CN102449145A - 能够在具有蜜二糖、水苏四糖和棉子糖的培养基中生长的酿酒酵母菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够分泌α-半乳糖苷酶到培养基中的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株，还涉及使用所述菌株获得α-半乳糖苷酶的方法和通过在富含半乳糖的培养基培养所述的菌株生产生物质和生物乙醇的方法。另一方面，本发明提供表达重组蛋白的方法，该方法使用富含半乳糖的组合物作为培养基用于生产所述蛋白的微生物。

Description

能够在具有蜜二糖、水苏四糖和棉子糖的培养基中生长的酿酒酵母菌株
技术领域
本发明涉及能够生产α-半乳糖苷酶的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。为了其更好地分泌，在α-半乳糖苷酶的基因上融合了信号序列。所述的菌株用于在富含棉子糖、蜜二糖和/或水苏四糖的培养基中生产α-半乳糖苷酶，生物质和乙醇的方法中，并且如果菌株含有表达具有治疗功能蛋白的二级构建体，则可以用于生产所述治疗蛋白。
背景技术
α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)催化半乳糖残基水解，该残基与半乳糖低聚糖和半乳糖甘露糖聚合物(带有半乳糖支链的甘露糖聚合物)通过α(1，6)糖苷键结合；也水解在豆子，大豆及其他豆类中存在的诸如水苏四糖，棉子糖和蜜二糖的低聚糖。
这些酶广泛地分布在动物，植物和微生物中。但是大多数单胃哺乳动物包括人类，缺乏胰腺α-半乳糖苷酶以至于这种类型的低聚糖不能在消化系统中消化，并通过肠道微生物群落发酵产生气体引起肠胃气胀和其他形式肠胃紊乱，可导致问题的严重性因个体敏感度而不同。大豆及其衍生产品具有特别的重要性，因为它们是许多人饮食的重要组成部分，基于它们是好的蛋白质的来源，在某些情况下可以用作乳制品的替代品，例如对于不能耐受乳糖的人群而言。有一些由来自不同来源(乳酸球菌(Lactococus)，曲霉菌(Aspergillusniger)，酵母(Saccharomyces)等)的α-半乳糖苷酶浓缩物构成的食品补充物，例如，诸如Promefarm(Sinaire)生产的片剂用于治疗这些紊乱。这些大豆制品以及其他制备的用于人和动物消耗的具有高含量的非消化性低聚糖如棉子糖，水苏四糖的产品用α-半乳糖苷酶的预处理，是很好的替代方法以避免这些肠胃问题。其进一步的贡献是增强其营养价值；这一点通常在动物营养中是非常重要的，因为对饲料能量的利用在增加。
在人体内，α-半乳糖苷酶是一种溶酶体的外切糖苷酶，在糖脂和糖蛋白的α-半乳糖基型末端残基上发生作用。这个基因的变异导致降解的缺乏，引起Fabry氏病(X-连锁溶酶体贮积病)。这种疾病的发病率为1/40,000。今天的治疗手段有，例如由美国健赞公司(Genzyme Corp.)开发的(Fabrazyme，β-半乳糖苷酶A静脉滴注剂)，其基于酶替代性技术通过将人类α-半乳糖苷酶在中国仓鼠卵巢细胞表达用于治疗该疾病。更有效降低成本的选择是将哺乳动物细胞用于异源蛋白的生产；人类α-半乳糖苷酶重组表达在酵母上的应用已经被研究。
另外，在红细胞的表面的糖蛋白杯型结构在许多其他功能中，决定了每一个个体的血型。O型血可以输给任何个体，因此它是最被需要的。O型血可以被通过使用能够加工α(1-3)型半乳糖键的α-半乳糖苷酶的B型血冒充。
α-半乳糖苷酶也被用于在工业水平上生产焦糖和糖类以去除棉子糖的存在，这将抑制焦糖的适当结晶，并因此改进了该生产。此外，糖蜜，该工业中的废产品具有很高的棉子糖和水苏四糖含量，意味着由于其具有很高的生物降解能力(BOD)不能被直接抛弃。这种生产该糖的酶或者有机体被用于降解这些糖并将这种降解与其他功能结合，例如生产乙醇或者生物质。进一步，糖蜜被广泛地作为基质，用于每年大约生产430000吨(干重)制造面包用的酿酒酵母(S.cerevisiae)。这种制备面包用的酵母菌株缺乏α-半乳糖苷酶，并且酿酒酵母菌株已经被开发用于制备面包，该类菌株是带有编码α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母变型葡萄汁酵母菌株(S.cerevisiae Var.uvarum)，目的在于提高这种生物质的生产(利尔耶施特勒姆-索米宁等；应用环境微生物学.1988年1月；第54卷第1期，第245-249页)(
Figure BPA00001469530300021
-Suominen et al.；Appl Environ Microbiol.1988 Jan；54(1)：245-249)。
就酵母来说，已经有文献记载了，α-半乳糖苷酶释放在半乳糖的末端的非还原残基，该残基是位于该底物的末端的位置而不是内部的残基()。除了水解活性外，α-半乳糖苷酶具有在高浓度单糖存在下，通过转糖基作用和反向水解合成低聚糖的能力()。酿酒酵母是研究最多的α-半乳糖苷酶来源之一以及其在生物技术上的应用是广泛的()。
考虑到这种酶的重要性和广泛的生物技术应用，有关于从细菌(bacteria)生产α-半乳糖苷酶的资料，所述细菌例如有嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)(美国专利号：3846239)，嗜热菌种(Thermussp.)菌株T2(西班牙专利号：2172380)，浅灰白链霉菌(Streptomycesgriseoloalbus)(Anisha et al.；Appl Biochem Biotechnol.2008 Sept 4)(Anisha等；生物化学生物技术应用.2008年9月4日)，然而考虑到这种酶具有的很多应用与涉及动物或人类食品的原料的加工或制备有关，必须是，这些将要被使用的微生物是GRAS(Generally Recognized As Safe，公认为安全的)，酿酒酵母就是例子。也有关于从真菌生产α-半乳糖苷酶的资料，所述真菌是链孢霉属(Neurospora)和根霉属(Rhizopus)(Worthington andBeuchat，J Agric Food Chem.1974；22(6)：1063-6)(沃辛顿和伯沙，食品农业化学杂志.1974年第22卷第6期第1063-6页)，米曲霉菌(Aspergillusoryzae)，臭曲霉菌(A.foetidus)(Liu et al.，Lett Appl Microbiol.2007Aug；45(2)：206-12)(刘等，生物工程与应用微生物.2007年8月第45卷第2期第206-12页)，无花果曲霉菌种(A.ficuum)(Zapater et al.，Prep Biochem.1990；20(3-4)：263-96)(萨帕特尔等，制备生物化学.1990年第20卷第3-4期第263-96页)和黑曲霉种(A.niger)(美国专利号6197566和5919690)，其中，然而真菌生产的主要的缺点之一是产生不想要的副产品。就在黑曲霉中生产α-半乳糖苷酶来说，大量的草酸产生。同样地，有关于生产非人类的α-半乳糖苷酶的资料，例如从融合不同信号序列的瓜尔豆植物存在的(Cyamopsis tetragonoloba)(Harmsen，M.et al.，Gene.1993 Mar 30；125(2)：115-23)(哈姆森，M.等，基因.1993年3月30日第125卷第2期第115-23页)。
关于在酵母中生产，美国专利4431737描述了一种变异的生产α-半乳糖苷酶的酿酒酵母菌株，该菌株通过紫外线照射的方法突变获得。通过用紫外线诱导处理突变得到的菌株的缺点是，由于嘧啶引物的构型导致了双螺旋结构的局部扭曲，干扰了正常互补碱基配对，从而使这种处理根本性改变了DNA；这反过来干扰复制和转录过程以及接下来的生长和呼吸。因此，除了能够具有其他不想要的突变外，因此突变的菌株也经常具有低生长率。有另外的专利(美国专利号：5055401)，其中用编码葡萄汁酵母菌(S.cerevisiae var.uvarum)的α-半乳糖苷酶基因转化的酵母菌株已经被构建得到(利尔耶施特勒姆-索米宁等，1988)(
Figure BPA00001469530300041
-Suominen et al.，1988)。从其他的酵母分泌进入培养基中的人类α-半乳糖苷酶已经生产得到，例如巴斯德毕赤酵母菌(Pichia Pastoris)(陈，Y.等，蛋白质表达和纯化.2000年12月；第20卷第3期第472-84页)(Chen，Y.et al.，Protein ExprPurif.2000 Dec；20(3)：472-84)。
因此，通过有效和改进的方式从酵母中生产和获得α-半乳糖苷酶是在生物技术上一个有特别兴趣的目标。
发明内容
本发明提供通过本发明的构建体转化的酿酒酵母菌株，在食品工业和生物技术公司有多种应用的由酵母产生的α-半乳糖苷酶的生产。α-半乳糖苷酶催化活性的开发有用的是，例如在生产甜菜糖和大豆加工过程中棉子糖的水解中；在酵母菌株对糖蜜的使用中，在研究Fabry疾病的治疗方法中，和作为使动物饮食中能量的利用最大化和治疗人类胃肠紊乱的食品补充剂。
因此，一方面，本发明涉及一种DNA构建体，包括：通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子，编码酵母中功能信号序列的序列，和编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的MEL1基因的片段或其功能等同变异体，其中序列(b)和(c)必须在相同阅读框内。
另一方面，本发明涉及一种DNA构建体，包含ADH2启动子或其功能等同变异体，编码酵母中功能信号序列和编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的基因片段或其功能等同变异体，其中信号序列和编码成熟形式的α-半乳糖苷酶基因必须在相同阅读框内。
另一方面，本发明涉及一种本发明的DNA构建体之一编码的蛋白。
另一方面，本发明涉及一种含有本发明DNA构建体的表达载体。
又另一方面，本发明涉及一种含有本发明构建体的微生物，本发明DNA构建体之一编码的蛋白，含有本发明DNA构建体之一的表达载体。
另一方面，本发明涉及一种生产α-半乳糖苷酶的方法，包含培养微生物和从培养基中回收分泌的α-半乳糖苷酶的步骤。
另一方面，本发明涉及一种获得细胞生物质的方法，包含步骤：在含有α-D-半乳糖的末端位置的非还原残基的基质上培养含有具有本发明的构建体的表达载体的微生物和回收细胞生物质。
另一方面，本发明涉及一种获得乙醇的方法，包括步骤：，在含有α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的基质上培养含有具有本发明的构建体的表达载体的微生物和回收所制备的乙醇。
另一方面，本发明涉及一种微生物，包含具有本发明构建体的表达载体且还具有编码目标蛋白的基因的二级构建体。
另一方面，本发明涉及一种获得蛋白的方法，包含步骤：在含有α-D-半乳糖的末端位置的非还原残基的基质上培养含有具有本发明的构建体表达载体且还具有编码目标蛋白的基因的二级构建体的微生物，和回收目标蛋白。
附图说明
图1显示含有编码酿酒酵母α-半乳糖苷酶的完整基因的分泌质粒转化的酿酒酵母菌株的600纳米吸收度测量值与细胞外、细胞内和总的α-半乳糖苷酶活性曲线。细胞外和细胞内的α-半乳糖苷酶活性测定是四个独立的测定结果。
图2显示含有编码酿酒酵母α-半乳糖苷酶的完整基因的分泌质粒转化的酿酒酵母菌株(黑色符号和实线)与含有在ADH1启动子下编码酿酒酵母α-半乳糖苷酶的基因转化的酿酒酵母菌株(白色符号和虚线)的细胞外和总的α-半乳糖苷酶活性比较测定。
图3显示含有编码酿酒酵母α-半乳糖苷酶的完整基因的分泌质粒转化的酿酒酵母菌株在含有2％的绵子糖的合成培养基中生长时的600纳米吸收度测量值和总的α-半乳糖苷酶活性曲线。上述600纳米吸收度值用来与相同菌株(除了没有用MEL1基因转化)的吸收度值进行比较。
具体实施方式
本发明的发明人已经研发了一种DNA构建体，该DNA构建体包括：通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子，与编码成熟形式的酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因融合在相同阅读框内的编码酵母中功能信号序列的序列。已经显示出，含有所述的构建体的酵母菌株以其活性形式分泌α-半乳糖苷酶到培养基中，使得该菌株具有使用于食品工业和生物技术公司的多种应用。由于这些特征，该菌株提供了一种现有技术所存在的问题的解决方案。
因此，在第一方面，本发明涉及一种DNA构建体，包含：
(a)通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子，
(b)编码酵母中功能信号序列的序列，和
(c)编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的MEL1基因的片段或其功能等同变异体，其中序列(b)和(c)必须在相同阅读框内。在下文中将之称为发明的一级构建体。
本发明的一级构建体的组成部分(a)是通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子。术语“葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子”指的是该目标基因是被启动子调节的基因不同于该目标基因本身，并且另一方面，它是指表达受葡萄糖阻遏作用的影响的启动子，以致于当培养基中葡萄糖的浓度开始增加时，α-半乳糖苷酶的表达将被抑制。
用于实施本发明的启动子包括例如：酿酒酵母甘油醛3-磷酸酯(GAP)脱氢酶启动子，半乳糖激酶(GAL1和GAL7)启动子和3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因启动子。一个优选的实施方式中，启动子是ADH2基因启动子，它的序列号是序列号(SEQ ID No.)：1。
本发明的一级构建体的组成部分(b)是编码酵母中功能信号序列的序列。
“酵母中功能信号序列”指的是能够促进任何蛋白分泌进入细胞外培养基中的肽，在具体的实施方式中，该蛋白为α-半乳糖苷酶。
在本发明环境中能够使用的信号序列的非限制示意性例子包括，酿酒酵母和来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)的其他种的α-因子信号序列，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)嗜杀毒素的信号序列，淀粉酶酵母菌(S.diastaticus)的葡萄糖淀粉酶II的信号序列，白假丝酵母(C.albicans)的葡萄糖淀粉酶的信号序列，酿酒酵母(S.cerevisiae)的磷酸酶的信号序列，酿酒酵母(S.cerevisiae)的128kDa的嗜杀毒素的信号序列，酿酒酵母(S.cerevisiae)的转化酶的信号序列，也可以是任何已知的能够在功能上替换大肠杆菌(E.coli)的信号序列的序列，如凯撒.C等描述的一样.(科学，1987年第235期第312-317卷)(Science，1987，235：312-317)，和使用本领域已知的方法能够鉴定的信号序列(例如Gallicioti，G.等.膜生物化学杂志，第183卷，第175-182页)(Gallicioti，G.et al.J.Membrane Biology，183：175-182)。
信号序列与α-半乳糖苷酶能够直接连接，或者它们可以选择通过在信号序列加工后连接到α-半乳糖苷酶上的间隔肽分开，这有助于α-半乳糖苷酶的鉴定或其从培养基中的提纯。在第一种情况下，事实上，任何可以识别肽或融合蛋白的肽或肽序列能够使用，例如通过单克隆抗体识别的肽序列，其能够通过免疫亲和色谱识别得到的融合蛋白；例如标记肽诸如c-myc，HA，E，FLAG和通常的任何其他被抗体识别的序列。在第二种情况下，事实上任何允许分离或提纯肽或者融合蛋白的肽或肽序列都能够使用，例如多组氨酸序列，被单克隆抗体识别的肽序列，有助于通过免疫亲和色谱纯化得到的融合蛋白，例如标记肽诸如c-myc，HA，E，FLAG等(抗体使用：实验室手册.E.哈洛和大卫莱恩(1999).冷泉港实验室出版社，纽约.章名：蛋白标记.第347-377页(UsingAntibodies：A laboratory manual.Ed Harlow and David Lane(1999).ColdSpring Harbor Laboratory Press.New Cork.Chapter：Tagging proteins.pp.347-377))和通常的任何其他可以被抗体识别的序列。该标记肽优选FLAG表位(序列号：2)，它与信号序列的C-末端相连，与α-半乳糖苷酶的N-末端相连，这样就使在移除信号序列后，FLAG表位形成带有α-半乳糖苷酶的N-末端。
在一种优选的实施方式中，DNA构建体可以包含编码酿酒酵母(S.cerevisiae)α-因子序列的序列(序列号：3)或者酿酒酵母(S.cerevisiae)MEL1基因的内源性信号序列，通过与编码α-半乳糖苷酶的序列在其3’端融合且在相同阅读框内。
本发明的一级DNA构建体的第三个组成部分(c)是编码成熟形式的α-半乳糖苷酶蛋白的MEL1基因片段(序列号：4)或其功能等同变异体。
鉴定为序列号：4的的序列的功能等同变异体理解为，由插入，缺失或取代一个或多个氨基酸产生的任何其他序列，其保持α-半乳糖苷酶活性。
测定α-半乳糖苷酶活性的方法在现有技术中是公知的。所述方法是基于测定酶水解具有通过α-糖苷键共轭结合到发色团/荧光团/化学发光团化合物上半乳糖的发色、荧光或者化学发光共轭体的能力，其中，所述化合物的释放可以通过检测被释放的荧光、确定波长的光密度或者化学发光来检测。发色化合物可以用做α-半乳糖苷酶的底物，用来按照邱和道格拉斯描述的方法(邱，O.M.和道格拉斯，H.C.，1976年)(Kew，O.M.and Douglas，H.C.，1976)测定其活性包括对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，其被水解后，产生强黄色的化合物，该化合物的形成是源于酶解反应一旦结束产生的pH的变化，其与底物的释放量是成比例的。
其他已知的α-半乳糖苷酶活性测定如下述那些文献中描述：1969年戴伊和普里德姆(戴伊，P.M.，普里德姆，J.B.，1969年，生物化学杂志第113卷，第49-55页)(Dey，P.M.，Pridham，J.B.，1969.Biochem.J.113，49-55)；1977年拉泽等(拉泽，P.S.，奥乔亚，A.G.，Gascon，S.，1977年.欧洲生物化学杂志第77卷第2期第375-382页)(Lazo，P.S.，Ochoa，A.G.，Gascon，S.，1977.Eur.J.Biochem.77(2)：375-382)；1998年赖安等(赖安，M.P.，琼斯，R.，摩尔斯，R.H.，1998年，分子和细胞生物学第18卷第4期第1774-82页)(Ryan，M.P.，Jones，R.，Morse，R.H.，1998.Mol Cell Biol 18(4)：1774-82)；2004加洛斯等(加洛斯MS，拉莫斯GF，吉奥里亚GS.，2004年.食品微生物学杂志，第21卷第511-8页)(Garroa MS，Valdeza GF，Gioria GS.，2004.FoodMicrobiol 21：511-8.)；2007年刘等(刘，C.，阮，阿屋斯，沈，阿屋斯，陈，Q.，周，B.，Li，Y.，何，G.，2007年，食品科学杂志第72卷第4期：M120-M125)(Liu，C.，Ruan，HOURS.，Shen，HOURS.，Chen，Q.，Zhou，B.，Li，Y.，He，G.，2007.J Food Sci 72(4)：M120-M125)的文献。
进行α-半乳糖苷酶测定的合适条件在现有技术中是广为知道的，例如，马尼阿蒂斯等的(分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1982))(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982))文献。
在第二方面，本发明涉及一种DNA构建体，包含：
(a)ADH2启动子或者其功能等同变异体，
(b)编码酵母中功能信号序列的序列，和
(c)编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的基因片段或其功能等同变异体，其中序列(b)和(c)必须在相同的阅读框内。
ADH2启动子是乙醇脱氢酶II基因的启动子并易受代谢产物抑制的影响。
术语“酵母中功能信号序列”在第一方面中已经定义，以同样的方式应用在这种情况下。在一个优选的实施方式中，该信号序列是MEL1基因的内源性信号序列或者是酵母α-因子的信号序列。
成熟形式的α-半乳糖苷酶可能相当于任何在动物，植物和微生物中存在的α-半乳糖苷酶。术语“功能等同变异体”应用的标准与在第一方面中的一样。优选的实施方式可以是其中编码α-半乳糖苷酶蛋白的基因为MEL1基因的实施方式。
另外，在另一方面本发明涉及一种之前定义的构建体编码的蛋白和含有所述构建体的表达载体。
本发明的DNA构建体之一产生的蛋白，包含酵母中的功能信号序列和α-半乳糖苷酶，融合在一起，从而该信号序列的C-末端与α-半乳糖苷酶的N-末端融合在一起。
术语“表达载体”指的是复制型DNA构建体，用于表达编码本发明多肽或者本发明的融合蛋白的DNA，它包含转录单元，该转录单元包括下述序列的组装：(1)遗传因子，在基因表达中起到控制的作用，例如启动子、操纵子或增强子；与该遗传因子有效地连接的(2)编码本发明多肽或融合蛋白的DNA序列，被转录到信使RNA中，并翻译成为蛋白；和(3)适当序列，用于开始和终止转录和翻译。
在本发明环境下使用的载体一般包括遗传标记，细菌和酵母中的复制起点、多克隆位点和遗传标记。遗传标记通常是给予了对抗生素耐受的基因，或者是对酵母来说的营养缺陷型标记物。
适合本发明的酵母载体可以是以下列类型的质粒为基础：
-多拷贝自主质粒：这些质粒包含可以形成所述载体的多拷贝的序列。这些序列可以是所谓的2μ，诸如是出现在附加体质粒(Yep或酵母附加体质粒)中的序列，或者ARS型序列如出现在复制型质粒内(YRps或酵母复制质粒)的序列。以这种类型质粒为基础的载体举例有p426GPD，p416GPD，p426TEF，p423GPD，p425GPD，p424GPD或p426GAL，YEp24和Yeplac。
-单拷贝自主质粒：该质粒包含自主复制序列ARS1和着丝粒序列(CEN4)。这个类型的质粒包括着丝粒质粒(YCps或酵母着丝粒质粒)。
-整合质粒：能够被整合到宿主细胞基因组的质粒。该类型的质粒包括整合质粒(YIPs或酵母整合质粒)。以这种类型质粒为基础的载体举例有pRS303，pRS304，pRS305或者pRS306以及类似物。
通常来说，西科尔斯基(“酿酒酵母的染色体外克隆载体”，质粒，实用方法，艾迪.K.G.哈代，IRL出版社，1993年)(“Extrachromosomal cloning vectorsof Saccharomyces cerevisiae”，in Plasmid，A Practical Approach，Ed.K.G.Hardy，IRL Press，1993)和奥苏伯尔等(“酵母克隆载体和基因”现代分子生物学实验技术，第2部分，13.4单元，1994年)(“Yeast Cloning Vectors and Genes”CurrentProtocols in Molecular Biology，Section II，Unit 13.4，1994)提到的所有的载体在本发明的环境中是有用的。
在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的DNA构建体的微生物，包含本发明的构建体的表达载体或者与本发明的融合蛋白。在一个特别的实施方式中，微生物是酵母。酵母可以被理解为任何属于子囊菌型的真核有机体，其包含通常知道的酵母有机体以及通常知道的丝状真菌。酵母和丝状真菌包括毕赤酵母种(Pichia sp)(例如，巴斯得毕赤酵母(P.pastoris)，芬兰毕赤酵母(P.finlandica)，喜海藻糖毕赤酵母(P.trehalophila)，P.koclamae，莫璞毕赤酵母(P.membranaefaciens)，微小毕赤酵母(P.minuta)，仙人掌酵母(P.opuntiae)，嗜热毕赤酵母(P.thermotolerans)，柳毕赤酵母(P.salictaria)，松栎酵母(P.guercuum)，皮杰普毕赤酵母(P.pijperi)，树干毕赤酵母(P.stiptis)，嗜甲毕赤酵母(P.methanolica))，酵母属(酿酒酵母(S.cerevisiae))，粟酒裂殖酵母属(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)，魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)，克鲁雄酵母(K.waltii)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)，嗜热克鲁维酵母(K.thernotolerans)，和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)，耶鲁维亚克鲁维酵母(K.yarrowia))，里氏木霉属(Trichoderma reesia)，粗糙链孢霉(Neurospora crassa)，许旺酵母属(Schwanniomyces)，西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Totypocladium)，曲霉菌属(Aspergillus)(例如，构巢曲霉(A.nidulans)，黑曲霉(A.niger)，米根霉(A.oryzae))，多形汉森(氏)酵母属(Hansenula polymorpha)，假丝酵母(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母(Rhodotorula)，汉森(氏)酵母属(Hansenula)，克鲁维酵母菌(Kluyveromyces sp.)(例如，乳酸克鲁维酵母菌属Kluyveromyces lactis)，白假丝酵母(Candida albicans)，曲霉菌(Aspergillussp.)(例如，构巢曲霉菌Aspergillus nidulans)，黑曲霉Aspergillum niger)，米根霉(Aspergillus oryzae))，里氏木霉属(Trichoderma reesei)，金孢子菌属(Chrysosporium luchiowense)，镰孢菌(Fusarium sp.)(例如，镰孢菌 禾谷链孢菌(Fusarium gramineum))，镰孢霉(Fusarium venenatum))，小立碗藓属(Physcomitrella patens)。
事实上任何酵母都可以用来实现本发明的方法；然而，在一个具体的实施方式中，所述的酵母是来自酵母属的酵母，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)。
为了得到本发明的酵母，将含有构建体的载体引入到酵母细胞中是必要的。适合引入DNA分子到酵母细胞的方法包括：
-原生质球状体的转化，需要去除酵母细胞壁并在PEG存在下将原生质球状体与质粒连接。
-用Li+转化，需要用一价碱阳离子(Na+、K+、Rb+、Cs+和Li+)联合PEG一同处理酵母细胞通过完整的细胞刺激DNA吸收。
-电穿孔法，需要给予酵母电脉冲，使在原生质球状体和完整的酵母细胞的膜上形成开孔。
本发明的微生物能够产生和分泌α-半乳糖苷酶到培养物中。因此，在另一方面，本发明涉及一种生产α-半乳糖苷酶的方法，该方法包括根据本发明培养微生物和从培养基中回收分泌的α-半乳糖苷酶。
α-半乳糖苷酶蛋白能够很容易地通过单一的亲和色谱方法进行纯化，通过使用下述底物类似物分离，即例如：对氨基苯基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(斯蒂尔斯.E等，1970年，生物化学杂志第246期：第196页-200页)(Steers，E.etal，1970，J.Biol.Chem.246：196-200)。
α-半乳糖苷酶的纯度的测定，能够通过具体酶的活性值评价，该值通过酶活性单位数除以蛋白的量计算得到，以确定体积内的毫克计。优选地，酶活性通过瓜伦特L.的方法(酶学方法.1983年，101卷：第181-191页)(MethodsEnzymol.1983，101：181-191)测定。
本发明的微生物能够在含有基质的培养基中成长，所述基质含有丰富的α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基作为唯一碳源。因此，在另一方面，本发明涉及一种从富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的组合物中获得细胞生物质的方法，该方法包含：(a)培养含有本发明构建体之一的微生物和(b)从培养基中回收生物质。
优选富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的培养基为富含水苏四糖、绵子糖、蜜二糖、甘蔗和/或甜菜糖蜜、大豆蛋白渗透物和任何上述物质的组合的培养基。
生物质能够从培养基中通过任何本领域普通技术人员已知的方法回收，包括但不限于离心，沉淀或过滤。使用的方法必须优选最大限度内对细胞破坏最小的。如果同样的培养物用于制备生物质和产生α-半乳糖苷酶，那么细胞生物质的分离必须在最大程度上使α-半乳糖苷酶的减少到最低。
从培养基中回收的微生物通常是用含水溶液洗涤去除不想要的可能是随此附带的物质。酵母中蛋白含量优选在35-65％之间。回收的酵母生物质不需要额外加工就能够用作食品产品的成分。回收的生物质也能被溶解，并可选择地，将完整细胞分离。溶解的酵母细胞可以作为酵母提取物用在培养基上或者可以通过额外加工分离其中的不同成分例如肽类、核苷酸、氨基酸或者细胞壁中的具体成分，例如几丁质，葡聚糖、甘露聚糖和低聚糖。
容许使用的基质(水苏四糖，绵子糖，蜜二糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜和/或大豆蛋白渗透物)被本发明酵母消化，产生半乳糖，其是适用于酒精发酵，乙醇或其他化合物的生产的合适基质。因此，在另一方面，本发明涉及一种获得发酵产品的方法，包含步骤：在富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的基质上培养微生物的步骤，其中所述酵母包括编码融合蛋白的DNA构建体，该融合蛋白中成熟形式的α-半乳糖苷酶与信号序列融合在相同阅读框内，其中所述的信号序列能够促进酵母细胞α-半乳糖苷酶的分泌；和(b)从培养基中回收发酵产品的步骤。
在本发明环境下的发酵产品被理解为在厌氧条件下从来自于糖的酵母中获得的产品。使用本发明的菌株和方法获得的发酵产品包括醇(乙醇、甲醇、丁醇)、有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸)、酮(例如，丙酮)、氨基酸(例如，谷氨酸)、气体(氢气和二氧化碳)、抗生素(青霉素、四环素)等。在优选的实施方式中，发酵产品是乙醇，该乙醇可以用作燃料、用在饮料或者工业水平上。用于生产乙醇的醇发酵通常是在温度大约在32℃进行发酵30-60小时。
就作为碳源的培养基而言，生产发酵产品的培养条件实质上与生产α-半乳糖苷酶的条件相同。然而，为了改进反应的收率，重要的是，培养条件是那些能够有利于单糖发酵的条件。一旦在基质中发酵产品的合适浓度已经达到，就需要从基质中回收产品。回收产品的方法将依赖于产品的化学性质。如果发酵产品是乙醇，就使用包括蒸馏的常规技术回收。
本发明微生物也能被包含编码目标蛋白的基因的二级表达载体转化，并进而用于通过在富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基作为唯一碳源的培养基上培养所述的双重转化菌株获得目标蛋白。
因此在另一方面，本发明涉及一种微生物，除包含本发明的一级构建体外还包含带有编码目标蛋白的基因的二级构建体。
能够用于表达异源性蛋白的表达载体实际上与那些能够用于表达带有α-半乳糖苷酶的融合蛋白的表达载体是一样的。然而，适当的是，对于两种载体具有不同选择标记物以保证它们两者在酵母中保持稳定。调控异源蛋白表达的启动子也可以与那些用于调控融合蛋白表达的启动子一样。用于生产本发明构建体的启动子包括：
-组成型启动子，例如，举例来说，乙醇脱氢酶(ADH1)启动子、1-
Figure BPA00001469530300141
延长因子(TEF)启动子和编码磷酸丙糖异构酶(TPI)的基因的启动子、磷酸3-甘油醛脱氢酶(GPD)启动子和3-磷酸甘油酸激酶(GPK)启动子，MRP7启动子和乙醇氧化酶(AOX1)启动子。
-诱导型启动子，例如，举例来说，金属硫蛋白(CUP1)启动子，其通过加入铜到培养基中来调控表达；编码FUS1基因或FUS2基因的基因启动子，如在美国专利US5063154中描述的，它的表达在信息素(α-因子)存在下被激活的；TET启动子，它的表达在四环素存在下被调控；GAL1-10，GALL，GALS启动子，它们在半乳糖存在下被激活；VP16-ER启动子，其被雌激素诱导；和磷酸酶(PH05)启动子，它的表达是在磷酸酯存在下激活的；和HSP150热休克蛋白启动子，它的表达在高温下被激活。
-阻遏型启动子，例如，举例来说，酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因启动子，当微生物在非可发酵碳源中生长时，它的表达被抑制；还有，受葡萄糖阻遏影响表达的启动子，当部分乳糖被水解，并且培养基中葡萄糖的浓度开始增加时，该表达将会被抑制；酿酒酵母中，3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)启动子和半乳糖激酶(GAL1)启动子。
优选地不同的启动子被用在两种构建体中，以致于α-半乳糖苷酶和异源蛋白的表达能够被独立地调控。优选地，在那些异源蛋白被认为是对宿主细胞是有毒性的情况下，用于调控其表达的启动子适当地是调控性启动子，从而使得目标蛋白的表达被延迟，直到已经达到足够的生物量水平。本发明想到使用水苏四糖，绵子糖，蜜二糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜，大豆蛋白渗透物和任何上述物质的组合作为富含α-半乳糖苷酶末端位置的非还原性残基的培养基。
目标蛋白可能缺乏信号序列，或者是为了达到刺激释放其到培养基中并进而促进它的回收的目的，它们能够被合成带有信号序列。在本发明环境下能够使用的信号序列本质上包括与那些能够用于促进α-半乳糖苷酶分泌相同的信号序列。
双重转化菌株能够方便地以使用α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基作为主要碳源用于生产目标蛋白。因此，在另一方面，本发明涉及一种获得目标蛋白的方法，包括步骤：(a)按照本发明在富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的培养基中培养双重转化的酵母菌株和(b)从培养基中回收目标蛋白。
在优选的实施方式中，富含α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的培养基是水苏四糖，蜜二糖，绵子糖，甘蔗和/或甜菜糖蜜，大豆蛋白渗透物和任何上述物质的组合。
实际上关于使用本发明菌株和方法能够表达的目标蛋白是没有限制的。这些既包括人类也包括哺乳动物的有治疗用途的蛋白，和能够在酵母中重新构建代谢途径的以及随后生产有用的化合物的不同来源的酶。
以本发明对象细胞生产的有治疗用途的蛋白的例子是，促红细胞生成素、促肾上腺皮质素释放激素(CRH)，生长激素释放激素(SRH)，促性腺激素释放激素(GnRH)，促甲状腺激素释放激素(TRH)，催乳素释放激素(PRH)，促黑素释放激素(MRH)，催乳素抑制激素(PIH)，生长激素抑制素，促肾上腺皮质激素(ACTH)，促生长激素或生长激素(GH)，促黄体生成激素(LH)，促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素刺激激素(TSH或促甲状腺激素)，催乳素，催产素，抗利尿激素(ADH或后叶加压素)，褪黑激素，穆勒氏管抑制因子，降钙素，胆囊收缩素激素(CCK)，胰泌素，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，心钠素(ANP)，人体绒毛膜促性腺激素(hCG)，胰岛素，胰高血糖素，生长激素抑制素，胰多肽(PP)，瘦素，Y神经肽，肾素，血管紧张素I，血管紧张素II，第Ⅷ因子，第IX因子，组织因子，第VII因子，第X因子，凝血酶，第Ⅴ因子，第Ⅺ因子，第ⅩⅢ因子，白细胞介素-1(IL-1)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8和化学增活素)，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-16(IL-16)，α、β、γ-干扰素，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，骨形成蛋白(BMPs)，成纤维细胞生长因子(FGF和KGF)，表皮生长因子(EGF和类似物)，血管内皮生长因子(VEGF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，神经胶质生长因子，角质化细胞生长因子，内皮生长因子，α-1抗胰蛋白酶，肿瘤坏死因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，环孢霉素，纤维蛋白原，乳铁蛋白，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，胰凝乳蛋白酶，免疫球蛋白，水蛭素，超氧化物歧化酶和伊米苷酶。
事实上，现有技术中的任何已知方法均能够用于从细胞内或从培养基中回收目标蛋白。如果蛋白是在酵母细胞内生产，那么需要溶解细胞以释放目标蛋白。酵母细胞被按照下述方式常规溶解：通过对之前形成原生质球状体用葡聚糖酶处理进行低渗溶解，借助声裂法或通过在玻璃珠存在下进行摇动。一旦目标蛋白从细胞内部释放到培养基中或者源于通过酵母本身的分泌结构分泌的蛋白到培养基中，则用于纯化所述蛋白的常规的方法，包括但不限于，色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱、HPLC)，电泳法(准备的等电位焦距电泳、在聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠胶中的制备电泳)，差别性溶解度(用硫酸铵沉淀)，准备的蔗糖梯度超速离心。一旦达到期望的纯度，这可能需要进行不止单一的色谱步骤，一般还需要浓缩蛋白或除去对随后使用有害的盐和离子。那样的话，已知的技术例如低压冻干法或超滤法可以使用。
本发明通过本发明的非限制性示意性实施例描述如下。
实施例
实施例1
获得修饰的酵母菌株用于生产α-半乳糖苷酶
材料和方法
1.由编码α-半乳糖苷酶的基因克隆核苷酸序列
设计两对引物用于通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)扩增编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-半乳糖苷酶的MEL1基因。两个片段扩增，其中一个对应α-半乳糖苷酶的完整基因(序列号：4)，使用下列具有序列号：5和序列号：6的引物进行扩增；另一个片段对应除去编码分泌信号(序列号：7)的54个核苷酸的α-半乳糖苷酶基因，通过下列具有序列号：8和序列号：9的引物进行扩增。将α-半乳糖苷酶的完整基因插入到载体YEpFLAG1(伊士曼柯达公司分类号IB13400)中，用于在ADH2(AlcoholDehydrogenase，醇脱氢酶2)启动子(序列号：1)和CYC1基因的转录终止子(序列号：10)下在酵母中表达。将具有不含分泌信号序列的α-半乳糖苷酶基因的扩增的第二种产品像前面描述的一样插入到载体中，其进一步具有了分泌信号酵母α因子(83个氨基酸)和FLAG多肽用于它的后续免疫学检测(SEQ ID NO：2)。产生的构建体通过乙酸锂的方法(伊藤等，细菌学杂志，1983年1月第153卷第1期：第163-8页)(Ito et al.，J Bacteriol.1983 Jan；153(1)：163-8)转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(pep4::HIS3 prb-Δ1.6R HIS3 lys2-208trp1-Δ101 ura3-52 gal2 can1)中。
2.培养重组菌株
用两种构建体转化的菌株在完全培养基(CM medium)(资陶茂等，生物化学杂志.1976年10月25日，第251卷第20期，第6320-6页)(Zitomer et al.，J Biol Chem.1976 Oct 25；251(20)：6320-6)中培养，使用色氨酸作为营养缺陷型标记物。当它们到达稳定的生长时期后，将它们接种到100ml的YPHSM培养基中(1％葡萄糖，3％甘油，1％酵母提取物和8％蛋白胨)或者接种到相同的培养基中，但所述培养基含有2％的棉子糖以代替1％的葡萄糖。
所有测定的培养物都是在30℃下，在250转/分钟轨道振荡器上生长并且在600nm初始吸收值是0.05时开始。在不同的时间间隔测定600nm的吸收值，细胞外和细胞内的α-半乳糖苷酶活性，并根据情况测定，棉子糖，蜜二糖，果糖，葡萄糖和半乳糖的消耗量。
在一些情况下，培养物是在赛多利斯-MD(贝朗生物系统)型(Braun-Biotech)发酵罐2升培养基中生长，控制通风量(2升/分钟)，温度30℃，pH，震荡频率(250转/分钟)。在不同的时间间隔收集样品，并将在前提到的参数进行同样的分析。
3.α-半乳糖苷酶活性的测定
α-半乳糖苷酶体外活性是使用发色底物对硝基苯基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(PNPG)(Sigma-Aldrich，西格玛-奥尔德利奇公司)按照邱和道格拉斯描述的方法(邱，O.M.等，细菌学杂志1976年1月，第125卷第(1)期，第33-41页)(Kew，O.M.et al.，J Bacteriol.1976 Jan；125(1)：33-41)测定。无色的PNPG化合物在水解后产生一种产物，其由于酶反应的终止产生的pH变化显示可以通过分光光度计定量的浅黄色，其与底物释放的量成比例。
α-半乳糖苷酶活性是通过酶单位表达的；酶单位(E.U.)的定义为在测定条件下，每分钟释放1纳摩尔对硝基苯基的酶的量(E.U.＝纳摩尔x min-1xml-1)。在培养基中该单位的表达为E.U./ml。
4.测定棉子糖、蜜二糖、果糖、葡萄糖和半乳糖的存在
沃特世HPLC(高效液相色谱)配有Breeze系列1515型单元泵，具有2414型折射率检测器和Sugar Pak I的6.5毫米x 300毫米的分离柱，该HPLC被用于测定棉子糖、蜜二糖，果糖、葡萄糖和半乳糖。
结果
图1表示，含有编码酿酒酵母(S.cerevisiae)α-半乳糖苷酶的全部MEL1基因的表达质粒转化的酿酒酵母菌株，在含有1％葡萄糖的合成培养基上生长时在600纳米的吸收度以及细胞外和细胞内的α-半乳糖苷酶活性。显示在图1中的酶活性数据是四个独立测定的结果。总活性是细胞内活性与细胞外活性的和。这个重组菌株在90-140小时内平均分泌18700E.U./ml的α-半乳糖苷酶到培养基中，对于相同时间间隔的平均总活性为32000E.U./ml，这就意味着细胞外活性是总活性的58.4％。
为了验证带有完整MEL1基因的重组菌株在含有棉子糖的培养基中生长，图3显示了菌株在带有2％棉子糖的合成培养基中生长时的600纳米的吸收以及总的α-半乳糖苷酶活性。通过对照，示出在2％棉子糖中相同的非转化菌株生长时600纳米吸收度值测定值。可以观察到，非转化菌株在培养结束时达到的吸收值大约是12，实际上它们在转化菌株中已经成倍，达到了约22。非转化菌株只能利用棉子糖中的果糖，但是不能代谢蜜二糖。然而转化的菌株，除了使用棉子糖中的果糖，还能使用蜜二糖。通过HPLC测定棉子糖，蜜二糖、果糖、葡萄糖和半乳糖确认了，在非转化菌株的培养中蜜二糖的存在，而在转化菌株中蜜二糖实际上在培养48小时后消失。
实施例2
带有MEL1在ADH2启动子下的菌株[A]与带有MEL1在ADH1启动子下的菌 株[B]的α-半乳糖苷酶活性对比
克隆的细节和α-半乳糖苷酶活性的测定在实施例1中已经描述。重组菌株[A]的培养是在含有1％葡萄糖的合成培养基上进行。
图2表示美国专利US 5055401描述的菌株[B]与本发明的重组菌株[A]获得的数据比较。为了达到目的，数据是从US 5055401中的图7A和7B中提取的，并且他们已经对比过。可以观察到，在US 5055401中描述的菌株的α-半乳糖苷酶总的活性在36-54小时达到8000E.U./ml，而本发明菌株[A]在相同的时间间隔达到的总的活性是10000E.U./ml到20000E.U./ml，正如前述讨论的，在培养的后续阶段达到了约32000E.U./ml。所述增加是，在本发明重组菌株[A]总的α-半乳糖苷酶活性相对于US5055401描述的菌株[B]增量为从25％到300％。同样地，关于在US5055401中描述的菌株[B]的细胞外α-半乳糖苷酶活性，当与本发明菌株[A]相比，可以观察到，前者在36-54小时时获得的活性约是2600E.U./ml，是总活性的32.5％，而在本发明菌株[A]中得到的数值是3400到7800E.U./ml(大约为总活性的37.25％)，在后续阶段的培养中增加到18700E.U./ml(总活性的58.4％)。
Figure IPA00001469519900021
Figure IPA00001469519900031
Figure IPA00001469519900051

Claims (19)

1.一种DNA构建体包括：
(a)通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子，
(b)编码酵母中功能性信号序列的序列，和
(c)编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的MEL1基因的片段或其功能等同变异体，其中序列(b)和(c)必须在相同阅读框内。
2.如权利要求1所述的构建体，其中通过葡萄糖阻遏作用调节的异源启动子是ADH2启动子。
3.如权利要求1或2所述的构建体，其中信号序列是MEL1基因的内源性信号序列。
4.如权利要求1或2所述的构建体，其中信号序列是酵母α因子的信号序列。
5.一种DNA构建体，含有：
(a)ADH2启动子或者或其功能等同变异体，
(b)编码酵母中功能信号序列的序列，和
(c)编码成熟形式的α-半乳糖苷酶的基因的片段或其功能等同变异体，其中序列(b)和(c)必须在相同阅读框内。
6.如权利要求5所述的构建体，其中编码α-半乳糖苷酶蛋白的基因是MEL1基因。
7.如权利要求5或6所述的构建体，其中信号序列是MEL1基因的内源性信号序列。
8.如权利要求5-7任一项所述构建体，其中信号序列是酵母α因子的信号序列。
9.权利要求1-8任一项所述构建体编码的蛋白。
10.一种表达载体，含有如权利要求1-8任一项所述构建体。
11.一种微生物，含有权利要求10所述载体，权利要求1-8任一项所述的DNA构建体或权利要求9所述的蛋白。
12.如权利要求11所述的微生物，其中微生物是酵母。
13.如权利要求12所述的微生物，其中所述的微生物是酿酒酵母。
14.一种生产α-半乳糖苷酶的方法，包括：
(a)在含有α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的基质上，培养权利要求11，12或13中任一所述的微生物和
(b)从培养基中回收分泌的α-半乳糖苷酶。
15.一种获得细胞生物质的方法，包括：
(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非还原性残基的基质上，培养权利要求11，12或13中任一项所述的微生物和
(b)回收细胞生物质。
16.一种获得乙醇的方法，包括：
(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非还原性残基的基质上，培养权利要求11，12或13中任一项所述的微生物和
(b)回收所制造的乙醇。
17.如权利要求11，12或13中任一项所述的微生物，包括编码目标蛋白基因的二级构建体。
18.一种获得蛋白的方法，包括：
(a)在含有α-D-半乳糖的末端的非还原性残基的基质上，培养权利要求17所述的微生物和
(b)回收目标蛋白。
19.如权利要求14-18任一项所述的方法，其中含有α-D-半乳糖末端位置的非还原性残基的基质选自棉子糖、蜜二糖、水苏四糖、甘蔗和/或甜菜糖蜜、大豆蛋白渗透物和任何上述物质的组合。
CN2010800233001A 2009-04-08 2010-04-08 能够在具有蜜二糖、水苏四糖和棉子糖的培养基中生长的酿酒酵母菌株 Pending CN102449145A (zh)

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