JP4669181B2 - 培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 - Google Patents
培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4669181B2 JP4669181B2 JP2001525235A JP2001525235A JP4669181B2 JP 4669181 B2 JP4669181 B2 JP 4669181B2 JP 2001525235 A JP2001525235 A JP 2001525235A JP 2001525235 A JP2001525235 A JP 2001525235A JP 4669181 B2 JP4669181 B2 JP 4669181B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hirudin
- sequence
- primer
- leu
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title claims description 102
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims description 67
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 40
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 62
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 61
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 53
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 8
- 241000863432 Shewanella putrefaciens Species 0.000 claims description 7
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 101150071603 oprF gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC2=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc2ccc(O)cc2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588720 Escherichia fergusonii Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 241000178960 Paenibacillus macerans Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 102000013370 fibrillin Human genes 0.000 description 2
- 108060002895 fibrillin Proteins 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 101150012518 lamB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 108010081403 pre-beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 101100446530 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fhaE gene Proteins 0.000 description 1
- 101900345593 Escherichia coli Alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 101710171920 Fumarate reductase flavoprotein subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108050005735 Maltoporin Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100352841 Pseudomonas fluorescens oprF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100398653 Yersinia pestis lamB1 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 101150093898 fimD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108010002230 lepirudin Proteins 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940030915 refludan Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
ヒル由来製品の登録商標「レフルダン」は、臨床試験において優良な治療上の特性を示している（The Lancet, Vol.353, p.429-438）。これは、本製品が将来的により大量に必要になるであろうという結論になる。この製品の生理活性成分は、欧州特許0 324 712に記載の［Leu1,Thr2］−63−脱硫酸化ヒルジンであり、以後、略して「Leu−ヒルジン」と呼ぶことにする。
【０００２】
欧州特許0 448 093は、ヒルジンの製造方法を記載する。この特許の好ましい実施態様は、Ｎ末端のアミノ酸がアラニンからなるヒルジンである。α−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）のシグナル配列へこのヒルジンを融合させ、この融合タンパク質をコードする発現用ベクターで、その特許に記述されているように、分泌変異型大腸菌を形質転換することにより、Ala−ヒルジン粗抽出物を１Lあたり２ｇ以上の収量で製造することができる。欧州特許0 549 915は、改良された安定性を有するAla−ヒルジンの変異体について記述している。大腸菌分泌系を用いたこれら変異体の製造は１Lあたり数ｇの収量をもたらす。これゆえ、この収量は、Dodtらによって記述されたヒルジン変異体ＨＶ１（FEBS LETTERS vol.202 373-377 1986）よりも明らかに高い。DodtらのpBR322由来ベクターの代わりにpUCベクターを介した発現カセットの周知の手法による発現によって、それと共に比較される収量の僅かな増加が米国特許5,573,929で記述されている。Benderら（Appl. Microbiol Biotechnol 34, p.203-207 1990）は、Streptomyces lividans によるThr−ヒルジンの分泌について記述している(欧州特許0 171 024)。しかしながら、欧州特許0 448 093 および0 549 915に記載の収量と比較すると、その収量は明らかに少ない。これはまた、P. de Taxis du Poetらによって大腸菌のシグナル配列Ompaを介したヒルジン変異体ＨＶ１の分泌において発見された大腸菌Bの発現にもあてはまる。著者はペリプラズムで３００mg／ｌおよび、細胞上清でヒルジンの約４０mg／Lの収量を認めている。昆虫細胞系における発現は、その論文にも記載されているが、４００ｇ／Lと低い。
【０００３】
Hansenula polymorphaまたはPichia pastorisの酵母発現系で得られた収量は、S.cerevisiaeで得られたレベルとは対照的に、欧州特許0 448 093および0549915記載の収量に非常に近くなっている。
【０００４】
Rosenfeldらは、酵母Pichia pastorisによるヒルジンの発現および分泌について述べている（Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996）。この場合、培養液あたりおよそ１.５ｇ／Lの収量が得られた。同程度の量が酵母Hansenula polymorphaで得られている（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385, 1995）。
【０００５】
しかし、このような発現系のかなり不利な点は、大腸菌系よりも発酵時間が明らかに長いことである。これゆえ、Ala−ヒルジンと同様、Leu−ヒルジンが大腸菌による分泌によって製造され得るならば有利である。しかしながら、これは、欧州特許0 448 093で記述されている系を用いては不可能である。この理由のために、この特許では、トリプシンとの反応後に天然の活性成分Leu−ヒルジンに最終的に変換するLeu−ヒルジン前駆体を製造するために、トリペプチドであるAla−Thr−ArgによってLeu−ヒルジン配列を伸長させることが提案されている。この提案に従い、フラスコでの振とう培養実験により、Ala−ヒルジンに関する記載のものよりも明らかに粗収量が低いという結果が得られた。これゆえ、一見して、その効果は、後者の酵母の発現系と比較しても全くはっきりしないものである。
【０００６】
故に、本発明の目的は、シグナル配列とLeu−ヒルジンを組み合わせることにより、Leu−ヒルジンを直接プロセシングさせ、次に大腸菌により天然型Leu−ヒルジンを高収量で分泌させる、融合タンパク質を製造することであった。これは、発酵およびそれに続くヒルジン初濃度の改善のための精製の両方においてレフルダンの製造コスト面で有利な効果のある方法の開発に必要不可欠である。
【０００７】
驚いたことに、大腸菌によるLeu−ヒルジンの直接的な分泌が生じるシグナル配列が存在することと、この際Leu−ヒルジン分泌は欧州特許0 448 093に記載のものよりも効率的であることが実際に観察されたことがわかった。それゆえ、多額の出費を要しないLeu−ヒルジンの大量製造方法の開発が可能である。その発明を以下に述べる。
【０００８】
有利なシグナル配列を探索するために、ＰＣＲを用いたシグナル配列のスクリーニング方法を導入する。この方法では、鋳型として興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ、所定の逆向きのＰＣＲプライマー、および興味のある遺伝子に連結するシグナル配列をコードするＤＮＡの合成を可能にする多様な進行方向プライマーを用いる。その反応は、図１に示したスキームに示されるように進む。当業者にとっては、反応工程の数が合成されるシグナル配列の長さにより異なることは明らかである。短いシグナル配列は一回の反応工程で、より長い配列は２、３回、またはそれ以上の反応で製造できる。さらにまた、反応の数はプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの合成に使用された装置にも依存する。次に、このように合成されたシグナルペプチド融合遺伝子は、制限酵素切断部位１および２を認識する酵素で特異的に切断でき、それに対応させて切断した発現用ベクターに挿入できる。この系は、ヒルジンが興味ある遺伝子として選択された場合に一般的に重要となっている。ヒルジンのＮ末端アミノ酸の可変的な選択がさらに可能となる。これは、ヒルジンのトロンビンへの結合においては一定の効果（結合定数の変化）を有するけれども、トロンビン活性に関与するヒルジンの阻害作用については依然として測定可能なままである。
【０００９】
特許EP-B1 0 448 093は、培養上清へのヒルジンの分泌について記載している。その中のヒルジン濃度は、周知のトロンビン阻害アッセイにより直接測定できる。ヒルジン濃度とは、分泌効率およびそれによるシグナル配列の除去効率を直接測定するものである。しかし、その特許には、例えば、アミノ酸ロイシンで始まるヒルジンがCGTaseのシグナル配列を介して上清に効果的に放出できないことが記載されている。本発明では、上記の方法を用いて、これを効果的に可能にするシグナル配列を探索することができる。同様に、ロイシン以外の１９個のアミノ酸のうちの１つで開始するヒルジンの分泌についても調べることができる。これはそれぞれの場合において、シグナルペプチドのカルボキシル末端アミノ酸の効率的なプロセシングおよびここにペプチド残基を付着させるようなシグナル配列の領域により生ずる。故に、所望のタンパク質をペリプラズムへ効率的に分泌するためのシグナルペプチドを予め選択でき、従ってタンパク質の有利な製造方法を開発する機会を増すことができる。本発明は同様にそれに関するものである。本方法は、リガンド混合液とコンピテント細胞の形質転換混合物を選択培地で液体培養として一晩振とうし、次の日、実施例１１に記載のように、その細胞のアリコートをインデューサーを含有する培地に接種して誘導し、培養物のほとんどを遠心分画し、その細胞のペレットを凍結することによって進行または自動化できるものである。発現によってヒルジン活性が見られた場合には、その対応する発現用プラスミドを、細胞から再び単離され、線形化され、そして他の自動的に連結した生成物からゲル電気泳動によって分離できる。次に、線形化されたプラスミドＤＮＡを再びライゲーションし、その宿主株を新たに形質転換する。次に、個々のコロニーを単離し、その発現効率を調べることができる。この場合、その方法は医薬品認可の判定基準に合うように進行することができる。
【００１０】
この手法の別の利点は、個々の種間のアミノ酸の変換による進化の過程で生じるような、シグナルペプチドの多型、並びにヒルジンを効率よく分泌するそれらの能力について調べることが容易なことである。
【００１１】
また、この方法は、シグナル配列と興味の対象となるタンパク質との間の切断部位を予測可能な方法であるNielsenらによる記載のコンピュータープログラムの使用（Protein engineering 10, 1-6, 1997）と比較しても有利である。しかし、ここで行われる予測は、全ての場合で正しいわけではないので、有利な結合を簡単に見落としてしまうことが分かっている。さらに、正しいプロセシングの予測と実際に得られる収量との間には何ら相関がない。
【００１２】
本発明の一つの実施態様は、Serratia marcescensの外膜タンパク質、Pseudomonas fluorescensのoprFタンパク質、大腸菌のlamb Bタンパク質（ラムダレセプター（lamB）遺伝子によりコードされている）、およびShewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列、好ましくはSerratia marcescensの外膜タンパク質およびShewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列からなる群から選択される、１つのシグナル配列にLeu−ヒルジン配列がＣ末端に付着して存在するヒルジン前駆体である。
【００１３】
本発明のもうひとつの実施態様は、
(ａ) ヒルジン前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む発現用プラスミドを調製し；
(ｂ) 工程(ａ)の発現プラスミドを適切な大腸菌細胞で発現させ；
(ｃ) そのヒルジン前駆体を大腸菌で分泌させ、同時にプロセシングさせて；
(ｄ) Leu−ヒルジンを培地から直接単離する；
ことからなる、ヒルジン前駆体が上述したように中間体として生じる、Leu−ヒルジンの製造方法である。同様に、本発明の実施態様は、上述したように、Leu−ヒルジンの製造のためのヒルジン前駆体の使用であり、好ましくは、上記の方法における使用である。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、
(ａ) 抗血栓作用があり、試験されるシグナルペプチドにＮ末端で連結する所定のアミノ酸aaxをＮ末端に有するヒルジンまたはヒルジン誘導体を、大腸菌で発現させ；
(ｂ) 培養上清のヒルジン活性を測定することによってその発現率を決定し；
(ｃ) 工程(ａ)および(ｂ)を様々なシグナルペプチドで繰り返し；
(ｄ) 工程(ｂ)で見られるヒルジン活性により示される発現率を比較することにより、適切なシグナルペプチドを選択する；
ことからなる、大腸菌にて所望のタンパク質を分泌発現するための適切なシグナルペプチドを探索する方法である。
【００１５】
同様に、本発明の実施態様は、抗血栓作用があり、そのＮ末端に所定のアミノ酸を有するヒルジンまたはヒルジン誘導体を、シグナルペプチドおよびＮ末端にアミノ酸aaxを有する他の所望のタンパク質から構成される前駆体タンパク質の大腸菌からの効率的な分泌と、同時にシグナルペプチドの除去を可能にし、特にaaxがロイシンである、シグナルペプチドの探索のために使用することである。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、
(ａ) 適切なシグナルペプチドを適切なシグナルペプチドを探索する方法により見出し；
(ｂ) 工程(ａ)の適切なシグナルペプチドを含む前駆体タンパク質をコードする核酸構築物および所望のタンパク質を大腸菌で発現させ；
(ｃ) 所望のタンパク質を培養上清から単離する；
という工程からなり、特に、所望のタンパク質のＮ末端のアミノ酸がロイシンである、大腸菌での分泌発現による所望のタンパク質の製造方法である。さらに、Serratia marcescensの外膜タンパク質、Pseudomonas fluorescensのoprFタンパク質、大腸菌のlamb Bタンパク質、Shewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素からなる群から選択されたシグナルペプチドのシグナルペプチドコードを含む配列を有する核酸構築物を介してその発現が起こる。
【００１７】
Leu−ヒルジンの有効な合成および分泌を可能にするシグナル配列の合成は、実施例として記載されている。同様に、目的を達成できなかった、または収量に関する結果が悪かった他のシグナル配列の合成についても記述されている。実施例は、Leu−ヒルジンをべースとしたシグナル配列の選択に基づき本発明の概念を説明するよう意図されたものであるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
記載された方法は、例えば、実施例１１に記載のようにレフルダンの精製に使用できる。
【００１９】
実施例１：「Leu−ヒルジン」およびSerratia marcescensの外膜タンパク質のシグナル配列からなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子の合成
使用された発現プラスミドは、欧州特許0 468 539の図１に記載のベクターpJF118であり、これは欧州特許0 448 093に記載のベクターpCM7053とその基本構造が同じであることによる。
使用された鋳型は、欧州特許0 448 093の実施例１で述べられ、欧州特許0 171 024に相当するヒルジン配列を有するプラスミドpK152である。
膜タンパク質は、Braun, G. and Cole, S. T (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984)に記載されている。
必要なＤＮＡ断片を合成するために、３つのオリゴヌクレオチド配列を作製した。
【００２０】
オリゴヌクレオチドhirrevは、次の配列である。
5′TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGGTC 3′[SEQ ID NO：1]
HindIII
hirrevプライマーは、表１に示されるヒルジン遺伝子の２２７〜２１０塩基対の領域とハイブリダイズする。
【００２１】
smompaf1プライマーは次の配列である。
5′-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3′[SEQ ID NO：2]
【００２２】
smompaf1プライマーは、表１に示されたヒルジン配列の１〜１９のヌクレオチドとハイブリダイズする。そのプライマー配列のハイブリダイズする部分は、小文字で表記されている。残りの配列は、Braun, G.とCole, S. T. （Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984）によって発表された配列の２２９〜２６３塩基対の領域とハイブリダイズする。
【００２３】
smompaf2プライマーは次の配列である。
5′-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3′[SEQ ID NO：3]
【００２４】
smompaf2プライマー配列は、Braun, G.とCole, S. T.によって発表された２０１〜２４５塩基対から１３塩基対上流からハイブリダイズしており、従ってsmompaf2プライマーの配列と重複している。プライマーの１〜１２部位は、制限酵素EcoRIの認識部位を含み、さらに酵素による認識を可能にするために６つのチミンヌクレオチドが隣接している。
【００２５】
鋳型として、表１に記載の配列を有するプラスミドpK152のＤＮＡとプライマー（hirrevとsmompaf1）を用いた標準的なＰＣＲ（例 ９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４５秒の２５サイクル）において、ヒルジン配列は、大腸菌の部分的なシグナル配列によって伸長される。次に、反応生成物を鋳型として、同じ条件下でプライマー（hirrevとsmompaf2）と二回目のＰＣＲで反応させる。その反応生成物は、必要なシグナル配列によって伸長されたヒルジン配列からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片である。5′末端には制限酵素EcoRIの認識部位があり、3′末端には制限酵素HindIIIの認識部位がある。
【００２６】
二回目のＰＣＲで得られた反応生成物を、二つの制限酵素とともに二倍量の反応混合液で反応させてEcoRI／HindIII断片とし、（その２つの制限酵素で予め切断しておいた）ベクターＤＮＡにＴ４リガーゼ反応によって挿入させる。大腸菌株Mc1061あるいは分泌変異株ＷＣＭ１００のコンピテントセルを、そのライゲーション混合物で形質転換し、アンピシリンを含有するプレートに選択培養される。翌朝、実施例６に記載のように、その発現を大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現と比較する。得られた発現は、比較試験の発現よりも約１.５倍多いことが分かる。
【００２７】
実施例２：「Leu−ヒルジン」およびPseudomonas fluorescensからのoprF遺伝子産物のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRIの認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、oprF遺伝子の必要なシグナル配列をコードするものである(De, E. et al.: FEMS Microbial Lett. 127, 267-272, 1995)。
【００２８】
pfuf1プライマーは次の配列である。
5′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3′0 [SEQ ID NO：4]
【００２９】
pfjf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3′[SEQ ID NO：5]
【００３０】
この場合、pfuf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、pfuf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施される。得られた発現は、比較実験よりも約１.１倍多い。SDS−PAGEゲル電気泳動法に分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まっていることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムがバリンによるヒルジンの伸長を予測する理由から、驚くべきものであった。
【００３１】
実施例３：「Leu−ヒルジン」および大腸菌由来lamB遺伝子産物のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、lamb遺伝子の必要なシグナル配列をコードするものである (Clement, J. M. and Hofnung, M: Cell 27, 507-514, 1981)。
【００３２】
プライマーlambbf1は次の配列である。
5′GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO：6]
【００３３】
プライマーlambbf2は次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3′[SEQ ID NO：7]
【００３４】
この場合、lambbf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、lambbf2プライマーは同様にＰＣＲ２に使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルディン発現との比較により実施する。得られた発現は、比較実験と同等のレベルである。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルディンのバンドを単離し、ヒルディンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まっていることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムが正しいヒルディンのプロセシングを予測しないという理由から、驚くべきものであった。
【００３５】
実施例４：「Leu−ヒルジン」およびShewanella putrefaciensのフマル酸還元酵素フラボタンパク質サブユニット前駆体のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、Shewanella putrefaciens由来の必要なシグナル配列をコードするというものである(Pealing S.L.et al.: Biochemistry 31, 12132-12140, 1992)。その文献はタンパク質の配列のみ記載してあるので、そのアミノ酸配列をコドン表に従ってＤＮＡ配列に翻訳すると、次のようなspfccf1プライマーの配列になる。
【００３６】
5′CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：8]
【００３７】
spfccf2プライマーは、次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3′[SEQ ID NO：9]
【００３８】
この場合、spfccf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、spfccf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施される。得られた発現は、比較実験よりも約１.５倍多いことが分かる。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離して、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムによりヒルジン配列中の６番目のシステインのカルボキシル末端側でのプロセシングが予測されていたことから、この結果は驚くべきものである。
【００３９】
実施例５：Leu−ヒルジンおよびpBR322由来β−ラクタマーゼ前駆体のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点でsmompaプライマーと同じ特徴を有するが、β−ラクタマーゼ前駆体タンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Sutcliffe J. G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90(1978))。
【００４０】
blatf1プライマーは次の配列である。
5′CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc
a 3′[SEQ ID NO：10]
【００４１】
blatf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3′[SEQ ID NO：11]
【００４２】
この場合、blatf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、blatf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施する。得られた発現量は、比較実験で得られたAla−ヒルジンの収量の５０〜９０％のみである。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチド認識部位を同定するプログラムにより予期されていた。
【００４３】
実施例６：Leu−ヒルジンおよび大腸菌由来アルカリフォスファターゼの前駆体のシグナル配列との融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、大腸菌由来アルカリフォスファターゼタンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである（Shuttleworth, H., Taylor, J. and Minton, N. Nucleic Acids Res. 14(21), 8689(1986)）。
【００４４】
linkphoaf1プライマーは次の配列である。
5′GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：12]
【００４５】
linkphoaf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3′[SEQ ID NO:13]
【００４６】
この２つのプライマーは大腸菌のコドンの選択、即ち、これらは開始部分の天然の遺伝子配列とは完全には一致しないこと、に関して最適化されている。
この場合、linkphoaf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、linkphoaf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験のAla−ヒルジン収量のほんの一部であることが分かった。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチド認識部位を同定するプログラムにより予測されたものである。しかし、収量が少量であることは驚くべきことである。
【００４７】
実施例７：Leu−ヒルジンおよびE.fergusonii由来アルカリフォスファターゼ前駆体のシグナル配列との融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、E.fergusonii由来アルカリフォスファターゼタンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Du Bose, R. F. and Hartl, D, L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577(1990))。
このシグナル配列は、大腸菌由来アルカリフォスファターゼと５つの部位で異なっている。
【００４８】
fergusf1プライマーは次の配列である。
5′GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：14]
【００４９】
fergusf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3′[SEQ ID NO：15]
【００５０】
２つのプライマーは、大腸菌のコドンの選択、即ち、これらは開始部分の天然の遺伝子配列とは完全には一致しないという点で最適化されている。この場合、fergusf2プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、fergusf2プライマーは対応してＰＣＲ２に使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られたAla−ヒルジン収量のほんの一部であった。これは、大腸菌のアルカリフォスファターゼのシグナルペプチドおよびLeu−ヒルジンの構築物の場合よりさらに約５０％低い。
【００５１】
実施例８：Leu−ヒルジンおよびPaenibacillus macerans由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの前駆体のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、Paenibacillus macerans由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ遺伝子の必要なシグナル配列をコードしている(Takano, T., Fukuda, M.,Monma, M., Kobayashi, S., Kainuma, K. and Yamane, K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122(1986))。
【００５２】
baccdgf1プライマーは次の配列である。
5′CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3′[SEQ ID NO：16]
【００５３】
baccdgf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC 3′[SEQ ID NO：17]
【００５４】
この場合には、baccdgf1プライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、baccdgf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約１／４である。合成されたヒルジンは、トロンビン阻害アッセイでLeu−ヒルジンのように作用する。これは、シグナルペプチドが正しくプロセシングされていることを意味する。このことは理論的解析からの予想とは一致しておらず、これはＮ末端での８アミノ酸の伸長または２アミノ酸の切断を示すものである。
【００５５】
実施例９：Leu−ヒルジンおよび大腸菌PCFO20フィンブリリン前駆体タンパク質（fotA）のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点でsmompaプライマーと同じ特徴を有するが、大腸菌PCFO20フィンブリリン前駆体タンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Viboud, G. I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. and Svennerholm, A. M. Infect. Immun. 64(4), 1233-1239(1996))。
【００５６】
pcf1−alaプライマーは次の配列である。
5′TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC 3′[SEQ ID NO：18]
【００５７】
p-pcf2プライマーは次の配列である。
5′TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC 3′[SEQ ID NO：19]
【００５８】
この場合には、pcf1−alaプライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、p−pcf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約４０％である。
【００５９】
実施例１０：Leu−ヒルジンおよびS.typhimuriumの外膜タンパク質（fimD）のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、S.typhimuriumの外膜タンパク質の所望のシグナル配列をコードするものである(Rioux, C. R., Friendrich, M. J. and Kadner, R.J.; J. Bacteriol. 172(11), 6217-6222(1990))。
【００６０】
styfimf1プライマーは次の配列である。
5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3′[SEQ ID NO：20]
【００６１】
styfimf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGCT GAGTCTC 3′[SEQ ID NO：21]
【００６２】
この場合には、styfimf1プライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、styfimf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約１０％である。
【００６３】
実施例１１：大腸菌での発現
本実施例は、ヒルジンの発現について記載する。この目的のために、２５mg／mlのアンピシリンおよび０.５〜２mMのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地１〜５mlに、形質転換体の細胞を接種し、２８℃、２２０rpmで約２０時間振とう培養する。次に、吸光度を測定した後、細胞懸濁液を遠心分離し、ヒルジンを透明な上清で測定する。
欧州特許0 448 093に記載の分泌性変異体ＷＣＭ１００におけるプラスミドpCM7053を介したAla−ヒルジンの発現は、レフルダンの発現と平行して実施される。このことは、発現率の直接的な比較を可能にする。
より大きなスケールでの発現は、米国特許5,616,476に記載のように実施できる。次に、レフルダンを本特許の実施例５および６に記載の方法により精製できる。
【００６４】
実施例１２：ヒルジン濃度の測定
ヒルジン濃度の測定は、Grieβbachらの方法(Thrombosis Research 37, 347-350, 1985)により実施される。この目的のために、標準品レフルダンの一定量は、検量線作成のために一連の測定に含まれる。これゆえ、収量を直接mg／ｌで定めることが可能となる。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 有利なシグナル配列を探索するための、ＰＣＲを用いたシグナル配列のスクリーニング方法を示す。
【配列表】
ヒル由来製品の登録商標「レフルダン」は、臨床試験において優良な治療上の特性を示している（The Lancet, Vol.353, p.429-438）。これは、本製品が将来的により大量に必要になるであろうという結論になる。この製品の生理活性成分は、欧州特許0 324 712に記載の［Leu1,Thr2］−63−脱硫酸化ヒルジンであり、以後、略して「Leu−ヒルジン」と呼ぶことにする。
【０００２】
欧州特許0 448 093は、ヒルジンの製造方法を記載する。この特許の好ましい実施態様は、Ｎ末端のアミノ酸がアラニンからなるヒルジンである。α−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）のシグナル配列へこのヒルジンを融合させ、この融合タンパク質をコードする発現用ベクターで、その特許に記述されているように、分泌変異型大腸菌を形質転換することにより、Ala−ヒルジン粗抽出物を１Lあたり２ｇ以上の収量で製造することができる。欧州特許0 549 915は、改良された安定性を有するAla−ヒルジンの変異体について記述している。大腸菌分泌系を用いたこれら変異体の製造は１Lあたり数ｇの収量をもたらす。これゆえ、この収量は、Dodtらによって記述されたヒルジン変異体ＨＶ１（FEBS LETTERS vol.202 373-377 1986）よりも明らかに高い。DodtらのpBR322由来ベクターの代わりにpUCベクターを介した発現カセットの周知の手法による発現によって、それと共に比較される収量の僅かな増加が米国特許5,573,929で記述されている。Benderら（Appl. Microbiol Biotechnol 34, p.203-207 1990）は、Streptomyces lividans によるThr−ヒルジンの分泌について記述している(欧州特許0 171 024)。しかしながら、欧州特許0 448 093 および0 549 915に記載の収量と比較すると、その収量は明らかに少ない。これはまた、P. de Taxis du Poetらによって大腸菌のシグナル配列Ompaを介したヒルジン変異体ＨＶ１の分泌において発見された大腸菌Bの発現にもあてはまる。著者はペリプラズムで３００mg／ｌおよび、細胞上清でヒルジンの約４０mg／Lの収量を認めている。昆虫細胞系における発現は、その論文にも記載されているが、４００ｇ／Lと低い。
【０００３】
Hansenula polymorphaまたはPichia pastorisの酵母発現系で得られた収量は、S.cerevisiaeで得られたレベルとは対照的に、欧州特許0 448 093および0549915記載の収量に非常に近くなっている。
【０００４】
Rosenfeldらは、酵母Pichia pastorisによるヒルジンの発現および分泌について述べている（Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996）。この場合、培養液あたりおよそ１.５ｇ／Lの収量が得られた。同程度の量が酵母Hansenula polymorphaで得られている（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385, 1995）。
【０００５】
しかし、このような発現系のかなり不利な点は、大腸菌系よりも発酵時間が明らかに長いことである。これゆえ、Ala−ヒルジンと同様、Leu−ヒルジンが大腸菌による分泌によって製造され得るならば有利である。しかしながら、これは、欧州特許0 448 093で記述されている系を用いては不可能である。この理由のために、この特許では、トリプシンとの反応後に天然の活性成分Leu−ヒルジンに最終的に変換するLeu−ヒルジン前駆体を製造するために、トリペプチドであるAla−Thr−ArgによってLeu−ヒルジン配列を伸長させることが提案されている。この提案に従い、フラスコでの振とう培養実験により、Ala−ヒルジンに関する記載のものよりも明らかに粗収量が低いという結果が得られた。これゆえ、一見して、その効果は、後者の酵母の発現系と比較しても全くはっきりしないものである。
【０００６】
故に、本発明の目的は、シグナル配列とLeu−ヒルジンを組み合わせることにより、Leu−ヒルジンを直接プロセシングさせ、次に大腸菌により天然型Leu−ヒルジンを高収量で分泌させる、融合タンパク質を製造することであった。これは、発酵およびそれに続くヒルジン初濃度の改善のための精製の両方においてレフルダンの製造コスト面で有利な効果のある方法の開発に必要不可欠である。
【０００７】
驚いたことに、大腸菌によるLeu−ヒルジンの直接的な分泌が生じるシグナル配列が存在することと、この際Leu−ヒルジン分泌は欧州特許0 448 093に記載のものよりも効率的であることが実際に観察されたことがわかった。それゆえ、多額の出費を要しないLeu−ヒルジンの大量製造方法の開発が可能である。その発明を以下に述べる。
【０００８】
有利なシグナル配列を探索するために、ＰＣＲを用いたシグナル配列のスクリーニング方法を導入する。この方法では、鋳型として興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ、所定の逆向きのＰＣＲプライマー、および興味のある遺伝子に連結するシグナル配列をコードするＤＮＡの合成を可能にする多様な進行方向プライマーを用いる。その反応は、図１に示したスキームに示されるように進む。当業者にとっては、反応工程の数が合成されるシグナル配列の長さにより異なることは明らかである。短いシグナル配列は一回の反応工程で、より長い配列は２、３回、またはそれ以上の反応で製造できる。さらにまた、反応の数はプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの合成に使用された装置にも依存する。次に、このように合成されたシグナルペプチド融合遺伝子は、制限酵素切断部位１および２を認識する酵素で特異的に切断でき、それに対応させて切断した発現用ベクターに挿入できる。この系は、ヒルジンが興味ある遺伝子として選択された場合に一般的に重要となっている。ヒルジンのＮ末端アミノ酸の可変的な選択がさらに可能となる。これは、ヒルジンのトロンビンへの結合においては一定の効果（結合定数の変化）を有するけれども、トロンビン活性に関与するヒルジンの阻害作用については依然として測定可能なままである。
【０００９】
特許EP-B1 0 448 093は、培養上清へのヒルジンの分泌について記載している。その中のヒルジン濃度は、周知のトロンビン阻害アッセイにより直接測定できる。ヒルジン濃度とは、分泌効率およびそれによるシグナル配列の除去効率を直接測定するものである。しかし、その特許には、例えば、アミノ酸ロイシンで始まるヒルジンがCGTaseのシグナル配列を介して上清に効果的に放出できないことが記載されている。本発明では、上記の方法を用いて、これを効果的に可能にするシグナル配列を探索することができる。同様に、ロイシン以外の１９個のアミノ酸のうちの１つで開始するヒルジンの分泌についても調べることができる。これはそれぞれの場合において、シグナルペプチドのカルボキシル末端アミノ酸の効率的なプロセシングおよびここにペプチド残基を付着させるようなシグナル配列の領域により生ずる。故に、所望のタンパク質をペリプラズムへ効率的に分泌するためのシグナルペプチドを予め選択でき、従ってタンパク質の有利な製造方法を開発する機会を増すことができる。本発明は同様にそれに関するものである。本方法は、リガンド混合液とコンピテント細胞の形質転換混合物を選択培地で液体培養として一晩振とうし、次の日、実施例１１に記載のように、その細胞のアリコートをインデューサーを含有する培地に接種して誘導し、培養物のほとんどを遠心分画し、その細胞のペレットを凍結することによって進行または自動化できるものである。発現によってヒルジン活性が見られた場合には、その対応する発現用プラスミドを、細胞から再び単離され、線形化され、そして他の自動的に連結した生成物からゲル電気泳動によって分離できる。次に、線形化されたプラスミドＤＮＡを再びライゲーションし、その宿主株を新たに形質転換する。次に、個々のコロニーを単離し、その発現効率を調べることができる。この場合、その方法は医薬品認可の判定基準に合うように進行することができる。
【００１０】
この手法の別の利点は、個々の種間のアミノ酸の変換による進化の過程で生じるような、シグナルペプチドの多型、並びにヒルジンを効率よく分泌するそれらの能力について調べることが容易なことである。
【００１１】
また、この方法は、シグナル配列と興味の対象となるタンパク質との間の切断部位を予測可能な方法であるNielsenらによる記載のコンピュータープログラムの使用（Protein engineering 10, 1-6, 1997）と比較しても有利である。しかし、ここで行われる予測は、全ての場合で正しいわけではないので、有利な結合を簡単に見落としてしまうことが分かっている。さらに、正しいプロセシングの予測と実際に得られる収量との間には何ら相関がない。
【００１２】
本発明の一つの実施態様は、Serratia marcescensの外膜タンパク質、Pseudomonas fluorescensのoprFタンパク質、大腸菌のlamb Bタンパク質（ラムダレセプター（lamB）遺伝子によりコードされている）、およびShewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列、好ましくはSerratia marcescensの外膜タンパク質およびShewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列からなる群から選択される、１つのシグナル配列にLeu−ヒルジン配列がＣ末端に付着して存在するヒルジン前駆体である。
【００１３】
本発明のもうひとつの実施態様は、
(ａ) ヒルジン前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む発現用プラスミドを調製し；
(ｂ) 工程(ａ)の発現プラスミドを適切な大腸菌細胞で発現させ；
(ｃ) そのヒルジン前駆体を大腸菌で分泌させ、同時にプロセシングさせて；
(ｄ) Leu−ヒルジンを培地から直接単離する；
ことからなる、ヒルジン前駆体が上述したように中間体として生じる、Leu−ヒルジンの製造方法である。同様に、本発明の実施態様は、上述したように、Leu−ヒルジンの製造のためのヒルジン前駆体の使用であり、好ましくは、上記の方法における使用である。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、
(ａ) 抗血栓作用があり、試験されるシグナルペプチドにＮ末端で連結する所定のアミノ酸aaxをＮ末端に有するヒルジンまたはヒルジン誘導体を、大腸菌で発現させ；
(ｂ) 培養上清のヒルジン活性を測定することによってその発現率を決定し；
(ｃ) 工程(ａ)および(ｂ)を様々なシグナルペプチドで繰り返し；
(ｄ) 工程(ｂ)で見られるヒルジン活性により示される発現率を比較することにより、適切なシグナルペプチドを選択する；
ことからなる、大腸菌にて所望のタンパク質を分泌発現するための適切なシグナルペプチドを探索する方法である。
【００１５】
同様に、本発明の実施態様は、抗血栓作用があり、そのＮ末端に所定のアミノ酸を有するヒルジンまたはヒルジン誘導体を、シグナルペプチドおよびＮ末端にアミノ酸aaxを有する他の所望のタンパク質から構成される前駆体タンパク質の大腸菌からの効率的な分泌と、同時にシグナルペプチドの除去を可能にし、特にaaxがロイシンである、シグナルペプチドの探索のために使用することである。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、
(ａ) 適切なシグナルペプチドを適切なシグナルペプチドを探索する方法により見出し；
(ｂ) 工程(ａ)の適切なシグナルペプチドを含む前駆体タンパク質をコードする核酸構築物および所望のタンパク質を大腸菌で発現させ；
(ｃ) 所望のタンパク質を培養上清から単離する；
という工程からなり、特に、所望のタンパク質のＮ末端のアミノ酸がロイシンである、大腸菌での分泌発現による所望のタンパク質の製造方法である。さらに、Serratia marcescensの外膜タンパク質、Pseudomonas fluorescensのoprFタンパク質、大腸菌のlamb Bタンパク質、Shewanella putrifaciensのフマル酸還元酵素からなる群から選択されたシグナルペプチドのシグナルペプチドコードを含む配列を有する核酸構築物を介してその発現が起こる。
【００１７】
Leu−ヒルジンの有効な合成および分泌を可能にするシグナル配列の合成は、実施例として記載されている。同様に、目的を達成できなかった、または収量に関する結果が悪かった他のシグナル配列の合成についても記述されている。実施例は、Leu−ヒルジンをべースとしたシグナル配列の選択に基づき本発明の概念を説明するよう意図されたものであるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
記載された方法は、例えば、実施例１１に記載のようにレフルダンの精製に使用できる。
【００１９】
実施例１：「Leu−ヒルジン」およびSerratia marcescensの外膜タンパク質のシグナル配列からなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子の合成
使用された発現プラスミドは、欧州特許0 468 539の図１に記載のベクターpJF118であり、これは欧州特許0 448 093に記載のベクターpCM7053とその基本構造が同じであることによる。
使用された鋳型は、欧州特許0 448 093の実施例１で述べられ、欧州特許0 171 024に相当するヒルジン配列を有するプラスミドpK152である。
膜タンパク質は、Braun, G. and Cole, S. T (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984)に記載されている。
必要なＤＮＡ断片を合成するために、３つのオリゴヌクレオチド配列を作製した。
【００２０】
オリゴヌクレオチドhirrevは、次の配列である。
5′TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGGTC 3′[SEQ ID NO：1]
HindIII
hirrevプライマーは、表１に示されるヒルジン遺伝子の２２７〜２１０塩基対の領域とハイブリダイズする。
【００２１】
smompaf1プライマーは次の配列である。
5′-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3′[SEQ ID NO：2]
【００２２】
smompaf1プライマーは、表１に示されたヒルジン配列の１〜１９のヌクレオチドとハイブリダイズする。そのプライマー配列のハイブリダイズする部分は、小文字で表記されている。残りの配列は、Braun, G.とCole, S. T. （Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984）によって発表された配列の２２９〜２６３塩基対の領域とハイブリダイズする。
【００２３】
smompaf2プライマーは次の配列である。
5′-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3′[SEQ ID NO：3]
【００２４】
smompaf2プライマー配列は、Braun, G.とCole, S. T.によって発表された２０１〜２４５塩基対から１３塩基対上流からハイブリダイズしており、従ってsmompaf2プライマーの配列と重複している。プライマーの１〜１２部位は、制限酵素EcoRIの認識部位を含み、さらに酵素による認識を可能にするために６つのチミンヌクレオチドが隣接している。
【００２５】
鋳型として、表１に記載の配列を有するプラスミドpK152のＤＮＡとプライマー（hirrevとsmompaf1）を用いた標準的なＰＣＲ（例 ９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４５秒の２５サイクル）において、ヒルジン配列は、大腸菌の部分的なシグナル配列によって伸長される。次に、反応生成物を鋳型として、同じ条件下でプライマー（hirrevとsmompaf2）と二回目のＰＣＲで反応させる。その反応生成物は、必要なシグナル配列によって伸長されたヒルジン配列からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片である。5′末端には制限酵素EcoRIの認識部位があり、3′末端には制限酵素HindIIIの認識部位がある。
【００２６】
二回目のＰＣＲで得られた反応生成物を、二つの制限酵素とともに二倍量の反応混合液で反応させてEcoRI／HindIII断片とし、（その２つの制限酵素で予め切断しておいた）ベクターＤＮＡにＴ４リガーゼ反応によって挿入させる。大腸菌株Mc1061あるいは分泌変異株ＷＣＭ１００のコンピテントセルを、そのライゲーション混合物で形質転換し、アンピシリンを含有するプレートに選択培養される。翌朝、実施例６に記載のように、その発現を大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現と比較する。得られた発現は、比較試験の発現よりも約１.５倍多いことが分かる。
【００２７】
実施例２：「Leu−ヒルジン」およびPseudomonas fluorescensからのoprF遺伝子産物のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRIの認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、oprF遺伝子の必要なシグナル配列をコードするものである(De, E. et al.: FEMS Microbial Lett. 127, 267-272, 1995)。
【００２８】
pfuf1プライマーは次の配列である。
5′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3′0 [SEQ ID NO：4]
【００２９】
pfjf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3′[SEQ ID NO：5]
【００３０】
この場合、pfuf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、pfuf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施される。得られた発現は、比較実験よりも約１.１倍多い。SDS−PAGEゲル電気泳動法に分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まっていることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムがバリンによるヒルジンの伸長を予測する理由から、驚くべきものであった。
【００３１】
実施例３：「Leu−ヒルジン」および大腸菌由来lamB遺伝子産物のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、lamb遺伝子の必要なシグナル配列をコードするものである (Clement, J. M. and Hofnung, M: Cell 27, 507-514, 1981)。
【００３２】
プライマーlambbf1は次の配列である。
5′GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO：6]
【００３３】
プライマーlambbf2は次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3′[SEQ ID NO：7]
【００３４】
この場合、lambbf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、lambbf2プライマーは同様にＰＣＲ２に使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルディン発現との比較により実施する。得られた発現は、比較実験と同等のレベルである。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルディンのバンドを単離し、ヒルディンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まっていることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムが正しいヒルディンのプロセシングを予測しないという理由から、驚くべきものであった。
【００３５】
実施例４：「Leu−ヒルジン」およびShewanella putrefaciensのフマル酸還元酵素フラボタンパク質サブユニット前駆体のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、Shewanella putrefaciens由来の必要なシグナル配列をコードするというものである(Pealing S.L.et al.: Biochemistry 31, 12132-12140, 1992)。その文献はタンパク質の配列のみ記載してあるので、そのアミノ酸配列をコドン表に従ってＤＮＡ配列に翻訳すると、次のようなspfccf1プライマーの配列になる。
【００３６】
5′CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：8]
【００３７】
spfccf2プライマーは、次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3′[SEQ ID NO：9]
【００３８】
この場合、spfccf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、spfccf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施される。得られた発現は、比較実験よりも約１.５倍多いことが分かる。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離して、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。推定されるシグナルペプチダーゼ認識部位を同定するためのプログラムによりヒルジン配列中の６番目のシステインのカルボキシル末端側でのプロセシングが予測されていたことから、この結果は驚くべきものである。
【００３９】
実施例５：Leu−ヒルジンおよびpBR322由来β−ラクタマーゼ前駆体のシグナル配列の融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点でsmompaプライマーと同じ特徴を有するが、β−ラクタマーゼ前駆体タンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Sutcliffe J. G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90(1978))。
【００４０】
blatf1プライマーは次の配列である。
5′CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc
a 3′[SEQ ID NO：10]
【００４１】
blatf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3′[SEQ ID NO：11]
【００４２】
この場合、blatf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、blatf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いたAla−ヒルジン発現との比較により実施する。得られた発現量は、比較実験で得られたAla−ヒルジンの収量の５０〜９０％のみである。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチド認識部位を同定するプログラムにより予期されていた。
【００４３】
実施例６：Leu−ヒルジンおよび大腸菌由来アルカリフォスファターゼの前駆体のシグナル配列との融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、大腸菌由来アルカリフォスファターゼタンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである（Shuttleworth, H., Taylor, J. and Minton, N. Nucleic Acids Res. 14(21), 8689(1986)）。
【００４４】
linkphoaf1プライマーは次の配列である。
5′GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：12]
【００４５】
linkphoaf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3′[SEQ ID NO:13]
【００４６】
この２つのプライマーは大腸菌のコドンの選択、即ち、これらは開始部分の天然の遺伝子配列とは完全には一致しないこと、に関して最適化されている。
この場合、linkphoaf1プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、linkphoaf2プライマーはＰＣＲ２に対応して使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験のAla−ヒルジン収量のほんの一部であることが分かった。SDS−PAGEゲル電気泳動法による分画の後、ヒルジンのバンドを単離し、ヒルジンのＮ末端配列を決定する。その配列は完全にそのままであり、アミノ酸ロイシンから始まることがわかる。この結果は、推定されるシグナルペプチド認識部位を同定するプログラムにより予測されたものである。しかし、収量が少量であることは驚くべきことである。
【００４７】
実施例７：Leu−ヒルジンおよびE.fergusonii由来アルカリフォスファターゼ前駆体のシグナル配列との融合タンパク質の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーとは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、E.fergusonii由来アルカリフォスファターゼタンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Du Bose, R. F. and Hartl, D, L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577(1990))。
このシグナル配列は、大腸菌由来アルカリフォスファターゼと５つの部位で異なっている。
【００４８】
fergusf1プライマーは次の配列である。
5′GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO：14]
【００４９】
fergusf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3′[SEQ ID NO：15]
【００５０】
２つのプライマーは、大腸菌のコドンの選択、即ち、これらは開始部分の天然の遺伝子配列とは完全には一致しないという点で最適化されている。この場合、fergusf2プライマーは実施例１に従ってＰＣＲ１に使用され、fergusf2プライマーは対応してＰＣＲ２に使用される。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られたAla−ヒルジン収量のほんの一部であった。これは、大腸菌のアルカリフォスファターゼのシグナルペプチドおよびLeu−ヒルジンの構築物の場合よりさらに約５０％低い。
【００５１】
実施例８：Leu−ヒルジンおよびPaenibacillus macerans由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの前駆体のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、Paenibacillus macerans由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ遺伝子の必要なシグナル配列をコードしている(Takano, T., Fukuda, M.,Monma, M., Kobayashi, S., Kainuma, K. and Yamane, K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122(1986))。
【００５２】
baccdgf1プライマーは次の配列である。
5′CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3′[SEQ ID NO：16]
【００５３】
baccdgf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC 3′[SEQ ID NO：17]
【００５４】
この場合には、baccdgf1プライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、baccdgf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約１／４である。合成されたヒルジンは、トロンビン阻害アッセイでLeu−ヒルジンのように作用する。これは、シグナルペプチドが正しくプロセシングされていることを意味する。このことは理論的解析からの予想とは一致しておらず、これはＮ末端での８アミノ酸の伸長または２アミノ酸の切断を示すものである。
【００５５】
実施例９：Leu−ヒルジンおよび大腸菌PCFO20フィンブリリン前駆体タンパク質（fotA）のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点でsmompaプライマーと同じ特徴を有するが、大腸菌PCFO20フィンブリリン前駆体タンパク質の必要なシグナル配列をコードするものである(Viboud, G. I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. and Svennerholm, A. M. Infect. Immun. 64(4), 1233-1239(1996))。
【００５６】
pcf1−alaプライマーは次の配列である。
5′TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC 3′[SEQ ID NO：18]
【００５７】
p-pcf2プライマーは次の配列である。
5′TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC 3′[SEQ ID NO：19]
【００５８】
この場合には、pcf1−alaプライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、p−pcf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約４０％である。
【００５９】
実施例１０：Leu−ヒルジンおよびS.typhimuriumの外膜タンパク質（fimD）のシグナル配列の融合遺伝子の合成
構築物の作製は、smompaf1／f2プライマーの代わりに、２つの新規プライマーを使用すること以外は、実施例１に記載のスキームに従って実施する。その２つの新規プライマーは、ヒルジン遺伝子および制限酵素EcoRI認識配列に対して特異的であるという点で、smompaプライマーと同じ特徴を有するが、S.typhimuriumの外膜タンパク質の所望のシグナル配列をコードするものである(Rioux, C. R., Friendrich, M. J. and Kadner, R.J.; J. Bacteriol. 172(11), 6217-6222(1990))。
【００６０】
styfimf1プライマーは次の配列である。
5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3′[SEQ ID NO：20]
【００６１】
styfimf2プライマーは次の配列である。
5′ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGCT GAGTCTC 3′[SEQ ID NO：21]
【００６２】
この場合には、styfimf1プライマーを実施例１に従ってＰＣＲ１に使用し、styfimf2プライマーをＰＣＲ２に対応して使用する。発現は、大腸菌株WCM100／pCM7053を用いてAla−ヒルジン発現との比較により行われる。得られた発現量は、比較実験で得られた収量の約１０％である。
【００６３】
実施例１１：大腸菌での発現
本実施例は、ヒルジンの発現について記載する。この目的のために、２５mg／mlのアンピシリンおよび０.５〜２mMのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地１〜５mlに、形質転換体の細胞を接種し、２８℃、２２０rpmで約２０時間振とう培養する。次に、吸光度を測定した後、細胞懸濁液を遠心分離し、ヒルジンを透明な上清で測定する。
欧州特許0 448 093に記載の分泌性変異体ＷＣＭ１００におけるプラスミドpCM7053を介したAla−ヒルジンの発現は、レフルダンの発現と平行して実施される。このことは、発現率の直接的な比較を可能にする。
より大きなスケールでの発現は、米国特許5,616,476に記載のように実施できる。次に、レフルダンを本特許の実施例５および６に記載の方法により精製できる。
【００６４】
実施例１２：ヒルジン濃度の測定
ヒルジン濃度の測定は、Grieβbachらの方法(Thrombosis Research 37, 347-350, 1985)により実施される。この目的のために、標準品レフルダンの一定量は、検量線作成のために一連の測定に含まれる。これゆえ、収量を直接mg／ｌで定めることが可能となる。
【００６５】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 有利なシグナル配列を探索するための、ＰＣＲを用いたシグナル配列のスクリーニング方法を示す。
【配列表】
Claims (5)
- Serratia marcescensの外膜タンパク質、Pseudomonas fluorescensのoprFタンパク質およびShewanella putrefaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列を含む群から選択される１つのシグナル配列にLeu−ヒルジン配列がＣ末端に付着して存在する、ヒルジン前駆体であって、ここで、Leu−ヒルジン配列は以下の配列である：
LTYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ
ヒルジン前駆体。 - シグナル配列が、Serratia marcescensの外膜タンパク質およびShewanella putrefaciensのフマル酸還元酵素のシグナル配列を含む群から選択された、請求項１に記載のヒルジン前駆体。
- (ａ) ヒルジン前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む発現用プラスミドを作製し；
(ｂ) 工程(ａ)の発現用プラスミドを適切な大腸菌細胞中で発現させ；
(ｃ) ヒルジン前駆体を大腸菌から分泌させて同時にプロセシングさせ；
(ｄ) Leu−ヒルジンを培地から単離する、
ことからなる、請求項１または２に記載のヒルジン前駆体が中間体として生じる、請求項１に記載のLeu−ヒルジンの製造方法。 - 請求項１に記載のLeu−ヒルジンを製造するための請求項１または２に記載のヒルジン前駆体の使用。
- 請求項３に記載の方法における請求項４に記載のヒルジン前駆体の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19944870A DE19944870A1 (de) | 1999-09-18 | 1999-09-18 | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
| DE19944870.1 | 1999-09-18 | ||
| PCT/EP2000/008537 WO2001021662A1 (de) | 1999-09-18 | 2000-09-01 | Signalsequenzen zur herstellung von leu-hirudin über sekretion durch e. coli in das kulturmedium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003510041A JP2003510041A (ja) | 2003-03-18 |
| JP4669181B2 true JP4669181B2 (ja) | 2011-04-13 |
Family
ID=7922547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001525235A Expired - Fee Related JP4669181B2 (ja) | 1999-09-18 | 2000-09-01 | 培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7455987B1 (ja) |
| EP (1) | EP1216259B1 (ja) |
| JP (1) | JP4669181B2 (ja) |
| KR (1) | KR100737189B1 (ja) |
| CN (2) | CN1192037C (ja) |
| AR (1) | AR025660A1 (ja) |
| AT (1) | ATE357458T1 (ja) |
| AU (1) | AU775923B2 (ja) |
| BR (1) | BR0014519A (ja) |
| CA (1) | CA2385287C (ja) |
| CZ (1) | CZ2002899A3 (ja) |
| DE (2) | DE19944870A1 (ja) |
| DK (1) | DK1216259T3 (ja) |
| EE (1) | EE05187B1 (ja) |
| HK (2) | HK1049172A1 (ja) |
| HR (1) | HRP20020226B1 (ja) |
| HU (1) | HUP0202596A3 (ja) |
| IL (2) | IL148624A0 (ja) |
| ME (1) | MEP27908A (ja) |
| MX (1) | MXPA02002469A (ja) |
| NO (1) | NO329723B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ517825A (ja) |
| PL (1) | PL205117B1 (ja) |
| RS (1) | RS50435B (ja) |
| RU (1) | RU2261867C2 (ja) |
| SK (1) | SK287865B6 (ja) |
| TR (2) | TR200200667T2 (ja) |
| WO (1) | WO2001021662A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA200202106B (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| MXPA06005705A (es) | 2003-11-21 | 2006-08-23 | Dow Global Technologies Inc | Sistemas de expresion mejorada con secrecion de sistema de sec. |
| AU2005269527B2 (en) | 2004-07-26 | 2011-12-01 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
| DE102005046113A1 (de) * | 2005-09-27 | 2007-03-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Amidierung von Polypetiden mit C-terminalen basischen Aminosäuren unter Verwendung spezifischer Endoproteasen |
| DE102006044841A1 (de) * | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Wacker Chemie Ag | Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| CN102517280A (zh) | 2007-01-31 | 2012-06-27 | 菲尼克斯股份有限公司 | 用于提高表达的细菌前导序列 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| CA2685326A1 (en) | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Dow Global Technologies Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| EP2968470B1 (en) | 2013-03-12 | 2020-10-28 | The General Hospital Corporation | Modified mullerian inhibiting substance (mis) proteins and uses thereof for the treatment of diseases |
| EP3079712B1 (en) | 2013-12-11 | 2022-02-02 | The General Hospital Corporation | Use of mullerian inhibiting substance (mis) proteins for contraception and ovarian reserve preservation |
| CN108220369B (zh) * | 2017-12-04 | 2021-03-12 | 广东双骏生物科技有限公司 | 一种生产重组水蛭素的方法 |
| CN108359689B (zh) * | 2018-01-19 | 2021-03-23 | 华中农业大学 | 利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法 |
| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH025891A (ja) * | 1988-02-23 | 1990-01-10 | Hoechst Ag | ヒルディン誘導体 |
| JPH04173798A (ja) * | 1990-11-08 | 1992-06-22 | Nikko Kyodo Co Ltd | ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤 |
| JPH04211391A (ja) * | 1990-03-22 | 1992-08-03 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター |
| JPH06508036A (ja) * | 1991-06-12 | 1994-09-14 | リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 組換えニューロトロフィンの生産および回収 |
| US5652139A (en) * | 1987-04-23 | 1997-07-29 | Monsanto Company | DNA comprising lamb secretion signal sequence and mature IGF-1 sequence |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| EP0324712B1 (de) * | 1985-04-11 | 1993-04-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Hirudin-Derivat |
| WO1992008736A1 (fr) * | 1990-11-08 | 1992-05-29 | Nippon Mining Company Limited | Mutant d'hirudine, sa production, anticoagulant, vecteur secretoire, microorganisme transforme par ledit vecteur et production d'un produit a partir dudit microorganisme |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
| DE4140381A1 (de) | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
-
1999
- 1999-09-18 DE DE19944870A patent/DE19944870A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-09-01 CA CA2385287A patent/CA2385287C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 CZ CZ2002899A patent/CZ2002899A3/cs unknown
- 2000-09-01 RS YUP-146/02A patent/RS50435B/sr unknown
- 2000-09-01 CN CNB00812955XA patent/CN1192037C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 EP EP00956507A patent/EP1216259B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-01 RU RU2002110278/13A patent/RU2261867C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 EE EEP200200139A patent/EE05187B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 SK SK362-2002A patent/SK287865B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 BR BR0014519-0A patent/BR0014519A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-01 PL PL354444A patent/PL205117B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 KR KR1020027003577A patent/KR100737189B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 AT AT00956507T patent/ATE357458T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 DK DK00956507T patent/DK1216259T3/da active
- 2000-09-01 DE DE50014189T patent/DE50014189D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-01 MX MXPA02002469A patent/MXPA02002469A/es active IP Right Grant
- 2000-09-01 IL IL14862400A patent/IL148624A0/xx unknown
- 2000-09-01 NZ NZ517825A patent/NZ517825A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 HU HU0202596A patent/HUP0202596A3/hu unknown
- 2000-09-01 WO PCT/EP2000/008537 patent/WO2001021662A1/de active IP Right Grant
- 2000-09-01 TR TR2002/00667T patent/TR200200667T2/xx unknown
- 2000-09-01 JP JP2001525235A patent/JP4669181B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 TR TR2005/01541T patent/TR200501541T2/xx unknown
- 2000-09-01 ME MEP-279/08A patent/MEP27908A/xx unknown
- 2000-09-01 CN CNB2004100346716A patent/CN1269838C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 AU AU68421/00A patent/AU775923B2/en not_active Ceased
- 2000-09-14 AR ARP000104820A patent/AR025660A1/es active IP Right Grant
- 2000-09-18 US US09/664,326 patent/US7455987B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-11 IL IL148624A patent/IL148624A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-03-13 NO NO20021254A patent/NO329723B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-03-14 ZA ZA200202106A patent/ZA200202106B/en unknown
- 2002-03-15 HR HR20020226A patent/HRP20020226B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-18 HK HK03101205A patent/HK1049172A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-13 HK HK05100336A patent/HK1068352A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5652139A (en) * | 1987-04-23 | 1997-07-29 | Monsanto Company | DNA comprising lamb secretion signal sequence and mature IGF-1 sequence |
| JPH025891A (ja) * | 1988-02-23 | 1990-01-10 | Hoechst Ag | ヒルディン誘導体 |
| JPH04211391A (ja) * | 1990-03-22 | 1992-08-03 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター |
| JPH04173798A (ja) * | 1990-11-08 | 1992-06-22 | Nikko Kyodo Co Ltd | ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤 |
| JPH06508036A (ja) * | 1991-06-12 | 1994-09-14 | リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 組換えニューロトロフィンの生産および回収 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4669181B2 (ja) | 培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 | |
| Curran | Decoding with the A: I wobble pair is inefficient | |
| EP0035384B1 (en) | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence | |
| Lukomski et al. | Identification and characterization of a second extracellular collagen-like protein made by group A Streptococcus: control of production at the level of translation | |
| AU701476B2 (en) | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides | |
| Mecsas et al. | Identification and characterization of an outer membrane protein, OmpX, in Escherichia coli that is homologous to a family of outer membrane proteins including Ail of Yersinia enterocolitica | |
| EP0531404B1 (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| Sargent et al. | Reassignment of the gene encoding the Escherichia coli hydrogenase 2 small subunit: identification of a soluble precursor of the small subunit in a hypB mutant | |
| Strom et al. | Mapping of export signals of Pseudomonas aeruginosa pilin with alkaline phosphatase fusions | |
| US5902735A (en) | Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for hirudin, hirudin obtained, and its pharmaceutical use | |
| Nahlik et al. | Nucleotide sequence and transcriptional organization of the Escherichia coli enterobactin biosynthesis cistrons entB and entA | |
| JPH04211391A (ja) | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター | |
| JPH06315384A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 | |
| Chiariotti et al. | Nucleotide sequence of the Escherichia coli hisD gene and of the Escherichia coli and Salmonella typhimurium hisIE region | |
| Nam et al. | Conservation of a dual-start motif in P22 lysis gene regulation | |
| US5677153A (en) | Methods for modifying DNA and for detecting effects of such modification on interaction of encoded modified polypeptides with target substrates | |
| AU777246B2 (en) | Microbial protein expression system | |
| US6800732B2 (en) | Human collagenase inhibitor, recombinant vector system for using same and recombinant DNA method for the manufacture of same | |
| Donly et al. | Affinities of ribosomal protein S20 and C-terminal deletion mutants for 16S rRNA and S20 mRNA | |
| JP2000501617A (ja) | 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター | |
| MOFFAT et al. | Functional domains in the Escherichia coli release factors: Activities of hybrids between RF‐1 and RF‐2 | |
| US6242177B1 (en) | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides | |
| US8527211B2 (en) | Method to produce recombinant MBP8298 and other polypeptides by nucleotide structure optimization | |
| KR930003913B1 (ko) | 트롬빈 억제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법 | |
| Boyd | Use of gene fusions to determine membrane protein topology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070817 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090929 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100511 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100806 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100806 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100928 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101124 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101221 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110114 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140121 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |