CZ2002899A3

CZ2002899A3 - Prekurzor hirudinu obsahující signální sekvenci

Info

Publication number: CZ2002899A3
Application number: CZ2002899A
Authority: CZ
Inventors: Paul Habermann; Rudolf Bender
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1999-09-18
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2002-06-12
Also published as: HRP20020226A2; KR100737189B1; CN1269838C; TR200200667T2; JP4669181B2; EE05187B1; RU2002110278A; NO20021254L; MXPA02002469A; BR0014519A; IL148624A; JP2003510041A; AU6842100A; ZA200202106B; US7455987B1; KR20020034188A; CN1374970A; CN1192037C; DK1216259T3; HRP20020226B1

Description

Prekurzor hirudinu obsahující signální sekvenci pp .zeoij - frr

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prekurzoru hirudinu, který obsahuje signální sekvenci, a sekvence Leu-hirudinu, způsobu jejich přípravy a jejich použití. Dále se týká způsobu zjišťování signální sekvence pro sekretorickou expresi libovolného proteinu v E. coli a také způsobu sekretorické exprese libovolného proteinu v E. coli

Dosavadní stav techniky

Preparát Refludan®, získaný z pijavice, vykazuje v klinických zkouškách dobré terapeutické vlastnosti (The Lancet, svazek 353, str. 429 - 438) . To vede k závěru, že lze v budoucnu očekávat větší požadavky z hlediska spotřeby tohoto preparátu. Biologicky účinná látka preparátu je [Leu¹, Thr²]-63-desulfatohirudin, který byl popsán v evropském patentu č. 0 324 712, a dále v popisu bude zkráceně označován jako Leu-hirudin.

V evropském patentu č. 0 448 093 byl popsán způsob výroby hirudinu. Výhodné provedení vynálezu podle patentu obsahuje hirudin, jehož N-koncovou aminokyselinou je alanin. Když je tento hirudin fúzován se signální sekvencí a-cyklodextringlykosyltransferázy (CGTase) a pak je expresní vektor kódující fúzní protein použit k transformaci, jak bylo popsáno v patentu, sekretorické mutanty E. coli, lze produkovat Ala-hirudin s hrubým výtěžkem vyšším než 2 gramy z 1 litru kultury. Evropský patent č. 0 549 915 popisuje varianty Ala-hirudinu se zlepšenou stabilitou. Při produkci těchto

- 2 • ·« · variant v sekretorickém systému E. coli by poskytly výtěžek několika gramů z 1 litru kultury. Tyto výtěžky jsou výrazně vyšší než jak byly popsány v publikaci Dodt et al. FEBS LETTERS svazek 202, str. 373-377, 1986) pro experiment s variantou hirudinu HV1. Ve srovnání s tím nepodstatné zvýšení výtěžku bylo popsáno v Patentu US 5,573,929, kde místo vektoru z pBR322, který užili Dodt et al., byla expresní kazeta exprimována známým způsobem prostřednictvím vektoru pUC. Bender et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, str. 203207, 1990) popsali v evropském patentu 0 171 024 sekreci

Thr-hirudinu ve Streptomyces lividans. Avšak zde byly výtěžky výrazně nižší ve srovnání s výtěžky podle evropských patentů 0 448 093 a 0 549 915. Totéž platí i pro expresi v E. coli B, jak ji pozorovali P. de Taxis du Poet et al. u sekrece varianty hirudinu HV1 prostřednictvím signální sekvence Omp z E. coli. Tito autoři dosáhli výtěžku 300 mg/1 hirudinu v periplazmě a přibližně 40 mg/1 v supernatantu. V tomtéž článku popsaná exprese v systému hmyzích buněk byla velmi nízká (400 μg/l).

Dosažitelné výtěžky s kvasinkovým expresním systémem Hansenula polymorpha nebo Pichia pastoris popsané v Evropském patentu 0 448 093 a 0 549 915 jsou naproti tomu nejbližší hodnotám dosaženým v S. cerevísiae.

Rosenfeld et al. (Protein Expression and Purification 8, 476482, 1996) popsal expresi a sekreci hirudinu v kvasinkách

Pichia pastoris. Přitom byl dosažen výtěžek přibližně 1,5 g/1 kultivačního média. Řádově podobného výtěžku bylo dosaženo s kvasinkami Hansenula polymorpha (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385, 1995). Výraznou nevýhodou těchto expresních systémů je výrazně delší fermentační doba ve srovnání se systémem E. coli. Bylo by také výhodné, kdyby ·· *· • · · · · · · ···· • · · · · · · · • ·« · • · ···· · · · β·· ···· ·· ·· ·· ····

- 3 Leu-hirudin byl, stejně jako Ala-hirudin produkován sekrecí v E. coli.

Avšak to se v systému popsaném v Evropském patentu 0 448 093 nezdařilo. Proto bylo v patentu navrženo sekvenci Leu—hirudinu prodloužit o tripeptid Ala-Thr-Arg, čímž se připraví pre-Leu-hirudin, který se pak nakonec působením trypsinu přemění na nativní účinnou látku Leu-hirudin. Pokud je však sledován tento navrhovaný postup, je v experimentu v třepaných baňkách dosaženo ještě výrazně horších hrubých výtěžků než bylo popsáno pro Ala-hirudin. Takže není nadále zřetelná výrazná výhoda proti kvasinkovému expresnímu systému.

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu byla proto příprava fúzního proteinu, při které kombinace ze signální sekvence a Leu-hirudinu dovolí přímé opracováni na Leu-hirudin u následnou sekreci nativního Leu-hirudinu s vysokým výtěžkem v E. coli. Takové bylo zadání pro vývoj způsobu, který jak při fermentaci tak při následné purifikaci poskytne zlepšení výstupní koncentrace hirudinu a tudíž příznivě ovlivní výrobní náklady Refludanu.

Překvapivě bylo zjištěno, že existuje signální sekvence, která dovoluje přímou sekreci Leu-hirudinu z E. coli a přitom umožňuje dosáhnout účinnější sekrece, než jaká byla popsaná v Evropském patentu 0 448 093. Na základě toho byl vyvinut způsob, který umožňuje získat bez velkých nákladů velká množství Leu-hirudinu. Tento způsob je právě předmětem předkládaného vynálezu.

Pro vyhledání výhodné signální sekvence byl zvolena metoda scřeeningu podpořeného PCR. Tato metoda užívá jako matrici • ···· · · · · · • · ···· ··· ······· *· ·· *· ····

- 4 DNA, která kóduje požadovaný protein, a pak definovaný reverzní PCR pimer a různé přímé PCR primery, které umožňují syntézu úseků DNA, která kóduje signální sekvenci navázanou na požadovaný gen.

Reakce probíhá podle schématu uvedeného na Obr. 1. Odborníkovi je jasné, že v závislosti na délce syntetizované signální sekvence může být užit různý počet reakčních kroků. Krátké signální sekvence mohou být připraveny v jednom reakčním kroku, delší sekvence mohou být připraveny ve dvou, třech nebo více reakčních krocích. Kromě toho je počet reakcí závislý také na přístroji, který se užívá k syntéze oligonukleotidů, které slouží v reakci jako primery. Takto syntetizované fúze signální peptid - gen se pak cíleně naštěpí enzymy rozpoznávajícími restrikční místa 1 a 2 a pak se vloží do odpovídajícím způsobem otevřeného (naštěpeného) expresního vektoru. Tento systém je výhodný pro vynález, když se za požadovaný gen vybere hirudin. Přitom mohou být N-koncové aminokyseliny hirudinu vybrány variabilně. To pak vede k cílenému ovlivnění vazby hirudinu na trombin (změnou vazebné konstanty), avšak inhibiční účinek hirudinu na aktivitu trombinu zůstává měřitelný. Patentový spis EP-B1 0 448 093 popisuje sekreci hirudinu do supernatantu. Zde byla koncentrace hirudinu stanovena přímo pomocí známého testu inhibice trombinové aktivity. Koncentrace hirudinu je přímým měřítkem účinnosti sekrece a tím i odštěpování signální sekvence. V uvedeném patentu se ale popisuje, že např. hirudin začínající aminokyselinou leucinem nemůže být prostřednictvím signální sekvence CGT-ázy účinně transportován do supernatantu. Užitím výše popsaného způsobu je možné nyní vyhledat signální sekvenci, která dovoluje takovou účinnost. Obdobným způsobem lze zkoumat sekreci hirudinu, který začíná jednou ze zbývajících 19 aminokyselin. Získá se tak celé

- 5 spektrum signálních sekvencí, které modelově umožňují účinné opracování karboxykoncových aminokyselin signálního peptidu a na ně navázaných peptidových zbytků. Tím se provede předběžný výběr signálních peptidů pro účinnou sekreci libovolného proteinu do periplazmatického prostoru a tak se zvýší pravděpodobnost, že se podaří vyvinout výhodný výrobní způsob. A právě to je také předmětem vynálezu. Způsob se dá urychlit, popřípadě automatizovat, takže se transformační směs z ligační reakce a kompetentní buňky jako tekutá kultura za třepání kultivují přes noc v selekčním médiu, a další den, stejně jako je to popsáno v příkladu 11, se alikvotem zaočkuje médium s induktorem k provedení indukce a větší část média se centrifuguje a buněčný pelet se odstraní. Pokud se najde exprimovaná hirudinová aktivita, pak se z buněk znovu izoluje expresní plazmid, linearizuje se a elektroforeticky se oddělí od případných produktů vzniklých autoligací. Lineární plazmidová DNA se znovu liguje a znovu transformuje do vybraného produkčního kmenu. Pak se izolují jednotlivé kolonie a otestuje se výtěžek jejich exprese. Přitom ze postupovat tak, aby způsob splňoval kritéria kladená pro povolování léčiv.

Další výhoda tohoto způsobu spočívá v tom, že je takto možné lehce vedle sebe zkoumat různé varianty signálních peptidů, které se vyvinuly v průběhu evoluce díky výměnám aminokyselin mezi jednotlivými druhy, se zřetelem na jejich způsobilost k účinné sekreci.

Způsob podle vynálezu je výhodný také ve srovnání s využitím počítačových metod, např. jak byly popsány v Nielsen et al. (Protein Engineering 10, 1-6, 1997), jejichž pomocí lze predikovat štěpná (sestřihová místa) mezi signální sekvencí a požadovaným proteinem. Ale ukazuje se přesto, že ne vždy lze takto učinit správnou predikci a výhodné kombinace mohou být • ···· · 9 · · ♦ • · ···· · · · ··· ···· «· ·· «· ···· snadno přehlédnuty. Navíc mezi predikcí správného opracování proteinu a dosažitelným výtěžkem není žádný vztah.

Předmětem vynálezu je prekurzor hirudinu, který obsahuje signální sekvenci vybranou ze skupiny obsahující signální sekvence vnějších membránových proteinů ze Serratia marcescens, proteinů oprF z Pseudomonas fluorescens, proteinů lamb B z Escherichia coli (kódovaných genem lambda receptorů lamB) a fumarátreduktázy z Shewanella putrifaciens, výhodně vybraný ze skupiny obsahující signální sekvence vnějších membránových proteinů ze Serratia marcescens a fumarátreduktázy z Shewanella putrifaciens, na jejíž C-konec je vnesena sekvence Leu-hirudinu.

Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby Leu-hirudinu, kde se jako meziprodukt užívá výše popsaný prekurzor hirudinu, kdy:

(a) se připraví expresní plazmid obsahující DNA sekvenci kódující prekurzor hirudinu;

(b) expresní plazmid podle kroku (a) je exprimován ve vhodných buňkách E. coli;

(c) prekurzor hirudinu je secernován z buněk E. coli a současně opracován; a (d) Leu-hirudin se izoluje přímo z kultivačního média.

Dále je předmětem vynálezu použití výše popsaného prekurzorů hirudinu pro výrobu Leu-hirudinu, výhodně způsobem, který byl výše uveden.

Dalším předmětem vynálezu je způsob vyhledání vhodného signálního peptidu pro sekretorickou expresi libovolného peptidu v E. coli, kdy (a) hirudin nebo derivát hirudinu s antitrombotickým účinkem, který má definovanou aminokyselinu As_x na svém N-konci, a který je svým N-koncem připojen k testovanému signálnímu peptidu, se exprimuje v E. coli;

• to · toto to toto to toto toto ···· ·· · · · · ·

Ί • toto·· · · · to · • · «··· ··* ··· ···« ·· ·· to· ···· (b) míra exprese se stanovuje měřením aktivity hirudinu v supernatantu kultivačního média;

(c) kroky (a) a (b) se opakují s různými signálními peptidy;

(d) vhodný signální peptid se vybere na základě srovnání aktivity hirudinu změřené podle kroku (b) reprezentující míru exprese.

Dále je předmětem vynálezu použití hirudinu nebo derivátu hirudinu s antitrombotickým účinkem, který má definovanou aminokyselinu As_x na svém N-konci, k vyhledání signálního peptidu, který umožní účinnou sekreci z E. coli prekurzorového proteinu sestávajícího ze signálního peptidu a libovolného jiného proteinu s N-koncovou aminokyselinou As_x, za současného odštěpení signálního peptidu, přičemž As_x je zejména leucin.

Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby libovolného proteinu sekretorickou expresí v E. coli, (a) vyhledá se vhodný signální peptid způsobem podle vynálezu pro vyhledání vhodného signálního peptidu;

(b) exprimuje se v E. coli konstrukt nukleové kyseliny kódující prekurzorový protein sestávající z vhodného signálního peptidu podle (a) a libovolného proteinu; a (c) libovolný protein se izoluje ze supernatantu kultivačního média, přičemž zejména N-koncová aminokyselina požadovaného proteinu je leucin, a exprimován je konstrukt nukleové kyseliny, ve kterém sekvence obsahující signální peptid kóduje signální peptid vybraný ze skupiny obsahující vnější membránový protein ze Serratia marcescens, protein oprF z Pseudomonas fluorescens, protein lamb B z Escherichia coli a fumarátreduktázu ze Shewanella putrifaciens.

Jako příklad bude popsána syntéza signální sekvence, která umožňuje účinnou syntézu a sekreci Leu-hirudinu. Také bude popsána syntéza další signální sekvence, která k takovému cíli • · • · · · · · · • 9··· · · · · • · · · · · ··· ······ · * · * «· * ·

- 8 nevede nebo s ohledem na výtěžek poskytuje horší výsledky. Příklady ilustrují, jak je možné vybrat signální sekvenci pro Leu-hirudin, avšak předmět vynálezu není příklady nijak omezen.

Popsaný způsob lze využít k získání Refludanu, jak je popsáno v příkladu 11.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza fúzního genu kódujícího fúzní protein složeného z Leuhirudinu a signální sekvence vnějšího membránového proteinu ze Serratia marcescens

Jako expresní vektor byl použit vektor pJF118 popsaný v Evropském patentu 0 468 539 na Obr. 1, který je základní výbavou identický s vektorem pCM7053 popsaným v Evropském patentu 0 448 093.

Jako templát byl použit v plazmid pK152 popsaný v Evropském patentu 0 448 093 v příkladu 1, který nese sekvenci hirudinu odpovídající Evropskému patentu 0 171 024.

Membránový protein byl popsán v publikaci Braun, G., Cole, S.T: (Mol.Gen.Genet. 195, 321-328 , 1984).

Pro syntézu požadovaných fragmentů DNA byly připraveny následující tři oligonukleotidové sekvence.

Oligonukleotid hirrev má sekvenci:

5¹-TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGGTC-3' [SEKVENCE ID. Č. 1]

HindlII

I* · ·· ·

Tento primer hybridizuje s úsekem 227-210 bp genu

Primer smompafl má sekvenci:

5' -TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca - 3 [SEKVENCE ID. Č. 2]

Tento primer hybridizuje s úsekem nukleotidů 1-19 sekvence hirudinu uvedeného v Tabulce 1. HybridizujIcí část sekvence primeru je znázorněna malými písmeny. Zbytek sekvence hybridizuje s úsekem 229 bp - 263 bp sekvence podle publikace Braun,G. undCole,S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984).

Primer smompaf2 má sekvenci:

5'- ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC - 3' [SEKVENCE ID. Č. 3]

Od pozice 13 bp hybridizuje sekvence primeru s úsekem 201 bp až 245 bp sekvence publikované Braun und Cole a překrývá se tak se sekvencí primeru smompaf2. Úsek nukleotidů 1 až 12 primeru obsahuje rozpoznávací místo pro restrikční enzym EcoRI a úsek šesti T-nukleotidů, který enzymu umožňuje rozpoznání sekvence.

Ve standardní polymerázové řetězové reakci, PCR (např. 94 °C:10, 50°C: 30, 72 °C: 45, 25 cyklů), kde jako templát sloužil DNA plazmid pK152 nesoucí sekvenci popsanou v Tab. 1, byla pomocí primerů hirrev a smompafl sekvence hirudinu prodloužena o část bakteriální signální sekvence. Reakční produkt byl pak ve druhé PCR použit jako templát s primery hirrev a smompaf2 za stejných podmínek. Výsledným reakčním produktem byl fragment DNA, který kóduje fúzní protein, kterým je sekvence hirudinu prodloužená o požadovanou signální sekvenci. Na 5'-konci se nachází rozpoznávací místo pro restrikční enzym EcoRI a na 3'-konci rozpoznávací místo pro restrikční enzym HindlII.

• · · · « ♦ φ φ · φ · φ ···· φ φ ♦ φ φ · φ * φφφφ φ φ · · · · · φφφ

ΦΦΦΦΦ·· ·4 «· * · ΦΦΦΦ

- 10 Reakční produkt u druhé PCR byl podroben dvojitému štěpení s oběma restrikčními ezymy a pak jakožto fragment EcoRl/HindlII byl pomocí T4-DNA ligázové reakce vložen do DNA vektoru naštěpeného předtím stejnými enzymy. Kompetentní buňky kmenu E. coli Mcl061 nebo sekretorické mutanty WCM100 byly transformovány touto ligační směsí a pak namnoženy a selektovány na plotnách obsahujících ampicilin. Další ráno byla sledována exprese podle příkladu 6 a srovnána s expresí Ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažená exprese byla přibližně l,5x vyšší než ve srovnávacím pokusu.

Příklad 2

Syntéza fúzního proteinu z Leu-hirudinu a signální sekvence genového produktu oprF z Pseudomonas fluorescens

Konstrukce odpovídala postupu popsaném v příkladu 1 s tou výjimkou, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci oprF genu (De, E. et al. : FEMS Microbial. Lett. 127, 267-272,

1995) .

Primer „pfufl má následující sekvenci:

5'-GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca-3'0 [SEKVENCE ID. Č. 4]

Primer „pfuf2 má následující sekvenci :

5'-ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT

TGCCGC-3' [SEKVENCE ID. Č. 5] • « ··· ·

- 11 Přitom byl užit primer pfufl v PCR 1 odpovídající příkladu 1 a primer pfuf2 v PCR2. Exprese byla sledována ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažená exprese byla l,lx vyšší než v kontrolním pokusu. Po elektroforetickém rozdělení v systému SDS-PAGE byl izolován pás hirudinu a byla určena N-koncová sekvence hirudinu. Ukázalo se, že sekvence je plně intaktní a začíná aminokyselinou leucinem. Tyto výsledky byly překvapivé, neboť počítačový program pro identifikaci předpokládaných rozpoznávacích míst signálpeptidázy předpověděl prodloužení hirudinu o aminokyselinu valin.

Příklad 3

Syntéza fúzního proteinu sestávajícího z Leu-hirudinu a signální sekvence produktu genu lamB z E. coli

Konstrukce odpovídala postupu popsaném v příkladu 1 s tou výjimkou, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci genu lamb (element,J.M. and Hofnung, M. : Cell 27, 507 -514,

1981).

Primer „lambbfl má následující sekvenci:

5'-GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a -3' [SEKVENCE ID. Č. 6]

Primer „lambbf2 má následující sekvenci :

5'-ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC

CGTCGCAGC -3' [SEKVENCE ID. Č. 7]

Přitom byl užit primer lambbfl v PCR 1 odpovídající příkladu 1 a primer lambbf2 v PCR 2. Exprese byla provedena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažená exprese byla stejně vysoká jako v kontrolním pokusu. Po elektroforetickém rozdělení v systému SDS-PAGE byl izolován pás hirudinu a byla určena N-koncová sekvence hirudinu. Ukázalo se, že sekvence je plně intaktní a začíná aminokyselinou leucinem. Tyto výsledky byly překvapivé, neboř počítačový program pro identifikaci předpokládaných rozpoznávacích míst signálpeptidázy nepredikoval správné opracování hirudinového produktu.

Příklad 4

Syntéza fúzního proteinu sestávajícího z Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzoru flavoproteinové podjednotky fumarátreduktázy ze Shewanella putrefaciens

Konstrukce byla provedena postupem popsaným v příkladu 1 s tou výjimkou, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci ze Shewanella putrefaciens (Pealing S.L. et al.: Biochemistry 31, 12132-12140, 1992). Jelikož publikace popisuje pouze proteinovou sekvenci, byla aminokyselinová sekvence přeložena pomocí odpovídající tabulky kodonů na sekvenci DNA, takže primer „spfccfl má následující sekvenci:

5¹ -CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca-3' [SEKVENCE ID. Č. 8]

- 13 Primer „spfccf2 má následující sekvenci :

5¹-ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC-3' [SEKVENCE ID. Č. 9]

Přitom byl užit primer spfccfl v PCR 1 odpovídající příkladu 1 a primer spfccf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla provedena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažená exprese byla asi l,5x vyšší než v kontrolním pokusu. Po elektroforetickém rozdělení v systému SDS-PAGE byl izolován pás hirudinu a byla určena Nkoncová sekvence hirudinu. Ukázalo se, že sekvence je plně intaktní a začíná aminokyselinou leucinem. Tyto výsledky byly překvapivé, neboť. počítačový program pro identifikaci předpokládaných rozpoznávacích míst signálpeptidázy predikoval opracování směrem ke karboxykonci až k cysteinu v pozici 6 sekvence hirudinu.

Příklad 5

Syntéza fúzního proteinu z Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzorů β-laktamázy z pBR322

Konstrukce byla provedena postupem popsaným v příkladu 1 s tou výjimkou, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci prekurzorů β-laktamázy (Sutcfiffe J.G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77-90 (1978)).

Primer „blatfl má následující sekvenci:

44·· • 4 4 4 4 4 · 4 · 4

4 4 4 4 4 444

444 4444 44 ·4 44 4444

- 14 5'-CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a -3' [SEKVENCE ID. Č. 10]

Primer „blatf2 má následující sekvenci :

5'- ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC-3' [SEKVENCE ID. Č. 11]

Zde byl užit primer blatfl v PCR 1 odpovídající příkladu 1 a primer blatf2v odpovídající PCR 2. Exprese byla provedena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese byl jen 50 až 90 % výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu. Po elektroforetickém rozdělení v systému SDS-PAGE byl izolován pás hirudinu a byla určena N-koncová sekvence hirudinu. Ukázalo se, že sekvence je plně intaktní a začíná aminokyselinou leucinem. Tyto výsledky byly predikovány programem pro identifikaci předpokládaných rozpoznávacích míst signálpeptidázy.

Příklad 6

Syntéza fúzního genu sestávajícího z Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzoru alkalické fosfatázy z E. coli

Konstrukce byla provedena postupem popsaným v příkladu 1 s tou výjimkou, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci prekurzoru alkalické fosfatázy z E. coli (Shuttleworth,H., Tayior, J. and Minton, N. Nucleic Acids Res. 14 (21) , 8689 (1986)) .

···· ·· · ···<

» ♦ · to to · ' to · • · · · · ··*> · ·· · · · · ·«· ««· ···· «· ·· ·· ····

- 15 Primer „linkphoafl má následující sekvenci:

5' -GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca -3' [SEKVENCE ID. Č. 12]

Primer „linkphoaf2 má následující sekvenci :

5'-ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC -3' [SEKVENCE ID. Č. 13]

Oba primery byly optimalizovány podle specifického využití kodonů v E. coli, to znamená, že neodpovídají plně přírodní sekvenci původního genu.

Zde byl užit primer linkphoafl v PCR 1 podle příkladu 1 a primer linkphoaf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla provedena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese byl jen zlomkem výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu. Po elektroforetickém rozdělení v systému SDS-PAGE byl izolován pás hirudinu a byla určena N-koncová sekvence hirudinu. Ukázalo se, že sekvence je plně intaktní a začíná aminokyselinou leucinem. Tyto výsledky byly predikovány programem pro identifikaci předpokládaných rozpoznávacích míst signálpeptidázy. Překvapivý však byl nízký výtěžek.

Příklad 7

Syntéza fúzního genu sestávajícího z Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzoru alkalické fosfatázy z E. fergusonii

Konstrukce byla provedena podle schématu popsaného v příkladu výjimkou toho, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky • ·· ·*···· ·· ·· • · * · · · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 99 9· 999 s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci prekurzorového proteinu alkalické fosfatázy z E. fergusonii (Du Bose, R.F. and Hartl, D.L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577 (1990)).

Tato signální sekvence se liší v pěti polohách od alkalické fosfatázy z E. coli.

Primer „fergusfl má následující sekvenci :

5' -GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca3' [SEKVENCE ID. Č. 14]

Primer „fergusf2 má následující sekvenci :

5¹-ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC'3 [SEKVENCE ID. Č. 15]

Oba primery byly optimalizovány podle specifického využití kodonů v E. coli, takže neodpovídají plně přírodní sekvenci výchozího genu. Byl zde užit primer fergusfl v PCR 1 podle příkladu 1 a primer fergusf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla ověřena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese byl jen zlomkem výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu. Byl asi o polovinu menší než výtěžek, který byl pozorován s konstruktem pro alkalickou fosfatázu z E. coli a Leuhirudin.

• «4 4 4 4	4 · 4	4	4 44 4 4	44 4	4	44 4 4
• 4 4	4	4	4	4 4	*	4
• 4	4	4	4 4	4	4	4
4 4 44 4 4	4·		4 4	44		4*4 4

Příklad 8

Syntéza fúzního genu sestávajícího ze sekvence Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzoru cyklodextringlukantranferázy z Paenibacillus macerans

Konstrukce byla provedena podle schématu popsaného v příkladu 1 výjimkou toho, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci cyklodextringlukantranferázy z Paenibacillus macerans (Takano,T., Fukuda,M., Monma,M., Kobayashi, S. , Kainuma,K. and Yamane,K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122 (1986)).

Primer „baccdgfl má následující sekvenci : ,

5' -CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca-3' [SEKVENCE ID. Č. 16]

Primer „baccdgf2 má následující sekvenci :

5' -ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC-3¹ [SEKVENCE ID. Č. 17]

Byl zde užit primer baccdgfl v PCR 1 podle příkladu 1 a primer baccdgf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla ověřena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese byl asi 1/4 výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu. Syntetizovaný hirudin se v trombinovém inhibičním testu choval stejně jako Leu-hirudin. To odpovídalo očekávání teoretické analýzy, která naznačila prodloužení N-konce o 8 aminokyselin nebo alternativně zkrácení o 2 aminokyseliny.

44 44 44*4 44 ··

44*4 44 4 4444 • 4444 44 *

44*4 4*44 *

4 4 4 4 4 «44 • 44 4444 44 44 44 4444

Příklad 9

Syntéza fúzního genu sestávajícího z Leu-hirudinu a signální sekvence prekurzorového proteinu (fotA) fimbrilinu E. coli PCFO20

Konstrukce byla provedena podle schématu popsaného v příkladu 1 výjimkou toho, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu , pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci prekurzoru fimbrilinu z E. coli PCFO20 (Viboud, G.I., Jonson,

G. , Dean-Nystrom, E. and Svennerholm, A.M. Infect. Immun. 64 (4) , 1233-1239 (1996) ) .

Primer „pcfl-ala má následující sekvenci :

5'-TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC -3' [SEKVENCE ID. Č.18]

Primer „p-pcf2 má následující sekvenci :

5'-TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC-3' [SEKVENCE ID. Č.19]

Byl zde užit primer pcfl-ala v PCR 1 podle příkladu 1 a primer p-pcf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla ověřena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese představoval asi 40 % výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu.

fc fcfc ··«*·· fc* fcfc fcfcfcfc fcfc fc fcfcfcfc fc fcfcfcfc fcfc fc • » ♦ · · fcfcfcfc fc • fc fcfcfcfc fc·· fc·· ···· fcfc fcfc fcfc fcfcfcfc

Příklad 10

Syntéza fúzního genu sestávajícího z Leu-hirudin a signální sekvence proteinu vnější membrány (fimD) ze S. typhimurium

Konstrukce byla provedena podle schématu popsaného v příkladu 1 výjimkou toho, že místo primerů smompafl/f2 byly užity dva nové primery, které mají specifitu pro hirudinový gen a rozpoznávací sekvenci restriktázy EcoRI jako shodné znaky s primerem smompa, ale kódují požadovanou signální sekvenci proteinu vnější membrány (fimD) ze S. typhimuriuin (Rioux, C.R., Friedrich, M.J. and Kadner, R. J. ; J. Bacteriol. 172 (11) , 6217-6222 (1990)) .

Primer „styfimfl má následující sekvenci :

5' -CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca -3' [SEKVENCE ID. Č.20]

Primer „styfimf2 má následující sekvenci :

5' -ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGCT GAGTCTC -3' [SEKVENCE ID. Č. 21]

Byl zde užit primer styfimfl v PCR 1 podle příkladu 1 a primer styfimf2 v odpovídající PCR 2. Exprese byla ověřena ve srovnání s expresí ala-hirudinu v kmenu E. coli WCM100/pCM7053. Ukázalo se, že dosažený výtěžek exprese představoval asi 10 % výtěžku dosaženého v kontrolním pokusu.

- 20 ΐ· φφφφ φφ φφ

Příklad 11

Exprese v Ε. coli

Tento příklad popisuje expresi hirudinu. K tomu bylo zaočkováno po 1 až 5 ml LB média, obsahujícího 25mg/l ampicilinu a 0,5 až 2mM IPTG (Isopropyl-S-Dthiogalaktopyranosid), transformovanými buňkami a pak přibližně 20 hodin kultivováno v 28 °C za třepání 220 ot./min (rpm) . Pak byla po změření optické denzity buněčná suspenze centrifugována a v čirém supernatantu byla stanoven hirudin.

Paralelně s expresí Refludanu byla provedena exprese Ala-hirudinu popsaného v Evropském patentu 0 448 093 užitím plazmidu pCM7053 v sekretorické mutantě WCM100 taktéž popsané v patentu. Tím bylo možné provést přímé srovnání rychlosti exprese. Exprese ve velkém měřítku se prováděla podle Patentu US 5,616,476. Refludan byl purifikován postupem podle tohoto patentu popsaným v příkladech 5 a 6.

Příklad 12

Stanovení koncentrace hirudinu

Stanovení koncentrace hirudinu bylo provedeno postupem podle publikace Grie6bach et al. (Thrombosis Research 37, 347-350,

1985). Za tím účelem byla zkonstruována kalibrační křivka pomocí definovaných množství Refludanu jakožto standardu. Takže výtěžek mohl být přímo stanovován v mg/1.

- 21 99

99 9

99

9 9 9 9 · 0 · 0 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99. 99 99 9999

Tabulka 1

Kódující DNA sekvence hirudinu s translací do sekvence aminokyselin

CTTACGTATACTGACTGCACTGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGATCTAAC 60

LTYTDCTESGQNLCLCEG SN

GTTTGCGGCCAGGGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTT 120

VCGQGNKCILGSDGEKNQCV

121 ACTGGCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCCT 180

TGEGTPKPQSHNDGDFEEI P

181 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGCTCGTCGACCTGCAGCCCAAGCTT 227 [SEKVENCE ID. Č. 22]

Ε Ε Y L Q * [SEKVENCE ID. Č. 23] ·· 9« ···· ·· ··»*«· · * • · 9 · * 9 • · » * · «99

9 * 9 9 9 9

999 9999 99 99 99 ·

• • ·· ·

Tabulka 2

C.Př	Signální sekvence	Primární struktura	Rel. výtěžek na 1 ml kultury	SEK. ID. Č.
	Kontrola: Cgt-áza ala-hirudin	MKRRNRFFNTS AAIAISIALNTF F CSMQTIA	1	24
1	Vnější membr. protein/ Serratia marcescens	MKKTAIALAVALAGFATVAQ A	1,5	25
2	Protein oprF/ Pseudomonas fluorescens	MKNTLGLAIGSLIAATSFGV LA	1,1	26
3	Protein lambB E.coli	MMITLRKLPL AVAVAAGVMS AQAMA	1	27
4	Fumarátreduktáza/ Shewanella putrifaciens	MKKMNLAVCI ATLMGTAGLM GTAVA	1,5	28
5	p-laktamáza/pBR322	MSIQHFRVAL IPFFAAFSLPVFA	0,5	29
8	Alkalická fosfatáza/ E. coli	MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A	0,1	30
9	Alkalická fosfatáza/ E. fergusonii	MKQSAIALAL LSCLITPVSQ A	0,05	31
10	Cyklodextringlukan- transferáza/ Paenibacillus macerans	MKSRYKRLTS LALSLSMALGI SLPAWA	0,25	32
11	Vnější membránový protein/S. typhimurium	MSFHHRVFKL SALSLALFSH LSFA	0,11	33

·· · · ···· ·· ·· • « · · · ···· • · · · · · · • · · · · · · · · pr íooi, -tt?

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 1 tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 2 tggcactggc aggtttcgct accgtagcgc aagcccttac gcatactgac tgca 54 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti ··· · <400> 3 ttttttgaac tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 4 ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 5 ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctctcat tgccgc 56 <210> 6 <211> 61 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 6 gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgta tactgactgc 60 a 61 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti

<400 7 ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcggttgc cgccgcagc 59 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 8 ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg tatactgact 60 gca '63 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 9 ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 60 <210> 10 <211> 61 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 10 ctgatcccgt tctttgcagc gttctgcctg ccggttttcg cgcttacgta tactgactgc 60 a 61

<210>	11
<211>	56
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

• · • · · ·

9 · · <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 11 túttttgaac tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt ctttgc 56 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 12 gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact gca 53 <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 13 ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttc 57 <210> 14 <211> 53 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 14 gctgagctgc ctgatcaccc cagtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 53 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence • ·· ·» ···· ·· »· • a « · · » · ··· • · · · · · · * ···· · · · · * • · «··· · · » ««· ···· ·· ·· ·· ··· <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 15 ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc ccgctggctc tgctgagctg cctgatc 57 <210> 16 <211> 64 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 16 ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtatactgac 60 tgca 64 <210> 17 <211> 65 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 17 ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60 atggc 65 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 18 tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgctcttac gtatactgac tgcac <210> 19 <211> 60 <212> DNA • · · to to to • · · to to · >

to··· ···· · • to ···· ··· ··· ···· to* ·· ·* ···· <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: gen <400> 19 tttcgggaat ccacgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 20 cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ccttacgtat actgactgca 60 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: různé vlastnosti <400> 21 ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 57 <210> 22 <211> 267 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: gen <400> 22 cttacgtata ctgactgcac tgaatctggt cagaacctgt gcctgcgcga aggatctaac 60 cytdctsgnc cgsngcttgc ggccagggta acaaatgcat ccttggaccc gacggtgaaa 120 agaaccag-cg cgttvcggnk cgsdgkncva ctggcgaagg taccccgaaa ccgcagtctc 180 ataacgacgg cgacttcgaa gagacccctt ggtksnndgd gaggaacacc ttcagtaata 240 gagctcgtcg acctgcagcc caagctc 267 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: peptid <400> 23

Glu Glu Tyr Leu Gin 1 5 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 24

Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser 15 10 15

Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gin Thr Ile Ala 20 25 30

<210> 25 <211> 21 <212> PRT	sekvence
<213>	Umělá
<220> <223>	Popis	umělé sekvence: s	ignální	peptid
<400> 25 Met Lys Lys 1	Thr Ala Ile Ala Leu 5	Ala Val 10	Ala Leu Ala Gly Phe Ala 15

Thr Val

Ala Gin Ala • · • · · • »

0 0 · · • · · 0 • 0 > 0 0 • · · · ··«···· «·

< 210 > 26 <211> 22 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 26

Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr 15 10 15

Ser Phe Gly Val Leu Ala 20 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 27

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gin Ala Met Ala 20 25 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 28

Met Lys Lys Met Asn Leu Ala Val Cys Ile Ala Thr Leu Mec Gly Thr 1 5 10 15

Ala Gly Leu Met Gly Thr Ala Val Ala • φφφ φ · · · Φ Φ * · • ΦΦΦΦ Φ·φ* · φ φ ΦΦΦΦ φΦΦ φφφ ΦΦΦΦ Φ· ·Φ Φ· Φ·Φ·

25 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 29

Met Ser Ile Gin His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala 15 10 15

Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala 20 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 30

Met Lys Gin Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 15 10 15

Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 31

Met Lys Gin Ser Ala Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Ile Thr • · · · ·· ··

5

Pro Val Ser Gin Ala 20

<210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 32

Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser' Leu Ser 15 10 15

Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala 20 25 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213 > Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: signální peptid <400> 33

Met Ser Phe His His Arg Val Phe Lys Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala 15 10 15

Leu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala

Claims

1. Prekurzor hirudinu obsahující signální sekvenci vybranou ze skupiny obsahující signální sekvenci vnějšího membránového proteinu ze Serratia marcescens, proteinu oprF ze Pseudomonas fluorescens, proteinu lamb B z Escherichia coli a fumarátreduktázy ze Shewanella putrifaciens, na jejíž C-konec je připojena sekvence Leu-hirudinu.

2. Prekurzor hirudinu podle nároku 1, kde je signální sekvence vybraná ze skupiny obsahující signální sekvenci vnějšího membránového proteinu ze Serratia marcescens a fumarátreduktázy ze Shewanella putrifaciens.

3. Způsob výroby Leu-hirudinu, ve kterém se jako meziprodukt vyskytuje prekurzor hirudinu podle jednoho z nároků 1 nebo 2,vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) připraví se expresní plazmid obsahující DNA sekvenci kódující prekurzor hirudinu;

(b) expresní plazmid podle (a) se exprimuje ve vhodných buňkách E. coli;

(c) prekurzor hirudinu je secernován z E. coli a současně opracováván; a (d) Z kultivačního média se izoluje Leu-hirudin.

4. Použití prekurzoru hirudinu podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro výrobu Leu-hirudinu.

4 • · 4· · · 4 4 4 • • 4 · 4 4 4* 4 « • 4 4 4 • 4 4 4 4 4 * 4 4 4 • 4 · 4 • · • 4 4 * · « « 4 4 4 4

5. Použití prekurzoru hirudinu podle nároku 4 ve způsobu podle nároku 3.

6. Způsob zjištění vhodného signálního peptidu pro sekretorickou expresi libovolného proteinu v E. coli, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) hirudin nebo derivát hirudinu s antitrombotickým účinkem, který má na svém N-konci definovanou aminokyselinu As_x a který je svým N-koncem připojen k testovanému signálnímu peptidu, se exprimuje v E. coli;

(b) míra exprese se stanoví měřením aktivity hirudinu v supernatantu kultivačního média;

(c) kroky (a) a (b) se opakují s různými signálními peptidy;

7. Použití hirudinu nebo derivátu hirudinu s antitrombotickým účinkem, který má na svém N-konci definovanou aminokyselinu As_x, ke zjištění signálního peptidu, který umožní účinnou sekreci prekurzorového proteinu sestávajícího ze signálního peptidu a libovolného dalšího proteinu s N-koncovou aminokyselinou As_x z E. coli, za současného odštěpení signálního peptidu.

8. Použití podle nároku 7, kde As_x je leucin.

• ·· ·· · · * A A A A A a A A · A A · · » A · A A · A A AA »

A AAAA AAAA A

A A · A A A AAA aaa AAAA AA AA A* AAAA

9. Způsob výroby libovolného proteinu sekretorickou expresí v E. coli vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) vyhledá se vhodný signální peptid způsobem podle nároku 6;

(b) v E. coli se exprimuje konstrukt nukleové kyseliny kódující prekurzorový protein sestávající z vhodného signálního peptidu podle (a) a libovolného proteinu; a (c) libovolný protein se izoluje ze supernatantu kultivačního média.

10. Způsob výroby libovolného proteinu v E. coli podle nároku

9 vyznačující se tím, že N-koncová aminokyselina požadovaného proteinu je leucin, přičemž se exprimuje konstrukt nukleové kyseliny, ve kterém sekvence obsahující signální peptid kóduje signální peptid vybraný ze skupiny obsahující vnější membránový protein ze Serratia marcescens, protein oprF z Pseudomonas fluorescens, protein lamb B z Escherichia coli a fumarátreduktázu ze Shewanella putrifaciens.