JP3370094B2 - リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現 - Google Patents

リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の説明 技術分野 本発明は組換えタンパク質合成の分野に関する。特
に、目的のポリペプチドが、リーダー配列のない融合パ
ートナーを含む融合ポリペプチドとして発現され、ここ
で、融合パートナーは、融合ポリペプチドを宿主細胞の
細胞質から分泌させる。
背景技術 遺伝子工学は、組換え発現系、特に、Escherichia co
li(E.coli)のような原核生物における発現により、ク
ローン化DNAにコードされたポリペプチドを大量に産生
することを可能にした。宿主細胞によって全く産生され
ないか、または限られた量しか産生されないこのいずれ
かの発現された異種ポリペチドは、宿主細胞の全細胞ポ
リペプチドの重要部分を構成し得る。
しかし、いくつかの問題に頻繁に遭遇する。細菌細胞
質に過剰に発現されたポリペプチドは、不溶性の「偏在
体」としてしばしは蓄積する(Williamsら、Science 21
5:687−688,1982;Schonerら、Biotechnology :151−1
54,1985)。偏在体形成は、細菌発現系に限らない。例
えば、DrosophilaのKruppel遺伝子産物は、バキュロウ
イルス発現系を用いて昆虫細胞において産生された場
合、偏在体を形成し得る。偏在体の形態で蓄積したポリ
ペプチドは、生物学的または生化学的アッセイにおける
スクリーニングの目的にとって、もしくは薬剤として比
較的有用でない。この不溶性物質を活性な可溶性ポリペ
プチドに変換するには、時間を要する困難な可溶化およ
び再生プロトコールが要求され、これによってしばしば
生物学的に活性なポリペプチドの正味の収量が大幅に減
少する。
異種ポリペプチドが可溶形態で細菌の細胞質に発現さ
れた場合でさえ、それらは宿主プロテアーゼによる分解
の結果のためにあまり蓄積しないことが多い。さらに、
蓄積されたポリペプチドは、所望のアミノ末端とは異な
るアミノ末端をしばしば有する。
これらの問題に対する1つのアプローチは、目的のポ
リペプチドを、lacZおよびtrpE遺伝子産物(Goeddel
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76:106−110,1979;Furman
ら、Biotechnology :1047−1051,1987);マルトース
結合ポリペプチド(Di Guanら、Gene 67:21−30,198
8);グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(Johnso,
Nature 338:585−587,1989);ユビキチン(Millerら、
Biotechnology :698−704,1989);またはチオレドキ
シン(LaVallieら、Biotechnology 11:187−193,1993)
のようなポリペプチド融合パートナーと融合することで
ある。しばしば融合パートナーは、特に組換え宿主が生
育に最適な温度より低い温度で培養される場合、目的の
ポリペプチドに高溶解性のような所望の特性を付与する
(LaVallieら、1993,前出)。しかし、低温培養は、そ
の方法を商業的規模で行うのを好ましくないものにする
その他の実際上の問題を生じる。
ポリペプチド融合物の使用はまた、組換え宿主に効率
的に蓄積するには小さすぎるポリペプチドを産生させる
(Schultzら、J.Bacteriol.169:5385−5392,1987)。さ
らに、適切な融合パートナーは、例えば親和性ペプチド
として作用し、その他の数百のポリペプチドを含有する
細胞抽出物由来の融合ポリペプチドの回収および精製を
容易にする(例えば、WO 91/11454参照)。
しかし、融合ポリペプチドを使用することには欠点が
ある。酵素または化学的手段によって、融合パートナー
から所望のポリペプチドを切断する必要がある場合が多
い。これは、融合パートナーの配列と所望のポリペプチ
ドの配列との間に切断のための適切な標的配列を配置す
ることによって行うことができる。残念なことに、ポリ
ペプチド切断に最も広く使用されている酵素は、高価で
あり、非効率的、すなわちそれらの切断が不正確である
ため、多数の融合構築物に常に適用できるわけではな
い。例えば、エンテロキナーゼおよびXa因子は非常に特
異的なエンンドプロテアーゼであるが、これらの哺乳動
物酵素は製造に費用がかかり、そして原核生物宿主細胞
に発現される目的のポリペプチドを、哺乳動物酵素で処
理する前に宿主細胞から単離しなければならないので、
大量生産のためにはさらにかなりの費用を要する。さら
に、酵素が基質を切断するときの効率および特異性は、
高い可変性である。例えば、酵素様ズブチリシンは製造
が比較的安価であるが、それが基質を切断する精度が、
現在の「Good Manufacturing Practices」(GMP)にお
いて、商業規模の製造法として決して許容されない。
いくつかの酵母ユビキチンヒドロラーゼには、ユビキ
チンが融合パートナーであり、そして切断部位の直ぐ下
流のアミノ酸がプロリンでない融合物を効率的に切断す
るものがある(Willerら、前出,1989;TobiasおよびVars
havsky,J.Biol.Chem.266:12021−12028,1991;WO 88/024
06およびWO 89/09829も参照)。酵母Saccharomyces cer
evisiae(S.cerevisiae)からクローン化されたユビキ
チンヒドロラーゼ遺伝子の1つであるYUH−1(Miller
ら、前出1989)は、下流ポリペプチドが約25kDよりも大
きい融合物を効率的に切断しない。もう1つのS.cerevi
siaeユビキチンヒドロラーゼ遺伝子(TobiasおよびVars
havsky,J.Biol.Chem.266:12021−12028,1991)は、切断
部位の下流のポリペプチドが130kD程度の大きさのユビ
キチン融合物を切断することができる。両方のユビキチ
ンヒドロラーゼは、E.coliの細胞内に発現された場合に
活性になり、これによってインビボで融合物を切断する
のに使用され得るものとなる。しかし、ユビキチンを融
合パートナーとして使用することは、ユビキナン融合構
築物を有する多コピープラスミドが、例えばE.coli宿主
細胞の増殖を遅らせ、生存度を損なうという事実により
勧められない。
融合ポリペプチドの細胞質蓄積は、異種ポリペプチド
部分が細胞質の強い還元環境下で正しく折りたたむこと
ができないことがあり、そのために生物学的に活性なポ
リペプチドの収量が低くなるという欠点を有する。この
問題を克服するために、目的のポリペプチドを、分泌
(すなわち、非細胞質部位に輸送する)のための前駆体
ポリペプチドのアミノ末端に存在する短い(15〜30アミ
ノ酸)配列である「シグナルペプチド」に融合し得る。
E.coliにおいて、そのような位置は、内膜、細胞周辺
腔、細胞壁、および外膜を含む。代表的には、細胞質外
へのポリペプチドの輸送の直前または輸送の間のある時
点において、シグナル配列が宿主酵素によって除去され
て、「成熟」ポリペプチドを産生する。シグナル配列が
宿主酵素によって除去されて、「成熟」ポリペプチドを
産生するこれらの場合において、シグナル配列はまた
「リーダーペプチド」として公知である(グラム陰性細
菌における一般分泌経路について最近の概説、およびリ
ーダーペプチドに関する議論については、Pugsley,Micr
obiol.Rev.57:50,108,1993を参照)。
発現ポリペプチドの細胞周辺腔への局在は、「浸透シ
ョック法」およびその他の技法を含むポリペプチドの簡
単な回収法を使用することができるので、有益である。
リーダー配列を用いて、異種ポリペプチドをE.coliの細
胞周辺腔に送達し得るが、ポリペプチドがこの方法によ
って可溶形態で効率的に蓄積することはほとんどない。
内膜の脂質2重層を横切るポリペプチドのトランスロケ
ーションは非効率的であると考えられ、特に異種ポリペ
プチドに連結しているリーダー配列を含む融合物の場合
においてそうである。
本来、リーダー配列を有していない数種のポリペプチ
ドのみが、浸透ショックまたは凍結解凍プロトコールに
よる処理時にそれらが細胞から選択的に放出されること
によって示されるように、非細胞質(または細胞周辺)
位置へ分泌される。これらは、チオレドキシン(Lunnお
よびPigiet,前出,1982)および延長因子Tu(EF−Tu)
(Jacobsonら、Biochemistry 15:2297−2302,1976)を
含む。E.coliで発現するIL−1−βは、改変浸透ショッ
ク法によって抽出されている(Joseph−Liauzunら、前
出,1990)。
細胞外局在もまた有効であり、そして少なくとも2つ
の異なる戦略によって達成され得る:(1)外膜を透過
性にし、細胞周辺ポリペプチドを「漏出」させる(米国
特許第4,595,658号;Kotoら、Cene 54:197−202,198
7);および(2)細胞外輸送を導く配列への融合(Nag
ahariら、EMBO J.:3589−3592,1985;米国特許第5,14
3,830号)。しかし、これらの方法は多くの場合に機能
しない;たとえ機能したとしても、その方法は一般に非
効率的であり、そして、しばしば所望のアミノ末端を有
するポリペプチドを産生しない(Hollandら、Biochimie
72:131−141,1990)。
融合ポリペプチドの構築において、理想的な融合パー
トナーとは、組換え宿主細胞、例えばE.coli中で、最適
な生育温度で、多種の異種ポリペプチドを産生するのに
有用なものである。好ましくは、そのような融合パート
ナーは、細胞位置で可溶な活性形態の所望のポリペプチ
ドの蓄積を高め、その位置でそれは、例えば、タンパク
質分解から保護され、融合ポリペプチドが単純な方法で
回収することができる。そのような融合パートナーが、
効果的、安価、およびインビボにおいて正確な切断系の
使用を可能にするのであれば、さらに有益である。
発明の開示 本発明は、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメント
から本質的になる融合パートナーを含む宿主細胞の細胞
質から選択的に輸送される融合ポリペプチドに関し、こ
こで該融合パートナーが任意のリーダー配列を有してい
ない。特に、本発明は、以下を含む融合ポリペプチドを
包含する:(a)細胞質外輸送を導くことができ、成熟
ポリペプチドの少なくとも1つのフラグメントからなる
本質的に融合パートナーであって、ここで該成熟ポリペ
プチドがインターロイキン1様ポリペプチドおよびリー
ダー欠失トランスロケーションポリペプチドからなる群
から選択される;および(b)目的のポリペプチド、こ
こで目的のポリペプチドが該融合パートナーのカルボキ
シ末端に対して遠位に位置する。好ましくは、本発明の
融合ポリペプチドはさらに、該融合パートナーと該目的
ポリペプチドとの間に位置するリンカーペプチドを含
む。最も好ましくは、該リンカーペプチドは、切断部
位、例えば、ユビキチンヒドロラーゼによって切断する
部位を含む。
本発明の融合ポリペプチドは、多種の宿主細胞中、例
えばE.coli中で、可溶性、活性、および回収容易な形態
で、宿主細胞の生育にとって生理学的に最適な温度また
はそれに近い温度において産生され得る。種々の目的の
ポリペプチドが、この様式で産生され得、ポリペプチド
は酵素、成長因子、単鎖抗体、DNAまたはRNA結合タンパ
ク質、膜レセプター、およびそれらのフラグメントを包
含する。
また本発明に含まれるのは、核酸、好ましくは本発明
の融合ポリペプチドをコードする発現ベクター、および
そのような核酸を含む宿主細胞である。好ましくは、そ
のような宿主細胞はさらに、宿主細胞の細胞質中にタン
パク質分解酵素を発現することができる核酸を含み、こ
のタンパク質分解酵素は融合ポリペプチド中、好ましく
はリンカー中に、切断部位を特異的に認識する。このよ
うな系は融合ポリペプチドのインビボでの切断に有用で
あり、特に、ユビキチンヒドロラーゼが同時発現されて
融合パートナーと目的のポリペプチドの間に位置するリ
ンカー内に位置する適合性切断部位で融合ポリペプチド
を切断する場合に有用である。
これらの形質転換宿主細胞は、融合ポリペプチドとし
ての目的のポリペプチドの組換え産生に有用であり、ま
た、好ましくは目的のポリペプチドから、融合ポリペプ
チドの他の配列、例えば、IL−1様ポリペプチド、リー
ダー欠失トランスロケーションポリペプチド、およびリ
ンカーを切断して除くために、インビボでの切断を用い
る。
本発明はさらに、本発明の核酸によってコードされる
本発明の実質的に精製された融合ポリペプチドの産生方
法を含み、この方法は以下の工程を包含する:(a)該
融合ポリペプチドをコードする該核酸を宿主細胞に導入
し、それによって形質転換宿主細胞を産生する工程;
(b)該融合ポリペプチドを発現させるのに適切な条件
下で該形質転換宿主細胞を培養し、それによって該融合
ポリペプチドを発現する工程;および(c)該融合ポリ
ペプチドを精製し、それによって実質的に精製された融
合ポリペプチドを得る工程。
本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプ
チドを産生する方法を含み、この方法は以下の工程を包
含する:(a)切断部位を含むリンカーペプチドを含み
本発明の融合ポリペプチドの1つをコードする本発明の
核酸を、宿主細胞に導入し、それによって形質転換宿主
細胞を産生する工程;(b)該融合ポリペプチドを発現
させるのに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養
し、それによって該融合ポリペプチドを発現する工程;
(c)該融合ポリペプチドを、切断部位を認識するタン
パク質分解酵素または切断剤で切断し、これによって該
目的のポリペプチドを産生する工程;および(d)該目
的のポリペプチドを精製し、それによって実質的に精製
された目的のポリペプチドを得る工程。
本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプ
チドの産生方法を含み、この方法は以下の工程を包含す
る:(a)切断部位を含むリンカーペプチドを含む本発
明の融合ポリペプチドの1つをコードする本発明の核酸
を、宿主細胞に導入し、ここで、該宿主細胞がさらに、
該切断部位を特異的に認識するタンパク質分解酵素を該
宿主細胞中に発現させることができる核酸を含み;それ
によって形質転換宿主細胞を産生する工程;(b)該融
合ポリペプチドおよび該タンパク質分解酵素を発現させ
るのに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、そ
れによって該融合ポリペプチドを発現させ、該融合ポリ
ペプチドのインビボでの切断を引き起こし、該目的のポ
リペプチドを産生する工程;および(c)該目的のポリ
ペプチドを精製し、それによって実質的に精製された目
的のポリペプチドを得る工程。
本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプ
チドの製造方法を含み、この方法は以下の工程を包含す
る:(a)切断部位を含むリンカーペプチドを含む本発
明の融合ポリペプチドの1つをコードする本発明の核酸
を、宿主細胞に導入し、それによって形質転換宿主細胞
を産生する工程;(b)該融合ポリペプチド発現させる
のに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、それ
によって該融合ポリペプチドを発現する工程;(c)該
融合ポリペプチドを精製し、それによって実質的に精製
された融合ポリペプチドを産生する工程;(d)該実質
的に精製された融合ポリペプチドを、該切断部位を認識
するタンパク質分解酵素または切断剤で切断し、それに
よって該目的のポリペプチドを産生する工程;および
(e)該目的のポリペプチドを精製し、それによって実
質的に精製された目的のポリペプチドを得る工程。
図面の簡単な説明 図1は、IL−1様タンパク質ファミリーの5つのメン
バーの配列のならびを示す:(1)E.coli DsbA、
(2)ヒトIL−1−β、(3)ヒトIL−1−α、(4)
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)、および(5)
ヒト酸性FGF。
図2は、E.coli DsbA、ヒトIL−1−β、ヒトIL−1
−α、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)の成熟ポ
リペプチドと、Vibrio choleraeの毒素と同時調節され
る繊毛(toxin coregulated prlus)(TcpG)ポリペプ
チドとの間の相同性を要約している。各成熟ポリペプチ
ドのサイズが括弧内に示されている。
図3は、IL−1−βが発現される37℃で増殖させたE.
coli細胞由来画分のクーマシー染色SDS−PAGEゲルを示
す。A:時間0(0')における全細胞溶解物(「WCL」);
B:120分(120')でのWCL;C:TEX抽出物;D:「細胞質」画
分;E:「不溶性」画分。各ゲルに対して、レーン1は野
性型IL−1β、レーン2はIL−1βの3種の変異体R4
A、L6A、R11G、およびレーン3はIL−1βの3種の変異
体R4D、L6A、R11G。野性型または各場合における変異体
IL−1βの予想されるサイズは約17kD(●)である。
図4は、E.coli DsbAを発現するE.coli細胞由来の画
分のSDS−PAGEを示す。(a)成熟DsbAを発現する細胞
からの、0'、60'、および120'におけるWCL;(b)「変
異体」DsbAを発現する細胞からの、0'、60'、および12
0'におけるWCL;(c)成熟DsbAを発現する細胞からのTE
X抽出物(「T」)および「細胞質(「C」)画分;
(d)「変異体」DsbAを発現する細胞からの「T」およ
び「C」画分。発現されるポリペプチドの予想サイズは
約22kD(●)である。
図5は、IL−1様タンパク質と、ヒトIGF−IまたはI
I型TGF−βレセプターの可溶性細胞外ドメインとの種々
の融合が発現されたE.coli細胞由来の画分のSDS−PAGE
ゲルを示す。左:(1)IL1β−IGF(pDM16963)、予想
サイズ約24〜25kD;(2)IL1β−Ubi−IGF(pDM1696
5)、予想サイズ約32kD(●);(3)DsbA−Ubi−IGF
(pYZ22070)、予想サイズ約37kD(●);および(4)
DsbA−Ubi−TGFR(pDM15428)、予想サイズ約46kD
(●)についての0'および120'でのWCL。右:4つの融合
ポリペプチドに対するTEXおよび「細胞質」(「CYT」)
画分。2つの点がある場合、下の点は、大きいポリペプ
チドの低分子量分解生成物を表す。
図6は、その天然のシグナル配列が欠失したヒトIL−
1−レセプターアンタゴニストを発現するE.coli細胞か
らの画分のSDS−PAGEを示す(pDM15424)。左:0'および
120'におけるWCL;右:TEX(「T」)および「細胞質」
(「C」)画分(「FXN」)。予想生成物は約18kDのサ
イズを有する。
図7、左は、予想サイズ約20kDのユビキチン−TGF−
β2融合ポリペプチドをコードするpDJ16920、または予
想サイズ42kDのDsbA−ユビキチン−TGF−β2融合をコ
ードするプラスミドpYZ22096で形質転換されたE.coli細
胞からの0'および120'におけるWCL、および可溶性
(「S」)および不溶性(「I」)画分のSDS−PAGEゲ
ルを示す。
図8は、左は、予想サイズ約15kDのユビキチン−IGF
融合物を発現するpDJ16927、または予想サイズ約32kDの
IL−1−β−ユビキチン−IGFを発現するpDM1695で形質
転換されたE.coli細胞からの0'および120'におけるWC
L、および可溶性(「S」)および不溶性(「I」)画
分のSDS−PAGEゲル。図8、右は、予想サイズ約37kDのD
sbA−ユビキチン−IGFをコードするpYZ22070、または予
想サイズ約37kDの、DsbAがその天然シグナル配列を有す
るDsbA−ユビキチン−IGFをコードするpDM15426で形質
転換されたE.coli細胞の抽出物の同様のゲルを示す。
図9は、IGFBP−3への融合を発現するE.coli細胞の
画分のSDS−PAGEゲルを示す。パネル[i]:予想サイ
ズ約38kDのユビキチン−IGFBP−3融合物をコードするp
DJ12875を発現するE.coli細胞の0'および120'におけるW
CLおよび「可溶性」(「S」)および不溶性(「I」)
抽出物;パネル[ii]:予想サイズ約55kDのIL−1−ユ
ビキチン−IGFBP−3(pDM16967);および[iii]:予
想サイズ約60kDのDsbA−ユビキチン−IGFBP−3(pDM15
427)。
図10、パネル[i]は、予想サイズ約24kDのユビキチ
ン−TGF−βR融合物(PDJ16921)を発現するE.coli細
胞からの0'および120'におけるWCLおよび「可溶性」
(「S」)および不溶性(「I」)画分のSDS−PAGEゲ
ルを示し;パネル[ii]は予想サイズ約64kDのDsbA−ユ
ビキチン−TGF−βR融合物(pDM15428)を示す。
図11AおよびBは各々、30℃で増殖させたDsbA−ユビ
キチン−IGFおよびユビキチン−IGF構築物の培養物由来
のユビキチンヒドラーゼ切断IGF−IのHPLC逆相溶離プ
ロフィルである。CおよびDは各々、37℃で増殖させた
ユビキチンヒドロラーゼ切断DsbA−ユビキチン−IGFお
よびユビキチン−IGFを示す。IGFピーの比活性を、箱で
囲った値(任意単位)で示す。
図12は、125I放射性同位元素標識TGF−β1で架橋さ
れた部分的に精製されたTGF−βR(136アミノ酸細胞外
ドメイン、pDM15428)のSDS−PAGEゲルを示す。予想さ
れる架橋生成物のサイズは約30kDである。左(−):非
付加の非放射性TGF−β1。右(+):過剰の非放射性T
GF−β1(2500倍モル) 図13は、(1)DsbA−ユビキチン−IGFBP−3融合物
をコードするpDM15427;(2)ユビキチン−IGFBP−3融
合物をコードするpDJ12875;または(3)pDJ12887、
「ベクターのみ」の対照、を発現するE.coli細胞の粗抽
出物(「可溶性」画分)の結合活性を測定するための
125I−放射性同位元素標識IGF−Iを用いたドット−ブ
ロットアッセイの結果を示す。サンプルは未処理(−U
H)またはユビキチンヒドロラーゼで切断した(+U
H)。
図14は、IL−1−β−IGFBP−3をコードするpDM1543
0(「IL1−BP3」)、またはベクターのみ(「ベクタ
ー」)を一時的にトランスフェクトしたCOS細胞由来の
架橋サンプルのSDS−PAGEゲルを示し、架橋サンプルを
エンドグリコシダーゼFで処理する(+)または処理な
し(−)、および「非放射性」IGFとの競合ありまたは
なしである。図の右側は、55kD融合ポリペプチド
(X)、天然のグリコシル化IGF結合タンパク質
(Y)、および天然の脱グリコシル化IGF結合タンパク
質(Z)に対する標識である。
図15は、プラスミドpDM15486、pDM25492、pDM46805お
よびpDM46806がW3110DE3に導入されたときの、それらの
プラスミドによって発現されるタンパク質を示す。図15
のパネル「A」および「B」は各々、pDM25492およびpD
M46805を有する株の音波処理後の、TEX抽出物(T)お
よび残りの可溶性画分(S)を示している。IGF−I融
合物構築物、pDM15486およびpDM46806に対応するサンプ
ルを、図15のパネル「C」および「D」に示す。DsbCタ
ンパク質の予想位置を、各々の場合において矢印で記
す。
図16は、プラスミドpDM15486、pDM25492、pDM46805お
よびpDM46806を、実施例10における構築物に対して記載
したように試験したとき、それらによって発現されるタ
ンパク質を示す。パネル「A」および「B」は、pYZ920
6(リーダー欠失DsbA)およびpDM25452(リーダー欠失
ミニ−DsbA)の比較を示している。各々の場合におい
て、誘導サンプルは、TEX(T)、残りの可溶性
(S)、および不溶性(I)画分に分画された。パネル
「C」はpDM25499で得られた結果を示す。
図17は、プラスミドpYZ22055、pDM25450、pDM25453お
よびpDM15449によって発現されたタンパク質を分析した
ときに得られた結果を示す。各パネルにおけるレーン
「A」、「B」、「C」および「D」は、pYZ22055、pD
M25450、pDM15499およびpDM15457に対応する抽出物をロ
ードした。13マーのビオチン化基質ペプチドを発現する
2つの構築物(pDM25450およびpDM15457)は、ウエスタ
ンブロット上に明瞭なポジティブシグナルを提供する
が、対照は提供しない。
図18は、pDM15449(パネル「A」)またはpDM25466
(パネル「B」)を有する誘導細胞から採取されたサン
プルの画分を示す。
図19Aは、融合タンパク質の発現およびそのTEX(T)
および残りの可溶性(S)画分への部分的分画を示す。
図19Bは、両方の精製された画分が、DNA結合活性を示
すことを示している。
図20は、天然のdsbA(リーダーを持つ)ビオチン化ペ
プチドに対する核酸配列(プラスミド25453)を示す。
図21は、リーダーのないdsbA(3'改変)−ビオチン化
ペプチドに対する核酸配列(プラスミド25450)を示
す。
図22は、リーダーのないdsbA(3'改変)−hubi(de14
5).IGF.newに対する核酸配列(プラスミド25477)を示
す。
図23は、リーダーのないdsbO(3'改変)−hubi.IGF.n
ewに対する核酸配列(プラスミド41620)を示す。
図24は、天然のdsbAに対する核酸配列(プラスミド92
05)を示す。
図25は、リーダーのないdsbC(3'改変)−C>S変種
に対する核酸配列(プラスミド46805)を示す。
図26は、リーダーのないdsbAに対する核酸配列(プラ
スミド9206)を示す。
図27は、リーダーのないdsbA(3'改変)に対する核酸
配列(プラスミド22055)を示す。
図28は、リーダーのないミニ−dsbA(3'改変)に対す
る核酸配列(プラスミド25452)を示す。
図29は、リーダーのないdsbA(3'改変)−y.ubi.IGF.
oldに対する核酸配列(プラスミド22070)を示す。
図30は、リーダーのないdsbC(3'改変)−hnbi.IGF.n
ewに対する核酸配列(プラスミド25498)(ベクターpUC
18)を示す。
図31は、リーダーのないdsbC(3'改変)C>S変種−
IGF 1(new)に対する核酸配列(プラスミド46806)を
示す。
図32は、リーダーのないdsbC(3'改変)−IGF 1(ne
w)に対する核酸配列(プラスミド15486)を示す。
図33は、リーダーのないdsbC(3'改変)に対する核酸
配列(プラスミド25492)を示す。
図34は、成熟ヒトインターロイキン1β(3'改変)−
IGF(old)に対する核酸配列(プラスミド16963)(ベ
クターpBR322)を示す。
図35は、成熟ヒトインターロイキン1βに対する核酸
配列(プラスミド12151)(ベクターpBR322p)を示す。
図36は、成熟ヒトインターロイキン1β(3'改変)に
対する核酸配列(プラスミド15449)を示す。
図37は、ヒトインターロイキン1β R11G変異体(3'
改変)に対する核酸配列(プラスミド25466)を示す。
図38は、インターロイキン−1レセプターアンタゴニ
スト(3'改変)−IGF(new)に対する核酸配列を示す。
図39は、リーダーのないインターロイキン−1レセプ
ターアンタゴニスト(3'改変)に対する核酸配列(プラ
スミド15424)を示す。
図40は、成熟ヒトインターロイキン 1β(3'改変)
−yubi.IGF.oldに対する核酸配列(プラスミド16965)
を示す。
図41は、ミニ−dsbA(3'改変)−hubi(de145).IGF.
newに対する核酸配列(プラスミド25499)を示す。
図42は、リーダーのないミニ−dsbA(3'改変)−hub
i.IGF.newに対する核酸配列(プラスミド25485)(ベク
ターpUC18)を示す。
本発明の実施態様 インターロイキン−1様のポリペプチド(「IL−1様
ポリペプチド」)、リーダー欠失トランスロケーション
ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む融合パー
トナーに融合されたときに、広範囲のポリペプチドが、
宿主細胞増殖にとって生理学的に最適な温度またはそれ
に近い温度において、可溶性の、活性な、回収容易な形
態で、種々の宿主細胞において大量に蓄積される。所望
であれば、目的のポリペプチドを、インビボまたはイン
ビトロのいずれかで、効率的かつ安価にインターロイキ
ン−1様ポリペプチドから切断し得る。インターロイキ
ン−1様ポリペプチドおよびリーダー欠失トランスロケ
ーションポリペプチドの両方が、E.coli、酵母、昆虫細
胞および哺乳動物細胞を含む原核細胞および真核細胞の
両方で広汎な種類の異種ポリペプチドの発現のための一
般的な融合パートナーとして有用である。
インターロイキン−1−β(IL−1−β)は、シグナ
ル配列を欠く天然に分泌されるポリペプチドの特有なク
ラスの1つである(Mueschら、TIBS,1990年3月、pp.86
−88,1990)。このクラスのメンバーは、細菌からヒト
に至る広汎な種で見い出され得る。哺乳動物の単核細胞
において、細胞質からのIL−1−β輸送が、一般の分泌
経路から独立していることが示されている(Rubartelli
ら、EMBO J.:1503−1510,1990;Singerら、J.Exp.Med.
167:389−407,1988;およびRubartelliら、J.Biol.Chem.
267:24161−24164、1992もまた参照)。
IL−1−βは、アミノ末端シグナルペプチドまたは内
部シグナル配列として機能し得る顕著に疎水性の領域を
含んでいないが、IL−1−βに対する遺伝子がE.coli宿
主細胞で発現されると、IL−1−βポリペプチドが、細
胞を溶解することなく浸透ショックによって宿主細胞か
ら放出され得る(Joseph−Liauzunら、Gene 86:291−29
5,1990)。さらに、アミノ末端メチオニンを含むIL−1
−β(Met−IL−1−β)は、酵母細胞によって分泌さ
れる(Joseph−Liauzunら、前出,1990における報告G.P.
Livi私信)。
哺乳動物単核細胞において、IL−1が細胞質膜と相互
作用し、小胞を形成し、小胞体(ER)またはゴルジ体を
通過せずに分泌されると考えられている。この特性のた
めに、ポリペプチド上の共通のグリコシル化部位が、グ
リコシル化されずに残る。しかし、切断可能なシグナル
配列がそのアミノ末端に連結している場合には、IL−1
−βのグリコシル化が起こる(Baldariら、EMBO J.:2
29−234,1987)。従って、融合パートナーとしてのIL−
1様ポリペプチドの使用は、哺乳動物細胞における非グ
リコシル化ポリペプチドの産生を可能にし得る。この特
長は、目的のポリペプチドのグリコシル化が望ましくな
い場合に特に重要である。例えば、ヒトタンパク質が他
の哺乳動物細胞中で合成されるとき、異なるグリコシル
化が起こり得、そしてヒト受容者に対して抗原性であり
得る。このことは、ヤギまたはヒツジのようなトランス
ジェニック動物において、ヒトの治療剤として有用なポ
リペプチドを発現させることに関心を持つ者にとって主
要な領域である。
さらに、IL−1様ポリペプチドによって使用される細
胞質からの輸送の代替ルートはERを避けるので、遊離の
スルフヒドリル基を持つポリペプチド、例えば、bFGF、
PD−ECGF、およびADF(Takahashiら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,83:8019−8023,1986)を、IL−1様ポリペプチ
ドへの融合物として発現することが有利であり得る。な
ぜなら、IL−1様融合物はER内腔の酸化環境を避けるか
らである。
また、IL−1様融合物は、脂質2重層を通過してトラ
ンスロケーションすることなく分泌されるようである。
従って、一般分泌経路を経由して通常分泌され得ない異
種ポリペプチドとのIL−1様融合物を使用することによ
って、これらのポリペプチドの細胞質からの輸送を可能
にする。例としては、脂質2重層の通過を妨害し得る長
い疎水性またはその他の配列を含むポリペプチドが含ま
れるが、それらに限定されない。
本発明の目的のためには、「インターロイキン−1
様」(または「IL−1様」)ポリペプチドは、実質的に
成熟ヒトインターロイキン−1−βの三次元構造と類似
の三次元構造により特徴付けられるポリペプチドまたは
その機能的フラグメントである(Priestleら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.86:9667−9671,1989)。目的のポリペ
プチドに融合されると、そのようなIL−1様ポリペプチ
ドはまた、その融合ポリペプチドを細胞質から専用の細
胞区画へ輸送することができ、その細胞区画では融合ポ
リペプチドは可溶性であり、そして生物学的に活性であ
るが、タンパク質分解からは保護される。
実際上、成熟IL−1−βは比較的小さく(約17kD)、
そして安定である。それは大きな不活性前駆体として合
成され、後に切断されて153アミノ酸長さの成熟ポリペ
プチドを放出する。成熟IL−1−βは特に安定な構造
(円筒構造を形成するための3つの折りたたみ対称軸の
まわりに並んだ3つの類似単位によって特徴付けられ
る、いわゆるβ−三つ葉折りたたみ)を持ち、各単位は
2対の逆平行βストランドを含む(Priestleら、前出,1
989)。このβ−三つ葉折りたたみは、αヘリックスを
含まない構造であり、その構造が一部を成す融合ポリペ
プチドの全体構造を安定化させる機能を果たし得る。β
−三つ葉折りたたみ構造をもつファミリーのメンバー
は、以下を含むがそれらに限定されない:IL−1−αお
よびIL−1−β;繊維芽細胞増殖因子(FGF)のメンバ
ーは、例えば、酸性FGFおよび塩基性FGF、int−2、hst
/KS3、FGF−5、FGF−6、およびケラチノサイト増殖因
子(Zhangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:3446−3450,
1991;Zhuら、Science 251:90−93,1991)を含む;ヒサ
クトフィリン(hisactophilin)(Habazettlら、Nature
359:855−857,1992);およびダイズトリプシンインヒ
ビター(Wolfsonら、Biochemistry 32:5327−5331,199
3)。McDonaldおよびHendrickson,Cell 73:421−424,19
93)もまた参照。
β−三つ葉構造を持つポリペプチドは、もしそれらが
IL−1のように、目的の融合ポリペプチドを細胞質から
専用の細胞区画(そこから、それが例えば選択的な抽出
手順によって、活性な形態で容易に放出され得る)へ輸
送し得るのであれば、IL−1様ポリペプチドであると考
えられる。従って、β−三つ葉構造の存在は、可能な融
合パートナーがインターロイキン−1様ポリペプチドで
あることを示すために使用され得る。例えば、リーダー
配列を欠く塩基性FGFは、IL−1−βのためのプロセス
と類似のプロセスによって、細胞から分泌されることが
知られている(Abrahemら、Science 235:545−548,198
6)。
「IL−1葉ポリペプチド」は、成熟ポリペプチドおよ
びその機能的フラグメントのみを含み、それは:(a)
von Heijneの方法によって認識され得るアミノ末端リー
ダー配列を欠き(Nucl.Acids,Res.14:4683−4690,198
6);(b)最適に並べられたときに成熟ヒトインター
ロイキン−1−β(IL−1−β)のアミノ酸配列と少な
くとも20%相同性であるアミノ酸配列を有し;および
(c)約20%以上の融合ポリペプチドを専用の細胞区画
へトランスロケーションし得る。IL−1葉ポリペプチド
が、アミノ末端リーダー配列を有する前駆体として天然
に合成される場合、成熟ポリペプチドに対応するDNA配
列(すなわちリーダー配列を欠いている)のみが、本発
明の目的の「IL−1様ポリペプチド」をコードする核酸
であると考えられる。従って、本発明の「IL−1様ポリ
ペプチド」は、インターロイキン−1遺伝子ファミリー
のメンバーを含む、この遺伝子ファミリーには、ヒトお
よび非ヒトの種、例えばマウスおよびラット、からのイ
ンターロイキン−1−αおよび−β、ならびにインター
ロイキン−1レセプターアンタゴニスト(IL−1ra)(E
isenbergら、Nature 343:341−346,1990;Eisenbergら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5232−5236,1991)。およ
びE.coliおよび関連する細菌からのDsbAが含まれる。
成熟E.coli DsbAポリペプチド(Bardwellら、Cell 6
7:581−589,1991;Kamitaniら、EMBO J.11:57−62,199
2)およびその公知の細菌の相同体(Vibrio cholerae T
cpG;PeekおよびTaylor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:621
0−6214,1992、を含む)もまたこれらの基準によるIL−
1様ポリペプチドの例である。DsbAは通常、おそらくト
ランスロケーションの間に除去される19アミノ酸のアミ
ノ末端リーダー配列によって、細胞周辺腔に分泌され
る。しかし、リーダーペプチドが単一のメチオンで置き
換えられたDsbAポリペプチドの変種は、予期せぬ挙動を
示す:そのポリペプチドは細胞膜を横切るだけでなく、
細胞膜を横切る輸送を実際に増加させる。DsbAはまた、
下記実施例に示すように、改良浸透ショック手続、およ
び細胞を溶解しないその他の単純化した方法によって、
細胞から放出させ得る。
図1はヒトIL−1−βDNAと短縮型dsbA遺伝子との間
の配列類似性を示している。ならびを最大にするため
に、dsbA配列の2つの領域(アミノ酸残基21−35および
126−157に対応する)を比較から除外している。これら
のセグメントのうちの第1番目(21−35)は、「2重シ
ステイン活性部位ループドメイン」の例を含み、これは
他の酸化還元酵素の活性部位領域に対して部分的な相同
性を示す(Bardwellら、前出,1991)。この相同の領域
には他のクラスのIL−1様ポリペプチドは存在せず、こ
の領域が本発明のIL−1様ポリペプチドの特性に必ずし
も必要ではないことを示している。これらの2重システ
イン活性部位ループドメイン、例えばDsbAの残基21−35
内に含まれるドメインは、インターロイキン−1様ポリ
ペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリ
ペプチドのクラスに入る、任意の酸化還元酵素を含む融
合パートナーから除去(または置き換え)され得、そし
て本発明の融合ポリペプチドの輸送に影響し得ない。
用語「インターロイキン」は、配列相同性および構造
の見地から広範囲に異なる多数のタンパク質(今日まで
のところ26)を包含することに注目すべきである。IL−
1以外のインターロイキンは一般に、上記に定義したよ
うに「IL−1様ポリペプチド」であるとは一般には考え
られないであろう。
チオレドキシンは、IL−1様ポリペプチドであるとは
考えられない。チオレドキシン分泌は、IL−1様ポリペ
プチドの分泌にある局面では類似しており、その類似点
とは、E.coliチオレドキシンがリーダー配列を欠き、お
よび哺乳動物チオレドキシンがERおよびゴルジ体を通ら
ずに分泌されるように見えることである。しかし、IL−
1とチオレドキシンとの配列相同性は15%未満であり、
それらの三次元構造には明確は類似性がない。さらに、
IL−1−βの分泌はチオレドキシンのそれとは異なって
いる。例えば、COSトランスフェクタントは、チオレド
キシンを分泌するが、IL−1−βは分泌しない。さら
に、活性化された単球において、いくつかのIL−1−β
が細胞内小胞に見い出されるが、その一方チオレドキシ
ンは小胞のような膜で境界された区画には検出されず、
このことは分泌されたチオレドキシン分子が原形質膜に
直接輸送されることを示している(Rubartelliら、前
出,1992)。チオレドキシンは、優先的に、接着ゾーン
としてE.coliの細胞質膜の内部周縁のまわりの部位、ま
たはバイヤーパッチ(Bayer's patche)(内部および外
部細胞膜が融合しているペプチドグリカン細胞壁中の間
隙がある部位)に存在する。IL−1−βの分泌とチオレ
ドキシンの分泌との間におけるこれらの観察された違い
は、これら2つのポリペプチドが異なる分泌経路を使用
し得ることを示す。
LaVallieら(前出,1993)は、融合パートナーとして
チオレドキシンの使用を提案しているが、チオレドキシ
ン融合物のいくつかは、それらを発現する細胞の増殖温
度が低下するにつれてより可溶性になる(LaVallieら、
前出,1993)。
「リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド」
は、成熟ポリペプチドおよびその機能的フラグメントの
みを含み、それらは:(a)最初に翻訳されたときに、
それらの天然の状態においてアミノ末端リーダー配列を
含むタンパク質に由来し、そのアミノ末端リーダー配列
は成熟タンパク質の形成において実質的に切断され;そ
して(b)融合ポリペプチドの約20%以上を専用の細胞
区画へ輸送し得る。リーダー欠失トランスロケーション
ポリペプチドが由来する全てのタンパク質は、アミノ末
端リーダー配列を持つ前駆体として天然に合成される
が、成熟ポリペプチド、即ち任意のリーダー配列を欠く
ペプチドに対応するDNA配列のみが、本発明の目的の
「リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド」を
コードする核酸であると考えられる。
従って、本発明の「リーダー欠失トランスロケーショ
ンポリペプチド」は、E.coliおよび関連する細菌のDsbA
およびDsbCタンパク質、ならびにヒトおよび非ヒト種、
例えば、マウスおよびラット、由来のインターロイキン
−1レセプターアンタゴニスト(IL−1ra)を含む(Eis
enbergら、Nature 343:341−346,1990;Eisenbergら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA.88:5232−5236,1991)。
その他のIL−1様ポリペプチドおよびリーダー欠失ト
ランスロケーションポリペプチドの同一性を測定するこ
とは、当業者により容易に実施され得る。IL−1様ポリ
ペプチドについては、20%の配列相同性の要求に合致す
るタンパク質は、スクリーニングされるべき活性(例え
ば、細胞質から輸送される)について先導候補として供
し得る。リーダー欠失トランスロケーションポリペプチ
ドについては、アミノ末端リーダー配列を持つ前駆体と
して天然に合成され、そしてペリプラズムのような専用
の細胞区画へ天然に分泌されるタンパク質は、先導候補
として機能し、特に酸化還元酵素、そしてさらにはE.co
liおよび関連する細菌のDsbタンパク質である。
本発明は、単一のIL−1様ポリペプチドまたは単一の
リーダー欠失トロンスロケーションポリペプチド由来の
1つまたはそれ以上のフラグメントを持つ融合パートナ
ーを含む融合ポリペプチド、複数のIL−1様ポリペプチ
ド、複数のリーダー欠失トランスロケーションポリペプ
チド由来の融合パートナーを含む融合ポリペプチドを含
み、または本発明においては特に、両方のクラスのポリ
ペプチド由来のフラグメントの組み合せが企画されてい
る。さらに、本発明は特に、変異体IL−1様ポリペプチ
ドまたは変異体リーダー欠失トランスロケーションポリ
ペプチドを本発明の融合ポリペプチドの融合パートナー
に使用することを含む。そのような変異体は、欠失、ア
ミノ酸の交換またはアミノ酸の付加を含み、特に、「イ
ンターロイキン−1−βの生物学的活性」に関して欠陥
がある」(野性型インターロイキン−1−β生物学的活
性の3%未満である)成熟インターロイキン−1−βの
変異体ポリペプチドフラグメントである。
選択された異種ポリペプチドのDNAに融合される、IL
−1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケー
ションポリペプチドのDNA配列を含む融合ポリペプチ
ド、もしくは目的のペプチドは、従来の遺伝子工学技術
によって容易に構築され得る。IL−1様ポリペプチドは
好ましくは選択された異種ポリペプチドのアミノ末端に
融合されるが、選択されたポリペプチドをIL−1様ポリ
ペプチド内の部位に挿入することもまた適切であり得
る。例えば、異種ポリペプチダーゼインヒビター・ルー
プが、IL−1−βの内部部位に挿入されている。Wolfso
nら、前出,1993参照。
融合ポリペプチドをコードする核酸は、IL−1様ポリ
ペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリ
ペプチドを含む融合パートナー、および目的のポリペプ
チドに加えて、付加的アミノ酸をコードする付加的「リ
ンカー」DNAを必要に応じて含む。このリンカーペプチ
ドは、融合パートナーと目的のペプチドとの間に位置す
る。
リンカーペプチドは、多くの機能を提供し得る。第一
に、リンカーはIL−1様ポリペプチドと目的のポリペプ
チドとの間に特異的切断部位を提供し得る。そのような
切断部位は、例えば、Xa因子、トリプシン、コラゲナー
ゼ、トロンビン、またはズブチリシンエンテロキナー
ゼ、または、好ましくはユビキチンヒドロラーゼのよう
なタンパク質分解酵素のための標的、または、例えば臭
化シアンまたはヒドロキシルアミンのような化学的「切
断剤」のための標的を含む。
切断工程は、宿主細胞によって発現され、そしてリン
カーペプチドのタンパク質切断部位を特異的に認識する
タンパク質分解酵素によって、インビボで実施され得
る。あるいは、切断工程は、融合ポリペプチドサンプル
上で、宿主細胞物質を除去する予備精製工程を経て、ま
たは経ずに実施され得、そしてそれに続いて切断剤また
はタンパク質分解酵素、および切断されたタンパク質フ
ラグメント、例えば、融合パートナーおよびリンカーを
除去するための精製工程が実施され得る。目的のペプチ
ドを本発明の融合タンパク質から切断する方法、および
種々の関連する精製工程は、使用される切断剤またはタ
ンパク質分解酵素に特異的であり、そして当該技術分野
において公知である。切断工程および精製工程の適切な
方法の例が、下記に記載されており、以下の実施例のセ
クションに例示されている。
リンカーはまた、融合ポリペプチドの他の細胞ポリペ
プチドからの精製を補助するための「アフィニティータ
グ(affinity tag)」をコードし得る。例えば、リンカ
ーによってコードされる複数のヒスチジン残基は、融合
ポリペプチドの精製のための金属キレートアフィニティ
ークロマトグラフィー法の使用を可能にする。
リンカーはまた、IL−1様ポリペプチドと目的のポリ
ペプチドとの間の融合ポリペプチド中の立体(steari
c)妨害を防止するためのスペーサーとして供し得る。
リンカーが必要かどうかは、当業者に明かであるよう
に、IL−1様ポリペプチドに融合される目的のポリペプ
チドの構造的および機能的特性に依存する。目的のポリ
ペプチドが天然に切断される場合、リンカーは必要とさ
れない。融合ポリペプチド自体が切断なしで有用であり
得る。
リンカーは、これらの目的の任意または全て、または
別の機能、または所望されるような他の機能を供し得
る。
同じ宿主細胞内の他の配列の存在下で、融合ポリペプ
チドを細胞質外空間へと標的させるIL−1様ポリペプチ
ドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチ
ドの能力(例えば、米国特許第4,595,658号に教示され
るように、外膜の透過処理後、ペリプラズムのポリペプ
チドを「漏出」させる)は、例えばE.coliが培養培地に
ポリペプチドをほとんど分泌しないため、融合ポリペプ
チドの精製を単純化する。あるいは、下記実施例に示す
ように、適切な抽出緩衝液で融合ポリペプチドを発現す
る細胞全体を単純に処理するだけで、大部分の細胞質ポ
リペプチドまたは核酸を放出することなく融合ポリペプ
チドを選択的に放出し得る。そのような選択的放出は、
融合ポリペプチドの精製を非常に単純化する。
不安定または非常に不溶性であるペプチドを含む広範
囲のポリペプチドを、本発明のIL−1様ポリペプチドま
たはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドと
の融合物として、適切な発現系を用いることにより、原
核動物細胞または真核動物細胞中で発現させ得る。
要約すると、本発明は、IL−1様ポリペプチドまたは
リーダー欠失トランスロケーションポリペプチドをコー
ドする配列を含む核酸が、好ましくは発現ベクター中で
目的のポリペプチドに融合される方法および組成物を提
供する。実施例において、翻訳カップリング(Squires
ら、J.Biol.Chem.263:16297−16302,1988)によって改
良されたT7 RNAポリメラーゼ駆動される発現系(Studie
rおよびMoffat,J.Mol.Biol.189:113−130,1986)が、IL
−1様ポリペプチド配列がリンカーポリペプチド配列を
介して異種ポリペプチドのアミノ末端に連結している融
合ポリペプチドを大量に発現させるために利用された。
異種ポリペプチドのいくつかの例が、2つの成長因子、
2つの酵素、一本鎖抗体、結合ポリペプチド、および膜
に広がるレセプターの細胞外ドメインを含むこの発現系
の一般的特性を示すために使用された。これらの実施例
は、本発明の方法および組成物が、特定の所望の治療用
ポリペプチド、他の方法であれば細胞宿主細胞で低レベ
ルでしか産生されない、例えば、IGF−Iの高レベルの
可溶性発現を可能にすることを示す。
本発明による融合ポリペプチドの産生は、所望の異種
ポリペプチドの溶解度を確実に改良し、かつ、所望のポ
リペプチドの活性なコンホメーションへの折たたみを促
進することによって、および宿主細胞内の専用の区画へ
融合ポリペプチドを偏在させることによって、または宿
主細胞の細胞質からの輸送を生じさせることによって、
異種ポリペプチド産生物の安定性および蓄積を増加させ
る。
さらに、本発明は、ランダムなポリペプチドのライブ
ラリーのスクリーニングを、それらの生物学的機能につ
いてアッセイすることによって可能にする。IL−1様ポ
リペプチドに融合されたとき、ランダムなポリペプチド
は、可溶性、活性形態で、保護された細胞区画に蓄積す
る。哺乳動物DNAを含む発現ライブラリーの機能的スク
リーニングは、所望のタンパク質機能が維持されている
という保証がないという事実によって束縛されてきた。
この問題は、そのライブラリーの遺伝子配列を、IL−1
様ポリペプチドの配列を含む発現ベクターにクローン化
し、それによってライブラリーの配列がIL−1融合物と
して発現され得るようにすることによって、容易に回避
し得る。例えば、そのライブラリーで形質転換されたE.
coli細胞のコロニーが、ナイロン膜のような固体支持体
に移される。そこでその細胞を穏やかに溶解して(例え
ば、Triton−X 100のような穏和な界面活性剤を使用し
て)、発現された融合ポリペプチドを放出し、そしてそ
の融合ポリペプチドが、目的の遺伝子を持つクローンを
同定する生物学的活性についてスクリーニングされる。
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、当業者に周知
の方法によって、モノクローナル抗体を含む抗体を開発
するために使用され得る。
ポリペプチド 通常、本発明のIL−1様ポリペプチドは、天然のヒト
IL−1−βポリペプチドに対して少なくとも約20%の相
同性であり、好ましくは少なくとも40〜60%、より好ま
しくは少なくとも約95%の相同性である。IL−1の特徴
的な三次元構造を共通に所有していることは必要ではな
いけれども、そのような相同は「実質的な相同である」
と考えられ、IL−1様ポリペプチドを同定するために使
用され得る。
ポリペプチドの相同性は、代表的には、Genetics Com
puter Group,University of Wisconsin Biotechnology
Center(1710 University Avenue,Madison,WI 53705)
のSequence Analysis Software Packageのような配列分
析ソフトウエアを用いて分析される。ポリペプチド分析
ソフトウエアは、種々の置換、欠失、置換、およびその
他の改変に帰する相同性の測定値を用いて類似配列にマ
ッチさせる。保存的な置換は、代表的には、以下の群の
中の置換を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロ
イシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、ア
スパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジ
ン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。
IL−1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロ
ケーションポリペプチドの「フラグメント」は、実質的
にその機能的特性を保持している、完全長のIL−1様ま
たはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドの
一部である。すなわち、IL−1様ポリペプチドフラグメ
ントまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペプ
チドフラグメントは、少なくとも約20%の融合ポリペプ
チドを、それが発現される宿主細胞の適切な専用の細胞
区画へ輸送し得る。また、「細胞質外輸送を導き得る」
という句は、そのように記載されているポリペプチドま
たはフラグメントが、それが発現される宿主細胞の適切
な保護された細胞区画に標的され得るものであるという
ことを意味にするために使用されている。
さらに、用語「リーダーペプチド」、「シグナルペプ
チド」、および「リーダー」は、本明細書において互換
的に使用されており、それらは、分泌、即ち、非細胞質
部位に輸送することを目的とした前駆体ポリペプチドの
アミノ末端に存在する短い(15−30アミノ酸)配列を意
味しており、それらは成熟タンパク質に存在しない。
「分離」 用語「分離された」、「実質的に純粋な」、「実質的
に精製された」、および「実質的に均質の」という語は
互換的に使用されており、例えば、リンカー配列(天然
成分を持たない目的のポリペプチドを得るために化学的
または酵素的に切断される)などを含む天然成分から分
離されているポリペプチドを意味する。単量体ポリペプ
チドは、少なくとも約60〜75%のサンプルが単一のポリ
ペプチド配列を示すときに実質的に純粋である。実質的
に純粋なポリペプチドは、代表的には、約60〜約90%w/
w、より一般的には約95%、そして好ましくは約99%以
上のポリペプチドサンプルを含む。ポリペプチドの純度
または同質性は、当該分野で周知の多くの方法によって
示され得、例えば、ポリペプチドサンプルのポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、それに続くゲル染色時の単一の
ポリペプチドバンドの視覚化である。ある目的に対して
は、HPLCまたは当該分野で周知のその他の方法を用い
て、より高度な分析を提供することができる。
ポリペプチド精製 細菌細胞に発現されたときに、IL−1様ポリペプチド
またはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチド
部分を含む融合ポリペプチドは、改変浸透ショック法、
凍結/解凍法、または、下記に例を示したような、特定
の抽出緩衝液中での再懸濁によって細胞から放出され得
る。さらに、ポリペプチド精製は、当該分野で周知の様
々な方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーに
よって行うことができる。
目的のポリペプチドを、融合パートナーおよび/また
はリンカー配列または融合ポリペプチドの一部分を含む
その他の配列から単離するために、融合ポリペプチドを
切断することが有益であり得る。ポリヒスチジンストレ
ッチをコードする配列を含むリンカーは、例えば、Ni−
NTA樹脂(QIAGEN,Chatsworth,CA)およびProBond樹脂
(Invitrogen,San Diego,CA)のような樹脂に結合させ
ることによって精製することができる。ポリペプチド精
製のその他の有用な方法については、例えば、ポリペプ
チド精製へのガイド、M.Deutscher編、182 Meth.Enzymo
l.(Academic Press,Inc.:San Diego,1990)およびR.Sc
opes、Polypeptide Purification:Principles and Prac
tice,Springer−Verlag:New York,1982に記載されてい
る。
好ましくは、宿主細胞の細胞質内で、適合可能なタン
パク質分解酵素の同時発現による融合ポリペプチドの切
断がインビボで生じる。E.coliのような細菌宿主におい
ては、ユビキチンヒドロラーゼが好ましい。例えば、本
発明の融合遺伝子のリンカーの一部分としてユビキチン
ヒドロラーゼ切断部位を有するポリペプチドを伴って発
現される場合は、実施例6に示された通りユビキチンヒ
ドロラーゼは特異的および効率的に切断する。
完全な融合ポリペプチドもまた有用であり得る。例え
ば、第2のポリペプチドに対するヒトインターロイキン
−1−β、またはそのアナログは治療上の用途を有し得
る。
ポリペプチドの改変;フラグメント;融合ポリペプチ
ド 本発明はまた、ヒトIL−1−βポリペプチドの1次
構造配列に実質的に相同的なポリペプチドまたはそのフ
ラグメントも提供する。本発明はまた、インビボまたは
インビトロの化学的および生化学的改変を伴うポリペプ
チドまたは特異アミノ酸を組み込んだポリペプチドも包
含する。このような改変は周知であり、そして、例え
ば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシ
ル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識、種
々の酵素的改変を含む。例えば、Molecular Cloning:A
Laboraory Manual、第2版、1−3巻、Sambrookら編、
Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)またはC
urrent Protocols in Molecular Biology、F.Ausubel
ら、Greene Publishing and Wiley−Interscience:New
York(1987および定期最新版)を参照のこと。
本発明は、IL−1様ポリペプチドまたはリーダー欠失
トランスロケーションポリペプチド(leader−deleted
−translocating Polypeptide)、および目的のポリペ
プチド含有する融合ポリペプチドを提供する。IL−1様
ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーション
ポリペプチドに融合したポリペプチドの例としては、ヒ
トまたは家畜の治療、診断、または研究への適用に有用
なペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。このよう
な目的のポリペプチドとしては、ホルモン、サイトカイ
ン、成長因子または阻害因子、および酵素が挙げられる
が、これらに限定されない。
IL−1様ポリペプチド、リーダー欠失トランスロケー
ションポリペプチド、目的のポリペプチド、および融合
ポリペプチドは、代表的には組換え法により作成される
が、化学的にも合成され得る。ポリペプチドの合成につ
いての技術は、例えばMerrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:
2149−2156,1963に記載されている。
核酸 本発明は、IL−1様ポリペプチドまたはリーダー欠失
トランスロケーションポリペプチド、および目的の別の
ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドをコードする
核酸を提供する。このような核酸には、RNA、cDNA、ゲ
ノムDNA、合成形態、および混合ポリマー、センス鎖お
よびアンチセンス鎖の両方が含まれる。このような核酸
は、化学的または生化学的に改変され得、そして非天然
または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。融
合ポリペプチドをコードする配列は、イントロンによっ
て中断され得る。
本発明の核酸配列は、このような融合ポリペプチドを
コードするに充分な長さであり、そして必要ならば何ら
かのベクター配列である。配列は、通常、数百のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド塩基対の長さであり、そして
数キロ塩基長であり得る。
本発明の融合ポリペプチドをコードし、そして発現し
得る核酸の構築を含む、核酸操作の技術は周知であり、
そして一般に、例えば、Sambrookら、前出またはAusube
lら、前出に記載されている。このような技術を適用す
るに有用な試薬、例えば、制限酵素などは、当業者に周
知であり、そして市販されている。
本発明の融合ポリペプチドを生産するために使用され
る組換え核酸配列は、天然配列または合成配列に由来し
得る。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列および/ま
たはそれらのフラグメントは、以下のデータベースアク
セス番号で、GENBANKおよび/またはSwiss Protein Dat
abaseから入手され得る: IGFおよびIGFBP−3の場合、コドンを最適化した遺伝子
を使用した。すべての場合において、成熟遺伝子産物を
コードする各配列の部分のみを使用した。
種々のIL−1−様およびリーダー欠失トランスロケー
ションポリペプチドのヌクレオチド配列については、例
えば、Maliszewskiら、Mol.Immunol.25:429−437、198
8;Auronら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:7907−7911,19
84;Marchら、Nature(Lond.)315:641−647,1985;Lomed
icoら、Nature(Lond.)312:458−462,1984;Grayら、J.
Immunol.137:3644−3648,1986;NishidaらMonokines and
Other Nonlymphocytic Cytokines、Powandaら編(Lis
s,New York)、73−78頁、1988;Furutaniら、Nucl.Acid
s Res.13:5869−5882,1985;Moriら、Biochem.Biophys.R
es.Commun.150:1237−1243,1988(ヒト、マウス、ラッ
ト、ウシ、およびウサギ由来のIL−1−αおよびIL−1
−β);Eisenbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:5232
−5236,1991(ヒト、マウス、およびラットIL−1ra);
およびBardwellら、Cell 67:581−589,1991(E.coli Ds
bA);LovettおよびKolodner,J.Bacteriol.173:353−36
4,1991;Missiakasら、EMBO J.13:2013−2020,1994(Dsb
C)にも報告されている。これらの参考文献の内容は、
本明細書中に参考として援用されている。
本発明の融合ポリペプチドの構築に用いられる他の配
列としては、タイプII TGF−βレセプター(Linら、Cel
l 68:755−785,1992)およびEGF−結合カリクレイン(B
laberら、Biochemistry 26:6742−6749,1987)の可溶性
細胞外ドメインが挙げられる。選定された宿主細胞に適
合可能ないずれの発現ベクターも、本発明の実施に使用
され得る。
本発明の融合ポリペプチドの構築は、組換えDNA技
術、例えばPRC、自動DNA合成などにおいて周知の方法を
用いて容易に達成される。
「コードする」 天然の状態においてまたは当業者に
周知の方法によって操作される場合において、核酸がポ
リペプチドを生産するために転写および/または翻訳さ
れ得る場合に、核酸はポリペプチドを「コードする」と
いう。このような核酸のアンチセンス鎖もまた、ポリペ
プチドをコードするという。
「作動可能に連結される」 別の核酸配列と機能的な
関係がある場合、核酸配列は作動可能に連結される。例
えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発
現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列に
作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結される
とは、連結されているDNA配列が隣接し、そして2つの
ポリペプチドコーディング領域を結合するのに必要な場
所において隣接し、そして読み枠内に存在することを意
味する。
「組換え」 用語「組換え」核酸(および類推によっ
て、組換え核酸の発現によって生産される「組換え」ポ
リペプチド)は、天然に存在しないもの、あるいは、化
学合成手段または核酸の単離されたセグメントの人為的
操作により、例えば遺伝子工学技術により、分離された
2つの他の配列のセグメントの人為的組合せにより作成
されるものである。
組換え核酸または化学的に合成された核酸の調製;ベ
クター、形質転換、宿主細胞 本発明の大量の核酸は、
細菌、酵母、昆虫、両性動物、トリ、哺乳動物、または
他の真核生物の細胞および発現系のいずれかの適切な宿
主細胞において複製により生産され得る。所望のフラグ
メントをコードする天然または合成DNAフラグメント
は、組換え核酸構築物(代表的にはDNA構築物)に組み
込まれる。これらのDNA構築物は、これらが複製する原
核細胞または真核細胞に導入される。通常、このDNA構
築物は、酵母または細菌のような単核細胞宿主において
自己複製に適切である。この構築物もまた、培養した昆
虫、哺乳動物、植物、またはその他の真核細胞株のゲノ
ム内に導入され、そして組み込まれ得る。これらの目的
のための適切な方法は当業者に周知であり、そして例え
ばSambrookら(1989)またはAusubelら(1987および定
期最新版)に記載されている。
本発明の核酸は、必要に応じて化学合成、例えばBeau
cageおよびCarruthers(Tetra.Letts.22:1859−1862,19
81)に記載のホスホルアミダイト法、またはMatteucci
ら(J.Am.Chem.Soc.103:3185,1981)によるトリエステ
ル法により生産され、そして市販の自動オリゴヌクレオ
チド合成機で実施され得る。
原核宿主または真核宿主への導入のために調製された
DNA構築物は、代表的には、宿主によって認識される複
製系を含有し、このようなDNA構築物は所望のポリペプ
チドをコードする意図したDNAフラグメントを含み、そ
して好ましくは、ポリペプチドをコードするセグメント
に作動可能に連結した転写および翻訳開始調節配列も含
む。発現ベクターとしては、例えば、複製開始点または
自己複製配列(ARS)および発現制御配列、プロモータ
ー、エンハンサー、ならびにリボソーム結合部位、RNA
スプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネー
ター配列、およびmRNA安定化配列のような必要なプロセ
ッシング情報部位が挙げられる。このようなベクター
は、当業者に周知の標準的な組換え技術によって調製さ
れ、そして例えばSambrookら(1989)またはAusubelら
(1987)に記載されている。
適切なプロモーターおよびその他の必要なベクター配
列は、宿主の機能に対して選択される。細胞株と発現ベ
クターとの機能的組合せの例については、Sambrookら、
1989またはAusubelら、1987)に記載されている;例え
ば、Metzgerら、Nature 334:31−36,1988も参照のこ
と。多くの有用なベクターが当業者に知られており、そ
して市販されている。真核宿主の使用については、tr
p、lac、およびファージプロモーター、tRNAプロモータ
ー、および解糖系酵素プロモーターが挙げられるが、こ
れらに限定されない。有用な酵母プロモーターとして
は、メタロチオネイン、3−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ、あるいはエノラーゼまたはグリセルアルデヒド−3
−リン酸デヒドロゲナーゼのような他の解糖系酵素、な
らびにマルトースおよびガラクトースの利用を司る酵素
が挙げられるが、これらに限定されない。酵母の発現に
使用するための他の適切なベクターおよびプロモーター
については、さらにHitzemanらEP 73,657Aに記載されて
いる。適切な非天然の哺乳動物のプロモーターとして
は、SV40由来の初期および後期プロモーター(FiersらN
ature 273:113,1978)、またはネズミモロニー白血病ウ
イルス、マウス乳ガンウイルス、トリ肉腫ウイルス、ア
デノウイルスII、ウシパピローマウイルス、およびポリ
オーマウイルス由来のプロモーターが挙げられるが、こ
れらに限定されない。さらに、構築物は増幅可能な遺伝
子(例えば、DHFR)に結合され得るため、遺伝子の多重
コピーが作成される。
このような発現ベクターは、自己複製し得る。あまり
好ましくない態様においても、当業者に周知の方法によ
り、宿主細胞のゲノムに挿入されることによって、発現
ベクターは複製し得る。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、一般
に、宿主細胞の生存または生育に必要なポリペプチドを
コードする選択マーカーを含む。この遺伝子の存在は、
マーカーを発現する宿主細胞のみの生育が確実にする。
代表的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、
ネオマイシン、メトトレキセートなどの抗生物質または
他の毒性物質に耐性を示し;(b)栄養要求生の欠損を
補い;または(c)複合培地から得られない重要な栄養
物を供給するポリペプチドをコードする。適切な選択マ
ーカーの選定は、宿主細胞に依存する。異なる宿主細胞
に対する適切なマーカーは、当業者に周知である。
目的の核酸を有するベクターは、インビトロで転写さ
れ得、そして得られたRNAは、周知の方法により(例え
ば、注入により)宿主細胞で導入される。T.Kuboら、FE
BS Lett.241:119,1988を参照のこと。あるいは、ベクタ
ーは、当業者に周知の方法により、直接宿主細胞に導入
され得る。これは、宿主細胞のタイプに依存して変化す
る。これらの方法としては、エレクトロポレーション;
塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、
DEAE−デキストラン、または他の物質を用いるトランス
フェクション;マイクロプロジェクタイルボンバード
(microprojectile bombardment);リポフェクション
(lipofection);および感染(ここでベクターは、レ
トロウイルスゲノムのような感染剤である)が挙げられ
るが、これらには限定されない。一般に、Sambrookら
(1989)およびAusubelら(1987)を参照のこと。この
ように形質転換された細胞もまた、このような細胞の子
孫を含むものとする。
本発明の大量の核酸およびポリペプチドは、適合可能
な原核宿主細胞または真核宿主細胞内のベクターまたは
他の発現ベヒクルにおいて核酸またはその一部を発現す
ることによって調製される。最も一般的に使用される原
核宿主はE.coliの株であるが、Bacillus subtilisまた
はPseudomonasのような他の原核細胞もまた使用され得
る。酵母、糸状菌、植物、昆虫、両性類、またはトリ種
の細胞のような、哺乳動物細胞または他の真核宿主細胞
もまた、本発明のポリペプチドの生産に有用であり得
る。
本発明は直接的な記載によって開示されている。以下
は、可溶性な活性なポリペプチドを生産する方法の有効
性を示す実施例である。本実施例はあくまで例に過ぎ
ず、如何なる場合においても、本発明の範囲を限定する
ものとして解釈されるべきではない。
実施例 実施例1:融合タンパク質の発現および精製 別に示さない限り、実施例を通して、以下の材料およ
び方法を使用した。さらなる詳細については、本明細書
に引用されている文献に見出され得る。
細菌株および生育条件 E.coli JM109 F−traD36 lac
Iq del(lacZ)M15 proAB/recA1 endA1 gryA96 thi hsd
R17 supE44 relA1 del(lac−proAB)。
E.coli W3110 DE3 F−thi(λDE3溶原菌;Studierおよ
びMoffat,J.Mol.Biol.189:113−130,1986)。
別に示さない限り、これらの株はL−ブロス中、37℃
で通気しながら生育させた。プラスミドを含む株につい
ては、抗生物質を適切なように増殖培地に添加した。
プラスミド 本研究で使用した発現ベクターは、pJU1
003(Squiresら、J.Biol.Chem.263:16297−16302,198
8)と本質的に一致する。但し、配列が種々の配置の以
下の遺伝子をコードする翻訳カップラーおよび開始コド
ンの下流に挿入された場合を除く:成熟ヒトIGF−1(7
0 aa)、IGFBP−3(264 aa)、TGF−β2(112 aa)、
TGF−β−レセプター(細胞外ドメイン、136 aa)、ま
たはマウスEGF−結合カリクレイン(237 aa)。各場合
において、終止コドンがこれらの配列に続く。これらの
プラスミドもまた、(a)pJU1003のtet遺伝子の5'末端
に合成16bpアダプター配列を含有しない点;および
(b)pSC101のpar遺伝子座を含有する285bpフラグメン
トからなる、pBR322由来のバックボーン(backbone)中
の唯一のPvu II部位にDNA挿入物を含有する点におい
て、pJU1003と異なる(MeacockおよびCohen、Cell 20:5
29−542,1980)。これらのプラスミドはまた、外来遺伝
子の下流でかつ同一転写ユニット内にリーダー部位に有
さないE.coliのペリプラズムロタマーゼ(periplasmic
rotamase)をコードする遺伝子も含有する。ロタマーゼ
遺伝子のシグナル配列を、LiuおよびWalsh、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.87:4028−4032,1990に記載のように、欠
失し、そして開始メチオニンコドンに置き換えた。短縮
型ロタマーゼ遺伝子が存在すると、E.coli宿主細胞内で
ユビキチン融合物の増殖阻害効果が中和される。このこ
とは、同一日に提出され、そして代理人の処理番号第22
095−20266.00号で「宿主細胞におけるタンパク質の過
剰発現についての方法およびDNA発現系」という表題の
同時係属中の出願に開示された通りである。
各遺伝子を4つの独立した位置における発現について
調製し、表1に記載のプラスミドを得た:(1)インフ
レームでかつ遺伝子配列の上流に挿入された酵母ユビキ
チン(「Ubi」)の76個のコドンを伴う;(2)開始コ
ドンと遺伝子との間のインフレームに融合された成熟ヒ
トIL−1−β(「IL1β」)に関する153個のコドン、お
よびIL−1−β配列と遺伝子配列との間に挿入されたAs
p−Arg−Gly−Glyをコードするリンカーを伴う;(3)
リンカーと配置(2)の遺伝子配列との間に挿入された
酵母ユビキチンの76個のコドンを伴う;および(4)成
熟E.coli DsbAの189個のコドンの後に、IL−1−β+配
置(3)のリンカー配列を置き換えて、His−His−His
−His−His−His−Serをコードするリンカーを伴う。さ
らに、遺伝子を欠失させ、そしてリンカー(5'...GGATC
CCGTGGAGGATTAAACCATGGATGCATAAGCTTCGAATTCTGCCAGGCAT
GCAAGCTCAGATCC...3')に置き換えたベクター12886およ
び12887をコントロールとして使用した。
6つのプラスミド−pYZ22070、pYZ22096、pYZ9205、p
YZ9206、pDM15426、およびpDM15424−は、pACYC184バッ
クボーン内の上記のプラスミドのT7転写ユニットを含有
する(ChangおよびCohen、J.Bacteriol.134:1141−115
6,1978)。具体的には、これら6つのプラスミドにおい
て、T7プロモーター、翻訳カップラー、遺伝子構築物、
ロタマーゼ遺伝子、およびT7ターミネーターを有するCl
a I−Sca Iフラグメントは、pACYC184の1.0kb Cla I−N
ru Iフラグメントを置き換えたものである。pYZ9205プ
ラスミドは、上記ベクターバックボーン内のDsbAに関す
る全コーディング配列を含有する。pYZ9206プラスミド
は、DsbAのシグナル配列がメチオニンコドンに置き換え
られている点を除いて、pYZ9205と同一である。pDM1542
6プラスミドは、DsbAのシグナル配列を含む点を除い
て、pYZ22070(上記)と同一である。pDM15424プラスミ
は、天然のシグナル配列を伴わずに、IL−1−レセプタ
ーアンタゴニストのコーディング配列を含有する。
適切なゲノムDNAからのPCR−介在増幅を用いて、酵母
ユビキチン配列およびロタマーゼ配列を得た。Spratt
ら、Growth Factors 3:63−72,1990に記載のように、IG
FBP−3に対するcDNAクローンを単離し、そしてアミノ
末端の3分の1の遺伝子の、天然の遺伝子(つまり、成
熟配列の最初の288個のヌクレオチド、唯一のBssH II部
位まで)と同一のアミノ酸をコードする合成DNA配列と
置換することによって、しかしE.coliにおける発現のた
めに最適化されたコドンを用いることによって、さらに
改変した(例えば、Fiers,Nature 260:500,1976を参照
のこと)。合成DNAからデノボでIGF−I配列を構築し、
そして同様にE.coliについて最適化したコドンを用い
た。
Michael Sporn博士、National Institutes of Health
から入手したcDNAクローンのPCR−介在改変により、TGF
−β2配列を得た。TGF−β−レセプター配列も、同様
にpH2−3FF(Herb Lin博士、Massachusetts Institute
of Technologyから入手したcDNAクローン)に由来し、
そしてマウスEGF−結合カリクレイン配列はpMS2−12A
(Ralph Bradshaw博士、University of California at
Riversideから入手したcDNAクローン)に由来した。全
てのPCR由来DNAを、使用前に配列決定した。
塩化カルシウム介在形質転換および抗生物質耐性につ
いての選択により、各プラスミドをW3110DE3に導入し
た。
酵素および試験 酵素および試薬を、New England Bi
olabs,Beverly,MA;Boehringer Mannheim,Indianapolis,
IN;Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Pharmacia,Piscat
away,NJ;BRL,Gaithersburg,MD;US Biochemical,Clevel
and,ON;およびClontech,Palo Alto,CAより購入した。
一般的技術 制限消化、アガロースゲル電気泳動、ラ
イゲーション、形質転換、DNAの調製、DNA配列決定、細
胞培養、SDS−PAGE、ウエスタンブロット、ELISA、およ
びその他通常の分子生物学的技術については、Maniatis
ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版、
1−3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press,1989およびCurrent Protocols in Molecular
Biology,F.Ausubelら編、Greene Publishing and Wile
y−Interscience:New York,1987および定期最新版に記
載されている。
細胞増殖および回収 上記のプラスミドのうちの1つ
を含有するE.coli W3110DE3株を、テトラサイクリン(1
5μg/ml)またはクロラムフェニコール(20μg/ml)を
含有する5mlのLuriaブロス(LB)に導入し、37℃で一
晩、通気しながら飽和になるまで増殖させた。2mlの新
鮮な一晩培養物を、0.2%グルコースを補充した100mlの
LBに希釈した。この培養物を、通気しながら数時間、同
一温度で増殖させた。培養物の吸光度を、初期対数増殖
期の間、吸光度(600nm)が0.4に達するまで追跡した。
次に、1mlのアリコートを取り出し、そして細胞を回収
した(「0分」時点)。
イソプロピル−チオガラクトピラノシド(IPTG)を、
最終濃度0.4mMとなるように添加し、そして培養物のイ
ンキュベーションを2時間継続した。第2のアリコート
の細胞を取り出した(「120分」時点)。
これらの時点からのアリコートを用いて、「全細胞溶
解物」(WCL)を下記のように調製した。残りの培養物
を遠心分離により回収し、次に、(1)「TEX緩衝液抽
出」プロトコールまたは(2)TEX工程を除いたTEXプロ
トコールの変法、「単純音波処理プロトコール」により
処理した。
TEX緩衝液抽出プロトコール 細胞を、最初の培養容
量の1/10量のTEX緩衝液(50mM Tris−Cl,pH8.0,2mM EDT
A,0.1%Triton X−100)に再懸濁し、そして20〜60分間
氷上においた。Beckman TJ−6遠心機で3,000rpm、15分
間4℃にて遠心分離後、上清(「TEX抽出物」または図
中「T」)を取り出し、そして細胞ペレットを同容量の
TE(10mM Tris−Cl,pH8.0,1mM EDTA)に再懸濁した。Br
ansonソニケーター(2×30秒バースト)を用いて、細
胞を破砕した。いくつかの実験において、0.2mg/mlのニ
ワトリリゾチームを破砕緩衝液に添加することによっ
て、溶解を促進したが、この工程は必要ではないと思わ
れた。破砕された細胞をBeckman TJ−6遠心機中で3,00
0rpm、50分間、4℃にて遠心分離した。上清(「細胞質
画分」または図中「C」)を取り出した。ペレットをTE
中で1回洗浄し、そしてさらに分析のために、等容量の
TE緩衝液中に再懸濁した(「不溶性画分」または図中
「I」)。
単純音波処理プロトコール 細胞を、最初の培養容量
の1/10量のTE(10mM Tris−Cl,pH8.0,1mM EDTA)に再懸
濁し、そして音波処理した。その後の全ての工程は、音
波処理後のTEX緩衝液抽出プロトコールに関するものと
同一であった。しかし、このプロトコールの音波処理後
に得られた上清は、「可溶性」画分(図中で標識された
「S」)を意味する(そして「TEX」画分および「細胞
質」画分の合計を表す)。
増殖中の培養物から取り出した各全細胞アリコートを
100μl SDS−PAGEサンプル緩衝液に再懸濁し、そして5
分間煮沸することにって、全細胞抽出物を電気泳動用に
調製した。2×サンプル緩衝液(1%SDS、10%グリセ
ロール、0.1%ブロムフェノールブルー)の1容量を添
加し、そして65℃で15分間インキュベートすることによ
って、「可溶性」画分サンプルおよび「不溶性」画分サ
ンプルを調製した。
実施例2:IL−1様タンパク質の相同性 図1は、IL−1様タンパク質ファミリーの次の5つの
メンバーの配列のアラインメントを示す:(1)E.coli
DsbA、(2)ヒトIL−1−β、(3)ヒトIL−1−
α、および(4)ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(FG
F)、および(5)ヒト酸性線維芽細胞増殖因子(FG
F)。このアライメントを最大にするために、より長い
メンバーの適切な領域を、比較(特にDsbAの酸化還元酵
素活性部位ループ(残基21〜35)、およびDsbAにおける
他の別の大きなループ(残基126〜157))から除外し
た。
この様式で最適に整列化すると、このグループの種々
のメンバーおよび毒素により同時調節された線毛(Tcp
G)ポリペプチド(Vibrio cholerae由来のE.coli DsbA
の細菌性同族体(PeekおよびTaylor、前出))は、図2
に示すIL−1−βに対して相同性を示す。認められた相
同性に加えて、図1に示す配列の種々の位置で、いくつ
かの保存的置換を観察し得た。例えば、いくつかの位置
で、Ile−−>Val、Phe−−>Try、およびAsp−−>Glu
を観察した。
実施例3:細菌細胞からのIL−1様ポリペプチドおよびそ
の融合物の蓄積および選択的放出 細菌細胞からの融合タンパク質の蓄積および選択的放
出を達成するために、IL−1様タンパク質ファミリーの
代表的な以下の3つのメンバーを選定して、IL−1−様
ポリペプチドに対するポリペプチド融合物の広範囲の適
用性の例を示した:(1)ヒトIL−1−β、(2)ヒト
IL−1−レセプターアンタゴニスト(IL−1ra)、およ
び(3)E.coli DsbA。IL−1raおよびE.coli DsbAの成
熟配列を発現させた。即ち、これらの天然コードされた
アミノ末端シグナル配列を、単一の開始メチオニンコド
ンに置き換えた(pDM15424およびpYZ9206;DsbAのV22か
らQ35のコドンが、バクテリオファージm13由来の遺伝子
IIIのV22からP77のコドンに置き換えられたこと以外
は、p15433はpY9206と同一である;変異遺伝子産物の予
想されるサイズは、約27kDである)。IL−1−βについ
ては、成熟タンパク質を特定する153個のコドンを、開
始メチオニンコドンの下流に配置した(pDJ12151)。
図3は、IL−1−βが発現され、そして37℃で増殖す
るE.coli細胞のSDS−PAGEによる分画の結果を示す。図3
Aは、0分時点での細胞からの全細胞溶解物(「WCL」)
を示す;図3Bは、WCL、120分;図3Cは、TEX抽出物;図3
Dは、「細胞質」画分;および図3Eは、「不溶性」画分
を示す。各ゲルについては、レーン1は、野生型IL−1
β、レーン2は、IL−1β3重変異R4A、L6A、R11G)、
およびレーン3は、IL−1β3重変異R4D L6A R11Gであ
る。これらの2つの3重変異体は、天然のレセプターの
少なくとも1つに結合するIL−1−βに影響することな
く、IL−1−βの生物学的活性をなくす残基で改変され
ている(Gehrkeら、J.Biol.Chem.265:5922−5925,1990;
Labriola−Tomkinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:111
82−11186,1991)。各場合における野生型または変異IL
−1βの予想されるサイズは、約17kDである(各ゲルの
右側に●で示す)。
これらのゲルは、TEX画分において、発現された野生
型IL−1−β(図3A−Eのレーン1)の大部分が見られ
ることを示し、IL−1−βがインビボで非細胞質位置に
偏在することが示された。このことは、2つの3重変異
体(R4A L6A R11G,レーン2;およびR4D L6A R11G,レーン
3)の場合には認められなかった。これら変異体由来の
大部分の発現されたIL−1−βは、「不溶性」画分に見
出された。これらのデータは、微細な改変であっても、
非細胞質の可溶性の形態で蓄積するIL−1−βの能力に
影響することを示す。
表2(以下)のデータからこれらの結果が確認され、
これは、ほとんどTEX画分においてのみ、ペリプラズム
タンパク質であるβ−ラクタマーゼと共に、IL−1−β
−IGF融合物(IL−1−β自体に類似する)が見出され
ることを示している。少ない割合のIL−1−β−IGF融
合タンパク質のみが、細胞質マーカーのβ−ガラクトシ
ダーゼと適合する。
図4は、E.coli DsbAの蓄積およびSDS−PAGE分画を示
す。図4aは、成熟DsbAを発現する細胞の0、60、および
120分時点における全細胞溶解物(「WCL」)(即ちリー
ダー配列を欠く)を示す;図4bは、活性部位ループのバ
クテリオファージm13の遺伝子III由来の約55個のアミノ
酸による置換(DsbAのコドンV22からQ35が、m13遺伝子I
IIのコドンV22からP77に置き換えられた)を有する、
「変異」成熟DsbAを発現する細胞の0、60、および120
分時点におけるWCL;図4cは、野生型成熟DsbAを発現する
細胞のTEX抽出(「T」)画分および「細胞質」
(「C」)画分;および図4dは、「変異」DsbAを発現す
る細胞の「T」および「C」画分を示す。発現されたポ
リペプチドの予想されるサイズは、約22kDである。
また、事実上、全ての発現されたDsbAタンパク質がTE
X画分に見出された。DsbAの「活性」部位ループが関連
のない遺伝子由来の配列に置き換えられた場合、抽出可
能なコンパートメントに輸送する能力は失われていなか
った。
図5は、IL−1様タンパク質とヒトIGF−IまたはTGF
−βレセプターとの種々の融合物が発現された細胞の分
画を示す:(1)予想されるサイズが約24−25kDのIL1
β−IGF(pDM16963);(2)予想されるサイズが約32k
DのIL1β−Ubi−IGF(pDM16965);(3)予想されるサ
イズが約37kDのDsbA−Ubi−IGF(pYZ22070);および
(4)予想されるサイズが約46kDのDsbA−Ubi−TGFR(p
DM15428)。
図5の4つのSDS−PAGEゲル(左)は、これらの4つ
の融合ポリペプチドを発現するE.coli細胞の0および12
0分時点におけるWCLを示す。図5の4つのSDS−PAGEゲ
ル(右)は、これらの4つの融合ポリペプチドに対する
TEX画分および「細胞質」画分を示す。点(dot)は、融
合ポリペプチドのバンドを示すために用いられ、そして
第2の点が存在する場合は、融合ポリペプチドの分解産
物が存在する。
4つの全ての場合において、融合タンパク質の実質的
な比が、TEX画分に見出された。従って、細胞由来のこ
れらのIL−1様タンパク質の融合物もまた、実質的に抽
出可能なコンパートメントに輸送した。
図6は、天然のリーダー配列の欠失(pDM1524)を伴
うE.coliで発現されたヒトIL−1−レセプターアンタゴ
ニストの、0および120分時点における、全細胞溶解物
(「WCU」)、ならびにTEX(「T])画分および細胞
質」(「C」)画分(「FXN」)を示す。さらに、ほと
んどのタンパク質がTEX画分において見出された。この
結果は、リーダー配列を欠くIL−1−raが適切に分泌さ
れることを示す。
表2(以下)は、IL−1−βまたはIL−1−β−IGF
融合物を発現するE.coli細胞のTEX画分が、ペリプラズ
ム酵素マーカーであるβ−ラクタマーゼを含むが、細胞
質マーカーであるβ−ガラクトシダーゼを含まないこと
を示す。同一のサンプルにおいて、IL−1免疫反応性
(融合タンパク質の存在を示す)が、ほとんどTEX画分
においてのみ見出された。
成熟DsbAによる同様の局在化を確認するために、Holm
gren(J.Biol.Chem.254:9627−9632,1979)により記載
のように、酸化還元酵素アッセイを粗抽出物で実施し
た。但し、以下の改変を行った:アッセイを室温で実施
した;DTTは、0.1mMであった;そしてインスリン基質は1
mg/mlであった。結果を表3に示す。IL−1−raと同様
に、リーダー配列を欠くDsbAが分泌され、その結果TEX
画分に局在する。
実施例4:細菌における可溶性融合ポリペプチドの蓄積 IL−1様融合パートナーは、細菌において発現される
種々の構造的に関連のない異種タンパク質の溶解性に対
して、著しいおよび有益な効果を示した。
図7〜10に、4つの異なるヒト遺伝子のそれぞれに対
する構築物を有する誘導された細胞の「可溶性」(S)
画分および「不溶性」画分(I)を比較した場合に得ら
れた結果をまとめる。
図7では、TGF−β2融合構築物を分析した。図7
(左)は、約20kDの予想されるサイズを有するユビキチ
ン−TGF−β2融合ポリペプチドをコードするpDJ16920
で形質転換したE.coli細胞の0および120分時点由来の
全細胞溶解物(「WCL」)、ならびに可溶性(「S」)
画分および不溶性(「I」)画分のクーマシー染色SDS
−ポリアクリルアミドゲルを示す。事実上、この融合ポ
リペプチドの全てが「不溶性」画分に見出された。しか
し、約42kDのDsbA−ユビキチン−TGF−β2融合物をコ
ードするプラスミドpYZ22096の場合、図7(右)は、タ
ンパク質がほとんど全体的に可溶性であることを示す。
これらの結果もまた、可溶性のTGF−β2が37℃で入手
され得ることを示す点で重要である。可溶性TGF−β2
を得るための以前の試みは、低温での増殖(例えば、30
℃)に依存しており、より低温での増殖は、E.coli宿主
細胞の増殖にとって最適ではなく、そして高価なリアク
ター冷却機器を必要とすることから、あまり望ましくな
い。
図8では、いくつかのIGF−I融合物で得られた結果
が示されている。図8(左)は、pDJ16927およびpDM169
65で形質転換したE.coli細胞の、0および120分時点由
来の全細胞溶解物(「WCL」)、ならびに可溶性
(「S」)画分および不溶性(「I」)画分のクーマシ
ー染色SDS−ポリアクリルアミドゲルを示す。pDJ16927
は、約15kDの予想されるサイズでユビキチン−IGF融合
物を発現する、pDJ16925は、約32kDの予想されるサイズ
でIL1β−ユビキチン−IGFを発現する。
図8(右)は、約37kDの予想されるサイズで成熟DsbA
−ユビキチン−IGF(即ち、シグナル配列を欠くDsbA)
を発現するpYZ22070で形質転換されたE.coli細胞、また
はDsbAが天然のシグナル配列を保持し、そして約37kDの
予想されるサイズを有するDsbA−Ubi−IGFを発現するpD
M15426で形質転換されたE.coli細胞の抽出物の同様のゲ
ルを示す。
図9は、IGFBP−3への融合物により得られた結果を
示す。パネル[i]は、予想されるサイズが約38kDのユ
ビキチン−IGFBP−3融合物(pDJ12875);パネル[i
i]は、予想されるサイズが約55kDのIL1−ユビキチン−
IGFBP3(pDM16967);および[iii]は、予想されるサ
イズが約60kDのDsbA−ユビキチン−IGFBP−3(pDM1542
7)。IL−1への融合物については、溶解性は著しく高
かった。
図10、パネル[i]は、予想されるサイズが約24kDの
ユビキチン−TGF−βR融合物(pDJ16921)を発現する
E.coli細胞の、0および120分時点由来の全細胞溶解
物、ならびに可溶性(「S」)画分および不溶性
(「I」)画分を、パネル[ii]は、予想されるサイズ
が約46kDのDsbA−ユビキチン−TGF−βR融合物(pDM15
428;βRはTGF−βレセプターの細胞外ドメインであ
る)を示す。ユビキチン−TGF−βR融合物は、大部分
は不溶性であった。極めて対照的に、DsbA−ユビキチン
−TGF−βR融合物は、事実上完全に溶解性であった。
実施例5:37℃で増殖した細菌細胞中の融合タンパク質か
ら得られたヒトIGF−Iの生物学的活性 図11は、IGF−Iの生物学的に活性な配置へのインビ
ボでの的折り畳みに対する温度およびDsbAへの融合の効
果を示す。
100mlの誘導された細胞から調製された「可溶性」画
分を、上記(「単純音波処理プロトコール」)のよう
に、50mM Tris−Cl,pH8.0,1mM EDTAで平衡化したQ−セ
ファロース(Pharmacia)カラム(5mlベッド容量)に通
すことにより、これらの培養物の抽出物から融合タンパ
ク質を精製した。カラムを2カラム容量の同緩衝液で洗
浄し、そしてサンプルを、0.4M CaClを添加した8mlの同
緩衝液で溶出した。Centricon−30メンブラン(Amico
n)上で、溶出物0.5mlの容量まで濃縮した。
ユビキチンヒドロラーゼ切断 上記の濃縮物に、以下
の実施例6に記載の通りプラスミド23344を含む株から
調製したユビキチンヒドロラーゼ酵素の10μlの粗抽出
物を添加した。
HPLC−逆相クロマトグラフィー HPLC−逆相クロマト
グラフィーを以下の通り実施した。37℃で60分間のユビ
キチンヒドロラーゼとインキュベートした後、消化物を
直接C−18(Vydac)逆相カラムにかけ、そして2緩衝
液系でHPLCクロマトグラフィーに供した:緩衝液Aは、
0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液であり、そして緩
衝液Bは、0.1%TFA/アセトニトリルであった。カラム
を以下の通り展開した:4分で0−22%B;6分間22%Bで
洗浄;1分あたり0.5%での22−42%B勾配で溶出(全体
で40分)。IGF−I標準物は、これらの条件下で31.4%
Bで溶出する。ピークを回収し、次にIGFバイオアッセ
イ(下記)のため希釈し、またはPAGE分析に供した。全
てのサンプルにおいて31.4%の位置から回収したピーク
は、PAGEで測定された通り、銀染色により可視化された
タンパク質のバンドとともに、7.5kDに泳動した単一の
タンパク質のバンドを含んでいた。この画分には混入タ
ンパク質は観察されなかった。従って、ピーク高を用い
て、市販のIGF標準物と比較することによって、存在す
るIGFの量を推定した。
IGFバイオアッセイ IGFバイオアッセイは、MG63細胞
(ATCC CRL #1427、雄性骨肉腫細胞株)を、5000細胞
/ウエルで96−ウエルマイクロタイタープレートに播
き、そしてCO2インキュベーター中、37℃で16時間イン
キュベートした。培養培地を吸引し、そしてサンプル
(例えば、Imcera、Terre Haute、INから入手可能な市
販のIGF標準物を含む)を、RPMI培地(2mMグルタミン、
50U/mlペニシリン、50mcg/mlストレプトマイシン、0.05
%ウシ血清アルブミン(BSA))の入ったウエルに加え
た。
各サンプルの2倍系列希釈物について試験した。Cell
Proliferation Kit(カタログ番号RPN.210、Amersha
m)を用いて、細胞を24時間、37℃でインキュベート
し、培地をデカントし、そして100μlのキット標識試
薬(kit's labelling reagent)を指示通り同培地で希
釈し、そして各ウエルに添加した。次にプレートを37℃
で3時間インキュベートした。
試薬をデカントした後、細胞を、冷PBSで3回洗浄
し、次に100μlの90%エタノール、5%酢酸を各ウエ
ルに添加することによって固定した。固定された細胞を
30分間室温でインキュベートし、そして、それぞれ
(a)PBS+0.1%Tween−20;(b)PBS+0.1%Triton X
−100、および(c)PBS+0.1%Tween−20で3回洗浄し
た。続いて、ウエルを、PBS+0.1%Tween−20+0.1%脱
脂粉乳(NFDM、Carnationブランド)中で15分間、室温
にてブロックし、そして製造者のプロトコール(Amersh
am)に従い、キットに供給されている抗体標識物で処理
した。5−ブロモ−2−ジオキシウリジン(BRDU)の取
り込みを測定するために、A405/A490比を測定した。標
準曲線と比較することによって、各サンプル中のIGF−
Iの濃度を測定した。すべてのサンプルを三つ組みで測
定した。
結合反応後、4℃で30分間、0.3mMスベリン酸ジスク
シンイミジルを添加することによって、サンプルを化学
的に架橋した。架橋を、Tris−HCl,pH7.5を濃度20mMと
なるように添加し、続いて10分間煮沸することによって
停止した。架橋したサンプルの一部を、0.2%2−メル
カプトエタノールおよび2%SDSの存在下、N−グリコ
シダーゼFと共に3時間、37℃でインキュベートするこ
とによって、酵素的に脱グリコシル化した。このインキ
ュベーションの後、N−グリコシダーゼFの第2のアリ
コートを添加し、そしてサンプルをさらに1時間インキ
ュベートした。結合反応の生成物を、8%ゲルを用いた
還元条件下でのSDS−PAGEにより分離した。標識した種
を、10%酢酸、40%メタノール中での固定化後、オート
ラジオグラフィーにより可視化した。
図11Aおよび11Bは、それぞれ30℃で増殖したDsbA−ユ
ビキチン−IGF構築物およびユビキチン−IGF構築物の培
養物由来のユビキチンヒドロラーゼ−切断IGF−Iから
のHPLC逆相溶出プロフィールを示す。図11Cおよび11D
は、それぞれ37℃で増殖したDsbA−ユビキチン−IGF構
築物およびユビキチン−IGF構造物の培養物の対応する
データを示す。市販の精製IGF標準物と比較することに
よって、31.4%緩衝液BでのIGF−Iの位置を確立し
た。図11Dにおいて、37℃でのユビキチン融合物が適切
に折り畳まれたIGF−I(IGF−Iは約35%Bで存在)を
生産しないが、30℃ではユビキチン融合物が適切に折り
畳まれたIGF−Iを生産したことが明らかである。IGF−
I折り畳み自体の温度依存性は予想されなかったが、適
切に折り畳まれたIGF−Iの回収に対するDsbA融合パー
トナーの著しい効果は驚くべきものであった(図11Cと1
1Dとを比較すること)。
IGFバイオアッセイにより、IGFピークの比活性(枠内
の数値(任意の単位)として図11に示す。)を確立し
た。このアッセイにおいて、実際のIGF−Iの比活性は
0.206であった。対照的に、図11Dの主要ピークであるピ
ーク#2の比活性(ユビキチン融合物、37℃)は0.004
であった。
図11CのIGF−Iピークに対するアミノ末端タンパク質
の配列を、自動シークエンサー(Applied BioSystems,F
oster City,CA)でのエドマン分解により確立された。
配列Gly−Pro−Gul−Thr−Leu−X−Gly−Ala−Glu−Le
uを有する単一の主な種を回収した。これは成熟IGF−I
に対する予想されるアミノ末端配列であり、そしてさら
に、ユビキチンヒドロラーゼが予想された通り正確に切
断したことを示す。
HPLC前のIGF−Iサンプルの精製が結果に影響し得る
という見込みのない可能性を排除するために、表4に挙
げた構築物を有する株からの粗抽出物(「可溶性」画
分)をユビキチンヒドロラーゼで処理し、総タンパク質
濃度を調整し、そしてIGFバイオアッセイのために希釈
した。融合タンパク質の切断を、各場合においてSDS−P
AGEにより確認した。粗生物活性(任意の単位で)は以
下の通りであった: これらの結果から、DsbA融合パートナーが、実質的にE.
coli由来の生物学的に活性なIGF−Iの回収率を上昇さ
せるという初期の観察を確認した。DsbAの代わりにIL−
1−βを含む融合物から、同様の方法で生物活性のある
IGF−Iも得、そして分析した。得られたIGF−I−DsbA
融合物もまた、ユビキチンヒドロラーゼによる切断後、
正確なアミノ末端配列(GPETLXGA...)を示した。
以上をまとめると、これらの結果は、細菌細胞におけ
る生物学的に活性なIGF−Iの生産、蓄積、および回収
におけるIL−1様融合パートナーの有用性を示す。
実施例6:細菌細胞における酵母ユビキチンヒドロラーゼ
の生産および融合ポリペプチドの同時発現 ユビキチンヒドロラーゼ(UH)発現ベクターは、唯一
のBgl II部位の上流の遺伝子のアミノ末端の92個のコド
ンを欠失し、かつこのDNAを以下のコドンと置き換えるU
BP−1のcDNAクローンに由来した(TobiasおよびVarsha
vsky,J.Biol.Chem.266:12021−12028,1991):(a)バ
クテリオファージT7のphi−10遺伝子の最初の12個のコ
ドンで、プラスミド23344を産出するコドン;(b)成
熟ヒトIL−1−βの153個のコドンの後にAsp−Arg−Gly
−Asp−Pro−His−His−His−His−His−His−Gluをコ
ードするリンカーが続き、プラスミド23399を生産する
コドン;または(c)E.coli DsbAの189個のコドンの後
にHis−His−His−His−His−His−Serをコードするリ
ンカーが続き、その後に酵母ユビキチンの(メチオニン
後の)最初の75個のコドンが続き、その後にAsp−Pro−
His−His−His−His−His−His−Gluをコードするリン
カーが続き、プラスミド27246を産出するコドン。各場
合において、インフレーム融合物は、T7プロモーター制
御下で融合遺伝子を生じた。これらの実験で使用した転
写単位のベクターバックボーンおよびその他の詳細につ
いては、実施例1に記載されている。
以下のような適合可能なプラスミドの組合せで、E.co
li W3110 DE3株細胞を形質転換した: 実施例1に記載の通りIPTGで誘導後、クーマシー染色SD
S−ポリアクリルアミドゲル上に主要なバンドが出現
し、これらはIGF融合タンパク質およびそのUHでの切断
の産物の予想されるサイズに対応した。
表5に示された結果から、一般的な分泌経路によりペ
リプラズム空間を標的とするタンパク質融合物が、IL−
1−βまたはDsbAのいずれかに融合したUH酵素による分
解は比較的免れるが、成熟DsbAにより使用される別の経
路により偏在する同一の融合タンパク質(即ち、シグナ
ル配列を欠く)が、細胞質酵素またはDsbA融合UH酵素の
いずれかにより効果的に切断されることを明らかに示
す。E.coliでの発現時に、IL−1様ポリペプチドおよび
それらの融合物について選択的な抽出が観察された(実
施例3)にもかかわらず、これらのポリペプチドは古典
的なペリプラズムタンパク質とは異なる方法で偏在する
と思われる。これらの結果もまた、同時発現したユビキ
チンヒドロラーゼ遺伝子が、インビボで効率的に、IGF
のような目的のポリペプチドから分離されたIL−1様プ
ラスミドを含有する融合ポリペプチドを、ユビキチンヒ
ドロラーゼ切断部位を含むリンカーのところで切断し得
る。
実施例7:TGFレセプターフラグメントの精製および架橋
アッセイ プラスミドpDM15428を含む誘導された細胞(100ml培
養容量)から調製された「可溶性」画分を、製造者の推
奨に従って、1mlベッド容量のNi−NTAアフィニティーカ
ラム(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)に通し、平衡化
し、洗浄し、そして展開した。溶出物を、最初のローデ
ィング緩衝液に対して透析し、ユビキチンヒドロラーゼ
の部分純粋調製物で消化し、そして上記と同一のNi−NT
Aカラムを通した。通過物をCentricon−10メンブラン
(Amicon)上で濃縮して最終容量を0.5mlとし、そして
以下の通り架橋アッセイに使用した:このサンプルの20
μlを100pM125I−TGF−β1(250nM)と共に一晩イン
キュベートした。このサンプルを0.3mMスベリン酸ジス
クシンイミジル(Pierce Chemical,Rockford,IL)で15
分間4℃で架橋した。3分の1容量の4×Laemmliゲル
サンプル緩衝液(50mMジチオスレイトールを含む)を添
加することにより、反応を停止した。サンプルを2分間
煮沸(100℃)し、そしてSDS−PAGEに供した。ゲルを乾
燥し、そして−80℃で一晩曝するオートラジオグラフィ
ーにより可視化した。
図12は、125I放射標識TGF−β1および部分精製TGF−
βR(136アミノ酸細胞外ドメイン)を用いる架橋実験
の結果を示す。予想される架橋産物が約33kDに泳動した
ことが観察される。この産物は、特異的結合相互作用に
よって形成される。何故なら、その出現は過剰な非放射
性TGF−β1(1000倍モル濃度)の添加によって、完全
になくなるからである。これらのデータは、IL−1様融
合パートナーにより機能的なTGF−βレセプターが細菌
内で生産され得ることを示す。
実施例8:IGFBP−3ドットブロットアッセイ IGFBP−3ドットブロットアッセイのために、予め切
り取ったImmobilon−Pメンブラン(Millipore)を5秒
間メタノールに浸漬し、Tris−緩衝化生理食塩水(TB
S)で濯ぎ、次に10分間TBSに浸漬した。メンブランをド
ットブロット装置に載せ、そして各ウエルに50μlのTB
Sを加えた。サンプルを真空吸引によりメンブランに載
せた。次に、メンブランを、TBS+3%脱脂粉乳(CARNA
TIONブランド)中、室温で2時間、ブロックした。125I
放射標識IGF−1(1μl/mlブロッキング緩衝液)を添
加し、室温で2時間インキュベートした。緩衝液を捨
て、そしてフィルターをTBSで洗浄した(室温で2×15
分洗浄)。次にメンブランを10分間風乾し、次に−80℃
で一晩、Kodak XR−Omatフィルムに曝した。
図13は、(1)DsbA−ユビキチン−IGFBP−3融合物
(pDM15427)、(2)ユビキチン−IGFBP−3融合物(p
DJ12875)、または(3)「ベクターのみ」コントロー
ル(pDJ12887)を発現する株の祖抽出物(「可溶性」画
分)の結合活性を測定するための、125I放射標識IGF−
Iを用いたドットブロット結合アッセイの結果を示す。
サンプルを予めユビキチンヒドロラーゼで前処理した
(+UH)かまたは処理しなかった(−UH)かにかかわら
ず、同様の結果が得られた。このことから、完全な融合
タンパク質が、切断されたIGFBP−3タンパク質と同じ
くらい効率的にリガンドを結合し得ることを示す。この
場合、活性タンパク質を得るためにユビキチン切断は必
要ではない。
この結果は、DsbA融合パートナーが生物活性のあるIG
FBP−3の回収率を約16倍上昇させることを明らかに示
す(4倍系列希釈をブロットで用いる)。
実施例9:哺乳動物細胞におけるIL−1−β−IGFBP−3
融合タンパク質の発現 哺乳動物細胞においてIL−1−β−IGFBP3融合タンパ
ク質をコードする発現プラスミドpDM15430を、プラスミ
ドpDM16964由来の融合配列をpDJ12147(pRcCMVの欠失誘
導体(InVitrogen Crop,La Jolla,CA)であって、ヒト
サイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサ
ー、ならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル
を利用する)中に挿入することによって、構築した。プ
ラスミドpDM16964由来の融合配列は、開始メチオニン、
成熟ヒトIL−1−βの153個のアミノ酸、および成熟ヒ
トIGFBP−3の264個のアミノ酸のコドンを含有する。
この構築物および対応する非組換えプラスミド(「ベ
クター」)を使用し、DEAE−デキストラン法を用いて一
時的にCOS−M6細胞をトランスフェクトした(Seedおよ
びAruffo、Proc.Natl.Acad.Sic.USA 84:3365−3369,198
7)。トランスフェクション72時間後、0.2%NP−40を含
むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞層を4℃にて30
分間溶解することによって、細胞抽出物を作成した。こ
の抽出物を遠心分離して、不溶性破砕物を除去し、そし
て上清を結合アッセイに使用した。
図14は、内因性のIGF−結合活性が、COS細胞抽出物中
で、45〜50kDのサイズ範囲の広いバンド(Y)で見い出
されたことを示す。図14右は、IL1β−IGFBP3(「IL1−
BP3」)をコードするpDM15430で、上記のように一時的
にトランスフェクトしたCOS細胞由来の架橋サンプルのS
DS−PAGEを示す。図14左は、ベクター単位(「ベクタ
ー」)でトランスフェクトしたCOS細胞由来の架橋サン
プルのSDS−PAGEを示す。各セットのゲルは、エンドグ
リコシダーゼF処理なし、または「非放射性」IGF競合
の左側のレーンを有する。中央のレーンは、エンドグリ
コシダーゼFでの処理後の結果を示し、そして右側のレ
ーンは、過剰の「非放射性」IGFを用いた競合の結果を
示す。上記のように、エンドグリコシダーゼFを用いて
架橋サンプルを処理した後、この内因性のIGF結合バン
ドは、約40kDで移動するより鮮明なバンドに縮小した。
IL−1−β−IGFBP−3融合構築物でトランスフェクト
した細胞では、予想されるサイズ範囲(約55kD+、図14
中の「X」)で架橋バンドが観察された。しかし、エン
ドグリコシダーゼFを用いた処理では、Xバンドの移動
度は変わらなかった。このことは、これら細胞中で蓄積
したIL1β−IGFBP−3融合タンパク質がグリコシル化さ
れなかったことを示す。観察された結合のすべては、そ
れが非放射性IGFで首尾良く競合したように特異的であ
った(図14の右のレーンを参照のこと)。
並行実験で、IL−1融合パートナーを欠いているMet
−IGFBP−3構築物でトランスフェクトした細胞は、上
記の基準により任意の検出可能なIGF結合を示さなかっ
た(データは示さず)。その他の実験は、IGFBP−3遺
伝子の天然形態(即ち、それ自身のシグナル配列を有す
る)が、哺乳動物細胞においてグリコシル化生成物を産
生することを示した(Sprattら、Growth Factors :63
−72、1990)。従って、本実施例のIL−1融合物は、IG
FBP−3タンパク質のグリコシル化を生じ得る分泌タン
パク質が通る正常の経路である、ERおよびゴルジを通る
通過によるのではなく、(IL−1−β自身のように)哺
乳動物細胞内に偏在するようである。
実施例10:リーダー欠失DsbC、変異体、および融合物の
発現 E.coliにおける、最近同定されたDsbタンパク質のフ
ァミリーのメンバーであるDsbCは、先に記載された他の
酸化還元酵素に対して、明らかな一次配列相同性を持た
ない。この遺伝子は、以前にはxprAと命名されていた
(Missiakasら、EMBO J.13:2013−2020、1994;Lovettお
よびKolodner、J.Bacteriol.173:353−364、1991)。こ
の遺伝子のリーダーを欠失異型(version)を、先に記
載した(例えば、上記実施例1中のpYZ22070を参照)T7
発現ベクター中に、鋳型としてのE.coli DNA、ならびに
プライマー 得られたプラスミドpDM25492を、さらに以下のように改
変した:推定される2重システイン活性部位ループの周
囲のDNA配列を、5'...ACCTGTGGTTACTGCCACAAA...3'から
5'...ACCGGTAGCGGTTCTGGTAAA...3'に、当業者に周知の
部位特異的変異の方法を用いて変えた。得られたプラス
ミドをpDM46805と命名した。リーダー欠失DsbC(2重シ
ステイン活性部位ループを有するまたは有さない)のIG
F−Iへの融合物を構築し、それぞれ、プラスミドpDM15
486およびpDM46806を生成した。
これら4つのプラスミドpDM15486、pDM25492、pDM468
05、およびpDM46806中に存在するリーダー欠失DsbC変種
のDNA配列を、図32、33、25、31にそれぞれ挙げる。
図15は、それらがW3110DE3中に導入される場合に、こ
れらのプラスミドにより発現されるタンパク質を示す。
上記の実施例1に記載されるように、誘導および選択的
抽出の後、サンプルを4〜20%のアクリルアミドグラジ
エントゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色し、そ
して写真撮影した。図15のパネル「A」および「B」
は、pDM25492およびpDM46805をそれぞれ有する株の音波
処理後のTEX抽出物(T)および残りの可溶性画分
(S)を示す。IGF−I融合構築物、pDM15486およびpDM
46806の対応するサンプルを、図15のパネル「C」およ
び「D」に示す。DsbCタンパク質の予想される位置を各
場合に矢印で示す。
これらの結果は、リーダー欠失DsbCが、IGF−IへのD
sbCの融合物のように、効率的に細胞質から輸送される
ことを明瞭に示す。2重システイン活性部位ループの存
在は、輸送のために明らかに必要とされない。
実施例11:ミニDsbAの発現と融合 DsbAの2重システイン活性部位のループ付近の全領域
を取り除いた効果を試験するために、DsbA発現ベクター
pYZ9206(上記の実施例1に記載)を、このプラスミド
の特有のBssH IIおよびBgl II部位間のDNAを、以下の配
列の合成DNAに置換することにより改変した: この置換(これ以後は、「ミニDsbA」と呼ぶ)の効果
は、元の(成熟)DsbAのアミノ酸#21−62の代わりにア
ミノ酸Ser−Gly−Serを用いることである。2重システ
イン活性部位のループ(#30−33に位置する)を本手法
により欠失させる。得られたプラスミド(pDM25452)を
ミニDsbAのカルボキシ末端にユビキチンとIGF配列とを
融合することによりさらに改変し、pDM25486を作製し
た。pDM25499は、ユビキチンのアミノ末端の45アミノ酸
をコードするDNAをさらに欠失させた、pDM25486の変種
である。
pDM25452、pDM25486、およびpDM25499にコードされた
リーダー欠失ミニDsbAのDNA配列を、図28、43、および4
1にそれぞれ列挙する。
図16は、上記の実施例10中の構築物について記載され
たように試験した場合に、これらのプラスミドにより発
現されたタンパク質を示す。パネル「A」および「B」
は、pYZ9206(リーダー欠失DsbA)とpDM25452(リーダ
ー欠失ミニDsbA)との比較を示す。各場合において、誘
導されたサンプルを、TEX(T)画分、残渣可溶性
(S)画分、および不溶性(I)画分に分画した。パネ
ル「C」は、pDM25499で得られた結果を示す。
この結果は、ミニDsbAが容易に細胞質から移動し、可
溶型で蓄積することを示す。2重システイン活性部位の
ループの存在は、リーダー欠失DsbAの輸送機能に明らか
に無関係である。
以下の表6に、本明細書に含まれる実施例に用いられ
たプラスミドを記載する。
実施例12:インビボビオチン化DsbAおよびIL1−βの発現 最近の報告(Schatz,Bio/Technology 11:1138−1143,
1993)で、E.coliのビオチンホロ酵素合成酵素の標的基
質に見かけ上擬態するコンセンサス13merペプチド配列
を同定している。DsbAおよびIL1−βのカルボキシ末端
へこの配列を付加した効果を調べるために、ベクターpY
Z22055(上記のpYZ9206に、カルボキシ末端リジン、コ
ドン189の下流の配合が、合成された次の配列であるこ
と以外は類似している: ;下線は終止コドン)中のリーダー欠失DsbA遺伝子を、
合成配列: をpYZ22055中のdsbA配列のカルボキシ末端リンカー内の
特有のSph I部位とXho I部位との間に挿入することによ
り改変した。この操作で、リーダー欠失DsbA配列のすぐ
下流のビオチン化基質ペプチド配列が融合される。得ら
れたプラスミドはpDM25450である。コントロールのプラ
スミドpDM25453は、天然DsbAリーダー配列がpDM25453中
において回復されたことを除いてはpDM25450と一致す
る。
pDM15457は、上記のpDM25450に類似するように構築さ
れた。それは、IL1−βのすぐ下流のビオチン化基質ペ
プチドをコードする。pDM15449は、非改変IL1−βを発
現する親ベクターである。
pYZ22055、pDM25450、pDM25453、およびpDM15449に存
在するDNA配列を、それぞれ図27、21、20、および35に
列挙する。
図17は、これらのプラスミドにより発現されたタンパ
ク質が前述の実施例(上記実施例1、10、および11を参
照のこと)で記載されたように分析された場合に得られ
た結果を示す。TEX画分のみを分析に供した。ゲルをク
マシーブルーで染色して撮影し、あるいはウエスタンブ
ロットを行い、ビオチン化タンパク質を検出するように
設計された試薬キット(Clontech's GENE−TECTカタロ
グ番号K1035−1;Palo Alto,CA)で処理した。
各パネルのレーン「A」、「B」、「C」、および
「D」には、pYZ22055、pDM25450、pDM15449、およびpD
M15457に対応する抽出物を流した。13merのビオチン化
基質ペプチドを発現する2つの構築物(pDM25450および
pDM15457)は、ウエスタンブロットでクリアな陽性シグ
ナルを提供するが、コントロールは提供しない。
この検出系をさらに検討するために、pDM25450および
pDM25453(両方ともビオチン化基質の13merをコードす
る)由来のTEX抽出物を、製造者の指示に従って、Ni−N
TAアフィニティークロマトグラフィー(QUIAGEN,Inc.Ch
atsworth,CA)にかけた。これらの2つのプラスミドに
よりコードされたDsbAタンパク質の改変カルボキシ末端
は、Ni−NTA樹脂への結合を容易にする一続きの6つの
ヒスチジン残基を含む。pDM25453タンパク質の分泌後
(リーダーがリーダーペプチダーゼにより切除された場
合)、タンパク質はpDM25450によりコードされたリーダ
ー欠失異型に一致する。従って、この実験において精製
された2つのDsbAタンパク質間のほんのわずかな差は、
それらが細胞質から外に輸送されたルートである:pDM25
453産物は一般の分泌経路により、そしてpDM25450産物
は(おそらく)いくつかの新規の機構により分泌され
る。これらを試験した場合(それぞれ、パネル「E」お
よび「F」)、これらの精製タンパク質は、ビオチン化
される効率は少なくとも10倍の差を示す。
実施例3に記載されたようにアッセイした場合、個々
の試験では、2つのタンパク質の比酵素活性(酸化還元
酵素)に差を示さない。これは、両タンパク質が正しく
折り畳まれていることを示唆している。
以上を考え合わせると、これらのデータは、リーダー
欠失DsbAタンパク質の細胞質外輸送の独立した様式(mo
de)についての強力な証拠を提供する。
実施例13:IL1−βR11G変異体の発現および輸送 インターロイキン−1−β配列内のいくつかの位置で
の置換変異の効果を、生物活性について評価した。R11G
(Arg−11からGlyへの)変異体は、1つのIL1レセプタ
ーに対して通常の結合を示すが生物活性は示さない。レ
セプター結合は、タンパク質の通常のコンホメーション
折り畳みを示唆している。従って、R11G変異体はE.coli
におけるこの輸送機能に関して影響され得ないと考える
のが合理的であり得る。
pDM25466は、当業者に周知の部位特異的変異誘発法に
よりコドン#11がCGG(Arg)からGGG(Gly)に置換され
たことを除いてはpDM15449(上記の実施例12を参照のこ
と)に類似している。pDM25466におけるIL1遺伝子のDNA
配列を図37に列挙する。
図18は、pDM15449(パネル「A」)またはpDM25466
(パネル「B」)を有する誘導細胞から得られたサンプ
ルの分画を示す。変異タンパク質の蓄積レベルは減少す
るが、輸送は明らかに生じる。
実施例14:DsbA−酵母MATα−2相同異質ドメイン(home
odomain)の発現 およそ60アミノ酸の酵母α−2相同異質ドメインが、
DNAに結合するに十分である(Wolbergerら、Cell 67:51
7−528,1991)。プライマー ならびに、S.cerevisiaeゲノムDNA(Sigma Chem.Co.,S
t.Louis,MO)を基質として用い、0.22kbのPCRフラグメ
ントを得、Sph IとNsi Iとで切断し、そして同酵素で切
断されたpYZ22055ベクター(上記)中にクローニングし
た。得られたプラスミドのpDM15478は、DsbAのカルボキ
シ末端とα−2相同異質ドメインのアミノ末端との間に
フレームに合うように融合したものを有する。このプラ
スミドを有する株を、前述の実施例に記載されたように
試験した。
図19Aは、融合タンパク質の発現とTEX(T)画分およ
び残渣可溶性(S)画分へのその部分的な分画を示す。
実施例12に記載されたNi−NTA法を用いて、精製融合タ
ンパク質を(T)画分および(S)画分から調製した。
これらの精製画分を、図19AのパネルN1およびN2に示
す。
図19Bは、両方の精製画分がDNA結合活性を示すことを
示す。オルゴヌクレオチドは、まさにWolbergerら(前
出)に記載されたものであり、そしてコントロールパネ
ル(control panel)は、(a)タンパク質なし、
(b)DsbA標準(Epicenter Technologies,Madison,WI
より購入)、および(c)ビオチン化DsbAである;上記
の実施例12を参照のこと。(d)および(e)は、精製
融合タンパク質サンプルN1およびN2である。全サンプル
は、TBEアクリルアミド濃度勾配ゲル(4−20%)上に
2重測定で添加される。電気泳動後、ゲルをエチジウム
ブロミド(1μg/ml)で染色し、撮影する。
結果は、融合タンパク質サンプルからのDNA結合活性
を明らかに示しているが、コントロールでは示さない。
本明細書中に言及されている全ての刊行物および特許
出願は、各々個々の開示または特許出願が、詳細および
個別に参考として援用されることが示されている限り、
同程度に参考として本明細書中に援用されている。
本発明は十分に記載されており、多くの変更および修
正が添付の請求の範囲の理念または範囲から逸脱するこ
となくさらになし得ることは、当業者には明らかであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12R 1:19) C12N 15/00 ZNAA (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 ザン,ヤン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94087,サニーベイル,23―アイ,イー. レミングトン ドライブ 575 (72)発明者 オルソン,パメラ エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014,カパーティノ,バーンハート アベニュー 18630 (72)発明者 オルセン,ディビッド アール. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025,メンロ パーク,ヘッジ ロー ド 276 (72)発明者 カリロ,ペドロ エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109,サン フランシスコ,カリフォ ルニア ストリート ナンバー7 1966 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 19/00 BIOSIS/WPI(DIALOG) EUROPAT(QUESTEL)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】融合タンパク質またはポリペプチドをコー
    ドする核酸であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、DsbAおよびDs
    bCからなる群より選択される融合パートナー;リンカー
    ペプチド;および目的のタンパク質またはポリペプチド
    を含有し、 ここで該リンカーペプチドは該融合パートナーと該目的
    のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そし
    て該融合パートナーは、該融合タンパク質またはポリペ
    プチドのアミノ末端を構成し、そしてシグナル配列を欠
    く、 核酸。
  2. 【請求項2】前記リンカーペプチドがポリペプチド切断
    部位を含有する、請求項1に記載の核酸。
  3. 【請求項3】前記リンカーペプチドがユビキチン分子を
    含む、請求項2に記載の核酸。
  4. 【請求項4】前記融合パートナーがE.coli DsbAであ
    る、請求項1に記載の核酸。
  5. 【請求項5】前記融合パートナーが、変異E.coli DsbA
    および変異E.coli DsbCからなる群より選択され、ここ
    で該変異E.coliが2重システイン活性部位のループドメ
    インを欠く、請求項1に記載の核酸。
  6. 【請求項6】前記目的のポリペプチドが異種ポリペプチ
    ドである、請求項1に記載の核酸。
  7. 【請求項7】融合タンパク質またはポリペプチドをコー
    ドする核酸であって、 該融合ポリペプチドが、DsbAまたはDsbC;ユビキチン分
    子を含むリンカーペプチド;および目的のタンパク質ま
    たはポリペプチドを含有し、 ここで、該リンカーペプチドが該DsbAまたはDsbCと該目
    的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そ
    して該DsbAまたはDsbCは、該融合タンパク質またはポリ
    ペプチドのアミノ末端を構成し、そしてシグナル配列を
    欠く、 核酸。
  8. 【請求項8】融合タンパク質またはポリペプチドをコー
    ドする核酸であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが: a)成熟E.coli DsbAと、2重システイン活性部位のル
    ープドメインを欠く変異E.coli DsbAとからなる群より
    選択されるポリペプチド; b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド;および c)目的のタンパク質またはポリペプチドを含み、 そしてここで該DsbAまたは変異DsbAは、該目的の融合タ
    ンパク質またはポリペプチドのアミノ末端を構成し、そ
    してシグナル配列を欠く、 核酸。
  9. 【請求項9】融合タンパク質またはポリペプチドをコー
    ドする核酸であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが: a)成熟E.coli DsbCと、2重システイン活性部位のル
    ープドメインを欠く変異E.coli DsbCとからなる群より
    選択されるポリペプチド; b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド;および c)目的のポリペプチドを含み、 そしてここで該DsbCまたは変異DsbCは、該目的の融合タ
    ンパク質またはポリペプチドのアミノ末端を構成し、そ
    してシグナル配列を欠く、 核酸。
  10. 【請求項10】請求項1に記載の核酸を含有する、発現
    ベクター。
  11. 【請求項11】請求項1に記載の核酸を含有する、宿主
    細胞。
  12. 【請求項12】宿主細胞であって、以下: a)該宿主細胞中で融合タンパク質またはポリペプチド
    を発現し得る発現ベクターであって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)DsbAおよびDsbCからなる群より選択される融合パー
    トナー、 ii)タンパク質分解酵素切断部位を含むリンカーペプチ
    ド、および iii)目的のタンパク質またはポリペプチド を含有し、 ここで該リンカーペプチド該融合パートナーと該目的の
    タンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そして
    さらに該融合パートナーは、該融合タンパク質またはポ
    リペプチドのアミノ末端を構成し、シグナル配列を欠
    く、 ベクター;ならびに b)宿主細胞の細胞質中で、該タンパク質分解酵素切断
    部位を特異的に認識するタンパク質分解酵素を発現し得
    る核酸 を含む、宿主細胞。
  13. 【請求項13】宿主細胞であって、以下: a)該宿主細胞中で融合タンパク質またはポリペプチド
    を発現し得る発現ベクターであって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)成熟E.coli DsbAと、2重システイン活性部位のル
    ープドメインを欠く変異E.coli DsbAとからなる群より
    選択されるポリペプチド; ii)タンパク質分解酵素切断部位を含むリンカーペプチ
    ド;および iii)目的のタンパク質またはポリペプチドを含み、 ここで該リンカーペプチドは、該DsbAまたは変異DsbAと
    該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置
    し、そしてさらに該DsbAまたは変異DsbAは、該融合タン
    パク質またはポリペプチドのアミノ末端を構成し、シグ
    ナル配列を欠く、ベクター;ならびに b)宿主細胞の細胞質中で、該タンパク質分解酵素切断
    部位を特異的に認識するタンパク質分解酵素を発現し得
    る核酸 を含む、宿主細胞。
  14. 【請求項14】前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒ
    ドロラーゼであり、前記切断部位がユビキチンヒドロラ
    ーゼ部位である、請求項12または13に記載の宿主細胞。
  15. 【請求項15】融合ポリペプチドであって、以下: a)本質的に成熟ポリペプチドの少なくとも1つのフラ
    グメントからなる、細胞質外輸送を導き得る融合パート
    ナーであって、ここで、該成熟ポリペプチドが、DsbAお
    よびDsbCからなる群より選択される、融合パートナー;
    ならびに b)目的のタンパク質またはポリペプチドであって、こ
    こで該タンパク質またはポリペプチドは該融合パートナ
    ーのカルボキシ末端に対して遠位に位置する、タンパク
    質またはポリペプチド を含む、融合ポリペプチド。
  16. 【請求項16】さらに前記融合パートナーと前記目的の
    タンパク質またはポリペプチドとの間に位置するリンカ
    ーペプチドを含有する、請求項15に記載の融合ポリペプ
    チド。
  17. 【請求項17】前記リンカーペプチドが切断部位を含
    む、請求項16に記載の融合ポリペプチド。
  18. 【請求項18】前記切断部位がユビキチンヒドロラーゼ
    切断部位である、請求項17に記載の融合ポリペプチド。
  19. 【請求項19】前記融合パートナーが、DsbAとDsbCとか
    らなる群より選択される変異E.coliポリペプチドフラグ
    メントであり、さらに該変異E.coliポリペプチドフラグ
    メントが2重システイン活性部位のループドメインを欠
    く、請求項15に記載の融合ポリペプチド。
  20. 【請求項20】前記目的のポリペプチドが、酵素、成長
    因子、抗体ポリペプチド、DNA結合タンパク質、RNA結合
    タンパク質、および膜レセプターからなる群より選択さ
    れるタンパク質を包含する、請求項15に記載の融合ポリ
    ペプチド。
  21. 【請求項21】前記目的のポリペプチドが、異種ポリペ
    プチドである、請求項15に記載の融合ポリペプチド。
  22. 【請求項22】融合ポリペプチドであって、以下: a)成熟E.coli DsbAと、2重システイン活性部位のル
    ープドメインを欠く変異E.coli DsbAとからなる群より
    選択されるポリペプチドから本質的になる融合パートナ
    ー; b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド;および c)目的のタンパク質またはポリペプチド、を含み、 ここで該目的のタンパク質またはポリペプチドは、該融
    合パートナーのカルボキシ末端に対し遠位に位置し、さ
    らに該リンカーペプチドが該融合パートナーと該目的の
    タンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そして
    該融合パートナーはシグナル配列を欠く、 融合ポリペプチド。
  23. 【請求項23】融合タンパク質またはポリペプチドを生
    成する方法であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、DsbAおよびDs
    bCからなる群より選択される融合パートナー、および目
    的のタンパク質またはポリペプチドを含有し、ここで該
    融合パートナーは、該目的のタンパク質またはポリペプ
    チドのアミノ末端を構成し、シグナル配列を欠き、 該方法は、以下の工程: a)宿主細胞中に該融合タンパク質またはポリペプチド
    をコードする核酸を導入し、それにより形質転換された
    宿主細胞を生成する工程; b)該融合タンパク質またはポリペプチドを発現するに
    適切な条件下で、該形質転換された宿主細胞を培養する
    工程;および c)該融合タンパク質またはポリペプチドを精製する工
    程 を包含する、方法。
  24. 【請求項24】実質的に精製された目的のタンパク質ま
    たはポリペプチドを生成する方法であって、以下の工
    程: a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドを
    コードする核酸を導入し、それにより形質転換された宿
    主細胞を産生する工程であって、 該融合ポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも1つのフラグメント
    から本質的になる、細胞質外輸送を導き得る融合パート
    ナー(ここで該成熟ポリペプチドが、DsbAおよびDsbCか
    らなる群より選択され ii)目的のタンパク質またはポリペプチド(ここで該目
    的のポリペプチドが、該融合パートナーのカルボキシ末
    端に対し遠位に位置する)、および iii)切断部位をコードするリンカーペプチド(ここで
    該リンカーペプチドが、該融合パートナーと該目的のポ
    リペプチドとの間に位置する) を含有する、 工程; b)該融合ポリペプチドを発現するのに適切な条件下
    で、該形質転換された宿主細胞を培養し、それにより該
    融合ポリペプチドを発現する工程; c)該タンパク質分解切断部位を認識するタンパク質分
    解酵素または切断剤で該融合ポリペプチドを切断し、そ
    れにより該目的のポリペプチドまたはタンパク質を生成
    する工程;ならびに、 d)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製する
    工程 を包含する、方法。
  25. 【請求項25】実質的に精製された目的のタンパク質ま
    たはポリペプチドを生成する方法であって、以下の工
    程: a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドを
    コードする核酸を導入し、それにより形質転換された宿
    主細胞を産生する工程であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも1つのフラグメント
    から本質的になる、細胞質外輸送を導き得る融合パート
    ナー(ここで該成熟ポリペプチドが、DsbAおよびDsbCか
    らなる群より選択される)、 ii)目的のタンパク質またはポリペプチド(ここで該目
    的のタンパク質またはポリペプチドが該融合パートナー
    のカルボキシ末端に対し遠位に位置する)、および iii)切断部位をコードするリンカーペプチド(ここで
    該リンカーペプチドが該融合パートナーと該目的のタン
    パク質またはポリペプチドとの間に位置する)、 を含有する、 工程; b)該融合タンパク質またはポリペプチドを発現するの
    に適切な条件下で、該形質転換された宿主細胞を培養
    し、それにより該融合ポリペプチドを発現する工程; c)該融合タンパク質またはポリペプチドを精製し、そ
    れにより実質的に精製された融合タンパク質またはポリ
    ペプチドを生成する工程; d)該タンパク質分解切断部位を認識するタンパク質分
    解酵素または切断剤で該実質的に精製された融合ポリペ
    プチドを切断し、それにより、該目的のタンパク質また
    はポリペプチドを生成する工程;ならびに e)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製し、
    それにより実質的に精製された目的のタンパク質または
    ポリペプチドを得る工程 を包含する、方法。
  26. 【請求項26】前記融合パートナーが、成熟E.coli Dsb
    Aと2重システイン活性部位のループドメインを欠く変
    異E.coli DsbAとからなる群より選択されるポリペプチ
    ドから本質的になる、請求項24または25に記載の方法。
  27. 【請求項27】前記融合パートナーが、成熟E.coli Dsb
    Cと2重システイン活性部位のループドメインを欠く変
    異E.coli DsbCとからなる群より選択されるポリペプチ
    ドから本質的になる、請求項24または25に記載の方法。
  28. 【請求項28】前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒ
    ドロラーゼであり、前記切断部位がユビキチンヒドロラ
    ーゼ部位である、請求項25に記載の方法。
  29. 【請求項29】実質的に精製された目的のタンパク質ま
    たはポリペプチドを生成する方法であって、以下の工
    程: a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドを
    コードする核酸を導入し、それにより形質転換された宿
    主細胞を産生する工程であって、 該融合ポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも1つのフラグメント
    から本質的になる、細胞質外輸送を導き得る融合パート
    ナー(ここで該成熟ポリペプチドが、DsbAおよびDsbCか
    らなる群より選択される)、 ii)目的のタンパク質またはポリペプチド(ここで該目
    的のタンパク質またはポリペプチドが該融合パートナー
    のカルボキシ末端に対し遠位に位置する)、および iii)切断部位をコードするリンカーペプチド(ここで
    該リンカーペプチドが該融合パートナーと該目的のタン
    パク質またはポリペプチドとの間に位置する) を含有し; さらに該宿主細胞が、該宿主細胞中で、該切断部位を特
    異的に認識するタンパク質分解酵素を発現し得る核酸を
    含有する、 工程; b)該融合ポリペプチドおよび該タンパク質分解酵素を
    発現するのに適切な条件下で、該形質転換された宿主細
    胞を培養し、それにより該融合ポリペプチドを発現し、
    該融合ポリペプチドのインビボ切断を引き起こし、そし
    て該目的のタンパク質またはポリペプチドを生成する工
    程;ならびに c)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製し、
    それにより実質的に精製された目的のタンパク質または
    ポリペプチドを得る工程 を包含する、方法。
  30. 【請求項30】前記融合パートナーが、成熟E.coli Dsb
    Aと2重システイン活性部位のループドメインを欠く変
    異E.coli DsbAとからなる群より選択されるポリペプチ
    ドから本質的になる、請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項31】前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒ
    ドロラーゼであり、前記切断部位がユビキチンヒドロラ
    ーゼ切断部位である、請求項29に記載の方法。
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