CN112852858B - 一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，本发明提供了一种链霉菌分泌型表达载体，所述链霉菌分泌型表达载体中包含如SEQ ID NO.1所示的序列，该表达载体具体为：将强启动子PA4以及特定的分泌信号肽与待表达目的基因N端融合，并插入至常规载体中构建得到重组质粒，可使目的基因表达并将表达的目的蛋白分泌至胞外，在重组菌株的发酵培养过程中，可以直接从发酵液中收集得到分泌表达的外源目的蛋白。所述载体的构建方法简单快速，并且可直接将目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了异源蛋白积累造成的细胞毒性。

Description

一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
蛋白类产品如酶类、血红蛋白、抗体等在日常生活中的需求庞大。天然来源的蛋白表达水平较低，严重限制了蛋白类产品的发展，而随着基因工程技术的兴起，异源表达系统的开发有效提高了蛋白的产量，使得目前重组蛋白在化工、燃料、食品等领域已经具有了较高的市场占有率，尤其是生物医药类蛋白蕴含着具大的生产潜力和商业价值。
在表达异源蛋白时，选择合适的表达系统十分关键。大肠杆菌表达系统最早被开发且目前应用最为广泛，具有培养价格低、生长迅速、易操作、表达水平高等优点，其使用局限在于表达水平过高易形成包涵体以及缺少翻译后修饰。与原核表达系统相比，真核表达系统的种类更加丰富，包括酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫杆状病毒表达系统等。在表达特定来源如链霉菌属或古细菌的蛋白时，常用的大肠杆菌表达系统和酵母表达系统往往效果不佳。
革兰氏阳性菌链霉菌不仅是许多药用抗生素的产生菌，还可以分泌不同种类的蛋白，包括酶和酶的抑制剂，从而保证自身在环境中的竞争优势。链霉菌具有强大的分泌系统，较低的内源蛋白水解酶活性，极低的外源DNA修饰限制系统，培养条件完善，遗传操作方法成熟。此外，它还可以帮助异源蛋白翻译后的折叠，促进蛋白分泌到胞外，极低的内源毒性，可用于食品与药品的发酵，具有成为蛋白表达宿主菌的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用，将强启动子PA4以及特定的分泌信号肽融合至目的基因的N端，并插入至常规载体中构建得到重组质粒，即链霉菌分泌型表达载体，该载体可表达目的蛋白并将其分泌至胞外；将该重组质粒通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移或原生质体转化的方法导入变铅青链霉菌ZX1(Streptomyces lividans ZX1)中，获得重组菌株，对该重组菌株进行培养，从发酵液中即可收集得到分泌表达的外源目的蛋白，所述载体的构建方法简单快速，并且可直接将目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了异源蛋白积累造成的细胞毒性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种链霉菌分泌型表达载体，所述链霉菌分泌型表达载体中包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步的，所述链霉菌分泌型表达载体为：在载体pIJ8660的tfd基因后插入如SEQID NO.1所示的序列。
本发明还提供了一种遗传工程菌，所述遗传工程菌包含权利要求1所述的链霉菌分泌型表达载体。
本发明还提供了上述链霉菌分泌型表达载体或上述遗传工程菌在表达并分泌外源蛋白中的应用。
本发明还提供了上述链霉菌分泌型表达载体的构建方法，包括：
S1、扩增得到如SEQ ID NO.2所示的强启动子PA4基因片段，并将其与经过EcoRV和XbaI双酶切处理的载体pIJ8660连接，转化至感受态细胞并培养后，筛选阳性克隆；
S2、合成如SEQ ID NO.3所示的分泌信号肽基因片段，并将其与经过XbaI和NotI双酶切处理的步骤S1所述的阳性克隆连接，转化至感受态细胞并培养后，筛选阳性克隆；
S3、扩增外源目的基因，将步骤S2所述的阳性克隆经过KpnI和NotI双酶切处理后，与外源目的基因连接；
S4、将步骤S3连接完成后的质粒转化至感受态细胞中并筛选即得所述链霉菌分泌型表达载体。
进一步的，步骤S1中以链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158的总DNA为模板，使用如SEQ ID NO.5-6所示的引物进行PCR扩增，得到所述强启动子PA4基因片段。
进一步的，步骤S3中所述外源基因为如SEQ ID NO.4所示的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白基因片段。
进一步的，如SEQ ID NO.4所示的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白基因片段的扩增方法为：以载体pIJ8660为模板，使用如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到。
本发明还提供了一种外源蛋白的分泌表达方法，所述方法包括：按照上述构建方法构建得到表达载体，将所述表达载体转化至大肠杆菌中培养，然后导入至变铅青链霉菌ZX1中，得到可表达并分泌外源蛋白的重组菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种链霉菌分泌型表达载体，具体为：将强启动子PA4以及特定的分泌信号肽与待表达目的基因N端融合，并插入至常规载体中构建得到重组质粒，其利用强启动子PA4启动目的基因表达，并利用分泌信号肽使表达得到的外源蛋白分泌至胞外。且该载体为大肠杆菌-链霉菌双功能载体，该重组质粒可通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移或原生质体转化的方法导入变铅青链霉菌ZX1(Streptomyces lividans ZX1)中，从而获得重组菌株，在重组菌株的发酵培养过程中，可以直接从发酵液中收集得到分泌表达的外源目的蛋白。所述载体的构建方法简单快速，并且可直接将目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了异源蛋白积累造成的细胞毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1中商业化载体载体pIJ8660的物理图谱；
图2为本发明实施例1中构建得到的绿色荧光蛋白分泌表达质粒pSe-eGFP的物理图谱；
图3为本发明实施例1中重组菌株ZX1::pSe-eGFP发酵液的SDS-PAGE检测结果图；
图4为本发明实施例1中重组菌株ZX1::pSe-eGFP发酵液的Western-blot检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1链霉菌分泌型表达载体的构建及验证
本实施例以绿色荧光蛋白作为外源目的蛋白，进行表达载体的构建和验证。
1、构建绿色荧光蛋白分泌表达载体
(1)以链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158的总DNA为模板，利用如SEQID NO.5-6所示的引物PA4u和PA4d进行常规PCR扩增，其中引物信息具体为：
PA4u：aaagatatcGCTCCCTCGCGCCGTGACC(如SEQ ID NO.5所示)
PA4d：aaatctagaggatccGCGCCCAGCGCTTCCGTGTCGA(如SEQ ID NO.6所示)
(2)PCR扩增产物跑胶回收后用EcoRV和XbaI双酶切，获得如SEQ ID NO.2所示的强启动PA4片段，并与经过EcoRV和XbaI双酶切处理的载体pIJ8660(链霉菌荧光表达载体，来源于文献Sun J,Kelemen GH,Fernández-Abalos JM,Bibb MJ.(1999).fluorescentprotein as a reporter for spatial and temporal gene expression inStreptomyces coelicolor A3(2).Microbiology(Reading).145:2221-2227，其图谱如附图1所示)连接，常规方法转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞中后涂布于含阿伯拉霉素的LB固体平板中，37℃过夜培养。然后提取转化子的质粒DNA，并用EcoRV和XbaI双酶切筛选正确的阳性克隆。
(3)人工合成获得分泌信号肽序列SE片段，其是以来自委内瑞拉链霉菌中的枯草蛋白酶抑制剂基因的分泌信号肽(Van Mellaert L,Lammertyn E,Schacht S,Proost P,Van Damme J,Wroblowski B,Ann é J,Scarcez T,Sablon E,Raeymaeckers J,VanBroekhoven A.(1998).Molecular characterization of a novel subtilisininhibitor protein produced by Streptomyces venezuelae CBS762.70.DNA Seq.9:19-30.)为模板，经过氨基酸突变和密码子优化设计而成的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(4)将步骤(2)中的质粒DNA用XbaI和NotI双酶切处理后，与步骤(3)中合成的分泌信号肽SE片段连接，常规方法转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞中后涂布于含阿伯拉霉素的LB固体平板中，37℃过夜培养。然后提取转化子的质粒DNA，并用XbaI和NotI双酶切筛选正确的阳性克隆。
(5)以质粒pIJ8660为模板，使用如SEQ ID NO.7-8所示的引物eGFPu和eGFPd进行常规PCR扩增，得到C端融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白基因片段(其核苷酸序列如SEQID NO.4所示)，作为外源目的基因，其中引物信息具体为：
eGFPu:aaaggtaccgCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(如SEQ ID NO.7所示)；eGFPd:aaagcggccgctTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG(如SEQ ID NO.8所示)。
(6)将步骤(4)的阳性克隆经过KpnI和NotI双酶切处理后，与步骤(5)扩增得到的绿色荧光蛋白基因片段(SEQ ID NO.4)连接，即构建得到重组质粒。
(7)将上述重组质粒转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞中，涂布于含阿伯拉霉素的LB固体平板中，37℃过夜培养，筛选验证得到正确的阳性克隆，并进行测序分析，测序正确的重组质粒即为绿色荧光蛋白分泌表达质粒pSe-eGFP，其图谱如图2所示。
其中，LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，加蒸馏水至1L，pH 7.0，用于大肠杆菌培养。
大肠杆菌培养方法：在LB培养基中，200转/分，37℃摇床过夜培养。
大肠杆菌转化方法：将500μL过夜培养物转接到新鲜的50mL LB中，37℃摇床培养至OD600＝0.5-0.6时，放置在冰上预冷培养物20分钟。在4℃下5000转/分离心5分钟。弃去上清液，加15mL的TFBI溶液，在冰上打散菌体沉淀，在4℃下5000转/分离心5分钟。弃去上清液，加2mL的TFBII溶液，冰上轻柔打散菌体。每100μL感受态细胞加入5μL酶连产物，混合均匀，冰上静置30分钟，37℃热激2分钟，然后冰上放置5分钟，加入900μL的新鲜LB培养基，在37℃摇床上培养0.5-1小时，均匀涂布于。5000转/分离心2分钟，去掉大部分上清。将培养物涂布于含阿伯拉霉素的LB固体平板中，37℃培养过夜。
2、构建绿色荧光蛋白分泌表达菌株
(1)将含有pSe-eGFP质粒的大肠杆菌菌株S17-1接种于5mL含有50μg/mL阿伯拉霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。取0.5mL过夜培养物转接到含有50μg/mL阿伯拉霉素的新鲜LB培养基中，37℃摇床培养至2-3小时，直至大肠杆菌菌体的浓度达到OD600约为0.5-0.6。收集其中培养物，5000转/分离心3分钟。然后用新鲜的LB培养基清洗菌体三次，最终用十分之一体积的新鲜LB培养基悬浮菌体。
(2)取100μL新鲜的变铅青链霉菌ZX1孢子，先用TSB培养基清洗三次，然后悬浮在新鲜的TSB培养基中，放入50℃水浴锅中热激10分钟。
(3)大肠杆菌-链霉菌接合转移：将步骤(1)中的大肠杆菌菌液和步骤(2)中的变铅青链霉菌ZX1孢子液按照供体:受体＝1:1000的比例混合均匀，涂布在含有MISP-4培养基的平板上，30℃培养13-20小时后，使用1mL含有1mg阿伯拉霉素和0.8mg萘啶酮酸的无菌水均匀覆盖平板表面。吹干平板表面的水分后，再放入30℃培养箱中恒温倒置培养3-5天，直至含有绿色荧光蛋白分泌表达质粒pSe-eGFP的重组菌株ZX1::pSe-eGFP生长起来。
其中，TSB培养基：胰蛋白胨大豆乳粉(Oxoid)30g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌20分钟，用于链霉菌的培养。
MISP-4培养基：可溶性淀粉10g、磷酸一氢钾1g、氯化钠1g、硫酸铵2g、碳酸钙2g、酵母提取物0.5g、蛋白胨1g、无机盐溶液1mL、琼脂20g，加蒸馏水至1L，用于接合转移实验。
3、外源目的蛋白绿色荧光蛋白的检测
(1)取绿色荧光蛋白分泌表达重组菌株ZX1::pSe-eGFP的孢子悬液50μL，接到50mL的YEME培养基中，30℃摇床培养36-48小时。5000转/分离心20分钟，收集发酵液上清。
其中，YEME培养基：酵母提取物3g，蛋白胨5g，麦芽提取物3g，葡萄糖10g，蔗糖340g，加蒸馏水至1L，高压灭菌后加入2mL的2.5M MgCl2和25mL的20％甘氨酸，用于链霉菌培养。
(2)向发酵液上清中加入TCA至终浓度为20％，用以沉淀蛋白，4℃静置30-60分钟，12000转/分离心10分钟，倒掉上清，并用预冷的丙酮清洗管壁，12000转/分离心10分钟，重复清洗两次。倒掉丙酮，再用移液器吸走管中残留的丙酮，放置在37℃培养箱中烘干沉淀，最后用1×loading buffer溶解蛋白，煮沸10分钟后离心，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测，用于检测发酵液中是否存在分泌至胞外的目的蛋白绿色荧光蛋白，并以不含有重重组质粒pSe-eGFP的变铅青链霉菌ZX1孢子发酵液作为空白对照(CK)。
其中，SDS-PAGE凝胶电泳条件：15％分离胶，80v恒压电泳至指示带跑出SDS-PAGE凝胶，检测结果如图3所示。
Western blot条件：按照合适大小剪切硝酸纤维素膜，提前2小时放置于蒸馏水中，然后在转移液中浸泡20分钟。按照特定次序将海绵垫、滤纸、SDS-PAGE胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵垫叠放在一起，避免气泡，放入转移夹子，至于转移槽槽中，加满转移液，在300mA电流下转移1小时或200mA电流下转移2小时。转膜完成后，用TBS浸湿膜，移至含有封闭液的平皿中，室温下封闭1小时。将一抗用封闭液稀释至适当浓度，加到硝酸纤维素膜上，室温下孵育1小时。在室温下用TBST洗涤硝酸纤维素膜2次，每次10分钟。按照相同方法准备二抗稀释液，加到硝酸纤维素膜上，室温下孵育1小时后，用TBST清洗2次后，用TBS浸泡膜。最后将等体积混合好的显色液完全浸润硝酸纤维素膜，化学发光检测信号，检测结果如图4所示。
根据图3和图4的检测结果，其中在重组菌株ZX1::pSe-eGFP的发酵液中均可检测到外源目的蛋白绿色荧光蛋白，说明采用本发明所述的表达载体，可成功表达外源目的蛋白，并成功将其分泌到胞外。
综上所述，将如SEQ ID NO.2所示的强启动子PA4以及SEQ ID NO.3所示的分泌信号肽融合至待表达的目的基因的N端，并插入至常规载体中构建得到重组质粒，即可实现目的基因的表达，并且可将目的蛋白分泌至胞外。所述载体的构建方法简单快速，并且由于可直接将目的蛋白分泌至胞外，因此有利于目的蛋白的收集，避免了异源蛋白积累造成的细胞毒性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明中的序列信息具体如下：
SEQ ID NO.1：
GATATCgctccctcgcgccgtgacccgccgccgggaccagtaagagctgcgaacaaaaggggcgcccggctcgcggtgtccggcacgcacgctcgcggcgttgccgaaaggccctggtagctccgctacaaggaccttccggcgccttgcgatcgcacgcaccggacaccgcccgctgatcggaacccacttttgttcgcagctctaagcggcatttgaagtattgcgttgactccaatgttgcctgttggatgagcctttgaagtatgtgtcgtggtgtacatgccgacttggaggacagtggcatgagtcaacagagcgagctgcttcgccgactgcgccggctcccgggggagcgccgggacgcgctgttggctcagctggaggatgtgtccgccggagcccggtccgcccccctgtcctaccggcaggagcagctgtggctgttcgaccggttcgcccccagcagcctggcctacgggctcggcttcgccctcccgatcgagggccggctcgacacggaagcgctgggcgcGGATCCTCTAGAAAGACTCCTCACCGCAGTCACCAACCGCATCGATCGAAGGAGAGTTCcatATGCGTCGCACCCTCCAGGCCGTGGGAGCAGCCGCGGCGGCGGCCACCTGCGTCCTCGCCGCGACGGCAGGCACCGCGCAGGCCGAGGCCggtaccgCCATGg
SEQ ID NO.2：
GATATCgctccctcgcgccgtgacccgccgccgggaccagtaagagctgcgaacaaaaggggcgcccggctcgcggtgtccggcacgcacgctcgcggcgttgccgaaaggccctggtagctccgctacaaggaccttccggcgccttgcgatcgcacgcaccggacaccgcccgctgatcggaacccacttttgttcgcagctctaagcggcatttgaagtattgcgttgactccaatgttgcctgttggatgagcctttgaagtatgtgtcgtggtgtacatgccgacttggaggacagtggcatgagtcaacagagcgagctgcttcgccgactgcgccggctcccgggggagcgccgggacgcgctgttggctcagctggaggatgtgtccgccggagcccggtccgcccccctgtcctaccggcaggagcagctgtggctgttcgaccggttcgcccccagcagcctggcctacgggctcggcttcgccctcccgatcgagggccggctcgacacggaagcgctgggcgcGGATCCTCTAGA
SEQ ID NO.3:
TCTAGAAAGACTCCTCACCGCAGTCACCAACCGCATCGATCGAAGGAGAGTTCcatATGCGTCGCACCCTCCAGGCCGTGGGAGCAGCCGCGGCGGCGGCCACCTGCGTCCTCGCCGCGACGGCAGGCACCGCGCAGGCCGAGGCCggtaccgCCATGg
SEQ ID NO.4:
CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCACCACCACCACCACCACTAAagcggccgc
SEQ ID NO.5：
aaagatatcGCTCCCTCGCGCCGTGACC
SEQ ID NO.6：
aaatctagaggatccGCGCCCAGCGCTTCCGTGTCGA
SEQ ID NO.7:
aaaggtaccgCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
SEQ ID NO.8:
aaagcggccgctTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatatcgctc cctcgcgccg tgacccgccg ccgggaccag taagagctgc gaacaaaagg 60
ggcgcccggc tcgcggtgtc cggcacgcac gctcgcggcg ttgccgaaag gccctggtag 120
ctccgctaca aggaccttcc ggcgccttgc gatcgcacgc accggacacc gcccgctgat 180
cggaacccac ttttgttcgc agctctaagc ggcatttgaa gtattgcgtt gactccaatg 240
ttgcctgttg gatgagcctt tgaagtatgt gtcgtggtgt acatgccgac ttggaggaca 300
gtggcatgag tcaacagagc gagctgcttc gccgactgcg ccggctcccg ggggagcgcc 360
gggacgcgct gttggctcag ctggaggatg tgtccgccgg agcccggtcc gcccccctgt 420
cctaccggca ggagcagctg tggctgttcg accggttcgc ccccagcagc ctggcctacg 480
ggctcggctt cgccctcccg atcgagggcc ggctcgacac ggaagcgctg ggcgcggatc 540
ctctagaaag actcctcacc gcagtcacca accgcatcga tcgaaggaga gttccatatg 600
cgtcgcaccc tccaggccgt gggagcagcc gcggcggcgg ccacctgcgt cctcgccgcg 660
acggcaggca ccgcgcaggc cgaggccggt accgccatgg 700
<210> 2
<211> 547
<212> DNA
<213> 链霉菌(Streptomyces sahachiroi)
<400> 2
gatatcgctc cctcgcgccg tgacccgccg ccgggaccag taagagctgc gaacaaaagg 60
ggcgcccggc tcgcggtgtc cggcacgcac gctcgcggcg ttgccgaaag gccctggtag 120
ctccgctaca aggaccttcc ggcgccttgc gatcgcacgc accggacacc gcccgctgat 180
cggaacccac ttttgttcgc agctctaagc ggcatttgaa gtattgcgtt gactccaatg 240
ttgcctgttg gatgagcctt tgaagtatgt gtcgtggtgt acatgccgac ttggaggaca 300
gtggcatgag tcaacagagc gagctgcttc gccgactgcg ccggctcccg ggggagcgcc 360
gggacgcgct gttggctcag ctggaggatg tgtccgccgg agcccggtcc gcccccctgt 420
cctaccggca ggagcagctg tggctgttcg accggttcgc ccccagcagc ctggcctacg 480
ggctcggctt cgccctcccg atcgagggcc ggctcgacac ggaagcgctg ggcgcggatc 540
ctctaga 547
<210> 3
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctagaaaga ctcctcaccg cagtcaccaa ccgcatcgat cgaaggagag ttccatatgc 60
gtcgcaccct ccaggccgtg ggagcagccg cggcggcggc cacctgcgtc ctcgccgcga 120
cggcaggcac cgcgcaggcc gaggccggta ccgccatgg 159
<210> 4
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 60
acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 120
acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 180
ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 240
agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 300
tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 360
tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 420
acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 480
acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 540
ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 600
actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 660
tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagc 720
accaccacca ccaccactaa agcggccgc 749
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagatatcg ctccctcgcg ccgtgacc 28
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatctagag gatccgcgcc cagcgcttcc gtgtcga 37
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaggtaccg ccatggtgag caagggcgag gag 33
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaagcggccg ctttagtggt ggtggtggtg gtgcttgtac agctcgtcca tgccgag 57

Claims (9)

1.一种链霉菌分泌型表达载体，其特征在于，所述链霉菌分泌型表达载体中包含如SEQID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种链霉菌分泌型表达载体，其特征在于，所述链霉菌分泌型表达载体为：在载体pIJ8660的tfd基因后插入如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌包含权利要求1所述的链霉菌分泌型表达载体。
4.权利要求1所述的链霉菌分泌型表达载体或权利要求3所述的遗传工程菌在表达并分泌外源蛋白中的应用。
5.一种权利要求1-2任一项所述的链霉菌分泌型表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
S1、扩增得到如SEQ ID NO.2所示的强启动子PA4基因片段，并将其与经过EcoRV和XbaI双酶切处理的载体pIJ8660连接，转化至感受态细胞并培养后，筛选阳性克隆；
S2、合成如SEQ ID NO.3所示的分泌信号肽基因片段，并将其与经过XbaI和NotI双酶切处理的步骤S1所述的阳性克隆连接，转化至感受态细胞并培养后，筛选阳性克隆；
S3、扩增外源目的基因，将步骤S2所述的阳性克隆经过KpnI和NotI双酶切处理后，与外源目的基因连接；
S4、将步骤S3连接完成后的质粒转化至感受态细胞中并筛选即得所述链霉菌分泌型表达载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中以链霉菌StreptomycessahachiroiATCC 33158的总DNA为模板，使用如SEQ ID NO.5-6所示的引物进行PCR扩增，得到所述强启动子PA4基因片段。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中所述外源目的基因为如SEQID NO.4所示的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白基因片段。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，如SEQ ID NO.4所示的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白基因片段的扩增方法为：以载体pIJ8660为模板，使用如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到。
9.一种外源蛋白的分泌表达方法，其特征在于，所述方法包括：按照如权利要求5所述的构建方法构建得到表达载体，将所述表达载体转化至大肠杆菌中培养，然后导入至变铅青链霉菌ZX1中，得到可表达并分泌外源蛋白的重组菌株。
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