFP在暗环境下只打开488nm荧光场、DR5:GFP在明场环境下同时打开488nm荧光场中进行拍照。

图3B部位为水稻叶片中，由左至右分别为DR5:RUBY在可见光下、DR5:GFP在明场、DR5:GFP在暗环境下只打开488nm荧光场、DR5:GFP在明场环境下同时打开488nm荧光场中进行拍照。

具体实施方式

为了使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1.构建RUBY基因-终止子片段，获得载体pRUBY-tHsp

本实施例RUBY基因采用能编码2A肽的核苷酸序列2A1、2A2为DNA连接单元，以CYP76AD1基因-2A1-DODA基因-2A2-GT(葡萄糖基转移酶)基因的顺序依次顺次连接(图1B)，其中，2A1核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示、2A2核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，2A1、2A2均为编码SEQ ID NO.4所示2A肽的核苷酸序列，以拟南芥基因的终止子tHsp为终止子。

构建方法为：

(1)通过体外全基因合成的方式分别合成：

(a)无终止密码子的CYP76AD1基因(SEQ ID NO.5)，

(b)无终止密码子的DODA基因(SEQ ID NO.6)，

(c)包括SEQ ID NO.7所示GT基因、3个连续的终止密码子TGA、TAG、TGA和SEQ IDNO.11所示终止子tHsp的无终止密码子的GT基因+终止密码子+终止子tHsp片段(SEQ IDNO.14)；

(2)使用能表达2A肽的DNA作为DNA连接单元，2A肽对应DNA的部分序列分别加在用于PCR扩增的引物的5‘端作为接头序列，通过体外重叠延伸PCR(overlap PCR)的方法组装成完整的2A肽的DNA，并将CYP76AD1基因(SEQ ID NO.5)-2A1(SEQ ID NO.8)-DODA基因(SEQID NO.6)-2A2(SEQ ID NO.9)-GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子+终止子tHsp(SEQ IDNO.12)(GT基因+终止密码子+终止子tHsp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)依次首尾相连组合到一起，获得RUBY-tHsp的DNA；进而最终构建出pRUBY-tHsp载体。

具体构建步骤：

(1)PCR1扩增获得CYP76AD1+前部分2A1 DNA，此处前部分2A1序列为：5’-GGTAGCGGAGCTACCAATTTTAGCCTCCTTAAGCAGGCAGGTG-3’(SEQ ID NO.27)，以SEQ ID NO.5所示无终止密码子的CYP76AD1基因为模板DNA，使用引物对：

CYP76AD1+前部分2A1-F：

5’-CACTGATAGTTTAAACTAGTATGGATCATGCGACCCTCGC-3’(SEQ ID NO.15)

CYP76AD1+前部分2A1-R：

5’-CACCTGCCTGCTTAAGGAGGCTAAAATTGGTAGCTCCGCTACCGTAGCGCGGAATCGGGA-3’(SEQ ID NO.16)进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM CYP76AD1+前部分2A1-F	0.6μl
		10μM CYP76AD1+前部分2A1-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水加水补至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：CYP76AD1+前部分2A1，大小为1554bp，其中包括SEQ ID NO.5的无终止密码子的CYP76AD1基因序列和SEQ ID NO.27的前部分2A1，此处前部分2A1序列提供了PCR所用反向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列。但由于PCR所用的引物加上了额外的用于最后Gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.5的无终止密码子的CYP76AD1基因序列和此处前部分2A1总共的序列长度。

(2)PCR2扩增获得后部分2A1+DODA+前部分2A2 DNA，此处后部分2A1序列为：5’-CCTTAAGCAGGCAGGTGATGTAGAAGAGAACCCCGGGCCT-3’(SEQ ID NO.28)，前部分2A2序列为：5’-GGATCCGGAGCAACCAACTTTAGCCTGCTCAAGCAAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.29)，以SEQ ID NO.6所示无终止密码子的DODA基因为模板DNA，使用引物对：

后部分2A1+DODA+前部分

2A2-F:5’-CCTTAAGCAGGCAGGTGATGTAGAAGAGAACCCCGGGCCTATGAAGATGATGAACGGCGA-3’(SEQ ID NO.17)

后部分2A1+DODA+前部分

2A2-R:5’-CTCCTGCTTGCTTGAGCAGGCTAAAGTTGGTTGCTCCGGATCCGGCGGAGGTGAACTTGT-3’(SEQ ID NO.18)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM后部分2A1+DODA+前部分2A2-F	0.6μl
		10μM后部分2A1+DODA+前部分2A2-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：后部分2A1+DODA+前部分2A2大小为908bp，其中包括SEQ ID NO.6的无终止密码子的DODA基因序列和SEQ ID NO.28的后部分2A1及SEQ ID NO.29的前部分2A2。由于此处后部分2A1序列及前部分2A2序列分别提供了PCR所用的正向引物和反向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列，所以PCR产物大小等于SEQ ID NO.6的无终止密码子的DODA基因序列和此处SEQ ID NO.28的后部分2A1及SEQ ID NO.29的前部分2A2总共的序列长度。

(3)PCR3扩增获得后部分2A2+GT+tHsp DNA，此处后部分2A2的序列为：5’-GCTCAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAAAATCCTGGCCCC-3’(SEQ ID NO.30)，以SEQ ID NO.14所示的：无终止密码子的GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子(TGA、TAG、TGA)+终止子tHsp(SEQ IDNO.10)为模板DNA，使用引物对：

后部分2A2+GT+tHsp

DNA-F:5’-GCTCAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAAAATCCTGGCCCCATGACCGCCATCAAGATGAA-3’(SEQ ID NO.19)

后部分2A2+GT+tHspDNA-R:5’-GCTAGCTTACTCAGTTAGGTCTTATCTTTAATCATATTCC-3’(SEQ ID NO.20)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-F	0.6μl
		10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：后部分2A2+GT+tHsp，大小为1819bp，其中包括SEQ ID NO.30所示的后部分2A2序列和SEQ ID NO.14所示序列：无终止密码子的GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子+终止子tHsp(SEQ ID NO.10)序列，终止密码子为：串联了3个连续的终止密码子TGA、TAG、TGA。

此处SEQ ID NO.30的后部分2A2序列提供了PCR所用的正向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列，但由于PCR所用的反向引物加上另加有额外的用于最后Gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.14所示的无终止密码子的GT基因+终止密码子+终止子tHsp和SEQ ID NO.30的后部分2A2总共的长度。

(4)PCR扩增获得RUBY-tHspDNA：将PCR1、PCR2、PCR3三种PCR产物CYP76AD1+前部分2A1、后部分2A1+DODA+前部分2A2、后部分2A2+GTT+终止密码子+tHsp混合作为模板，使用引物对：

CYP76AD1+前部分

2A1-F:5’-CACTGATAGTTTAAACTAGTATGGATCATGCGACCCTCGC-3’(SEQ ID NO.15)；后部分2A2+GT+tHspDNA-R:5’-GCTAGCTTACTCAGTTAGGTCTTATCTTTAATCATATTCC-3’(SEQ IDNO.20)为引物进行PCR扩增，获得RUBY-tHsp DNA。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM CYP76AD1+前部分2A1-F	0.6μl
		10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物大小为4247bp。

(5)构建出pRUBY-tHsp载体：使用Xba I酶切pHDE质粒(质粒信息参见文献：Gao X,Chen J,Dai X,Zhang D,Zhao Y.An Effective Strategy for Reliably IsolatingHeritable and Cas9-Free Arabidopsis Mutants Generated by CRISPR/Cas9-MediatedGenome Editing.Plant Physiol,2016,171(3):1794-1800；pHDE质粒能通过文献中的邮箱向文献的作者索取)，将步骤(4)获得的RUBY-tHsp的PCR产物通过Gibson连接的方式(Gibson连接为目前流行的公知的快速连接DNA的方法，其中的原理、详细操作步骤以及试剂信息参见文献：Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,SmithHO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatMethods,2009,6(5):343-345)连入pHDE质粒的Xba I处，获得pRUBY-tHsp载体。

实施例2.以YUC4启动子(YUC4P)为待监测的DNA顺式元件，连入RUBY-tHsp片段之前，构建pYUC4P-RUBY-tHsp载体

(1)使用拟南芥基因组DNA作为模板，使用引物对：

YUC4P-F:5’-CTGTCAAACACTGATAGTTTATGTCCAACATGCATGCG-3’(SEQ ID NO.21)

YUC4P-R:5’-CGCATGATCCATACTAGTTTGTCGACTAATAAAAGCGAAAGAGAG-3’(SEQ IDNO.22)作为引物，进行PCR扩增，获得YUC4启动子的PCR产物。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM YUC4P-F	0.6μl
		10μM YUC4P-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物YUC4启动子大小为2956bp，包括SEQ ID NO.12的YUC4启动子序列，由于PCR所用的引物加上了额外的用于gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ IDNO.12的YUC4启动子序列长度。

(2)通过Gibson连接的方法将该PCR产物连入Pme I酶切的实施例1构建得到的pRUBY-tHsp质粒获得pYUC4P-RUBY-tHsp质粒。

实施例3.以DR5为待监测的DNA顺式元件，构建pDR5-RUBY-tNOS载体

本实施例RUBY基因采用能编码2A肽的核苷酸序列2A为DNA连接单元，以CYP76AD1基因-2A1-DODA基因-2A2-GT(葡萄糖基转移酶)基因的顺序依次顺次连接(图1B)，以DR5为待监测的DNA顺式元件，以tNOS为终止子，构建方法为：

(1)合成DR5启动子DNA，以此DNA作为模板，使用引物对：

DR5-DX2181-F:5’-TAAGGGACTGACCACCCGGGGATCCGGTATCGATAAGCTTGCAGCC-3’(SEQID NO.23)；

DR5-DX2181-R:5’-CAGCGCTGAAGCTTGGCTGCAGTGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATG-3’(SEQ ID NO.24)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM DR5-DX2181-F	0.6μl
		10μM DR5-DX2181-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物DR5启动子DNA大小为400bp，包括SEQ ID NO.13的DR5启动子序列，由于PCR所用的引物加上了额外的用于gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ IDNO.13的DR5启动子序列长度。

(2)构建pDR5-GFP-tNOS载体：通过Gibson连接的方法将本实施例第(1)步获得的PCR产物DR5启动子DNA连入Pst I酶切过的pDX2181载体(pDX2181骨架载体为pCAMBIA，质粒信息参见文献：Ye R,Zhou F,Lin Y.Two novel positive cis-regulatory elementsinvolved in green tissue-specific promoter activity in rice(Oryza sativa Lssp.).Plant Cell Rep,2012,31(7):1159-1172；pDX2181载体质粒能通过文献中的邮箱向文献的作者索取)获得pDR5-GFP-tNOS质粒。

(3)PCR扩增获得RUBY DNA：以实施例1中pRUBY-tHsp载体质粒作为模板，使用引物对：

DR5-RUBY-tNOS-F:5’-CACTGCAGCCAAGCTTCAGCGCTGTAGATCTCCATGGATCATGCGACCCTCG-3’(SEQ ID NO.25)；

DR5-RUBY-tNOS-R:5’-ACGATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCACTATCACTGGAGGCTTG-3’(SEQ ID NO.26)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM DR5-RUBY-tNOS-F	0.6μl
		10μM DR5-RUBY-tNOS-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物RUBY DNA大小为4018bp。

(4)通过Gibson连接的方法本实施例第(3)步获得的PCR产物RUBY DNA连入Afe I+Eco91 I酶切过的pDR5-GFP-tNOS质粒，获得pDR5-RUBY-tNOS质粒。

对比例1.构建pDR5-GFP-tNOS载体

具体操作步骤与实施例3中步骤(1)、(2)一致。

应用例1.通过RUBY验证拟南芥生长素合成基因YUC4启动子在拟南芥中的表达模式

将实施例2获得的测序后的阳性质粒pYUC4P-RUBY-tHsp电转化到农杆菌(GV3101)中，然后使用花浸法(花浸法为拟南芥遗传转化的普遍方法，直接使用带有质粒的农杆菌浸泡刚开花的拟南芥的花序即可，相关详细操作参见文献：Clough SJ,Bent AF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J,1998,16(6):735-743)对拟南芥进行遗传转化。收获遗传转化的拟南芥种子，使用含有16.7μg/ml潮霉素的MS培养基对种子进行发芽培养，获得有抗性的拟南芥幼苗，然后将其移栽到营养土上，与野生型拟南芥的花相比，pYUC4P-RUBY-tHsp转基因成功发生的植株在雌蕊的柱头顶端区域出现明显的红色(图2)，该结果与已有的拟南芥中YUC4基因启动子在拟南芥的雌蕊柱头中特异表达的模式一致(Cheng Y,Dai X,Zhao Y.Auxinbiosynthesis by the YUCCA flavin monooxygenases controls the formation offloral organs and vascular tissues in Arabidopsis.Genes Dev,2006,20(13):1790-1799)，从而实现对植物中基因表达模式进行原位观察。不用对植物进行取样，避免因为取样时的机械外力刺激使顺式元件的表达模式受到干扰。

应用例2.分别通过RUBY和GFP检测生长素应答DNA顺式元件DR5在水稻中的表达模式

将实施例3获得的测序后的阳性质粒pDR5-RUBY-tNOS、对比例1获得的测序后的阳性质粒pDR5-GFP-tNOS分别电转化到农杆菌(EHA105)中，然后分别侵染水稻愈伤组织。转化品种为水稻“NIP-XW”(又称“小薇”，来自中国水稻研究所)，(水稻遗传转化现已为水稻转基因领域的普遍操作方法，其中详细的转化步骤及使用的各种培养基配方参见文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6(2):271-282)。DR5是一种响应生长素的瞬时元件，其表达强度与生长素的浓度成正比，比如植物的根尖和植物叶片的疏导组织表达较强。对T0转化苗进行观察，发现在水稻根中，利用RUBY观察到DR5在水稻根尖中有较强表达，与通过传统的荧光蛋白报告基因GFP观察到的水稻根尖中DR5的表达模式一致(图3A)。在水稻叶片中观察DR5的表达模式时，发现DR5:RUBY叶片中DR5启动子的活性很容易观察到，而DR5:GFP无法有效检测(图3B)。说明在绿色植物中，进行顺式元件表达模式研究时，RUBY报告基因相比于GFP荧光蛋白存在明显的优势，可以用于荧光蛋白报告系统无法较好观察的叶片等绿色组织。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的无损报告系统、构建方法及其应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp His Ala Thr Leu Ala Met Ile Leu Ala Ile Trp Phe Ile Ser

1 5 10 15

Phe His Phe Ile Lys Leu Leu Phe Ser Gln Gln Thr Thr Lys Leu Leu

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Lys Pro Leu Pro Ile Ile Gly Asn Ile Leu Glu Val

35 40 45

Gly Lys Lys Pro His Arg Ser Phe Ala Asn Leu Ala Lys Ile His Gly

50 55 60

Pro Leu Ile Ser Leu Arg Leu Gly Ser Val Thr Thr Ile Val Val Ser

65 70 75 80

Ser Ala Asp Val Ala Lys Glu Met Phe Leu Lys Lys Asp His Pro Leu

85 90 95

Ser Asn Arg Thr Ile Pro Asn Ser Val Thr Ala Gly Asp His His Lys

100 105 110

Leu Thr Met Ser Trp Leu Pro Val Ser Pro Lys Trp Arg Asn Phe Arg

115 120 125

Lys Ile Thr Ala Val His Leu Leu Ser Pro Gln Arg Leu Asp Ala Cys

130 135 140

Gln Thr Phe Arg His Ala Lys Val Gln Gln Leu Tyr Glu Tyr Val Gln

145 150 155 160

Glu Cys Ala Gln Lys Gly Gln Ala Val Asp Ile Gly Lys Ala Ala Phe

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Asn Leu Leu Ser Lys Leu Phe Phe Ser Val Glu Leu

180 185 190

Ala His His Lys Ser His Thr Ser Gln Glu Phe Lys Glu Leu Ile Trp

195 200 205

Asn Ile Met Glu Asp Ile Gly Lys Pro Asn Tyr Ala Asp Tyr Phe Pro

210 215 220

Ile Leu Gly Cys Val Asp Pro Ser Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Cys

225 230 235 240

Ser Phe Asp Lys Leu Ile Ala Val Phe Gln Gly Ile Ile Cys Glu Arg

245 250 255

Leu Ala Pro Asp Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Asp Asp Val

260 265 270

Leu Asp Val Leu Leu Gln Leu Phe Lys Gln Asn Glu Leu Thr Met Gly

275 280 285

Glu Ile Asn His Leu Leu Val Asp Ile Phe Asp Ala Gly Thr Asp Thr

290 295 300

Thr Ser Ser Thr Phe Glu Trp Val Met Thr Glu Leu Ile Arg Asn Pro

305 310 315 320

Glu Met Met Glu Lys Ala Gln Glu Glu Ile Lys Gln Val Leu Gly Lys

325 330 335

Asp Lys Gln Ile Gln Glu Ser Asp Ile Ile Asn Leu Pro Tyr Leu Gln

340 345 350

Ala Ile Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Thr Val Phe Leu

355 360 365

Leu Pro Arg Lys Ala Asp Thr Asp Val Glu Leu Tyr Gly Tyr Ile Val

370 375 380

Pro Lys Asp Ala Gln Ile Leu Val Asn Leu Trp Ala Ile Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Asn Ala Trp Gln Asn Ala Asp Ile Phe Ser Pro Glu Arg Phe Ile

405 410 415

Gly Cys Glu Ile Asp Val Lys Gly Arg Asp Phe Gly Leu Leu Pro Phe

420 425 430

Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Met Asn Leu Ala Ile Arg Met

435 440 445

Leu Thr Leu Met Leu Ala Thr Leu Leu Gln Phe Phe Asn Trp Lys Leu

450 455 460

Glu Gly Asp Ile Ser Pro Lys Asp Leu Asp Met Asp Glu Lys Phe Gly

465 470 475 480

Ile Ala Leu Gln Lys Thr Lys Pro Leu Lys Leu Ile Pro Ile Pro Arg

485 490 495

Tyr

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Met Met Asn Gly Glu Asp Ala Asn Asp Gln Met Ile Lys Glu

1 5 10 15

Ser Phe Phe Ile Thr His Gly Asn Pro Ile Leu Thr Val Glu Asp Thr

20 25 30

His Pro Leu Arg Pro Phe Phe Glu Thr Trp Arg Glu Lys Ile Phe Ser

35 40 45

Lys Lys Pro Lys Ala Ile Leu Ile Ile Ser Gly His Trp Glu Thr Val

50 55 60

Lys Pro Thr Val Asn Ala Val His Ile Asn Asp Thr Ile His Asp Phe

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Pro Ala Ala Met Tyr Gln Phe Lys Tyr Pro Ala Pro Gly

85 90 95

Glu Pro Glu Leu Ala Arg Lys Val Glu Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gly

100 105 110

Phe Glu Thr Ala Glu Thr Asp Gln Lys Arg Gly Leu Asp His Gly Ala

115 120 125

Trp Val Pro Leu Met Leu Met Tyr Pro Glu Ala Asp Ile Pro Val Cys

130 135 140

Gln Leu Ser Val Gln Pro His Leu Asp Gly Thr Tyr His Tyr Asn Leu

145 150 155 160

Gly Arg Ala Leu Ala Pro Leu Lys Asn Asp Gly Val Leu Ile Ile Gly

165 170 175

Ser Gly Ser Ala Thr His Pro Leu Asp Glu Thr Pro His Tyr Phe Asp

180 185 190

Gly Val Ala Pro Trp Ala Ala Ala Phe Asp Ser Trp Leu Arg Lys Ala

195 200 205

Leu Ile Asn Gly Arg Phe Glu Glu Val Asn Ile Tyr Glu Ser Lys Ala

210 215 220

Pro Asn Trp Lys Leu Ala His Pro Phe Pro Glu His Phe Tyr Pro Leu

225 230 235 240

His Val Val Leu Gly Ala Ala Gly Glu Lys Trp Lys Ala Glu Leu Ile

245 250 255

His Ser Ser Trp Asp His Gly Thr Leu Cys His Gly Ser Tyr Lys Phe

260 265 270

Thr Ser Ala

275

<210> 3

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Ala Ile Lys Met Asn Thr Asn Gly Glu Gly Glu Thr Gln His

1 5 10 15

Ile Leu Met Ile Pro Phe Met Ala Gln Gly His Leu Arg Pro Phe Leu

20 25 30

Glu Leu Ala Met Phe Leu Tyr Lys Arg Ser His Val Ile Ile Thr Leu

35 40 45

Leu Thr Thr Pro Leu Asn Ala Gly Phe Leu Arg His Leu Leu His His

50 55 60

His Ser Tyr Ser Ser Ser Gly Ile Arg Ile Val Glu Leu Pro Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Asn His Gly Leu Pro Pro Gly Ile Glu Asn Thr Asp Lys Leu

85 90 95

Thr Leu Pro Leu Val Val Ser Leu Phe His Ser Thr Ile Ser Leu Asp

100 105 110

Pro His Leu Arg Asp Tyr Ile Ser Arg His Phe Ser Pro Ala Arg Pro

115 120 125

Pro Leu Cys Val Ile His Asp Val Phe Leu Gly Trp Val Asp Gln Val

130 135 140

Ala Lys Asp Val Gly Ser Thr Gly Val Val Phe Thr Thr Gly Gly Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Thr Ser Ala Tyr Val Ser Ile Trp Asn Asp Leu Pro His Gln

165 170 175

Asn Tyr Ser Asp Asp Gln Glu Phe Pro Leu Pro Gly Phe Pro Glu Asn

180 185 190

His Lys Phe Arg Arg Ser Gln Leu His Arg Phe Leu Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Gly Ser Asp Asp Trp Ser Lys Tyr Phe Gln Pro Gln Leu Arg Gln Ser

210 215 220

Met Lys Ser Phe Gly Trp Leu Cys Asn Ser Val Glu Glu Ile Glu Thr

225 230 235 240

Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Thr Lys Leu Pro Ile Trp Gly

245 250 255

Ile Gly Pro Leu Ile Ala Ser Pro Val Gln His Ser Ser Ser Asp Asn

260 265 270

Asn Ser Thr Gly Ala Glu Phe Val Gln Trp Leu Ser Leu Lys Glu Pro

275 280 285

Asp Ser Val Leu Tyr Ile Ser Phe Gly Ser Gln Asn Thr Ile Ser Pro

290 295 300

Thr Gln Met Met Glu Leu Ala Ala Gly Leu Glu Ser Ser Glu Lys Pro

305 310 315 320

Phe Leu Trp Val Ile Arg Ala Pro Phe Gly Phe Asp Ile Asn Glu Glu

325 330 335

Met Arg Pro Glu Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg Met Lys Val

340 345 350

Lys Lys Gln Gly Lys Leu Val Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Leu Glu Ile

355 360 365

Leu Asn His Glu Ser Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn

370 375 380

Ser Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Gly Val Pro Met Leu Gly Trp Pro

385 390 395 400

Leu Ala Ala Glu Gln Ala Tyr Asn Leu Lys Tyr Leu Glu Asp Glu Met

405 410 415

Gly Val Ala Val Glu Leu Ala Arg Gly Leu Glu Gly Glu Ile Ser Lys

420 425 430

Glu Lys Val Lys Arg Ile Val Glu Met Ile Leu Glu Arg Asn Glu Gly

435 440 445

Ser Lys Gly Trp Glu Met Lys Asn Arg Ala Val Glu Met Gly Lys Lys

450 455 460

Leu Lys Asp Ala Val Asn Glu Glu Lys Glu Leu Lys Gly Ser Ser Val

465 470 475 480

Lys Ala Ile Asp Asp Phe Leu Asp Ala Val Met Gln Ala Lys Leu Glu

485 490 495

Pro Ser Leu Gln

500

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 5

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggatcatg cgaccctcgc catgatcctc gcgatctggt tcatcagctt ccacttcatc 60

aagctgctgt tctcccagca gaccaccaag ctgcttccgc caggaccaaa gccgcttccg 120

atcatcggca acatccttga ggtgggcaag aagccgcatc ggtccttcgc caacctcgcc 180

aagattcacg gcccactcat ttccctcaga ctcggctctg tgaccaccat cgttgtgtcc 240

tctgccgacg tggccaaaga gatgttcctc aagaaggatc acccgctctc caaccgcacg 300

atcccgaata gtgttacagc cggcgaccac cacaagctca ccatgtcttg gctcccggtg 360

tctccgaagt ggcgcaactt ccgcaagatt accgccgtgc atctgctctc cccacagaga 420

ctcgatgcct gccagacatt caggcacgcc aaggtgcagc agctctacga gtacgttcaa 480

gagtgcgccc agaaaggcca ggccgtggat attggcaagg ccgcctttac gaccagcctc 540

aacctcctca gcaagctgtt cttcagcgtc gagctggcgc accacaagtc ccataccagc 600

caagagttca aagagctgat ctggaacatc atggaagata taggcaagcc gaactacgcc 660

gactacttcc cgattctcgg ctgcgttgac ccatctggca ttagaagaag gctcgcctgc 720

tccttcgaca agctgatcgc cgtgttccag ggcatcatct gcgagagact cgccccagat 780

tcctccacca caactaccac caccaccgac gacgtgctcg atgtgctcct ccagctgttc 840

aagcagaacg agctgacgat gggcgagatc aaccacctcc tcgtggacat cttcgacgcc 900

ggcaccgata ccacatcctc cacattcgag tgggtgatga ccgagctgat ccgcaatcca 960

gagatgatgg aaaaggccca agaggaaatc aagcaggtcc tcggcaagga caagcagatc 1020

caagagtccg acatcatcaa cctgccgtac ctccaggcga tcatcaaaga gacactccgc 1080

ctccatccgc cgaccgtgtt cttgctccca agaaaggccg acaccgatgt cgagctgtac 1140

ggctacatcg tgccgaagga tgcccagatc ctcgtgaacc tctgggccat tggcagggac 1200

ccaaacgcct ggcagaacgc cgatattttc agcccagagc gcttcatcgg ctgcgagatc 1260

gatgttaagg gccgcgattt cggcctcctt ccatttggcg ctggccgcag aatttgccca 1320

ggcatgaatc tcgccatcag gatgctcacc ctcatgctcg ccacactcct ccagttcttc 1380

aactggaagc tcgaaggcga catctccccg aaggacctcg acatggacga gaagttcggc 1440

attgcgctcc aaaagaccaa gccgctcaag ctcatcccga ttccgcgcta c 1491

<210> 6

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagatgatga acggcgagga cgccaacgac cagatgatca aagagtcctt cttcatcacc 60

cacggcaacc cgatcctcac cgtcgaggat acacatccgc tcaggccgtt cttcgagaca 120

tggcgcgaga agattttctc caagaagccg aaggccatcc tcatcatctc cggccactgg 180

gagacagtga agccaaccgt gaacgccgtg cacatcaacg acaccatcca cgacttcgac 240

gactacccag ccgccatgta ccagttcaag tacccagctc caggcgagcc agagcttgcg 300

agaaaggtgg aagagatcct caagaagtcc gggttcgaga cagccgagac agaccaaaag 360

aggggccttg atcacggcgc ctgggttcca ctcatgctca tgtatccaga ggcggacatc 420

ccggtgtgcc agctctcagt tcagccacat ctcgacggca cctaccacta caatctcggc 480

agagccctcg cgccgctcaa gaatgatggc gtgctcatta ttggctccgg cagcgccaca 540

catccactcg atgagacacc gcactacttc gatggtgttg ccccttgggc cgctgccttc 600

gattcttggc ttaggaaggc cctcatcaac ggccgcttcg aggaagtgaa catctacgag 660

agcaaggccc cgaactggaa gctcgcccat ccatttccag agcacttcta cccgctccac 720

gttgtgctcg gcgctgctgg tgaaaagtgg aaggccgagc tgatccactc ctcctgggat 780

catggcacac tttgccacgg ctcctacaag ttcacctccg cc 822

<210> 7

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accgccatca agatgaacac caacggcgag ggcgagacac agcacatcct catgatcccg 60

ttcatggcgc agggccacct caggccattt ctcgaactcg ccatgttcct ctacaagcgc 120

tcccacgtga tcatcaccct gctcacaact ccgctcaacg ccggcttcct caggcacctc 180

cttcaccacc attcctactc ctccagcggc atcaggatcg tcgagctgcc attcaactcc 240

accaaccacg gactcccacc gggcatcgag aacaccgata agctcacact cccgctcgtg 300

gtgtccctct tccattccac catcagcctc gatccgcacc tccgcgatta catctccagg 360

catttcagcc cagccaggcc accactctgc gtgatccatg atgtgttcct cggctgggtt 420

gaccaggtgg ccaaggatgt gggctctaca ggcgtggtgt tcacaacagg cggcgcttat 480

ggcacatccg cctacgtgtc catctggaac gatctcccgc accagaacta ctccgacgac 540

caagagttcc cgctgccagg cttcccagag aaccataagt tccgcaggtc ccagctccat 600

cggttcctca gatatgccga cggctccgac gattggtcca agtatttcca gccgcagctc 660

cgccagtcca tgaagtcttt tggctggctc tgcaactccg tggaagagat cgagacactc 720

ggcttctcca tcctccgcaa ctacaccaag ctgccgatct ggggcatcgg cccacttatt 780

gcttccccag tgcagcactc ctcctccgac aacaattcaa caggcgccga gttcgtgcag 840

tggctcagcc tcaaagagcc ggactccgtc ctctacatct ccttcggctc ccagaacacg 900

atcagcccga cgcagatgat ggaactcgct gctggccttg agtcctccga gaagccattc 960

ctctgggtga tcagagcccc gttcggcttc gacatcaacg aagagatgcg cccagagtgg 1020

ctgccagagg gctttgagga acgcatgaag gtgaagaaac agggcaagct cgtgtacaag 1080

ctcggcccgc agcttgagat cctcaaccat gaatccatcg gcggctttct cacccactgc 1140

ggatggaaca gcatccttga gtctcttcgc gagggcgttc cgatgcttgg atggccactt 1200

gctgccgagc aggcctacaa cctcaagtac ctcgaagatg agatgggcgt cgcggttgag 1260

cttgctagag gcctcgaagg cgagatctcc aaagagaagg tcaagcgcat cgtcgagatg 1320

atccttgagc gcaacgaggg ctccaaaggc tgggagatga agaatcgcgc cgtggaaatg 1380

ggcaaaaagc tcaaggacgc cgtgaacgag gaaaaagagc tgaagggctc ctccgtgaag 1440

gcgatcgacg atttcctcga cgccgtcatg caggccaaac ttgagccaag cctccag 1497

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtagcggag ctaccaattt tagcctcctt aagcaggcag gtgatgtaga agagaacccc 60

gggcct 66

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatccggag caaccaactt tagcctgctc aagcaagcag gagatgttga ggaaaatcct 60

ggcccc 66

<210> 10

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atatgaagat gaagatgaaa tatttggtgt gtcaaataaa aaggttgtgt gcttaagttt 60

gtgttttttt cttggcttgt tgtgttatga atttgtggct ttttctaata ttaaatgaat 120

gtaacatctc attataatga ataaacaaat gtttctataa tccattgtga atgttttgtt 180

ggatctcttc tccagcatat aactactgta tgtgctatgg tatggactat ggaatatgat 240

taaagataag 250

<210> 11

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 60

attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 120

ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 180

caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg g 231

<210> 12

<211> 2916

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 12

atgtccaaca tgcatgcgtc tatatatggt atatatgagt gtggtcatgt aactatggtg 60

agaaaaattg aggttgaggg caaattcaag cctgacagaa aagttccaaa gagcattgag 120

tcggataatg cagaaggaga aattggaaga agaggccaga gcaagatgac gttttcatgg 180

gaccctaaat tcttttgtct acattgtaat attcatattt ttgccattat cgatagtgta 240

aacaagattg ctgatggtga tccatccaag gaccacaata ttcctcgtct aaccaaaggg 300

accatcaata cactatgtaa catgcatata gagtagatta atagtatagc cgatacactt 360

gtataacttg tatttttctt ccagcttagt catgagtcta ggctctatta aactgaattt 420

taggaccatt tgaattaaca aaagaaaatg tatggaccat tctattatac caagcatgca 480

taaataatga gtctatagaa tcgtttgatt tcgaagttat ctttacgtaa gaaacatttg 540

attctcgtcc aagctaagta agtttatgca cacctgatct ttaaaacggt tatgtagtgc 600

tagttaaaga aaatttgaac tagattgaat ttttgctatt gaataagtat ctttcgttta 660

cctaattaat aaaatatgta tatattgaaa ctagctagcg ttttagttta gcacaaattt 720

tgtgtttact agaactagct agagatacat gcatgcagaa agataattat attagtttca 780

aatatcatat tccaatatat tgattttctc acgtataatt agaatatttt tttggtttta 840

attagaaatt atttgcttac tataaggatt gtaaaagaaa ttgaacatgt catgattata 900

tgtaagtgga gtactaacgt aaataatagg aatgatacat gaaaaaatgg cattttaatt 960

aaatcttgtt gataaagtca ttcatctctt gaccataata aggtttttat ttgattggag 1020

caaacaaaac atttgggtct atgtagtaat aatatgcatc caagtcaagc gtatatacag 1080

tttatttttc gattaaataa tacccagaaa gcaagttaat atagttaaaa catttacgtt 1140

ggatatcgtt tacgtcttaa tcaattgtgt ctgtgtgaaa tggtatccat aataaggtca 1200

aacgttaatc gatgagatga ggtttagcat gcaatgcatc attaaattta cagcttaaac 1260

taccatgcgc atatatacat ttctgactaa aataagtcac attaaaataa catttaagtc 1320

ccaatatttc tcttcctctt tacctataaa gtataaacta tatacatata tatacaaaaa 1380

tatttcatcc ttaggatttt tttagtaatg atatctcgta tttttataat ttttgattct 1440

atatgcatat tattttaaga tatcatagaa gtaattttgg ttcatatctg ttagtaacta 1500

gtttatagaa tctattgaac aaaacgaaat atcagctatt taatcagccg tacatttata 1560

agtaaatgtg atgttgttgc gtccagtata aaatccaatc tagatttaaa tgatccataa 1620

ttagttgctt tgaagaatat ggcttcgcat aaaatatgtt aaatattgat attgcaacct 1680

tatagagatc ataggggaag tggaggtcgg ctgcattagt tgacatttaa cgaaggagtg 1740

gcaagtcaaa ttacattttc cacatatcca cttattaatt atgtgtttgg tgcaattctc 1800

attaattgtg cttgaatata tcatccctcc agctacctca aaatcaaagc gtagaagtag 1860

ttatcttttg attatgtatc tttctttctc acgaaaatgt aataatctat atggtatact 1920

ataatttatg ttggaaagaa gatgaatact tatgatggaa agaaggtcat ctaaaccttt 1980

gttaaagtaa acaatatttg attaattgat aatttaatga catgaatctt ctgtttccac 2040

ttacttgacc ccaacaaact ttcggtaaaa gatttaatta taacaattgt acgaatgtga 2100

atatgtgaat gtgatcatgg aagtcatgaa acacgtcaac gcatatatca tatactacaa 2160

tatagttagc ggatgttcgt tttagtgttt aaagacatgt ttagctttta catcctgaca 2220

tcaacactgt tttaatgttt tttgtactaa acatagaact gttttttttt ttaataaacg 2280

tacactatac acaacataat tgaattatat ttaacataat gcactattaa catatgttgc 2340

tcacgaaagt atcaaagtaa ttaaaatctt aaccataata tatagtaatc atgttggatc 2400

gcattatcgc atataaataa attcttagtg attataaagg gaaaaaaata gtcattaatt 2460

gtagaaagaa atttagtttg actaatagta aagaatctat ggcaaagatt tttccagtgg 2520

taatatttaa tatctccacc atttttccct tcttagacct actctactcc ctacactata 2580

cacatcacaa tacttcttct cttttctctc tctctcctcc cccattactt attgagaaac 2640

acacacacac aaatcctttc cttttctctc acgccttctc tctctctctc actcactctc 2700

gagcatttac accacctcat cttacgtggt ctctatataa tttccaactt ggtttcttgg 2760

tttttcccga gaaacaatca aaagaagacc ctaaaacagg acacttctta ggtgcatgtg 2820

tgtgtgatcg tcagagaaag ataaagacac tttcctcttc cttccttctt cttctttctt 2880

actctctctc tctctctttc gcttttatta gtcgac 2916

<210> 13

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtatcgata agcttgcagc cgacggtatc gcagccccct tttgtctccc ttttgtctcc 60

cttttgtctc ccttttgtct cccttttgtc tcccttttgt ctcccttttg tctccctttt 120

gtctcccttt tgtctccctt ttgtctccct tttgtctcct ttttgtctcc cttttgtctc 180

ccttttgtct cccttttgtc tcccttttgt ctccctgggc aggcctcgat aaggatcccc 240

gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggtatt tttacaacaa 300

ttaccaacaa caacaaacaa caaacaacat tacaattact atttacaatt aca 353

<210> 14

<211> 1756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accgccatca agatgaacac caacggcgag ggcgagacac agcacatcct catgatcccg 60

ttcatggcgc agggccacct caggccattt ctcgaactcg ccatgttcct ctacaagcgc 120

tcccacgtga tcatcaccct gctcacaact ccgctcaacg ccggcttcct caggcacctc 180

cttcaccacc attcctactc ctccagcggc atcaggatcg tcgagctgcc attcaactcc 240

accaaccacg gactcccacc gggcatcgag aacaccgata agctcacact cccgctcgtg 300

gtgtccctct tccattccac catcagcctc gatccgcacc tccgcgatta catctccagg 360

catttcagcc cagccaggcc accactctgc gtgatccatg atgtgttcct cggctgggtt 420

gaccaggtgg ccaaggatgt gggctctaca ggcgtggtgt tcacaacagg cggcgcttat 480

ggcacatccg cctacgtgtc catctggaac gatctcccgc accagaacta ctccgacgac 540

caagagttcc cgctgccagg cttcccagag aaccataagt tccgcaggtc ccagctccat 600

cggttcctca gatatgccga cggctccgac gattggtcca agtatttcca gccgcagctc 660

cgccagtcca tgaagtcttt tggctggctc tgcaactccg tggaagagat cgagacactc 720

ggcttctcca tcctccgcaa ctacaccaag ctgccgatct ggggcatcgg cccacttatt 780

gcttccccag tgcagcactc ctcctccgac aacaattcaa caggcgccga gttcgtgcag 840

tggctcagcc tcaaagagcc ggactccgtc ctctacatct ccttcggctc ccagaacacg 900

atcagcccga cgcagatgat ggaactcgct gctggccttg agtcctccga gaagccattc 960

ctctgggtga tcagagcccc gttcggcttc gacatcaacg aagagatgcg cccagagtgg 1020

ctgccagagg gctttgagga acgcatgaag gtgaagaaac agggcaagct cgtgtacaag 1080

ctcggcccgc agcttgagat cctcaaccat gaatccatcg gcggctttct cacccactgc 1140

ggatggaaca gcatccttga gtctcttcgc gagggcgttc cgatgcttgg atggccactt 1200

gctgccgagc aggcctacaa cctcaagtac ctcgaagatg agatgggcgt cgcggttgag 1260

cttgctagag gcctcgaagg cgagatctcc aaagagaagg tcaagcgcat cgtcgagatg 1320

atccttgagc gcaacgaggg ctccaaaggc tgggagatga agaatcgcgc cgtggaaatg 1380

ggcaaaaagc tcaaggacgc cgtgaacgag gaaaaagagc tgaagggctc ctccgtgaag 1440

gcgatcgacg atttcctcga cgccgtcatg caggccaaac ttgagccaag cctccagtga 1500

tagtgaatat gaagatgaag atgaaatatt tggtgtgtca aataaaaagg ttgtgtgctt 1560

aagtttgtgt ttttttcttg gcttgttgtg ttatgaattt gtggcttttt ctaatattaa 1620

atgaatgtaa catctcatta taatgaataa acaaatgttt ctataatcca ttgtgaatgt 1680

tttgttggat ctcttctcca gcatataact actgtatgtg ctatggtatg gactatggaa 1740

tatgattaaa gataag 1756

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cactgatagt ttaaactagt atggatcatg cgaccctcgc 40

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacctgcctg cttaaggagg ctaaaattgg tagctccgct accgtagcgc ggaatcggga 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccttaagcag gcaggtgatg tagaagagaa ccccgggcct atgaagatga tgaacggcga 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcctgcttg cttgagcagg ctaaagttgg ttgctccgga tccggcggag gtgaacttgt 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctcaagcaa gcaggagatg ttgaggaaaa tcctggcccc atgaccgcca tcaagatgaa 60

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctagcttac tcagttaggt cttatcttta atcatattcc 40

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtcaaaca ctgatagttt atgtccaaca tgcatgcg 38

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgcatgatcc atactagttt gtcgactaat aaaagcgaaa gagag 45

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taagggactg accacccggg gatccggtat cgataagctt gcagcc 46

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagcgctgaa gcttggctgc agtgtaattg taaatagtaa ttgtaatg 48

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cactgcagcc aagcttcagc gctgtagatc tccatggatc atgcgaccct cg 52

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgatcgggg aaattcgagc tggtcacctc actatcactg gaggcttg 48

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtagcggag ctaccaattt tagcctcctt aagcaggcag gtg 43

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccttaagcag gcaggtgatg tagaagagaa ccccgggcct 40

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggatccggag caaccaactt tagcctgctc aagcaagcag gag 43

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctcaagcaa gcaggagatg ttgaggaaaa tcctggcccc 40

Claims

1.一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统，其特征在于，所述无损监测报告系统为包括顺次设置待监测的DNA顺式元件、甜菜红素生物合成基因RUBY基因、终止子的载体。

2.根据权利要求1所述的无损筛选系统，其特征在于，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因；

所述DODA基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.2所示DODA1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述GT基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；优选的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求2所述的无损筛选系统，其特征在于，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接。

4.根据权利要求2所述的无损监测报告系统，其特征在于，所述DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列；

进一步优选的，所述DNA连接单元为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2。

5.根据权利要求1所述的无损监测报告系统，其特征在于，载体的骨架质粒为植物载体。

6.根据权利要求1所述的无损监测报告系统，其特征在于，所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子；

7.一种监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2)将待监测的DNA顺式元件连入RUBY-终止子片段之前，获得所述无损监测报告系统pDNA顺式元件-RUBY-终止子。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)的具体操作为：分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子片段；使用体外重叠延伸PCR的方法将CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因三种DNA分子通过DNA连接单元以任意顺序组合为RUBY基因，在RUBY基因之后连接终止子，获得RUBY基因-终止子片段；将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

9.权利要求1所述的监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统或权利要求7所述的监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统的构建方法在监测植物中DNA顺式元件表达模式中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采用所述监测DNA顺式元件在植物中表达模式的裸眼可视无损报告系统转化植物后，直接通过裸眼观察植物的哪些组织或者器官变成红色，确定待监测的DNA顺式元件的在植物中表达模式。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述DNA顺式元件的表达可以发生在各类植物整体或植物的部分，

优选的，所述植物为双子叶类植物和/或单子叶类植物，

进一步优选的，所述植物为拟南芥和/或水稻。